Регуляция адаптации симбиотрофных бактерий к неблагоприятным условиям

Погорелова, Анна Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Регуляция адаптации симбиотрофных бактерий к неблагоприятным условиям
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция адаптации симбиотрофных бактерий к неблагоприятным условиям"

004609605

На правах рукописи

/1 Л

Погорелова Анна Юрьевна

РЕГУЛЯЦИЯ АДАПТАЦИИ СИМБИОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ К НЕБЛАГОПРИЯТНЫМ УСЛОВИЯМ

Специальность 03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 О СЕН 2010

Москва-2010

004609605

Работа выполнена на кафедре микробиологии и иммунологии Российского государственного аграрного университета - МСХА имени К. А. Тимирязева

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент

Ванькова Анна Андреевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Воробьева Лена Ивановна

кандидат биологических наук Мышкина Вера Леонидовна

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский

институт агрохимии имени Д.Н. Прянишникова, г. Москва

Защита диссертации состоится «Zfocsrii'J'pfbP 2010 г. в/£час.:5/-?шн. на заседании диссертационного совета Д 220.043.03 при Российском государственном аграрном университете - МСХА имени К.А. Тимирязева, корпус № 9, аудитория имени H.H. Худякова.

Адрес: 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 49. Ученый совет РГАУ -МСХА имени К.А. Тимирязева, факс 8(495)9762492.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Российского государственного аграрного университета - МСХА имени К.А. Тимирязева

Автореферат разослан « » Ü 1/7)0^- 2010 г. и размещен на сайте университета www.timacad.ru

Ученый секретарь

диссертационного совета (jUlÜU " O.B. Селицкая

Актуальность проблемы.

Использование бактериальных препаратов на основе симбиотрофных бактерий, способных к фиксации атмосферного азота, является наиболее экономичным и экологически чистым способом повышения плодородия почвы [Черников, Чекерес, 2000; Новикова, 2004; Тихонович, Круглое, 2006]. Инокуляция растений симбиотрофными азотфиксирующими бактериями (клубеньковыми pp. Azorhizobium, Rhizobium, Mesorhizobium, Sinorhizobium, Bradyrhizobium или ассоциативными pp. Azospirillum, Agrobacterium, Arthrobacter, Klebsiella) приводит к повышению продуктивности растений при снижении нормы расхода минеральных азотных удобрений [Мишустин, Шшьникова, 1973; Lin, 1983; Хотянович, 1991; Воробьева, 2000; Завалин с соавт., 2003; Кожемяков с соавт., 2004; Емцев, Мишустин, 2005; Тихонович с соавт. 2005]. Симбиозы также обладают огромными преимуществами для развития растительно-микробных ассоциаций в изменяющихся условиях окружающей среды, чему способствуют высокий природный адаптационный потенциал партнеров и их эволюционно закрепленное взаимовыгодное сосуществование [Douglas, 1994; Seckbach, Dordrecht, 2002; Muratova et al., 2003; Проворов, 2001, 2009; Тихонович, Проворов, 2003, 2007]. Однако при циклической смене хозяина симбиотрофные бактерии попадают в почву и должны существовать в ней в иных, отличных от симбиотических, условиях, что требует реализации ранее не проявляемых свойств. Вместе с тем проблеме выживания симбиотрофных микроорганизмов в природных экосистемах, особенно в неблагоприятных условиях, уделяется мало внимания.

Создание современных бактериальных препаратов сопряжено с селекцией как высокопродуктивных, так и стрессоустойчивых штаммов, быстро адаптирующихся при попадании в почву, возобновляющих активный метаболизм и сохраняющих способность к колонизации растения [Завалин, 2000; Проворов, Тихонович, 2003]. Поэтому изучение механизмов адаптации симбиотрофных бактерий не только актуально, но является и своевременной агробиотехнологической задачей. Особенно важным представляется исследование таких типов стратегии адаптации, как образование покоящихся форм (ПФ), которые позволяют популяции переживать неблагоприятные для роста условия [Бухарин с соавт., 2005; Мулюкин с соавт., 2002; Эль-Регистан с соавт., 2006], реализуя внутрипопуляционную фенотипическую вариабельность, от которой зависит эффективность развития бактерий в их жизненном цикле и результативность симбиозов [Dragutin et al., 2003; Woude et al., 2004]. Особое значение имеет изучение роли в этих процессах низкомолекулярных микробных и растительных ауторегуляторов.

Цель работы: изучить закономерности формирования и развития адаптивных реакций симбиотрофных бактерий.

Задачи исследования:

1. Установить условия образования покоящихся клеток симбиотрофных бактерий БиюгЫгоЫит теШой, шт. Р221, и АгсщпгШит ЪгазИете, шт. Бр7 и Бр245, как формы адаптационного ответа на неблагоприятные для роста условия. Исследовать морфологическое и физиологическое разнообразие покоящихся форм этих бактерий, образующихся при имитации природных стрессовых условий. 2. Выявить различия в стратегии выживания симбиотрофных бактерий с разным типом взаимодействия с растительным партнером на примере двух штаммов А. ЬгазИете: неэндофитного (ассоциативного) Бр7 и эндофитного 8р245. 3. Изучить внутривидовую вариабельность 51. теШоН и А. brasilen.se, реализующуюся при прорастании покоящихся форм. Охарактеризовать культуральные, морфологические, физиолого-биохимические и биотехнологические признаки выделенных диссоциантов, а также тип их подвижности. 4. Оценить роль низкомолекулярных ауторегуляторов растительного и микробного происхождения в контроле адаптивных реакций ризобиальных бактерий.

Научная новизна.

1. Впервые получены доказательства способности симбиотрофных ризобиальных бактерий 5. теШой, шт. Р221, и А. ЬгаяИете, шт. 8р245, образовывать в цикле развития их культур клетки, обладающие признаками покоящихся форм. Выявлены условия, моделирующие стрессовые природные ситуации и способствующие массовому образованию покоящихся форм. 2. Обнаружено разнообразие покоящихся форм 5. теШой и А. brasilen.se, различающихся ультраструктурной организацией, пролиферативным потенциалом и терморезистентностью, что демонстрирует гибкость стратегии выживания этих бактерий. 3. Установлена зависимость формирования ПФ А. ЪгазИете определенного морфотипа от характера взаимодействия с растительным партнером (неэндофитного или эндофитного). 4. Изучена фенотипическая диссоциация теШоН и А. bra.silen.4e, составляющая адаптивный потенциал популяции. Выделены и охарактеризованы варианты бактерий по культуральным, морфологическим, физиолого-биохимическим и биотехнологическим признакам, а также типу подвижности. 5. Обнаружены различия в плазмидном профиле диссоциантов 5. теШоИ. 6. Впервые показана возможность регуляции адаптивных реакций симбиотрофных бактерий ауторегуляторами растительного происхождения - агглютинином зародышей пшеницы (АЗП) и микробного происхождения - алкилоксибензолами (АОБ).

Практическая значимость работы. 1. Полученные результаты могут быть использованы для разработки эффективных бактериальных препаратов на основе цистоподобных покоящихся клеток (ЦПК) азотфиксиругощих бактерий, длительно сохраняющих жизнеспособность. 2. Предложены способы: а) быстрого получения диссоциантов симбиотрофных бактерий путем рассева ПФ на плотные или полужидкие среды; б) селекции диссоциантов с заданными свойствами, путем применения избирательных ростовых условий. 3. Создана коллекция диссоциантов S. meliloti и A. brasilense, различающихся ростовыми, физиолого-биохимическими признаками, а также типом подвижности, которые могут быть использованы при получении бактериальных препаратов для сельского хозяйства. 4. Разработаны способы контроля адаптационных возможностей симбиотрофных бактерий, основанные на применении низкомолекулярных ауторегуляторов микробного и растительного происхождения. Способы предусматривают: а) стимуляцию роста; б) сохранение жизнеспособности клеток при длительном хранении; в) направленное изменение типа коллективной подвижности бактерий для повышения результативности колонизации растений.

Апробация работы. Результаты работы были обсуждены на: VI Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Беларусь, Минск 2008); II Международной научно-практической конференции «Проблемы биологии, экологии, географии, образования: история и современность» (Пушкин, 2008); Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной выдающимся педагогам Петровской академии (Москва, 2008); IV межрегиональной конференции молодых ученых (Саратов, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Исследования осуществлялись совместно с ИНМИ имени С.Н. Виноградского РАН, ГосНИИГенетики, Центром «Биоинженерия» РАН, ИБФМ имени Г.К. Скрябина РАН, Пущино.

Автор выражает искреннюю признательность научному консультанту, доктору биологических наук Г.И. Эль-Регистан, кандидату биологических наук Н.Г. Лойко, сотрудникам лаборатории классификации и хранения уникальных микроорганизмов Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.

Структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 155 страницах и включают 29 рисунков и 20 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов и списка литературы, содержащего 200 работ отечественных и зарубежных авторов.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили симбиотрофные азотфиксирующие бактерии БтогЫгоЫит теШоН шт. Р221 (В-9442) и АгозртИит ЬгазИете штаммы 8р7 (АТСС 29145) и 8р245 (из коллекции ИБФРМ РАН, Саратов).

Методы исследований.

Бактерии >5. теШоН выращивали на маннитной среде \Muratova е1 а1., 2003] или безазотистой среде Эшби [Зенова с соавт.., 2002]; А. ЬгачИеп.че - на среде МБМ [БдЬегетег У. е! а1., 1976] в колбах объемом 250 мл (50 мл среды) на качалке (150 об/мин) при температуре 28°С.

Оптическую плотность (ОП) клеточных суспензий измеряли нефелометрически на спектрофотометре «Зресогс!» (к = 540 нм, 1 = 10 мм). Численность колониеобразующих единиц (КОЕ) определяли высевом бактериальных суспензий соответствующих разведений на агаризованные среды. Термоустойчивость клеток оценивали после прогрева клеточных суспензий в ультратермостате «ЦУ-Ю» при температурах 50 - 60°С в течение 5-10 минут с последующим определением числа КОЕ. Эндогенное дыхание клеток определяли полярографически [Шольц, Островский, 1975]. Микроскопические наблюдения проводили на микроскопе «АшрНуа1» (Германия) с фазово-контрастным устройством. Для ультрамикроскопических исследований осажденные клетки фиксировали по методу Бригг [Бригг е1 а1., 1980]. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме ЬКВ III (Швеция) и просматривали в микроскопе 1ЕМ-100В (Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ и инструментальном увеличении 10000 - 35000. Цистоподобные покоящиеся клетки (ЦПК) получали, подвергая бактерии стрессорным воздействиям (термообработке) [Мулюкин с соавт., 1996; Лойко с соавт., 2000]. Диссоцианты бактерий получали при рассеве ЦПК на агаризованные среды с пересевом каждого фенотипа по 5 клонов последовательно в 5 - 6 пассажах. Индекс диссоциации популяции определяли как долю (%) колоний определенного фенотипа к общему числу колоний. Подвижность бактерий оценивали после их посева уколом в полужидкую среду (0.4 - 0.5 % агар-агара или фитогеля) [Шелудько с соавт., 2001].

В качестве микробных ауторегуляторов использовали химические аналоги аутоиндукторов анабиоза - алкилоксибензолы (АОБ): амфифильный С7-АОБ и гидрофобный С12-АОБ. В качестве растительного ауторегулятора использовали лектин растительного происхождения - агглютинин зародышей пшеницы (АЗП). Для исследования влияния ауторегуляторов на адаптационные механизмы бактерий их растворы вносили в плотные или полужидкие среды, или в клеточные суспензии до заданной концентрации.

Степень деградации фенантрена диссоциантами 5. теШоН оценивали следующим образом. Клетки бактерий высевали на агаризованную маннитную

среду. Спустя трое суток выросшие колонии опрыскивали 3%-ным раствором фенантрена в серном эфире. Через 2 недели фиксировали зоны деструкции фенантрена с областью просветления вокруг колоний. Определение нитрогеназной активности в чистой культуре проводили ацетиленовым методом на газовом хроматографе CHROM-4-1 с пламенно-ионизационным детектором [Звягинцев, 1991].

Выделение ДНК осуществляли согласно методике, основанной на модифицированном методе щелочного выделения ДНК Бирнбойма-Доли [Birnboim, Doty, 1979] и Wizard-технологии фирмы Promega (США). Для проведения полгшеразной цепной реакции и дальнейшего секвенирования ПЦР-фрагментов гена 16S рРНК была использована универсальная праймсрная система [Lane, 1991]. Секвенирование продуктов амплификации проводили по методу Сэнгера [Sanger et al., 1977]. Построение бескорневых филогенетических деревьев исследуемых бактерий производили с помощью методов, реализованных в пакете программ TREECON [Van de Peer Y„ De Wachter, 1994]. Плазмидный скрининг осуществляли согласно методике Голубева [Голубев, 2002].

Статистическую обработку проводили стандартными методами в программе Microsoft Excel ХР. Значение искомого параметра выражали как среднюю величину из трех независимых экспериментов с учетом значений стандартного отклонения. Различия между группами данных считали достоверными при уровне значимости менее 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Образование покоящихся клеток как форма адаптации симбиотрофных бактерий к условиям, неблагоприятным для роста и развития. Биоразнообразие форм покоя

Важным эволюционно выработанным и наследственно закрепленным механизмом адаптации бактерий к стрессовым условиям (исчерпанию питательных веществ, источников энергии, пространственных возможностей, действию повреждающих факторов) является образование покоящихся форм (ПФ), в виде которых популяция переживает неблагоприятные для роста и развития условия [Бухарин с соавт., 2005; Dressaire et al., 2008]. Недостаток информации об образовании ПФ симбиотрофными бактериями, совмещающими в жизненном цикле стадию свободноживущих гетеротрофных клеток и стадию симбиотического взаимодействия с растением-хозяином, не позволяет эффективно использовать эти бактерии в биотехнологических процессах.

В качестве объекта для исследования процессов образования ПФ у симбиотрофных бактерий были взяты клубеньковые бактерии Sinorhizobium meliloti, штамм Р221, способные к разложению ароматических углеводородов. Покоящиеся формы у них ранее не были известны. При анализе лабораторных культур S. meliloti, выросших в стандартной (маннитной) среде и длительно хранящихся - 6 - 12 месяцев, в них было обнаружено небольшое количество интактных, уменьшенных в размерах, рефрактерных клеток, которые по морфологическим признакам можно отнести к ПФ. Для увеличения количества образующихся ПФ были применены разработанные ранее способы, имитирующие природные стрессовые условия [Мулюкин с соавт., 1996].

1.1 Образование ПФ S. meliloti при модификации условий культивирования

Первый прием, способствующий массовому образованию ПФ у неспорообразующих бактерий, был основан на модификациях стандартной среды роста - снижении количества азота и/или фосфора, уровня аэрации, что приводит к повышенному биосинтезу аутоиндукторов анабиоза, относящихся к алкилоксибензолам, концентрация которых в среде определяет путь дальнейшего развития клеток [Эль-Регистан с соавт., 1979, 1980, 2006; Светличный с соавт., 1986; Лойко с соавт., 2003]. Были использованы 5 вариантов модификации стандартной среды: 1) снижение содержания азота (lim N) в 10 раз; 2) снижение содержания фосфора (lim Р) в 5 раз; 3) снижение содержания азота в 10 раз и фосфора в 5 раз (lim N,P) 4) снижение уровня аэрации (lim О); 5) снижение содержания азота в 10 раз, снижение фосфора в 5 раз, а также снижение уровня аэрации (lim N,P,0). Культуры клеток, выращенные в этих условиях, хранили при температурах 20°С и 4°С в течение 4 и более месяцев. Микроскопические наблюдения показали, что в лимитированных средах значительно увеличилось количество образовавшихся покоящихся рефрактерных клеток (до 90 %) и время сохранения (2-4 месяца) их жизнеспособности. Численность КОЕ через 4 месяца инкубации в опытных вариантах снижалась на 24 - 76 % от максимальной в стационарной культуре (48 ч), тогда как в контрольных вариантах в стандартной среде - на 2 порядка. Хранение образовавшихся ПФ при низкой температуре (4°С) обеспечивало лучшее сохранение жизнеспособности бактерий, чем хранение при 20°С (рис. 1).

стандартная lim N lim P lim N, P lim О lim N, P, О

среда

Рисунок 1. Численность жизнеспособных клеток S. meliloti шт. Р221 (% от КОЕ в стационарной фазе, 48 ч), полученных в разных вариантах сред при хранении их суспензий 4 месяца: - при 20°С; □ - при 4°С

Следует отметить, что хотя в лимитированных условиях роста число КОЕ в выросших культурах было существенно ниже, чем в контроле, однако доля образовавшихся ПФ была значительно больше. По процентному содержанию клеток, сохранивших способность к колониеобразованию на плотной среде после длительного (4 месяца) хранения от максимального числа КОЕ в 48 ч культуре, лучшими оказались варианты: 1) lim N; 2) lim N, Р, О при 20°С и 3) lim N; 4) lim N, Р; 5) lim N, P, О при 4°C, тогда как по абсолютному количеству образовавшихся ПФ (КОЕ/мл) лидировали культуры в средах с lim Р (20°С) и lim N (4°С), lim Р (4°С), lim N, Р (4°С). Проведение процедур реактивации, включающих отмывку клеток от аутоиндукторов анабиоза, а также инкубацию в 10"4 М растворе фитогормона индолил-3-уксусной кислоты (ИУК), повышало число жизнеспособных ПФ (КОЕ) в 1.5-2 раза (табл. 1).

Таблица 1. Жизнеспособность ПФ, полученных в лимитированных средах через 7 месяцев хранения при 20°С после проведения процедур реактивации

Варианты реактивации Варианты сред

КОЕ/мл (% от КОЕ до реактивации)

lim N lim Р lim N,P lim N,P,0

Контроль (до реактивации) (6.6±0.2) хЮ8(Ю0) (8.2±0.4) х108 (100) (5.1±0.3) х108(100) (0.6±0.3) хЮ8 (100)

Отмывка в физ. р-ре pH 7.0,2 ч (1.0±0.06) х109(152) (8.7±0.3) хЮ8(Ю6) (6.8*0.3) х109 (133) (0.8±0.3) хЮ8 (119)

Отмывка в физ. р-ре pH 7.0+ИУК 10~4М, 2ч (1.3±0.1)х 109 (197) (1.0±0.1) Х109 (122) (1.2±0.1) х109 (235) (0.93±0.6) х108(142)

Рефрактерные, длительно сохраняющие жизнеспособность клетки обладали свойствами, позволяющими отнести их к покоящимся формам

бактерий. Электронно-микроскопически были выявлены существенные различия в ультраструктурной организации переживающих форм и вегетативных клеток. Также были обнаружены различия в морфотипах ПФ, образовавшихся в разных условиях роста (рис. 2). У ПФ, полученных в среде с lim N,P,0 (20°С), наблюдались: многослойная оболочка, увеличение периплазматического пространства (электронно-прозрачного или заполненного плотными гранулами на апикальных участках), мелкогранулярная комковатая текстура цитоплазмы и конденсированный нуклеоид. ПФ другого типа, сформированные в средах с lim N и lim О, имели утолщенную клеточную стенку и многочисленные включения полиоксиалканатов (рис. 2 б, в).

Рисунок 2. Ультратонкие срезы покоящихся клеток S. meliloti шт. Р221, полученных через 4 мес. хранения в лимитированных средах: а) lim N,P,0 (20°С) б) lim О (20°С); в) lim N (4°С). Длина масштабной линейки - 1 мкм

Полученные в длительно хранящихся (2-7 месяцев) культурах переживающие клетки не проявляли метаболической активности -эндогенное дыхание не выявлялось.

Важным признаком покоящегося состояния клеток является их повышенная устойчивость к стрессовым воздействиям. ПФ после 4 месяцев хранения обладали повышенной термоустойчивостью. После прогрева при 55°С в течение 10 минут численность жизнеспособных клеток в лимитированных средах в среднем на два порядка выше, чем в стандартной среде (табл. 2). Наиболее терморезистентными оказались ПФ, полученные в среде с limN.

Таблица 2. Термоустойчивость ПФ S. meliloti шт. Р221 (4 месяца хранения)

Условия получения ПФ Число жизнеспособных ПФ, КОЕ/мл

Среда Температура °C До термообработки (контроль) После термообработки

55°С, 10 мин. 60°С, 5 мин.

Стандартная 20 (0.3±0.1)хЮ9 (6.1±0.2)хЮ3 (5.0±0.3)хЮ'

4 (0.14±0.01)хЮ9 (5.6±0.1)xl0J (4.4±0.2)х10'

limN 20 (1.0±0.1)xl09 (1.9±0.1)х106 (9.0±0.1)хЮ2

4 (2.5±0.2)хЮу (5.5±0.3)хЮ6 (9.2±0.3)хЮ2

limP 20 (2.16±0.2)х10'' (6.3±0.4)хЮ5 (8.0±0.5)х102

4 (4.8±0.3)хЮ" (2.2±0.2)хЮ4 (8.0±0.5)хЮ2

lim N,P 20 (1.2±0.2)хЮ" (5.1±0.4)х105 (9.8±0.1)хЮ2

4 (2.9±0.1)хЮ9 (9.5±0.6)хЮ5 (4.5±0.3)*102

lim О 20 (0.14±0.02)хЮу (4.4±0.2)х104 (2.5±0.1)хЮ2

4 (0.21±0.03)х10у (6.0±0.3)х104 (3.1±0.2)хЮ2

lim N,P,0 20 (0.48±0.2)хЮ9 (1.5±0.1)х105 (2.1±0.1)хЮ2

4 (0.57±0.1)х109 (2.4±0.3)хЮ5 (3.0±0.2)хЮ2

Таким образом, лимитирование среды роста по азоту, фосфору или уровню аэрации приводит к образованию в цикле развития культуры S. meliloti покоящихся форм бактерий цистоподобного типа (ЦПК), длительно сохраняющих способность к колониеобразованию, обладающих особенностями ультраструктурной организации, термоустойчивостью и метаболически не активных.

1.2 Образование ПФ S. meliloti в сгущенных клеточных суспензиях

Одним из стрессов, «запланированных» в циклах развития микробных культур, является исчерпание жизненного пространства в результате достижения критической клеточной плотности [Parsek, Greenberg, 2000; Бухарин с соавт., 2005]. Такую ситуацию в работе моделировали сгущением клеточных суспензий S. meliloti в среде роста в 20 раз. При этом часть клеток подвергалась автолизу, другая приобретала рефрактерность. Число жизнеспособных клеток (КОЕ) после 2-месячного хранения сгущенных суспензий оказалось на порядок меньше, чем без сгущения (табл. 3). Термообработка суспензий ПФ приводила к резкому снижению численности. После прогрева при 55°С в течение 10 минут сгущенных суспензрш число жизнеспособных клеток составило 5.2x103 КОЕ/мл, в среде без сгущения -7.1 ХЮ4 КОЕ/мл. Отметим, что по литературным данным [Layne, Johnson, 1964] цисты бактерий рода Azotobacter практически не отличались от вегетативных

клеток по устойчивости к дозе теплового воздействия, но выдерживали высушивание.

Таблица 3. Влияние сгущения клеточной суспензии на жизнеспособность клеток 5. теШой шт. Р221

Время наблюдения Численность, КОЕ/мл (% от первоначального КОЕ)

Без сгущения Сгущенная в 20 раз

1 час (5.0±0.3)х 109 (100) (2.0±0.1)х10ш(100)

2 недели (3.1±0.3)х109 (62) (8.6±0.2)хЮ8 (4)

1 месяц (1.8±0.1)х109 (36) (3.8±0.2)xl0s(2)

2 месяца (1.0±0.1)х109 (20) (2.7±0.1)х108(1)

Электронно-микроскопически было установлено, что переживающая сгущенная популяция (3 месяца хранения) представлена двумя типами клеток. Первый тип был аналогичен ПФ, полученным в среде с lim N, Р, О (рис. 3 а). Клетки второго типа отличались расширенным периплазматическим пространством, практически не имели включений полиоксиалканатов, обладали конденсированным нуклеоидом (рис. 3 б).

Рисунок 3. Электронно-микроскопические снимки срезов ПФ клеток 5". теШой шт. Р221, полученных в сгущенной в 20 раз клеточной суспензии через 3 месяца хранения: а) 1 -й тип клеток, б) 2-й тип леток

Таким образом, показано, что сгущение клеточных суспензий теШоН не приводит к повышению жизнеспособности бактерий.

1.3 Образование ПФ 5. теШоИ при внесении аутоиндукторов анабиоза

Третий прием получения анабиотических клеток 5. теШой имитировал экологическую ситуацию, связанную с высыханием почвы и происходящим при этом повышением в среде концентрации ауторегуляторов, в том числе, аутоиндукторов анабиоза, по химической структуре относящихся к

алкилоксибензолам (АОБ) [Элъ-Регистан с соавт., 1979; Дуда с соавт., 1982; Сузина с соавт., 2004]. Образование ПФ индуцировали внесением химического аналога микробных АОБ - Сп-АОБ в 36-часовую культуру до конечных концентраций 1хЮ"3, 5*10"4, 1x10"4, 5><10'5 М. Воздействие ауторегулятора оказалось дозозависимым (табл. 4): при воздействии самой высокой из исследуемых концентраций С12-АОБ 1 х 10"3 М, бактерии теряли способность к образованию колоний уже через 30 минут экспозиции при сохранении интактности клеток. Такие клетки можно рассматривать как ранее описанные мумифицированные формы [Мулюкин с соавт., 2003]. В варианте с концентрацией 5х 10"4 М клетки теряли способность к колониеобразованию через 1 месяц инкубации, возможно вследствие перехода во временно некультивируемое состояние, описанное ранее для ПФ Micrococcus luteus [Kaprelyants, Mucamolova et al., 1996].

Таблица 4. Жизнеспособность клеток S. meliloti шт. P221 после воздействия С12-АОБ

Концентра цня Сп-АОБ, М Время экспозиции

Численность жизнеспособных клеток, КОЕ/мл (% от контроля)

30 мин. 5 сут. 1 мес.

Контроль (6.9±0.2)х10"(100) (4.2±0.1)х10"(100) (2.3±0.2)х109(Ю0)

lxl0"J 0 0 0

5x10"" (1.0±0.1)х106(0.02) (13±0.4)х 10^(0.03) 0

1хНГ (5.9±0.2)х 10^(86) (3.7±0.1)xl0s(9) (2.8±0.3)х10'(12)

5х 10"5 (6.7±0.3)х10"(97) (5.8±0.2)х 10^(139) (4.2±0.5)х 109(183)

В варианте с наименьшей концентрацией - 5хЮ"5 М при длительной инкубации (5 суток - 1 месяц) число клеток, способных образовывать колонии на агаризованной среде было на 39% и 83%, соответственно, выше, чем в контроле, а их терморезистентность (55°С х 10 минут) на порядок больше (табл. 5). Действие температуры (60°С х 5 минут) оказалось губительным как для контрольной, так и для опытных клеточных суспензий. Применение описанных выше процедур реактивации, включающих отмывку ПФ в физрастворе для вариантов 1Х10"4, 5 х 10~5 М способствовало увеличению числа КОЕ в 1.5 -2 раза.

Таблица 5. Термостабильность ПФ теШой шт. Р221, полученных при воздействии С12-АОБ, хранившихся в течение месяца

Концентрация Число жизнеспособных клеток, КОЕ/мл

с,2-аоб, м До термообработки 55°С, 10 мин. 60°С, 5 мин.

Контроль (2.3±0.2)х109 (4.5±0.48)хЮ4 0

1х10"3 0 0 0

5x10"4 0 0 0

1 х 10"* (2.8±0.3)х107 (2.2±0.1)хЮ4 0

5хЮ"5 (4.2±0.5)х109 (4.0±0.32)хЮ5 0

Клетки в длительно хранящихся опытных образцах не обладали выявляемым уровнем эндогенного дыхания, что свидетельствовало об ингибировании их метаболической активности, и имели отличительные особенности ультраструктурной организации, характерной для ЦПК.

Следует отметить, что у полученных покоящихся клеток не менялся тип коллективной подвижности, что является важным фактором при взаимодействии ризобиальных симбиотрофов с растениями \Catlow et al., 1990; Bashan, Holguin, 1994; Dekkers et al., 2000; Шелудько, Кацы, 2001; Czaban et al., 2006]. Вегетативные клетки S. meliloti после инокулирования их уколом в полужидкий агар (0.4%) скоординировано распространялись с образованием регулярных кольцевых структур - роились (Swa+ фенотип, от англ. swarming -роение). На фоне роения наблюдалось также распространение клеток с образованием микроколоний (Gri+ фенотип, от англ. granular inclusions). ПФ также имели смешанный тип подвижности Swa+Gri+, при этом скорость движения у вариантов с внесением С12-АОБ в концентрации 5*10"5М, SxlO^M была на уровне, 1хЮ"4М - значительно выше контрольной, Iх 10"3 - движение отсутствовало (табл. 6).

Таблица 6. Подвижность клеток S. meliloti шт. Р221, полученных при воздействии С^-АОБ

Концентрация с,2-аоб,м Диаметр зон распространения клеток, мм

Возраст ПФ

30 мин. 5 сут. 1 мес.

Контроль 16.5±0.2 15.0±0.5 11.0±0.4

1хЮ"3 0 0 0

5Х10-4 15.0±0.14 15.0±0.32 0

lxlO"4 25.0±1.9 19.75±1.5 15.0±0.2

5хЮ"5 15.0±0.4 14.0±0.3 11.0±0.31

Итак, при повышении концентрации аутоиндукторов анабиоза бактерии & теШоН формировали ЦПК, обладающие всеми необходимыми характеристиками ПФ бактерий.

Таким образом, впервые для симбиотрофных ризобиальных бактерий & теЫоИ показано, что они способны в циклах их развития или в условиях повышения уровня аутоиндукторов анабиоза формировать клетки, обладающие всеми признаками покоящихся форм: длительным сохранением жизнеспособности в условиях, способствующих автолизу; пониженным уровнем метаболической активности (эндогенного дыхания); устойчивостью к стрессовым воздействиям (термоусточивостыо); особенностями ультратонкой организации, свидетельствующими о существенных внутриклеточных структурных перестройках. Количество, свойства и полиморфизм образующихся покоящихся форм 5. те1Ио// зависели от условий роста культур (модификация среды), условий их постстационарной инкубации, концентрации АОБ. Биоразнообразие ЦПК ризобий, по-видимому, обеспечивает осуществление разных экологических функций. Полученные результаты могут быть использованы при создании бактериальных препаратов нового поколения на основе ЦПК бактерий, длительно сохраняющих жизнеспособность и устойчивость к повреждающим воздействиям.

2. Различия в стратегии выживания (образования ПФ) симбиотрофных ассоциативных бактерии АгоъртИит Ъгаъ'йете с разным типом взаимодействия с растительным партнером

В жизненном цикле азоспирилл выделяют две фазы, что обусловлено сменой условий окружающей среды и связано с жизнедеятельностью растения-хозяина. Фаза активной жизнедеятельности совпадает с периодом вегетации колонизируемого ими растения, а фаза покоя (в зимнее время) совпадает с фазой покоя растения-хозяина [Мулюкин с соавт., 2009]. Поэтому большое значение в их адаптации к неблагоприятным условиям должен играть характер взаимодействия с растительным партнером (экзо- или эндосимбиоз). В работе исследовали стратегию выживания, связанную с переходом клеток в покоящееся состояние, у двух штаммов А. Ьга$Иете\ неэндофитного шт. Бр7, колонизирующего поверхность корня, и эндофитного шт. Бр245, клетки которого локализуются внутри корня е1 а1., 1995; БсЬШег й а1., 1998].

Оба штамма обладали полиморфизмом покоя и образовывали в циклах развития несколько типов покоящихся клеток, которые по совокупности признаков, описанных в предыдущей главе, можно квалифицировать как ЦПК (рис. 4). Образование ЦПК наблюдалось в разных условиях. ЦПК обоих

штаммов отличались ультраструктурной организацией и термоустойчивостью (рис. 4, табл. 7).

Рисунок 4. Электронно-микроскопические снимки срезов ЦПК А. brasilense, полученых в среде с lim N через 4 месяца хранения: а, б) шт. Sp7; в, г) шт. Sp245. Обозначения: К - капсула; НМ - наружная мембрана; ЦПМ -цитоплазматическая мембрана; Ц - цитоплазма; Н - нуклеоид; В - включения; Гр - гранулы на поверхности клеток; КС - клеточная стенка; Э - экзина; И -интина. Длина масштабной линейки - 300 нм

Таблица 7. Термоустойчивость ЦПК А brasilense шт. Sp7 и шт. Sp245

Штамм Число жизнеспособных клеток (КОЕ/мл)

До термообработки (контроль) После те эмообработки (10 мин.)

50°С 55°С 60°С

Sp7 (2.1±0.3)х108 (1.4±0.3)х106 (2.0±0.2)хЮТ1 (2.0±0.1)хЮ4

Sp245 (3.1±0.3)хЮ7 (2.1±0.4)хЮ5 <10 <10

В постстационарных культурах шт. Бр7 (среда с пятикратно сниженным содержанием Ы) обнаруживались ЦПК двух типов. Для первого (рис. 4 а) было характерно хорошо выявляемое периплазматическое пространство,

дополнительные слои в электронно-плотных покровах, выраженный капсулярный слой, наличие внеклеточных электронно-плотных меланиноподобных гранул, ассоциированных с капсульным слоем. ЦПК второго типа (рис. 4 б) капсулыюго слоя не имели, но были заключены в обширный, синтезированный de novo матрикс, вероятно, обеспечивающий дополнительную защиту ПФ бактерий неэндофитов от повреждающих воздействий, что согласуется с их повышенной термоустойчивостью (табл. 7). ЦПК штамма Sp245 формировались при развитии культур в средах с пятикратно сниженным содержанием Р. У ЦПК штамма Sp245 наружные покровы были менее дифференцированы, цитоплазма содержала меньше включений, отсутствовал выраженный капсульный слой (рис. 4 в). Кроме того, клетки штамма Sp245 в условиях голодания (при перенесении клеток, выращенных в lim N, в физраствор) формировали дифференцированные ПФ, сходные с цистами азотобактера и цистами, описанными выше для S. meliloti. Такие покоящиеся клетки обладали хорошо выраженными слоями, аналогичными интине и экзине (рис. 4 г). У штамма Sp7 в этих условиях образования цист не наблюдалось, но в литературе они были описаны при высушивании колоний и клеточных агрегатов [Sadasivan, Neyra, 1987].

Таким образом, оба штамма азоспирилл при лимитировании питательных сред образовывали ЦПК разных морфотипов и покоящиеся формы типа цист азотобактера, что отражает различия в их взаимодействиях с растением-хозяином. Покоящиеся клетки у штамма Sp245 были получены впервые. Образование нескольких типов ПФ у обоих штаммов как более просто организованных - типа ЦПК, так и дифференцированных и близких по строению с цистами, различающихся не только особенностями ультраструктурной организации, но и термоустойчивостью, свидетельствует в пользу внутривидового разнообразия форм покоя, что способствует выживанию популяции и сохранению вида.

3. Внутрипопуляционная фенотипическая вариабельность снмбиотрофных бактерий как форма их адаптации к стрессу

Вклад в адаптацию микроорганизмов вносит внутрипопуляционная фенотипическая вариабельность - расщепление однородной популяции бактерий на варианты, различающиеся генотипическими, физиолого-биохимическими и морфологическими свойствами [Милько с соавт., 2007]. Фенотипическая вариабельность относится к специфическому типу мутаций и осуществляется за счет транспозиции мобильных генетических элементов, экспрессии генов по типу «включение-выключение», фаговой или плазмидной конверсии и др. [Hallet et al., 1997; Головлев, 1998; Прозоров, 2001; Woude et al.,

2004]. Диссоциативные (фазовые) переходы реализуются при прорастании покоящихся клеток как селективное развитие варианта, наиболее адаптивного к новым условиям роста [Дорошенко с соавт., 2001], а для ризобиальных бактерий - наиболее способного к колонизации растения, что обеспечивает результативность симбиоза.

3.1 Популяционная вариабельность Azospirillum brasilensex сопряженность с состоянием покоя, свойства диссоциантов

Способность к фенотипической диссоциации штаммов A. brasilense Sp7 и Sp245 оценивали по образованию и развитию колоний, различающихся по культуральным признакам, при рассеве суспензий ЦПК, полученных в лимитированных средах.

В нашей работе были выделены и описаны 6 диссоциантов азоспирилл шт. Sp7 (табл. 8): S (smooth) - гладкий, R (rough) имеет шероховатый тип колоний [.Милько, Егоров, 1991], Pg (pigment) - пигментированные колонии с гладкой поверхностью, Sm (small) - мелкие (d 0.3-0.7мм) гладкие колонии, Sg (segment) - гладкие колонии с сегментообразным ростом, PgCr (pigment-crystal) -пигментированные колонии, образующие внеклеточные кристаллы в толще агара [Погорелова с соавт., 2009]; и 3 диссоцианта шт. Sp245 (табл. 9): М (mucoid) - слизистый [Милько, Егоров, 1991], S, Sm. По-видимому, наличие более широкого диссоциативного спектра у неэндофитных азоспирилл, по сравнению с эндофитными, обусловливает большие возможности адаптивных реакций в условиях их сапротрофного роста в ответ на действие неблагоприятных факторов.

Внутрипопуляционные диссоцианты различались морфологическими признаками, устойчивостью к стрессовым воздействиям (повышенной температуре), диссоциативной стабильностью, а также типом подвижности клеток, определяющим успешность колонизации растений.

Применение термообработки ЦПК перед их рассевом позволило расширить диссоциативный спектр популяций за счет проявления Sm-фенотипа, клетки которого не обладали наблюдаемой подвижностью в полужидком агаре. Этот вариант не обладал стабильностью в стандартных условиях роста и быстро ревертировал к доминантным S- и Pg-типам, что обеспечивало восстановление способности клеток к передвижению.

Таблица 8. Описание фенотипических признаков диссоциантов А. brasilense шт. Sp7 (неэндофитный штамм)

Тип диссоцианта Культур альные признаки диссоциантов Фото диссоцианта длина линейки 5 мм Условия получения диссоциантов в среде с lim N Индекс диссоциации, % Тип подвижности

S Округлые палевые колонии с гладкой поверхностью и ровными краями - Хранение в стандартной (безлимитной) среде 3 сут. при +20°С 96 Swa+Gri+

Pg Округлые бурые колонии с гладкой поверхностью и ровными краями Л J Ш^ЯШШШ1 Хранение в физрастворе 4 мес. при -20°С 74 Swa'Gri"

Округлые колонии палевого цвета и шероховатой поверхностью f§ Щвг Хранение в физрастворе 14 сут. при +20°С 11 Swa+Gri+

Sm Мелкие кремовые колонии ((1 0.3-0.7мм) с гладкой поверхностью и ровными краями, часто сливаются на плотной среде щ* Хранение в физрастворе и стандартной среде 4 мес. при -20°С; после прогревания при 60°С 100 Swa" Gri"

Sg Кремовые колонии продолговатой формы с сегментообразным ростом Хранение в физрастворе 4 мес. при +20°С 31 SwaGri"

PgCr Пигментированные колонии,внеклеточные кристаллы в толще (агара V W — Хранение в физрастворе 4 мес. при -20°С 2 ( Swa+Gri+

Таблица 9. Описание фенотипических признаков диссоциантов А. brasi/ense шт. Sp245 (эндофитный штамм)

Тип диссоцианта Культур альные признаки диссоциантов Фото диссоцианта длина линейки 3 мм Условия получения диссоциантов в среде с lim N Индекс диссоциации, % Тип подвижности

S Округлые палевые колонии с гладкой поверхностью и ровными краями Q Хранение в стандартной (безлимитной), 3 сут. при +20°С Перенесение в физраствор, инкубация 6 мес. при +20°С Тот же вариант после термообработки при 55°С 95 55 10 Swa+Gri"

Sm Мелкие Перенесение в физраствор, инкубация 6 мес. при +20°С 35

полупрозрачные колонии (сЗ 0.3-0.7 мм) с HB Swa" Gri"

гладкой поверхностью и ровными краями Тот же вариант после термообработки при 55°С 70

М Белые колонии со слизистой поверхностью, неровными краями Перенесение в физраствор, инкубация 6 мес. при +20°С Тот же вариант после термообработки при 55°С 10 20 Swa+ Gri+

Таким образом, неэндофигный (8р7) и эндофитный (Бр245) штаммы А. ЬгаьНете различались не только эффективностью образования и

разнообразием морфотипов покоящихся клеток, но и культуральными признаками. Различия свойств диссоциантов определяют диапазон толерантности бактериальной популяции к параметрам условий роста [Милъко, Егоров, 1991]. Подбор условий, способствующих селективному выщеплению определенного диссоцианта, который может не проявляться в стандартных условиях посева, имеет практическое значение для поиска вариантов с желаемыми признаками.

3.2 Популяционная варибельность Б. теШоН, биотехнологические свойства диссоциантов

При высеве на плотную маннитную питательную среду ЦПК 5. теШоИ, описанных выше, были отобраны 2 варианта, различающиеся морфологией колоний (табл. 10).

Таблица 10. Характеристика диссоциантов теШои шт. Р221

Тип диссоци анта Фото диссоцианта длина линейки 3 мм Культуральные признаки диссоциантов Накопление биомассы, ОП (через 30 часов) № фиксирующа я активность, мкмольГЧ/мл, сут.

8 ЯШ Вя Гладкие, вогнутые в центре, кремовые колонии, имеющие ровные края 1.55±0.05 5.9±0.31

Бт - Мелкие плоские прозрачные шероховатые колонии с ровными краями 0.58±0.04 3.0±0.27

Диссоциант Бт, имеющий мелкие колонии, по ростовым характеристикам и уровню накопления биомассы отставал от варианта 8 (табл. 10), однако был устойчив к стрессовым воздействиям (длительному хранению, воздействию высоких температур) (табл. 11). Можно предположить, что его экологической функцией является выживание бактерий 5. теШои в почве в условиях дефицита питания и повреждающих воздействий, тогда как доминантный фенотип, способный к колонизации растений, обеспечивает симбиотическую фазу жизненного цикла ризобий.

Диссо-цианты Число жизнеспособных клеток, КОЕ/мл

До термообработки (контроль) После термообработки

55°С, 10 мин. 60°С, 5 мин.

S (2.5±0.2)х109 (8.0±1.0)хЮ4 0

Sm (1.9±0.3)х109 (6.8±0.6)х104 (4.2±0.1)хЮ3

Оба диссоцианта росли на безазотистой среде Эшби, что говорит об их способности к азотфиксации. Однако вариант 8т не обладал способностью к утилизации полициклического ароматического углеводорода фенантрена. Одним из генетических механизмов диссоциативных вариаций является изменение плазмидного профиля ризобий. В нашей работе это было продемонстрировано отсутствием плазмидной ДНК у варианта Ят (рис. 5).

3 М т.п.н.

1000

Рисунок 5. Электрофореграмма плазмидных ДНК диссоциантов S. meliloti шт. Р221: 1 - S; 2 - Sm; 3 - контроль - Е. coli; М - ДНК-Маркер (GeneRuler™ 1000 п.н.)

Таким образом, бактерии 5. теШоН и А. ЬгаяНете обладают способностью изменять диссоциативный спектр их популяций, проявляющийся развитием различных фенотипов, что можно использовать в селективном отборе наиболее приспособленных и устойчивых в данных условиях вариантов. Показанная возможность регуляции диссоциативной активности и выделения определенных фенотипов симбиотрофных бактерий актуальны для разработки эффективных бактериальных препаратов.

4. Роль внеклеточных ауторегуляторов в контроле процессов адаптации симбиотрофных бактерий

В формировании и функционировании ассоциаций бактерий и растений важную роль играют внеклеточные регулятор ные метаболиты партнеров симбиоза. Известно, что растительные лектины, имеющие функции адгезинов, участвуют в прикреплении бактериальных клеток к корням растения [.Антонюк, 2005], но их роль в контроле адаптивных реакций бактерий изучена мало. Среди микробных низкомолекулярных ауторегуляторов, осуществляющих межклеточную коммуникацию для координированного ответа популяции на изменения окружающих условий, функциями адаптогенов обладают алкилоксибензолы [Николаев с соавт., 2006]. Их влияние на адаптацию симбиотрофных бактерий и результативность симбиозов неизвестны. Отметим, что АОБ широко распространены в природе и синтезируются не только микроорганизмами, но и растениями [КогиЬек, Тутап, 1999; Ки1атпек, КогиЬек, 2008]. В связи с вышесказанным, в заключительной части работы изучалось участие микробных и растительных низкомолекулярных регуляторов в адаптационных стратегиях симбиотрофных бактерий.

Присутствие в стандартной питательной среде растительного лектина -агглютинина зародышей пшеницы (АЗП) (1-10 мкг/мл) не влияло на рост А. ЬгаяИеиче 8р245 (ОП культуры, КОЕ), однако дозозависимо повышало количество жизнеспособных ПФ, дающих колонии на агаризованной среде после их рассева. Количество жизнеспособных (КОЕ) покоящихся клеток в культурах с внесением 5 и 10 мкг/мл АЗП через 5 месяцев инкубации оказалось в 11 и 3 раза больше, чем в контроле (рис. 6).

Важно отметить, что при инокулировании ПФ опытных вариантов в полужидкую среду были зафиксированы изменения в типе подвижности выросших клеток: увеличиваась доля Оп+ фенотипа, отвечающего за заселение растущих корней после «заякоривания» бактерий (1 и 5 мкг/мл), тогда как в контрольных суспензиях (без АЗП), а также в варианте с концентрацией АЗП 10 мкг/мл доминировал 8\уа+ фенотип. Кроме того, в опытной культуре с 5 мкг/мл АЗП после 2 недель хранения, наблюдали появление у Б\уа+ фенотипа «протуберанцев» - зон более быстро движущихся при роении клеток, а также развитие фенотипа с отсутствием движения (Блуа" Оп").

9'5 | 0.17:0.18:0.17:0.17*

§ 8'5

и 8 О

« 7,5 «й> 7

6,5

0.19:0.37:0.28:0.18

0.16:0.19:0.095:0.17*

0.38:0.07:0.19:0.13*

1 суг.

5 мес.

2 нед. 2 мес.

Время хранения 0 контроль (без АЗЩ ■ 10 мкг/мл □ 5 мкг/мл □ 1 мкг/мл

* Предельные ошибки средних значений ^ КОЕ/мл

Рисунок 6. Динамика численности жизнеспособных клеток А. ЫтНете шт. 5р245 при различной концентрации АЗП

Рост азоспирилл в средах с внесенным амфифильным алкилоксибензолом, Су-АОБ, в зависимости от его концентрации характеризовался: (1) сокращением на 25 - 40 % времени лаг-фазы (10~7, 10~6, 105 М); (2) увеличением в - 2 раза максимальной удельной скорости роста (10"? и 10 й М); (3) увеличением накопления биомассы (10"6 и 10~5 М) на 120 - 140 %. Кроме того, содержание в среде С7-АОБ в концентрации 10~7 М ускоряло развитие культуры за счет сокращения времени трофофазы. Количество жизнеспособных (КОЕ) покоящихся клеток бактерий в опытных суспензиях после 5-месячной инкубации оказалось выше, чем в контроле.

С7-АОБ также оказывал влияние на диссоциативный спектр популяции азоспирилл: в экспоненциальной фазе роста увеличивалась доля клеток с Б'\л'а++типом подвижности (суперроение).

В серии экспериментов по выявлению влияния алкилоксибензолов на результативность адаптивных реакций бактерий гидрофобного гомолога Си-АОБ учитывали его ингибиторный эффект на рост бактерий [Лойко с соавт., 2002]. В этой серии опытов, клетки азоспирилл линейной фазы роста (ОП 0.9; 19 ч) рассевали на плотные и полужидкие среды, содержащие Сп-АОБ, либо инокулировали в среду М8М (рН 5.7 и 7.0) с разными концентрациями Сп-АОБ. Развитие азоспирилл в опытных вариантах существенно отличалось от контрольных (без АОБ) по показателям численности жизнеспособных клеток и их диссоциативным переходам (табл. 12).

Таблица 12. Влияние концентрации Сп-АОБ на жизнеспособность и гетерогенность популяции А. ЪгаъИете Бр 245 (инкубация в жидкой среде при рН 7.0)

Концентра ция С)2-АОБ,М Число Доля Индекс диссоциации, % Диаметр колец

жизнеспособных доминан тного Тип подвижности роения, мм

клеток, диссоци Swa+ Swa+ Gri+ Мико на 3 на 7

КОЕ/мл, анта, % белый пиг- идный день день

хЮ8 мент.

Контроль 4±1.3 55 5 95 0 0 6.5±1.0 9.0±1.1

lxlO"4 1.8±0.3 52 0 100 0 0 4.0±0.5 6.5±0.9

5x10"5 1.9±0.1 41 20 80 >1 0 6.0±1.2 8.0±0.5

1хЮ"5 2.8±0.3 33 12 88 0 >1 6.5±0.7 10.0±1.0

5хЮ"6 2.6±0.2 46 6 94 0 >1 7.0±0.9 8.5±0.7

Инкубация азоспирилл в присутствии Сп-АОБ в МБМ среде с рН 5.7 в наибольшей степени способствовала проявлению фенотипической гетерогенности популяции (табл. 13). Эти результаты можно объяснить воздействием на бактерии как закисления среды, так и самого С12-АОБ, играющего в развитии стрессовых реакций роль сигнала тревоги - алармона [Голод с соавт., 2009]. Высокая концентрация С^-АОБ (5x10"" М) вызывала переход доминантного фенотипа (Б\уа+ с белой пигментацией) в минорный микоидный фенотип («М», рост в виде «мицелия»), В популяции, подвергшейся воздействию в пять раз меньшей концентрации (10"4 М) С12-АОБ, 89 % клеток имели микоидный фенотип и 11% - распространялись суперроением (Блуа^).

Таблица 13. Влияние концентрации С12-АОБ на диссоциативный спектр А. brasilense Sp 245 (инкубация в жидкой среде при рН 5.7)

Концентрация Диссоциативный спектр, %

с12-аоб, м Тип подвижности

Swa+ Swa+ Микоид SwaT+ Grf «Протубе

белый пигмент. ный ранцы»

Контроль 25 67 0 8 >1 0

5Х10"4 0 0 100 0 >1 0

lxlO"4 4 0 89 11 >1 0

5хЮ"5 16 84 >1 0 >1 0

1хЮ'5 8 92 >1 0 >1 0

5хЮ"6 5 65 >1 30 >1 >1

Таким образом, было показано, что низкомолекулярные внеклеточные регуляторные метаболиты растений (АЗП, АОБ) и бактерий (АОБ) способны контролировать развитие адаптивных реакций симбиотрофных бактерий, влияя на их ростовые параметры, жизнеспособность, популяционную гетерогенность, клеточную подвижность. Варьируя приемы обработки клеток фиторегуляторами, их концентрацию и время воздействия на клетки возможно координировать эффекты в нужном направлении для решения конкретных биотехнологических задач.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что одними из основных форм адаптации симбиотрофных бактерий к неблагоприятным условиям роста являются образование анабиотических покоящихся форм и проявление внутрипопуляционной вариабельности, составляющие часть единой адаптационной системы, обеспечивающей выживание популяции и результативность симбиоза с растением.

2. Продемонстрирована способность симбиотрофных бактерий 5. теШоН шт. Р221 и А. ЬгазИете шт. 8р245 и шт. Бр7 образовывать в цикле развития их культур при стрессовых воздействиях, имитирующих природные ситуации или при повышении уровня аутоиндукторов анабиоза, цистоподобные клетки, обладающие всеми признаками покоящихся форм бактерий.

3. Выявлено разнообразие морфотипов покоящихся форм & теШоН и А. ЬгазИеже, зависящее от условий роста и характера взаимодействия с растительным партнером. ПФ разных морфотипов различаются ультраструктурной организацией, пролиферативным потенциалом, термоустойчивостью и степенью реализации фенотипических диссоциативных переходов.

4. Изучена внутрипопуляционная вариабельность бактерий 5. теШой и А. ЬгсяНете. Выделены колониально-морфологические диссоцианты этих бактерий, показаны их различия по морфологическим, физиолого-биохимическим и биотехнологическим (для & теШой) признакам, а также по типу коллективной подвижности клеток.

5. Установлены различия между неэндофитным 5р7 и эндофитным Бр245 штаммами А. ЬгаяНепяв в способности к фенотипической диссоциации и подвижности клеток в полужидких средах, что, по-видимому, отражает особенности их адаптации к меняющимся условиям окружающей среды и характер взаимоотношений этих бактерий с растениями.

6. Выявлена способность низкомолекулярных внеклеточных ауторегуляторов - растительного лектина (АЗП) и микробных

алкилоксибензолов (АОБ) влиять на эффективность адаптивных реакций симбиотрофпых бактерий: параметры их роста в питательных средах, сохранение жизнеспособности при длительном хранении, интенсивность диссоциативных переходов и стабильность развития определенных фенотипов, а также тип коллективной подвижности клеток.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Мулюкгт А.Л., Сузина Н.Е., Погорелова А.Ю., Антонюк Л.П., Дуда В.К, Эль-Регистан Г.И. Разнообразие морфотипов покоящихся клеток и условия их образования у Azospirillum brasilense II Микробиология. 2009. Т. 78. № 1. С. 4252.

2. Погорелова А.Ю., Мулюкин А.Л., Антонюк Л.П., Галъченко В.Ф., Эль-Регистан Г.И. Фенотипическая вариабельность у Azospirillum brasilense штаммов Sp7 и Sp245: сопряженность с состоянием покоя и свойства диссоциантов // Микробиология. 2009. Т. 78. № 4. С. 618-628.

3. Погорелова А.Ю., Лойко Н.Г., Ванькова A.A. Образование цистоподобных покоящихся форм Sinorhizobium meliloti Р221 под влиянием алкилоксибензола -химического аналога микробных аутоиндукторов анабиоза // Известия ТСХА. 2009. Выпуск 1.С. 149-154.

4. Погорелова А.Ю., Лойко Н.Г., Ванькова A.A. Регуляция развития и диссоциативных переходов симбиотрофных бактерий // Известия ТСХА. 2009. Выпуск 2. С. 176-182.

5. Погорелова А.Ю., Мулюкин А.Л., Сузина Н.Е., Антонюк Л.П., Дуда В.И., Эль-Регистан Г.И. Получение покоящихся форм Azospirillum brasilense для разработки бактериальных препаратов на их основе // Материалы VI Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». 2-6 июня 2008. Минск. Т. 2. С. 9192.

6. Погорелова A.A., Затонских О.В., Лойко Н.Г., Ванькова A.A., Эль-Регистан Г.И. Механизмы адаптации симбиотических бактерий Sinorhizobium meliloti'. образование покоящихся форм, популяционная вариабельность // Материалы второй Международной научно-практической конференции «Проблемы биологии, экологии, географии, образования: история и современность». 3-5 июня 2008. Санкт-Петербург. С. 120-122.

7. Погорелова А.Ю., Мулюкин А.Л., Сузина Н.Е., Антонюк Л.П., Дуда В.И., Ванькова A.A., Эль-Регистан Г.И. Покоящиеся формы Azospirillum brasilense как основа бактериальных препаратов // Сборник статей Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной выдающимся педагогам Петровской академии. 5-6 июня 2008. Москва. С. 345-349.

8. Погорелова А.Ю., Лойко Н.Г., Косилова И. С., Ванькова A.A., Антонюк Л.П., Эль-Регистан Г.И. Регуляция развития ризобактерий Azospirillum brasilense Sp245 в присутствии внеклеточных метаболитов // Материалы IV межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой». 14-16 октября 2008. Саратов. С.51.

Отпечатано с готового оригинал-макета

Формат 60х84'/|6 Усл.печл. 1,63. Тираж 100 экз. Заказ 463.

Издательство РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Погорелова, Анна Юрьевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Азотфиксирующие ризобактерии и их роль в жизни растений.

1.1 Ризобии. Современное представление о систематике, физиологии и экологии.

1.1.1 Систематика ризобий и некоторые их представители.

1.1.2 Физиология и экология ризобий.

1.2 Бактерии рода АгохртИит. Современное представление о систематике, физиологии и экологии.

1.3 Адаптационные механизмы бактерий.

1.3.1 Стрессовые факторы и адаптационные ответы бактерий.

1.3.2 Состояние покоя как форма переживания стрессовых условий.

1.3.3 Фенотипическая изменчивость как форма адаптации бактерий к внешним условиям.

1.4 Растительные и микробные ауторегуляторные факторы.

1.4.1 Влияние индолил-3-уксусной кислоты на рост и развитие ризобактерий.

1.4.2 Микробные ауторегуляторные факторы.

1.4.2.1 Ауторегуляторные факторы сЦ микроорганизмов.

1.5 Современное представление о бактериальных препаратах на основе ризобактерий.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА II. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Образование покоящихся клеток как форма адаптации симбиотрофных бактерий к условиям, неблагоприятным для роста и развития. Биоразнообразие форм покоя.

3.1.1. Образование ПФ S. meliloti при модификации условий культивирования.

3.1.2. Образование ПФ S. meliloti в сгущенных клеточных суспензиях.

3.1.3. Образование ПФ S. meliloti при внесении аутоиндукторов анабиоза.

3.2 Различия в стратегии выживания (образования ПФ) симбиотрофных ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense с разным типом взаимодействия с растительным партнером.

3.3. Внутрипопуляционная фенотипическая вариабельность симбиотрофных бактерий как форма их адаптации к стрессу.

3.3.1 Популяционная варибельность Azospirillum brasilense: сопряженность с состоянием покоя, свойства диссоциантов.

3.3.2 Популяционная варибельность S. meliloti, биотехнологические свойства диссоциантов.

3.4 Роль внеклеточных ауторегуляторов в контроле процессов адаптации симбиотрофных бактерий.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляция адаптации симбиотрофных бактерий к неблагоприятным условиям"

Актуальность проблемы. Использование бактериальных препаратов на основе симбиотрофных бактерий, способных к фиксации атмосферного азота, является наиболее экономичным и экологически чистым способом повышения плодородия почвы [Черников, Чекерес, 2000; Новикова, 2004; Тихонович, Круглов, 2006]. Инокуляция растений симбиотрофными азотфиксирующими бактериями (клубеньковыми pp. Azorhizobium, Rhizobium, Mesorhizobium, Sinorhizobium, Bradyrhizobium или ассоциативными pp. Azospirillum, Agrobacterium, Arthrobacter, Klebsiella) приводит к повышению продуктивности растений при снижении нормы расхода минеральных азотных удобрений [Мишустин, Шильникова, 1973; Lin, 1983; Хотянович, 1991; Завалин с соавт., 2003; Кожемяков с соавт., 2004; Емцев, Мишустин, 2005; Тихонович с соавт. 2005]. Симбиозы, также обладают огромными преимуществами для развития растительно-микробных ассоциаций в изменяющихся условиях окружающей среды, чему способствуют высокий природный адаптационный потенциал партнеров и их эволюционно закрепленное взаимовыгодное сосуществование [Douglas, 1994; Seckbach, Dordrecht, 2002; Muratova et al., 2003; Проворов, 2001, 2009; Тихонович, Проворов, 2003, 2007]. Однако при циклической смене хозяина симбиотрофные бактерии попадают в почву и должны существовать в ней в иных, отличных от симбиотических, условиях, что требует реализации ранее не проявляемых свойств. Вместе с тем проблеме выживания симбиотрофных микроорганизмов в природных экосистемах, особенно в неблагоприятных условиях, уделяется мало внимания.

Создание современных бактериальных препаратов сопряжено с селекцией как высокопродуктивных, так и стрессоустойчивых штаммов, быстро адаптирующихся при попадании в почву, возобновляющих активный метаболизм и сохраняющих способность к колонизации растения [Завалин, 2000; Проворов, Тихонович, 2003]. Поэтому изучение механизмов адаптации симбиотрофных бактерий не только актуально, но является и своевременной агробиотехнологической задачей. Особенно важным представляется исследование таких типов стратегии адаптации, как образование покоящихся форм (ПФ), которые позволяют популяции переживать неблагоприятные для роста условия [Бухарин с соавт., 2005; Мулюкин с соавт., 2002; Эль-Регистан с соавт., 2006], реализуя внутрипопуляционную фенотипическую вариабельность, от которой зависит эффективность развития бактерий в их жизненном цикле и результативность симбиозов [Dragutin е! а1., 2003; "\№оис1е е! а1., 2004]. Особое значение имеет изучение роли в этих процессах низкомолекулярных микробных и растительных ауторегуляторов.

Цель работы: изучить закономерности формирования и развития адаптивных реакций симбиотрофных бактерий.

Задачи исследования:

1. Установить условия образования покоящихся клеток симбиотрофных бактерий 5тогЫгоЫит теШоН, шт. Р221, и АгоБртПит ЬгаБИете, шт. Эр7 и 8р245, как формы адаптационного ответа на неблагоприятные для роста условия. Исследовать морфологическое и физиологическое разнообразие покоящихся форм этих бактерий, образующихся при имитации приролных стрессовых условий.

2. Выявить различия в стратегии выживания симбиотрофных бактерий с разным типом взаимодействия с растительным партнером на примере двух штаммов А. ЬгаяНете: неэндофитного (ассоциативного) Эр7 и эндофитного Бр245.

3. Изучить внутривидовую вариабельность & теШоИ и А. ЬгаБИете, реализующуюся при прорастании покоящихся форм. Охарактеризовать культуральные, морфологические, физиолого-биохимические и биотехнологические признаки выделенных диссоциантов, а также тип их подвижности.

4. Оценить роль низкомолекулярных ауторегуляторов растительного и микробного происхождения в контроле адаптивных реакций ризобиальных бактерий.

Научная новизна

1. Впервые получены доказательства способности симбиотрофных ризобиальных бактерий £ теШоН, шт. Р221, и А. Ъгаййете, шт. 8р245, образовывать в цикле развития их культур клетки, обладающие признаками покоящихся форм. Выявлены условия, моделирующие стрессовые природные ситуации и способствующие массовому образованию покоящихся форм. 2. Обнаружено разнообразие покоящихся форм теШоН и А. ЬгаяИете, различающихся ультраструктурной организацией, пролиферативным потенциалом и терморезистентностью, что демонстрирует гибкость стратегии выживания этих бактерий. 3. Установлена зависимость формирования ПФ А. ЪгаБПете определенного морфотипа от характера взаимодействия с растительным партнером (неэндофитного или эндофитного). 4. Изучена фенотипическая диссоциация теШоН и А. ЬгаяИете, составляющая адаптивный потенциал популяции. Выделены и охарактеризованы варианты бактерий по культуральным, морфологическим, физиолого-биохимическим и биотехнологическим признакам, а также типу подвижности. 5. Обнаружены различия в плазмидном профиле диссоциантов Я. теШоН. 6. Впервые показана возможность регуляции адаптивных реакций симбиотрофных бактерий ауторегулятором растительного происхождения -агглютинином зародышей пшеницы (АЗП) и микробного происхождения — алкилоксибензолами (АОБ).

Практическая значимость работы. 1. Полученные результаты могут быть использованы для разработки эффективных бактериальных препаратов на основе цистоподобных покоящихся клеток (ЦПК) азотфиксирующих бактерий, длительно сохраняющих жизнеспособность. 2. Предложены способы: а) быстрого получения диссоциантов симбиотрофных бактерий путем рассева ПФ на плотные или полужидкие среды; б) селекции диссоциантов с заданными свойствами, путем применения избирательных ростовых условий. 3. Создана коллекция диссоциантов S. meliloti и А. brasilense, различающихся ростовыми, физиолого-биохимическими признаками, а также типом подвижности, которые могут быть использованы при получении бактериальных препаратов для сельского хозяйства. 4. Разработаны способы контроля адаптационных возможностей симбиотрофных бактерий, основанные на применении низкомолекулярных ауторегуляторов микробного и растительного происхождения. Способы предусматривают: а) стимуляцию роста; б) сохранение жизнеспособности клеток при длительном хранении; в) направленное изменение типа коллективной подвижности бактерий для повышения результативности колонизации растений.

Исследования осуществлялись совместно с УРАН ИНМИ имени С.Н. Виноградского, ГосНИИГенетики, «Центром биоинженерии» РАН.

Благодарность. Автор выражает искреннюю признательность научному консультанту работы профессору, доктору биологических наук Галине Ивановне Эль-Регистан за постоянное внимание к работе и неоценимую помощь.

Автор благодарит научного руководителя работы доцента, кандидата биологических наук Ванькову Анну Андреевну за помощь в подготовке диссертации.

Автор выражает глубокую благодарность кандидату биологических наук Наталии Геннадиевне Лойко, кандидату биологических наук Андрею Львовичу Мулюкину за помощь в работе и подготовке публикаций.

Автор благодарит сотрудников лаборатории классификации и хранения уникальных микроорганизмов Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН за содействие.

Автор благодарит доктора биологических наук Антонюк Людмилу Петровну за плодотворное сотрудничество.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Погорелова, Анна Юрьевна

выводы

2. Продемонстрирована способность симбиотрофных бактерий & теШоН шт. Р221 и А. Ъга^Иете шт. Бр245 и пгг. 8р7 образовывать в цикле развития их культур при стрессовых воздействиях, имитирующих природные ситуации или при повышении уровня аутоиндукторов анабиоза, цистоподобные клетки, обладающие всеми признаками покоящихся форм бактерий.

3. Выявлено разнообразие морфотипов покоящихся форм Б. теШой и А. ЬгайИете, зависящее от условий роста и характера взаимодействия с растительным партнером. ПФ разных морфотипов различаются ультраструктурной организацией, пролиферативным потенциалом, термоустойчивостью и степенью реализации фенотипических диссоциативных переходов.

4. Изучена внутрипопуляционная вариабельность бактерий теШоН и А. ЬгазИете. Выделены колониально-морфологические диссоцианты этих бактерий, показаны их различия по морфологическим, физиолого-биохимическим и биотехнологическим (для теШоН) признакам, а также по типу коллективной подвижности клеток.

5. Установлены различия между неэндофитным 8р7 и эндофитным 8р245 штаммами А. ЬгаяПете в способности к фенотипической диссоциации и подвижности клеток в полужидких средах, что, по-видимому, отражает особенности их адаптации к меняющимся условиям окружающей среды и характер взаимоотношений этих бактерий с растениями:

6. Выявлена способность низкомолекулярных внеклеточных ауторегуляторов - растительного лектина (АЗП) и микробных алкилоксибензолов (АОБ) влиять на эффективность адаптивных реакций симбиотрофных бактерий: параметры их роста в питательных средах, сохранение жизнеспособности при длительном хранении, интенсивность диссоциативных переходов и стабильность развития определенных фенотипов, а также тип коллективной подвижности клеток.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Погорелова, Анна Юрьевна, Москва

1. Агроэкология: Учеб. для вузов / Под ред. В.А. Черникова, А.И. Чекереса. М.: Колос, 2000. - 536 с.

2. Андреева И.Н., Редькина Т.В., Измайлов С.Ф. Роль индолилуксусной кислоты в стимулирующем действии Azospirillum brasilense на бобово-ризобиальный симбиоз // Физиология растений. — 1993. Т. 40. № 6. С. 2527.

3. Антонюк Л.П., Камнев A.A., Чернышев A.B., Игнатов В.В. Образование кристаллов струвита при культивировании почвенной бактерии Azospirillum brasilense II Докл. РАН. 1996. Т. 350, № 3. - С. 421-423.

4. Антонюк Л.П. Растительные лектины как факторы коммуникации в симбиозах // Молекулярные основы взаимоотношений ассоциативных микроорганизмов с растениями; Ин-т биохимии и физиологии растений и микроорганизмов. М.: Наука, 2005. — 262 с.

5. Ахиярова Г.Р., Сабуржанова И.Б., Веселов Д.С., Фрике В. Участие гормонов в возобновлении роста побегов пшеницы при кратковременном засолении NaCl // Физиология растений. 2005. Т. 52, № 6. - С. 891-896.

6. Бабусенко Е.С., Эль-Регистан Г.И., Градова Н.Б., Козлова А.Н., Осипов Г.А. Исследование мембранотропных ауторегуляторных факторов метаноокисляющих бактерий //Успехи химии. 1991. Т. 60. Вып. 11. - С. 2362-2373.

7. Базилинская М.В. Улучшение обеспечения растений микро- и макроэлементами за счет деятельности почвенных микоризных грибов. -М., 1990.-50 с.

8. Белимов A.A., Иванчиков А.Ю., Юдкин JI.B. и др. Характеристика и интродукция новых штаммов ассоциативных ростстимулирующих бактерий, доминирующих в ризоплане проростков ячменя // Микробиология. 1999. Т. 68, № 3. - С. 392-397.

9. Биопрепараты в сельском хозяйстве (методология и практика использования микроорганизмов в растениеводстве и кормопроизводстве) / Под ред. И.А. Тихоновича, Ю.В. Круглова. М.: РАСХН, 2006. 154 с.

10. П.Бухарин О.В., Гинцбург А.Д., Романова Ю.М., Эль-Регистан Г.И. Механизмы выживания бактерий. М.: Медицина. 2005. - 367 с.

11. Вавилов П.П., Посыпанов Г.С. Бобовые культуры и проблема растительного белка. М.: Россельхозиздат. — 1983. — 255 с.

12. Вахитов Т.Я., Петров JI.H. Регуляторные функции бактериальных экзометаболитов бактерий // Микробиология. — 2006. — Т. 76, № 4. — С. 483-288.

13. Волкогон В.В., Мамчур А.Е., Лемешко С.В., Миняйло В.Г. Азоспириллы эндофиты семян злаковых растений // Микробиологич. журнал. - 1995. Т. 57. №1.-С. 14-19.

14. Волкогон В.В. Мшробюлопчш аспекта оштизацп азотного удобрения сшьскогосподарських культур. К.: Аграрна наука, 2007. — 143 с.

15. Волкова Р.И., Дроздов С.Н., Сычева З.Ф., Балагурова Н.И. О регуляторной функции ауксинов у активно вегетирующих растений при температурном воздействии // Физиология растений. — 1991. Т. 38. Вып. 3. -С. 538-544.

16. Воробьева Л.И. Промышленная микробиология Учебное пособие для биолол. и технологич. спец. вузов. / М.: Изд-во МГУ. 1989. - 293 с.

17. Воробьева Л.И. Стрессоры, стрессы и выживаемость батктерий // Прикл. биохим. микробиол. 2004. - Т. 40, № 3. - С. 261-269.

18. Воробейков Г. А. Микроорганизмы, урожай и биологизация земледелия. -СПб., 1998. 120 с.

19. Голубев С.Н. Криптические миниплазмиды азоспирилл: разработка эффективных методов выделения и характеристика репликонов. — Дис. . канд. биол. наук. Саратов. — 2002. - 209 с.

20. Головлев Е.JI. Метастабильность фенотипа у бактерий // Микробиология. -1998. Т. 59. № 2. С. 149-155.

21. Голод H.A., Лойко Н.Г., Мулюкин A.JL, Нейматов A.JL, Воробьева Л.И., Сузина Н.Е., Шаненко Е.Ф., Гальченко В.Ф., Эль-Регистан Г.И. Адаптация молочнокислых бактерий к неблагорпиятным для роста условиям // Микробиология. 2009. Т. 78. № 3. - С. 1-11.

22. Дерфлинг К. Гормоны растений. Системный подход. М.: Мир, 1985. -206 с.

23. Добровольская Т.Г. Структура бактериальных сообществ почв. М.: ИКЦ «Академкнига», 2002. - 282 с.

24. Доросинский JI.M. Клубеньковые бактерии и нитрагин. Л.: Колос, 1970. -191 с.

25. Дорошенко Е.В., Лойко Н.Г., Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Горнова И.Б., Климанова Е.В., Эль-Регистан Г.И. Характеристика диссоциантов Bacillus cereus II Микробиология. 2001. Т.70, № 6. - С. 811-819.

26. Дуда В.И., Пронин С.В., Эль-Регистан Г.И., Капрельянц A.C., Митюшин Л.Л. Образование покоящихся рефрактерных клеток к Bacillus cereus под влиянием ауторегуляторного фактора //Микробиология. 1982. Т. 51, № 1,С. 77-81.

27. Егоренкова И.В., Коннова С.А., Федоненко Ю.П., Дыкман Л.А., Игнатов В.В. Роль полисахаридсодержащих компонентов капсулы Azospirillum brasilense в адсорбции бактерий на корнях проростков пшеницы // Микробиология. 2001. - Т. 70, №1. - С. 45-50.

28. Емцев В.Т., Мишустин E.H. Микробиология. М.: Дрофа, 2005. 445 с.

29. Емцев В.Т., Чумаков М.И. Об эффективности азотфиксирующего ассоциативного симбиоза у небобовых растений // Почвоведение, 1990, № 11.-С. 116-126.

30. Ефимов В.Н., Воробейков Г.А., Патил А.Б. Азотное питание и продуктивность гороха и кормовых бобов при обработке семян комплексом бактериальных препаратов // Агрохимия. 1996. №1. — С. 1015.

31. Завалин A.A., Сергалиев Н.Х. Влияние условий азотного питания и физиологически активных веществ на формирование величины и качества урожая зерна яровой пшеницы //Агрохимия. 2000, № 1. - С. 23 - 29.

32. Завалин A.A. Азотное питание и продуктивность сортов яровой пшеницы. М.: Агроконсалт, 2003. 152 с.

33. Завалин A.A. Биопрепараты, удобрения и урожай. М.: ВНИИА, 2005. -302 с.

34. Звягинцев Д.Г. Проблема управления азотфиксаторами в ризосфере и ризоплане // Бюл. Всес. НИИ с.-х. микробиологии. 1985. Т.42. - С. 6-9.

35. Зенова Г.М., Степанов А.Л., Лихачева A.A., Манучарова H.A. Практикум по биологии почв. М.: Изд-во МГУ, 2002. 120 с.

36. Зинченко А.П. Статистика. М.: Колос. 2007. - 568 с.

37. Злотников А.К., Казакова M.JL, Злотников K.M., Казаков A.B. Новый бактериальный эндофит сельскохозяйственных культур // С.-х. биология Сер. Биология растений. 2006, № 3. — С. 62-66.

38. Игнатов В.В. Биологическая фиксация азота и азотфиксаторы // Соросовский образовательный журнал (биология). 1998. - № 9. - С. 2833.

39. Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Зеленихин П.В., Круглова З.Ф., Чойдаш Б., Дорошенко Е.В., Мулюкин A.JL, Эль-Регистан Г.И. Влияние аутоиндукторов анабиоза на геном микробных клеток // Микробиология. — 2002. Т.71. Вып. 2. -с. 194-199.

40. Камнев A.A., Тугарова A.B., Антонюк Л.П. Эндофитный и эпифитный штаммы Azospirillum brasilense по-разному отвечают на стресс, вызываемый тяжелыми металлами // Микробиология. — 2007. Т. 76, № 6. -С. 908-911.

41. Кацы Е.И. Генетика азотфиксации и взаимодействия с растениями бактерий рода Azospirillum (Tarrand, Krieg and Döbereiner, 1979) // Генетика. 1992.-28. Т.7. С. 5-18.

42. Кириченко О.В., Жемойда A.B., Капралова Ю.О. OcoönißocTi розвитку рослин яро!" пшенищ та ризосферных мисрооргашзм1в-азотфжсатор1в за умов передос1вно1 бактеризаци насшня // Живлення рослин: теор1я i практика. КиТв: Логос, 2005. - С. 306-314.

43. Кожемяков А.П. Использование инокулянтов бобовых и биопрепаратов комплексного действия в сельском хозяйстве // Доклады РАСХН. Научно-теоретический журнал. 1998, №6. - С. 7-10.

44. Кожемяков А.П., Проворов H.A., Завалин A.A., Шотт П.Р. Оценка взаимодействия сортов ячменя и пшеницы с ризосферными ростстимулирующими бактериями на различном азотном фоне // Агрохимия. 2004, № 3. - С. 33-40.

45. Кононов A.C. Люпин: технология возделывания в России. Брянск, 2003. -212 с.

46. Кравченко Л.В., Азарова Т.С., Макарова Н.М., Тихонович И.А. Роль триптофана в корневых экзометаболитах для фотостимулирующей активности ризобактерий // Микробиология. 2004. Т. 73. № 2. - С. 195198.

47. Кретович A.B., Евстигнеева З.Г., Львов Н.П. Молекулярные механизмы фиксации азота атмосферы // Вестник АН СССР. 1972, № 3. С. 38-46.

48. Круглов Ю.В. Микробиологические аспекты плодородия почвы и проблемы устойчивого земледелия // Плодородие. — 2006. — № 5. С. 9-12.

49. Кузнецов В.Д. Спонтанная изменчивость актиномицетов продуцентов антибиотиков и стабилизация их биосинтетической активности и таксономических свойств / Док. дис. ИНМИ РАН, 1974. — 310 с.

50. Кузнецов В.В., Дмитриева Г.А. Физиология растений. Учебник для вузов. М.: Высшая школа. Изд. 2-е. 2006. - 742 с.

51. Лойко Н.Г., Козлова А.Н., Осипов Г.А., Эль-Регистан Г.И. Низкомолекулярные ауторегуляторы развития бактерий Thioalkalivibrioversutus и Thioalkalimikrobium aerophilum II Микробиология. 2002. Т. 71. №3.-С. 308-315.

52. Лойко Н.Г., Соина B.C., Сорокин Д.Ю., Митюшина JI.JI., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм хемолитоавтотрофных бактерий Thioalkalivibrio versutus и Thioalkalivibrio aerophilum // Микробиология. -2003. Т. 72, № 3. - С. 328-337.

53. Макаров П.Н., Юргина B.C., Трофимова А.Ф., Лисофенко И.Б. Влияние семенной инокуляции ассоциативными штаммами бактерий на рост и продуктивность растений-сидератов семейства крестоцветных // Сургут, гос. ун-т. Сб. науч. тр. 2005. № 2. - С. 79-82.

54. Матора Л.Ю., Серебренникова О.Б., Петрова Л.П., Бурыгин Г.Л., Щеголев С.Ю. Нетипичный характер R-S диссоциации Azospirillum brasilense II Микробиология. 2003. Т. 72, №2. - С.60 - 63.

55. Медведев С.С. Физиология растений. Спб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та. 2004. 336 с.

56. Методы почвенной микробиологии в биохимии / под ред. Д.Г. Звягинцева. М.: Изд-во МГУ, 1991. 303 с.

57. Милько Е.С. Егоров Н.С. Гетерогенность популяции бактерий и процесс диссоциации М.: Изд-во МГУ. 1991. - С. 143.

58. Милько Е.С., Котова И.Б., Нетрусов А.И. Процесс диссоциации у бактерий. М.: Изд-во ООО «МАКС Пресс» 2007. - 68 с.

59. Мильто Н.И. Клубеньковые бактерии и продуктивность бобовых растений. — Минск, 1982. 296 с.

60. Мишустин E.H., Емцев В.Т. Биологическая фиксация молекулярного азота. Микробиология. — М.: ВО «Агропромиздат». —1987. С. 169 - 192.

61. Мишустин E.H., Шильникова В.К. Биологическая фиксация атмосферного азота. М.: Наука, 1968. - 531 с.

62. Мишустин E.H., Шильникова В.К. Клубеньковые бактерии и инокуляционный процесс. М.: Наука, 1973. - 289 с.

63. Моргун В.В., Коць С.Я., Кириченко Е.В. Ростстимулирующие ризобактерии и их практическое применение // Физиология и биохимия культ, растений. 2009. Т. 41, № 3. - С. 187-206.

64. Мулюкин A.JL, Луста К.А., Грязнова М.Н., Козлова А.Н., Дужа М.В., Дуда В.И., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Bacillus cereus и Micrococcus luteus II Микробиология. 1996. Т. 65, № 6. - С. 782-789.

65. Мулюкин А.Л., Луста К.А., Грязнова М.Н., Бабусенко Е.С., Козлова А.Н., Дужа М.В., Митюшина Л.А., Дуда В.И., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм в автолизирующихся суспензиях микроорганизмов // Микробиология. 1997. Т. 66, № 1 - С. 42-49.

66. Мулюкин А.Л., Сузина Н.Е., Дуда В.И. Эль-Регистан Г.И. Структурное и физиологическое разнообразие цистоподобных покоящихся клеток бактерий рода Pseudomonas II Микробиология. 2008. Т. 77, № 4. - С. 512-523.

67. Мулюкин А.Л., Антонюк Л.П., Погорелова А.Ю., Эль-Регистан Г.И. Биоразнообразие цистоподобных покоящихся форм Azospirillum brasilense II Микробиология. 2009. Т. 78, № 1. - С. 42-52.

68. Назарюк В.М., Кленова М.И., Сидорова К.К. Влияние генотипа и условий азотного питания на эффективность бобово-ризобиального симбиоза// Агрохимия. — 2001, № 4. С. 8-10.

69. Николаев Ю.С., Мулюкин A.JL, Степаненко И.Ю., Эль-Регистан Г.И. Ауторегуляция стрессового ответа микроорганизмов // Микробиология. — 2006. Т. 75, № 4. С. 489-496.

70. Новикова Т.И. структурно-функциональные особенности бобово-ризобиального симбиоза : : автореф. дис. . д.б.н.: 03.00.05, 03.00.12 / Новосибирск: 2004. С. 32.

71. Онищук О.П., Пучко В.Н., Шарыпова JI.A. Влияние псевдомонад и агробактерий на рост штаммов Rhozobium meliloti и активность их симбиоза с люцерной // Бюллетень ВНИИСХМ. 1983. Вып. 351. - С. 711.

72. Орлова И.Ф., Фесенко А.Н., Орлов В.П. Оценка конкурентной способности Rhizobium leguminosarum (Pisum).// Доклады ВАСХНИЛ. 1991.-№ 11.-с. 27-32.

73. Орлов В.П. Итоги научных работ лаборатории микробиологии. Научное обеспечение производства зернобобовых и крупяных культур. Сб. науч. трудов. Орел, 2004. С. 124-136.

74. Оценка эффективности микробных препаратов в земледелии / Под общей редакцией A.A. Завалина. Тр. ВИУА. -М.: РАСХН. 2000. 82 с.

75. Патыка В.Ф. Азотфиксирующие и фосфатмобилизирующие микроорганизмы в аллелопатии высших растений. М., 1988. - С. 24-31.

76. Патыка В.Ф. Агроэкологическая роль азотфиксирующих микроорганизмов. Киев. 2004. - 302 с.

77. Пейве Я.В. Микроэлементы и биологическая фиксация атмосферного азота. -М.: Наука, 1971. 187 с.

78. Полевой В.В. Фитогормоны. Л.: Изд-во ЛГУ, 1982. 248 с.

79. Посыпанов Г.С. Методические аспекты изучения симбиотического аппарата бобовых культур в полевых условиях // Известия ТСХА. № 5. -1983.-С. 17-26.

80. Посыпанов Г.С. Методы изучения биологической фиксации азота воздуха. М.: Агропромиздат, 1991. - 300 с.

81. Прозоров A.A. Рекомбинантные перестройки генома бактерий, и адаптация к среде обитания // Микробиология. — 2001. Т. 70, № 5. С.581 -594.

82. Проворов H.A. Соотношение симбиотического автотрофного питания азота у бобовых растений // Физиология растений. — 1996. № 43. С. 127135.

83. Проворов H.A. Генетико-эволюционные основы учения о симбиозе // Журнал общей биологии. 2001. № 62. - С. 472-495.

84. Проворов H.A., Тихонович И.А. Эколого-генетические принципы селекции растений на повышение эффективности взаимодействия с микроорганизмами // С.-х. биология. 2003, № 3. - С. 11-25.

85. Проворов Н.А., Фокина И.Г., Румянцева M.JL, Симаров Б.В. Перенос Sym-плазмид в симбиотически активные и асимбиотические штаммы ризобий: свойства рекомбинантов и возможные эволюционные последствия // Экологич. генетика. 2004. Т. 2, № 2. - С. 29-34.

86. Проворов Н.А. Растительно-микробные симбиозы как эволюционный континуум // Журн. общ. биологии. 2009. Т. 70, № 1. - С. 10-34.

87. Прянишников Д.Н. Азот в жизни растений. М.: Сельхозгиз, 1953. - 220 с.

88. Редькина Т.В. Механизм положительного влияния бактерий рода Azospirillum на высшие растения // Биологический азот в сельском хозяйстве СССР / Под. ред. Е.Н. Мишустина. М.: Наука, 1989. - С. 132141.

89. Рудавина Е.В. Активность симбиотической азотфиксации вики мохнатой // Научно-практическая конференция молодых ученых. Воронеж, 2005. Ч. 2.-С. 127-129.

90. Рулинская Н.С. Влияние влажности почвы на образование клубеньков вики посевной. // Биология и агротехника с.-х. культур. Сб. науч.трудов, Горки. 1971. Т. 79 - С. 202-206.

91. Светличный В.А., Савельева И.Д., Некрасова В.К., Эль-Регистан Г.И. Изучение содержания мембраноактивных ауторегуляторов при литоавтотрофном росте Pseudomonas carboxydoflava II Микробиология. — 1986. Т. 55. Вып. 1.- С. 55-59.

92. Степаненко И.Ю., Мулюкин A.JI, Козлова А.Н., Николаев Ю.А., Эль-Регистан Г.И. Роль алкилоксибензолов в адаптации Micrococcus luteus к температурному шоку // Микробиология. 2005. Т. 74, № 1. - С. 26-33.

93. Степанова Г.В. Симбиотические биотехнологии создания эффективных сорто-микробных систем кормовых трав.// Кормопроизводство: проблемы и решения. 2007. - С. 357-364.

94. Сузина Н.Е., Мулюкин А.Д., Козлова А.Н., Шорохова А.П., Дмитриев

95. B.В., Баринова Е.С., Мохова О.Н., Эль-Регистан Г.И., Дуда В.И. Тонкое строение некоторых неспорообразующих бактерий // Микробиология. -2004. Т. 73, № 4. С. 516-529.

96. Тихонович И.А. Молекулярная биология бактерий, взаимодействующих с растениями. СПб., 2002. - 567 с.

97. Тихонович И.А., Проворов H.A. Симбиогенетика микробно-растительных взаимодействий // Экологич. генетика. — 2003. Т. 1, № 2. —1. C. 36-46.

98. Тихонович И.А., Борисов А.Ю., Цыганов В.Е., Овцына А.О., Долгих Е.А., Проворов H.A. Интеграция генетических систем растений и микроорганизмов при симбиозе // Успехи соврем, биологии. 2005. Т. 125, №3.-С. 227-238.

99. Тихонович И.А., Круглов Ю.В. Микробиологические аспекты плодородия почвы и проблемы устойчивого земледелия // М.: Плодородие. 2006. № 5. - С. 9-12.

100. Тихонович И.А., Проворов H.A. Кооперация растений и микроорганизмов: новые подходы к конструированию экологически устойчивых агросистем // Успехи соврем, биологии. — 2007. Т. 127, № 4. -С. 339-357.

101. Тюрин Ю.С. Направления и методы селекции вики посевной {Vicia sativa L.) // Кормопроизводство: проблемы и решения. 2007. — С. 306-310.

102. Умаров М.М. Ассоциативная азотфиксация. М.: Наука, 1986. - 131 с.

103. Федоров A.A., Красильникова H.A., Уранова A.A. Жизнь растений. -Введение. Бактерии и актиномицеты. — М.: Просвещение, 1974. Т. 1. - С. 200-220.

104. Фесенко А.Н., Орлова И.Ф., Проворов H.A., Симаров Б.В. Изучение симбиотических свойств клубеньковых бактерий гороха в вегетационных опытах.// Доклады РАСХН. 1995, №3. С. 24-26.

105. Хотянович A.B. Методы культивирования азотфиксирующих бактерий, способы получения и применения препаратов на их основе (методические рекомендации). JL: Б. и., 1991. - 60 с.

106. Хотянович A.B. Бактериальные препараты и возможность повышения продуктивности люпина // Биологический и экономический потенциал люпина и пути его реализации. Брянск, 1997. - С. 119-121.

107. Хохлов A.C. Низкомолекулярные микробные ауторегуляторы. М.: Наука, 1988.-272 с.

108. Шелудько A.B., Кацы Е.И. Образование на клетке Azospirillum brasilense полярного пучка пилей и поведение бактерий в полужидком агаре // Микробиология. 2001. - Т. 70, № 5. - С. 662-667.

109. Шильникова В.К. Цитоморфология и цитохимия клубеньковых бактерий в онтогенезе разных видов бобовых культур // Известия ТСХА.1974. Вып. 1.-С. 3-13.

110. Шильникова В.К., Серова Е.Я. Микроорганизмы-азотонакопители на службе растений. М., 1983. - 150 с.

111. Шольц К.Ф., Островский Д.Н. Ячейка для амперометрического определения кислорода // Методы современной биохимии. М.: Наука.1975.-С. 52-58.

112. Шумный В.К., Сидорова К.К., Гляненко М.Н. Биологический азот и симбиотическая азотфиксация // Главный агроном. 2004. № 10. - С. 2729.

113. Эль-Регистан Г.И. Роль мембранотропных ауторегуляторных факторов в процессах роста и развития микроорганизмов / Дисс. . докт. биол. наук, Москва, 1988.-С. 507.

114. Эль-Регистан Г.И., Мулюкин A.JL, Николаев Ю.А., Сузина Н.Е., Гальченко В.Ф., Дуда В.И. Адаптогенные функции внеклеточных ауторегуляторов микроорганизмов // Микробиология. 2006. Т. 75, № 4. -С. 446-456.

115. Allan G.J., Porter J.M. Tribal delimitation and phylogenetic relationships of Loteae and Coronilleae (Fabaceae) with special reference to Lotus: evidence from nuclear ribosomal ITS sequences // Amer. J. Bot. 2000 V. 40. - P. 429435.

116. Allen O.N., Allen E.K. The leguminonosae. A sourse book of characteristica, uses and nodulation. Univ. Wisconsin Press. 1981. 800 p.

117. Alexandre G., Greer-Phillips S., Zhulin I.B. Ecological role of energy taxis in microorganisms // FEMS Microbiol. Rev. 2004. V. 28. - P. 113-126.

118. Awaya J. D., Tittabutr P., Li Q. X., Borthakur D. Pyruvate carboxylase is involved in metabolism of mimosine by Rhizobium sp. strain TALI 145 //Archives of Microbiology. 2008. V. 190, № 4. - P. 409-415.

119. Ba A., Guissou T. et al. Mycorhization contrôlée et fertilisation phosphatée : application à la domestication du jujubier// Fruits. 2001 V. 56, № 4. - P. 261269.

120. Baldani V.L.D., Baldani J.I., Dobereiner J. Effects of Azospirillum inoculation on root infection and nitrogen incorporation in wheat // Can. J. Microbiol. 1983. V. 29. - P. 924-929.

121. Baldani J.I., Baldani V.L.D. History on the biological nitrogen fixation research in graminaceous plants: special emphasis on the Brazilian experience // Anals da Academia Brasileira de Ciencias 2005. V.77, № 3. P. 549 - 579.

122. Bashan Y., Holguin G. c Azospirillum-plant relationships: environmental and physiological advances (1990-1996) // Ibid. 1997. - V. 43, № 2. - P. 103-121.

123. Bashan Y., Holguin G., de-Bashan L.E. Azospirillum-plant: Physiological, molecular, agricultural, and environmental advances (1997-2003) // Can. J. Microbiol. 2004. V.50. - P.521 - 577.

124. Birnboim H. C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA // Nucleic Acids Res. 1979. V. 7, № 6. - P. 15131523.

125. Bohlool B.B., Scmidt E.L. Lectins: a possible basis for specificity in the Rhizobium-legumG root nodule symbiosis // Science. 1974. V. 185. - P. 269271.

126. Braeken K., Fuavart M., Vercruysse M., Beullens S., Lambrichts I., Michiels J. Pleiotropic effects of a rel mutation on stress survival of Rhizobium etli CNPAF512 // BMC Microbiol. 2008. V. 10, № 8. - 219 p.

127. Catlow H.Y., Glenn A.R., Dilworth M.J. Does rhizobial motility affects its ability to colonize along the legume root? // Soil Biol. Biochem. 1990. V. 22. -P. 573.

128. Chen W. M., Lee T. M., Lan C. C., Cheng C. P. Characterization of halotolerant rhizobia isolated from root nodules of Canavalia rosea from seaside areas. // FEMS Microbiol. Ecol. 2000. - 34. - P. 9-16.

129. Czaban J., Gajda A., Wröblewska B. The Motility of Bacteria from Rhizosphere and Different Zones of Winter Wheat Roots // Polish J. of Environ. Stud. -2006. V. 16, No. 2. P. 301-308.

130. Dangeard P. A. Recherches sur les turbercles radicaux des Lergumineuses // Botaniste (Paris) 1926, 16.- P. 1-275.

131. Diaz C.L., Melchers L.S., Hookaas P.J.J., Lugtenberg E.J.J., Kijene J.W. Root lectin as a determinant of host-plant specifity in the Rhizobium-legume symbiosis. Nature. 1989. V. 338. - P. 579-581.

132. Douglas A.E. Symbiotic interactions Oxford Oxfordshire. // Oxford University Press. — 1994.

133. Dragutin J., Savic, Ferretti J.J. Novel Genomic Rearrangement That Affects Expression of the Streptococcus pyogenes Streptolysin O (slo) Gene // J. of Bacteriology-2003.V. 185, №6.-P. 1857-1869.

134. Dressaire C., Redon E., Milhem H., Loubiere P., Cocaign-Bousquet M. Growth rate regulated genes and their wide involvement in the Lactococcus lactis stress responses // BMC Genomics. 2008. V. 9, № 1. - P. 343-366.

135. Hall P.G., Krieg N.K. Swarming of Azospirillum brasilense on solid media // Can. J. Microbiol. 1983. -V. 29. - P. 1592-1594.

136. Hallet B., Sherratt D.J. Transposition and site-specific recombination: adaptating DNA cut and paste mechanism to a variety of genetic rearrangements // FEMS Microbiol. Rev. 1997. V. 21. - P. 157-178.

137. Hengge-Aronis R. Survival of hunger and stress: the role of rpoS in early stationary phase gene regulation in Escherichia coli II Cell. 1993. V. 72. - P. 165-168.

138. Hilton T., Rosche T., Froelich B., Smith B., Oliver J. Capsular Polysaccharide Phase Variation in Vibrio vulnificus II Applied and Environmental Microbiology. 2006. V. 72, № 11. - p. 6986-6993.

139. Holmes D S. Improved rapid heating technique for screening recombinant plasmids in E. coli. II Biotechniaues. -1984. V. 2. P. 68-69.

140. Howieson, J., and R. Ballard. Optimising the legume symbiosis in stressful and competitive environments within southern Australia—some contemporary thoughts. // Soil Biol. Biochem. 2004. V. 36. - P. 1261-1273.

141. James E.K. Nitrogen fixation in entophytic and associative symbiosis // Field Crops Res. 2000. - V. 65, № 2/3. - P. 197-209.

142. Jenkins, M. B. 2003. Rhizobial and bradyrhizobial symbionts of mesquite from the Sonoran Desert: salt tolerance, facultative halophily and nitrate respiration. // Soil Biol. Biochem. V. 35. -P: 1675-1682.

143. Kadouri D., Jurkevitch V., Okon Y. Involvement of the reserve material poly-fl-hydroxybutirate in Azospirillum brasilense stress endurance and root colonization // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - V. 69, № 6. - P. 3244-3250.

144. Kozubek A., Tyman John H.P. Resorcinolic lipids, the natural non-isoprenoid phenolic amphiphiles and their biological activity // Chemical Rev. — 1999. V. 99.-P.1-31.

145. Kulawinek M., Jaromin A., Kozubek A., Zarnowski R. Alkylresorcinols in selected Polish rye and wheat cereals and whole-grain cereal products // Journal of agricultural and food chemistry. 2008. V. 56, № 16. - P. 7236-7242.

146. Lane D. J. 16S/23S sequencing // In: Nucleic acid techniques in bacterial systematics / Stackebrandt E. a. Goodfellow M. (Eds.). Chichester: John Wiley & Sons, Ltd. 1991.-P. 115-175.

147. Lavin M., Pennington R.T., Klitgaard B.B., Sprent J.I., de Lima H.C., Gasson P.E. The dalbergioid legumes (Fabaceae): delimination of pantropical clade // Amer. J. Bot.-2001. V. 88.-P. 503-533.

148. Layne J.S., Johnson E.J. Resistant properties of Azotobacter cysts induced in response to mineral deficiencies // J. Bacteriol. 1964. V. 88. - P. 956-959.

149. Mandal S.M., Mandal M., Pati B.R., Das A.K., Ghosh A.K. Proteomics view of Rhizobium isolate response to arsenite As(III). stress // Acta Microbiologica et Immunologicf Hungarica. 2009. V. 56, № 2. - P. 157-67.

150. Markman K., Giczey G., Parniske M. Functional Adaptation of a Plant Receptor-Kinase Paved the Way for the Evolution of Intracellular Root Symbioses with Bacteria II PLoS Biology. 2008. V. 6. Issue 3. - P. 497 - 506.

151. Morris J., González J.E. The novel genes emmABC are associated with exopolysaccharide production, motility, stress adaptation, and symbiosis in Sinorhizobium meliloti IIJ Bacteriol. 2009. V. 191, № 19. - P. 5890-5900.

152. Muratova A., Hübner Th., Turkovskaya O., Moder M., Kuschk P. Plant -rhizosphere-microflora association during phytoremediation of PAH-contaminated soil // Int. J. Phytorem. 2003. V.5, № 2. - P. 137-151.

153. Nicholson W.L., Munakata N., Horneck G., Melosh H.J., Setlow P. Resistance of Bacillus endospores to extreme terrestrial and extraterrestrial environments 11 Microbiol, and Mol. Biol. Rev. 2000. V. 64, № 3. - P. 548572.

154. Parsek M.R., Greenberg E.P. Acylhomoserine lactone quorum sensing in Gram-negative bacteria: A signaling mechanism involved in associations with higher organisms // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V.97, №16. - P. 87898793.

155. Rinaudi L., Fujishige N. A., Hirsch A. M., Banchio E., Zorreguieta A., Giordano W. Effects of nutritional and environmental conditions on Sinorhizobium, meliloti biofilm formation // Research in Microbiology. 2006. V. 157, Issue 9.-P. 867-875.

156. Robin C., Sultan-Tubeileh K., Obaton M.,Guckert A. Nitrogen fixation and growth of annual Medicago — Sinorhizobium associations at low temperature // European Journal of Agronomy. 2005. V. 22, Issue 3. - P. 267-275.

157. Rodríguez-Navarro D.N., Dardanelli M.S., Ruíz-Saínz J.E. Attachment of bacteria to the roots of higher plants // FEMS Microbiol., Lett. 2007. V. 272, № 2. P. 127-136.

158. Rosenberg S. Evolving responsively: adaptive mutation // Nat. Rev. Genet. -2001. V. 2, №7. P. 504-514.

159. Sadasivan L., Neyra C A. Cyst production and brown pigment formation in aging cultures of Azospirillum brasilense ATCC 29145 // J. Bacteriol. 1987. V. 169, №4.-P. 1670-1677.

160. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. V. 84. - P. 5463-5467.

161. Schloter M., Hartmann A. Endophytic and surface colonization of wheat roots (Triticum aestivum) by different Azospirillum brasilense strains studied with strain specific monoclonal antibodies // Symbyosis. 1998. - V. 25. — P. 159-179.

162. Seckbach Ed., Dordrecht J. Symbiosis: Mechanisms and Model Systems / Boston, London: Kluwer Acad. Publ. 2002. P. 125.

163. Sourjik V., Berg H.C. Functional interactions between receptors in bacterial chemotaxis //Nature. -2004. V. 428. P. 437-441.

164. Spaink. H.P, Kondorosi. A., Hooykaas. P.J.J. The Rhizobiaceae. Molecular Biology of Model plant-Associated Bacteria. Dordrecht. Boston. London. Kluwer Academic Publishers. 1998. - P. 558.

165. Sridevi M. and Mallaiah K. V. Production of indole-3-acetic acid by Rhizobium isolates from Sesbania species // African Journal of Microbiology Research. 2007. V. 1, № 7. - P. 125-128.

166. Steenhoudt O., Vanderleyden J. Azospirillum, a free-living nitrogen-fixing bacterium closely associated with grasses: genetic, biochemical and ecological aspects // FEMS Microbiol. Rev. 2000. V. 24, № 4. - P. 487 - 506.

167. Thimann K.V. On physiology of the formation of nodules on legume roots // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1936. V. 22. - P. 511-513.

168. Trotman, A. P., and R. W. Weaver. Tolerance of clover rhizobia to heat and desication stresses in soil // Soil Sci. Soc. Am. J. 1995. V. 59. - P. 466-470.

169. Turner S.L., Young J.P.W. The glutamine synthetases of rhizobia: phylogenetics and evolutionary implications // Mol Biol. Evol. — 2001. V. 17. -P. 309-319.

170. Van de Peer Y., De Wachter R. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment// Comput. Applic. Biosci. 1994. V. 10. - P. 569-570.

171. Van Rhijn P., Fujishige N.A., Lim P.O., Hirsch A.M. Sugar-binding activity of pea lectin anhances heterologous infection of transgenic alfalfa plants by Rhizobim leguminosarum biovar viciae // Plant Physiol. 2001. V. 126. - P. 133-144.

172. Vial L., Lavire C., Mavingui P., Blaha D., Haurat J., Moenne-Loccoz Y., Bally R., Wisniewski-Dye F. Phase variation and genomic architecture changes in Azospirillum // J. Bacteriol. 2006 V. 188, № 15. - P. 5364 - 5373.

173. Vriezen J. A. C., de Bruijn F. J., Niisslein K. Responses of Rhizobia to desiccation in relation to osmotic stress, oxygen, and temperature // Applied and Environmental Microbiology. 2007. V. 73, № 11. - P. 3451-3459.

174. Wilkinson S., Davies W.J. ABA-based chemical signaling: the coordination of responses to stress in plants // Plant Cell Environ. 2002. V. 25. - P. 195210.

175. Willems A. The taxonomy of rhizobia: an overview // Plant and Soil. 2006. V. 287-P. 3-14.

176. Wolfe J.A., Millikan D.S., Campbel J.M.,Visick K.L. Vibrio fischeri a54 Controls Motility, Biofilm Formation, Luminescence, and Colonization // Applied and Environmental Microbiology. 2004. V. 70, №4. - P. 2520-2524.

177. Woude M.V., Baumler A.J. Phase and antigenic variation in bacteria //Clin. Microbiol. Rev. -2004. V. 17, № 3. P. 581-611.

178. Zhang H., Jennings A., Barlow P. W., Forde B. G. Dual pathways for the regulation of root branching by nitrate // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1999. V. 96.-P. 6529-6534.

179. Список работ, опубликованных по теме диссертации

180. Мулюкин A.JL, Сузина Н.Е., Погорелова А.Ю., Антонюк Л.П., Дуда В.И., Эль-Регистан Г.И. Разнообразие морфотипов покоящихся клеток и условия их образования у Azospirillum brasilense II Микробиология. 2009. Т. 78. № i.e. 42-52.

181. Погорелова А.Ю., Лойко Н.Г., Ванькова A.A. Образование цистоподобных покоящихся форм Sinorhizobium meliloti Р221 под влиянием алкилоксибензола — химического аналога микробных аутоиндукторов анабиоза // Известия ТСХА. 2009. Выпуск 1. С. 149-154.

182. Погорелова А.Ю., Лойко Н.Г., Ванькова A.A. Регуляция развития и диссоциативных переходов симбиотрофных бактерий // Известия ТСХА. 2009. Выпуск 2. С. 176-182.

Информация о работе

Погорелова, Анна Юрьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.02.03

Диссертация

Регуляция адаптации симбиотрофных бактерий к неблагоприятным условиям - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы