Выживаемость патогенных бактерий в почвах

Евстигнеева, Анна Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Выживаемость патогенных бактерий в почвах
ВАК РФ 03.00.27, Почвоведение

Автореферат диссертации по теме "Выживаемость патогенных бактерий в почвах"

На правах рукописи

□030G307'4

ЕВСТИГНЕЕВА АННА СЕРГЕЕВНА

ВЫЖИВАЕМОСТЬ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ В ПОЧВАХ (НА ПРИМЕРЕ COXIELLA BURNETII И АМЕБО-РЕЗИСТЕНТНЫХ БАКТЕРИЙ)

03 00 27 - почвоведение 03 00 07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3 МАЙ 2007

Москва - 2007

003063074

Работа выполнена на кафедре физики и мелиорации почв факультета почвоведения Московского Государственного Университета им МВ Ломоносова и в лаборатории экологии риккетсий Государственного Учреждения Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им Н Ф Гамалеи Российской Академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Л.О. Карпачевский

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор М.М. Умаров

кандидат биологических наук Н.М. Щсголькова

Ведущая организация:

Российский государственный аграрный университет - МСХА им. К А Тимирязева

Защита диссертации состоится » мая 2007 г в аудитории -П на

заседании диссертационного совета Д 501 001 57 при факультете почвоведения МГУ им M В Ломоносова по адресу 119899, ГСП-2, Москва, Ленинские горы

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета почвоведения МГУ им M В Ломоносова

Автореферат разослан «23» апреля 2007 г

л п

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор • ^ A.C. Никифорова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Теоретическая предпосылка настоящей работы - проблема сохранения в разных почвах патогенных микроорганизмов Естественные почвы обычно обладают самоочищающей способностью (Мишустин и др, 1979) Она определяется комплексом почвенных свойств, препятствующих сохранению в почвах большинства возбудителей болезней Однако современное техногенное воздействие на почву приводит к быстрому расширению спектра патогенных агентов человека, выживающих в объектах окружающей среды Создание таких условий заложено в самом техническом прогрессе, когда появляются многочисленные разнообразные новые местообитания и экологические ниши, весьма благоприятные для потенциально патогенных микроорганизмов на фоне неуклонного снижения иммунных барьеров человека (Литвин и др, 1997)

Для оценки патогенной опасности почвенных объектов важно, чтобы используемый метод позволял провести быстрый и точный скрининг почвы на наличие потенциально патогенных микроорганизмов Когда речь идет об уменьшении риска заболевания человека, именно быстрота обнаружения и точность определения патогена выходят на первый план

Поэтому в рамках настоящей работы представлялось важным оценить почву как биотоп, где возможно сохранение патогенных микроорганизмов, и попытаться, с одной стороны, вскрыть механизм взаимодействия конкретного патогена со сложной системой - почвой, а с другой, - провести скрининг почвенных объектов, расположенных в местах частого и массового пребывания людей для оценки риска заражения

Цель работы

Определить выживаемость патогенных бактерий в почвах различных типов (на примере Coxiella burnetii и амебо-резистентных бактерий) и изучить влияние свойств почв на выживаемость патогенных микроорганизмов

Задачи исследования

1. Определить выживаемость С burnetii в исследуемых почвах после инокуляции в эксперименте

2. Оценить динамику количества С burnetii в различных почвах при разных температурах

3. Выделить амебо-резистентные бактерии (АРБ) из почвенных и песчаных объектов, расположенных в местах частого и массового пребывания людей

4. Дать характеристику выделенным АРБ методом построения филогенетического дерева

5. Выявить почвенные свойства, влияющие на выживаемость патогенных бактерий в почве

6. Провести оценку применимости метода амебного со-культивирования для скрининга почв на наличие амебо-резистентных бактерий

Защищаемые положения

1. Патогенные бактерии (С burnetii, АРБ) выживают (сохраняют жизнеспособность) в почвенной среде, в почвах разных типов в течение длительного времени

2. Выживаемость патогенных бактерий (С burnetii, АРБ) в почвах связана обратной зависимостью с активностью органо-минеральной матрицы при уменьшении содержания органического вещества (черноземы, +20°С) и удельной поверхности почв (городские почвы) выживаемость увеличивается

3. Метод амебного со-культивирования позволяет выявлять наличие в почвах потенциально патогенных бактерий и обнаруживать новые виды

Научная новизна

Проведенное исследование позволило выделить из почвенных и песчаных

объектов, расположенных в местах частого и массового пребывания людей, 33

вида потенциально патогенных бактерий, многие из которых ранее не выделяли

из почвенной среды

Обнаружены 4 потенциальных представителя новых видов/родов

(типирование по гену rrs, сходство <97%), а также новый вид рода Acinetobacter

(секвенирование всего гена гроВ, сходство 94 9%), идентифицированные последовательности генов которых помещены в GenBank

Впервые определена выживаемость патогенной у-протеобактерии С burnetii в разных почвах (дерново-подзолистой, серой лесной, черноземе, каштановой и болотной почве высокогорья), которая составляет не менее 20 дней

Установлено, что из всех почвенных свойств наибольшее ингибирующее влияние на выживаемость С burnetii в черноземе оказывает содержание органического углерода выживаемость С burnetii в черноземе при +20°С уменьшается при увеличении содержания органического углерода

Показано, что у коксиеллы существует широкий диапазон экологической толерантности по отношению к температуре почвы (от -20 до +20°С), при этом количество сохранившихся в почве коксиелл увеличивается с уменьшением температуры независимо от типа почвы, а при температуре исследуемых почв -20°С имеет место консервация С burnetii в жизнеспособном состоянии

Впервые для скрининга почв на наличие потенциально патогенных бактерий использован метод амебного со-культивирования, который, как показало данное исследование, также позволяет каталогизировать почвенные микроорганизмы и выявлять новые виды/роды бактерий в почвенной среде Научно-практическая ценность н реализация результатов работы Полученные данные свидетельствуют о том, что почвы и пески в местах частого и массового пребывания людей содержат потенциально патогенные для человека бактерии

Организациям практического здравоохранения рекомендуется включить обследование территории на наличие амебо-резистентных бактерий в комплекс необходимых мер по оценке эпидемиологической опасности мест проживания людей

Метод амебного со-культивирования позволяет с достаточной быстротой и точностью проводить скрининг почв на наличие потенциальных патогенов человека и обнаруживать новые виды микроорганизмов

Увеличение содержания органического углерода в черноземах способствует снижению выживаемости С burnetii, возбудителя Q-лихорадки Апробация работы

Основные результаты работы представлены на Российско-Итальянском студенческом форуме по экологии и наукам об окружающей среде (Палермо, Италия, 23-26 июля, 2003), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Суздаль, 1922 мая, 2005), нескольких рабочих совещаниях Центра ВОЗ Средиземноморского Университета (Марсель, Франция, ноябрь 2005 - октябрь 2006) и заседании лаборатории экологии риккетсий ГУ НИИЭМ им НФ Гамалеи РАМН (Москва, 6 апреля 2007)

По материалам диссертации имеется 5 печатных работ, в том числе 3 статьи и 2 тезисов

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, списка литературы (97 отечественных и зарубежных источника) Объем работы составляет страниц машинописного текста, в том числе 6 таблиц и 18 рисунков

Глава 1. Почва как биотоп для выживания патогенных бактерий

Роль почвы в процессах циркуляции и резервации патогенных микроорганизмов представлена на рис 1 Популяция хозяина

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ПОЧВА

Р и с 1 Роль почвы в процессах циркуляции и резервации патогенных микроорганизмов

Сама проблема находится на «стыке» сразу нескольких научных дисциплин (почвоведения, микробиологии, экологии, эпидемиологии, медицины), что должно помочь в формировании взглядов на истинную природу взаимодействия патогенного микроорганизма и почвы

Вполне очевидно, что в почвенных экосистемах наряду с факторами, лимитирующими популяции патогенных бактерий, действуют факторы, поддерживающие их устойчивое существование и обеспечивающие жизнеспособность возбудителей инфекций как полноправных обитателей почв

Очень важное экологическое значение имеет адгезия микроорганизмов, которая во многих случаях определяет выживание вида (Д Г Звягинцев, 1987) Следует отметить, что под выживаемостью патогенного микроорганизма мы, прежде всего, понимаем сохранение им способности к инфицированию В настоящем исследовании была предпринята попытка ответа на вопрос о том, какие факторы оказывают наибольшее влияние на выживаемость патогенных бактерий в почвах

Coxiella burnetii - возбудитель Q-лихорадки (коксиеллеза) - заболевания с природной очаговостью Q-лихорадка занимает одно из первых мест среди других риккетсиозов по своей значимости, практически повсеместному распространению и наносимому экономическому ущербу Для ряда районов нашей страны Q-лихорадка представляет серьезную народно-хозяйственную проблему, связанную как с заболеваемостью людей, так и сельскохозяйственных животных (Проблемы коксиеллеза на рубеже третьего тысячелетия, 2002)

Ведущим путем передачи инфекции является аспирационный (Тарасевич, 2002) Однако в литературе отсутствуют данные о выживаемости С burnetii в почве Определялась ее выживаемость в песке и глине (Другапова, 1985), но последние рассматривались исключительно как субстрат для С burnetii

Эпидемиологические исследования последних лет убедительно доказывают, что это заболевание должно рассматриваться как насущная проблема здравоохранения во многих странах, таких как Франция,

Великобритания, Италия, Испания, Германия, Израиль, Греция, Канада и др, где оно превалирует, но не распознается по причине недостаточного надзора за инфекцией (Maurin и Raoult, 1999) В РФ эпидемиологическая и эпизоотологическая обстановка по зооантропонозным и природяоочаговым инфекциям в целом является напряженной, при этом Q-лихорадка - одна из болезней, вызывающих озабоченность Министерства здравоохранения (Онищенко и др, 1999) Повышение эффективности эпидемиологического надзора за коксиеллезом возможно при консолидации широкого круга специалистов (врачей, ветеринаров и экологов), при этом, на наш взгляд, важно привлечь к указанной проблеме внимание почвоведов в рамках изучения взаимосвязей между особенностями почвенного покрова и здоровьем человека

К сожалению, сегодня стала актуальной и потенциальная возможность использования С burnetii в качестве агента биотерроризма Согласно данным «CDC» («Centers for Disease Control and Prevention») С burnetii принадлежит к категории «В» (2-й по опасности из 3-х) биологических агентов В эту группу входят возбудители таких болезней, как бруцеллез, пситтакоз и др В российской классификации патогенных для человека микроорганизмов С burnetii относится к риккетсиям П-й группы патогенности (Классификация патогенных для человека микроорганизмов, 2003)

Для условно-патогенных бактерий, имеются лишь разрозненные, хотя и многочисленные факты изоляции культур из внешней среды, трактовка которых, особенно в антропогенных ландшафтах, затруднена На фоне огромного потока информации об их растущей роли в инфекционной патологии человека, особенно в эпидемиологии внутрибольничных инфекций, почти нетронутой остается проблема первичных (природных) резервуаров условно-патогенных микроорганизмов, их экологии в различных объектах окружающей среды - местах постоянного обитания человека (Литвин и др , 1997)

Возможность исследовать структуру микробного сообщества до недавних пор была ограничена из-за отсутствия подходящей стратегии культивирования для определения видового разнообразия (Crawford, 2005)

Метод амебного со-культивирования успешно используется в диагностике внутрибольничных инфекций и для поиска потенциальных патогенов человека (Abd et al, 2005, Greub, Raoult, 2002, La Scola & Raoult, 2001, Landers et al, 2000) и новых видов микроорганизмов в различных объектах окружающей среды (Adekambi et al, 2004, Adeleke et al, 2001, Birtles et al, 2000, Greub & Raoult, 2003, La Scola et al, 2000, 2004(1), 2004(2)) С помощью данного метода был открыт Mimivmis (La Scola et al, 2003(2)) -самый большой из известных сегодня вирусов Нами метод был впервые использован для скрининга почв

Глава 2. Объекты и методы исследования

Были проведены модельные исследования с разными субстратами (почвами)

Модель экспериментов I. Определение выживаемости патогенных бактерий в почвах

11 Определение выживаемости С burnetii в основных типах почв (дерново-подзолистой, серой лесной, каштановой, болотной и черноземе ЦЧЗ) при различных температурах

12 Выявление свойств почв, оказывающих непосредственное влияние на выживаемость данного вида микроорганизмов в почве (на примере чернозема ЦЧЗ и черноземов Воронежской области - природного очага коксиеллеза) По результатам, полученным в первой части исследования, именно чернозем при +20°С статистически значимо отличается от всех других почв в отношении выживаемости С burnetii Для этого образцы чернозема ЦЧЗ предварительно подвергли стерилизации (с целью исключения влияния почвенной биоты) и разрушению органического вещества (для выяснения роли гумуса) Выживаемость С burnetii в черноземах Воронежской обл определяли в нестерильной почве с исходным содержанием органического вещества

Эксперимент проводился в несколько этапов

1 Во все почвенные образцы, предварительно просеянные через сито 2 мм, вносили по 5 мл раствора высушенного штамма М-44 (С burnetii, фаза II) в разведении 1 10

2 Образцы почвы, инфицированные возбудителем, инкубировали при различной температуре -20, +4, +20°С, - каждый раз применяя положительный и отрицательный контроль Черноземы во второй части исследования, как отмечено ранее, инкубировали только при + 20°С, тк только при этой температуре было получено статистически значимые показатели выживаемости С burnetii

3 Инкубация инфицированных образцов в течение 20 дней Этот срок был выбран, исходя из данных о выживаемости С burnetii в амебах в течение 18 дней (Maurm, Raoult, 1999)

4 Почвы центрифугировали (10 мин при 5000 об/мин) и супернатантом (V®2 мл) инфицировали внутрибрюшинно белых беспородных мышей В эксперименте использовались самцы весом 14-16 г (Здродовский, Голиневич, 1972) Всего было заражено 120 особей

5 В течение 10 дней (Здродовский, Голиневич, 1972) проводили наблюдение за поведением мышей и регистрировали появляющиеся у них признаки заболевания

6 Отпечатки селезенок мышей исследовали с помощью реакции прямой иммунофлуоресценции (РИФ)

Для получения статистически значимых результатов во всех случаях использовали 5-кратную повторность (по 5 мышей на каждый почвенный образец в заданных условиях)

II. Обнаружение амебо-резистентных бактерий в почве с помощью метода амебного со-культивирования (amoebal co-culture), состоявшего из следующих этапов

1 Подготовка образцов 3 методики («французская» оригинальная, «французская» модифицированная, «российская»)

2 Амебная со-культура

2 1 Инокуляция пробы в культуру амеб 3 серии (без антибиотика, с 2 и 3 антибиотиками)

2 2 Наблюдение за со-культурой микроскопия в отраженном свете, субкультура на «свежей» культуре амеб, регистрация лизиса амеб, приготовление и окраска (по Граму, Гименезу и методу Циля-Нильсена ) стекол для иммерсионной микроскопии

2 3 Выделение штаммов (селективные среды для каждого образца)

3 Проверка цитопатогенного эффекта в отношении амеб для каждого выделенного штамма, констатация внутриамебного роста

4 (Клонирование)

5 Молекулярная идентификация изолятов при типировании по генам rrs (ген 16S рРНК) и гроВ (ген, кодирующий 13-субъединицу РНК-полимеразы)

Диагностическим критерием для проведения этапа клонирования является лизис амеб в том случае, если на момент цельной пробы регистрировался лизис амеб (п 2 2), и он подтвердился наличием цитопатогенного эффекта на стадии монокультур (п 3), можно сразу переходить к молекулярной идентификации изолята, вызвавшего лизис Если же, в отличие от первого случая, цитопатогенный эффект не регистрировался, но при этом имел место лизис амеб на стадии цельной пробы, необходимо провести клонирование для обнаружения некультивируемого штамма, который вызвал лизис

Объекты исследования I. Почвы, используемые для определения выживаемости С burnetii (0-20см) дерново-среднеподзолистая среднесуглинистая на покровном суглинке, подстилаемом мореной (г Калуга), серая лесная среднесуглинистая на лессовидном суглинке (г Суздаль), каштановая среднесуглинистая на лессовидном карбонатном суглинке (Ростовская обл, г Пролетарск), болотная низинная торфянисто-глеевая висячих болот (Ставропольский край, Тебердинский заповедник, »2800 м над ум), чернозем типичный среднемощный среднесуглинистый на лессовидном карбонатном суглинке

(Курская обл, Центральный Черноземный Заповедник (ЦЧЗ)), чернозем типичный среднемощный среднесуглинистый на лессовидном карбонатном суглинке (Воронежская обл, Острогожский район), чернозем типичный маломощный среднесуглинистый на лессовидном карбонатном суглинке окультуренный (Воронежская обл, Острогожский район), чернозем обыкновенный среднемощный среднесуглинистый на лессовидном

карбонатном суглинке (Воронежская обл, Калачеевский район), чернозем обыкновенный маломощный среднесуглинистый на лессовидном карбонатном суглинке окультуренный (Воронежская обл, Калачеевский район), чернозем обыкновенный среднемощный среднесуглинистый на лессовидном карбонатном суглинке (Воронежская обл, Россошанский район), чернозем обыкновенный маломощный среднесуглинистый на лессовидном карбонатном суглинке окультуренный (Воронежская обл , Россошанский район) II. Почвы, используемые для обнаружения амебо-резистентных бактерий

Смешанные образцы городских почв и песков г. Марсель (Франция) были отобраны вблизи мест массового скопления людей (глубина отбора 0-10 см) таких, как

1 Средиземноморский Университет (Umversite de la Mediterranee, Aix-Marseille 11)

2 Больница №1 (Hôpital de la Timone)

3. Больница №2 (Hôpital de la Conception)

4 Сквер y резиденции медсестер (Jardin Guy Azais)

5 Центральный парк, площадка для детских игр (Parc Borely)

6 Центральный парк, аллея (Parc Borely)

7 Центральный пляж (Plage Borely)

8 Публичный пляж (Plage de la Pomte Rouge)

9 Учебная ферма (Ferme Pédagogique) 10.Парк (Parc du XXVI Centenaire)

11 Вокзал (Gare St Charles)

Присвоенные порядковые номера используются далее для обозначения соответствующих почв

Использовали методы исследования, применяемые в почвоведении, а также статистические, микробиологические, серологические и генетические

Для всех почв, в которых изучали выживаемость С burnetii, определяли гигроскопическую влажность, рНн2о, гранулометрический состав (по стандартным методикам, Аринушкина, 1972) и содержание органического углерода {экспресс методом на анализаторе АН-7529 (сухое сжигание в токе кислорода при температуре 950-1000°С)}

Разрушение органического вещества чернозема ЦЧЗ производили двумя способами, в первом случае прокаливали почву в муфеле при 500°С в течение 8 часов, во втором - для более глубокого разрушения органического вещества почву подвергли многократной обработке горячей 30% Н2С>2 при нагревании смеси на газовой горелке до полного обесцвечивания почвенной массы

Стерилизацию чернозема ЦЧЗ осуществляли у - лучами дозой в ЗОкГр Со60 После облучения стерильность почвы проверяли посевом на питательный агар

Для почв и песков, служащих объектом для обнаружения АРБ, определяли рН, содержание органического углерода (так же, как и в первом случае) и удельную поверхность при помощи анализатора СОРБТОМЕТР-М Принцип работы прибора основан на использовании метода тепловой десорбции газа-адсорбата (азота) с поверхности исследуемого образца Перед началом испытаний образцы подвергли высушиванию до абсолютно сухого состояния (105°С, 6 часов) и дегазации, заключавшейся в его прогреве в стационарном потоке газа (150°С, 20 минут)

Для диагностики С burnetii использовали иммунофлуоресцентный метод (РИФ) Оценку результатов проводили стандартным способом на основании количества коксиелл и яркости их свечения Использовали систему обозначения в условных единицах (у е) 4 - яркая, сверкающая флуоресценция (ф ), >20 колоний (к ) коксиелл в поле зрения (п з ), 3 - отчетливо выраженная ф , 10-20 к п з , 2 - ф слабая, 5-10 к в п з , 1 - ф очень слабая, до 5 к в п з , 0 5 - единичные коксиеллы в п з

Подробное описание методики амебного со-культивирования приведено в тексте диссертации

На стадии подготовки образцов почв использовали 3 различные методики с целью последующего их сравнения

«Российская» методика заключается в приготовлении почвенной вытяжки (стандартным способом, в данном случае - с использованием стерильной воды), с последующей обработкой ультразвуком (22 кГц в течение 4 мин) для разрушения агрегатов и подбором соответствующего разведения В настоящем эксперименте использовалась неразведенная почвенная вытяжка с целью введения в амебы максимально нативного раствора

«Французская» методика основана на фильтрации почвенной вытяжки через двойную систему фильтров 40-|дм (Falcon cell strainer) и бумажные фильтры, - с последующим осаждением частиц на 0,22-цм мембране (Millipore) После чего каждая мембрана тщательно омывается в 2 мл PAS (Page's modified Neffs amoeba saline), специальном растворе для работы с амебами, и подготовленная суспензия используется для инокуляции на микроплашках Costar

Помимо двух выше перечисленных серий, были подготовлены образцы с использованием дополнительного 5-цм фильтра (Falcon cell strainer, 5 (im) после первой фильтрации с целью выявления влияния частиц размером 5-40 ¡im на адгезию АРБ («французская» модифицированная методика)

Глава 3. Выживаемость Coxiella burnetii в почвах

3.1. Выживаемость С. burnetii в почвах различных типов

Результаты свидетельствуют о способности С burnetii выживать в указанных почвах в течение 20 дней (табл. 1) Инфекция у лабораторных животных протекала при невыраженной симптоматике и проявилась в увеличении селезенки с накоплением в ней С burnetii у всех особей

При этом выживаемость С burnetii в исследуемых почвах при трех разных температурах близка по значению и расположена в интервале от 1,36 до 3,67 условных единиц (табл 1) Только выживаемость С burnetii в черноземе

ЦЧЗ при +20°С (1,36 единицы) статистически значимо (п=5, р=0,05) отличалась от всех остальных

Таблица 1 Выживаемость С burnetii в почве при разных температурах

Тип почвы Выживаемость, у е

20°С 4°С -20°С

Дерново-подзолистая 2,47 2,89 3,67

Серая лесная 2,25 2,92 2,97

Чернозем ЦЧЗ 1,36 2,58 2,67

Каштановая 2,55 2,89 3,36

Бототная 2,25 2,75 2,78

3.2. Влияние свойств почв на выживаемость С. burnetii

В целом существующие колебания в свойствах изучаемых почв (AWr=5,92%, АрНнгО =1,66, ДС=12,98%, табл 2), не привели к статистически значимым отличиям в выживаемости С burnetii

Результаты эксперимента со стерильным черноземом (1,35) показали, что почвенная биота в черноземе ЦЧЗ при +20°С не оказывала влияние на снижение выживаемости С burnetii

После разрушения органического вещества чернозема ЦЧЗ путем прокаливания почвенного образца в муфельной печи, когда содержание органического углерода уменьшилось в 2,2 раза (с 4,84 до 2,18%), выживаемость С burnetii значительно увеличилась - с 1,36 до 3,00 единиц (также в 2,2 раза) Обработка образца почвы пергидролем способствовала еще большему уменьшению содержания органического углерода - в 15,1 раза (с 4,84 до 0,32%), и это повлекло за собой дальнейшее, хотя и пропорционально меньшее увеличение выживаемости до 4,00 единиц (в 2,9 раза)

Выявленная зависимость подтвердилась для черноземов Воронежской обл Выживаемость С burnetii составила 1,42 у е для черноземов Калачеевского, 2,14 - Острогожского и 1,00 - Россошанского р-нов и 2,00, 2,67 и 3,25 для их окультуренных аналогов при содержании органического углерода 6 73, 5 21, 7 85, 5 26, 4 30 и 2 77 соответственно

Таблица 2 Свойства изученных почв ДП - дерново-подзолистая, СЛ - серая лесная, Ч -чернозем, К - каштановая, Б - болотная, цчз - Центральный Черноземный Заповедник, к о р - Калачеевский, Острогожский и Россошанский р-ны Воронежской обл Образцы в Воронежской обл отобраны под лесной (1) и с/х растительностью (2) соответственно, в остальных случаях - на пашне

Почва Гигроскопическая влажность, % рН водный С орг, % Гранулометрический состав (%), частицы (мм)

<0,01 <0,001

ДП 1 14 6 10 1 28 29 6 10 3

СЛ 1 93 7 10 3 36 391 18 9

Чцчз 3 79 7 47 4 84 40 9 13 0

К 2 50 7 75 1 78 35 6 23 2

Б 7 04 6 86 14 26 Не опр

ЧК1 3 29 7 66 6 73 43 7 18 8

Чк2 3 99 7 50 5 26 41 5 168

Чо1 6 08 7 63 5 21 43 0 186

Чо 2 4 24 7 32 4 30 44 6 19 2

ЧР1 7 06 7 40 7 85 42 2 17 1

Чр 2 5 93 7 76 2 77 45 0 199

Однако, при одинаковом виде полученных зависимостей (обратная пропорциональность) для черноземов Воронежской обл и ЦЧЗ, выживаемость С burnetii в первом случае оказалась несколько выше, что наглядно демонстрирует график зависимости выживаемости С burnetii от содержания органического углерода черноземов при +20°С (рис 2) Оба значения - 1,36 и 3,00, отвечающие выживаемости С burnetii в черноземе ЦЧЗ (нативном и после удаления части органического вещества соответственно) располагаются ниже трендовой прямой

Проведенный эксперимент также показал, что у С burnetii существует широкий диапазон экологической толерантности по отношению к температуре инкубирования инфицированной почвы (-20, +4, +20°С) Выживаемость возбудителя увеличивалась с уменьшением температуры независимо от типа почвы (табл 1)

С о р г ) %

Р и с 2 Зависимость выживаемости С burnetii от содержания органического углерода

черноземов при +20°С Примечание--значения выживаемости С burnetii в черноземах

Воронежской обл и ЦЧЗ (комментарии в тексте), прямая - трендовая линия обратно пропорциональной зависимости

Глава 4. Использование амеб для обнаружения потенциально патогенных бактерий в почвах

4.1. Разнообразие амебо-резистентных бактерий (АРБ) в почвах

Было выделено более 200 штаммов бактерий, количество которых после исключения повторов уменьшилось до 126 Проверка каждого штамма на цитопатогенный эффект в отношении амеб выявила 33 вида АРБ (табл 3, рис 3), не считая 4 некультивируемых клонов АРБ были обнаружены во всех изучаемых объектах Все выделенные АРБ принадлежат к четырем типам, семи классам и четырнадцати порядкам современной классификации бактерий (Берджи, 1997) Почвы и пески содержали приблизительно одинаковое количество АРБ (в среднем 4 3 и 5 видов на образец соответственно)

4.2. Лизис амеб и цнтопатогенные свойства изолятов

Из 11 образцов, подвергнутых инокуляции в амебах, один характеризовался завершенным лизисом через 3 дня, семь — завершенным или частичным амебным лизисом через 8 дней и последние три — сосуществованием амеб с бактериями

Таблица 3 Список и таксономическая классификация изолированных АРБ по результатам секвенирования гена 16S рРНК Виды, ранее описанные как патогены человека, выделены жирным шрифтом Отмечены проба обнаружения (цифрами обозначены номера образцов, буквами - серия обнаружения, более подробная информация содержится в тексте статьи) и литическая способность (L) каждого штамма в отношении амеб С (complete) - завершенный лизис через 24 часа, СЗ - завершенный лизис через 3 дня, С5 - завершенный лгоис через 5 дней, Р (partial) - частичный лизис через 5 дней, G (growth) - интра-амебный рост _ ______

Класс / Порядок Род-Вид % сходства по гену 16S рРНК с ближайшими последовательностями в GenBank (accession №) % сходства no rcny 16S pPHK с ближайшими официально оиисаниыми видами (accession JV») Ближайшие официальпо оинсаипые виды L / Проба

ALPHAPROTEOBACTERIA

Sphingomonadales Sphingomonas sp 99 (DQ337548) 98 (AF331660) Caulobacter leidyi G(7)

Rhizobiales Agrohactenum tumefaciens 99 (DQ468100) G(l)

Bradyrhizobium /apomcum 97 (AY117677) P(9E)

Caulobacterales Brevundimonas diminuta 99 (DQ857897) G(8)

BETAPROTEOBACTERIA

Burkholdenales Comamonas aquatica 99 (DQ1873 85) G(5)

Delftia sp 100 (FF061135) 99 (DQ356901) Delftia tsuruhatensis G(4)

Delftia actdovorans 99 (DQ530074) G(4)

Delftia tsuruhatensis 99 (AY302438) G(2E)

GAMMAPROTEOBACTERIA

Aeromonadales Aeromonas eucrenopbila 99(AJ458411) P(6)

Aeromonas salmomcida 99 (AM296510 G (5)

Pseudomonadales Acinetobacter /umi 97-100 (AMI 84279) G (4CV, 9CV)

Acinetobacter calcoaceticus 99 (AJ888984) G (1CV, 5)

Pseudomonas aeruginosa 99-100 (EF051248) С (5CV, 6E, 9)

Pseudomonas alcahgenes 99 (AF390747) G (3E, 4CV)

Pseudomonas fulva 99 (AM411071) C5 (2)

Pseudomonas mendocina 100 (DQ641475) G (6CV)

Pseudomonas plecoglossicida 100 (DQ140383) G(10, 11)

Pseudomonas putida 99-100 (AF094745) СЗ (1, 5, 6CV)

Enterobactenalcs Enterobacter cloacae 99 (Y17665) G(2, 3E)

Klebsiella varucola 99 (AJ783916) C5 (4E)

Serratia plymuthica 100 (DQ365586) I G(10CV)

Xanthomonadales Stenotrophomonas maltophilia 99(AJ293470) 1 P (4E, 11)

ACTINOBACTERIA

Actmomycetales Microbacterium oxydans 100 (AM286269) C5(7)

Rhodococcus equi 99 (AY741716) C5 (1)

Rothia dentocariosa 99 (AY546095) G (8CV)

Unclassified Actinobactena Actinobactenum sp 99 (AF348727) 98 (AY785738) Microbacterium oxydans C5 (8)

SPHINGO- /FLAVOBACTERIA

Sphmgobactenales Flexibacter canadensis 99 (AB078046) P(4E)

Sphingobactenum multtvorum 97 (AB100738) G (10)

Sphingobacterium sp 99 (DQ530064) 98 (AB100739) Sphingobactenu m multivorum G (2E, 7E, 8E, 9)

Flavobactenales Flavobacterium ¡ohnsoniae 97 (DQ530073) Flexibacter aurantiacus G(11CV)

BACILLI

Bacillalcs Bacillus cereus 99 (AF155958) P(2)

Staphylococcus pasteuri 99 (AJ717376) G(7)

Lactobacillales Streptococcus pneumoniae 99 (AY525795) G (8CV)

Таблица 4 Предлагаемые названия для новых видов бактерий и номера, присвоенные изолятам в базе ОепВапк, по результатам секвенирования гена 16Б рРПК

Тип Класс Поридок Род-Вид % сходства по гену 16S pPHK Предлагаемые имена GenBank access JV«

Proteo-bacteria Alpha Rhizobiales Bradyrhizobium ]apomcum 97 СаЫиЫдо "Bradyrhlzoblum пшзгЬеюи" EF203409

Gamma Pseudo-monadales Acinetobacter junu 97 Са1к1^а1ш "Аапе1оЬас1ег йтопепмз" EF203410

Bactcroidetes Flavobacteria Flavobacterium 1ohnsoniae 97 СагкМайк "Р1ауоЬа&егшт твУлЛеи4и" EF203412

Sphmgobacteria Sphingobacterium multivorum 97 Candldatus "БрЫпкоЬааепит та55111еп51я" EF203411

О 02 зиЬзйййюп рег вйе

X У с&а*** ^

Вга4угНиоЪшт]аротисит

йЬфососсшрпеитотае

еп:

Я 1 N С О 3 1

£ ю ОС о хл &

1 Сй Чп

о?

Р и с 3 Филогенетическое дерево, показывающее положение всех выделенных АРБ Построено с помощью метода "пе^Ызог^отич?" на основании сегмента (1000 пар нуктеотидов) гена 168 рРНК Таксономические и предлагаемые имена для кандидатов указаны на концах веток Имена, содержащие числовые характеристики, не упоминаются в тексте

Двенадцать из 33 изолированных штаммов (~36%) приводили к лизису амеб один через 24 часа, 1 через 3 дня, 5 через 5 дней и 5 видов приводили к частичному лизису амеб через 5 дней Все эти штаммы были выделены из семи образцов, исследование которых на первоначальном этапе выявляло лизис Исключение составил образец №3, собранный у одной из больниц, для которого констатировали частичный лизис через 8 дней на стадии цельного образца, но ни один из выделенных штаммов не приводил к лизису амеб Для данного образца соответственно было произведено клонирование

Остальные штаммы (21) обнаруженных АРБ (~64%) демонстрировали интра-амебный рост без выраженного лизиса 4.3. Идентификация изолятов

Основная масса штаммов (30 из 33) - грамотрицательные бактерии Полученные последовательности гена 16S рРНК позволили достоверно идентифицировать 29 изолятов (99% сходства с известными видами), четыре изолята имели сходство по гену rrs <97% с известными видами (табл 4) Идентификация штамма Streptococcus pneumoniae (по rrs) была подтверждена секвенированием части гена гроВ (720 н п., 99% сходства) Один из штаммов являлся представителем рода Klebsiella, однако был одинаково близок ик^ varucola, и к К singaporensis (при сравнении последовательностей гена 16S рРНК) Эти данные были подтверждены секвенированием части гена гроВ

Количество изолированных АРБ, ранее описанных как патогены человека, было также практически равным для почвенных и песчаных образцов (в среднем 2 8 и 2 3 вида на образец соответственно) Максимальное их количество (4 вида) было выделено из образцов № 1, 4 и 6, отобранных около университета, в сквере и центральном парке соответственно

Идентификация клонов, полученных из единственного образца, в котором, несмотря на выявление лизиса на первичном этапе, не было получено лизирующих штаммов, привела к обнаружению генов rrs, принадлежащих четырем различным бактериям, имеющим 99% сходство с генами некультивируемых бактерий, которые зарегистрированы в GenBank под

обозначениями «uncultured bacterium clone DSSD88», «S-Rwb_56», «156ds20», и «KD3-117»

4.4. Выделение нового вида

Помимо всех перечисленных штаммов АРБ (включая 4 штамма, которые могут представлять новые виды), был выделен штамм (образец 4CV), имеющий 94% сходство по гену rrs к Acinetobacter tandou По результатам последующего секвенирования всего гена гроВ данного изолята было получено 94,9% сходства к выше указанному виду (рис 4), что дает основание заключить, что этот изолят является новым видом

Дополнительные исследования, необходимые для официального описания нового вида (ДНК-ДНК гибридизация, секвенирование генов гесА и gyrB) находятся в стадии выполнения

Genomic species 9 A Iwoffl A schmdkri

A bouvetu A johnsonu

towneri

94,9%

H30JIAT

A tandou A gerneri

Genomic spccies 10 A baylyi 1001— Genomic species 11 A calcoaceticus Genomic spccics 3 A baumann

Genomic species 6 t grimoi A jurni A haemolyticus A tjernbergiae Genomic species 13 Genomic species 16 A parvus A ursingu

-A radioresistense

P и с 4 Филогенетическое дерево, показывающее положение выделенного нового вида Acinetobacter среди других представителей рода Построено с помощью метода "neighbor-joining" на основании полных последовательностей гена гроВ Значения показателей "bootstrap" вычислены из расчета на 100 повторений

4.5. Удельная поверхность почвы и адгезия бактерий (сравнение методик)

Результаты свидетельствуют, что оригинальная «французская» методика превосходит как свой аналог с дополнительно введенным 5цм-фильтром, так и «российский» вариант подготовки пробы к анализу (табл 5), при этом «российская» методика по количеству выделенных штаммов уступает и второй из «французских» методик

Заслуживает внимания то обстоятельство, что для образцов №7 и 8 количество выделенных штаммов (8 и 9 соответственно) по всем трем методикам совпадало Сопоставление количества выделенных штаммов с удельной поверхностью почвенных и песчаных образцов (табл 5) наталкивает на вывод о существующей корреляции между этим почвенным свойством и способностью бактерий, адгезированных на поверхности почвенных частиц, переходить в водный раствор

Таблица 5 Свойства почв и песков, используемых для обнаружения АРБ, и количество выделенных штаммов с помощью различных методик подготовки пробы к анализу ФО -«французская» оригинальная, ФМ - «французская» модифицированная, Р - «российская» методики Образцы городских почв и песков, отобранные 1 - около университета, 2, 3 -около больниц, 4 - в сквере у резиденции медсестер, 5 - на площадке для детских игр в центральном парке, 6 - в аллее центрального парка, 7, 8 - на пляжах, 9 - на учебной ферме, 10 - в городском парке, 11 - около вокзала

№ образца рН водный Сорг, % 8, м*/г ФО ФМ Р

1 6 78 3 34 7 52 13 7 5

2 6 67 3 25 6 23 15 8 6

3 7 10 2 40 12 64 8 4 3

4 6 53 3 36 5 39 18 10 8

5 6 12 3 30 2 63 11 9 7

б 6 47 3 28 3 46 10 7 5

7 6 95 6 38 0 60 8 8 8

8 6 93 5 58 0 44 9 9 9

9 6 34 2 32 5 48 16 10 7

10 7 21 7 99 8 84 12 6 4

11 7 06 3 34 18 05 6 3 2

Данная корреляция прослеживается в том, что при более высоких показателях удельной поверхности меньшее количество штаммов бактерий

переходит в жидкую фазу, в то время как при низких значениях того же показателя в раствор переходит их повышенное количество (рис 5) Именно поэтому для песчаных образцов №7 и 8 с удельной поверхностью 0 60 и 0 44 м2/г соответственно количество штаммов бактерий по всем трем методикам совпадало

Использование дополнительного 5цм-фильтра способствует удалению фракции 5-40 цм, что, как мы видим, приводит к уменьшению количества выделяемых штаммов

§ 20 -

S 15 ■ =

S 10

z о

в в.

же ж

0,00

5,00

10,00 S, м'/г

15,00

В "французская' оригинальная

ф "французская" модифицированы 1я

Ж "российская' методики

20,00

Р и с 5 Зависимость количества выделенных штаммов АРБ от удельной поверхности почвы

Глава 5. Особенности выживания патогенных бактерий в почвах (Обсуждение результатов)

Проведенные исследования выявили, что почва - благоприятная среда для выживания в ней С burnetii в течение не менее 20 дней С точки зрения формы протекания инфекционного процесса, вызванного С burnetii, можно отметить, что она в целом была характерной для лабораторных мышей (Rehacek, Tarasevich, 1988)

Различия в свойствах изучаемых почв (дерново-подзолистой, серой лесной, каштановой и болотной) не оказали существенного влияния на выживаемость патогенного микроорганизма при -20, +4, +20°С (п=5, р=95%) Однако, полученные данные указывают на то, что выживаемость С burnetii в

черноземе при +20°С связана обратно пропорциональной зависимостью с содержанием в нем органического вещества При этом наиболее сильное влияние на выживаемость данного возбудителя в почве, по всей видимости, оказывает активная (легче разрушающаяся) часть гумуса, которая и обуславливает повышенную адсорбционную способность в отношении С burnetii, приводящую к уменьшению количества доступных жизнеспособных патогенных бактерий в черноземе по сравнению с другими почвами Наши выводы согласуются с результатами, полученными Д Г Звягинцевым по адсорбции Staphylococcus aureus и Pseudomonas руосуапеа на прокаленном или обработанном пергидролем черноземе (Звягинцев, 1970)

Причина ранее отмеченного незначительного различия в выживаемости С burnetii в черноземах Воронежской обл и ЦЧЗ, вероятно, кроется во внутренней специфике органического вещества этих почв и, возможно, объясняется различной гидрофобностью их органического вещества В настоящее время установлено, что максимальное прикрепление клеток наблюдается в системах, в которых и клетки, и сорбенты гидрофобны (Кайырманова и др, 2004) При этом важно отметить, что образцы черноземов Воронежской обл были отобраны в местах наличия природного очага коксиеллеза, в то время как образец чернозема ЦЧЗ - в месте, где коксиеллез ни разу не регистрировался

С позиции влияния температуры почв на выживаемость С burnetii следует обратить внимание на тот факт, что отличия в выживаемости при +20 и +4°С являются статистически значимыми в трех почвах из пяти, а при +20 и -20°С - во всех пяти Таким образом мы полагаем, что при температуре -20°С имеет место консервация С burnetii в жизнеспособном состоянии, что приводит к увеличению выживаемости

В выявленной закономерности (обратно пропорциональной зависимости выживаемости С burnetii от содержания органического углерода) проявляется протекторная функция гумусовых веществ (Орлов, 1990), характеризующая санитарную роль почвы в биосфере

В последние годы коренным образом меняются взгляды на процессы, традиционно толковавшиеся как «отмирание» патогенных микроорганизмов во внешней среде вскрыты причины редкости и непродолжительности выделения культур из почв или водоемов Речь идет о переходе многих патогенных бактерий в некультивируемое состояние при обитании в почве (воде), что с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) удалось доказать как в экспериментах (иерсинии, листерии, сальмонеллы), так и обнаружением некультивируемых форм возбудителей псевдотуберкулеза, чумы и холеры в естественных почвах и водоемах очагов инфекций (Литвин и др , 1997)

Важным механизмом сохранения и распространения некоторых патогенных микроорганизмов является их выживание в простейших (в частности, в амебах) Эти бактерии способны противостоять фагоцитозу свободноживущих амеб и использовать их как хозяев (Molmeret et al, 2005) Таким образом, амебы представляют собой их природный резервуар, действуя как «Троянские кони» микробного мира (Barker и Brown, 1994)

Предполагается, что способность бактерий выживать внутри фагоцитирующих клеток (амеб) является предпосылкой для проявления патогенности Эта гипотеза подтверждается фактом подобного цитотоксического поведения и внутриклеточной репликации видов Legionella в макрофагах млекопитающих и в простейших, указывая на общий адаптивный механизм по отношению к интрацеллюлярным условиям (Harb et al, 2000) Более того, было обнаружено, что штаммы Acanthamoeba способны продуцировать Legionella-содержащие пузырьки, которые могут служить агентами трансмиссии легионеллеза Легионеллы являются наиболее изученными АРБ, но уже было продемонстрировано, что несколько ранее неизвестных АРБ также являются патогенами человека (Greub et al, 2004, La Scola et al, 2001, La Scola et al, 2003)

Представленные результаты позволяют заключить, что амебная со-культура является подходящим методом для скрининга почв на наличие амебо-резистентных бактерий В настоящем исследовании все выдсаенные АРБ принадлежали к Proteobactena, Actinobacteria, Bacteroidetes и Firmicutes

В таксономии почвенных бактерий известно, что обозначенные четыре типа вместе с пятью другими (Acidobacteria, Verrucomicrobia, Chloroflexi, Planctomycetes и Gemmât imonadetes) являются доминантными в почвенных библиотеках генов 16S рРНК Их члены составляют в среднем 92% почвенных обитателей (Janssen, 2006) Как и ожидалось, подавляющее большинство изолятов имеют >99% сходства по гену 16S рРНК с ранее охарактеризованными видами Однако 4 выделенных штамма - виды, имеющие <97% сходства по этому гену с известными видами или родами (Acinetobacter junu, Bradyrhizobium japonicum, Flavobacterium johnsomae и Sphingobacterium multivorum) Эти изоляты, вероятнее всего, представляют собой новые виды/роды (Stackebrandt, Goebel, 1994, Stackebrandt, Ebers, 2006)

Обозначенный новый вид, для которого проведено секвенирование всего гена гроВ принадлежит к роду Acinetobacter Согласно определителю бактерий Берджи 1984 г (Juni, 1984) этот род относился к семейству Neissenaceae и включал один вид A calcoaceticus с двумя подвидами anitratus ssp и Iwofii ssp С современных позиций таксономии на основе изучения 16S рРНК и анализа рРНК-ДНК гибридизации в настоящее время род Acinetobacter отнесен к семейству Moraxellaceae (куда также включены роды Moraxella и Psychrobacter), порядку Pseudomonadales, классу Proteobacteria (табл 3) Сложнее обстоит дело с подразделением на виды Род Acinetobacter характеризуется гетерогенностью и содержит до 18 генетических видов (Зубков, 2003) Представители рода Acinetobacter способны вызывать септицемию, эндокардит, менингит, остеомиелит, инфекцию мочевых путей (Todar's Online Textbook of Bacteriology, TOTB) Дальнейшее изучение изолята должно помочь в определении его положения среди других генетических видов и патогенности для человека

При этом важно отметить, что в отличие от анализа почвенных библиотек генов 16S рРНК, методы культур открывают путь к характеристике таких изолятов

В нашем исследовании Pseudomonas aeruginosa способствовала максимально быстрому лизису амеб (табл 3) Патогенность данной бактерии

хорошо изучена - она является одним из самых распространенных возбудителей внутрибольничных инфекций, вызывая их в 28,7% случаев, при этом они потенциально более опасны, чем вызванные другими условно-патогенными микроорганизмами (Сидоренко и др, 1999) Способность Р aeruginosa противостоять фагоцитозу амеб была описана ранее (Wang & Ahearn, 1997), но настолько быстрый и полный лизис ни разу не регистрировался Было продемонстрировано, что патогенность данной бактерии для человека коррелирует с ее резистенцией к бактерицидному эффекту амеб (Fenner et al, 2006). Р putida также вызвала завершенный амебный лизис Этот факт ранее не регистрировался Р putida редко патогенна для человека, но часто обнаруживается в ассоциации с другими бактериями при инфекциях мочевых путей, септицемии и различных других заболеваниях (ТОТВ)

Pseudomonas fulva, Microbacterium oxydans, Rhodococcus equi, Actinobacterium sp и Klebsiella varucola (или К singaporensis) вызвали завершенный, но более медленный амебный лизис Члены рода Rhodococcus особенно R equi известные патогены для людей с ослабленным иммунитетом (ТОТВ) К variicola - недавно описанный вид, генетически отделившийся от К pneumoniae (Martinez et al, 2004) Здесь мы представляем первый случай выделения К varucola из почвы и обнаружения ее литической способности в отношении амеб Сегодня известно, что бактерии этого вида многочисленны в растениях и составляют менее 10% клинических изолятов Klebsiella, рассматриваемых ранее как К pneumoniae Считается, что К varucola лучше адаптируется к условиям окружающей среды, чем К pneumoniae и что ее растительные штаммы могут случайно инфицировать людей (Rosenblueth, 2004) Наш штамм одинаково близок к К varucola и К singaporensis (Li et al, 2004), но информация о К singaporensis была включена в базу GenBank только в июле 2006 года (без какой-либо корреляции с К varucola)

Aeromonas eucrenophila, Bacillus cereus, Flexibacter canadensis и Stenotrophomonas maltophilia вызвали частичный амебный лизис, также как и изолят, имеющий 97% сходства с Bradyrhizobium japonicum Их литическая

способность по отношению к амебам была обнаружена впервые Три из перечисленных бактерий могут рассматриваться как потенциальные патогены Патогенность В cereus для человека хорошо известна (ТОТВ) S maltophilia (ранее Pseudomonas maltophilia и Xanthomonas maltophilia) ассоциируются с различными (преимущественно внутрибольничными) инфекциями -бактериемия, менингит, раневая инфекция, инфекция мочевых путей, пневмония (ТОТВ) В 2000 году зарегистрирован первый случай выделения А eucrenophila от человека (Albert et al, 2000)

Выделение Streptococcus pneumoniae из песка, собранного на популярном пляже, - неожиданный результат, подтвердившийся при повторной инокуляции замороженного образца Это послужило доказательством того, что его выделение не явилось результатом контаминации на стадии инокуляции, однако, контаминацию во время отбора образца или его подготовки полностью исключить нельзя До сегодняшнего дня этот вид не рассматривается как обитатель окружающей среды Наш изолят был восприимчив к ванкомицину Его выделение из серии, содержащей коли- и ванкомицин подтверждает, что этот штамм рос как интрацеллюлярная бактерия внутри амеб, так как в противном случае он бы погиб от действия ванкомицина

Гены rrs, обнаруженные в почвенном образце и принадлежащие четырем различным некультивируемым бактериям, ранее обнаруживали в воде и фекалиях животных Так, некультивируемая бактерия «DSSD88» была идентифицирована в питьевой воде (Williams et al, 2004), она таксономически близка к Sphingomonas aromaticivorans (99% сходства) порядка Sphingomonadales (Alphaproteobacteria), «S-Rwb_56» - в проточной воде (Beier et al., 2005), близка к Denitrifying bacterium W125 (97% сходства, unclassified betaproteobacteria) «156ds20» впервые выделили из фекалий лошадей (Simpson et al., 2004), а «KD3-117» - помета пингвинов в Антарктике (Zhang et al, 2003), что примечательно, если вспомнить, что наш изолят был получен из образца почвы, собранной около больницы г Марселя По своей таксономии эти некультивируемые бактерии близки к гамма-протеобактерии IMCC1704 (98%

сходства, неклассифицированная Gammaproteobacteria) и Flexibacter sp 1-0-7 (93% сходства, Sphingobacteria, Bacteroidetes) соответственно

С точки зрения методических подходов, как показал наш эксперимент, оригинальная «французская» методика подготовки пробы для инокуляции в амебах (по сравнению с «российской» и нами модифицированной «французской») является наиболее результативной по количеству выделяемых штаммов бактерий Прослеженная нами корреляция между удельной поверхностью почвы и количеством бактерий, адгезированных на почвенных частицах, согласуется с известным положением о прямо пропорциональной зависимости между количеством адгезированных клеток и величиной поверхности (Звягинцев, 1987) с небольшим отклонением для малых величин удельной поверхности (см рис 5) При этом можно говорить о некотором оптимуме значений удельной поверхности для перехода адгезированных на почвенных частицах бактерий в жидкую фазу - в нашем случае он составляет ~5м2/г (табл 5, 6, рис 5) Заметная адгезия бактерий почвенной фракцией 5-40 мкм также согласуется с имеющимися в литературе данными (эксперимент Н С Карпинской с поглощением культуры Serratia marcescens различными по размерам частиц фракциями толченого кварцевого песка) о сильной адгезии бактериальных клеток фракцией 2-50 мкм (Звягинцев, 1987)

В целом известно, что на адгезию помимо удельной поверхности влияет целый ряд факторов - содержание гумуса, характер поглощенных катионов, pH (Звягинцев, 1987), что вполне объяснимо, учитывая их взаимозависимость Поэтому для характеристики влияния свойств почв на выживаемость патогенных бактерий мы используем понятие «органо-минеральной матрицы», подразумевая, что ее активность определяет способность бактерий к адгезии на почвенных частицах Таким образом, как показало настоящее исследование, уменьшение активности органо-минеральной матрицы (через снижение содержания органического вещества черноземов и удельной поверхности городских почв) приводит к увеличению выживаемости соответствующих патогенных бактерий в изучаемых почвах

Заключение

Трансмиссия микроорганизмов в окружающей среде определяется рядом факторов, как чисто экологических, так и внутрисистемных (Harvey, Harms, 2001) в данном случае, почвенных Подобная мультифакторность требует комплексного подхода с учетом максимального количества параметров Даже потенциально существующая возможность снижения риска возникновения эпидемии делает такое исследование практически значимым

Обнаруженная способность Coxiella burnetii выживать в почвах (в течение не менее 20 дней) при ведущем аспирационном пути передачи инфекции заставляет в некотором смысле по-другому взглянуть на очаги Q-лихорадки - обратить внимание эпидемиологов, экологов и просто людей на почву как еще на один фактор сохранения возбудителя При этом выявленная обратно пропорциональная зависимость выживаемости данного микроба от содержания в почве органического углерода позволяет разрабатывать экологические методы борьбы с его трансмиссией, снижая таким образом риск заражения людей в очаге

До сегодняшнего дня большинство моделей по изучению взаимодействия бактерий с простейшими были сфокусированы на водах больниц и стояков водного охлаждения Однако, как отмечено Snelling и др (2006), исследования структуры и последовательности генов 16S и 18S рРНК абсолютно необходимы для составления каталога разнообразия бактерий и простейших, населяющих как различные воды, так и различные типы почв Почва считается одной из сложнейших природных систем для жизни микробов, насчитывающей около 109 бактериальных клеток на грамм и ~104 различных видов (Crawford, 2005) Культивирование всего разнообразия видов пока представляется недосягаемой целью, так как дает такое огромное количество изолятов, которые невозможно индивидуально прокультивировать и определить (Janssen, 2006) Поэтому в случае с патогенными микроорганизмами необходим направленный метод, способствующий быстрому и эффективному их обнаружению в почвенной среде

По результатам, представленным в этой работе, мы можем заключить, что амебная со-культура является подходящим методом как для каталогизации почвенных микроорганизмов, с выделением редких и даже новых видов, так и для чисто практического скрининга почв на наличие потенциально патогенных микроорганизмов Интересно отметить, что С burnetii также сохраняется внутри свободно-живущих амеб (в течение 18 дней) (La Scola, Raoult, 2001), что указывает на возможность последних играть роль и в естественных почвенных условиях - предоставлять дополнительную нишу для выживаемости патогенных микроорганизмов

Подводя итоги, обратим внимание, что некоторые известные ранее факультативные патогены человека, выделяемые из почвы, являются АРБ, при этом почвы и пески в местах проживания человека содержат АРБ, являющиеся новыми видами бактерий

В будущем представляется необходимым исследовать другие типы почв, к примеру, расположенные в районах с более влажным климатом (по сравнению с сухим средиземноморским климатом Марселя) как с целью скрининга новых территорий на наличие потенциальных патогенов человека, так и для оценки разнообразия АРБ в разных природных зонах, а также расширить и углубить наши представления о роли температуры в вопросе выживаемости в почве патогенных микроорганизмов (Coxiella burnetii, в частности) и роли амеб в выживании коксиеллы в почвах

Выводы:

1. Почвы (дерново-подзолистая, серая лесная, чернозем, каштановая, болотная почва высокогорья и городские почвы) представляют собой биотоп, в котором выживают патогенные бактерии

2. Из 11 почвенных и песчаных объектов, расположенных в местах частого и массового пребывания людей, выделено 33 вида амебо-резистентных бактерий, 20 из которых - ранее описанные патогены человека

3. Спектр естественных почв, в которых может выживать Coxiella burnetii (возбудитель Q-лихорадки) не менее 20 дней, достаточно широк дерново-

подзолистая, серая лесная, чернозем, каштановая и болотная почва высокогорья

4. Выживаемость патогенных бактерий (Coxiella burnetii, АРБ) в почвах связана обратной зависимостью с активностью органо-минеральной матрицы при уменьшении содержания органического вещества (черноземы, +20°С) и удельной поверхности почв (городские почвы) выживаемость увеличивается

5. Обнаружено четыре потенциальных представителя новых видов/родов (типирование по гену rrs, сходство <97%) candidatus "Bradyrhizobium massihensis", "Acinetobacter timonensis", "Flavobacterium massiliensis" и "Sphingobacteriurn massiliensis'", а также новый вид рода Acinetobacter (секвенирование всего гена гроВ, сходство 94 9% к A tandoii) Полученные последовательности генов помещены в GenBank

6. Доказана применимость метода амебной со-культуры для скрининга почв на наличие потенциально патогенных бактерий

Основные положения работы отражены в следующих публикациях:

1 Evstigneeva A Survival of pathogenic microorganisms in soils by the example of Coxiella burnetii Italian-Russian Student Forum, Palermo, Italy, 23-26 July 2003 P 32

2 Евстигнеева А С , Карпачевский JI О , Тарасевич И В Почва как уникальный биотоп для выживания патогенных микроорганизмов (на примере коксиеллы Бернета) II Окружающая среда и здоровье Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов 19-22 мая 2005 г, Суздаль С 438-439

3 Евстигнеева А С , Комарова А И, Макарова В А, Фетисова Н Ф, Тарасевич ИВ Выживаемость Coxiella burnetii в почве // Журн микробиол 2005, 6 57 -59

4 Евстигнеева А С , Ульянова Т Ю , Тарасевич И В Выживаемость Coxiella burnetii в почвах // Почвоведение 2007,5 622-627

5 Evstigneeva A, Raoult D, Karpachevskiy L, В La Scola Isolation and identification of amoeba-resistant bacteria from soil using an amoeba co-culture procedure Emerg infect dis 2007 Принята в печать

Автор выражает большую благодарность ГУ НИИЭМ им Н Ф Гамалеи в лице ее директора академика РАМН А Л Гинцбурга и руководителя лаборатории экологии риккетсий академика РАМН И В Тарасевич за предоставленную возможность выполнения данной работы и ценные научные консультации, а также руководителю Центра ВОЗ Средиземноморского Университета, профессору Д Раулю и профессору Б Ла Скола за содействие в проведении эксперимента

Подписано в печать 20 04 2007 г Исполнено 20 04 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 427 Тираж 75 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» И1Ш 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Евстигнеева, Анна Сергеевна

ГЛАВА 1. ПОЧВА КАК БИОТОП ДЛЯ ВЫЖИВАНИЯ 10-35 ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ

1.1. Роль почвы в возникновении эпидемий 10

1.2. Патогенные бактерии, обнаруживаемые в почвах 15

1.3. Факторы, определяющие выживаемость патогенных 18-25 микроорганизмов в почвах

1.4. Coxiella burnetii и Q-лихорадка 25

1.5. Свободноживущие амебы и потенциально патогенные 31-35 микроорганизмы

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 36

2.1. Структура исследования (модель экспериментов) 36

2.1.1. Определение выживаемости Coxiella burnetii в почвах 36

2.1.2. Обнаружение амебо-резистентных бактерий (АРБ) в 38-39 почвах

2.2. Объекты исследования 40

2.2.1. Почвы, используемые для определения выживаемости 40-41 Coxiella burnetii

2.2.2. Почвы, используемые для обнаружения АРБ 41

2.3. Методы исследования 42

2.3.1. Методика почвенных исследований 42

2.3.2. Иммунофлуоресцентный анализ

2.3.3. Co-культура амеб 45

2.3.3.1. Подготовка образцов. «Российская» и «французская» 45-46 методики

2.3.3.2. Инокуляция образцов в культуру амеб 46

2.3.3.3. Наблюдение за со-культурой

2.3.3.4. Выделение и морфологическая идентификация 48-49 штаммов

2.3.3.5. Цитопатогенный эффект 49

2.3.3.6. Клонирование 50

2.3.3.7. Молекулярная идентификация изолятов 52-

ГЛАВА 3. ВЫЖИВАЕМОСТЬ COXIELLA BURNETII 54-58 В ПОЧВАХ

3.1. Выживаемость С. burnetii в почвах различных типов 54

3.2. Влияние свойств почв на выживаемость С. burnetii 56-

ГЛАВА 4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АМЕБ ДЛЯ 59-71 ОБНАРУЖЕНИЯ ПОТЕНЦИАЛЬНО ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ В ПОЧВАХ

4.1. Разнообразие амебо-резистентных бактерий (АРБ) в почвах

4.2. Лизис амеб и цитопатогенные свойства изолятов 60

4.3. Идентификация изолятов 61

4.4. Выделение нового вида 63

4.5. Удельная поверхность почвы и адгезия бактерий 65-66 (сравнение методик)

ГЛАВА 5. ОСОБЕННОСТИ ВЫЖИВАНИЯ 72-82 ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ В ПОЧВАХ (ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ)

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выживаемость патогенных бактерий в почвах"

Актуальность темы

Теоретическая предпосылка настоящей работы - проблема сохранения в разных почвах патогенных микроорганизмов. Естественные почвы обычно обладают самоочищающей способностью (Мишустин и др., 1979). Она определяется комплексом почвенных свойств, препятствующих сохранению в почвах большинства возбудителей болезней. Однако современное техногенное воздействие на почву приводит к быстрому расширению спектра патогенных агентов человека, выживающих в объектах окружающей среды. Создание таких условий заложено в самом техническом прогрессе, когда появляются многочисленные разнообразные новые местообитания и экологические ниши, весьма благоприятные для потенциально патогенных микроорганизмов на фоне неуклонного снижения иммунных барьеров человека (Литвин и др., 1997).

Для оценки патогенной опасности почвенных объектов важно, чтобы используемый метод позволял провести быстрый и точный скрининг почвы на наличие потенциально патогенных микроорганизмов. Когда речь идет об уменьшении риска заболевания человека, именно быстрота обнаружения и точность определения патогена выходят на первый план.

Цель работы

Задачи исследования

1) Определить выживаемость С. burnetii в исследуемых почвах после инокуляции в эксперименте.

2) Оценить динамику количества С. burnetii в различных почвах при разных температурах.

3) Выделить амебо-резистентные бактерии (АРБ) из почвенных и песчаных объектов, расположенных в местах частого и массового пребывания людей.

4) Дать характеристику выделенным АРБ методом построения филогенетического дерева.

5) Выявить почвенные свойства, влияющие на выживаемость патогенных бактерий в почве.

6) Провести оценку применимости метода амебного со-культивирования для скрининга почв на наличие амебо-резистентных бактерий.

Защищаемые положения

1. Патогенные бактерии (С. burnetii, АРБ) выживают (сохраняют жизнеспособность) в почвенной среде, в почвах разных типов в течение длительного времени.

2. Выживаемость патогенных бактерий (С. burnetii, АРБ) в почвах связана обратной зависимостью с активностью органо-минеральной матрицы: при уменьшении содержания органического вещества (черноземы, +20°С) и удельной поверхности почв (городские почвы) выживаемость увеличивается.

3. Метод амебного со-культивирования позволяет выявлять наличие в почвах потенциально патогенных бактерий и обнаруживать новые виды.

Научная новизна

Проведенное исследование позволило выделить из почвенных и песчаных объектов, расположенных в местах частого и массового пребывания людей, 33 вида потенциально патогенных бактерий, многие из которых ранее не выделяли из почвенной среды.

Обнаружены 4 потенциальных представителя новых видов/родов (типирование по гену rrs, сходство <97%), а также новый вид рода Acinetobacter (секвенирование всего гена гроВ, сходство 94.9%), идентифицированные последовательности генов которых помещены в GenBank.

Впервые определена выживаемость патогенной у-протеобактерии С. burnetii в разных почвах (дерново-подзолистой, серой лесной, черноземе, каштановой и болотной почве высокогорья), которая составляет не менее 20 дней.

Установлено, что из всех почвенных свойств наибольшее ингибирующее влияние на выживаемость С. burnetii в черноземе оказывает содержание органического углерода: выживаемость С. burnetii в черноземе при +20°С уменьшается при увеличении содержания органического углерода.

Показано, что у коксиеллы существует широкий диапазон экологической толерантности по отношению к температуре почвы (от -20 до +20°С), при этом количество сохранившихся в почве коксиелл увеличивается с уменьшением температуры независимо от типа почвы, а при температуре исследуемых почв -20°С имеет место консервация С. burnetii в жизнеспособном состоянии.

Научно-практическая ценность и реализация результатов работы

Полученные данные свидетельствуют о том, что почвы и пески в местах частого и массового пребывания людей содержат потенциально патогенные для человека бактерии.

Увеличение содержания органического углерода в черноземах способствует снижению выживаемости С. burnetii, возбудителя Q-лихорадки.

Автор выражает большую благодарность ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи в лице его директора академика РАМН A.JI. Гинцбурга и руководителя лаборатории экологии риккетсий академика РАМН И.В. Тарасевич за предоставленную возможность выполнения данной работы и ценные научные консультации, а также руководителю Центра ВОЗ Средиземноморского Университета, профессору Д. Раулю и профессору Б. Jla Скола за содействие в проведении эксперимента.

Заключение Диссертация по теме "Почвоведение", Евстигнеева, Анна Сергеевна

выводы

3. Спектр естественных почв, в которых может выживать Coxiella burnetii (возбудитель Q-лихорадки) не менее 20 дней, достаточно широк: дерново-подзолистая, серая лесная, чернозем, каштановая и болотная почва высокогорья.

4. Выживаемость патогенных бактерий (Coxiella burnetii, АРБ) в почвах связана обратной зависимостью с активностью органо-минеральной матрицы: при уменьшении содержания органического вещества (черноземы, +20°С) и удельной поверхности почв (городские почвы) выживаемость увеличивается.

5. Обнаружено четыре потенциальных представителя новых видов/родов (типирование по гену rrs, сходство <97%): candidatus "Bradyrhizobium massiliensis", "Acinetobacter timonensis", "Flavobacterium massiliensis" и "Sphingobacterium massiliensis", а также новый вид рода

Acinetobacter (секвенирование всего гена гроВ, сходство 94.9% к А. tandoii). Полученные последовательности генов помещены в GenBank. 6. Доказана применимость метода амебной со-культуры для скрининга почв на наличие потенциально патогенных бактерий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Трансмиссия микроорганизмов в окружающей среде определяется рядом факторов, как чисто экологических, так и внутрисистемных (Harvey, Harms, 2001) в данном случае, почвенных. Подобная мультифакторность требует комплексного подхода с учетом максимального количества параметров. Даже потенциально существующая возможность снижения риска возникновения эпидемии делает такое исследование практически значимым.

Обнаруженная способность Coxiella burnetii выживать в почвах (в течение не менее 20 дней) при ведущем аспирационном пути передачи инфекции заставляет в некотором смысле по-другому взглянуть на очаги Q-лихорадки - обратить внимание эпидемиологов, экологов и просто людей на почву как еще на один фактор сохранения возбудителя. При этом выявленная обратно пропорциональная зависимость выживаемости данного микроба от содержания в почве органического углерода позволяет разрабатывать экологические методы борьбы с его трансмиссией, снижая таким образом риск заражения людей в очаге.

До сегодняшнего дня большинство моделей по изучению взаимодействия бактерий с простейшими были сфокусированы на водах больниц и стояков водного охлаждения. Однако, как отмечено Snelling и др. (2006), исследования структуры и последовательности генов 16S и 18S рРНК абсолютно необходимы для составления каталога разнообразия бактерий и простейших, населяющих как различные воды, так и различные типы почв. Почва считается одной из сложнейших природных систем для жизни микробов, насчитывающей около 109 бактериальных клеток на грамм и ~104 различных видов (Crawford, 2005). Культивирование всего разнообразия видов пока представляется недосягаемой целью, так как дает такое огромное количество изолятов, которые невозможно индивидуально прокультивировать и определить (Janssen, 2006). Поэтому в случае с патогенными микроорганизмами необходим направленный метод, способствующий быстрому и эффективному их обнаружению в почвенной среде.

По результатам, представленным в этой работе, мы можем заключить, что амебная со-культура является подходящим методом как для каталогизации почвенных микроорганизмов, с выделением редких и даже новых видов, так и для чисто практического скрининга почв на наличие потенциально патогенных микроорганизмов. Интересно отметить, что С. burnetii также сохраняется внутри свободно-живущих амеб (в течение 18 дней) (La Scola, Raoult, 2001), что указывает на возможность последних играть роль и в естественных почвенных условиях - предоставлять дополнительную нишу для выживаемости патогенных микроорганизмов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Евстигнеева, Анна Сергеевна, Москва

1. Аринушкина Е.В. Руководство по химическому анализу почв. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1972.

2. Барбан П.С., Пшеничнов Р.А., Пантюхина А.Н., Ившина И.Б. Иммунофлуоресцентный анализ. Свердловск, 1988.

3. Воронкевич И.В. Выживаемость фитопатогенных бактерий в природе. М., 1974.

4. Друганова Л.П. Эпидемиология лихорадки Ку в ЦЧР. Дисс. . канд. мед. наук. М., 1985.

5. Дубровский Ю.А., Шустрова Н.М., Кузнецов Г.Г. Ассоциации энтеробактерий и неферментирующих микроорганизмов зимних гнезд обыкновенных полевок и поверхности почвы в бесснежную половину года // Бюлл. МОИП, отд. биол. 1990. 95(4): 28-35.

6. Звягинцев Д.Г. Почва и микроорганизмы. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1987.

7. Звягинцев Д.Г. Адсорбция микроорганизмов почвой и ее влияние на их жизнедеятельность. Дисс. . докт. биол. наук. М., 1970.

8. Здродовский П.Ф. Ку-лихорадка. М., 1955.

9. Здродовский П.Ф., Голиневич Е.М. Ку-лихорадка // Учение о риккетсиях и риккетсиозах. М.: Медгиз, 1972.

10. Зубков М.Н. Неферментирующие бактерии. Acinetobacter spp.: таксономия и классификация, характеристика, клиническое значение, идентификация, антибиотикорезистентность // Инф. и антимикроб, терап. 2003, 2. Доступно на: http://www.consilium-medicum.com/

11. Кайырманова Г.К., Шупшибаев К.К., Абишева К.К., Баубекова А .С. Изучение взаимосвязи гидрофобности дрожжевых клеток с их сорбционной активностью в отношении различных носителей, 2004. Доступно на: http://www.kazsu.kz/articles/bio/23article.htm.

12. Касьяненко A.M., Вернер О.М., Завирюха А.И., Синяк К.М. Характеристика почв в стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктах // Журн. микробиол. 1984,1: 90-95.

13. Классификация патогенных для человека микроорганизмов. Приложение 5.1. Безопасность работы с микроорганизмами I II групп патогенности. Госкомсанэпиднадзор России. М., 2003.

14. Кравченко А.Т., Шишулина JI.M. Распространение возбудителей ботулизма и столбняка на территории СССР. М., 1970.

15. Куделина Р.И. Фазовые варианты риккетсий Бернета и их значение для диагностики и профилактики лихорадки Ку. Дисс. . докт. мед. наук. М., 1970.

16. Литвин В.Ю., Гинцбург A.JI., Пушкарева В.И., Романова Ю.М., Боев Б.В. Эпидемиологические аспекты экологии бактерий. М., 1997.

17. Максименкова И.А., Карпачевский JI.O. Характеристика почв природного очага лептоспирозов, псевдотуберкулеза и кишечногого иерсиниоза//Почвоведение. 1985, 10: 107-115.

18. Максименкова И.А., Литвин В.Ю. Влияние некоторых почвенных факторов на динамику численности псевдотуберкулезного микроба // Вопросы микробиол., патогенеза и лабораторной диагностики иерсиниозов. Новосибирск, 1985.

19. Милановский Е.Ю., Шеин Е.В. Функциональная роль амфифильных компонентов гумусовых веществ в процессах гумусо-структурообразования и в генезисе почв // Почвоведение. 2002, 10: 1201-1213.

20. Мишустин Е.Н., Перцовская М.И., Горбов В.А. Санитарная микробиология почвы. М., 1979.

21. Найштейн С .Я., Тарков М.И., Меренюк Г.В., Тимченко Л.А. Актуальные вопросы гигиены почвы. Кишинев, 1975.

22. Никульшин С.В., Онацкая Т.Г., Луканина Л.М. и др. Изучение ассоциаций почвенных амеб Hartmanella rhysodes с бактериями -возбудителями чумы и псевдотуберкулеза в эксперименте // Журн. микробиол. 1992, 9-10: 2-4.

23. Онищенко Г.Г., Монисов А.А., Гульченко Л.П., Федоров Ю.М. Заболеваемость зооантропонозными и природноочаговымиинфекциями и меры по их профилактике // Журн. микробиол. 1999, (4): 14-18.

24. Орлов Д.С. Гумусовые кислоты почв и общая теория гумификации. М, 1990.

25. Пиковская Р.И., Рцхиладзе С.И., Гелашвили М.Г. К вопросу о самоочищающих свойствах основных типов почв Грузинской ССР.-Гигиена и санитария, 1956, №1.

26. Проблемы коксиеллеза на рубеже третьего тысячелетия. НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, 2002. Доступно на: http:// www. pasteur. socspb. ru/ news/publication/2002/04/05/events9442/

27. Пушкарева В.И. Патогенные бактерии в почвенных и водных сообществах (экспериментально-экологическое исследование). Автореф. дисс. . докт. биол. наук. М., 1994.

28. Пушкарева В.И. Экспериментальная оценка взаимодействия Yersinia pestis с почвенными инфузориями и возможности длительного сохранения бактерий в цистах простейших // Журн. микробиол. 2003, 4: 40-44.

29. Романова Ю.М. Некультивируемое состояние у патогенных бактерий на модели Salmonella typhimurium: феномен и генетический контроль. Автореф. дисс. докт. биол. наук. М., 1997.

30. Сидоренко С.В., Резван С.П., Стерхова Г.А., Грудинина С.А. Госпитальные инфекции, вызванные Pseudomonas aeruginosa. Распространение и клиническое значение антибиотикорезистентности // Антибиотики и химиотерапия. 1999, 3: 25-34.

31. Сомов Г.П., Литвин В.Ю. Сапрофитизм и паразитизм патогенных бактерий. Новосибирск: Наука, 1988.

32. Тарасевич И.В. Коксиеллез (лихорадка Ку). Частная эпидемиология. Т.2. М., 2002.

33. Терских В.И. Сапронозы. (О болезнях людей и животных, вызываемых микробами, способными размножаться вне организма во внешней среде, являющейся для них местом обитания) // Журн. микробиол. 1958. (8): 118-122.

34. Федотов Г.Н., Добровольский Г.В., Путляев В.И., Гаршев А.В., Иванов В.К., Пахомов Е.И. Гелевые структуры в почвах // Почвоведение. 2006, 7: 824-835

35. Федотов Г.Н., Путляев В.И., Гаршев А.В., Иванов В.К., Пахомов Е.И., Баранчиков А.Е. Органо-минеральные гели почв и оценка возможности получения подобных структур диспергационными методами // Доклады по экологическому почвоведению. 2006, 1: 116.

36. Шеин Е.В., Милановский Е.Ю. Роль и значение органического вещества в образовании и устойчивости почвенных агрегатов // Почвоведение. 2003,1: 53-61.

37. Шустрова Н.М., Дубровский Ю.А. Природные резервуары условно-патогенных бактерий // Потенциально патогенные бактерии в природе. М., 1991-6. С. 30-42.

38. Abd Н, Weintraub A, Sandstrom G (2005) Intracellular survival and replication of Vibrio cholerae 0139 in aquatic free-living amoebae. Environ Microbiol 7: 1003-1008.

39. Adekambi T, Reynaud-Gaubert M, Greub G, Gevaudan MJ, La Scola B, Raoult D, Drancourt M (2004) Amoebal coculture of "Mycobacterium massiliense" sp. nov. from the sputum of a patient with hemoptoic pneumonia. J Clin Microbiol 42: 5493-5501.

40. Adeleke AA et al. (2001) Legionella drozanskii sp. nov., Legionella rowbothamii sp. nov. and Legionella fallonii sp. nov.: three unusual new Legionella species. Int J Syst Evol Microbiol 51: 1151-1160.

41. Arricau-Bouvery N, Rodolakis A (2005) Is Q fever an emerging or re-emerging zoonosis? Vet. Res. 36: 327-349.

42. Barker J & Brown MRW (1994) Trojan horses of the microbial world: protozoa and the survival of bacterial pathogens in the environment. Microbiology 140: 1253-1259.

43. Beier S, Witzel KP, Marxsen J (2005) Bacterial community composition in Central European running waters examined by TGGE and sequence analysis of 16S rDNA. Unpublished.

44. Birtles RJ, Rowbotham TJ, Michel R, Pitcher DG, La Scola B, Alexiou-Daniel S, Raoult D (2000) 'Candidatus Odyssella thessalonicensis' gen. nov., sp. nov., an obligate intracellular parasite of Acanthamoeba species. IntJ Syst Evol Microbiol 50:63-72.

45. Brown MRW & Barker J (1999) Unexplored reservoirs of pathogenic bacteria: protozoa and biofilms. Trends Microbiol 7: 46-50.

46. CDC. Available from: http://www.cdc.gov/agent/agentlist.asp.

47. Crawford RL (2005) Microbial diversity and its relationship to planetary protection. Appl Environ Microbiol 71: 4163-4168.

48. Cutler SJ, Paiba GA, Howells J, Morgan KL (2002) Q fever a forgotten disease? Lancet Infect Dis. 2: 717-718.

49. Dasch GA, Weiss E (2000) Coxiella burnetii as a Bioterrorist Agent. //Topley and Wilson's Microbiology and Microbiological Infections, New York, p. 78-87.

50. Daoud Z, Cocozaki A, Hakime N (2006) Antimicrobial susceptibility patterns of Haemophilus influenzae and Streptococcus pneumoniae isolates in a Beirut general university hospital between 2000 and 2004. Clin Microbiol Infect 12: 86-90.

51. Davis GE, Cox HR (1938) A filter passing infections agent isolated from ticks. Isolation from Dermacentor Andersoni, reactions in animals and filtrations experiments. Pub Health Rep 53: 2259-2261.

52. Derrick EH (1937) Q-fever a new entity. Clinical features, diagnosis and laboratory investigation. Med J Aust 2: 281-299.

53. Derrick EH (1939) Rickettsia burneti. The cause of a Q-fever. Med J Aust 1: 14.

54. Drancourt M, Roux V, Fournier PE, Raoult D (2004) rpoB gene sequence-based identification of aerobic gram-positive cocci of the genera

55. Streptococcus, Enterococcus, Gemella, Abiotrophia, and Granulicatella. J Clin Microbiol 42: 497-504.

56. Dworkin MS, Ma X, Golash RG (2002) Fear of bioterrorism and implications for public health preparedness. Available from: http:// www.cdc.gov/ncidod/EID/vol9no4/02-0593.htm.

57. Fenner L, Richet H, Raoult D, Papazian L, Martin C, La Scola В (2006) Are clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa more virulent than hospital environmental isolates in amebal co-culture test? Crit Care Med 34: 823-828.

58. Garcia MM & McKay KA (1970) Pathogenic microorganisms in soil: an old problem in a new perspective. Can J Comp Med 34: 105-110.

59. Greub G & Raoult D (2003) Rhodobacter massiliensis sp. nov., a new amoebae-resistant species isolated from the nose of a patient. Res Microbiol 154: 631-635.

60. Greub G & Raoult D (2004) Microorganisms resistant to free-living amoebae. Clin Microbiol Rev 17: 413-433.

61. Greub G, La Scola B, Raoult D (2004) Amoebae-resisting bacteria isolated from human nasal swabs by amoebal coculture. Emerg Infect Dis 10: 470-477.

62. Haas W, Kaushal D, Sublett J, Obert C, Tuomanen EI (2005) Vancomycin stress response in a sensitive and a tolerant strain of Streptococcus pneumoniae. J Bacterid 187: 8205-8210.

63. Harakeh S, Yassine H, El-Fadel M (2006) Antimicrobial-resistance of Streptococcus pneumoniae isolated from the Lebanese environment. Mar Environ Res 62: 181-193.

64. Janssen PH (2006) Identifying the dominant soil bacterial taxa in libraries of 16S rRNA and 16S rRNA genes. Appl Environ Microbiol 72: 17191728.

65. Juni E (1984) Bergey's manual of systematic bacteriology// Eds. N.R.Krieg, J.G.Holt. Baltimore: Willam& Willcins Co. 9th ed., V.l: 303-307.

66. Koide M, Arakaki N, Saito A (2001) Distribution of Legionella longbeachae and other legionellae in Japanese potting soils. Infect Chemother 7: 224-227.

67. La Scola В, Raoult D (2001) Survival of Coxiella burnetii within free-living amoeba Acanthamoeba castellanii. Clin Microbiol Infect 7: 75-79.

68. La Scola B, Michel G, Raoult D (1997) Use of amplification and sequencing of the 16S rRNA gene to diagnose Mycoplasma pneumoniae osteomyelitis in a patient with hypogammaglobulinemia. Clin Infect Dis 24: 1161-1163.

69. La Scola B, Barrassi L, Raoult D (2000) Isolation of new fastidious alpha. Proteobacteria and Afipia felis from hospital water supplies by direct plating and amoebal co-culture procedures. FEMS Microbiol Ecol 34: 129-137.

70. La Scola B, Barrassi L, Raoult D (2004) A novel alpha-Proteobacterium, Nordella oligomobilis gen. nov., sp. nov., isolated by using amoebal co-cultures. Res Microbiol 155: 47-51.

71. La Scola B, Mezi L, Weiller PJ, Raoult D (2001) Isolation of Legionella anisa using an amoebic coculture procedure. J Clin Microbiol 39: 365366.

72. La Scola B, Boyadjiev I, Greub G, Khamis A, Martin C, Raoult D (2003) Amoeba-resisting bacteria and ventilator-associated pneumonia. Emerg Infect Dis 7: 815-821.

73. La Scola В, Birtles RJ, Greub G, Harrison TJ, Ratcliff RM, Raoult D (2004) Legionella drancourtii sp. nov., a strictly intracellular amoebal pathogen. Int J Syst Evol Microbiol 54: 699-703.

74. La Scola B, Audic S, Robert C, Jungang L, Lamballerie de X, Drancourt M, Birtles R, Claverie JM, Raoult D (2003) A giant virus in amoebae. Science 29: 2033.

75. Landers P, Kerr KG, Rowbotham TJ, Tipper JL, Keig PM, Ingham E, Denton M (2000) Survival and growth of Burkholderia cepacia within the free-living amoeba Acanthamoeba polyphaga. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 19:121-123.

76. Li X, Zhang D, Chen F, Ma J, Dong Y, Zhang L (2004) Klebsiella singaporensis sp. nov., a novel isomaltulose-producing bacterium. Int J Syst Evol Microbiol 54: 2131-2136.

77. Martinez J, Martinez L, Rosenblueth M, Silva J, Martinez-Romero E (2004) How are gene sequence analyses modifying bacterial taxonomy? The case of Klebsiella. Int Microbiol 7: 261-268.

78. Maurin M, Raoult D (1999) Q fever. Clin Microbiol Rev 10: 518-553.

79. McCaul TF (1991) The developmental cycle of Coxiella burnetii// J.C. Williams, H.A. Thompson H.A. Q fever: the biology of Coxiella burnetii. CRC Press, p. 223-258.

80. Molmeret M, Horn M, Wagner M, Santic M, Kwaik YA (2005) Amoebae as training grounds for intracellular bacterial pathogens. Appl Environ Microbiol 71: 20-28.

81. Pettenkofer M. Boden und Grundwasser in ihrer Beziehungen zur Cholera und Typhus. Zeitschrift fur Biologie, V, Heft. 2. Munchen, 1869.

82. Rehacek J., Tarasevich I.V. Acari-borne Rickettsiae & Rickettsioses in Eurasia. Bratislava, 1988.

83. Rosenblueth M, Martinez L, Silva J, Martinez-Romero E (2004) Klebsiella variicola, a novel species with clinical and plant-associated isolates. Syst Appl Microbiol 27: 27-35.

84. Simpson JM, Santo Domingo JW, Reasoner DJ (2004) Assessment of equine fecal contamination: the search for alternative bacterial source-tracking targets. FEMS Microbiol Ecol 47: 65-75.

85. Snelling WJ, Moore JE, McKenna JP, Lecky DM, Dooley JSG (2006) Bacterial-protozoa interactions; an update on the role these phenomena play towards human illness. Microbes and Infection 8: 578-587.

86. Stackebrandt E & Ebers J (2006) Taxonomic parameters revisited: tarnished gold standarts. Microbiology today 10: 846-849.

87. Stackebrandt E & Goebel BM (1994) Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology. Int J Syst Evol Microbiol 44: 846-849.

88. Steele TW, Moore CV, Sangster N (1990) Distribution of Legionella longbeachae serogroup 1 and other legionellae in potting soils in Australia. Appl Environ Microbiol 56: 2984-2988.

89. Thornsberry C, Ogilvie PT, Holley HP, Sahm DF (1999) Survey of susceptibilities of Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, and Moraxella catarrhalis. Antimicrob Agents Chemother 11: 2612-2623.

90. Tissot-Dupont H, Amadei M-A, Nezri M, Raoult D (2004) Wind in November, Q fever in December. EID 7: 1264-1269.

91. Todar's Online Textbook of Bacteriology (TOTB). Available at: http://textbookofbacteriology.net.

92. Waksman SA & Woodruff HB (1940) Survival of bacteria added to soil and resultant modification of the soil population. Soil Sci., 50: 421-427.

93. Wang X & Ahearn DG (1997) Effect of bacteria on survival and growth of Acanthamoeba castellanii. Curr Microbiol 34: 212-215.

94. Williams MM, Domingo JW, Meckes MC, Kelty CA, Rochon HS (2004) Phylogenetic diversity of drinking water bacteria in a distribution system simulator. Appl. Microbiol. 96: 954-964.

95. Zhang R, Zeng R, Zhao J, Lin N (2003) 16S rDNA diversity of bacteria in penguin droppings sediments from Ardley Island, Antarctica. Unpublished.

Информация о работе

Евстигнеева, Анна Сергеевна
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.27

Диссертация

Выживаемость патогенных бактерий в почвах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы