Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Отбор продуцентов, характеристика целлюлазы и бета-галактозидазы экстремально термофильных бактерий

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Отбор продуцентов, характеристика целлюлазы и бета-галактозидазы экстремально термофильных бактерий"

? 6 дпр шз

ЫШЮТЕРСТЗО НАШ,. ВЫСПЕЙ ВШШ И ТЕХНИЧЕСКОЙ ПОЛИТИКИ РОССИИ МОСКОВСКАЯ ГОСУДАКЯЗЕННАЯ АКАДЕМИЯ ПЩШ ШШВОДрТВ

Ка правах рукописи УМ 577. 152. 321

ЕШИНА

Тамара Васильевна 7

отбор продаитш, 1арашж1ш цшшш и ^-гмангсзвдазы зксташшо терыо0иыж еактерей.

Специальность 03.00.04 - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диесертадаи на соискание ученей степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1993

/

Работа выполнена в Институте биохимии им. А.Н.Баха РАК к БНИ пищевой биотехнология РАС-ХН.

Научай руководитель - доктор биологически* наук, профессор Тихомирова A.C. Научный консультант - кандидат химических наук

Тихомиров Д.Ф. ' ~

Официальные оппоненты - доктор биологических наук,

профессор Грачева U.U. - кандидат биологических наук Цаплина И.А. Ведущая организация - Ао "Биотехнология"

• х зг?

Защита состоится п7<?" 1903 г. в " /¿>* часов

на заседании Специализированкого Ученого Совета К 063.51.06.

Московской государственной академии пищевых производств.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии.

Отзыв на автореферат в 2-х экземплярах, заверенных печат

просим направлять по адресу: 125080, Москва А-80, Волоколамское

<

шоссе, Ц, МГАПП на шя ученого секретаря Специализированного Совета'К 063.51.06.

Автореферат разослан "/Vг.

Ученый секретарь Специализированного Совета К 063.51.06. МГАПП, к.б.н.

) '

Генералова Т.Г.

•з

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ

Актуальность проблемы. Промышленная реализация процесса <ге1— ментативного превращения целлюлозы в усвояеше сахара требует качественного улучшения бнстехнологаческнх м физкко-ли-шческкх свойств фер»;ектов цздлигазного комплекса. Особенно важную роль при этом кпрегт: повышение термостабидышстя биокаталазаторов, высокая каталитическая активность, снииение кнгкбарованкя продуктами реакции. К сожалению, используемые в настоящее время продуценты ца&шшаз вв отлячаптся необходимой устойчивостью к повшхен-1Ш& температурам.

Дня излучения чвллвлолятическкх ферментов с заранее заданны»® свойствами в качестве первого этапа необходим скрининг цел-г.влаз по. кагэ^улярным характеристикам с целью выявления мякроор-рягиэнав - иродуцеи-юс цз*дплаз, пгрспекгпзных с точки зрения биотехно до ггя, с последующим созданием на юс основе высокопродуктивных технологических атаымов. Данная задача требует разработки принципиально новых критериев пригодное« целлвлазных комплексов па основе ях молекулярных характеристик, что в своп очередь связано с разработками ряда проблем звзякояогии как фундаментального, так и методологического характера.

Возможность ферментативного гздролиза лактозп и использование этого процесса в промышленности, прежде всего для получения дополнительной сладости, явилась предметом тщательного изуче1шя б пзелгдше годы. Лактоза является плохо растворимы*:, несладким, практически несбргливаеикм дпеахартгдом, легко дасталлизуицится даяз в невысоких концентрациях. Наиболее полная утилизация лактозы имеет большое значение для молочной и пищевой, промышленности и вносит определенный вклад в решение экологической проблемы о кружащей среды. Гидролиз лактозы до глисозы я галактозы осу-

цеетвляет фермент ^-галахтозидаза. Наиболее акткЕнымз продуцентами этого '¿¡ермента являются млкрооргакнзкы: прокариоты и низ-Еие эуяарлоъ; - юирсницеты - грибы к дрожки. Необходим отбор продуцентов, наиболее перспективных в отношении высокотармоста-бильнах _р~пазактозкдаз, чтобы в дрдьнейсем их можно было использовать в Сиэтехнологагвдскях процессах к в генной икгеиеркя.

Цель работы, Целью настоящей работы являлось проведзняе скрининга продуцентов целшололитических ферментов, учитывая их молекулярные свойства, а также ^-галаятоэидаз. Выявить наиболее перспективные продуценты, отвечающие основным требованиям биотехнологии г дать кс бкохимкчесхуг характеристику.

Научная новизна. Из коллекции, вялючакцей 30 штаммов экстремально термофальшг. бахтерай, проведен отбор штанма, наиболее перепекзжзного б качестве продуцента высокотеркостабильных целлшаз. Изучены фЕэико-химические и биотехнодогкческие свойства цеяяшмитичееких ферментов экстремально термофильной анаэробной бактерии «кегосеМит Ычег-тч^ит штамм -1320, выделенной из гейзеров Камчатки. Проведено сравнение эффективности гидролиза кристаллической целлюлозы препаратами целлвяаз иккроыи-цета Тг1с1'.0(1йтао гее«х и зтетреиалыы термофильной бактерии А. ЬЬегторкИцв» . Проведено фракционирование цэллклаз Т гее«еи

И А. У1егтор1м.1и-п .

В ходе скрининга изучены физико-химические свойства ^-га-лактозидаз двух экстремально тармофяльнкх ыорегак архебахтерий (штаммов У 42 и £ 45). Установлена способность синтезировать ^р-галактозидезу у бактерии А. 1ЬегтеорЧ.1|ит -1320, эта _р-галак-- тозпдаза ввдмена '.»"очищена. . ""* . ' >

Практическое значение работы. На основе проведенного отбора новых продуцентов целлшаз и р-галактозидаз выявлены наиболее

перспективный, экстремально термофильные гатяитог, растущая при 75'" С, которые определенно могут быть эффактазнй применены в разя?"чккх бпотехнологичепких процессах к в генгоГ, ккненери.;.

Апробация раосты. Осноаиьте результаты работы представлена на 3 Всесоюзной коферензди "Биосинтез целлгаоэы и других компо-. шнтов стакггГ СКлзакь, 1990 г.), на 7 2г.есоизноы

симпозиуме "Инженерная энзимологин" СМосквв, Г5ЭТ г.), ка Всэ-r.oüLKui ■кяфзреицы "Kodhj направления в шацезой биэтгшэлогаи" (Черновцы, I9QI г.), на Взесотаной конференции "Ьшэтэсимз превращения Шощевыг потаперог" СОьетлогорск, 1931 г.), на 5 Конфо-ренцяч Розсг'чП'.гой {генерации "Новые кя1фявл«>тня биотехнологии ü^ukr:os TSC?. ;.).

. Го ла^риала:: дгх^ер-гадкк ра)6^ковано il печат-

paf'OT,

0. дяг ~г ;ie. ч ^ъьч работы, й'.'-ейр-гадлонкая гчЛгс .., oof•- г .гдонал, сбоорс. .чг^ературе, гэпеперя^зк-альной Чаем, ^sjoäob, 'tiwJKct лкгерм'уры- F?.6oya .^гипиша üa I2C стрь-нкгат, ссдер-гл- ¿"оутоь, -9 табляц. Бя^дксграфг-м ".тллчает

—Z-l nc'j'i;"--fiCi; ..Л.

Г^уешк PA^ii ■

Ihpr'M cpv."pe£iiuiu этапом раиотч ¿зллися стбор

Еродуциа-ша г,кс iysaa. ■г'-рмофнльных аедовдаэ й ^р-галактозидеи» е цй-и. ььтз^гчш®-: :J=. ^лее п^глркмвкых для бнотх-о^ ъоръч - Д&к-коя задан- р*атэа:5откк ^е^?дэлоглкссЕ:ас эскзз с::ртнииг?.. .

Лея опр^дслснт калбэлсе су^ествеяки*: для практика характеристик целтолону^теесг-х ферментов на гтом этапе в щлгщппе могут быть легализованы частично ечкченныэ препараты фермсктоз. Вил иссле-

дована 30 пггазшов экстремально термофлльньк бактерия, растурос при 76-95° С га целлюлозе в качестве единствемкого источника углерода в среде, отобран штамп- наиболее перспективный в качест ве продуцента высокотермостабялькых целлюлаз. Критериями отбора служили: I) удельная активность эвдрглшаназы целлплазного комплекса на мл я кг белка; 2) количественная секреция в культурлль-нув жидкость и характеристика ферментов целлслазного комплекса; 3) термостабшаность..

Данные отбора представлены в таблице I. Целлшазные коигшек сы оказались весьма привлекательными по биотехнологическим харак теристихам, недостигнутым пока в литературе. Так удельны«? актив-кости были сравнима с таковой для "стандартной" бактериальной ку туры С4о&Ь-Ы'мап ^ЬемпосйЦит ( 0.Б Е/мг), значительная часть фермента (32 - 10С$) секрвтировалась из клеток в культуральную жидкость, период полуинактивации при 95° С варьировал от несколь гак минут до 16,5 часов.

Наиболее термостабильныыи целлгаазами характеризовались пресноводные и морские бактерии рода ТЬелпо^-сда, однако их продуктивность быза невысока.

Экстремально термофильные бактерия - аэробы также вызывали интерес, поскольку синтезировали болыее количество балка. Апробированная кулмура неидентифицнрованноЯ аэробной термофильной бактерии секретировала крайне с кронное количество целлшаз (0,0025 ЫЕ/мл), ори этом феризнгов было адсорбировано на клетках. Наиболее перспективной оказалась группа пресноводных анаэробных бактерий, сходных с родом Алаегос-е-Нищ. Они обладали наиболее высокой продуктивностью по ондоглвганазе, достаточно полной секрецией фермента в культуральную акдкость и оптимальными для технологических процессов параметрами термоянаятпвации

TäöJ.iua у

ХАРАКТЕРИСТИКА Э!1Д0-"3-Г.Ш{АНДЗ ЦЕ.1ШАЗН0Г0 КОМПЛЕКС?.,

секретирнш рг.док тьт эшршшо терйшзьш штшг.

Культура, Зндоглчканаэа, MÜ/mi птаим в Ю : в фильтрате I КЗ (з?) :!S/ur белка 2ериод полу-*нактивации при 5Ь°.мин

Anaerocellust

thernophllus 76° 0,- 0247 0,0095 (33g) 0.77 10

Прео11изодкие

Thernotoga

theraiarun, 80°

LA3 0,0010 1000

271 IF 0,0007 900

17I3F 0,000В 540

2908F 0,0005 520

sigma F 0,0009 300

морские

Therniotoga

maritima, 80°

M S 3 - 3 0,0055 0,0047 (85?) 0,51

Thernotoga

nsapolitana

NS-K 0,0170 0,0150 (885) 1,52 240

2312 A 0,0085 0,0055 (55?) 0,33 220

2312 В .0,0043 0,0017 (33?) 0,24; 98 0

2711 M 0,0110 0,0075 (58?) G,79 Í 000

I20I-I203 0,0113 0,0095 (S5?) 0,35 57

sigma УР 0,0046 0,0013 (23?) 0,20 53

slgaa "C 2S 0,0058 0,0020 4 (34?) 0,30 44

signa MC 27 0,0078

Аэробная i

культура

на 0,0023 0,0008 (33.2) 0.55 9

на филь-

тровальной

буиаге 0.0006 1000

целлшаз Спрлюсть» стабильны при 75° с и инактивируются за десятки минут при 95° С). До морфологическим я физиологически» характеристикам штаммы близки друг к другу, что подтверждается также данными скрининга по целлюдазе. Б качестве объекта для дальнейшего изучения нами был выбран . . Anaaroce-ííum ihsr-mopkUum штамм -Т320, как имеющий лучшие продуктивность, секрецию и термостабильность целлшаз.

2. Сравнение целлюлаз Trícbcdermo reesei. и Anoenocetíum {ЬегторЯЦит.

Ферментативное расщепление целлюлозы и целлшозоссдержащего сырья является одним из важных направлений современной бяотехно-' логии. Деградация целлюлозы под действием целлюлаз грибного происхождения детально изучена. В лабораторных условиях проведено сравнение эффективное«; гидролиза целлюлаз аш из Т- гее sel и A- iWmdphiJum при оптимальных для хаздой из пих условиях. Црллюлазы бактериальной природа уступают грибным целлюлазам по удельной активности и по количеству внеклеточного белка. Однако главным достоинством бактериальных целлшаз является их термостабильность. Термостабилъность - одно из важных требования, предъявляемых промыиленностью к целлилазеа. Использование термостабильных ферментов позволит проводить процесс биоконверсия растительного сырья при температуре пастеризации и тем самым уменыпить вероятность заражения посторонней микрофлорой.

Для сравнения эффективности ферментативного гидролиза целлюлозы культуральньвм жидкостями целлалолитическях микроорганизмов наиболее целесообразно использовать лабораторный реактор колонного типа. Основным требованием при этом является хорошая способность фермента адсорбироваться на поверхности субстрата.Подбот

о

оптимально условий деградации микрокристаллической целлшозы (ШЩ) кульгуральной жидкостью представлен «а

рйС I Установлено, что зависимость накопления воеетанавливажь Сахаров, додохся на с» адсорбирован** активкостн, т 75° С в 6-7 раз вше, чем при 55° С. ^ьнейпее гювшение температуры гидролиза было нецелесообразно, так как резко ускорят термокнгктлвашш фермента. В буфер, годащнЯсл на колонку, добавляли иош Са*2 СТО мИ СаС12), ч*> приводило г значительному повышению степени конверсии субстрата. Установлены оптимальные для гидролиза значения рН среда (рН 6,2) и «°®ой . (0,05 Ы ацетатный буфер). Гвдроетз при 75° С даяивзаии «^Мт проводался за счет их высокой термостабмьности в течете нескольких суток. Так период полуинактивацш пря 75 С эн-до4л_|з-глюканаз кЛЬ^Ииг, составляет 50 „асов. Оптимальные услоэия гидролиза целлшозы целлгашзаии Тге**» известны СрН 4,5; 50° С). Сопоставление эффективности гидролиза микрокристаллической целлшозы культурный«- даомачи А. ^егторЬ^ ^гп й Т. ге»е\. проводаюсь в указанных ^птак-ьет ретииех.

Рис. I. Влияние температуры на Гйдр^т«з целлюлозы куяьтуральной жидкостью АяавосеНит 1Ьег-торьИит. Количество субстрата ОИЦ) - 5 г; рН-б,2; скорость протока 5 -ил/с.

1

к-.г/ед 4

55

61

75

85

В таблицг 2 приведены данные по степени конверсии микрокристаллической целдышзы культуральнымк жидкостями Т. гегзе1 и ДЛЬегторЬИадп в процессе гидролиза при 50° и 750 соответственно- Еа всех случаях было уравнено количество единиц активности по филироваяьязй бумаге, сорбированных I г субстрата (активность измерялась при 75° для А.1ЬегторЬиит и 50° для Т* Ч »

гьгьъI }, «по дает возможность сопоставить эффективность действия грибник а бактериальных цвллшшз. На начальных этапах (15 ч), когда идет главным образом гидролиз аморфных участков целлшозы, скорость деструкции субстрата целлхшаземи А-^Кегто-рШит и Т-гее*г1 практически одинакова. Однако при увеличении продолжителыюсти гидролиза скорость конзерсии субстрата бактериальными целлшазаш уменьшается по сравнению с грибными. Поскольку в реактора колонного типа практически ке происходит тер-моинактивацян ферментов, а также икгибирования их продуктами реакции Сза счет непрерывного удаления последних из сферы реакции), но наблюдается частичная десорбция ферментов с субстрата, можно предположить, что ослабление гидролитических функций бактериальных цеяшяаз в ходе гидролиза возможно связано с нарушением надмолекулярной структуры целлюяазного комплекса.

Таблица 2.

Степень конверсии микрокристаллической целлвлозы (МКЦ-I г) культуральными жидкостями Тг1сЬЫегшо гееьеи (500 рН-4,5) я АпаскзсеЯит 1ЬегторШит (75°> рН-6,2).

субстраг !время гидролиза, ч!_ степень !£ОНЕерсии_

' ___

МКЦ "СЬетарЛ" . ~15 ~ 6,2 7,1

Чехия и Словакия 30 12,0 12,3

60 21,2 19,4

ТОО 38,2 32,6

7аккн образок, при сравненье эисфзктнькос-л гидролиза Miucpc-крксталлнческой целлюлозы в реакторе колонного типа культурачь-иыми гядкостями к- IhcrmophÙum t75u, рН-6,2) и Т-гее se- С50°, рН—4,5) установлено, что по степени конверсии субстрата бактериальные целлшазы лишь немного уступает грябныи. Однако бактериальное целлтякзы яигст то преимущество, чтр осучрттвлягт гидролиз при т^шературе ?5°, когда существенно уменьшается вероятность заражения процесса посторонней микрофлорой.

3. Очистка и характеристика целлглаз ¡г^сЬо^тпа reaset.

Очистка включала гидрофобную хромат с графив на тойоперле HW-65F, обессоливаже на акриле ке г П-б и узьтргфяльтрадии на поляг вслокнаг; гел*~^льтрацкю через тойоперл 'A'7- ^r . lia первом этапе фракционгрованяя для группой'- очистки и разделение раз-ïix эндогноканаз бшх использозач атпобкрозакный нам метод (Т'.'.хожров к др., 19661 г7.дрофоб:-:о?. хроматограф;" ?" тейоперле KW-65F в нисходящем градиенте сульфата аюгокня Cl,Ь—О М). Результаты разделзнкя предзгазлег^ на ркс. 2. 1-1з рисунка видно, что большая часть зндогльканазной актизностн при высокой концентрация сульфата °м"и:кя в стартов.чх ус.,7эв;:ях прочет с~язнвается с сорбекто:;. В гфотизапологпость эндоглкжаназз болшипстзо балластных белков эл'£:трувтся, не зздетаизаясь на колонке. Благодаря селективной сорбции достигается очистка эндоглгз?яази з ? "раз. Полученную даншэ ср.ицет?лъ1т^/vï о высокой гидрофоочостк эн^оглхзкакагч, выделят^зй ее из общегс рядя белкоз гультураль-ной зждк^сг/. Т.гек.ье* . Последу^дкГ: анализ полученных з результате гидрофобной хроматографии фракций зндрглькан&зы на сродст-со к целлплезе показал, что адсорбированная при высокой ионной силе эндоглвхаиаза злягруется нисходящим градиентом сульфата

пик i пик2 пкяЗ Аэнло'

Рис. 2..Гидрофобная хроматография цеялюлазкого комплекса "D-ícboderma reeseí. на полигздроксяльном геле то йо л еря HV/-65T. Элгция со скоростью 120 мл/ч при 20° С нисходящим градиентом сульфата аммония (1,5-0 И). I - концентрация белка (мг/мл); 2 - активность эпдогликаназы (А.

аммония в вндг дъух пиков. При более высокой концентрации соли, что свидетельствует о более низкой гидрофобкости, элсируется эндоглюканаза, характеризующаяся умеренным сродством к целлюлозе (пик 2, рис. 2). Фермент с высоким сродством к целлюлозе (пик 3, ряс. 2) элгаруется позже, что указывает на более высокую гидрофобкость отой эндоглюканазы в сравнении со "среднесор-бирупцейся" фэруой (пик 2). Наконец, эвдрглзаканаза, на связавшаяся с носителем з стартовых условиях и Еыхсднщая вместе с большинством балластных белков, т.е. но отличающаяся от нкх по гидрофобное?» (1шк I), характеризуется минимальным сродством

к поверхности субстрата.

Полученная путей гидрофобной хроматаграфии зкдзглюкаказа-З с высоким сродством к целлюлозе (пик 3) далее была сконцентрирована ультрафильтрацией на полых волокнах. Для этого предварительно с помощью гель-фильтрации через акрилекс П-6 из раствора был удален сульфат аммония, лрепятствупций ультрафильтрации из-за высотой гидрофобной сорбции белков на дазаамиьосуль-фатных полых волокнах (ВДУ-Т5). Для дальнейшей очистки сильно-сорбирующейся зндоглюканази была использована гель-хроматография на тойоперле И^-55р.

Результаты разделения эндоглюканазы на фракции, характеризующиеся различной гидрофобностью и дальнейшей очистки наиболее гидрофобной и сальносорбирупцейся на целлвгозз эгорглюкачазы представлены в табл. 3.

Таблица 3.

Екделение гидрофобной, с высоким сродством к целлюлозе форы зндо-1,4-^-глюканазы ТгхсКос1ггта >-е&$е1..

{Общая ак-I Бело к, 1 Удельная ! Выгод! Степень Этап очистки !тивность»1 мг Iактивность,! % !очистки _____ _!_ ед_ _!__X ёД&Т.__1__1___

I. Фильтрат культу-ралькой жидкости 2522 632 3,9 100 I

2. Гидрофобная хроматография на тойоперле и>/-Б5г 783 22,6 27 31 6,9

3. Обессоливание на ; акрилексе П-6 и ультрафильтрацля 166 28 6,0 6,7 Т,5

4. Гель-фильтрация через тойоперл №/-55? 164,7 5,6 29,2 6,5 7,49

А. £зделен::е очистка ко:тонзнгоз целдпяазного еампдзпса АпаегосеЯигл ЬЬггторК^иг*:.

Сракцконгрованке вклсчало следуйте стадия: I) концентрирование культура^ьной жидкости улътрафильтрац;:ей колонке с полыни волокнами отечественного производства ВПУ-15 Сг.Кириши ОКЕГЕа); 2) ионообменную хроматографии ка ДЗАЭ-сефароэе СЬ-63; 3) гель-фильтрации через сефакркл АсА-34 дал анырлазы и гель-фильтрацки ^ерез тойоперл №*/-55г ; 4) высокоэффективную ахшошоб-менную хроматографа» на Мопо-Ос для звдрглюкангзы.

Результат фракционировался представлены в табл. 4. Декте в таблице указывает на то, что ультрафильтрадия через колонку . с полыми волокнами 2ПУ-15 является эффективным методом концентрирования К&. Болонкой задерживается более 95% экдоглшаназы, а в отношении аищелазы происходит активация, вероятно вследствие удаления низксвюлекулярных ингибиторов. 3 результате ультрафиль-трацки объем образца был сокращен в ?0 раз. Результаты ионообменной хроматографии представлены на рисунке 3.

Рис. 3. Ионообменная хроматография на ДЗАЗ-г. кг.'« т «г.. -сефарозе СЬ-оВ, схшн-** центрироза1Шой ультрафильтрацией, Бысоксмоде-кукрной фракции эндоглз-а какгз Кпаыв Иит 1Ьс.г-

-'л?; ы

[Г-Ч. ^лг.-,..

1'________

J «

иоаЧИит Коленка 2x12 си, уравновешенная 0,025 Н трис-вцотатнам буфером рИ-3. Эшсаач линейным градиентом НаС1 0-0,6 Ы со скоростью 40 мл/час.Исходный образец 40 мл, фракции по 1мл

Выделение ипохсгтвониых форм эндо-1,4-_р-,-т'люкйнаэ, е. высоким сродством к целлклоэе |\поггсс.?Ч(ит 'сЬпгторЬи.ит.

■.гас лит

---- _ -----1~ ----- -- Этал очистки ЮСдал актшшость,' | ед ЛФБ/ЭГ 1 Еелок, 1 иг { ¡Удельная актив- 1 Бшод.Т Со 1 i ?еллнь очле.тнл

I. Фильтрат культураль- ной жидкосй'и-- 0,Т96/460 143,8 0,0013/3,2 100 I

2. УльтпьфилыФаш-.я на колонке ВПУТ15 (р.Ки-риши ОКБТВМ) 0,550/450 120,3 0,0076/3,74 4,0/96 6/1,2

3. Ионообианпая хроматография на ДЭАЭ-сзфаро-зэТЬ-бВ

Фщсция А (авицелаза, 0.389/104 ; С 0,0181/4,е4 1,98/23 13,9/1 ,5Г

Фракция 0 (.'¿ндоглгака-наза, ЭГ) 0,209/191 13,9 0,0150/13,7 1,06/42 ТТ,Ь/4,3

4а.Фракция А - гель-фильтрация через сефакрил АоА-34 0,0119/0,^5 3,25 0,0168/0,18 2,7/0,12 I г,, г/0,06

4б.2ракцнл В - гель-фильтрация чеэез тойомарл

0, С447/ТТл 3,12 0,0038/35,9 5,96/24,3 ■:,9/П,2

Ь. Высокоэффективная ани-онообменная хроматография на колонке Мола- 0. " 0,0548/5,43 г, 9 0,0189/1,89 27,9/1,19 14,5/0,[)9

Бгдно, что в ходе процедуры получаются два белка, один из которых представляет авицелазу Сфракция А), второй - эндоглгка-назу Сфракция В). С целью дальнейшей очистки от взаимных примесей фракции подвергались гель-фильтрации через подобранные нами носители. Для авицелазы успешно апробирован смешанный гель се-фарозы и полиакриламида - сефакркл АсА-34, обеспечиваюций разделение в диапозоне молекулярных масс 50 - 100 кДа. В ходе фракционирования достигнуто разделение пиков авицелазы к остаточной эндоглюканазной активности. Авицелаза представлена белком меньшей молекулярной массы, нежели основная множественная форма эк-доглюкаяазы. Обнаруживается наличие низкомолекулярного белка с молекулярной массой 10 кДа, имеющего зндо глюканаэную активность. В целом выход авицелазы равен от нанесенной активности. Столь низкий выход можно объяснить прежде всего необходимостью для полного проявления активности на кристаллической целлюлозе дополнительных компонентов целлюлазного комплекса (в данном случае использовалась для определения активности - фильтровальная бумага IАФБ). Это делает метод АФБ не совсем удобным для определения индивидуальных компонентов целлюлазного комплекса. Однако другие, более специфические метода лишь разрабатываются, их универсальность для целлюлаз различного происхождения пока не доказана.

Для фракционирования основных эндоглвканаз (фракция В) после ионообменной хроматографии был использован более жесткий гель тойоперл НМ-ЙР, менее инертный в отношении белков к обеспечивающий большее разделение СЮ - 700 кДа). Эндоглюканаза представлена одним пиком с молекулярной массой 70 кДа, имеющим незначительную следовую активность в отношении фильтровальной бумаги (соотношение активности по окрашенной КМ-целлюлозе к активности по

фильтровальной бумаге составляет 22,7:1 против Т,5:1 для очищенной гель-фильтрацией авицелазк).

Для дальнейшей характеристики полученной таким образом эн~ доглюканазы использовалась высокоэффективная анионообменная хроматография на Нопо-О . Фермент олшровался в виде симметричного пика без разделения остаточной авяцелазной активности. Это указывает на тс, что активность в отдаиекж кристаллической целлюлозы присуща и эндоглвкглазяому компоненту целлвлазногс комплекса АпаегссяИит &снпорЫ4ит ,

Таким образом, э ходе фракционирования целлшаз нового вы-сотатермостабильного продуцента достигнуто разделение белков, обладающих ферментативной активностью в отношении растворимой КК-целлвлозы с одной стороны и кристаллической целлюлозы с другой. Оба фгрмента представлена индивидуальными белками с молекулярной массой 70 кДа Сэндоглвканаза) и 50 ада Савкпелаза), не входящими в мультяферментныэ агрегаты.

5. Отбор продуцентов и изучение условий биосинтеза вксокотермостабильных ^-галактоз.чдаз.

Среда ряда штел¡мов экстремально термофильных бактерий н&'-я проведана селамшл бактерий по уровню биосинтеза _р-галактозида-за и ее физико-химическим характеристикам Стабл. 5). Отобрана новая бактерия Апаетосс-Цит йегтэрЫ 1ит дгя.

, выделенная из гейзеров Камчатяз, растуцая от 40 да Б3° С, отобранная нами. ранее как продуцент внеклеточных цзляпляз. Ват---ной особенность» А. 'Л^гто^Ь^лд является зе терностабильность, нго позволяет использовать повдаеннув температуру для создания селективншс условий размножения этого микроорганизма по отношение к иэзофильным стрептококка« и лактобездллам. Продуцент куль-

Таблица 5.

Характеристика ^-галактозкдаз, секрзтируемчх рядом культур экстремально термофильных бактерий.

!? !_р-галаетозидаза^_ Ка/мл,_С^)_! НЕ/мг » Рсриод полукн-ытами |внеклеточная!внутриклеточная { 6глка |

II 0,0013(58) 0,0010(42) 20 0,3

13 0,0031(95) 0,0001(4) 33 0,3

18 0,0031(65) 0,0005(14) 3 0,3

19 0,0011(65) 0,0006(35) 19 0,3

20 0Г 039(84) 0,0007(16) 60 0,3

24 0,0014(73) 0,0005(27) 36 0,3

26 0,0031(20) . 0,0004(10) 42 0,3

28 0,0010(56) 0,0009(46) 44 0,3

30 0,0037(74) 0,0013(26) •14 0,3

31 0,0003(20) 0,0010(80) 17 0,5

33 0,0019(92) 0,00С2(8) 10 0,3

34 0,0004(57) 0,0003143) 45 л к

36 0,0041(76) 0,0013(24) 72 0,3

37 0,0038(74) 0,0013(26) 25 0,5

38 0,0042(77) 0,0013(23) 16 0,5

39 0,0042(77) 0,0013(23) 32 0,5

-'¿0 0,0034(77) 0,0011(23) 32 0,4

41 0,0008(43) 0,0011(57) 14 0,3

42 0,0042(79) 0,0011(21) 8 1.0

43 0,0041(78) 0,0011 ('22) 43 0,5

44 0,0042(78) 0,0012(22) 37 0,5

45 0.ССК2С78) 0,0012(22) 15 1,5

46 0,0043(79) 0,0011(21) 28 0,5

48 0,0043(76) 0,0912(22) 26 0,3

49 0.0014С53) 0,0012С47> 93 0,4

50 0.0043С78) 0,0012С22) 48 0,5

А,£1"гг- 0,044(65) торЫйчп

0,0014(16)

52

0,3

тивхровали при 75° С в строго акасробкьсс условиях по 400 нл з флаконе, на среде Дгекинга СВкомироз и др., 1989) с различным содержанием лактозы ("от 0,5 до 55»),

На среде Пфенинга с лактозой экспоненциальная фаза накопления биомассы и суммарной активности р-галакгсзидазы наблюдается до 48 ч роста (рис. 4). При этсм 1-е сутки фермент ассоциирован с клетками и не детектируется в куяьтуральнай жидкости. Лишь через 24-43 ч количество биомассы достигает максимума фермент практически полностью (Е0--90&) переходит в свободное состояние ('рис. 4).

Способность микроорганизмов синтезировать р-галактозидазу зависит от состава среда и,прежде всего, от того, какой сахар используется в качестве источника углерода. Известно, что лактозидача является иядуцибельным ферментом, т.е. образуется только в «фисутстэии специфических субстратов: лактозы, адлолах-тозы СТихомирова, 1938).

А.^егторЬЦигп на среде с лактозой синтезирует наибольшее количество р-галактозкдазк, Но клетки синтезируют соизмеримое количесаво _р-галактозидазы и в отсутствие лактозы. Поскольку абсолютное количество ^-галактозкдазы, синтезируех'ой клетками Л.и1Ьгтг.орЬИит при росте на средах с различными неспецифическими сахарами,по сравнению со средой с лактозой, варьирует з несколько раз, следует, по-видимому, говорить об индуцированном характере синтеза этого фермента у данного вида бактерчй.

Езльшае в&кяние на биосинтез р-гагажтозидязы оказывает изменение рК средш. 3 культуре дрсгаей установлено, что при автоматическом поддержании в ферментаторах рН в диапазоне 5,5-6,0 Св течение 24 часов роста) удается получить более активный биосинтез о-галактозидазы, чем при рЯ 5,0 или 7,0 (Тихомирова и

2с

{ г з <

Рис. 4. Накопление р-галгжтозидазной активности (пол-нкт-рофекил-^-б-галактопиранозид при 75°, рН-6,9) в ходе культивирования Апаегссг-Иит ¿ЬеппорЬь1ит на среде Щжкикга с различным содеряадазм лактозы Сот 0,5 до Е&).

др., 1973). В культурах микроскопических грибов на накопление внеклеточной ^-галактозидазьг большое влияние оказывает начальная величина рН среда. Синтезу _р-галактозидазы благоприятствует

кислая среда СрН 2,6-3,4/, а максимуму накопления биомассы соог-зетсх-вует рН-4,5 (Тихомирова и др., 1975).

Для A.i'nermopoHum рН-олтимум для биосинтеза фермента или ддя действия^находится в нейтральной области, с пологим спадом а кислуя зон;,'. 'Зэрмен? обладает ркачительтой термостабильностьн: период полуинактивации при 95° С составляет 15-30 мгнут, причем субстрат - лактоза оказывает cvабиотз'/ругцее действие.

ХЪлучеииые результаты указизает на перспективность исследуемой бактерии в качестве продуцента термостабильной ^-галахто-зидазы, особенно - для целей генной инженерии.

б. Выделение и очистка ^-галактозидаз Anaeroeeiiun

Выделение ^-гала.ктозидаэ вшгочало следуйте стадии: I) ультрафильтрация на колонке с полыми волокнами ВЯУ-15 Сг.йиришк ОКБГБМ) отзче^'зеиього производства; 2) ионообменная хроматография на ДЭАЭ-сефарозе CL-6B; 3) гель-фильтрация через тойопэрл HW-5SF. .Ультрафпльтрация, как и г случае ферментов целлалазкого комплекса, оказалась эффективным методом концентрирования ^-га-лактозидаз: пря концентрировании в 100 раз выход по активности составлял больше 100£, Сконцсотркроганный препарат был нанесен дяя ионообменной хроматографии на колонку с ДЗАЭ-сефарсзой CL-6B. Колонку уравноветавали 0,(5 Ы трис-HGI буфером. рН-8,0. После нанесения колонку промывали тем же буфером, ссдеряакрм 0,04 М i.'aCi, со скоростью IG0 мл/ч, а затем элгаровали активный белок лилейным градиентом 0Д-0,5 М НоС{ со скоростью 80 мл/ч C2xg00mji), Из картины разделения (рис. 5) видно, что р-галактозидаза элш-руется градиентом NoCi одним широким пиком, более широким, чем пик белка. 3?о позволяет предположить наличие в препарате нес-

/

кодьких множественных форм р-галактозида*, близких ло свойствам. На стадии ионообменной хроматографии достигается высокий выход активности.

Ркс. 5. Ионообменная хроматография через колонку с ДЗАЭ-сефарэзой СЬ-об,сконцентрированной ультрафкльтрацизй высокомолекулярной фракции р-галактозидая Апаего-Сейит ЬЬегтерЬЫлп, Колонка 3x12 см уразно--венкншш 0,05 М трис-НС1 буфером, рН-8,0. Элвцйя линейным градоентом ЫаО. 0,1-0,5 М со скоростью 60 мл/час.

1- р-гадгктозидаза;

2- белок

р-ГалакхОзидаза, содержащаяся в фракциях основного пика, после концентрирования упариванием в вакууме была нанесена для гель-фильтрации на колонку е. тойопердом НУЛЕ? . -Галактози даза злщруется, как минимум, в трех пиках и характеризуется молекулярной массой около 100, 70, 50 кДа. Это указывает на субьединич-ную природу фермента. Зфоме того, низкий выход по активности (приблизительно 25%) • свидетельствует, что значительная инактивация и дестабилизация молекулы ^р-галактозидаэы происходит при распаде на су<Ь>единицы.

Попытка дальнейшего фракционирования основного пика ^-галак-тозидазы (50 кДа), очевидно, состоящего из субьединиц,методами

высокоэффективной гящкостной хроматографии к успеху не привела. Вследствие нестабильности фермента в процессе разделения при ионообменной хроматографии на с колонки алдаровалось лишь

10? нанесенного фермента.

Таким образом найден продуцент экстремально термофильной ^-галактозидазы анаэробная бактерия - Ánoeroce-Jtam ttwrrrephi4um , период полуииактивации фермента при ТОО0 С равен 30 минутам. Подобная термостабильность делает этот новый продуцент весьма перспективным для использования з генной инженерии.

ВЫВОДЫ

1. Проведен скрининг штаммов экстремально термофильных анаэробных бактерий, основанный на их продуктивности и свойствах целлюлаз к _р-галактозидаз.

По биотехно логическим характеристикам выявлены целлшаз-кне комплексы, близкие к которая не описаны в литературе. В качестве объекта для дальнейшего изучения нами был выбрал штамм Аг>аег-осе Him thei-mophi-iuni aftn. row., ip. raw имещиЙ

более высокую продуктивность, секрецию и теркостабильность целлшаз.

2. Проведено сравнение б реакторе колонного типа эффективности ферментативного гидролиза микрокристалгическо й целлшозы культуралышми гидкостями Anoeroceiium Ibo-iropbiium и Trlcbo-dermo reesít при оптимальных для каядоЯ из них условиях. Установлено, что на начальных этапах гидролиза микро кристаллит ческой целтатозы (75 ч) скорость деструкции субстрата цслгаэ-лазами AnasroceiJum thermcphUurn я TritKadarmc reeiei. практически одинакова. При увеличения продолжительности гидролиза скорость конверсии субстрата бактериальными целяюлазами

уменьшается по сравнению с грибнкми. Однако бактериальные цед-лвяазы икевгтг преимущество, что осуществляв гидролиз при температуре 75° С, когда существенно уменьшается вероятность за-рагения.посторонней микрофлорой.

3.Разработать: способы очиотга зддо-Т ,4-^з-глшаназк мгзофильного микроищата Тг1сЬэс!ггта гсезеь. и анаэробной термофильной бактерии класгасеНит гЬестолЬНит . Предложен способ групповой очистки ц&ютолазного комплекса ТЯсЬэйегта гемес с использование»! гидфефоотой хроматографии на геле тойоперл (.'V/- 65Р

4. Врсзедек отбор экстремально термофильных анаэробных бактаркй по способности к биосинтезу, секреции и свойствам ^-голахто-зидаг. Обобрана нояад Са;:терия Апоегосейигп ¿Ьггпср!,14ип

пы., .^\<.,БаделОпная мз гейзероь Касатки, растущая 75° С к енц^лекная ранее как продуцент внеклеточних цмшмггз. Й.'уч°;к фвзико-хкмичеокие свойства в-гяльктозидаз шкемуов 42 " 45. Ёзрмекш обладаот высокой термстабильнсеты. З.Рдэга6;>та№-Особн очисеки ^з-галачыозЕДчз АгзкгоссПит УКег-¡¿срЬЦлг В ходе фракционпроьания показана субъеда.-дчнаи природа фрриенте., получен« свидетельства, что при рдечеде на субвэданй!^ происходил' с.;?о*ительная ик^ктизг^ил и дсп^Зилч-зация -гвлактос:ухаз.

СМ'-ОК ОПУБШЗЕЛаК Р.5ШГ

I. 'йсго'-ирпч- Д.*., Столбов* В,В. Баулина Т.Б., Озеодпветй В.А. вермо!*? базгеркк Апзсто^чИ-лгл У-,гггг.:рЬНит , Еыйоког:?гив:£1й в отношении кристаллической целлюлозы. // Тез. докл. ГП Всесоюзной конференции "£косиьг-ес Ць.г^аяоьы к других гокпонзктов клеточной стенки". Назялъ, 1990, с 135.

2. Еаулика Т.В., Столбова З.В., йкояисов Д.Ф. 5-лсокстеь-перагут^гй wpojws кристалл «еояой целяллооы, цгдзклазами экстремально терчофклы!з>; бактерии ^псегсса^игл -LhsrmtphUum , //Tea, докл. III Всесоюзной конференции "Екссиьтез цеяяпяозы и-других компонентов клето^.и'/. стенкк". Июанъ, 1990, с 105.

3. Екомирэв Д.&., Столбова 2.3., Баулина Т.В., Клесов A.A. Цзллвяаза И ^-галактсэидаза экстремально термофильных бЕЕтеркй. // Таз. докл. Бессоюзного симпозиума "Инженерная энзима логик", Москва, 1991, е. 25.

4. Ткхомироз Д.Ф., Столбова В.В., Ззудлна Т.В. Условия еы-покотемпературного ферментативного гидролиза целлюлозы в глюкозу. // Тез.. докл. Всесоюзной коференши "Химические превращения пйщевж голяиеров1', Светлогорск, Т9ЭТ, с. 34,

5. Тихомиров Д.Й., Ермакове Г.Н., Тихояровг. A.C., Еаулм-на Т.В,, Сурков A.A., Устинников Б.А. Активнсз оздоровлекле окружающей среды при получении и использовании профилактического продукта с бифидобак?ер:щми. // Тез. докл. Всесоюзной конференции "Достижения биотехнологии - агропромышленному комплексу", Черновцы, 1991, с. 189.

6. Тихомиров Д.Ф., Светличный В.А., Баулина Т.В. Биосинтез и свойства .р-галахтолидазы новой экстремально термофильной бактерии inae.roixelium ihernwpbúum . // Тез. докл. Всесоюзной конференции "Достижения биотехнологии - агропромышленному комплексу", Черновцы, 1991, с. Г42.

7. Тихомирова A.C., Ермакова Г.Н., Ъксмироэ Д.»., Баули-на Т.В. Роль-п-галактози,цаз'°; в биотехнологии получения профилактического кормового продукта, оздоравливаюцего окружанцую среду. // Тез. докл. Республиканской конференции "Разработка и внедрение высокоэффективных и ресурсосберегающих технологий в

АПК". Киев, T99I, с. 132.

8. Тихомирова А.С., Ермакова Г.Н., Тихомиров Д.З., Баули-на Т.В., Сурков А.А., Устинников Б.А. Активное оздоровление ок-ружшцей среда при получении и использовании профилактического продукта с бифидобактериямк. // Тез. докл. Республиканской кон-ферннщи "Разработка и внедрение высокоэффективных и ресурсосберегающих технологий в АПК". Киев, 1991, с. 132.

9. Tichomirow D.F., Baulina Т.К., Stolbowa V.V., Klyosow А. А, Thermally stable cellulases from extremely thermophilic bacterium 20 Meeting of FFBS, August 19-24, 1990, Budapest, Abstracts,

Ed.: FEBS Publ. Commitee. Budapest, Topreclam Ltd., 1990. p. 340.

10. Баулкна T.B., Светличный В.A., Тихомиров Д.й. Скрининг экстремально термофильных бактерий по секреции и свойствам _р-га-лактозидаз. // Тез. докл. 5 конференции Рос. федерации "Новые направления биотехнологии". Цущино, 1992 г., с.108.

11. Баудина Т.Н., Столбова Б.В., Светличный В.А., Тихомиров Д.$. Скрининг экстремально термофильных бгктери? по секреции и свойствам целлвлаз. //Тез. докл. 5 конференции Рос. федерации

" Новые направления биотехнологии". Цущино, 1992 г., с.109.