Адсорбционно иммобилизованные нокардиоморфные актиномицеты в биоремедиации нефтезагрязненных объектов

Самков, Андрей Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Адсорбционно иммобилизованные нокардиоморфные актиномицеты в биоремедиации нефтезагрязненных объектов
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Адсорбционно иммобилизованные нокардиоморфные актиномицеты в биоремедиации нефтезагрязненных объектов"

На правах рукописи

Самков Андрей Александрович

АДСОРБЦИОННО ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ НОКАРДИОМОРФНЫЕ АКТИНОМИЦЕТЫ В БИОРЕМЕДИАЦИИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ОБЪЕКТОВ

03.00.23 — биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Краснодар — 2009

003467047

Работа выполнена на кафедре генетики, микробиологии и биотехнологии Кубанского государственного университета

Научный руководитель: кандидат биологических наук, профессор

Карасёва Эмма Викторовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Шуб Геннадий Маркович доктор биологических наук, профессор Тихомирова Елена Ивановна

Ведущая организация:

Кубанский государственный технологический университет

Защита состоится « 29 » апреля 2009 г. в 13.00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (410049, г. Саратов, просп. Энтузиастов, 13)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН Автореферат диссертации размещён на сайте: http://www.ibppm.saratov.ru/obyav_dis.html

Автореферат разослан « » ^-¿¿¿ЕХ/'тг_2009 г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук

В. Е. Никитина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Загрязнение окружающей среды нефтепродуктами является одной из актуальных проблем современной экологии. Широчайшее применение нашли биологические методы ликвидации углеводородных загрязнений, основанные на метаболическом потенциале нефтеокис-ляющих микроорганизмов. Внесение в нефтезагрязнённый объект углеводо-родокисляющей микрофлоры, а также стимуляция естественных микроорга-низмов-биодеструкгоров позволяют полностью ликвидировать последствия таких загрязнений. Данные методики наиболее дёшевы и автономны, но весьма чувствительны к условиям среды и объекта очистки. Наукоёмкость биологических методов определяется необходимостью их адаптации к конкретным объектам и задачам биоремедиации.

В настоящей работе рассматриваются аспекты применения углеводородо-кисляющих актинобактерий, адсорбционно иммобилизованных на твёрдом носителе. Адсорбция клеток является специфическим методом изменения их свойств, прежде всего, метаболической активности и устойчивости к факторам внешней среды. В зависимости от используемого носителя, отклик иммобилизованной системы на различные факторы может значительно варьировать, что требует эмпирического подхода для выявления её преимуществ или недостатков. Биоаугментация, а также биостимуляция in vitro с использованием иммобилизованных клеток в настоящее время становятся перспективной альтернативой традиционным методам, основанным на внесении свободных клеток.

Важным условием, позволяющим реализовать преимущества иммобилизованной системы, является знание специфических условий её создания и функционирования, определяемых как общими закономерностями, так и особенностями конкретных компонентов биотехнологического производства. Ключевыми моментами являются подготовка для конкретного носителя биологического агента и максимально эффективная адсорбционная иммобилизация последнего. Испытания иммобилизованной системы в различных углеводо-родсодержащих субстратах раскрывают особенности функционирования адсорбированных микроорганизмов сравнительно со свободными.

Любой экотоп, в том числе нефтезагрязнённая почва, грунт или нефте-шлам, могут рассматриваться как естественная иммобилизованная система, характеризующаяся особым распределением микробиоты по поверхностям минеральных частиц, компонентов органического происхождения, а также по поверхности адсорбированного и эмульгированного в почвенном растворе углеводородного поллютанта. В связи с этим, использование нефтеокис-ляющих микроорганизмов, не только искусственно иммобилизованных на твёрдых носителях, но и свободных, и по сути, находящихся в состоянии сорбционного равновесия, затрагивает практические вопросы адсорбционной иммобилизации клеток.

Цель и задачи исследования.Целью исследования является увеличение эффективности технологии биоремедиации нефтезагрязнённых объектов с применением свободных и адсорбционно иммобилизованных но-кардиоморфных актиномицетов. Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1) количественно определить показатели адгезии и деструкционной активности штаммов в выборке музейных культур, выбрать критерии экспресс-отбора нефтеокисляющих микроорганизмов из состава профилированных коллекций для применения в биоремедиации в иммобилизованном виде;

2) исследовать связь конвективного переноса углеводородокисляющих актинобактерий с показателем гидрофобности клеток в различных условиях для оценки вертикального распределения и результативности интродукции неиммобилизованных культур родококков различной степени гидрофобности;

3) оптимизировать составы жидких минеральных питательных сред для увеличения продукции биомассы клеток нефтеокисляющих нокарди-оморфных актиномицетов;

4) оптимизировать условия адсорбционной иммобилизации на сорбент нефтепродуктов клеток углеводородокисляющих нокардиоморфных актиномицетов;

5) сравнить эффективности свободных и адсорбционно иммобилизованных клеток нефтеокисляющего родококка в ходе моделирования биоремедиации песка, почвы и воды, загрязнённых нефтепродуктами;

6) сравнить эффективности свободных и адсорбционно иммобилизованных клеток родококка в ходе полевых экспериментов по очистке загрязненного нефтепродуктами песчаного грунта и нефтезагрязнённой почвы.

Научная новизна. Проведённая комплексная оценка показателей гидрофобности, адгезии к твёрдому носителю, эффективности деструкции нефтепродуктов в выборке штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов позволила, с учётом морфотипа колоний, определить критерии экспресс-отбора культур для использования в иммобилизованном виде при биоремедиации. Впервые обнаружена зависимость конвективного переноса бактерий в почве и грунте от показателя гидрофобности клеток, а также присутствия углеводородного поллютанта. Высокая эффективность иммобилизованных клеток относительно свободных обнаружена при биоремедиации нефтезагрязнённых песка и песчаного грунта, характеризующихся интенсивным вымыванием внесенных микроорганизмов. При очистке нефтезагрязнённых почв снижение концентрации нефтепродуктов не зависело от иммобилизации бактерий. Оптимизированы составы жидких минеральных

сред, а также условия адсорбционной иммобилизации клеток нефтеокисля-ющих нокардиоморфных актиномицетов.

Исследование выполнено в соответствии со Всероссийской программой фундаментальных исследований «Проблемы общей биологии и экологии; рациональное использование природных ресурсов». Часть исследований проведена в рамках грантов ШТАБ 01 -2151 и РФФИ 06-04-96811.

Практическая ценность работы. Полученные данные используются в работах по биологической очистке и рекультивации нефтезагряз-нённых почв, грунтов, а также детоксикации нефтешламов, проводимых центром «Биотехнология» ГОУ ВПО КубГУ на территории ЮФО. Обработки нефтесодержащих отходов биомассой разных штаммов микроорганизмов-деструкторов осуществляются с учётом гидрофобности клеток и интенсивности их конвективного переноса, в зависимости от характеристик объекта. Апробированная в модельных и полевых условиях иммобилизованная система использована в качестве основы для нефтеокисляющего биопрепарата. Результаты исследований являются объектами авторского права и защищены двумя патентами РФ. Дополнительная заявка на изобретение, поданная на рассмотрение в ФИПС РФ, получила приоритет в 2007 г.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Показатель гидрофобности клеток и морфотип колоний на питательном агаре в совокупности могут быть взяты в качестве критериев экспресс-отбора штаммов из состава коллекций нефтеокисляющих микроорганизмов для интродукции в объект очистки в адсорбционно иммобилизованном на сорбент нефтепродуктов виде.

2. Интенсивность конвективного переноса микроорганизмов в почве и песке различна и зависит от показателя гидрофобности клеток, а также присутствия углеводородного поллютанта.

3. При глубинном культивировании на жидких минеральных средах оптимизированных составов продукция биомассы нефтеокисляющих нокардиоморфных актиномицетов штаммоспецифично возрастает при использовании в качестве основ сред дистиллированной, а также морской воды.

4. Условия адсорбционной иммобилизации нокардиоморфных актиномицетов на сорбент нефтепродуктов, включающие пониженное значение рНсреды иммобилизации и присутствие катионов алюминия штаммоспецифично обеспечивают увеличение показателя адгезии клеток.

5. Адсорбционно иммобилизованные клетки родококка эффективнее свободных при биоочистке нефтезагрязнённых песка, песчаного грунта и воды. В случае очистки нефтезагрязнённой чернозёмной и луговой глинистой почвы, эффективности иммобилизованных и свободных микроорганизмов сходны.

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на следующих конференциях, конкурсах, съездах и конгрессах: 6-я и 10-я Пущинские школы-конференции молодых учёных «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2002, 2006), второй и четвёртый съезды общества биотехнологов России им. Ю. А. Овчинникова (2004 и 2006), третий московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005), международная конференция «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005), Всероссийский смотр-конкурс научно-технического творчества «Эврика — 2005» (Новочеркасск, 2005), конкурс научных проектов студентов и аспирантов в области экологии «ЭкоЛогичные технологии» (Москва, 2005 г.), 2-я Всероссийская научная конференции молодых учёных и студентов «Современное состояние и приоритеты развития фундаментальных наук в регионах» (Краснодар — Анапа, 2005), международная школа-конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва—Пущино, 2006), 2nd FEMS congress of European microbiologists (Мадрид, 2006), конференции грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края «Юг России» (Краснодар — Агой, 2007), III международная конференция «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал «ICOMID 2008» (Пермь, 2008), конкурс научно-технического творчества молодежи «НТТМ — 2008» (Москва, 2008), российская школа-конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва — Пущино, 2008).

Публикации. По материалам исследований опубликовано 22 работы, из них 3 статьи, одна из которых в отечественном рецензируемом издании, рекомендованном ВАК РФ, 2 патента РФ, 17 тезисов российских, международных и зарубежных конференций.

Объём и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, описания проведённых исследований, выводов, заключения и приложений. Работа изложена на 153 страницах машинописного текста, содержит 26 рисунков, 16 таблиц, 5 приложений. Список литературы включает 232 наименования, в том числе 76 на иностранных языках.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В работе использованы пггаммы бактерий из коллекции кафедры генетики, микробиологии и биотехнологии КубГУ. Данные микроорганизмы были получены сотрудниками кафедры и центра «Биотехнология» в процессе многолетней НИР, связанной с выделением, учётом и идентификацией алканотрофных бактерий. Исследованные штаммы включали представителей родов Rhodococcus, Nocardia, Gordonia, Dietzia, Kocuria, Arthrobacter,

Micrococcus и др. Штамм, использовавшийся в полевых экспериментах, проверен на непатогенность в остром опыте на мышах и депонирован в В КМ.

Питательные среды и условия культивирования. Микроорганизмы выращивали на питательном агаре, жидкой минеральной среде состава (г/л): KN03 — 4; Na2HP04*12H20 — 1,4; КН2Р04 — 0,6; MgS04*7H20 — 0,8. В экспериментах по оптимизации состава питательной среды варьировали соотношение элементов исходного варианта. В качестве единственного источника углерода и энергии в жидкой минеральной среде использовали гексадекан (ЧДА), мазут, сырую нефть, дизельное топливо. Культивирование осуществляли при комнатной температуре на орбитальных качалках. Для выявления микроорганизмов-интродуцентов использовали комплекс кулыурально-морфологических признаков и селективные среды с антибиотиками.

Многофакторные эксперименты. Эксперименты ставили по схеме полного факторного эксперимента (ПФЭ) с двухуровневым варьированием факторов, с последующей серией экспериментов по методике крутого восхождения на основе полученных в ПФЭ коэффициентов регрессии.

Определение показателя адгезии клеток. Адгезивную активность определяли из разницы концентрации клеточной биомассы до и после инкубации с носителем. Показатель адгезии (%) определяли как процент убыли биомассы клеток из суспензии после инкубации с носителем с учётом контроля. Концентрацию биомассы измеряли гравиметрически. Среда иммобилизации — фосфатный буфер.

Моделирование конвективного переноса микробных клеток. Стеклянные колонки заполняли высушенным до абсолютно сухого веса и просеянными через сито грунтом, интактным, либо загрязнённым нефтью. В колонках устанавливали постоянный напор дистиллированной воды. Суспензию исследуемых клеток вносили единовременно в объёме жидкости, равном объёму порового пространства содержимого колонки (такту), после чего снова включали подачу дистиллированной воды и регулярно отбирали пробы образующегося фильтрата. На основании динамики OD670 фильтрата, строили выходные кривые, отражающие зависимость OD/ODg— отношения оптической плотности порции фильтрата к OD исходной суспензии клеток, внесённой в колонку, от количества пропущенной через керн воды. На основании выходных кривых судили о динамике прохождения микробных клеток через грунт.

Лабораторное моделирование биодеградации нефтепродуктов. В стеклянные стаканы помещали навески отмытого песка или чернозёмной почвы, высушенных до абсолютно сухого веса, либо воды. В стаканы внесли аликвоты нефтепродуктов: сырой нефти или мазута. При инокуляции свободные и иммобилизованные на сорбенте нефтепродуктов

клетки нефтеокисляющего микроорганизма вносили до достижения засев-ной концентрации 106 КОЕ/г. В песок и почву вносили растворы биогенных элементов. Инкубировали при 30 °С в термостате. Влажность почвы и песка поддерживали на уровне 60 % от предельной влагоёмкости дистиллированной водой. Культивирование вели 90 либо 180 суток.

Полевые эксперименты. В качестве объекта очистки in situ использовали луговую глинистую почву, загрязнённую нефтью, а также песчаный грунт (содержание песка более 90 %), загрязнённый нефтепродуктами. Инокулировали свободными, а также иммобилизованными клетками нокар-диоморфного актиномицета до достижения в обрабатываемом объёме неф-тесодержащих отходов титра 106 КОЕ/г. Регулярно проводили рыхление и увлажнение (дренаж) объёма отходов. Концентрации биогенных элементов под держивали на постоянном уровне. Длительность эксперимента составляла 3 месяца.

Математическая обработка результатов.Математическуюобработку результатов осуществляли с использованием пакетов StatSoft Statistica 5.5,6.0 и Microsoft Office Excel 2003. При определении достоверности, принимали уровень значимости 5 %.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Отбор штаммов для внесения в иммобилизованном виде в объект биологической очистки

Оперативное использование нефтеокисляющих микроорганизмов в иммобилизованном виде при биостимуляции in vitro и биоаугментации на первичном этапе требует предварительного отбора культур. Изоляты должны обладать способностью к адсорбционной иммобилизации на гидрофобный носитель и высокой деструкционной активностью по отношению к нефтепродуктам.

Для определения оптимального алгоритма отбора микроорганизмов, выборка штаммов была параллельно исследована по двум группам признаков:

- непосредственные измерения показателя адгезии клеток и процента деградации жидких нефтепродуктов в минеральной среде;

- учёт дополнительных признаков: показателя гидрофобности клеток и морфотипа микробных колоний на питательном агаре.

Использование для отбора первой группы признаков, непосредственно отражающих способность микроорганизмов к адгезии и деструкции, выявило недостатки, лишающие оперативности лабораторный этап работ по биоочистке. В том числе: общая длительность и трудоёмкость измерения технологически важных признаков, низкая вероятность одновременного совпадения высоких значений нескольких признаков для одного штамма.

Была обнаружена положительная корреляция показателей гидрофобно-сти и адгезии клеток (г = 0,36 (р<0,05)). Морфотип колоний разделил исследуемую выборку изолятов на В.-, Б- и М-штаммы (16, 72 и 12 % соответственно). Показатель гидрофобности коррелировал с показателем деструкции мазута, для Л-штаммов — отрицательно (г^ = -0,75), для М-штам-мов — положительно (г = 0,84). Для 5-штаммов корреляция отсутствовала. Отмечена высокая положительная корреляция показателей деструкции мазута и дизельного топлива.

На этом основании, была предложена альтернативная схема экспресс-отбора штаммов, включающая измерение показателя гидрофобности клеток, выращенных на питательном агаре (измерение проводится в течение 1,2—1,5 часа) и анализ морфотипа колоний на указанной среде. Для осуществления экспресс-отбора имеющуюся выборку нефтеокисляющих микроорганизмов ранжируют по признаку показателя гидрофобности клеток. Если обладающий наибольшим показателем гидрофобности микроорганизм имеет или М-морфотип колоний, то его используют для иммобилизации без каких-либо дальнейших анализов.

Если обладающий наибольшим показателем гидрофобности штамм имеет /{-морфотип колоний, то его дополнительно проверяют на способность к деструкции высокомолекулярных углеводородов путём культивирования на жидкой минеральной среде с мазутом в качестве единственного источника углерода и энергии. Степень деструкции мазута данным штаммом сравнивают с аналогичным параметром, измеренным для одного микроорганизма с 5- либо М-типом колоний, обладающим наибольшим показателем гидрофобности клеток среди всех микроорганизмов с или М-типом колоний в имеющейся выборке. Для иммобилизации выбирают тот из двух штаммов либо К.-, либо М- (5-) типа, который способен к деградации мазута в большей степени. Описанный метод позволяет ограничить скрининг штаммов быстрым комплексным измерением показателя гидрофобности и учётом морфотипа колоний, ускоряя и удешевляя отбор. Упрощенный отбор позволяет быстро варьировать состав микроорганизмов, вносимых в иммобилизованном виде в зависимости от условий среды и особенностей конкретного объекта очистки.

2. Взаимосвязь конвективного переноса углеводородокисляющих микроорганизмов с показателем гидрофобности клеток

При интродукции неиммобилизованных нефтеокисляющих микроорганизмов в почву или грунт, естественное вертикальное распределение бактерий определяет колонизацию ими того или иного объёма нефтесодержащего субстрата и, тем самым, эффективность биодеструкции поллютанта. В работе использовали штамм Шюйососст егу&юроШ Р1, обладающий показа-

телем гидрофобности клеток, близким к среднему по исследованной выборке значению — 24 %, а также культуру с максимальным обнаруженным значением показателя — 88 % — ЯЪо^соссш 5р. №.

Графики зависимости относительной оптической плотности фильтрата клеточных суспензий от числа тактов (количества пропущенной через колонку воды, выраженной в объёмах порового пространства керна), отражающие динамику вымывания клеток при конвективном переносе микроорганизмов через содержимое колонки (интакгные или нефтезагрязнённые песок и почву), приведены на рисунках 1 и 2, где (Ю/СЮ0 — отношение оптической плотности порции фильтрата к СЮ исходной суспензии клеток, внесённой в колонку.

такт, условные единицы

-■♦-••ГОтобососсиз егуИтороИз И, интактиый песок —■— РЬос1ососсиз ер. ив, интактный песок -■А--Июс1ососси8 егуШгороПэ Р1, нефгезагрязненный песок —•— №ос)ососси8 вр. ив, нефгезагрязненный песок

Рисунок 1 — Динамика вымывания (выходные кривые) клеток при конвективном переносе микроорганизмов через песок

На миграцию клеток непосредственно влияло присутствие углеводородов в керне: перенос микробных клеток как ЯИос1ососс№ егуЛгороШ /7, так и Шюйососст яр. № в нефтезагрязнённых песке и почве происходил более интенсивно по сравнению с незагрязнёнными образцами. Исключением яв-

0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 2,2 2,4 2,6 2,8 3 3,2 3,4

такт, условные единицы

ГОгайососсиз егуМгоройз Я1, интактый чернозем —■—^юЛхюссиз ер. и8, интактный чернозем

йюйососсиз егуНтороКэ Р1, нефтезагрязненный чернозем —•— ГОгаскзсоссиз эр. и8, нефтезагрязненный чернозем

Рисунок 2 — Динамика вымывания (выходные кривые) клеток при конвективном переносе микроорганизмов через почву

ляется динамика выноса клеток Шойососсия егуЛкгороИз ¥1 из нефтезагряз-нённого и интакгного песка, где сходство выходных кривых объясняется общей малой адгезией данного штамма на частицах содержимого колонки. Вымывание микроорганизмов из песка происходило более активно, чем из почвы.

Увеличение вымывания клеток при загрязнении чернозёмной почвы и песка сырой нефтью может быть связано с распределением углеводородов по поверхности почвенных микроагрегатов, в результате чего агрегатная по-розность не смогла обеспечить клетки сайтами адгезии. Конвективный перенос микроорганизмов, в этом случае, происходил исключительно в межагрегатном поровом пространстве, причём большая скорость переноса препятствовала адгезии клеток.

Кроме того, углеводородное загрязнение почвы или грунта вызывает экранирование гидрофильных сайтов адгезии, а также общую гидрофобизацию поверхности. В результате, лишь наиболее гидрофобный штамм Шойососст вр. обладающий показателем гидрофобности, равным 88 %, был способен к иммобилизации в нефтезагрязнённом содержимом колонки.

Обнаружено влияние степени гидрофобности клеток на их перенос в поровом пространстве колонок. Отмечено практически полное вымывание из загрязнённых нефтью песка (на 97,6 %) и почвы (на 94,1 %) низкогидрофобных клеток Шойососст егуЛюроШ Р1. Вымывание клеток высокогидрофобного штамма Юю<1ососст яр. имеющего показатель гидрофобности— 88 %, в аналогичных условиях составило соответственно 33,5 и 38,6 %. В случае незагрязнённых нефтью интактных песка и почвы, клетки гидрофобного штамма Шо(1ососс№ яр. № также вымывались в наименьшей степени.

Таким образом, использование клеток Шодососст егуЛпъроИй П в условиях конвективного переноса обеспечивает высокую подвижность биомассы. С одной стороны, это позволяет осуществлять обработки нефтезаг-рязненной почвы на большую глубину (увеличение объемов одновременно обработанных нефтесодержащих отходов, удаление вносимых микробов от иссушаемого и перегреваемого в климатических условиях ЮФО РФ поверхностного слоя почвы или грунта). С другой — приводит к большим потерям клеток при обработке ими нефтезагрязнённого песка. Использование высокогидрофобных клеток Я1гос1ососсж хр. /8 лишь частично решает проблему миграции клеток нефтеокисляющих микроорганизмов из зоны углеводородного загрязнения. Следовательно, применение препаратов в виде суспензий клеток микроорганизмов-деструкторов может быть малоэффективно в условиях, способствующих их интенсивному конвективному переносу, например, при биоремедиации увлажняемого нефтезагрязнённого песчаного грунта.

3. Оптимизация составов жидких питательных сред для наработки биомассы нокардиоморфных актиномицетов

Концентрации основных биогенных элементов жидкой питательной среды: С,МнР варьировали на двух уровнях согласно схеме полного факторного эксперимента (ПФЭ) 23. При культивировании штамма Мюйососст егу1Ьгоро1'и П на восьми опытных вариантах сред были получены два уравнения регрессии, различающиеся используемой в полных факторных экспериментах для растворения солей водной основой: дистиллированной или натуральной морской водой (соответственно, уравнения 1,2), где хг х2 ¿с3 — факторы [С], |7У] и [Р] соответственно. Функция отклика^ — концентрация биомассы (абсолютно сухой вес).

3^=1,81+0,9975^+0,5375^ (1)

1,1189+0,194^-0,369х2-0, 169^+0,394х3+0,219x^-0,119x^+0,181 х^ (2)

На основании коэффициентов регрессии при линейных членах уравнений были определены составы сред экспериментов по крутому восхождению,

концентрация биомассы, г/л

Рисунок 3 — Продукция биомассы (абсолютно сухой вес) нефтеокисляю-щими микроорганизмами при росте на минеральной среде оптимизированного состава на дистиллированной воде

концентрация биомассы, г7л

Рисунок 4 — Продукция биомассы (абсолютно сухой вес) нефтеокисляю-щими микроорганизмами при росте на минеральной среде оптимизированного состава на основе морской воды

показавших оптимальные для штамма КУюйососст егуМгороНя П соотношения элементов среды. Проверка показала эффективность применения разработанных сред для культивирования других представителей нокардиоморф-ных акгиномицетов, в том числе и при использовании дизельного топлива в качестве дешевого альтернативного источника углерода и энергии (рис. 3,4).

4. Оптимизация условий адсорбционной иммобилизации клеток нокардиоморфных актиномицетов на носителе

При использовании плана полного факторного эксперимента 23, в качестве факторов были взяты рН среды иммобилизации, концентрация А13+ и продолжительность инкубации носителя-сорбента нефтепродуктов в суспензии клеток. Для пределов варьирования факторов на двух разных штаммах родококков было эмпирически проверено отсутствие бактерицидного и бак-териостатического действия условий иммобилизации, а также снижения уг-леводородокисляющей активности. Соотношение клеток и носителя было определено из эмпирически полученной для штамма Шойососст егуЖгороШ Р1 изотерме адсорбции (рис. 5) и соответствовало предположительно моно-слойной адсорбции. Было получено следующее уравнение регрессии (3), где хг х2Гх} — факторы рН, [А13+] и время инкубации соответственно. Функция отклика у—концентрация биомассы.

С', мг/г

С, г/л

С — равновесная концентрация клеточной биомассы в растворе, С' — количество иммобилизованной биомассы на единицу массы сорбента Рисунок 5 — Изотерма адсорбции клеточной биомассы на носителе

у=26,37-8,64^,-7,08x^+4,10^,^+4,03х2+2,95х,х2-1,73х3

(3)

На основании коэффициентов уравнения было определено направление и шаг дальнейшего варьирования факторов в эксперименте по крутому восхождению, определившему оптимальные условия адгезии клеток. При оптимальном в рамках данного факторного эксперимента сочетании факторов удалось увеличить процентную долю адгезирующихся клеток с 34,8 до 49,2 %. Обнаруженные условия адгезии позволили штаммоспецифично увеличить показатель адгезии других нокардиоморфных актиномицетов, обладающих разными показателями гидрофобности (рис. 6).

ЯЛойососсиз яр. J12 Согс!оп<а 5р. 2 4 ЯЬо(1ососси$ 5р В 4 Сойота вр 13 Р.Ьобососсив вр..] 8

| > адгезия в неогпимизированных условиях Е^ адгезия в оптимизированных условиях —А—ПГ

Рисунок 6 — Адгезия нокардиоморфных актиномицетов в зависимости условий иммобилизации и показателя гидрофобности клеток

от

5. Моделирование биоочистки песка и черноземной почвы свободными и иммобилизованными клетками родококка в лабораторных условиях

В случае очистки нефтезагрязнённой чернозёмной почвы (горизонт А,/Апах) иммобилизованные и свободные клетки, внесенные в равном количестве, обеспечили одинаковое снижение концентрации нефтепродуктов (рис. 7). В случае же очистки песка, внесение иммобилизованных клеток обусловило снижение концентрации нефтепродуктов на 42,3 %, в то же время внесение

-биосорбент -суспензия клеток -контроль -сорбент без клеток

месяцы

Рисунок 7 — Динамика содержания нефтепродуктов в загрязнённой чернозёмной почве

клеток в виде суспензии — на 25,2 % при прочих равных условиях (рис. 8). Таким образом, преимущество иммобилизованных систем зависело от физических показателей очищаемых субстратов. После трех месяцев культивирования изоляты интродуцированного микроорганизма с использовани-

-биосорбент -суспензия клеток - контроль -сорбент без клеток

Рисунок 8 — Динамика содержания нефтепродуктов в загрязнённом песке

ем маркерного комплекса признаков устойчивости к антибиотикам были обнаружены в почве, обработанной как иммобилизованными, так и свободными клетками Ююйососсш егуМгороШ П.

В нефтезагрязнённом песке интродуцент был обнаружен только в случае внесения микроорганизмов в иммобилизованном виде. При биоочистке загрязнённого нефтью песка более низкая, по сравнению с иммобилизованными клетками, эффективность неиммобилизованных клеток ЮюсЗососсги егу^гороИь Р1 может быть связана с высокой интенсивностью конвективного переноса данного микроорганизма. Аналогичная картина имела место при моделировании биоочистки замазученного песка (рис. 9).

г/кг

35# биосорбент

^■ суспензия клеток

^^А контроль

• сорбент без клеток

20 15 10 5 0

месяцы

Рисунок 9 — Динамика содержания нефтепродуктов в загрязнённом

мазутом песке

Таким образом, использование родококков, иммобилизованных на сорбенте, является перспективным способом очистки песка, загрязнёенного углеводородными поллютантами. Гидродинамические свойства песка определяют интенсивный перенос незакрепленных микробных клеток током влаги. Недостаток в песке отрицательно заряженных сайтов адгезии, в случае почвы обеспечиваемых гуматами, а также микропор необходимого размера обусловливает затруднение колонизации поверхности адсорбированных углеводородов бактериями-деструкторами. Наиболее интенсивно вымываются штаммы с невысокой гидрофобностью, в связи с чем, их использование для биоремедиации песка или песчаного грунта возможно исключительно в иммобилизованном виде.

6. Биодеградация нефти в воде свободными и иммобилизованными клетками .Кйо^ососси« егуЖгороШ ¥1

В лабораторных условиях моделировали биодеградацию нефтяного слика на поверхности пресной, а также морской воды. Вносили клетки в иммобилизованном виде либо в суспензии. Поскольку моделировали открытую систему — водный биоценоз, характеризующийся невозможностью увеличения концентрации биогенных элементов в очищаемом объеме жидкости, источники биогенных элементов не вносили. Результаты измерения концентрации нефтепродуктов после инкубации системы в течение 2 месяцев приведены на рисунке 10.

50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

1—

------V - £ - и

£ 11 I-

; 1

■ 1

□ иммобилизованные клетки вэ свободные клетки

□ носитель без клеток ■ контроль

морская вода

пресная вода

Рисунок 10 — Деградация углеводородов нефти штаммом Ккос1ососс№ егу^гороШ Р1 в водной среде

Как в пресной, так и в морской воде внесение иммобилизованных клеток обеспечило более высокую степень деструкции нефти по сравнению с планктонными клетками. Носитель клеток в данном случае играл роль не только сорбента нефтепродуктов, нарушившего целостность слика и восстановившего газовый режим, но и источника биогенных элементов. Среда иммобилизации, в которой происходила адсорбция клеток для получения иммобилизованной системы, представляла собой раствор комплексного минерального удобрения и за счет остаточных концентраций солей И,Р,К и др. в сорбенте обеспечивала частичное снабжение клеток после интродукции.

3.8 Испытание иммобилизованной системы в ходе полевых экспериментов

Снижение концентрации углеводородов в глинистой луговой почве (горизонт А), загрязнённой нефтью в результате аварии, в зависимости от способа обработки, показано на рис. 11. В качестве биологического агента были взяты клетки Якос/ососсиз егуМгороНз Р1, свободные и иммобилизованные на сорбенте нефтепродуктов. В качестве сорбента без клеток брали носитель, обработанный средой иммобилизации, не содержащей бактерий.

иммобилизованные свободныеклепси сорбент без клеток клетки

контроль

Рисунок 11 — Концентрации остаточных углеводородов в зависимости от способа обработки луговой глинистой почвы, загрязнённой нефтью

В условиях луговой глинистой почвы, очистка от нефти осуществлялась с одинаковой интенсивностью с использованием как иммобилизованных, так и свободных (внесённых в суспензии) клеток. Ключевым моментом в данном случае являлось внесение клеточной биомассы, вне зависимости от способа. Титр общей гетеротрофной микрофлоры загрязнённой почвы до обработки составил 7*10б КОЕ/г, нефтеокисляющей — 5*10" КОЕ/г. За время, прошедшее с момента разлива нефти, токсичные летучие фракции нефти подверглись выветриванию, физико-химическому и биологическому разрушению, за счёт чего было снижено угнетение естественной микробиоты. Это подтверждается значениями общего микробного числа и титра нефте-окисляющих микроорганизмов в интактном соседнем участке аналогичной почвы (этого же биогеоценоза), не подвергшемся заражению нефтью при разливе — 2* I О7 и 104 КОЕ/г соответственно. Таким образом, при очистке нефтезагрязнённой глинистой луговой почвы, характеризующейся высоким титром собственной гетеротрофной, в том числе углеводородокисляющей

микрофлоры, низкой интенсивностью конвективного переноса интродуци-руемых клеток, присутствием растительных остатков, сорбирующих нефть, эффективность применения свободных и иммобилизованных клеток одинакова.

Снижение концентрации нефтепродуктов в загрязнённом углеводородами песчаном грунте показано на рис. 12. Условия эксперимента были аналогичны таковым при очистке нефтезагрязнённой луговой почвы. Максимальная разница в остаточных концентрациях углеводородов между вариантами опытов, где использовались иммобилизованные и свободные клетки была зафиксирована после истечения полутора месяцев эксперимента (4,9 и 17,0 г/кг соответственно), что показывает значительную разницу в скорости биодеструкции поллютанта. После трёх месяцев эксперимента, при использовании иммобилизованных систем было отмечено уменьшение концентрации углеводородов в грунте на 80,1 %. Остаточная концентрация составила 4,71 г/кг. Использованный параллельно способ обработки, основанный на интродукции суспензии клеток деструктора, позволил снизить содержание поллютанта до 8,28 г/кг за три месяца. Иммобилизованные клетки 7?/го<^ососсш егуМгороШ Р1 обеспечили снижение концентрации углеводородов до 4,9 г/кг практически вдвое быстрее, т.е. за 1,5 месяца.

II!

а й|

1 I

1Р ЗИй

■исходное И1,5 месяца □ 3 месяца

иммобилизованные свободные клетки сорбент без клеток клетки

контроль

Рисунок 12 — Концентрации остаточных углеводородов в зависимости от способа обработки нефтезагрязненного песчаного грунта

Микробиологические анализы нефтезагрязненного песчаного грунта, сделанные до начала очистки, показали низкий титр гетеротрофной (104 КОЕ/г), в том числе нефтеокисляющей микрофлоры — не более 103 КОЕ/г. После комплекса мероприятий по биологической детоксикации, ключевым элементом которого являлась биоаугментация посредством внесения Ккойососст егуЛгороИв П, титр нефтедеструкторов варьировал в пределах 10б— 107 КОЕ/г. Это, наряду со снижением концентрации нефтепродуктов в грун-

те, говорит о формировании и функционировании в данном биоценозе пула нефтеокисляющих микроорганизмов.

Таким образом, применение описанной иммобилизованной системы в биоремедиации загрязнённых нефтепродуктами песчаных грунтов позволяет увеличить эффективность микробиологического метода очистки нефте-загрязнённых объектов.

ВЫВОДЫ

1. Показатель гидрофобности выращенных на питательном агаре клеток и морфотип колоний соответствующих штаммов при росте на данной среде в совокупности могут быть использованы в качестве критериев экспресс-отбора штаммов из состава коллекций нефтеокисляющих микроорганизмов для применения в биоремедиации с использованием адсорбционной иммобилизации на сорбент.

2. Обнаружено, что конвективный перенос током влаги неиммобили-зованных на носителе микроорганизмов в почве и песке различен и зависит от показателя гидрофобности клеток, а также присутствия нефтепродуктов.

3. Получены новые составы жидких минеральных сред для наработки клеточной биомассы нефтеокисляющих нокардиоморфных актиноми-цетов, штаммоспецифично увеличивающие выход биомассы в 2,2—5,0раз при использовании дистиллированной воды (по сравнению с исходной средой увеличены концентрации источников углерода и азота) и в 2,2— 7,4 раза — при морской (увеличены концентрации источников углерода и фосфора).

4. Выявлены оптимальные условия адсорбционной иммобилизации клеток нефтеокисляющих нокардиоморфных актиномицетов на гидрофобный носитель, требующие пониженного значениярН(5,4), присутствия катионов АР* в концентрации 51,3 мг/л и обеспечивающие штаммоспецифичное увеличение показателя адгезии клеток в 1,5—14,1 раза. Инкубация в среде иммобилизации не ингибировала микробный рост и катаболизм углеводородов.

5. В случае очистки нефтезагрязнённых чернозёмной и глинистой луговой почвы эффективности очистки с использованием иммобилизованных и свободных клеток нокардиоморфных актиномицетов сходны.

6. Адсорбционная иммобилизация клеток Яйо^ососсг« егуЧкгороШ Р1 на носитель-сорбент для сбора нефтепродуктов обеспечивает более высокую скорость и величину снижения концентрации углеводородов по сравнению со свободными клетками при очистке нефтезагрязнённых песка, песчаного грунта и воды.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи:

1. Самков А. А. Применение иммобилизованных систем нефтеокис-ляющих микроорганизмов нефтеокисляющих микроорганизмов для ликвидации углеводородного загрязнения песчаного грунта / А.А. Самков // Экологичные технологии: Сб. науч. статей победителей конкурса. —М., 2005,—С. 67—73.

2. Самков А. А. Взаимосвязь конвективного переноса нефтеокисляющих микроорганизмов с показателем гидрофобности клеток и эффективностью биоремедиации / А. А. Самков, Э. В. Карасёва// Биотехнология. — 2007, — №4, — С. 69—75.

3. Карасёва Э. В. Микробиологический подход к реабилитации экосистем, загрязнённых нефтепродуктами и отходами бурения при проведении буровых работ на морском шельфе / Э. В. Карасёва, С. Г. Карасёв, С. М. Сам-кова, В. В. Гора, Н. Н. Волченко, А. А. Самков, И. Е. Головина // Наука Кубани,—2008.—№ 1,—С. 14—19.

Патенты:

1. Патент на изобретение №2311237 РФ. — Способ микробиологической очистки нефтяных шламов и загрязнённого нефтепродуктами грунта (варианты). — Э. В. Карасёва, А. А. Самков, Н. Н. Волченко, С. Г. Карасёв,

A. А. Худокормов. —Приоритет от 02.05.06. Опубл. 27.11.2007. —Бюл. 33.

2. Патент на изобретение № 2317162 РФ. — Препарат для микробиологической очистки нефтяных шламов и загрязнённого нефтепродуктами грунта. — Э. В. Карасёва, А. А. Самков, С. Г. Карасёв, В. Ю. Сычёв. —Приоритет от 02.05.06. — Опубл. 20.02.2008. — Бюл. 5.

Тезисы:

1. Самков А. А. Бактериальная деградация мазута в присутствии углеводородного косубстрата / А. А. Самков // Биология — наука XXI века: Сб. тез. 6 Междунар. шк.-конф. — Пущино, 2002. — С. 56.

2. Волченко Н. Н. К вопросу о локализации микробных поверхностно-активных веществ углеводородокисляющей бактерии Шюйососсив егу(кгороШ /У / Н. Н. Волченко, А. А. Самков // Процессы и явления в конденсированных средах: Матер, науч.-практ. конф. —Краснодар, 2004. — С. 205—210.

3. Самков А. А. Продукция биомассы и показатель гидрофобности штамма Rhodococcш егуМгороШ ¥1 на средах различного состава / А. А. Самков, Н. Н. Волченко // Матер. 2-го съезда общ-ва биотехнологов России им. Ю. А. Овчинникова. — М., 2004. — С. 133—134.

4. Карасёва Э. В. Адгезия нефтеокисляющих микроорганизмов на твёрдых носителях / Э. В.Карасёва, А. А. Самков, И. Б. Ившина, М. С. Куюкина,

B. И. Лозинский, Г. А. Коваленко, 1 РЫ1р// Биотехнология: состояние и пер-

спективы развития: Третий Московский международный конгресс. — М., 2005. — С. 27.

5. Самков А. А. Отбор штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов для биоактивации нефтяного сорбента // Эврика 2005: Матер. Всерос. смотра-конкурса / А. А. Самков, О. А. Швец, Э. В. Карасёва. — Новочеркасск, 2005. —С. 113—117.

6. Самков А. А. Сравнение деструкции углеводородов свободными и иммобилизованными клетками нефтеокисляющих микроорганизмов / А. А. Самков, И. Е. Гирич, Э. В. Карасёва // Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды: Матер.междунар. конф. — Саратов, 2005. — С. 48.

7. Швец О. А. Анализ адгезивной и деструкционной активности выборки штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов / О. А. Швец, А. А. Самков // Тр. 2-й Всерос. науч. конф. молодых учёных и студентов. — Краснодар, 2005. — Т. 1. — С. 97—98.

8. Карасёва Э. В. Биологическая реабилитация земель, загрязнённых нефтепродуктами, в условиях Южного федерального округа / Э. В. Карасёва, А. А. Худокормов, Н. Н. Волченко, А. А. Самков, С. Г. Карасёв // Матер. 4-го съезда общ-ва биотехнологов России им. Ю. А. Овчинникова. — М., 2006, —С. 93—94.

9. Самков А. А. Показатель гидрофобности клеток в отборе штаммов-деструкторов при биостимуляции in vitro / А. А. Самков, Н. Н. Волченко, Э. В. Карасёва // Матер. 4-го съезда общ-ва биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. — Москва, 2006. — С. 225—226.

10. Самков А. А. Взаимосвязь миграции нефтеокисляющих микроорганизмов в интактном и нефтезагрязнённом песке и почве с эффективностью биоремедиации / А. А. Самков, Э. В. Карасёва // Генетика микроорганизмов и биотехнология: Тез. междунар. шк.-конф., посвящ. 100-летию со дня рожд. С. И. Алиханяна. — М., 2006. — С. 203—205.

11. Швец О. А. Оптимизация условий адгезии клеток Rhodococcus erythropolis F1 методом полного факторного эксперимента / О. А. Швец,

A. А. Самков, Э. В. Карасёва// Биология — наука XXIвека: Сб тез. 10 Междунар. шк.-конф. — Пущино, 2006. — С. 460.

12. Карасёва Э. В. Разработка проекта регламента работ по микробиологической ликвидации загрязнений нефтепродуктами и отходами бурения при проведении буровых работ на морском шельфе / Э. В. Карасёва,

B. В. Гора, С. Г. Карасёв, А. А. Самков, Н. Н. Волченко, С. М. Самкова//Юг России: Сб. тез. конф. грантодержателей регионального конкурса РФФИ и админ. Краснодарского края. —Краснодар, 2007. — С. 142—144.

13. Карасёва Э. В. Восстановление микробного биоразнообразия в процессе рекультивации нефтезагрязнённых почв / Э. В. Карасёва, А. А. Худо-

кормов, С. Г. Карасёв, Н. Н. Волченко, А. А. Самков, Н. Ю. Алёшина//Естественные и инвазийные процессы формирования биоразнообразия водных и наземных экосистем: Тез. докл. междунар. науч. конф.—Ростов н/Д, 2007. — С. 150.

14. Карасёва Э. В. Биологическая реабилитация нефтезагрязнённых почв и детоксикация нефтешламов в Южном федеральном округе / Э. В. Карасёва, А. А. Худокормов, А. А. Самков, Н. Н. Волченко, С. Г. Карасёв // Биоресурсы, биотехнологии, экологически безопасное развитие регионов Юга России: Матер, междунар. конф. — Астрахань, 2007. — С. 81—83.

15. Самков А. А. Иммобилизованный биопрепарат с возможностью варьирования входящих в его состав штаммов / А. А. Самков, Н. Н. Волченко, А. А. Худокормов, С. М. Самкова, Э. В. Карасёва // Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал «ICOMID 2008»: Матер. III междунар. конф. — Пермь, 2008. — С. 86—87.

16. Карасёва Э. В. Биологическое разнообразие и биотехнологический потенциал углеводородокисляющих микроорганизмов коллекции Кубанского государственного университета/ Э. В. Карасёва, Н. Н. Волченко, И. Е. Ги-рич, В. В. Гора, С. Г. Карасёв, А. А. Самков, С. М. Самкова, А. А. Худокормов // Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал «ICOMID 2008»: Матер. III междунар. конф. — Пермь, 2008. — С. 47—48.

17.KarasevaE. V. Forming ofstable bacterial community in oil sludges exposed to biological purification / E. V. Karaseva, A. A. Khudokormov, I. E. Girich, A. A. Samkov, N. N. Volchenko // Abstracts book of 2-nd FEMS congress of European microbiologists. — Madrid, 2006. — P. 167.

САМКОВ АНДРЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

АДСОРБЦИОННО ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ НОКАРДИОМОРФНЫЕ АКТИНОМИЦЕТЫ В БИОРЕМЕДИАЦИИ НЕФТЕЗАГРЯЗН ННЫХ ОБЪЕКТОВ

Автореферат

Подписано в печать 24.03.2009. Формат 60x84 716. Бумага тип. № 1. Тираж 100 экз. Заказ № 633 от 25.03.09.

Кубанский государственный университет 350040, г. Краснодар, ул. Ставропольская, 149

350040, г. Краснодар, ул. Ставропольская, 149, Центр «Универсервис», тел. 21-99-551

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Самков, Андрей Александрович

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАНЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Способы и механизмы иммобилизации микробных клеток.

1.2 Факторы, определяющие адгезию микроорганизмов.

1.3 Влияние адсорбционной иммобилизации микробных клеток на их. физиологию и метаболическую активность.

1.4 Биоремедиация загрязненных нефтепродуктами объектов с использованием иммобилизованных и свободных нефтеокисляющих микроорганизмов.

1.5 Актинобактерии в биоремедиации нефтезагрязненных объектов.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Бактериальные штаммы.

2.2 Носитель для адсорбционной иммобилизации клеток.

2.3 Питательные среды, субстраты, реактивы.

2.4 Культивирование микроорганизмов на жидких минеральных средах

2.5 Многофакторные эксперименты.

2.5.1 Оптимизация состава питательной среды для получения биомассы.

2.5.2 Оптимизация условий адгезии клеток.

2.6 Определение концентрации биомассы при культивировании на жидкой питательной среде.•.

2.7 Определение показателя гидрофобности клеток.

2.8 Моделирование конвективного переноса микробных клеток.

2.9 Определение показателя адгезии клеток.

2.10 Лабораторное моделирование биодеградации нефтяного слика в воде

2.11 Лабораторное моделирование биодеградации нефтепродуктов в песке и почве.

2.12 Количественные химические анализы.

2.12.1 Количественный анализ нефтепродуктов.

2.12.2 Количественный анализ аммонийного и нитратного азота.

2.12.3 Количественный анализ фосфора.

2.13 Микробиологические анализы.

2.13.1 Определение численности общей гетеротрофной микрофлоры.

2.13.2 Определение численности нефтеокисляющих микроорганизмов.

2.13.3 Определение спектра устойчивости к антибиотикам.

2.14 Испытания углеводородокисляюгцей культуры на безвредность.

2.15 Математическая обработка результатов'.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Отбор нефтеокисляющих микроорганизмов для внесения в объект биологической очистки в иммобилизованном виде.

3.1.1 Критерии отбора штаммов.

3.1.2 Экспресс-отбор микроорганизмов по косвенным критериям.

3.2 Модельный штамм.

3.3 Взаимосвязь конвективного переноса углеводородокисляюгцих микроорганизмов с показателем гидрофобности клеток.

3.4 Оптимизация составов жидких питательных сред для наработки биомассы нефтеокисляющих микроорганизмов.

3.4.1 Оптимизация состава жидкой питательной среды на основе дистиллированной воды.

3.4.2 Оптимизация состава жидкой питательной среды на основе морской воды.

3.4.3 Продукция биомассы нокардиоморфными актиномицетами при культивировании на средах оптимизированного состава.

3.5 Оптимизация условий адсорбционной иммобилизации клеток нокардиоморфных актиномицетов на носителе.

3.5.1 ВлияниерНи концентрации катионов алюминия на жизнеспособность и деструкцию нефтепродуктов родококками.

3.5.2 Полный факторный эксперимент.

3.5.3 Иммобилизация нефтеокисляющих нокардиоморфных актиномицетов в оптимизированных условиях.

3.6 Биодеградация нефти в воде свободными и иммобилизованными клетками Rhodococcus erythropolis Fl.

3.7 Деструкция нефтепродуктов свободными и иммобилизованными клетками нефтеокисляющих микроорганизмов в модельных экспериментах по очистке загрязненных песка и почвы.

3.8 Испытание иммобилизованной системы в условиях полевых экспериментов.

3.8.1 Биоремедиация луговой глинистой почвы.

3.8.2 Биологическая очистка нефтесодержащего песчаного грунта.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Адсорбционно иммобилизованные нокардиоморфные актиномицеты в биоремедиации нефтезагрязненных объектов"

Актуальность проблемы

В связи с всё увеличивающимся объемом добычи, транспортировки и переработки нефти и нефтепродуктов, обособленной экологической проблемой становится углеводородное загрязнение окружающей среды. Исследования многих авторов в области научных основ экологической биотехнологии направлены на решение проблем антропогенного загрязнения биосферы. Свойства нефти обуславливают её опасность как поллютанта, что в связи с увеличением плотности населения планеты требует ужесточения ряда соответствующих экологических норм. Известны токсическое, мутагенное, тератогенное, онкогенное, а также иммунодепрессирующее свойства нефти. Вовлечение большинства индивидуальных углеводородов, а также продуктов их термического и фотохимического разложения в биологический круговорот чревато угнетением всей зараженной экосистемы в целом, но, прежде всего, организмов, замыкающих пищевые цепи. В случае агроценозов, таковым организмом является человек.

В настоящее время существует большое количество методов, направленных на ликвидацию заражения среды углеводородами. Широчайшее применение нашли биологические подходы, основанные на метаболическом потенциале нефтеокисляющих микроорганизмов. Данные методики наиболее дешевы и автономны, но весьма чувствительны к условиям среды и, как следствие, наукоемки ввиду необходимости адаптации к объектам и задачам биоремедиации.

Непрерывное развитие биотехнологических методов очистки обусловливается разнообразием откликов организмов на различные воздействия. Инновации касаются основного агента биотехнологического процесса - неф-теокисляющего микроорганизма, его свойств и способа использования. В настоящей работе рассматриваются аспекты применения углеводородокисляющих микроорганизмов, адсорбционно иммобилизованных на твердом носителе.

Иммобилизация микроорганизмов является распространенным методом модификации их активности. В частности, адсорбционная иммобилизация обеспечивает протективное действие на микроорганизм. Бактериальная клетка, закрепленная в поверхностной микропоре носителя, менее подвержена неблагоприятным условиям внешней среды. Расположение на границе раздела твердой и жидкой фаз способствует интенсифицированному снабжению микроорганизма дефицитными биогенными элементами за счет адсорбции последних из раствора. Носитель, подобранный адекватно задачам, опосредует взаимодействие биологического агента с субстратом. Также иммобилизация облегчает механические операции с клетками.

Методы биологической очистки, связанные с интродукцией (биоаугментация, а также биостимуляция in vitro) иммобилизованных на" носителях клеток нефтеокисляющих микроорганизмов в настоящее время являются перспективной альтернативой традиционным методам, основанным на внесении свободных клеток. Важным условием, позволяющим реализовать преимущества иммобилизованной системы, является знание специфических условий её создания и функционирования, определяемых как общими закономерностями, так и особенностями конкретных компонентов биотехнологического производства.

Любой экотоп, в том числе нефтезагрязненная почва, грунт или неф-тешлам, могут рассматриваться как естественная иммобилизованная система, характеризующаяся особым распределением микробиоты по поверхностям минеральных частиц, компонентов органического происхождения, а также по поверхности адсорбированного и эмульгированного в почвенном растворе углеводородного поллютанта. В связи с этим, вопросы адсорбционной иммобилизации клеток нефтеокисляющих микроорганизмов касаются не только подготовки и применения иммобилизованных препаратов, но и использования клеток бактерий — деструкторов, вносимых в объект очистки в виде суспензии.

Цель и задачи исследования

Целью исследования является увеличение эффективности технологии биоремедиации нефтезагрязненных объектов с применением свободных и ад-сорбционно иммобилизованных нокардиоморфных актиномицетов. Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Количественно определить показатели адгезии и деструкционной активности штаммов в выборке музейных культур, выбрать критерии экспресс - отбора нефтеокисляющих микроорганизмов из состава профилированных коллекций для применения в биоремедиации в иммобилизованном виде.

2. Исследовать связь конвективного переноса углеводородокйсляющих актинобактерий с показателем гидрофобности клеток в различных условиях для оценки вертикального распределения и результативности интродукции неиммобилизованных культур родококков различной степени гидрофобности.

3. Оптимизировать составы жидких минеральных питательных сред для увеличения продукции биомассы клеток нефтеокисляющих нокардиоморфных актиномицетов.

4. Оптимизировать условия адсорбционной иммобилизации на сорбент нефтепродуктов клеток углеводородокисляющих нокардиоморфных актиномицетов.

5. Сравнить эффективности свободных и адсорбционно иммобилизованных клеток нефтеокисляющего родококка в ходе моделирования биоремедиации песка, почвы и воды, загрязненных нефтепродуктами.

6. Сравнить эффективности свободных и адсорбционно иммобилизованных клеток родококка в ходе полевых экспериментов по очистке загрязненного нефтепродуктами песчаного грунта и нефтезагрязненной почвы.

Научная новизна работы

Проведенная комплексная оценка показателей гидрофобности, адгезии к твердому носителю, эффективности деструкции нефтепродуктов в выборке штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов позволила, с учетом морфоти-па колоний, определить критерии экспресс-отбора культур для использования в иммобилизованном виде при биоремедиации. Впервые обнаружена зависимость конвективного переноса бактерий в почве и песке от показателя гидрофобности клеток и присутствия углеводородного поллютанта. Высокая эффективность иммобилизованных клеток относительно свободных обнаружена при биоремедиации нефтезагрязненных песка и песчаного грунта, характеризующихся интенсивным вымыванием внесенных клеток. Оптимизированы составы жидких минеральных питательных сред, а также условия адсорбционной иммобилизации клеток нефтеокисляющих нокардиоморфных актиномицетов.

Практическая значимость работы

Полученные данные успешно используются в работах по биологической очистке и рекультивации нефтезагрязненных почв, грунтов, а также де-токсикации нефтешламов, проводимых центром «Биотехнология» на территории Краснодарского и Ставропольского краев. Обработки углеводородзаг-рязненных грунтов биомассой нефтеокисляющих микроорганизмов осуществляются с учетом гидрофобности клеток и интенсивности их конвективного переноса. Апробированная в модельных и полевых условиях иммобилизованная система использована в качестве основы для нефтеокисляющего биопрепарата. Проведенные исследования также служат научной основой создания способа очистки нефтяных шламов и загрязненного грунта. По результатам исследований получено 2 патента РФ.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту • Показатель гидрофобности клеток и морфотип колоний на питательном агаре в совокупности могут быть взяты в качестве критериев экспрессотбора штаммов из состава коллекций нефтеокисляющих микроорганизмов для интродукции в объект очистки в адсорбционно иммобилизованном на сорбент нефтепродуктов виде.

• Интенсивность конвективного переноса микроорганизмов в почве и песке различна и зависит от показателя гидрофобности клеток, а также присутствия углеводородного поллютанта. Иммобилизация микроорганизмов на носитель исключает их конвективный перенос.

• При глубинном культивировании на жидких минеральных средах оптимизированных составов продукции биомассы нефтеокисляющих но-кардиоморфных актиномицетов штаммоспецифично возрастают при V использовании в качестве основ сред дистиллированной, а также морской воды.

• Условия адсорбционной иммобилизации нокардиоморфных актиномицетов на сорбент нефтепродуктов, включающие пониженное значение рН среды иммобилизации и присутствие катионов алюминия штаммоспецифично обеспечивают увеличение показателя адгезии клеток.

• Адсорбционно иммобилизованные клетки родококка эффективнее свободных при биоочистке нефтезагрязненных песка, песчаного грунта и воды. В случае очистки нефтезагрязненных черноземной и луговой глинистой почвы, эффективности применения иммобилизованных и свободных микроорганизмов сходны.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на следующих конференциях, съездах и конгрессах: второй и четвертый съезды общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (2004 и 2006 гг. ), 2nd FEMS congress of european microbiologists (Мадрид, 2006), международная конференция "Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды" (Саратов, 2005 г.), 6-я и 10-я Пущинские школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2002, 2006 гг.), международная школа-конференция, посвященная 100-летию- со дня рождения; С.И.Алиханяна «Генетика.микроорганизмов и биотехнология» (Москва - Пущино,. 2006 г.), третий московский международный, конгресс « Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005),. Всероссийский смотр-конкурс научно-технического творчества? «Эврика;- 2005» (Новочеркасск, 2005); конкурс научных проектов студентов и аспирантов.в области экологии «ЭкоЛогичные технологии» (Москва, 2005), 2-я:Всероссийская: научная конференция« молодых учёных и студентов (Краснодар; 2005), международная? конференция? «Биоресурсы; , биотехнологии;, экологически; безопасное развитие регионов, юга России» (Сочи;. 2007), краевая, научно-практическая г конференция гран-тодержателей конкурса РФФИ (Агой, 2007); ПГ международная конференция: «Микробное; разнообразие: состояние, стратегия сохранения; биотехнологический: потенциал; «КЮМЮ -2008» (Пермь, 2008), конкурс научно; - технического > творчества молодежи «НХГМ - 2008» (Москва, 2008), российская! школа — конференция? «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва - Пушино, 2008).

Публикации' .

По материалам исследований опубликовано 22 работы, из них 3 статьи, одна из которых в отечественном; рецензируемом? издании; рекомендованном ВАК РФ; 2 патента РФ; 17 тезисов российских, международных и зарубежных конференций.

Структура и объём работы

Диссертация состоит из введения; обзора литературы, материалов и методов, описания проведенных исследований, выводов, заключения и приложения; Работа изложена^ на 153- листах машинописного' текста, содержит 26 рисунков; 16 таблиц, 5 приложений. Список литературы; включает 232 наименования; в том1числе 76 зарубежных источников;;

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Самков, Андрей Александрович

ВЫВОДЫ

1. Показатель гидрофобности выращенных на питательном агаре клеток и мор-фотип колоний соответствующих штаммов при росте на данной среде в совокупности могут быть использованы в качестве критериев экспресс-отбора штаммов из состава коллекций нефтеокисляющих микроорганизмов для применения в биоремедиации с использованием адсорбционной иммобилизации на сорбент.

2. Обнаружено, что конвективный перенос током влаги неиммобилизованных на носителе микроорганизмов в почве и песке различен и зависит от показателя гидрофобности клеток, а также присутствия нефтепродуктов.

3. Получены новые составы жидких минеральных питательных сред для наработки клеточной биомассы нефтеокисляющих нокардиоморфных актиноми-цетов, пггаммоспецифично увеличивающие выход биомассы в 2,2-5,0 раз при использовании дистиллированной воды (по сравнению с исходной средой увеличены концентрации источников углерода и азота) и в 2,2-7,4 раза - при морской (увеличены концентрации источников углерода и фосфора).

4. Выявлены оптимальные условия адсорбционной иммобилизации клеток нефтеокисляющих нокардиоморфных актиномицетов на гидрофобный носитель,

3 ! требующие пониженного значения рН (5,4), присутствия катионов Al в концентрации 51,3 мг/л и обеспечивающие штаммоспецифичное увеличение показателя адгезии клеток в 1,5 — 14,1 раза. Инкубация в среде иммобилизации не ингибировало микробный рост и катаболизм углеводородов.

5. В случае очистки нефтезагрязненных черноземной и глинистой луговой почвы эффективности очистки с использованием иммобилизованных и свободных клеток нокардиоморфных актиномицетов сходны.

6. Адсорбционная иммобилизация клеток Rhodococcus erythropolis F1 на носитель-сорбент для сбора нефтепродуктов обеспечивает более высокую скорость и величину снижения концентрации углеводородов по сравнению со свободными клетками при очистке нефтезагрязненных песка, песчаного грунта и воды.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе работы было обосновано применение альтернативных критериев экспресс-отбора штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов для их иммобилизации на гидрофобный носитель и использования в биоремедиации. Непосредственное измерение признаков — показателя адгезии и деструкци-онной активности при больших выборках чрезвычайно длительно, трудоемко и не дает однозначного результата. Экспресс-отбор изолятов по показателю гидрофобности клеток с параллельным анализом морфотипов колоний на питательном агаре, используемом для подготовки теста на гидрофобность, позволяет быстро отбирать необходимые штаммы нефтеокисляющих микроорганизмов, интенсивно адсорбирующиеся на гидрофобный носитель - термически обработанные опилки и обладающие деструкционной активностью в отношении мазута.

Преимущества иммобилизованных микроорганизмов во многих случаях связаны с механической фиксацией клеток в необходимом объеме пространства. Для оценки механической фиксации сравнивали перенос неиммо-билизованных бактерий с разными показателями гидрофобности, и иммобилизованных клеток. Конвективный перенос нефтеокисляющих микроорганизмов, определяющий, с одной стороны, вертикальное распределение ин-тродуцированных клеток в толще очищаемого слоя, и, с другой стороны, их вынос зоны биоремедиации, зависел от ПГ штамма. Высокогидрофобный штамм Ккойососст яр. 38 ( ПГ=88%) вымывался меньше во всех вариантах опыта (черноземная почва и песок, интактные и нефтезагрязненные), чем обладающий средней величиной показателя гидрофобности штамм ЛЬснЗососсш егу1кгороИз П(ПГ=24%). Присутствие углеводородов в песке или почве увеличивало процент выноса клеток обоих штаммов по сравнению с интактны-ми образцами. Использование штамма с ПГ=24%, таким образом, позволяет проводить биообработки на большую глубину по сравнению с высокогидрофобными штаммами, однако имеется риск конвективного выноса клеток током влаги из зоны очистки. Обработка высокогидрофобными неиммобилизо-ванными клетками, такими как Rhodococcus sp. J8, лишь частично решает проблему вымывания клеток, так как 33,5% и 38,6% клеток, внесенных в виде суспензии, вымывались из дециметрового слоя нефтезагрязненных песка и почвы соответственно. Лишь адсорбционно иммобилизованные клетки были надежно зафиксированы в горизонте очистки.

Следовательно, при биоочистке увлажняемых песчаных грунтов, проблема выноса клеток решается их иммобилизацией на носителе. При невозможности иммобилизации, предпочтительно использование высокогидрофобных штаммов.

Методики биоаугментации и биостимуляции in vitro связаны с использованием большого количества микробной биомассы биодеструкторов. В настоящее время в подавляющем большинстве случаев, в качестве биологического агента биоремедиации нефтезагрязненных объектов используют но-кардиоморфных актиномицетов, доминирующих в углеводородокисляющих бактериоценозах углеводородзагрязненных почв. Были оптимизированы составы жидких минеральных питательных сред для наработки клеточной биомассы нокардиоморфных актиномицетов. При глубинном культивировании представителей родов Gordonia и Rhodococcus на минеральной среде на основе пресной воды, оптимизированный состав обеспечил увеличение выхода биомассы в среднем на 216 % для гексадекана и на 166 % для дизельного топлива. Для сред на основе морской воды цифры составили 230 и 245 % соответственно.

Известно, что эффективность биокатализатора прямо зависит от концентрации микробных клеток на единицу объема среды. При приготовлении влажного препарата иммобилизованных на гидрофобный носитель клеток, происходила неполная адгезия нефтеокисляющих микроорганизмов. Методом математического планирования была увеличена штаммоспецифичная доля адгезировавшихся бактерий. В ходе оптимизации условий адсорбционной иммобилизации нокардиоморфных актиномицетов обнаружено, что при л 124 сутствие поливалентных катионов [А1Ъ*~\=51,3 мг/л, кислая реакциясреды рН= 5,4 максимально увеличивает показатель адгезии клеток в среднем в 1,94 раза при минимально допустимом сроке инкубации с носителем.

Использование экспериментально . оптимизированных. условий иммобилизации, атакжеоптимизированных составов питательных сред для наработки биомассы, видо-и штаммоспецифично увеличивает выход соответствующих* процессов и целесообразно для внедрения в методики биостимуляции т у/'/го и биоаугментации с применением иммобилизованных систем.

На основе носителя — гидрофобного сорбента нефтепродуктов и родо-кокка был приготовлен препарат иммобилизованных клеток. Эффективность Г иммобилизованной системы сравнивали, в различных условиях, с эффективностью внесенных в идентичном количестве неиммобйлизованных клеток.

V Эффективность адсорбционно иммобилизованных клеток ЯЪойососсин : егуМгороШ Р1 при ликвидации нефти в водной среде в модельных условиях \ оказалась выше таковой планктонных клеток того же штамма: Это было связано с физическими свойствами носителя? клеток — нефтяного сорбента, г обеспечивающего разрушение пленки нефти на поверхности воды й: положительную плавучесть иммобилизованной: системы, насыщенной углеводородами. Иммобилизованные клетки имели селективное преимущество перед свободными за счет присутствия в носителе биогенных элементов из среды | иммобилизации.

Сравнительная эффективность свободных и иммобилизованных кле

Ь ток Якос1ососсш егуЖгороШ при очистке нефтезагрязненных почвогрун

I . тов, в ходе лабораторного моделирования биоочистки, зависела от типа объекта ремедиации. В случае биодеградации нефтепродуктов в песке, иммобилизованные клетки оказались эффективнее клеток, внесенных в виде суспензии, обеспечив за тот же срок в 1,3 раза меньшую остаточную конценгра

Г цию углеводородов сырой нефти и мазута. Напротив, при очистке загрязнен

I ной нефтью черноземной почвы, иммобилизация клеток не влияла на степень

1-, •. • I. утилизации ими углёводородов. Таким образом, предварительная иммобилизация клеток родококка перспективна при их интродукции в увлажняемые нефтезагрязненные песчаные грунты, отличающиеся интенсивным конвективным переносом вносимых клеток. Неблагоприятное влияние выноса клеток заключается в их перемещении в глубоко: залегающие* слои грунта, характеризующиеся неблагоприятными для катаболизма углеводородов нефте-окисляющими микроорганизмами, условиями, прежде всего недостаточной: аэрацией.

Полученные: на стадии модельного эксперимента данные о сходстве эффективности иммобилизованных и неиммобилизованных клеток при очистке нефтезагрязненной' почвы были / подтверждены полевым экспериментом по бйоремедиации: участка луговой глинистой почвы, загрязненной сырой нефтью. . ".".'•"' '' V V- ■•■■'■'■.'.■■•

Полевой эксперимент по очистке углеводородзагрязненного песчаного грунта на территории' Краснодарского:; нефтезавода подтвердил ' большую сравнительную ■' эффективность иммобилизованных; клеток при биоремедиа-ции данного типа' грунта. Условия эксперимента обусловили' интенсивное увлажнение грунта, а также резкие возрастания' температуры, характерные для Краснодарского края. Иммобилизованная: система- вследствие масштабирования, была приготовлена на основе раствора биогенных элементов с соот

Лг ветствующим значением рН в присутствии катионов [А\ ] в концентрации 51.3 мг/л. Иммобилизованные клетки обеспечили? в; 1,7 раза меньшую остаточную концентрацию нефтепродуктов по сравнению со свободными за вдвое меньший срок. Остаточная концентрация углеводородов позволяла использовать остаточный грунт для технических целей на территории предприятия.' ■■■■'- '-'•:.'.;.'

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Самков, Андрей Александрович, Краснодар

1. Абелян В.А. Получение L-теанина с использованием иммобилизованных клеток Pseudomonas nitroreducens / В.А. Абелян, Т. Ямамото, Т. Окубо, Э.Г. Африкян // Прикладная биохимия и микробиология. — 1995. — № 3. — С. 323328.

2. Абелян В.А. Получение молочной кислоты с использованием иммобилизованных клеток в реакторе с перемешиванием / В.А. Абелян, Л.А. Абелян // Прикладная биохимия и микробиология. 1996. — № 5. — С. 549-553.

3. Абелян В.А. Одновременное получение D-аспарагиновой кислоты и L-аланина / В.А. Абелян // Прикладная биохимия и микробиология. 1999. - № 2.-С. 173-177.

4. Абелян В.А. Иммобилизация клеток включением в аубазидан / В.А. Абелян // Прикладная биохимия и микробиология. 2000. - № 1. - С. 85-88.

5. Абелян В.А. Новый метод иммобилизации клеток микроорганизмов поперечной сшивкой / В.А. Абелян // Прикладная биохимия и микробиология. -2000. -№3.- С. 359-364.

6. Алексеева Т.П. Перспективы использования торфа для очистки нефтезагряз-ненных почв / Т.П. Алексеева, Т.И. Бурмистрова, H.H. Терещенко, Л.Д. Ста-хина, И.И. Панова // Биотехнология. 2000. - № 1. - С. 58-64.

7. Андреева И.С. Психротолерантные штаммы-нефтедеструкторы для биореме-диации почв и водной среды / И.С. Андреева, Е.К. Емельянова, С.Н. Загре-бельный, С.Е. Олькин, И.К. Резникова, В.Е. Репин // Биотехнология. 2006. — №1. - С. 43-52.

8. Баулина О.И. Электронно-микроскопическое изучение иммобилизации дрожжей в частицах носителя растительного происхождения / О.И. Баулина, Р. Эвальд, O.A. Горелова, Т.Г. Корженевская, Е.С. Лобакова, М.В. Гусев // Микробиология. 1995. - № 4. - С. 519-525

9. Бахаева JI.П. Микробное разложение 3,4-дихлоранилина, сорбированного активированным углем / Л.П. Бахаева, Г.К. Васильева, Э.Г. Суровцева, В.М. Мухин // Микробиология. 2001. - № 3 - С. 329-336.

10. Блиева Р.К. Образование пектинрасщепляющих ферментов иммобилизованными клетками Aspergillus awamori / P.K. Блиева, H.A. Родионова, Л.И. Мар-тинович // Микробиология. 1989. - №. 2. - С. 246-250.

11. Бельков В.В. Биоремедиация: принципы, проблемы, подходы / В.В. Бельков // Биотехнология. 1995. - № 3. - С. 20-27.

12. Вельков В.В. Стандартизация формата описаний промышленных технологий биоремедиации / В.В. Вельков // Биотехнология. 2001. - №2. - С. 70-76.

13. Волова Т.Г. Связывание окиси углерода иммобилизованными клетками карбоксидобактерий / Т.Г. Волова, В.Ф. Плотников // Прикладная биохимия и микробиология. 1999. -№ 1. - С. 43-44.

14. Габбасова И.М. Использование биогенных добавок совместно с биопрепаратом «Деворойл» для рекультивации нефтезагрязненных почв / И.М. Габбасова, P.P. Сулейманов, Т.Ф. Бойко, Н.Ф. Галимзянова // Биотехнология. -2002. №2. - С. 57-65.

15. Глазочева Л.Е., Ившина И.Е., Оборин A.A. Клеточные приспособления Rhodococcus rhodochrous и Rhodococcus ruber, усваивающих пропан и бутан // Микробиология. 1990. - №2. - С.225-229.

16. Гоготов И.Н. Образование поверхностно-активных веществ бактерией Rhodococcus erythropolis sH-5 при росте на разных источниках углерода / И.Н. Гоготов, P.C. Ходаков // Прикладная биохимия и микробиология. 2008. - № 2. —- С. 207-212. : '.'/ " •■■'' ' t-"

17. Головлев E.JI. Экологическая стратегия бактерий: специфика проблемы / Е.Л. Головлев // Микробиология; 2001. - №4. - С. 437-443.

18. ГОСТ 26489-85 Определение обменного аммония по методу ЦИАНО / Сборник методик и инструктивных материалов- по-определению вредных веществ для контроля источников загрязнения; окружающей среды. Часть. VIT — Краснодар. 1997. - 184 с.

19. Давиденко Т.И. Восстановление нитрозамещенных соединений нативными и иммобилизованными клетками Escherichia coli I Т.И. Давиденко, Г.И. Бонда-ренко // Прикладная биохимия и микробиология. 2000. — Ж1. — С.74-79. .

20. ДемаковВ;А. Иммобилизация клетокмикроорганизмов: биотехнологические аспекты / В.А. Де,маков, АЛО. Максимов // Биотехнология. 2008. — № 2. — С. 30-45.

21. Доронина Н.В. Аэробная биодеградация формальдегида, метанола и метиламина иммобилизованными клетками Methylobacterium extorquens / H.B. Доронина, В.А. Ежов, Ю.А. Троценко // Прикладная биохимия и микробиология. 1997.-№ 2.-С. 162-165.

22. Доронина Н.В. Биодеградация метил ацетата и эти л ацетата иммобилизованными клетками Pseudomonas esterophilus / H.B. Доронина, Н.М Назаров, В.А. Ежов, Ю.А. Троценко // Прикладная биохимия и микробиология. 2006. - № 1.-С. 52-54.

23. Егоров Н.С. Сравнение липидного состава R-, S- и М-вариантов Rhodococcus rubropertinctus / Н.С. Егоров, Т.В. Коронелли, Е.С. Милько, P.A. Степанова, Б.В. Розынов, М.Г. Плетенко // Микробиология. 1986. -№ 2. - С. 227-230.

24. Егоров Н.С. Комбинированные иммобилизованные культуры, продуцирующие фибринолитические протеиназы / Н.С. Егоров, Н.С. Ландау, И.Б. Котова // Микробиология. 1988. - №. 6. - С. 945-951.

25. Емельянова Е.В. Об активности клеток Pseudomonas rathonis как основы рецептора мембранного биосенсора для определения поверхностно-активных веществ / Е.В. Емельянова, А.Н. Решетилов // Микробиология. 2002. - № 2. - С. 277-280.

26. Ефременко E.H. Влияние длительного хранения клеток микроорганизмов, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта, на их выживаемость и биосинтез целевых метаболитов / E.H. Ефременко. Н.Ю. Татаринова // Микробиология. 2007. -№3. - С. 383-389.

27. Журина М.В. Влияние состава реконструированных биопленок на активность парафинокисляющих бактерий / М.В. Журина, Е.А. Стрелкова, В.К. Плакунов, С.С. Беляев // Микробиология. 2008. - №5. - С. 701-703.

28. Звягинцев Д.Г. Взаимодействие микроорганизмов с твердыми поверхностями / Д.Г. Звягинцев. М. - 1973. - 232 с.

29. Звягинцев Д.Г. Определение величины адгезии клеток микроорганизмов к твердым поверхностям / Д.Г. Звягинцев, А.Ф. Перцовская, Е.Д. Яхин, Э.И. Авербах // Микробиология. 1971. - № 6. - С. 1024-1028.

30. Звягинцев Д.Г. Почва и микроорганизмы / Д.Г. Звягинцев. М. - 1987. - 256 с.

31. Звягинцев Д.Г. Электронномикроскопическое изучение адсорбции микроорганизмов на почвах и минералах / Д.Г. Звягинцев, А.Ф. Перцовская, В;. И. Дуда, Д:И- Никитин // Микробиология. — 1969: — № 6. — С. 1091-1095^ V

32. Иванова Е.С. Мониторинг интродуцированных микроорганизмов. нефтедеструкторов в открытых системах / E.G. Иванова, Т.З. Есикова, А.Б.

33. Гафаров, А.Н. Шкидченко // Биотехнология.- 2006. №3. - G.74-78.

34. Ившина И.Б. Феногипическая характеристика алканотрофных родококков из различных экосистем / И.Б. Ившина, М.В. Бердичевская, Л.В. Зверева, Л.В. Рыбалка, Е.А. Еловикова // Микробиология. 1995. -№4. - С. 507-513. . ■

35. Ившина И.Б. Селективное выделение пропанокисляющих родококков с использованием антибиотических веществ '/ ИлБ. Ившина, М.С. Кугакина //

36. Микробиология^-1997 -№4. -С. 494-5001 , ; ,

37. Игнатов : 0:В1 Утилизация синтанола ДС-10 бактериями-деструкторами, . включенными в полисахаридные гели / О.В.Игнатов,Ю.В. Шалунова,Л.В.

38. Панченко, О.'В: Турковская; H.MI Птичкина //Прикладная биохимия и микг у- робиология. 1995. - № 2. - С. 220-223. ■

39. Каменщиков Ф.А. Нефтяные сорбенты / Ф.А. Каменщиков, Е.И. Богомоль-. ный.-М.-2005.-268 с.j 43. Карасева Э.В. Биоремедиация черноземной почвы, загрязненной нефтью /1. ■ ' Э:В- Карасева, И.Е. Гирич, A.A. Худокормов, Н.Ю. Алешина^С.Г., Карасев//

40. Биотехнология: 2005.- № 2. - С. 67-72.

41. Карпенко E.B; Перспективы использования бактерий рода Rhodococcus имикробных поверхностно-активных веществ для деградации нефтяных загрязнений /E.B. Карпенко, Р.И. Вильданова-Марцишин, Н.С. Щеглова, Т.П.1: Ь1. Vi ,1.'

42. Квасников Е.И. Влияние факторов внешней среды на деструкцию нефтепродуктов ассоциативными культурами микроорганизмов / Е.И. Квасников, Г.Ф. Смирнова, Т.М. Клюшникова // Микробиологический журнал. 1987.-Т.49.-№3.-С. 33-37.

43. Квасников Е.И. Усвоение бактериями легколетучих н-алканов (Сб Сш ) Е.И. Квасников, Э.Ф. Соломко, O.A. Нестеренко, Н.И. Павленко / Микробиология. - 1972. - № 4. - С. 586-591.

44. Киреева H.A. Комплексная биоремедиация нефтезагрязненных почв для снижения токсичности / H.A. Киреева, Е.М. Тарасенко, Т.С. Онегова, М.Д. Бакаева // Биотехнология. 2004. — № 6. - С. 63-70.

45. Кистень А.Г. Адгезия смешанных культур метанотрофов к твердым материалам / А.Г. Кистень, A.A. Рой, И.К. Курдиш, Т.В. Шевченко // Прикладная биохимия и микробиология. 1998. - № 4. - С. 414-418.

46. Китова А.Е. Деградация 2,4-динитрофенола свободными и иммобилизованными клетками Rhodococcus erythropolis HL РМ-1 / А.Е. Китова, Т.Н. Кувич-кина, А.Ю. Аринбасарова, А.Н. Решетилов // Прикладная биохимия и микробиология. 2004. - № 3. - С. 307-311.

47. Кондратенко В.М. Препарат для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов / В.М. Кондратенко, В.П. Холоденко, И.А. Дунайцев, З.М. Ермоленко, В.А. Чугунов, И.И. Мартовецкая, Р.И. Миронова, Н.А. Жиркова // Патент РФ RU 2191753 С2. Приоритет 1999.

48. Коронелли Т.В. Углеводородокисляющая микрофлора акваторий Балтийского моря и Куршского залива, загрязненных при разливе мазута / Т.В". Коронелли, В.В. Ильинский, В.А. Янушка, Т.И. Красникова // Микробиология. -1987. — Т.56. — С. 472-477.

49. Коронелли Т.В. Экологическая стратегия бактерий, использующих гидрофобный субстрат / Т.В. Коронелли, Е.Д. Нестерова // Микробиология. — 1990. — №6. — С. 993-997.t

50. Коронелли Т.В. Липиды R- и ^-вариантов Rhodococcus erythropolis / Т.В. Коронелли, Т.И. Комарова, О.В. Поршнева // Микробиология. 1995. - № 6. -С. 769-771

51. Коронелли Т.В. Принципы и методы интенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей среде (обзор) / Т.В. Коронелли // Прикладная биохимия и микробиология. 1996. — № 6. - С. 579-585.

52. Коронелли Т.В. Изменение липидного состава клеток R- и ^-вариантов Rhodococcus erythropolis при длительном хранении на лабораторной среде / Т.В. Коронелли, Т.И. Комарова, О.В. Поршнева, С.Г. Дермичева // Микробиология. 1998. - № 5. - С. 718-720.

53. Курдиш И.К. Сравнительный анализ • адгезии различных видов метанотроф-. ных бактерий к твердым материалам / И.К. Курдиш, A.C. Гордиенко,Н.Ф;

54. Кигель, А.Е. Кистень // Прикладная биохимия и микробиология. 1998. - № 3; - С. 245-250;. • . / v.'. : . ' '

55. Куюкина М.С. Влияние . состава? клеточных липидов на формирование ^ неспецифическрй' антибиотикорезистентности алканотрофных родококков /

56. Ландау Н.С. Особенности биосинтеза прогеиназ клетками Bacillus firmus, , включенными в Са-альгинатный гель / Н.С. Ландау, И.Б. Горнова, Н.С. Егоров // Прикладная биохимия и микробиология.— 1997. -№ 6. С. 611-615.

57. Лебенко Е.В1 Особенности хемотаксиса у диссоциативных ¿>- и ^-вариантов Bacillus thuringiensis / E.B. Лебенко, O.A. Секерина, В.И. Чемерилова // Микробиология. 2005. - №1. - С. 87-91.

58. Лозинский В.И. Применение криогелей' поливинилового спирта в биотехнологии. V. Сверхмакропористые носители для; иммобилизации молекул / В.И. Лозинский, Ф;М. Плиева, А.Л. Зубов // Биотехнология: 1995. - № 1. - С. 32. 37. ■ ' ; ■. '•••• \ • ' / , . . ■ '

59. Максимов. А.Ю: Иммобилизация на. углеродных сорбентах клеток штамма, Rhodococcus ruber gil, обладающего нитрилгидратазной активностью / А.Ю. Максимов; Ю.1Г. Максимова, М;В:; Кузнецова^ В'.Ф.- Олонцев, В.А. Демаков //

60. Прикладная биохимия и микробиология. 2007. - №2. - С. 193-198.

61. Матыс В .IO: Адаптации к стрессовым условиям у представителей родов Rhodococcus и Gordona / В.Ю: Матыс, Л.М. Барышникова, Е.Л. Головлев // Микробиология.-1998: №6: - С. 743-747.

62. Медведева Н.Г. Иммобилизация уксуснокислых бактерий на углеродных волокнах и использование их для трансформации тиодигликоля / Н.Г. Медведева, Ю.А. Гриднева, А.А. Лысенко, В.И. Сухаревич // Биотехнология.-2001.-№ 5;'-С. 51-57.

63. Методыобщейбактериологии/подред:Ф.Герхардгаидр:-М;- 1983;—Т.1.-536с.

64. Методы общей бактериологии/ под ред. Ф. Терхардга и др. -М. -1984. Т.2. -472 с.

65. Методы общей бактериологии/ под ред. Ф. Герхардга и др. -Mi -1984. -Т.3. -264 с. 79; Милько E.G. Влияние аэрации и концентрации фосфора в среде на рост S-, Rи М-форм Mycobacterium, lacticolum в смешанных культурах / E.G. Милько,

66. H.G. Егоров; BiHi Максимов; A.H. Недбайло // Микробиология; 1977. - № З.-С. 490-495. •

67. ВО. Милько Е.С. Гидрофильно — гидрофобные и адгезивные свойства диссоциан-t tob >Rhodöcoccus rubropertinctus / E.G. Милько, H.C. Егоров // Микробиоло-■ ч<:гая?.-'19941-:№^2:.-С:-171-174^. • '.• ■■. ■•'■ :

68. Милько Е.С. Динамика роста и состава популяций смешанных культур R-, S-и М-диссоциантов Pseudomonas aeruginosa-/ E.G. Милько,: С.С. Хабибуллин, Ю)А> Николаев; Ä.H; Козлова;, РЛЖ Эль-Рёгистан // Микробиология;:- 2005. -№4-.-С. 475-482. . ' . . V ' ■ ; '

69. Милько Е.С. Образование: биологически* активных-: соединений S-, R- и М-fyopMWw Mycobacterium lacäcolum на среде с н-гексадеканом. Е.С.Милько, HiC. Егоров, H.H. Угарова, А.А; Ревенко // Микробиология;.- 1976i :—-№•• 5t

70. G^ 808-81 iC; -л .' . . . 7 ;

71. Милько? E.CI, Сравнительное изучение химического состава и некоторых свойств полисахаридов капсул М-,. S- wK-Ba^mamoBMycobacteriumlacticolum;/ Е.С. Милько, И.В; Ботвинко, Р.А. Степанова, Н1С. Егоров // Микробиология;. 1983.-№3;-С. 388-391.

72. Мурыгина В.П:, Войшвилло Н.Е., Калюжный С.В; Биопрепарат "Родер" для очистки почв, почвогрунтов, пресных и минерализованных вод от нефти и нефтепродуктов. Патент РФ RU 2174496 G2;;- Приоритет 1999;

73. Нетрусов А.И. Практикум по микробиологии: Учебное пособие для студентов высших учебных заведений / А.И. Нетрусов, М.А. Егорова, Л.М. Захар-чук, H.H. Колотилова и др. — М. 2005. - 608 с.

74. Никитин Д.И. Утилизация этиленгликоля свободными и иммобилизованными клетками бактерий / Д.И; Никитин, 0:И. Слабова, JI.E. Никитин, Н.М. Назаров, Ю.Е. Синяк, Г.В. Федотова // Прикладная биохимия и микробиология.- 1999. -№4. -С. 441-444.

75. Никовская Г.Н. Гидрофильно-гидрофобные свойства микроорганизмов при различных условиях культивирования / Г.Н. Никовская, A.C. Гордиенко, Л.Й;

76. Глоба // Микробиология. 1989. - №3. -- С. 448-451. V''

77. Никовская Г.Н. Сорбция микроорганизмов волокнистыми материалами / Г.Н. Никовская, А.Н. Гордиенко; Л.И; Глоба // Микробиология; 1986. - №4. -С. 694-694. ' ,

78. Николаев Ю.А. Адгезивные и ростовые свойства R- иS-диссоциантов Pseudomonas fluorescens J Ю;А. Николаев^ Е.С. Милько // Микробиология^ 2000.- № 2. С. 293-294.

79. Николаев Ю.А. Внеклеточные факторы адаптации к . неблагоприятным условиям среды в периодической' культуре Pseudomonas fluorescens /■ Ю.А. Николаев, Дж. И. Проссер, Н.С. Паников // Микробиология. 2000. - № 5. -С. 629-635. \

80. Николаев Ю.А. Внеклеточные факторы, влияющие на адгезию Pseudomonas fluorescens на стекле / Ю.А. Николаев, Дж. И: Проссер // Микробиология. -2000. -№2.-С. 231-236.

81. Николаев Ю.А. Регуляция адгезии клеток Pseudomonas fluorescens к стеклу летучими соединениями, выделяемыми культурой / Ю.А. Николаев, Дж.И. Проссер, Р.И. Виттли // Микробиология. 2000. - № 3. - С. 352-355.

82. Николаев Ю.А. Регуляция адгезии у бактерий Pseudomonas fluorescens под влиянием дистантных межклеточных взаимодействий / Ю.А. Николаев // Микробиология. 2000. - № 3. - С. 356-361.

83. Николаев Ю.А. Свойства адгезина и антиадгезина Pseudomonas fluorescens / Ю.А. Николаев, Дж.И. Проссер // Микробиология. 2000. - № 2. - С. 237242.

84. Николаев Ю.А. Насыщенные C21-G33 углеводороды авторегуляторы адгезии Pseudomonas fluorescens на стекле / Ю.А. Николаев, Н.С. Паников, С.М. Лукин, Г.А. Осипов // Микробиология. - 2001. - № 2. - С. 174-181.

85. Николаев Ю.А. Внеклеточная протеаза как регулятор обратимой адгезии Pseudomonas fluorescens" I Ю.А. Николаев, Н.С. Паников // Микробиология. -2002.-№5.-С. 629-634.

86. Николаев Ю.А. Биопленка — «город микробов» или аналог многоклеточного организма? / Ю.А. Николаев, В.К. Плакунов // Микробиология. 2007. — №2. -С. 149-163.

87. Определитель бактерий Берджи в 2-х томах, 9-е издание / под ред. Дж, Хоулта, Н.Крига, П. Снитта и др. М: Издательство «Мир». - 1997. - Т.2. -678 с.

88. Паников Н.С. Рост и адгезия Pseudomonas fluorescens в периодической культуре: кинетический анализ действия внеклеточных антиадгезинов /Н.С. Паников, Ю.А. Николаев // Микробиология. 2002. - № 5. - С. 619-628.

89. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток / С. Дж.t 1

90. Перт. М.: Издательство «Мир». - 1978. - 336 с.

91. Пирог Т.П. Использование иммобилизованных на керамзите клеток нефтео-кисляющих микроорганизмов для очистки воды от нефти / Т.П: Пирог, Т.А. Шевчук, И.Н. Волошина, H.H. Грегирчак // Прикладная биохимия и микробиология. 2005. - № 1. - С. 58-63.

92. Плакунов B.K. Устойчивость нефтеокисляющего микроорганизма, Dietzia sp. к гиперосмотическому шоку в реконструированных биопленках / В.К. Плакунов, М.В. Журина, С.С. Беляев // Микробиология. 2008. - №5. - С. 581589.

93. Практикум по микробиологии / под ред. Н.С. Егорова. М. - 1976. - 307с.

94. Родионова Т.А. Рост и адгезия Bacillus lichenifofmis в зависимости от условий культивирования / Т.А. Родионова, Н.В. Шеховцева, Н.С. Паников, Ю.А. Николаев // Микробиология. 2003. - № 4. - С. 521-527.

95. Розанова Е.П. Использование углеводородов микроорганизмами / Е.П. Розанова // Успехи микробиологии. 1967. - №4. - С.61-79.

96. Ш.Рубашко Г.Е. Оптимизация процесса деградации флуорена штаммом Rhodococcus rhodochrous 172 / Г.Е. Рубашко, М.П. Коломыцева, JI.А. Голов-лева // Прикладная биохимия и микробиология. 2006. - № 4. - С. 448-451.

97. Рымовская М.В. Биосорбционная очистка сточной воды производства полимеров / Рымовская М.В., Ручай Н.С. // Биотехнология. 2008. - № 2. - С. 51-58.

98. ПЗ.Рябоконь A.M. Восстановление СОг до ацетата иммобилизованными термофильными гомоацетатными бактериями Thermoanaerobacter kivui / A.M. Ря-боконь, M.А. Пушева, E.H. Деткова, Е.И. Райнина // Микробиология. 1995. - № 6. - С. 776-781.

99. Самонин В.В. Изучение закономерностей адсорбции бактериальных клеток на пористых носителях / В.В. Самонин, Е.Е. Еликова // Микробиология. -2004.-№6. -С. 810-816.

100. Самсонова A.C. Очистка сточных вод от дизельного топлива с помощью иммобилизованных микроорганизмов-деструкторов / A.C. Самсонова, З.М.

101. Алещенкова, Е. Ли, Б.-Р. Лим, C.B. Хван, Н.Ф. Сёмчина, Л.С. Пинчук, A.B. Макаревич, А.Г. Кравцов // Биотехнология. 2003. - № 4. - С. 83-87.

102. Сапунова Л.И. Свойства препарата иммобилизованных клеток Arthrobacter sp. продуцента ксилозо(глюкозо)изомеразы / Л.И. Сапунова, А.Г. Лобанок, Е.В. Парахня, И.О. Казакевич // Микробиология. - 2003. - № 3. - С. 395-399.

103. Секерина O.A. Об адаптивности процесса диссоциации у Bacillus thuringien-sis / O.A. Секерина, В.И. Чемерилова // Микробиология. 2003. — №5. — С. 689-694.

104. Семенов B.C. Лабораторные тесты для оптимизации интродукции в почву микроорганизмов-деструкторов нефти / B.C. Семенов, И.С, Куличевская, Э.М. Халимов, B.C. Гузев, Н.С. Паников // Прикладная биохимия и микробиология. 1998. - №5. - С. 576-582.

105. Сидоров Д.Г. Микробиологическая деструкция мазута в почве при использовании биопрепарата Деворойл / Д.Г. Сидоров, И.А. Борзенко, Е.И. Милехина, С.С. Беляев, М.В. Иванов // Прикладная биохимия и микробиология. 1998. -№32.-С. 281-286.

106. Синицын А.П. Иммобилизованные клетки микроорганизмов / А.П. Синицын, Е.И.Райнина, В.И.Лозинский, С.Д.Стасов. М.: Издательство МГУ. 1994.288 с.

107. Слабова О.И. Окисление водорода иммобилизованными в силикагель и криосиликагель клетками олиготрофных бактерий / О.И. Слабова, Д.И. Никитин, В.И. Лозинский, В.К. Кулакова, Е.С. Вайнерман, C.B. Рогожин // Микробиология. 1988. -№ 6. - С. 940-944.

108. Слабова О.И. Особенности газового обмена водородных бактерий, иммобилизованных в обычные и криогели сшитого полиакриламида / О.И. Слабова,

109. Д.И. Никитин, В.И. Лозинский, Е.С. Вайнерман, С.В. Рогожин // Микробиология. -1991.-№ 1*.-С. 23-27.

110. Слабова О.И. Иммобилизация олиготрофных микроорганизмов на пористых носителях методом сорбции / Слабова О.И., Никитин Д.И. // Микробиология. 2005. - №3. - С. 430-432.

111. Смирнова Т.А. Адгезивные свойства,Bacillus thuringiensis / Т.А. Смирнова, М!Н. Поглазова, М.Н; Николаенко, P.P. АзизбекянУ/ Биотехнология. 2000. -№ 3. — С. 16-26.

112. Соколова Е.Н. Потребление метана метанотрофными бактериями, иммобилизованными в каррагинановом геле / Е.Н. Соколова; В:Ф. Гальченко // Микробиология. 1989: - № 6. - С. 903-908.

113. Суржко Л.Ф. Утилизация нефти в почве и воде микробными клетками / Л.Ф. Суржко, З.И. Финкелыптейн, Б.П. Баскунов, М.И. Янкевич, В.И. Яковлев, Л.А. Головлева // Микробиология. 1995-. - № 3. - С. 393-398.

114. Суровцева Э.Г. Разрушение ароматической фракции нефти ассоциацией грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов /Э.Г. Суровцева, В.С.~Ивойлов, С.С. Беляев // Микробиология. 1997. -том 66. -№1. - С. 78-83.

115. Турковская О.В. Разработка'приемов утилизации маслосодержащих сточных вод / О.В. Турковская, А.Ю. Муратова, Л.В. Панченко // Биотехнология. -2000.-№3.-С. 73-82.

116. Улезло И.В. Ассимиляция летучих органических соединений алкалифильны-ми микроорганизмами / И.В. Улезло, A.M. Безбородов // Прикладная биохимия и микробиология. 2007. - № 2. - С. 219-222.

117. Уткин И.Б. Деструкция токсичных органических соединений организмами / И.Б. Уткин, H.H. Якимов, Е.И. Козляк, И.С. Рогожин // Итоги науки и техники ВНИИТИ. Серия Биологическая химия. 1991. - Т.93.-С. 1-56.

118. Федоров А.Ю Защитное действие агара при иммобилизации штаммов -деструкторов ароматических соединений / А.Ю. Федоров, Е.В. Волченко, И.Н. Сингирцев, В.И. Коржневич, Г.М. Шуб // Прикладная биохимия и микробиология. 1999. - № 2. - С. 165-172.

119. Фурсова П.В. Подходы к управлению составом сообщества диссоциантов Pseudomonas aeruginosa: экспериментальные данные и модельные расчеты / П.В. Фурсова, Е.С. Милько, И.А. Ильиных, А.П. Левич // Биотехнология. -2005.-№1.-С. 73-82.

120. Фурсова П.В. Культивирование диссоциантов Pseudomonas aeruginosa в условиях заданного лимитирования / П.В. Фурсова, Е.С. Милько, А.П. Левич // Микробиология. 2008. - №2. - С. 226-231.

121. Хабибуллина Ф.М. Исследование способности нефтеокисляющих бактерий утилизировать углеводороды нефти / Ф.М. Хабибуллина, A.A. Шубаков, И.Б. Арчегова, Г.Г. Романов // Биотехнология. 2002. — №2. — С. 57-62.

122. Холоденко В.П. Биопрепарат для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов / В.П. Холоденко, В.А. Чугунов, З.М. Ермоленко, Р.И. Миронова, H.A. Жиркова, И.И. Мартовецкая // Патент РФ RU 2191752 С2. Приоритет 1999.

123. Шеин Е!В. Полевые и лабораторные методы исследования- физических свойств и режимов-почв / Е.В. Шеин, Т.А. Архангельская,. В ;М. Гончаров, А.К. Губер, T.Hi Початкова, A.M. Сидорова, A.B. Смагин, А.Б. Умарова. М. -2001.-200с.

124. Широких A.A. Изучение конкурентных свойств алюмотолерантного штамма Rhizobium leguminosarum bv trifolii 9-4А антибиотикорезистентным методом /

125. Шкидченко А.Н. Особенности анализа углеводородов в процессе микробной деструкции нефтезагрязнений / А.Н. Шкидченко, В.И. Крупянко, М.У. Арин-басаров, A.M. Воронин // Биотехнология. 2007. - №2. - С.40-44.

126. Шумкова Е.С. Разложение фенола штаммом Rhodococcus opacus IG / Е.С. Шумкова, И.П. Соляникова, Е.Г. Плотникова, JI.A. Головлева // Прикладная биохимия и микробиология. 2009. — №1- С.51-57.

127. Ягафарова Г.Г. Новый нефтеокисляющий штамм бактерий Rhodococcus erythropolis. Г.Г. Ягафарова, И.Н. Скворцова // Прикладная биохимия и микробиология. 1996. - №2. - С.224-227.

128. Ягафарова Г.Г. Экологическая биотехнология в нефтегазодобывающей и нефтеперерабатывающей промышленности / Г.Г. Ягафарова // Уфа: Изд-во УГНТУ.- 2001. -214с.

129. Яскович Г.А. Характеристика гидрофобности поверхности клеток микроорганизмов / Г.А. Яскович, Г.Э. Елькин // Микробиология. 1995. - № 1. - С. 137-139.

130. Яскович Г.А. Изучение гидрофобности поверхности штаммов клеток бактерий / Г.А. Яскович, Е.П. Яковлева // Микробиология. 1996. - № 4. - С. 569571.

131. Яскович Г.А. Роль гидрофобности клеточной поверхности в адсорбционной иммобилизации штаммов бактерий / Г.А. Яскович // Прикладная биохимия и микробиология. 1998. - № 4. - С. 410-413.

132. Яскович Г.А. Микробиологический синтез виразола иммобилизованными клетками / Г.А. Яскович, Е.П. Яковлева // Прикладная биохимия и микробиология. 1999. - № 2. - С. 146-149.

133. Ascencio F., Cell-surface charge and cell-surface hydrophobicity of collagen. binding Aeromonas and Fzèrzo strans / F. A'scencio* G; Johansson,. T. Wadstrom 7/

134. Arch Microbiol. 1995: - №164. - P. 223-230. : ' ' • . ; ' . . '."".

135. Ayo B. Kineticsof glucose and amino acid uptake by attachedi and; free living marine, bacteria in oligotrophic waters / B; Ayo, M. Unanue, I. Azua, G; Gorsky, C. Turley, J. Inberri //Marine Biology. -2001. -№138. - P. 1071-1076.

136. Bell K.S. The genus Rhodococcus / K.S. Bell, J.C. Philp, D.W.J. Aw, N. Christo-phi //Jöumal-of Applied Microbiology. 1998;- Vol;85: -P. 195-210.

137. Bengtsson G. Contribution of suspended and sorbed groundwater bacteria to degradation of dissolved and sorbed aniline / G. Bèngtsson, C. Carlsson // Appl Microbiol Biotechnol. 2001. -№57. - P. 234-241.

138. Bos R. Retentions of bacteria on a substratum surface with micro-patterned hydrophobicity / R.Bos, H.C. van der Mei, J. Gold, H.J. Busscher // FEMS Microbiol. Lett.-2000. Vol.189. - P. 311-315.

139. Bredholt H. Hydrophobicity development, alkane oxidation, and crude-oil emulsification in a Rhodococcus species / H. Bredholt, P. Potocky, K. Eimhjellen // Can. J. Microbiol. 2002. - Vol.48. - P.295-304.

140. Brown W.A. Determing biomass from differential total organic carbon / W.A. Brown, R. Punchik, D.G. Cooper // Biotechnology Techniques. 1997. - Vol.11. -№3. -P.213-216.

141. Bruinsma G.M. Adhesion of Pseudomonas aeruginosa to contact lenses after exposure to multi-purpose lens care solutions / G.M. Bruinsma, J. de Vries, H.C. Van Der Mei, H.J. Busscher // Adhesion Sci. Technol. 2001. - Vol.15. - №12. -P.1453-1461.

142. Busalmen J.P. Influence of pH and ionic strength on adhesion of a wild strain of Pseudomonas sp. to titanium / J.P. Busalmen, S.R. de Sanchez // Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 2001. - Vol.26. - P.303-308.

143. Cammarota M.C. Metabolic blocking of exopolysaccharides synthesis: effect on microbial adhesion and biofilm accumulation / M.C. Cammarota, G.L. Sant' Anna J. // Biotechnology Letters. 1998. - Vol.20. - №1. - P. 1-4.

144. Cauwenberg P. Flotation as a remediation technique for heavily polluted dredged matrial. 1. A feasibility study / P. Cauwenberg, F. Verdonckt, A. Maes // The Science of the Total Environment. 1998. - №209. - P.l 13-119.

145. Cavalca L. Survival and naphthalene degrading activity of Rhodococcus sp. strain 1BN in soil microcosms / L. Cavalca, M. Colombo, S. Larcher, C. Gigliotti, E. Collina, V. Andreoni // Journal of Applied Microbiology. - 2002. - № 92. -P.1058-1065.

146. Chun J. Phylogeny of mycolic acid-contatining actinimycetes / J. Chun, S.-O. Kang, Y.C. Hah, M. Goodfellow // Jornal of Industrial Microbiology. 1996. -Vol.17.-P. 205-213.

147. Colquhoum J.A. Novel rhodococci and other mycolate actinimyces from the deep sea / J.A. Colquhoum, J. Mexson, M. Goodfellow, A.C. Ward, K. Horikoshi, A.T. Bull // Antonie van Leeuwenhoek. 1998. - №74. - P. 27-40.

148. Cowell B.A. A relatively small change in sodium chloride concentration has a strong effect on adhesion of ocular bacteria to contact lenses / B.A. Cowell, M.D.P. Willcox, R.P. Schneider // Journal of Applied Microbiology. 1998. -Vol.84. - P.950-958.

149. Cowell B.A. Effect of nutrient limitation on adhesion characteristics of Pseudomonas aeruginosa / B.A. Cowell, M.D.P. Willcox, B. Herbert, R.P. Schneider // Journal of Applied Microbiology. 1999. - Vol.85. - P.944-954.

150. Cunliffe D. Bacterial adhesion at synthetic surfaces / D. Cunliffe, C.A. Smart, C. Alexander, E.U. Vulfson // Applied and Environmental Microbiology. 1999. -№11. — P.4995-5002.

151. Del'Arco Influence of oil contamination levels on hydrocarbon biodégradation in sandy sediment / J.P. Del'Arco, F.P. de Franca // Environmental Pollution. 2001. — №110. -P.515-519.

152. Fisher J. Inducible aluminum resistance of Acidophilum cryptum and aluminum tolerance of other acidophilic bacteria / J. Fisher, A. Quentmier, S. Gansei, V. Sabados, C. G. Freidrich // Arch Microbiol. 2002. - №178. - P.554-558.

153. Fonseca A.P.Staphylococcus epidermidis RP62A adhesion to chemically modified cellulose derivatives / A.P. Fonseca- P.L.Granja, J.A. Nogueira,' DR. Oliveira, MA. Barbosa,// Journal of. Material Science: Materials in; Medicine. 2001.№12.-P. 543-548. ; ;

154. Goodfellow M. Rhodococcal systematic: problems and ■ developments /• M. Good-fellow, G. Alderson, J. Chun // Antonie van Leeuwenhoek. 1998: -№74. - P. 3• 20. . '■ .■ .

155. Gutnick D.L. Engineering bacterial biopolymcrs for the biosorption of heavy metals; new products and novel formulations / D.L. Gutnick, H. Bach. //Appl Microbiol BiotechnoU- 2000. №54. - P:451-460;

156. Haines J.R. Protocol for laboratory , testing of crude — oil bioremediation products in freshwater conditions / J.R: Haines, K.M. Koran, E.L. Holder, A.D. Venosa // J. Ind. Microbio. Biotechnol. -2003. -№30. P. 107-113.

157. Hamamura N. Microbial .population dynamics associated with crude-oil biodegra-dationiimdiversesoils/N: Hamamura;.S;HLOlson, D:Mi Ward;. WJK Inskeep //

158. Appliedand Enviromental-Microbiology. 2006?- №9:- iP; 6316-6324.192.1wabuchi N.: Relationships among colony morphotypes, cell surface properties and bacterial adhesion to substrata in Rhodococcus / N. Iwabuchi, M. Sunairi, II.

159. Jirasripongpun K. The characterization of oil degrading microorganisms from lubricating oil contaminated (scale) soil / K. Jirasripongpun // Letters in Applied Microbiology. - 2002. - №35. - P. 296-300.

160. Kaper HJ. Characterization of poly(ethylene oxide) brushes on glass surfaces and adhesion of Staphylococcus epidermidis / H.J. Kaper, H.J. Busscher, W. Norde // J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 2003. - Vol.14. - №4. - P. 313-324

161. Karakecili A.G. Comparison of bacterial and tissue cell initial adhesion on hydro-philic/hydrophobic biomaterials / A.G. Karakecili, M. Gumusderelioglu, J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 2002. - Vol.13. - №2. - P. 185-196.

162. Kim Y.H. Development of a carrier for adhesion of nitrifying bacteria using a thermodynamic approach / Y.H. Kim, J.H. Cho, Y.W. Lee, W.K. Lee // Biotechnology Techniques. 1997. - Vol. 11. - №11. - P. 773-776.

163. Maiz I. Evaluation of heavy metal availability in contaminated soils by a short sequential extraction procedure / I. Maiz, M.V. Esnaola, E. Millan // The Science of the Total Environment. 1997. - №206. - P. 107-105.

164. Marino F. Biomass measurement in hydrocarbon fermentation / F. Marino, J.M. Karp, D.G. Cooper // Biotechnology Techniques. 1998. - Vol. 12. - №5. - P. 385-388.

165. Mosoni? P. Competition? between mminalf cellulolytic: bacteria^ for adhesion» to; cellulose / PI Mosoni^GlFonty, P. Gouet // Current Microbiology. 1997.-Vol. 35.-P. 44-47.

166. Nocentini Mi, Bioremediation of soil contaminated by hydrocarbon mixture: the residual concentration probleni / M. Nocentini; D. Pinelli, F. Faba // Chemosphere. -2000.-№41.-P. 1115-1123: ■■ ■ "v':=. ; :

167. Orchard V.A. Selective isolation and occurrence of Nocardiae im soil / V.A. Orchard, M. Goodfellow, S:T. Williams;// SoiliBiology & Biochemistry. 1977. -№9:-P: 233-238.

168. Pruthi V. Rapid identification of biosurfactant-producing bacteria strains using a cell surface hydrophobicity technique7 V: Pruthi, S.S. Cameotra // Biotechnology Techniques. 1997. - Vol. 11.- №9. - P. 671-674.

169. Ramakrishna C. High rate anaerobic digestion of a petrochemical wastewater using biomass support particles / G Ramakrishna, J.D. Desai // World Journal of Microbiology and Biotechnology. 1997. - № 13. - P. 329-334.

170. Rau.buch M. Comparison of microbial properties measured by O2 consumption and microcalorimetry as bioindicators in forest soil / M. Raubuch, F. Beese // Soil Biology & Biochemistry. 1999. -№31.- P. 949-956. :

171. Riley M.S. Rapid phenotypic change and diversification of a soil bacterium during 1000 generations of experimental evolution / M.S. Riley, V.S. Cooper, R.E. Len-ski, L.J. Forney, T.L. Marsh // Microbiology. 2001. - Vol. 147. - P. 995-1006;

172. Sharma S.L. Biodégradation and conversion of alkanes and crude oil by a marine ■ Rhodococcus sp: / S.L. Sharma, A. Pant // Biodégradation. 2000; - № 11. - P.289.294.,. ; ■:

173. Shleeva M.O. Formation and resuscitation of 'non-culturable' cells of Rhodococcus rhodochrous and Mycobacterium tubercidosis in prolonged stationary phase /

174. M.O. Shleeva, K. Bagramyan, M.V. Telkov, G.V. Mukamolova, M. Yong, D.B. Kell, A.S. kaprelyants// Microbiology.-2002. -Vol. 148.-P. 1581-1591.

175. Shultz C.L. Bacterial colonization of rigid gas permeable and hydrogel contact lenses by Staphylococcus aureus / C.L. Shultz, K.S. Kunert, R. White // Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 2000. - Vol. 24. - P. 113-115.

176. Sousa M. Polymeric support for'the adhesion of a consortium of autotrophic nitrifying bacteria / M. Sousa, J. Azeredo, J. Feijo, R. Oliviera // Biotechnology Techniques. 1997. - Vol. 11. - №10. - P. 751-754.

177. Stelmack P! L. Bacterial adhesion to soil contaminants in the presence of surfactants / P. L. Stelmack, M. R. Gray, M. A. Pickard // Applied and Environmental Microbiology. 1999. -№ 1. - P. 163-168.

178. Sutcliffe I.C. Characterisation of a lipomannan lipoglycan from the mycolic acid* **containing actinomycete Dietzia maris / I. C. Sutcliffe // Antonie van Leeuwen-hoek. — 2000. — № 78. P. 195-201.

179. Swannell R.P.J. Field evaluation of marine oil spill bioremediation / R.P.J. Swan-nell, K. Lee, M. McDonagh // Microbiological Reviews. 1996. - Vol. 60. - №2. -P. 342-365.

180. Uraizee F.A. A model for diffused controlled bioavailability of crude oil components / A. F. Uraizee, A.D. Venosa, M.T. Suidan // Biodégradation1. 1998. - №8. -P. 287-296.

181. Van Dyke M.I. Enhanced survival of Pseudomonas fluorescens in soil following establishment of inoculum in a sterile soil carrier / M.I. Van Dyke, J.I. Prosser // Soil Biology & Biochemistry. 2000. -№32. - P. 1377-1382.

182. Veen J. A. Fate and activity of microorganisms introduced into soil / J. A. van Veen, L. S. van Overbeek, J.D. van Elsas // Microbiology and Molecular Biology Reviews.-1997.-Vol. 61.-№2.-P. 121-135.

183. Wei O.F. Oil removal from used sorbents using a biosurfactant / O.F. Wei, R.R. Mather, A.F. Fotheringham // Bioresource Technology. 2005. - № 96. — P. 331334.

184. Xing B. Sorption of naphthalene and phenanthrene by soil humic acids / B. Xing // Environmental Pollution. 2001. - №111. - P. 303-309.

185. Zhang Y. Effect of Pseudomonas rhamnolipid biosurfactant on cell hydrophobic-ity and biodégradation of octadecane / Y. Zhang, R. M. Miller // Applied and Environmental Microbiology. 1994. - № 6. - P. 2101-2106

186. Распределение штаммов по деструкционной активностимазут РДТ85,7-100155

Информация о работе

Самков, Андрей Александрович
кандидата биологических наук
Краснодар, 2009
ВАК 03.00.23

Диссертация

Адсорбционно иммобилизованные нокардиоморфные актиномицеты в биоремедиации нефтезагрязненных объектов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы