Биотехнологические аспекты внутрипопуляционной вариабельности молочнокислых бактерий

Симон, Наталия Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биотехнологические аспекты внутрипопуляционной вариабельности молочнокислых бактерий
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биотехнологические аспекты внутрипопуляционной вариабельности молочнокислых бактерий"

На правах рукописи

003485740

СИМОН НАТАЛИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ВНУТРИПОПУЛЯЦИОННОЙ ВАРИАБЕЛЬНОСТИ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ

03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 3 ДЕК 2009

Москва-2009

003485740

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Российского химико-технологического университета имени Д.И. Менделеева совместно с Институтом микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Эль-Регистан Галина Ивановна

Офицальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Складнее Дмитрий Анатольевич

кандидат технических наук Пичугина Татьяна Викторовна

Ведущая организация:

Научно-Технический Центр «Лекарства и биотехнология» (НТЦ «Лекбиотех»)

Защита состоится «22» декабря 2009 г. в 10.30 часов на заседании объединенного диссертационного совета ДМ 212.204.13 в Российском химико-технологическом университете им. Д.И. Менделеева ио адресу: 125074, Москва, Миусская пл., 9.

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ им. Д.И. Менделеева.

Автореферат разослан «\Я »УисиР^^пО 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета ДМ 212.204.13 Л ив- Шакир

Актуальность проблемы. Ухудшение экологической обстановки, приводящее к снижению защитных сил организма человека и всплеску заболеваний, связанных с нарушением бактериального баланса в желудочно-кишечном тракте, обусловливает постоянный интерес к изучению адаптационных механизмов молочнокислых бактерий (МКБ) |Ъее с1 а1., 2005; ЯосЬа! е1 а1., 2005; НаГакка « а1., 2008; Mengheri, 2008]. Выполняющие защитную и детоксицирующую функцию в организме человека, участвующие в симбиозах как с животными, так и с растениями, МКБ интенсивно используются в производствах про- и пребиотических продуктов; продуктов, нетрадиционно обогащенных молочнокислыми бактериями, например, таких как мороженое, соевый йогурт, шоколад, овощные лактоферментированные соки; натуральных пищевых консервантов; а также применяются в медицине как лечебные средства ¡ТапшогЛ е1 а1., 2007; Яи ег а!., 2007; КатсИалёгап « а1., 2008; МасГаг1апе е1 а1., 2008]. Внимание исследователей к изучению способности МКБ переживать неблагоприятные условия вызвано как теоретическим интересом, так и необходимостью создания кисломолочных продуктов с жизнеспособными клетками МКБ, длительное время сохраняющими способность к пролиферации, а при попадании в желудочно-кишечный тракт быстро адаптирующимися и возобновляющими активный метаболизм.

В ответ на изменения условий окружающей среды, связанные с исчерпанием питательных веществ, источников энергии и пространства, или с воздействиями повреждающих факторов (ухудшением физико-химических условий, антимикробными агентами и т.д.), микроорганизмы включают ряд защитных механизмов для адаптации клеток в пределах нормы реакции вида или для его выживания в виде покоящихся форм (ПФ) в неростовых условиях [\Voolin й а1., 2001; Бухарин с соавт., 2005]. Свой вклад в адаптацию вносит внутрипопуляционная фенотипическая вариабельность, от которой зависит результативность симбиозов, замещение и поддержание продуктивных вариантов [НаИй а1., 1997; Головлев, 1998; Прозоров, 2000; ^/ош1е е1 а1., 2004]. Согласно ряду гипотез, процесс диссоциации связан с состоянием покоя, при выходе из которого меняется соотношение диссоциантов в популяции [Дорошенко с соавт., 2002], и действием сигнальных молекул, контролирующих экспрессию генов стационарной фазы и

переход клеток в состояние покоя [Suh et al., 1999]. Среди внеклеточных метаболитов такими функциями обладают видонеспецифичные ауторегуляторы - аутоиндукторы анабиоза, выделенные и описанные для большого числа микроорганизмов, и представленные у ряда бактерий и дрожжей алкилоксибензолами (АОБ) [Бухарин с соавт., 2005; Эль-Регистан с соавт., 2006]. Изучение механизмов адаптации к неблагоприятным воздействиям, в том числе за счет внутрипопуляционных диссоциативных переходов, и использование выявленных закономерностей для направленной регуляции популяционной вариабельности МКБ представляют значительный интерес для микробиологии, биотехнологии производства про-, пребиотиков и медицины.

Цель работы: изучить закономерности регуляции адаптивных реакций молочнокислых бактерий; выявить особенности их внутрипопуляционной вариабельности; разработать приемы контроля диссоциативных переходов; выяснить роль алкилоксибензолов в регуляции стрессовых реакций МКБ.

Задачи исследования:

1. Изучить адаптационные ответы молочнокислых бактерий Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus AT-41, Lactococcus lactis ТБ2 на стрессовые воздействия как «запрограммированные» в онтогенезе - исчерпание источников питания, так и «незапрограммированные» - действие антибиотиков.

2. Изучить закономерности фенотипической диссоциации МКБ, охарактеризовать выделенные диссоцианты по их колониально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам.

3. Разработать приемы контроля диссоциативных переходов бактерий.

4. Изучить роль АОБ в регуляции адаптивных реакций бактерий: контроле экспрессии стрессовых генов и повышении частоты диссоциативных переходов.

5. Разработать биотехнологические приемы получения овощных лактоферментированных напитков.

Научная новизна. 1. Впервые показано, что при возникновении неблагоприятных для роста условий молочнокислые бактерии L. plantarum, L. acidophilus AT-41, L. lactis ТБ2, как и другие неспорообразующие бактерии, образуют клетки, обладающие всеми признаками покоящихся форм. Установлено, что образование и свойства ПФ

молочнокислых бактерий зависят от условий роста культур (модификации сред) и их постстационарной инкубации. На моделях L. acidophilus и L. plantarum продемонстрирован внутривидовой полиморфизм покоящихся форм МКБ -образование как цистоподобных покоящихся клеток (ЦПК), так и переживающих клеток L-типа. 2. Разработаны приемы регуляции виутрипопуляционной изменчивости промышленных штаммов L. acidophilus АТ-41 и L. lactis ТБ2. Найдены селективные условия для стабилизации развития недоминантных вариантов. Выделены и охарактеризованы колониально-морфологические варианты этих бактерий. 3. Обнаружена способность алкилоксибешолов контролировать включение защитных функций микроорганизмов путем индукции экспрессии стрессовых генов и повышения частоты виутрипопуляционных диссоциативных переходов, обусловливающих фенотипическую изменчивость бактерий. Установлена зависимость регуляторпых эффектов АОБ от их структуры (длины алкильного радикала) и концентрации. 4. Выявлена регуляторная функция АОБ в контроле виутрипопуляционных диссоциативных переходов бактерий. Обнаружена зависимость частоты вьпцепления недоминантных вариантов от структуры и концентрации АОБ. 5. Выявлена роль ддинноцепочечных АОБ как алармонов (сигналов тревоги) в активации стрессовых генов SOS-ответа и rpoS-регулона. 6. Продемонстрированы протекторные функции короткоцепочечных АОБ в защите клеток от УФ-облучения, что выражается в снижении уровня экспрессии генов SOS-ответа.

получения нового лактоферментированного продукта на основе овощного сока, обладающего высокой пробиотической потенцией. 4. Возможность направленной регуляции экспрессии стрессовых генов может быть использована в целях генной инженерии. 5. Показанные антимутагенные и протекторные свойства короткоцепочечных АОБ в отношении повреждающих агентов различной природы могут быть использованы в биотехнологических процессах и медицинской практике.

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на Всероссийской молодежной школе-конференции (ИНМИ, Москва, 2005); Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов, 2007); Международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (Москва, 2008); Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, 2008). По материалам диссертации опубликовано 8 работ: из них 4 статьи в рецензируемых журналах, утвержденных в перечне ВАК; 4 тезиса.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 152 страницах и состоит из введения, обзора литературы (Глава 1), экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 235 публикаций отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 19 таблицами и 21 рисунком.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования в работе были молочнокислые бактерии Lactobacillus acidophilus АТ-41, Lactococcus lactis ТБ2 и Lactobacillus plcinlarum\ бактерии Bacillus subtilis trpAS В 1733; Escherichia coll C600 thi, thr, leu A(pro-lac)', Pseudomonas aeruginosa K2.

Бактерии L. acidophilus выращивали на питательной среде MRS [Todorov et al., 2009], L. lactis - на среде M21, L. plantarum - на питательной среде «Бифидум» [Тренина с соавт., 1997], В. subtilis trpA5 В 1733, ауксотрофный по триптофану мутант, - на среде [Дорошенко с соавт., 2001], Е. coli - на среде LB [Baev et al., 2006], P. aeruginosa K2 - на минеральной среде [Милько с соавт., 2008] в колбах объемом 250 мл (50 мл среды) на качалке (140 - 160 об/мин) при 37°С (L. acidophilus), 28°С (I.

¡aclis, В. subtilis), 30°C (L. plantarían, E. coli и P. aeruginosa).

Микробиологические методы. Оптическую плотность клеточных суспензий (ОП) определяли на спектрофотометре «Specord» (1=600 им, (=10 мм). Численность жизнеспособных колониеобразующих клеток (КОЕ) определяли при высеве клеточных суспензий из соответствующих разведений на агаризованные среды. Термоустойчивость клеток МКБ определяли при прогреве клеточных суспензий (0.2 мл) в ультратермостате «UV-10» при температуре 60°С в течение 15 минут с последующим определением числа КОЕ. Эндогенное дыхание клеток определяли по методу Шольца-Островского на полярографе LP7E в кислородной ячейке объемом 1 мл [Шольц-Островский, 1975]. Микроскопические наблюдения проводили на микроскопе «Amplival» с фазово-контрастным устройством. Ультратонкие срезы бактерий получали по методу [Spurr et al., 1980] и просматривали на микроскопе JEM-100B (Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ и инструментальном увеличении в 10000 - 35000 раз. Покоящиеся цистоподобные клетки МКБ получали, подвергая бактерии стрессорным воздействиям [Мулгокин с соавт., 1996; Демкипа с соавт., 2000]. Диссоцианты L. acidophilus и L. ¡actis получали при рассеве ЦПК этих бактерий на агаризованные среды MRS и М21 с пересевом определенного морфотипа (по 5 клонов) последовательно в 5 — 6 пассажах. Индекс диссоциации популяции определяли как долю (%) колоний определенного морфотипа к общему числу колоний. Определение антагонистической активности МКБ проводили методом развивающихся смешанных популяций тестерных штаммов Е. coli Kl 2 и S. aureus 209-Р [Сборник инструкций по селекции молочнокислых бактерий и подбору заквасок для кисломолочных продуктов. М.: ВНИМН, 1986]. Адгезивную способность клеток МКБ оценивали по результатам подсчета клеток в флюоресцентном микроскопе Axio Imager Dl (Carl Zeiss, Германия) после их адсорбции на гидрофильной поверхности при прокрашивании флюоресцентным красителем акридиновым оранжевым [Аристовская с соавт., 1962].

Генетические методы. Мутагенную активность химических аналогов микробных аутоиндукторов анабиоза С7- и Сп-АОБ определяли в тесте реверсий к прототрофности бактерий В. subtilis trpAS В 1733, растущих без метаболической активации [Marón, Ames, 1983]. Тестерные штаммы для определения экспрессии

стрессовых генов получали на основе бактерии Е. coli С600 thi, thr, leu ts (pro-lac). Клонирование лидерной области гена osmE (кодирует липопротеины наружной мембраны, находится в составе фоХ-регулона) и гена umuD (кодирует ДНК-полимеразу Pol V SOS-ответа) проводили, амплифидируя их (ПЦР) с использованием фланкирующих праймеров. ПЦР проводили на приборе Gene Amp PCR System 2400 (фирма «Perkin-Elmer Cetus»), подбирая температурный режим с учетом длины и состава амплифицируемого фрагмента и праймеров. Выделение и очистку ПЦР продуктов проводили с использованием набора GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit (фирма «GE Healthcare»). Праймеры генов osmE и umuD содержали сайты узнавания для эндонуклеаз рестрикции EcoRI и BamHI, соответственно. Полученные ПЦР-фрагменты клонировали в полилинкерную последовательность экспрессионных малокопийных векторов pJEL250 (транскрипционный) и pJEL246 (трансляционный), содержащих реперный ген lacZ и детерминант устойчивости к ампициллину (AmpR) [Zolotukhina et al., 2003]. Векторы с помощью трансформации [Mandel, Higa, 1992] переносили в реципиентный штамм Е. coli. Таким образом, были получены штаммы:

ит250-Е. coli С600 thi, thr, leu&(pro-lac)/pSEL250AmpRumuD-lacZ; um246-E. coli С600/Й;, thr, leu A(pro-lac)/p]EL246AmpKumuD-lacZ; os250-E. coli C600 thi, thr, leu&(pro-lac)/p}EL250Amp%smE-lacZ; os246 - E. coli C600 thi, thr, leu A(pro-lac)lp3EL246Amp%smE-lacZ.

Биохимические методы. Активность ß-галактозидазы в клетках, дважды отмытых Z-буфером, определяли с помощью стандартной методики расщепления субстрата о-нитрофенил-/3-галактопиранозида, принимая за единицу активности такое количество фермента, которое давало увеличение ОП при 420 нм на 1 ед за 1 мин [Миллер, 1976].

Лабораторный образец овогцного лактоферментированного напитка готовили на основе свекольного сока. В качестве закваски использовали культуру L. acidophilus (5% от объема среды). Определите органолептических (цвет, аромат, вкус) и физико-химических показателей готового напитка (активная кислотность,

содержание сухих веществ, титруемая кислотность) проводили по стандартным методикам [Ермолаева с соавт., 2000].

Статистическую обработку проводили стандартными методами в программе Microsoft Excel ХР. Значение искомого параметра выражачи как среднюю величину из трех независимых экспериментов с учетом значений стандартного отклонения. Различия между группами данных считали достоверными при критерии вероятности Р < 0.05.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Адаптация МКБ к стрессу, образование ПФ

Показано, что адаптация молочнокислых бактерий к неблагоприятным для роста условиям - исчерпанию источников питания, нехватке жизненного пространства (сверхкритической клеточной плотности популяции), дисбалансу по одному или нескольким источникам питания (С, N, Р) или действию антимикробных агентов -включает: I) образование цистоподобных покоящихся клеток, предназначенных для переживания и сохранения вида; 2) реализацию внутрипопуляциошюй фенотипической вариабельности, что проявляется при рассеве ЦПК на плотные среды развитием различающихся по морфологическим признакам колоний, в том числе, недоминантных типов.

В адаптационном ответе оценивали: сохранение жизнеспособности клеток МКБ (КОЕ) в течение длительного времени (1 - 12 мес); образование метаболически неактивных покоящихся форм; а также изменение диссоциативного спектра популяций, вырастающих при рассеве ПФ.

В экспериментах с L. plantarum имитировали стрессовые условия, возникающие в цикле развития культур микроорганизмов при исчерпании источников питания и/или нехватке жизненного пространства. Такая ситуация моделировалась сгущением клеточных суспензий МКБ в 10, 20. 30 раз с последующим их хранением в течение 4 мсс в среде роста с и без СаС12 0.02%, в фосфатном буфере с Si02 0.09%. В автолизирующихся сгущенных клеточных суспензиях L. plantarum число КОЕ (рис. 1) снижалось на три порядка в течение первых двух месяцев хранения с дальнейшей стабилизацией на уровне 0.03 - 0.09%, что зависело от среды, в которой хранились клетки.

0 12 3 4 5

время хранения, мес

Рис. 1.Динамика численности жизнеспособных (КОЕ) покоящихся клеток МКБ при длительном хранении их суспензий:

(1) L. plantarum в фосфатном буфере с Si02 0.09%, сгущение в 30 раз;

(2) L. plantarum в фосфатном буфере с Si02 0.09%, сгущение в 20 раз;

(3) L. acidophilus в среде роста, сгущение в 20 раз;

(4) L. acidophilus в среде роста, сгущение в 10 раз;

(5) L. plantarum в среде роста с СаС12 0.02%, сгущение в 10 раз;

(6) L. plantarum в среде роста, без сгущения;

(7) L. acidophilus в среде роста, без сгущения.

Электронно-микроскопически было установлено, что переживающая популяция (4 мес) представлена двумя типами форм, имеющими существенные отличия в ультраструктурной организации от вегетативных клеток: 1) цистоподобными покоящимися клетками, описанными ранее для ряда неспорообразующих бактерий [Бабусенко с соавт., 1991; Мулюкин с соавт., 1996; Демкина с соавт., 2000] (рис. 2а, б); 2) L-формами (рис. 2в). ЦПК - клетки с уплотненной и утолщенной клеточной стенкой, гетерогенной текстурой цитоплазмы, компактизованным нуклеоидом. L-формы - клетки, лишенные клеточной стенки с комковатой цитоплазмой и слабо компактизованным нуклеоидом. ЦПК (4 мес) не проявляли метаболической активности (эндогенное дыхание отсутствовало) и обладали высокой устойчивостью к действию повышенных температур (табл. 1). Термообработка (60°С, 15 мин) вегетативных клеток культур экспоненциальной и стационарной (48 ч) фаз роста приводила к их гибели, тогда как ЦПК опытных вариантов сохраняли жизнеспособность на уровне 0.8 - 8.0% (от численности клеток до термообработки).

Эксперименты с L. acidophilus выявили сходную картину: в сгущенных в 10 и 20 раз (в среде роста) клеточных суспензиях через 4 месяца число КОЕ составляло 1.0 и 1.5% от значения КОЕ в стационарной фазе, соответственно (рис. 1). Микроскопические наблюдения показали, что часть клеток популяции L. acidophilus сохраняла интактность, и через месяц хранения до 50% из них приобретали рефрактерность, что является одним из морфологических признаков ПФ (рис. 2г). Электронно-микроскопически в сгущенных суспензиях L. acidophilus (4 мес) также обнаружили ПФ двух типов (рис. 2д): ЦПК, аналогичные ЦПК L. plantarum, и клетки существенно меньших размеров с электронноплотной цитоплазмой. ПФ обоих типов характеризовались отсутствием эндогенного дыхания и терморезистентностью: доля жизнеспособных клеток после прогревания (60°С, 15 мин) составила 0.5 - 7.0%.

Таблица 1. Термоустойчивость покоящихся форм L. plantarum (4 мес хранения).

Условия получения ПФ Число жизнеспособных ПФ L. plantarum, КОЕ/мл (% от КОЕ до термообработки)

До термообработки После термообработки, 60°С, 15 мин

Клетки экспоненциальной фазы роста 2.3x10" (100) 0

Клетки стационарной фазы роста (48 ч) 3.9x10s (100) 0

Хранение в среде роста с СаСЬ, сгущение в 10 раз 3.2x10" (ЮО) 2.7 х 10J (0.8)

Хранение в фосфатном буфере с 8Юг, сгущение в 30 раз 4.0x106 (100) 3.2х 103 (8.0)

Покоящиеся формы МКБ были также получены в условиях их роста в средах с дисбалансом C/N: для L. acidophilus - при 5-ти кратном снижении количества азота, для L. lactis - глюкозы, а также при перенесении стационарных клеток в среду с полным отсутствием глюкозы. В 4-х месячных опытных культурах МКБ сохранялось высокое число КОЕ - до 10% от их численности в стационарной фазе. Число КОЕ в контрольных культурах, выращенных на стандартной среде, в течение первых двух месяцев хранения снижалось на 5 - 6 порядков (L. acidophilus) и падало до единиц (/.. lactis). Особенности ультраструктуры, термоустойчивость и отсутствие метаболической активности клеток в постстационарных культурах позволили их охарактеризовать как покоящиеся формы.

Рис. 2 Микроскопические снимки покоящихся клеток МКБ, полученных в сгущенных в 20 раз клеточных суспензиях, (а-в) - ультратонкие срезы ПФ L. plantarum: а - ЦПК, время хранения 3 нед; б - ЦПК, время хранения 4 мес; в - лишенные клеточной стенки L-формы, время хранения 4 мес; (г, д) - ЦПК L. acidophilus, время хранения 4 мес: г -фазовый контраст; д - ультратонкие срезы. Обозначения: КС - клеточная стенка, ЦПМ -цитоплазматическая мембрана, КН - компактизованный нуклеоид, КТЦ - комковато-текстурированная цитоплазма. Длина масштабной метки: а, б, в, д - 1 мкм; г - 2 мкм.

Такая же форма адаптации к неростовым условиям наблюдалась у МКБ при «^запрограммированном» стрессе, вызванном воздействием антибактериальных агентов, что моделировало ситуацию, часто возникающую при антибиотикотерапии, приводящую к гибели МКБ и развитию дисбактериозов. Обработка культур лактобацилл L. acidophilus экспоненциальной фазы роста эритромицином (30, 100 мкг/мл) индуцировала быстрый лизис большей части клеточной популяции (число КОЕ снижалось до 50-100 ед/мл). При действии ампициллина (30,100 мкг/мл) число КОЕ через 10 суток составляло 0.8 - 1.0% от первоначального. Оставшиеся интактными клетки уменьшались в размерах и ■ приобретали ультраструктуру, характерную для ПФ этих бактерий (рис. 2д).

Таким образом, МКБ формировали в циклах развития их культур или при повреждающих воздействиях клетки, обладающие всеми признаками покоящихся форм: длительным сохранением жизнеспособности в условиях, способствующих автолизу (хранение при комнатной температуре в жидких средах); отсутствием метаболической активности (эндогенного дыхания); устойчивостью к стрессовым воздействиям (термообработке); особенностями ультратонкой организации, свидетельствующими о существенных внутриклеточных структурных перестройках. Количество, свойства и полиморфизм образующихся покоящихся форм МКБ зависели от условий роста культур (модификация сред) и их постстационарной инкубации.

3.2 Популяциоиная вариабельность МКБ, селекция вариантов

При рассеве на плотных средах полученных покоящихся клеток МКБ было отмечено изменение диссоциативного спектра выросшей популяции по морфологическим признакам колоний. У L. acidophilus по мере хранения ПФ в автолизирующихся суспензиях наблюдалось существенное (до 50 - 60%) возрастание доли минорного диссоцианта S-типа (рис. 3). В контроле (хранение в среде роста) доля S-диссоцианта составила 6 и 30% на 10 и 30 сутки хранения, соответственно.

В процессе хранения лактобацилл на среде, лимитированной по азоту, доля минорного диссоцианта увеличивалась постепенно o r 23% на 10 до 68% на 30 сутки, соответственно (рис. 4).

При рассеве суспензий ПФ L. lactis, полученных в культурах, лимитированных по источникам питания, также было обнаружено увеличение доли минорного R-диссоцианта (у L. lactis доминантным является S-диссоциант), а диссоциативный переход был выражен значительно сильнее, чем у L. acidophilus. Через 25 суток хранения в суспензиях ПФ L. lactis (рост при лимите глюкозы) обнаруживались только клетки, дающие колонии R-типа, тогда как в контрольных вариантах (рост на полноценной среде) выщепления R-диссоцианта не наблюдалось (рис. 4). Для стабилизации развития S- или R-вариантов требовалось применение селективных условий. Преимущественный рост S-варианта L. lactis наблюдался на полноценной среде М21 как при так и при 37 С, тогда как R-варианта - на разбавленной в 5 раз среде М21 и температуре 28°С.

10 25 30

срок хранения, сут

Рис. 3. Доля (%) минорного S-варианта L. acidophilus при рассеве клеток, хранившихся: 1 - в среде роста; 2 -при сгущении в 10 раз; 3 - при сгущении в 20 раз.

10 25 30

срок хранения, с/т

25 30 срок хранения, сут

Рис. 4. Индекс диссоциации (% минорного диссоцианта): (a) L. acidophilus при рассеве ПФ, хранившихся в стандартной среде роста - 1 и в среде с лимитом по азоту - 2; (б) L. lactis при рассеве ПФ, хранившихся в стандартной среде роста - 3, в среде с лимитом глюкозы - 4, в голодной среде (без глюкозы) - 5.

Таким образом, в настоящей работе выявлены закономерности регуляции внутрштопуляционной вариабельности МКБ. Показано, что величина изменений диссоциативного спектра культур зависит от характера стрессового воздействия. Так, цри хранении культур L. acidophilus доля минорного варианта через 11 сут инкубации составляла: в стареющей культуре - 6%; в сгущенной в 10 раз клеточной суспензии -56%; при внесении ампициллина - 30%.

Следует подчеркнуть важность реализации адаптационного потенциала (внутрипопуляционной изменчивости) бактерий не только при действии внешних стрессоров, но и в условиях постоянно повторяющихся «запрограммированных» стрессов в цикле развития культур, что было подтверждено на модели смешанной культуры диссоциантов (S+M) P. aeruginosa. Увеличение доли М-клеток в развивающейся популяции в лаг-фазе до 80% (стресс новой среды) и фазе отмирания до 95% (стресс голодания) можно объяснить селективным развитием М-диссоцианта, более стрессоустойчивого и имеющего низкую скорость роста.

3.3 Колониально-морфологические и физиолого-биохимические свойства

Адаптационный потенциал изменений диссоциативного спектра популяции определяется различиями свойств вариантов, развивающихся в данных условиях. При изучении свойств диссоциантов L. acidophilus показано, что S-диссоциант обладал более высокими максимальной удельной скоростью роста и уровнем накопления биомассы (в 1.5 и 1.2 раза, соответственно), чем доминантный R-вариант. Терморезистентность клеток S-диссоцианта (60°С, 15 мин) была в 3.3 раза выше, чем клеток R-варианта (рис. 5). Степень антимикробной активности в отношении тестерных штаммов Е. coli К12 и S. aureus Р-209 также была больше у S-диссоцианта (табл. 2). Однако, адгезивная способность клеток была выше у R-варианта, что, по-видимому, должно обеспечивать его

диссоциантов L. acidophilus

«сходный штамм

Рис. 5. Термоустойчивость клеток диссоциантов L. acidophilus.

доминирование при колонизации биотопа, и предполагает предпочтительность применения этого диссоцианта в производстве препаратов медицинского назначения. Напротив, S-диссоциант L acidophilus, обладающий лучшими физиолого-биохимическими характеристиками целесообразно использовать в приготовлении кисломолочных продуктов.

Таблица 2. Антагонистическая активность исходного штамма и диссоциаятов L. acidophilus в отношении тестерных штаммов Е. coli К12 и S. aureus 209-Р.

Жизнеспособность клеток условно-патогенных штаммов, КОЕ/мл х 10* (%)

тестерный штамм Варианты опыта

контроль (монокультура тестсрного штамма) Совместное культивирование с L. acidophilus

Исходный штамм лактобацилл R-вариапт S-вариант

Е. coli 1.3 (100) 0.07 (4.4) 0.04 (3) Полное подавление роста

S. aureus 0.38 (100) 0.03(1.68) Подавление роста на 5 порядков Полное подавление роста

3.4 Получение овощного лакггоферментированного напитка

В наших экспериментах 8-вариант был использован в качестве закваски для разработки нового лактоферментированного диетического напитка на основе сока столовой свеклы. Напиток получали добавлением закваски к рецептурной среде с последующей инкубацией при 37°С в статических условиях в течение 24 ч. Органолептическая оценка лабораторного образца лактоферментированного овощного напитка по показателям цвета, аромата и вкуса показала его отличные качества. В процессе хранения (20 сут) готового продукта оценивали его физико-химические показатели. Через 24 ч ферментации значение рН снижалось до 4.2, а затем стабилизировалось. Показатели титруемой кислотности увеличивались от 4.2 моль №ОН/л до 7.6 на 20 сутки хранения. Содержание сухих веществ за время брожения (24 ч) уменьшилось на 1.6% и на 20 сутки составило 5.6%. Важным потребительским свойством напитка являлось сохранение в нем высокого титра жизнеспособных клеток МКБ (по показателям КОЕ), число которых в готовом напитке (24 ч) составляло 3.2Х107 кл/мл и на 20 сутки хранения изменилось

незначительно - 2.1*106 кл/мл, что свидетельствовало о высоких лечебно-профилактических свойствах продукта.

3.5 Участие алкилоксибензолов в механизмах адаптации бактерий

Адаптационный потенциал микроорганизмов, проявляющийся при сублетальных стрессорных воздействиях, помимо изменения метаболической активности клеток, включает: увеличение частоты адаптивных мутаций; экспрессию стрессовых генов, в том числе системы SOS-ответа как реакцию на внешние стрессорные воздействия [Aburatani et al., 2005] и общего rpoS-регулона стационарной фазы в ответ на «запрограммированный» стресс [Saint-Ruf et al., 2007]; а также реализацию внутрипопуляционной фенотипической вариабельности, вызываемой процессами обратимой внутригеномной рекомбинации генетического материала клетки [Woude, Baumler, 2004]. Фенотипические (фазовые) переходы связаны с остановкой клеточного деления, в частности при переходе культуры в стационарную фазу [Frenkiel-Krispin et al., 2001], что, как было установлено ранее, сопряжено с повышением в культуре уровня АОБ [Светличный с соавт., 1987; Эль-Регистан с соавт., 2006]. С другой стороны, на модели теплового шока у Micrococcus luteus было показано, что биосинтез АОБ стимулируется при нелетальном стрессе [Степаненко с соавт., 2005; El-Registan et al., 2005]. В настоящем исследовании изучали функционирование АОБ в качестве сигнала, свидетельствующего о повышении частоты внутрипопуляционных диссоциативных переходов и регуляции экспрессии стрессовых генов SOS-системы и rpoS-регулона.

Влияние АОБ на стабильность генома клеток бактерий определяли в тесте реверсий к прототрофности клеток штамма В. subtilis trpA5. Гомологи С7- и С12-АОБ применяли для обработки клеток в концентрациях, при которых ростингибирующая активность АОБ не перекрывала прогнозируемый мутагенный эффект: С7-АОБ - до 100 мкг/мл, а С[2-ЛОБ - до 50 мкг/мл. Было показано влияние физиологического возраста клеток на соотношение субпопуляций фенотипически различающихся вариантов после устранения индуцирующего фактора - воздействия АОБ. Так, обработка С12-АОБ (5 мкг/мл, 1 ч) клеток экспоненциальной культуры увеличивала частоту реверсий в 43 раза, при одновременной индукции перехода исходного R- в S-фенотип (доля S-варианта составила 87% против 2% в контроле) (табл. 3). Клетки

стационарной фазы были более устойчивы к действию С12-АОБ: увеличение частоты реверсий в 4 и 125 раз наблюдалось при использовании концентраций 10 и 50 мкг/мл, параллельно с увеличением среди ревертантов доли S-варианта до 50 и 84%, соответственно (в контроле 5%) (табл. 3). Менее гидрофобный С7-АОБ проявлял слабое мутагенное действие и только в отношении клеток экспоненциальной фазы роста: в концентрации 50 мкг/мл вызывал увеличение частоты реверсий в 2.5 раза и доли минорного S-варианта до 40%. В отношении клеток стационарной фазы роста С7-АОБ проявлял антимутагенную активность, частота реверсий к прототрофности была достоверно ниже, чем в контроле при всех исследуемых концентрациях ауторегулятора.

Таблица 3. Превышение частоты реверсий к прототрофности над спонтанным фоном и диссоциативный переход доминантного варианта Я—>8 шт. В. зиЫШя 1грА5 В 1733 под действием С^-АОБ.

Превышение частоты Индекс диссоциации среди

Концентрация С и-АОБ, мкг/мл реверсий к ревертантов,%

прототрофности над спонтанным фоном, раз ^доминантный S

Экспоненциальная фаза роста

0 1.0 98 2

1 1.3 95 5

5 43.0 13 87

50' 1650 31 69

Стационарная фаза роста

0 1.0 95 5

1 1.1 92 8

5 1.2 88 12

10 4.0 50 50

50 125.0 16 84

в концентрации 50 мкг/мл С12-АОБ вызывал ингибирование роста экспоненциальных клеток, поэтому данные некорректны, приведены для сравнения

Таким образом, эксперименты выявили: 1) корреляцию между частотой реверсий к прототрофности и интенсивностью диссоциативных переходов (Я—»Б), которые индуцируются при определенных и одинаковых для обоих событий концентрациях С12-АОБ; 2) индуцирующее геномные перестройки, а не селективное действие АОБ, так как диссоциативный переход фенотипов Я—наблюдался при кратковременном (1 ч) воздействии АОБ на клетки, в отличие от развития бактерий в среде роста,

содержащей ЛОБ [Ильинская с соавт., 2002]; 3) зависимость эффектов АОБ от чувствительности к ним клеток различного физиологического возраста.

Участие АОБ в контроле диссоциативных переходов может быть обусловлено показанным ранее в опытах in vitro их взаимодействием с ДНК, что приводит к изменениям ее топологии и физико-химических характеристик [Давыдова с соавт., 2005, 2006], и может отражаться на результативности реакций, вызывающих внутригеномные перестройки. Однако, более вероятным представляется влияние АОБ на активность ДНК-ассоциированных или рсгуляторных белков, учитывая функционирование АОБ как модификаторов ферментных белков [Петровский с соавт., 2009].

Участие АОБ в регуляции экспрессии генов SOS-ответа (гена umuD) и rpoS-регулона стационарной фазы (гена osmE) изучали с использованием тестерных штаммов Е. coli (ит250, os250, ит24б, os246) путем определения уровня ß-галактозидазы, синтезируемой в гибридных оперонах при соответствующих стрессовых условиях и при экзогенном внесении АОБ в концентрациях, не вызывающих ингибирования роста: Qj-AOB - до 100 мкг/мл, С7-АОБ - до 600 мкг/мл.

В клетках штаммов ит250 и ит246 при возрастании дозы УФ-облучения, не снижающей численности КОЕ, активность ß -галактозидазы увеличивалась в 1.5 -2.4 раза, что свидетельствовало о реализации SOS-ответа (табл. 4).

Таблица 4. Активность ß -галактозидазы в клетках штаммов ит250 и ит246 после действия УФ-облучения.

Время облучения, с Активность ß -гал; (изменение базового у] штозидазы, ед/мин ровня активности, раз)

транскрипционный фыоз (шт. ит250) трансляционный фьюз (шт. ит246)

0 133.2 51.5

60 206.5 (1.55) 87.6(1.70)

120 293.0 (2.19) 123.6(2.40)

В клетках штаммов об250 и оз246 стационарной фазы роста уровень /?-галактозидазы был в 2 раза выше, чем в клетках экспоненциально растущей

культуры (рис. 6), что указывало на активацию гро5-регулона в условиях стресса голодания.

экспонента стационар

экспонента

стационар

Рис. 6. Экспрессия гибридного оперона озтЕ-1ас2 в клетках различных фаз роста: (а) Е.соИ шт. 05250 с транскрипционным фьюзом и (б) Е.соЦ шт. оя246 с трансляционным фьюзом.

Действие гидрофобного длинноцепочечного С^-АОБ (50, 100 мкг/мл) на клетки штаммов, тестерных для ЗОБ-ответа, приводило к пропорциональному концентрациям увеличению активности /3-галактозидазы (до 2 раз от базового уровня), что свидетельствует об активирующей 805-ответ функции длинноцепочечных АОБ (рис. 7). При внесении С]гАОБ в культуры штаммов, тестерных для гро8-регулона, как экспоненциальной, так и стационарной фаз роста, наблюдали дозозависимое увеличение (до 2 и более раз) экспрессии гибридного оперона о$тЕ-1ас2. При этом активность /?-галакгозидазы в клетках с трансляционным фыозом при всех концентрациях С^-АОБ была ниже контрольного уровня активности фермента (без АОБ) в клетках, содержащих транскрипционный фьюз, что позволяет сделать вывод о действии С12-АОБ на уровне транскрипции (табл. 5). Дозозависимое действие длинноцепочечных АОБ на повышение экспрессии (в 2 - 3 раза) стрессовых генов до такой же величины, что и при действии естественных стрессоров (УФ-облучение, голодание) свидетельствует о функции АОБ как алармонов - сигналов тревоги, контролирующих включение защитных функций организма (табл. 5, рис. 7). Результаты эксперимента согласуются с ранее

полученными данными о повышении а микробной культуре уровня АОБ (вне- и внутриклеточного) при сублетальных стрессах, вызванных воздействием голодания, теплового шока и др. [Степаненко с соавт., 2005; Эль-Регистан с соавт., 2006].

К 10 50 100 К 10 50 100

С,3 -АОБ, мкг/мл С1г-АОБ, мкг/мл

Рис. Активность Р -галактозидазы (ед/мин) в пролиферируюших клетках Е. соН штаммов ит250 (а) и ит246 (б) при действии: УФ-облучения - (К); С^-АОБ в концентрациях 10, 50 и 100 мкг/мл. Полосатые столбики - базовый уровень экспрессии реперного гена. Цифры - изменение уровня экспрессии, раз.

Таблица 5. Активность р-галактозидазы в клетках штаммов О5250 и 05246 после действия С,2-АОБ.

Концентрация С]2-АОБ, мкг/мл Активность /? -галактозидазы, ед/мин

(изменение базового уровня активности, раз)

экспонента стационар

транскрипционный фыоз (шт. О5250)

0 1882.0 2800.0

1 1660.0 (0.88) 2408.0 (0.86)

5 1675.0 (0.89) 2660.0 (0.95)

10 1693.0(0.89) 3266.0(1.16)

35 2512.0(1.33) 4049.0 (1.44)

70 3636.0(1.93) 6022.0(2.15)

трансляционный фьюз (шт. о$246)

0 812.0 940.0

1 844.5 (1.04) 1137.0 (1.20)

5 982.5 (1.20) 1128.0(1.20)

10 998.8 (1.23) 1629.0 (1.80)

35 1232.2 (1.51) 1692.0(1.80)

70 1538.0 (1.89) 2800.5 (2.97)

Действие другого короткоцепочечного гомолога С7-АОБ качественно отличалось от эффектов, вызываемых С12-АОБ. В диапазоне физиологических концентраций 10 -100 мкг/мл он вызывал достоверное снижение экспрессии гибридных оперонов итиО-1ас2 и оатЕ-1ас2 по сравнению с базовым уровнем в клетках тестерных штаммов Е.соП (табл. 6,7).

Таблица 6. Активность /1 -галактозидазы в клетках штаммов ит250 и ит246 после действия С7-АОБ.

Концентрация С7-АОБ, мкг/мл Активность /?-гал; (изменение базового у1 истозидазы, ед/мин ровня активности, раз)

транскрипционный фьюз (шт. 05250) трансляционный фьюз (шт. 05246)

0 133.2 51.5

10 85.3 (0.64) 32.5 (0.63)

50 79.9 (0.59) 36.1 (0.70)

100 113.2(0.84) 36.1 (0.70)

Увеличение активности р-галактозидазы в штаммах О5250 и 05246 было

зафиксировано только в опытах со стационарными клетками при внесении высоких концентраций С7-АОБ от 200 до 600 мкг/мл (табл. 7).

Таблица 7. Активность ,в-галактозидазы в клетках стационарной фазы роста штаммов о$250 и 05246 после действия С7-АОБ.

Концентрация Сг-АОБ, мкг/мл Активность р -галактозидазы, ед/мин

(изменение базового уровня активности, раз)

транскрипционный фьюз (шт. ох250) трансляционный фьюз (шт. оя250)

0 2800.0 940.0

10 2016.0 (0.72) 1128.0(1.20)

50 2324.0 (0.83) 846.0 (0.90)

100 2464.0 (0.88) 864.8 (0.92)

200 3889.0(1.38) 1386.0(1.47)

300 3977.0 (1.42) 1659.0(1.76)

600 4810.0(1.70) 1778.0 (1.90)

Однако, во всем диапазоне концентраций уровень регуляции (отношение активности -галактозидазы в клетках экспоненциальной фазы роста, обработанных АОБ, к активности фермента в клетках стационарной фазы (контроль, без АОБ)) для обоих штаммов как с транскрипционным, так и трансляционным фыозами практически не

изменялся (0.6 - 1.0), что не позволяет считать С7-АОБ веществом, индуцирующим стрессовый ответ клетки.

Учитывая полученные данные, были проверены протекторные свойства С7-АОБ в вариантах индукции SOS-ответа в экспоненциальных клетках Е. coli при УФ-облучении. Активность ß -галактозидазы при внесении С7-АОБ (10 - 100 мкг/мл) в культуры тестеркых штаммов за 30 мин до УФ-облучения была достоверно ниже, чем в контроле (без предобработки С7-АОБ) (рис. 8).

50 100

С,-АОБ, мкг/мл

50 100

С.-А ОБ, мкг/мл

Рис. 8. Активность ß-галактозидазы (ед/мин) в пролиферирующих клетках Е. coli штаммов ит250 (а) и ит246 (б), предобработанных С7-АОБ в концентрациях 10, 50 и 100 мкг/мл за 30 мин до облучения УФ; и при действии УФ-облучения - (К). Полосатые столбики - базовый уровень экспрессии реперного гена, серые столбики -уровень экспрессии реперного гена после УФ-облучения. Цифры - изменение уровня экспрессии, раз.

Отсюда следует, что гомолог С7-АОБ оказывал защитное действие на клетки Е. coli, устраняя характерную для umuD SOS-зависимую регуляцию. Протекторное действие С7-АОБ (а также С^-АОБ в низких концентрациях) можно объяснить их антиоксидантной активностью, показанной ранее [El-Registan et al., 2005] и свойственной многим фенолыгым соединениям. АОБ выполняют функции ловушек активных форм кислорода (АФК), образующихся при стрессе, в том числе окислительном, вызванном УФ-облучением. Этим же объясняется дозонезависимость протекторных эффектов С7-АОБ в широком диапазоне концентраций (10 - 100 мкг/мл). Таким образом, регуляторные эффекты АОБ в контроле экспрессии стрессовых генов зависят не столько от концентрации АОБ, сколько от их структуры.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные в настоящей работе результаты демонстрируют гибкое реагирование МКБ на изменение окружающих условий. Основными механизмами адаптации МКБ являются: переход клеток в состояние покоя, что сопровождается образованием покоящихся форм различных морфотипов; проявление внутривидовой вариабельности, выражающееся в диссоциативном переходе доминантного фенотипа в минорные; экспрессия генов стрессовых регулонов, что повышает защитные свойства клеток. Эти адаптационные процессы, которые контролируются уровнем видонеспецифических внеклеточных ауторегуляторов, в наших экспериментах -АОБ, обеспечивают выживание популяции (вида) в неблагоприятных для роста условиях и селективное развитие наиболее адаптивного к новым условиям варианта при прорастании покоящихся клеток. Приемы получения суспензий длительно переживающих, стрессоустойчивых покоящихся клеток МКБ могут быть рекомендованы для производства кисломолочных продуктов и препаратов пробиотиков в пищевой промышленности и медицине. Диссоцианты МКБ с требуемыми свойствами могут быть рекомендованы для разработки новых лактоферментированных продуктов. Теоретический и практический интерес представляет выявление функционирования АОБ как коммуникативного сигнала, контролирующего уровень экспрессии генов стрессовых регулонов (БОБ-ответа и общего /ро5-зависимого регулона стационарной фазы) и влияющего на частоту диссоциативных переходов фенотипов. Возможность направленной регуляции экспрессии стрессовых генов имеет практическое значение для генной инженерии. Показанные антимутагенные и протекторные свойства С7-АОБ в отношении повреждающих агентов различной природы могут быть использованы в биотехнологических процессах и медицинской практике.

ВЫВОДЫ

1. Основными формами адаптации молочнокислых бактерий к возникновению неростовых1 условий как «запрограммированных» в онтогенезе их культур (исчерпанию источников питания и/или пространства), так и «незапрограммированных» (действию антибиотиков) являются образование покоящихся форм и проявление внутрипопуляциошюй вариабельности.

2. Количество образующихся ПФ бактерий L. plantarum, L. acidophilus, L. lactis, их свойства (термостабилыюсть, длительность сохранения жизнеспособности) и внутривидовой полиморфизм (ЦПК разных типов и L-формы) зависят от условий роста культур и их постстационарной инкубации. Приемы получения ПФ могут быть рекомендованы для производства кисломолочных продуктов и препаратов пробиотиков.

3. Изучена фенотипическая диссоциация промышленных штаммов L. acidophilus АТ-41, L. lactis ТБ2, выделены колониально-морфологические варианты этих бактерий, показаны их различия по ростовым признакам, стрессоустойчивости, антагонистической активности.

4. Выявлены закономерности регуляции популяционной изменчивости МКБ. Установлена зависимость интенсивности диссоциативных переходов доминантного фенотипа в минорные от характера стрессового воздействия, что может быть использовано для быстрого скрининга вариантов с необходимыми признаками. Для стабилизации развития определенного фенотипа следует использовать селективные условия культивирования (среда, температура).

5. Установлена способность микробных алкилоксибензолов в зависимости от их структуры и концентрации контролировать уровень частоты диссоциативных переходов (в тесте с ауксотрофным штаммом В. subtilis trpA5 В 1733).

6. С использованием тестерных штаммов, сконструированных на основе бактерий Е. coli, обнаружена функция длинноцепочечных АОБ в повышении экспрессии стрессовых генов SOS-ответа и /"poS-зависимого регулона стационарной фазы, что реализуется на уровне транскрипции. Доказаны протекторные свойства короткоцепочечных АОБ, прединкубация клеток с которыми устраняла в них развитие SOS-ответа. Антимутагенные и протекторные свойства С7-АОБ могут быть использованы в биотехнологических целях и медицинской практике.

7. На основе S-диссоцианта L. acidophilus с высокими физиолого-биохимическими показателями разработаны приемы получения нового лактоферментированного овощного напитка, обладающего высокой пробиотической потенцией.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хабибуллин С.С., Николаев Ю.А., Лойко Н.Г., Голод Н.А., Милько Е.С., Воейкова Т.А., Эль-Регистан Г.И. Ауторегуля'ция фенотипической диссоциации у Bacillus lichertiformis // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2006. - Т. 75,№6.-С. 9-13.

2. Милько E.G., Крейер В.Г., Егоров Н.С., Лойко Н.Г., Голод Н.А. Развитие и популяцнонный состав смешанных (S+M) культур Pseudomonas aeruginosa в поздней стационарной фазе роста// Микробиология. - 2008. - Т. 77, № 3. - С. 318-323.

3. Голод Н.А., Лойко Н.Г., Мулюкин А.Л., Неймагов А.Л., Воробьева Л.И., Сузина Н.Е., Шаненко Е.Ф., Гальченко В.Ф., Эль-Регистан Г.И. Адаптация молочнокислых бактерий к неблагоприятным для роста условиям // Микробиология. - 2009. - Т. 78, №3.-С. 317-335.

4. Голод Н.А., Лойко Н.Г., Лобанов К.В., Миронов А.С., Воейкова Т.А., Гальченко

B.Ф., Эль-Регистап Г.И. Роль микробных ауторехуляторов - алкилоксибензолов, в контроле экспрессии стрессовых регулонов // Микробиология. - 2009. - Т. 78, № 6. -

C. 731-741.

5. Голод Н.А., Воейкова Т.А., Эль-Регистан Г.И. Влияние микробных аутоиндукторов анабиоза на геном бактерий // Тезисы Всероссийской молодежной школы-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии». 1-3 ноября 2005. Москва. С. 70-71.

6. Голод Н.А., Лойко Н.Г., Козлова А.Н., Николаев Ю.А. Популяционная вариабельность молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus АТ-41 и Lactococcus lactis ТБ2 // Материалы Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем». 25-27 сентября 2007. Саратов. С. 45.

7. Голод Н.А., Лойко Н.Г., Козлова А.Н., Николаев Ю.А., Дунин Д.А., Нематов А.Л., Эль-Регистан Г.И. Популяционная вариабельность молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus АТ-41 и Lactococcus lactis ТБ21I Материалы Международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты». 1113 марта 2008. Москва. С. 80.

8. Голод Н.А., Лойко Н.Г., Эль-Регистан Г.И. Роль микробных аутоиндукторов анабиоза в регуляции экспрессии стрессовых регулонов // Материалы Международной школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология». 21-24 октября 2008. Москва-Пущино. С 125-126.

Подписано в печать: 12.11.2009

Заказ № 3045 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 wwv.autoreferat.ru

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биотехнологические аспекты внутрипопуляционной вариабельности молочнокислых бактерий"

Актуальность проблемы. Ухудшение экологической обстановки, приводящее к снижению защитных сил организма человека и всплеску заболеваний, связанных с нарушением бактериального баланса в желудочно-кишечном тракте, обусловливает постоянный интерес к изучению адаптационных механизмов молочнокислых бактерий (МКБ) [Ьее et а1., 2005; ЯосЬа! et а1., 2005; На1акка ег а1.5 2008; Mengheri, 2008]. Выполняющие защитную и детоксицирующую функцию в организме человека, участвующие в симбиозах как с животными, так и с растениями, МКБ интенсивно используются в производствах про- и пребиотических продуктов; продуктов, нетрадиционно обогащенных молочнокислыми бактериями, например, таких как мороженое, соевый йогурт, шоколад, овощные лактоферментированные соки; натуральных пищевых консервантов; а также применяются в медицине как лечебные средства [ТагпшогЙ1 ^ а1., 2007; Би е1 а1., 2007; ЯатсЬапёгап^. а1., .2008; МасГаг1апе ее а1., 2008]. Внимание исследователей к изучению способности МКБ переживать неблагоприятные условия вызвано как теоретическим интересом, так и необходимостью создания кисломолочных продуктов с жизнеспособными клетками МКБ, длительное время сохраняющими способность к пролиферации, а при попадании в желудочно-кишечный тракт быстро адаптирующимися и возобновляющими активный метаболизм.

В ответ на изменения условий окружающей среды, связанные с исчерпанием: питательных веществ; источников энергии и пространства; или с воздействиями повреждающих факторов (ухудшением физико-химических условий, антимикробными агентами и т.д.), микроорганизмы включают ряд защитньтхмеханизмовдляадаптацииклетоквпределахнормыреакциисвида или для его- выживания в виде покоящихся форм (ПФ) в неростовых условиях [\УооИп е!; а1., 2001; Бухарин с соавт., 2005]. Свой вклад в адаптацию вносит внутрипопуляционная фенотипическая вариабельность, от которой зависит результативность симбиозов, замещение и поддержание продуктивных вариантов [Hallet et al., 1997; Головлев, 1998; Прозоров, 2000; Woude et al., 2004]. Согласно ряду гипотез, процесс диссоциации связан с состоянием покоя, при выходе из которого меняется соотношение диссоциантов в популяции [Дорошенко с соавт., 2002], и действием сигнальных молекул, контролирующих экспрессию генов стационарной фазы и переход клеток в состояние покоя [Suh et al., 1999]. Среди внеклеточных метаболитов такими функциями обладают видонеспецифичные ауторегуляторы - аутоиндукторы анабиоза, выделенные и описанные для большого числа микроорганизмов, и представленные у ряда бактерий и дрожжей алкилоксибензолами (АОБ) [Бухарин с соавт., 2005; Эль-Регистан с соавт., 2006]. Изучение механизмов адаптации к неблагоприятным воздействиям, в том числе за счет внутрипопуляционных диссоциативных переходов, и использование выявленных закономерностей для направленной регуляции популяционной вариабельности МКБ представляют значительный интерес для микробиологии, биотехнологии производства про-, пребиотиков и медицины.

Задачи исследования:

1. Изучить адаптационные ответы молочнокислых бактерий Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus AT-41, Lactococcus lactis ТБ2 на стрессовые воздействия; как «запрограммированные» в онтогенезе -исчерпание источников питания, так. и «^запрограммированные» - действие антибиотиков

2. Изучить' . закономерности: фенотипической диссоциации МКБ,. охарактеризовать^ выделенные диссоцианты; по их колониально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам.

3: Разработать приемы контроля диссоциативных переходов бактерий.

5. Разработать биотехнологические приемы получения овощных лактоферментированных напитков.

Научная новизна. 1. Впервые показано, что при возникновении неблагоприятных для роста условий молочнокислые бактерии L. plantarum, L. acidophilus АТ-41, L. lactis ТБ2, как и другие неспорообразующие бактерии, образуют клетки, обладающие всеми признаками покоящихся форм. Установлено, что образование и свойства ПФ молочнокислых бактерий зависят от условий роста культур (модификации сред) и их постстационарной инкубации. На моделях L. acidophilus и L. plantarum продемонстрирован внутривидовой полиморфизм покоящихся форм МКБ -образование как цистоподобных покоящихся клеток (ЦПК), так и переживающих клеток L-типа. 2. Разработаны приемы регуляции внутрипопуляционной изменчивости промышленных штаммов L. acidophilus АТ-41 и L. lactis ТБ2. Найдены селективные условия для стабилизации развития недоминантных вариантов. Выделены и охарактеризованы колониально-морфологические варианты этих бактерий. 3. Обнаружена способность алкилоксибензолов контролировать включение защитных функций микроорганизмов путем индукции экспрессии стрессовых генов и повышения частоты внутрипопуляционных диссоциативных переходов, обусловливающих фенотипическую изменчивость бактерий. Установлена зависимость регуляторных эффектов АОБ. от их структуры (длины алкильного радикала) и концентрации. 4. Выявлена регуляторная функция АОБ в контроле внутрипопуляционных диссоциативных переходов бактерий. Обнаружена зависимость частоты выщепления недоминантных вариантов от структуры и концентрации АОБ. 5. Выявлена роль длинноцепочечных АОБ как алармонов (сигналов тревоги) в активации стрессовых генов SOS-ответа и /роЯ-регулона. 6. Продемонстрированы протекторные функции короткоцепочечных АОБ в защите клеток от УФ-облучения, что выражается в снижении уровня экспрессии генов SOS-ответа.

Практическая ценность. 1. Разработаны приемы получения суспензий длительно хранящихся, стрессоустойчивых цистоподобных покоящихся клеток МКБ. 2. Предложены способы: а) быстрого получения диссоциантов МКБ путем рассева на плотные среды ЦПК, обладающих нестабильным генотипом; б) направленного контроля диссоциативного спектра МКБ путем применения селективных условий для развития вариантов, различающихся ростовыми, физиолого-биохимическими признаками, антагонистической активностью и адгезивными свойствами. Выделенные диссоцианты могут быть рекомендованы для получения препаратов пробиотиков и пищевых продуктов. 3. С использованием диссоцианта L. acidophilus, имеющего ростовые и физиолого-биохимические преимущества, разработаны приемы получения нового лактоферментированного продукта на основе овощного сока, обладающего высокой пробиотической- потенцией. 4. Возможность направленной регуляции экспрессии стрессовых генов может быть использована в целях генной инженерии. 5. Показанные антимутагенные и протекторные свойства короткоцепочечных АОБ в отношении повреждающих агентов различной природы могут быть использованы в биотехнологических процессах и медицинской практике.

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на Всероссийской молодежной школе-конференции (ИНМИ, Москва, 2005); Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов, 2007); Международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (Москва, 2008); Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов^ и биотехнология» (Москва-Пущино, 2008). По материалам диссертации опубликовано 8 работ: из них 4 статьи в рецензируемых журналах, утвержденных в перечне ВАК; 4 тезиса.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Симон, Наталия Александровна

выводы

1. Основными формами адаптации молочнокислых бактерий к возникновению неростовых условий как «запрограммированных» в онтогенезе их культур (исчерпанию источников питания и/или пространства), так и «^запрограммированных» (действию антибиотиков) являются образование покоящихся форм и проявление внутрипопуляционной вариабельности.

2. Количество образующихся ПФ бактерий L. plantarum, L. acidophilus, L. lactis, их свойства (термо стабильность, длительность сохранения жизнеспособности) и внутривидовой полиморфизм (ЦПК разных типов и L-формы) зависят от условий роста культур и их постстационарной инкубации. Приемы получения ПФ могут быть рекомендованы для производства кисломолочных продуктов и препаратов пробиотиков.

3. Изучена фенотипическая диссоциация промышленных штаммов L. acidophilus АТ-41, L. lactis ТБ2, выделены колониально-морфологические варианты этих бактерий, показаны, их различия по ростовым признакам, стрессоустойчивости, антагонистической активности.

5. Установлена способность микробных алкилоксибензолов в зависимости от их. структуры и концентрации, контролировать уровень частоты диссоциативных переходов (в тесте с ауксотрофным штаммом В. subtilis trpA5 В 1733).

6. С использованием тестерных штаммов, сконструированных на основе бактерий Е. coli, обнаружена функция длинноцепочечных АОБ в повышении

123 экспрессии стрессовых генов SOS-ответа и фо5-зависимого регулона стационарной фазы, что реализуется на уровне транскрипции. Доказаны протекторные свойства короткоцепочечных АОБ, прединкубация клеток с которыми устраняла в них развитие SOS-ответа. Антимутагенные и протекторные свойства С7-АОБ могут быть использованы в биотехнологических целях и медицинской практике.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные в настоящей работе результаты демонстрируют гибкое реагирование МКБ на изменение окружающих условий. Основными механизмами адаптации МКБ являются: переход клеток в состояние покоя, что сопровождается образованием покоящихся форм различных морфотипов; проявление внутривидовой вариабельности, выражающееся в диссоциативном переходе доминантного фенотипа в минорные; экспрессия генов стрессовых регулонов, что повышает защитные свойства клеток. Эти адаптационные процессы, которые контролируются уровнем видонеспецифических внеклеточных ауторегуляторов, в наших экспериментах - АОБ, обеспечивают выживание популяции (вида) в неблагоприятных для роста условиях и селективное развитие наиболее адаптивного к новым условиям варианта при прорастании покоящихся клеток. Приемы получения суспензий длительно переживающих, стрессоустойчивых покоящихся клеток, МКБ могут быть рекомендованы для производства кисломолочных продуктов и препаратов пробиотиков в пищевой промышленности и медицине. Диссоцианты МКБ с требуемыми свойствами могут быть рекомендованы для разработки новых лактоферментированных продуктов. Теоретический и практический интерес представляет выявление функционирования АОБ как коммуникативного сигнала, контролирующего уровень экспрессии генов стрессовых регулонов (БОЗ-ответа и общего гро^-зависимого регулона стационарной фазы) и влияющего на частоту диссоциативных переходов фенотипов. Возможность направленной регуляции экспрессии стрессовых генов имеет практическое значение для генной, инженерии; Показанные антимутагенные и протекторные свойства С7-АОБ в отношении повреждающих агентов различной природы могут быть использованы в- бйотехнологических процессах и медицинской практике.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Симон, Наталия Александровна, Москва

1. Бабусенко Е.С., Эль-Регистан Г.И., Градова Н.Б., Козлова А.Н., Осипов Г.А. Исследование мембранотропных ауторегуляторных факторов метаноокисляющих бактерий //Успехи химии. 1991., Т. 60, Вып. 11, С. 2362-2373.

2. Бахматова И.В. Естественная изменчивость Bacillus subtilis R-623 и биосинтез гидролитических ферментов четырьмя вариантами: Автореф. дис. канд. биол. наук. М., 1979

3. Бухарин О.В., Гинцбург А.Л., Романова Ю.М., Эль-Регистан Г.И. Механизмы выживания бактерий. М.: Медицина. 2005. 367 с.

4. Ганина В.И. Пробиотики. Назначение, свойства и основы биотехнологии: Монография: М.г: МГУПБ. 2001, С. 122.

5. Глушанова H.A., О биологической и антагонистической активности «сухохо» и «жидкого» пробиотика «Narine» // Бюллетень ВосточноСибирского НЦ СО РАМН. 2005. №1. С. 130-133.

6. Головлев E.JL Метастабильность фенотипа у бактерий // Микробиология. 1998. Т. 59. №2. С. 149-155.

7. Головлев E.JI. Введение в биологию стационарной фазы бактерий // Микробиология. 1999, Т. 68, № 5, С. 623-631.

8. Давыдова O.K., Дерябин Д.Г., Никиян А.Н., Эль-Регистан Г,И. О механизмах взаимодействия ДНК с химическими аналогами микробных аутоиндукторов анабиоза // Микробиология. 2005, Т. 74, № 5, С. 616-625.

9. Давыдова O.K., Дерябин Д.Г., Эль-Регистан Г,И. Длительное сохранение ДНК в водных растворах в присутствии химических аналогов микробных ауторегуляторов //Микробиология. 2006, Т. 75, № 5, С. 662-669.

10. Дараселия Г.Я., Даушвили ЛюПю Спонтанная изменчивость Mycobacterium brevicale по синтезу каратиноидов //Сообщ. АН ГССР. 1978, Т. 89, № 3, С. 677-680.

11. Демкина Е.В., Соина B.C., Эль-Регистан Г.И., Звягинцев Д.Г. Репродуктивные покоящиеся формы Arthrobacter globiformis II Микробиология. -2000, Т. 69, № 3, С. 377-382.

12. Демкина Е.В., Соина B.C., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Arthrobacter globiformis в автолизирующихся суспензиях // Микробиология. -2000, Т. 69, № 3, С. 383-388.

13. Донова М.В. Трансформация стероидных соединений актинобактерий // Прикладная биохимия и микробиология. 2007, Т. 43, № 1, С. 5-18.

14. Дорошенко Е.В., Лойко Н.Г., Ильинская О.Н., Колпаков А.Н., Горнова Н.Б:, Климанова Е.В., Эль-Регистан Г.И. Характеристика диссоциантов Bacillus cereus II Микробиология. 2001, Т. 70, № 6, С. 811 - 819.

15. Дуда В .И., Пронин С.В., Эль-Регистан Г.И., Капрельянц A.C., Митюшин Л.Л. Образование покоящихся рефрактерных клеток к Bacillus cereus подвлиянием ауторегуляторного фактора //Микробиология. 1982, Т. 51, № 1, С. 77-81.

16. Ермолаева Г.А., Колчева P.A. Технология производства пива и безалкогольных напитков М.: Изд-во Академия., 2000, С. 416.

17. Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Зеленихин П.В., Круглова З.Ф., Чойдаш Б., Дорошенко Е.В., Мулюкин А.Л., Эль-Регистан Г.И. Влияние аутоиндукторов анабиоза бактерий на геном микробной клетки // Микробиология. 2002. Т. 71. № 2. С. 194 199.

18. Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Шмидт М.А., Дорошенко Е.В., Мулюкин А.Л., Эль-Регистан Г.И. Роль бактериальных ауторегуляторов роста группы алкилоксибензолов в ответе стафилококков на стрессовые воздействия // Микробиология. 2002. Т. 71. № 1. С. 23-29.

19. Коновалова. Е.Ю.", Эль-Регистан Г.И., Бабьева И:П. Динамика и накопление ауторегуляторных факторов di и d2 дрожжами Rhodosporidhim toruloides //Биотехнология. 1985, № 3, С. 71-74.

20. Красильников Н.А, Таусон Т.А. Изменчивость проактиномицетов и микобактерий // Микробиология. 1938, Т. 7, 1. С. 50-59.

21. Лойко Н.Г., Соина B.C., Сорокин Д.Ю., Митюшина JI.JI., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм хемолитоавтотрофных бактерий Thioalkalivibrio versutus и Thioalkalivibrio aerophilum II Микробиология. — 2003, Т. 72, № 3, С. 328-337.

22. Маргулис А.Б., Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Эль-Регистан Г.И. Индукция SOS-ответа клетки под действием ауторегуляторных факторов микроорганизмов // Генетика. 2003. Т. 39. № 9. С. 1180-1184.

23. Мартиросова Е.И., Карпекина Т.А., Эль-Регистан Г.И. Модификация ферментов естественными химическими шаперонами микроорганизмов // Микробиология. 2004. Т. 73. № 5. С. 708-715.

24. Мартиросова Е.И., Николаев Ю.А., Шаненко Е.Ф., Крупянский Ю.Ф., Лойко Н.Г., Эль-Регистан Г.И. Использование алкилоксибензолов для повышения активности и стабильности ферментов // Химическая технология. 2007. № 6. С. 250-256.

25. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. М.: Мир. 1976. С.324 327.

26. Милько Е.С. Егоров Н.С. Гетерогенность популяции бактерий и процесс диссоциации М.: Изд-во МГУ. 1991, С.143

27. Милько Е.С., Егоров Н.С. Гидрофильно-гидрофобные и адгезивные свойства диссоциантов Rhodococcus rubroperíinctus II Микробиология. -1994, Т. 63, №2, С. 382-384.

28. Мулюкин А.Л. Козлова' А.Н., Капрельянц A.C. Эль-Регистан Г.И. Обнаружение и изучение динамики накопления ауторегуляторного фактора di в культуральной жидкости Micrococcus luteus II Микробиология. 1996, Т. 65, № 1, С. 20-25.

29. Мулюкин А.Л., Луста К.А., Грязнова М.Н., Козлова- А.Н., Дужа М.В., Дуда В.И., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся.форм Bacillus cereus и Micrococcus luteus II Микробиология. 1996, Т. 65, № 6, С. 782-789.

30. Мулюкин А.Л., Луста К.А., Грязнова М.Н., Бабусенко Е.С., Козлова А.Н., Дужа М.В., Митюшина Л.А., Дуда В.И., Эль-Регистан Г.И. Образованиепокоящихся форм в автолизирующихся суспензиях микроорганизмов // Микробиология. 1997, Т. 66, № 1, С. 42-49.

31. Ненашев Е.А., Придачина H.H., Эль-Регистан Г.И., Золотарева И.Н., Батраков С.Н. Действие ауторегуляторов анабиоза некоторых микроорганизмов на дыхание митохондрий печени крысы //Биохимия. 1994. Т.59. Вып. С. 1511-1515:

32. Николаев Ю.А., Милько Е.С. Адгезивные и ростовые свойства R- и S-диссоциантов Pseudomonas ßuorescens II Микробиология. 2000, Т. 69, № 2, С. 293-294.

33. Нонхибел Д., Уолтон Дж. Химия свободных радикалов. М.: Мир, 1977.

34. Октябрьский О.Н:, Смирнова Г.В. Редокс-регуляция клеточных функций // Биохимия: 2007. Т. 72.В. 2. С. 158-174.

35. Осипов Г.А., Эль-Регистан Г.И., Светличный В;А., Козлова. А.Н., Дуда В.И., Капрельянц A.C., Помазанов В:В. О химической природе ауторегуляторного фактора dj Pseudomonas carboxydoflava II Микробиология. 1985. Т. 54. Вып. 2. С. 186-190.

36. Прозоров A.A. Рекомбинантные перестройки генома бактерий, и адаптация к среде обитания // Микробиология. 2001. Т. 70. № 5. С.581 594.

37. Рогинский В.А. Фенольные антиоксиданты: Реакционная способность и эффективность. М.: Наука, 1988.

38. Рыжова Н.В., Разработка биотехнологии натуральных пищевых красителей из растительного сырья дис. канд. техн. наук . М., 2006.

39. Сборник инструкций по селекции молочнокислых бактерий и подбору заквасок для кисломолочных продуктов. М.: ВНИМИ, 1986. 44 С.

40. Светличный В.А., Эль-Регистан Г.И., Романова А.К., Дуда В.И Характеристика ауторегуляторного фактора сЬ вызывающего автолиз клеток Pseudomonas carboxydoflava и Bacillus cereus // микробиология. 1983, Т. 52, № 1, С. 33-38:

41. Светличный В:А., Савельева И.Д., Некрасова В.К., Эль-Регистан Г.И. Изучение содержания« мембраноактивных ауторегуляторов при литоавтотрофном росте Pseudomonas carboxydoflava II Микробиология. -1986, Т. 55, Вып. 1, С. 55-59.

42. Сингер М., Берг П. Гены и геномы. М.: «Мир», 1998.

43. Степаненко И.Ю., Страховская М.Г., Беленикина Н.С., Николаев Ю.А., Мулюкин А.Л., Козлова А.Н., Ревина А.А., Эль-Регистан Г.И. Защита алкилоксибензолами от окислительного и радиационного поражения // Микробиология. 2004. Т. 73. № 2. С. 204 210.

44. Степаненко И.Ю., Мулюкин A.JI, Козлова А.Н., Николаев Ю.А., Эль-Регистан Г.И. Роль алкилоксибензолов в адаптации Micrococcus luteus к температурному шоку // Микробиология. 2005, Т. 74, № 1, С. 26-33.

45. Сузина Н.Е., Мулюкин А.Л., Козлова А.Н., Шорохова А.П., Дмитриев

46. B.В., Баринова Е.С., Мохова О.Н., Эль-Регистан Г.И., Дуда В.И. Тонкое строение некоторых неспорообразующих бактерий // Микробиология. 2004, Т. 73, №4, С. 516-529.

47. Хабибуллин С.С. Популяционная вариабельность микроорганизмов // дисс. канд. биол. наук, М.: 2007. 149 с.

48. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Т.З. Пробиотики и функциональное питание. М. 2001. Изд-во Грантъ. — 287 с.

49. Шендеров Б.А., Функциональное питание, криогенные банки микробиоценозов и их роль в сохранении и восстановлении здоровья // Вестник восстановительной медицины. 2003. №1. С. 29-31

50. Шольц К.Ф., Островский Д.Н. Ячейка для амперометрического определения кислорода //Методы современной биохимии. М.: Наука. 1975, С. 52-58.

51. Эль-Регистан Г.И., Мулюкин А.Л., Николаев Ю.А., Сузина Н.Е., Гальченко В.Ф., Дуда В.И. Адаптогенные функции внеклеточных ауторегуляторов микроорганизмов // Микробиология. 2006, Т. 75, № 4. С. 446-456.

52. Aburatani S., Horimoto К. Elucidation of the relationships between LexA-regulated genes in the SOS response // Genome Inform. 2005, V. 16, № 1, P. 95 - 105.

53. Aertsen A., Michiels C.W. Diversify or die: Generation of diversity in response to stress // Crit. Rev. Microbiol. 2005, V. 31, P. 69 - 78.

54. Amzallag G.N. Adaptive changes in bacteria: a consequence of nonlinear transitions in chromosome topology? // J. Theor. Biol. 2004, V. 229, № 3, P. 361-369:

55. Atrih A., Zollner P., Allmaier G., Foster S. F. Structural analysisof Bacillus subtilis 168 endospore peptidoglycan and its role during differentiation // J. Bacteriol. 1996, V. 178, P. 6173-6178:

56. Agrawal S.C., Singh V. Viability of dried vegetative trichomes, formation of akinetes and heterocysts and akinete germination in some-blue-green, algae under water stress // Folia Microbiol. 1999, V. 44, № 4, P. 411-418:

57. Bacon D.J., Szymanski C.M., Burr D.H., Silver R.P., Aim R.A., Guerry P. A phase-variable capsule is involved in virulence of Campylobacter jejuni 81-176 // Mol. Microbiol. 2001, V. 40, P. 769-777.

58. Beumer R.R., deVries J., Rombouts F.M. Campylobacter jejuni non-culturable coccoid cells // Int. J. Food Microbiol. 1992, V. 15, P. 153-163.

59. Bjedov I., Tenallion O., Gerad B., Sousa V., Denamur E., Radman M., Taddei F., Matic I Stress-induced mutagenesis in bacteria //Science. 2003, V. 42, № 2, P. 74-79.

60. Bhamre S., Gadea B.B., Koyama C.A., White S.J., Fowler R.G. Anaerobic recA-, wmwC-dependent pathway of spontaneous base-pair substitution mutagenesis in Escherichia coli II Mutat. Res. 2001, V. 473, P. 229-247.

61. Blandino G., Fazio D., Marco R. Probiotics: overview of microbiological and immunological characteristics // Expert Rev. Anti Infect. Ther. 2008, V. 6, № 4, P. 497-508.

62. Bloomfield S.F., Arthur M. // Mechanisms of inactivation andresistance of spores to chemical biocides. J. Appl. Bacteriol. 1994, V. 76, P. 91-104.

63. Burke P.V., Raitt D.C., Allen L.A., Kellogg F.A., Poyton R.O. Effect of oxygen concentration on the expression of cytochrome c and cytochrome c oxidase genes in yeast//J. Biol.5 Ghem. 1997. V. 272. P. 14705-14712.

64. Cairns J., Foster P.L. Adaptive reversion of a frameshift mutation- in Escherichia coli II Genetics. 1991, V. 128, P. 695-701.

65. Cebrian G., Sagarzazu N., Pagan R., Condon S., Manas P: Resistance of Escherichia coli grown-at different'temperatures to various environmental stresses // J. Appl. Microbiol. 2008, V. 105, № 1, p. 271-278.

66. Chopra I., O'Neill A.J., Miller K. The role of mutators in the emergence of antibiotic-resistant bacteria // Drug Resist. 2003, V. 6, P. 1247-1252.

67. Chou L.S., Weimer B. Isolation and characterization of acid- and bile-tolerant isolates from strains of Lactobacillus acidophilus II J. Dairy Sci. 1999, V. 82, № 1,P. 23-31.

68. Colwell R.R., Brayton P., Herrington D., Tall B., Huq A., Levine M.M. Viable but non-culturable Vibrio cholerae Ol revert to a cultivable state in the human intestine II World J. Microbiol. Biotechnol. 1996, V. 12, P. 28-31.

69. Conter A., Menchon C., Gutierrez C. Role of DNA Supercoiling and RpoS Sigma Factor in the Osmotic and Growth Phase-dependent Induction of the Gene osmE of Escherichia coli K12II J. Mol. Biol. 1997, V. 273, P. 75-83.

70. Cowley S.C., Myltseva S.V., Nano F.E. Phase variation in Francisella tularensis affecting intracellular growth, lipopolysaccharide antigenicity and nitric oxide production // Mol. Microbiol. 1996, V. 20, P. 867-874.

71. Day A.P., Oliver j.D. Changes in membrane fatty acid composition during entry of Vibrio vulnificus into the viable but nonculturable state // J. Microbiol. -2004, V. 42, №2, P. 69-73.

72. Donelli G., Matarrese P., Fiorentini C., Dainlli B., Taraborelli T., Di Campli E., Di Bartolomeo S., Cellini L., The effect of oxygen on the growth and cellmorphology of Helicobacter pylori //FEMS Microbiol. Lett. 1998, V. 168, P. 9-15.

73. Douglas L.C., Sanders M.E. Probiotics prebiotics in dietetics practice // J. Am. Diet. Assoc. -2008, V. 108, № 3, P. 510-521.

74. Dressaire C., RedonE., Milhem H., Loubiere P., Cocaign-Bousquet M. Growth rate regulated genes and their wide involvement in the Lactococcus lactis stress responses // BMC Genomics. 2008, V. 9, № 1, P. 343-366.

75. Driks A. Bacillus subtilis spore coat // Microbiol and Mol. Boil. Rev. 1999, V. 63, №1, P. 1-20.

76. Dragutin J., Savic, Ferretti J.J. Novel Genomic Rearrangement That Affects Expression of the Streptococcus pyogenes Streptolysin O (slo) Gene // J. of Bacteriology 2003, V. 185, №6, P. 1857-1869.

77. Du M., Chen J., Zhang X., Li A., Li Y. Retention of Virulence in a Viable but Nonculturable Edwardsiella tarda Isolate // Appl. Environ. Microbiol. 2007, V. 73, №4, P. 1349-1354.

78. Du M., Chen J., Zhang X., Li A., Li Y. Characterization and resuscitation of viable but nonculturable Vibrio alginolyticus VIB283 // Arch. Microbiol. 2007, V. 188, №3, P. 283-288.

79. Enos-Berlage J.L., McCarter L.L. Relation of capsular polysaccharide production and colonial cell organization to colony morphology in Vibrio parahaemolyticus II J. Bacteriol. 2000, V. 182, P. 5513-5520.

80. Farnworth E.R., Mainville I., Desjardins M.P., Gardner N., Fliss I., Champagne C. Growth of probiotic bacteria and bifidobacteria in a soy yogurt formulation // Int. J. Food Microbiol. 2007, V. 116, № 1, P. 174-181.

81. Fegatella F., Cavicchioli R. Physiological responses to starvation in the marine oligotrophic ultramicrobacterium Sphingomonas sp. strain RB2256 // Appl. Environ. Microbiol. 2000, V. 66, № 5, P: 2037-2044.

82. Fera M.T., Maugeri T.L., Gugliandolo C., La Camera E., Lentini V., Favaloro A., Bonanno D., Carbone M. Induction and resuscitation of viable nonculturable Arcobacter butzleri // Appl.' Environ. Microbiol. 2008, V. 74, № 10, P. 3266-8.

83. Flint K.P. The long-term-survival of Escherichia coli in river water 11 J. Appl. Bacteriol. 1987, V. 63, P. 261-270.

84. Foster P.L. Stress responses and genetic variation in bacteria // Mutat. Res. -2005, V. 569, P. 3-11.

85. Friedberg E.C., Walker G.C., Siede W. DNA repair and mutagenesis. Washington: ASM Press, 1995. P. 698.

86. Friedberg E.C., Wagner R., Radman M. Specialzed DNA polymerases, cellular survival, and genetics of mutations //Science. 2002, V. 296, P. 1627 -1630.

87. Ftacek P., Skultety L., Toman R. Phase variation of Coxiella burnetii strain Priscilla: influence of this phenomenon on biochemical features of its lipopolysaccharide // J. Endotoxin Res. 2000, V. 6, P. 369-376.

88. Gerhardt P., Marquis R.E. Spore thermoresistance mechanisms // In I. Smith, R. A. Slepecky, and P. Setlow (ed.), Regulationof procaryotic development. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 1989, P. 43-63.

89. Gonzales M., Woodgate R. The «tale» of umuD and it's role in SOS mutagenesis // Bioessays. 2002, V. 24, № 2, P. 141-148.

90. Hallet B., Sherratt D.J: Transposition and site-specific recombination: adaptating DNA cut and paste mechanism to a variety of genetic rearrangements // FEMS Microbiol. Rev. 1997. V. 21. P. 157-178.

91. Hammerschmidt S., Hilse R., Putten J.P., Gerardy-Schahn R., Unkmeir A., Frosch M. Modulation of cell surface sialic acid expression in Neisseria meningitidis via a transposable genetic element // EMBO J. 1996, V. 15, P. 192198.

92. Hartke A., Bouche S., Gansei X., Boutibonnes P., Auffray Y. Starvation-Induced stress resistance in Lactococcus lactis subsp. Lactis IL1403 // Appl. and Envir. Microbiol. 1994, V. 60, № 9, P. 3474-3478.

93. Hasegawa K., Yoshiyama K., Maki H. Spontaneous mutagenesis associated with nucleotide excision repair in Escherichia coli //Genes Cells. 2008, V. 13, № 5, P. 459-469.

94. Hatakka K., Saxelin M. Probiotics in intestinal and non-intestinal infectious diseases-clinical evidence // Curr. Pharm. Des. 2008, V. 14, № 14, P. 13511367.

95. Hersh M.N., Ponder R.G., Hastings P.J., Rosenberg S.M. Adaptive mutation and amplification in Escherichia coli: two pathways of genome adaptation under stress // Res. Microbiol. 2004, V. 255, P. 352-359.

96. Higgins B.P., Carpenter C.D., Karls A.C. Chromosomal context directs high-frequency precise excision of IS492 in Pseudoalteromonas atlantica //Proc. Natl. Acad. Sei. 2007, V. 104, № 6, P. 1901-1906.

97. Hilton T., Rosche T., Froelich B., Smith B., Oliver J. Capsular polysaccharide phase variation in Vibrio vulnificus // Appl. And Environ. Microbiol. 2006, V. 72, №11, P. 6986-6993.

98. Holm F. Gut Health and diet// World Food Ingredient. 2003. P. 52-55

99. Horst J.P., Wu T.H., Marinus M.G. Escherichia coli mutator genes // Trends Microbiol., 1999, V. 7, P. 29-36.128i Holzapfel W.H., Shillinger U. Introduction-to pre- and probiotics.// Food Research International. 2002. v.35. P. 109-116

100. Humayun M.Z. SOS and mayday: multiple indused mutagenic parthways in Ercherichia coli II Mol. Microbiol. 1998, V. 30, P. 905 - 910.

101. Hussong D., Colwell R.R., O'Brien M., Weiss E., Pearson A.D., Weiner R.M., Bürge W.D. Viable Legionella pneumophila not detectable by culture on agar medium // Bio/Technology. 1987, V. 5, P. 947-950.

102. Hütt P., Shchepetova J., Loivukene K., Kullisaar T., Mikelsaar M. Antagonistic activity of probiotic lactobacilli and bifidobacteria against entero- and uropathogens //J. Appl. Microbiol. 2006, V. 100, № 6, P. 1324-1332.

103. Ishibashi N., Yamazaki S. Probiotics and safety // Am. J. Clin. Nutr. 2001, V. 73, P. 465-470.

104. Jones G.W., Clewell D.B., Charles L.G., Vickerman M.M. Multiple phase variation in haemolytic, adhesive and antigenic properties of Streptococcus gordonii II Microbiology. 1996, V. 142, P. 181-189.

105. Kaprelyants A.S., Gottschal J.C., Kell D.B. Dormancy in nonsporulating bacteria // FEMS Microbiol. Rev. 1993.V. 104. №3. P.2 71-286.

106. Kell D.B., Young M. Bacterial dormance and culturability: the role of autocrine growth factors // Curr. Opin. Microbiol. 2000, V. 3, P. 238-243.

107. Kim J.O., Weiser J.N. Association of intrastrain phase variation in quantity of capsular polysaccharide and teichoic acid with the virulence of Streptococcus pneumonia II J. Infect Dis. 1998, V. 177, P. 368-377.

108. Kim W.S., Park J.H., Ren J., Su P., Dunn N.W Survival response and rearrangement of plasmid DNA of Lactococcus lactis during long-term starvation // Appl. and Envir. Microbiol. 2001, V. 67, № 10, P. 4594-4602.

109. Kivisaar M. Stationary phase mutagenesis: mechanisms that accelerate adaptation of microbial populations under environmental stress //Environ Microbiol. 2003, V. 5,№ 10, P. 814-827.

110. Kline K.A., Sechman E.V., Skaar E.P., Seifert H.S. Recombination, repair and replication in the pathogenic neisseriae: the 3 R's of molecular genetics of two human-specific bacterial pathogens // Mol. Microbiol. 2003, V. 50, P. 3-13.

111. Kolsto A.B. Dynamic bacterial genome organization //Mol. Microbiol. -1997, V. 24, P. 241-246.

112. Larsen J.E., Gerdes K., Light J., Molin S. // Gene. 1984. - V.28. - P. 45-54.

113. Lee J., Hwang K.T., Heo M.S., Lee J.H., Park K.Y. Resistance of Lactobacillus plantarum KCTC 3099 from Kimchi to oxidative stress // J. Med. Food 2005, V. 8, № 3, P. 299-304.

114. Lenich A.G., Glasgow A.G. Amino acid sequence homologybetween Piv, an essential protein in site-specific DNA inversion in Moraxella lacunata, and transposases of an unusual family of insertion elements // J. Bacterid. 1994, V. 176, P. 4160-4164.

115. Lenoir-Wiujnkoop I., M.Hopkins. The Intestinal Microflora. Understanding the Symbiosis. Danone Vitapole. John Libbey Eurotext. 2003. P. 48

116. Lesterlin C., Barre F.X., Cornet F. Genetic recombination and the cell cycle: what we have learned from chromosome dimmers // Mol; Microbiol; 2004, V. 54, №5, P. 1151-1160.

117. Lleo M., Bonato B., Benedetti D., Canepari P. Survival of enterococcal species in aquatic environments // FEMS Microbiol. Ecol.- 2005, V. 54, P. 189— 196.

118. Lonnig W.E., Saedler H. Chromosome rearrangements and transposable elements // Annu. Rev. Genet. 2002, V. 36, P. 389-410.

119. Low D., Braaten B., Woude M. Fimbriae II Eschericia coli and Salmonella: cellular and molecular biology / Ed. Neighardt F.C. Washington: ASM Press, 1996. P. 146-157.

120. Lukacova M., Baumann M., Brade L., Mamat U., Brade H. Lipopolysaccharide smooth-rough phase variation in bacteria of the genus Chlamydia II Infect. Immun. 1994, V. 62, P. 2270-2276.

121. Macfarlane G.T., Steed H., Macfarlane S. Bacterial metabolism and health-related effects of galacto-oligosaccharides and other prebiotics // Appl. and Envir. Microbiol. -2008, V. 104, № 2, P. 305-344.

122. Macnab R.M. Flagella and motility // Eschericia coli and Salmonella: cellular and molecular biology / Ed. Neighardt F!G. Washington: ASM Press, 1996. P. 123145.

123. Maietti L., Bonvini B., Huys G., Giraffa G. Incidence of antibiotic resistance and virulence determinants among Enterococcus italicus isolates from dairy products II Syst. Appl. Microbiol. 2007. V. 6, P. 509-517.

124. Mahillon J., Chandler M. Insertion sequences // Microbiol. Mol. Biol. Rev. -1998, V. 62, P. 725-774.

125. Mahillon J., Leonard C., Chandler M. IS elements as constituents of bacterial genomes // Res. Microbiol. 1999, V. 150, № (9-10), P. 675-678.

126. Manahan S.H., Steck T.R. The viable but nonculturable state in Agrobacterium tumefaciens and Rhizobium meliloti II FEMS Microbiol. 1997, V. 22, P. 29-37.

127. Mannu L., Paba A., Pes M., Scintu M.F. Genotypic and phenotypic heterogeneity among lactococci isolated from traditional Pecorino Sardo cheese. 2000. J. Appl. Microbiol. V. 89. N. 2. P. 191-197

128. Maor-Shoshani A., Reuven N.B., Tomer G., Livneh Z. Highly mutagenic replication by DNA polymerase V (UmuC) provides a mechanistic basis for SOS untargeted mutagenesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000, V. 97, № 2, P. 565570.

129. Maron M., Ames B.N. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test //Mut. Res. 1983, V. 113, P. 173-215.

130. Martinez J., Mulvey M.A., Shsilling J., Pinkner J., Hultgren S. Type 1 pilus-mediated bacterial invasion of bladder epithelial cells // EMBO J. 2000, V. 19, № 12, P. 2803-2812.

131. Mattila-Sandholm T., Saarela M., L. Lahteeenmaki. Gut Health Foods // World Food Ingredient. 2004. P. 5052-55

132. McDonnell G., Russell A.D. Antiseptics and disinfectants: activity, action, and resistance // Clin. Microbiol. Rev. -1999, V. 12, P. 147-179.

133. Mengeheri E. Health, probiotics and inflammation // J. Clin. Gastroenterol. -2008, Epub ahead of print.,

134. Morita, R.Y., Bioavailability of energy and its-relationship to growth and starvation survival in natura, CanJ. Microbiol, 1988, vol.34, no. 4, pp: 436-441.

135. Na S.H., Miyanaga K., Unno H., Tanji Y. The survival response of Escherichia coli K12 in a natural environment // Appl. Microbiol. Biotechnol. -2006, V. 72, P. 386-392.

136. Nash H.A. Site-specific recombination: integration, excision, resolution, and insertion of defined DNA segments // Eschericia coli and Salmonella: cellular and molecular biology / Ed. Neighardt F.C. Washington: ASM Press, 1996. P. 23632376.

137. Nicholson W.L., Schuerger A.C., Setlow P. The solar UV environment and bacterial spore UV resistance: considerations for Earth-to-Mars transport by natural processes and human spaceflight // Mutat. Res. 2005, V. 571, P. 61736178.

138. Oliver J.D., Hite F., McDougald D., Andon N.L., Simpson L.M. Entry into, and resuscitation from, the viable but nonculturable state by Vibrio vulnificus in a natural environment // Appl. Environ. Microbiol. 1995, V. 61, P. 2624-2630.

139. Oliver J.D. The viable but nonculturable bacteria // J>. Microbiol. 2005, № 2, P. 93-100.

140. Ottemann K.M., Lowenthal A.C. Helicobacter pylori uses motility for initial colonization and to attain robust infection // Infect. Immun. 2002, V. 70, P. 1984-1990.

141. Park S.F., Purdy D., Leach S. Localized reversible frameshift mutation in the flhA gene confers phase variability to flagellin gene expression in Campylobacter coli //J. Bacteriol. 2000, V. 182, P. 207-210.

142. Perkins-Balding D., Duval-Valentin G., Glasgow A.C. Excision of IS492 requires flanking targetsequences and results in circle formation in Psuedoalteromonas atlantica//J. Bacteriol., 1999. V. 181 P. 1691-1697.

143. Postgete J.R., Viability measurements and survival of microbes under minimum stress // In Adv. Microbiol. Physiol., Eds. Rose A. and Wilkinson J., Academic Press, London. 1987, V. 1, P 1-23.

144. Priest F.G., Girgorova R. Methods for studying the ecology of endospore-forming bacteria // In R. Grigorova and J. R. Norris(ed.), Methods in microbiology, vol. 22. Academic Press, London, U.K- 1991, P. 565-591.

145. Pzoni L., Kotzamanides C., Yiangou M., Litopoulou-Tzanetaki E. Genotypic and phenotypic diversity of Lactococcus lactis isolates form Batzos, a Greek PDO raw goat milk cheese // Int. J. Food Microbial. 2007, V. 114, № 2, P. 211-220:

146. Rahman M.H., SuzukLS., Kawai K. Formation of viable* but non-culturable state (VBNC) of Aeromonas hydrophila and its virulence in goldfish, Carassius auratus II Microbiol. Res. 2001, V. 156, P. 103-106.

147. Ramchandran L., Shah N.P. Effect of Versagel on the growth and metabolic activities of selected lactic acid bacteria // J. Food Sci. 2008, V. 73, № 1, P. 2126.

148. Rasmussen M., Bjorck L. Unique regulation of SclB—a novel collagen-like surface protein of Streptococcus pyogenes II Mol. Microbiol. 2001, V. 40, P. 1427-1438.

149. Reponen T.A., Gazenko S.V., Grinshpun S.A., Willeke K, Cole E.C. Characteristics of airborne actinomycete spores // Appl. Environ. Microbiol. -1998, V. 64, № 10, P. 3807-12.

150. Ring A., Weiser J.N., Tuomanen E.I. Pneumococcal trafficking across the blood-brain barrier. Molecular analysis of a novel bidirectional pathway // J. Clin. Investig. 1998, V. 102, P. 347-360.

151. Rochat T., Miyoshi A., Gratadouxs J.J., Duwat P., Sourice S., Azevedo V., Langella P. High-level resistance to oxidative stress in' Lactococcus lactis conferred by Bacillus subtilis catalase KatE // Microbiology. 2005, V. 151, № 9, P. 3011-3018.

152. Roche R.J., Moxon E.R. Phenotypic variation in Haemophilus influenzae: the interrelationship of colony opacity, capsule and lipopolysaccharide // Microb. Pathog. 1995, V. 18, P. 129-140.

153. Rollins D.M.,Colwell R.R. Viable but nonculturable stage of Campylobacter jejuni and its role in, survival in the natural'aquatic environment // Appl. Environ. Microbiol! 1986, V. 52, P^ 531-538.

154. Roszak D-Bl, Grimes D.J., OolwelLR.R. Viable but nonrecoverable stage of Salmonella enteritidis in aquatic systems I I Can. J. Microbiol. 1984, V. 30, P. 334-338.

155. Saint-Ruf C., Pesut J., Sopta M., Matic I. Causes and consequences of DNA repair activity modulation during stationary // Crit. Rev. in Biochem. And Mol. Biol. 2007, V. 42, P. 259-270.

156. Sauer K., Camper A. Charactarization of phenotypic changes in Pseudumonas putida in response to surface-associated growth // J. of Bacteriol. -2001, V. 183, № 22, P. 6579-6589.

157. Saulnier D.M., Molenaar D., de Vos W.M., Gibson G.R., Kolida S. Identification of prebiotic fructooligosaccharide metabolism in Lactobacillus plantarum WCFS1 through microarrays // Appl. Environ. Microbiol. 2007, V. 73, №6, 1753-1765.

158. Saunders J.R. The genetic basis of phase and antigenic variation in bacteria // Antigenic Var. Infec. Diseases. Oxford, 1986. P. 57-76.

159. Schnider D., Lenski R.E., Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria // Res. Microbiol. 2004, V. 155, P. 319-327.

160. Setlow P. Bacterial spore resistance // G. Storz and R.Hengge-Aronis (ed.), Bacterial stress responses. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 1999/p: 217-230.

161. Setlow P. Spores of Bacillus subtilis: their resistance to and killing by radiation, heat and chemicals // J. Appl: Microbiol. 2006, V. 101, P. 514-525.

162. Shen X., Gumulak J., Yu H., French C.T., Zou N., Dybvig K. Gene rearrangements in the vsa locus of Mycoplasma pulmonis II J. Bacteriol. 2000, V. 182, P. 2900-2908.

163. Schilling J.D., Mulvey M.A., Hultgren S.J. Structure and function of Escherichia coli type 1 pili: new insight into the pathogenesis of urinary tract infections // J. Infect. Dis. 2001, V. 183, P. 36-40.

164. Siegle D.A., Almiron M., Kolter R. Approaches to the study of survival and death in stationary-phase Escherichia coli II In S. Kjelleberg (ed.) Starvation inbacteria. Plenum press, New York, 1993, P. 151-169.

165. Singh U.S., Scanneil R.T., An H.Y., Carter B.J., Hecht S.M. DNA cleavage by di-and tryhydroxyalkylbenzenes. Characterization of products and roles of O2 Cu(II) and alkali//J. Amer. Chem. Soc. 1995. V. 117. №51. P. 12691- 12699.

166. Slupska M.M., Baikalov C., Lloyd R., Miller J.H. Mutator tRNAs are encoded by Escherichia coli mutator genes mutA and mutC: a novel parthway for mutagenesis IIProc. Nat. Acad. Sei. USA. 1996, V. 93, P. 4380-4385.

167. Smith B., Oliver J.D. In Situ and In Vitro Gene Expression by Vibrio vulnificus during Entry into, Persistence within, and Resuscitation from the Viable but Nonculturable State // Appl. Environ; Microbiol. 2006, V. 72, № 2, P. 14451451.

168. Soina V.S., Mulyukin A.L., Demkina E.V., Vorobyova E.A., El-Registan G.I. The structure of resting bacterial populations in soil and subsoil permafrost // Astrobiology. 2004. V. 4. N. 3. P. 345-358

169. Stern A., Meyer T.F. 1987. Common mechanism controlling phase and antigenic variation in pathogenic neisseriae // Mol. Microbiol. 1987, V. 1, P. 512.

170. Su P., Henriksson A., Mitchell H. Prebiotics enhance survival and prolong the retention period of specific probiotic inocula in an in vivo murine model // J. Appl. Microbiol. 2007, V. 103, № 6, P. 2392-2400.

171. Sudo S.Z., Dworkin M. Comparative biology of prokaryotic resting cells // Adv. Microbiol. Physiol., 1973, V. 9, P. 153-224.

172. Suh S.J., Silo-Suh L., Woods D.E., Hasset D.J., West S., Ohman D.E. Effects of rpoS mutation on the stress response and expression of virulence factor in Pseudomonas aeruginosa II J. Bacterid. 1999, V. 181, № 13, P. 3890-3897.

173. Swanson J., Robbins K., Barrera O., Corwin D., Boslego J., Ciak J., Blake M., Koomey J. Gonococcal polin variants in experimental gonorrhea // J. Exper. Med. 1987, V. 165, № 5, P. 1344-1357.

174. Tang M., Shen X., Frank E.G., O'Donnell M., Woodgate R. UmuD*2C is an error-prone DNA polymerase Escherichia coli pol V II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1999, V. 96, pp. 8919-8924.

175. Tannaes T., Grav H.J., Bukholm G. Lipid profiles of Helicobacter pylori colony variants // APMIS. 2000, V. 108, P. 349-356.

176. Tannaes T., Dekker N., Bukholm G., Bijlsma J.J., Appelmelk B.J. Phase variation in the Helicobacter pylori phospholipase A gene and its role in acid adaptation // Infect. Immun. 2001, V. 69, P. 7334-7340.

177. Tenaillon O., Taddei F., radman M., Matic I. Second-order selection in bacteria evolution: selection acting on mutation and recombination rates in the course of adaptation//Res. Microbiol. 2001, V. 150, P. 617-626.

178. Tenaillon O., Denamur E., Matic I. Evolutionary significance of stress-induced mutagenesis in bacteria // Trends Microbiol. 2004, V. 12, № 6, P. 264270.

179. Tennen R., Setlow B., Davis K.L, Loshon C.A., Setlow P: Mechanisms of killing of spores of Bacillus subtilis by iodine, glutaraldehyde and nitrous acid // J. Appl. Microbiol. 2000, V. 89, P. 330-338.

180. Vinderola G., Marco M.B., Guglielmotti D.M., Perdigon G., Giraffa G., Reinheimer J., Quiberoni A. Spontaneous Lactobacillus delbrueckii phage-resistantmutants with acquired bile tolerance //Int. J. Food Microbiol. 2007. V. 116. P. 96-112.

181. Waite R.D., Penfold D.W., Struthers J.K., Dowson C.G. Spontaneous sequence duplications within capsule genes cap8E and its control phase variation in Streptococcus pneumoniae serotypes 8 and 37 // Microbiology. 2003, V. 149, P. 497-504.

182. Weiser J., Pan N. Adaptation of Haemophilus influenzae to acquired and innate humoral immunity on phase variation of lipopoly saccharide // Mol. Microbiol. 1998, V. 30, № 4, P. 767-775.

183. Wyers R. Prebiotics in Action // World Food Ingredient. 2004. October/November. P. 74-77.

184. Wyers R. Spreading Probiotics // World Food Ingredient. 2004. March. P. 26-27.

185. Wolfe J.A., Millikan D.S., Campbel J.M., Visick K.L. Vibrio fischeri <r54 controls motility, biofilm formation, luminescence and colonization //Appl. and Environ. Microbiol. 2004, V. 70, № 4, P. 2520-2524.

186. Woojin S. Kim, Ji Hyeon Park, Jun Ren, Ping Su, Noel W. Dunn Survival response and rearrangement of plasmid DNA of Lactococcus lactis during long-term starvation // Appl. and Envir. Microbiol., 2001. V. 67. № 10. P. 4594-4602.

187. Woude M.V., Baumler A.J. Phase and antigenic variation in bacteria //Clin. Microbiol. Rev. -2004, V. 17, № 3, P. 581-611.

188. Yaron S., Matthews K. A reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay for detection of viable Escherichia coli 0157:H7: investigation of specific target genes // J. Appl. Microbiol.- 2002, V. 92, P. 633-640.

189. Zhang J.R., Norris S.J. Genetic variation of the Borrelia burgdorferi gene vlsE involves cassette-specific, segmental gene conversion // Infect. Immun. -1998, V. 66, P. 3698-3704.

190. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ1. ДИССЕРТАЦИИ

191. Хабибуллин С.С., Николаев Ю.А., Лойко Н.Г., Голод Н.А., Милько Е.С., Воейкова Т.А., Эль-Регистан Г.И. Ауторегуляция фенотипической диссоциации у Bacillus licheniformis II Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2006. - Т. 75, № 6. - С. 9-13.

192. Милько Е.С., Крейер В.Г., Егоров Н.С., Лойко Н.Г., Голод Н.А. Развитие и популяционный состав смешанных (S+M) культур Pseudomonas aeruginosa в поздней стационарной фазе роста // Микробиология. 2008. — Т. 77, № 3. - С. 318-323.

193. Голод Н.А., Лойко Н.Г., Мулюкин А.Л., Нейматов А.Л., Воробьева Л.И., Сузина Н.Е., Шаненко Е.Ф., Гальченко В.Ф., Эль-Регистан Г.И. Адаптация молочнокислых бактерий к неблагоприятным для роста условиям // Микробиология. 2009. - Т. 78, № 3. - С. 317-335.

194. Голод Н.А., Лойко Н.Г., Лобанов К.В., Миронов А.С., Воейкова Т.А., Гальченко В.Ф., Эль-Регистан Г.И. Роль микробных ауторегуляторов -алкилоксибензолов, в контроле экспрессии стрессовых регулонов // Микробиология. 2009. - Т. 78, № 6. - С. 731-741.

195. Голод Н.А., Воейкова Т.А., Эль-Регистан Г.И. Влияние микробных аутоиндукторов анабиоза на геном бактерий // Тезисы Всероссийской молодежной школы-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии». 1-3 ноября 2005. Москва. С. 70-71.

196. Голод Н.А., Лойко Н.Г., Козлова А.Н., Николаев Ю.А., Дунин Д.А., Нематов А.Л., Эль-Регистан Г.И. Популяционная вариабельность молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus АТ-41 и Lactococcus lactis

197. ТБ2 // Материалы Международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты». 11-13 марта 2008. Москва. С. 80.

Информация о работе

Симон, Наталия Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.23

Диссертация

Биотехнологические аспекты внутрипопуляционной вариабельности молочнокислых бактерий - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы