Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительный электрофоретический анализ белков патогенных псевдомонад

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный электрофоретический анализ белков патогенных псевдомонад"

г Г ■.Р/'Ц

На правах рукописи

БУДЧЕНКО Анатолий Александрович ^

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ЗЛЕКТРСЯЮРЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ БЕЛКОВ ПАТОГЕННЫХ ПСЕВДОМОНАД

. 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 1995

Работа выполнена в Волгоградском научно-исследовательском противочумном институте.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

В.И.Илюхин

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Ю.А.Попов,

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Г.М.Сергеева.

Ведущая организация: Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт.

Защита состоится 1995 г. в часов

на васедании диссертационного совета Д 074.32.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" (410071 г. Саратов, Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института "Микроб".

Автореферат разослан "^У" ¿¿¿0/1Л 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Корнеев Г.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние годы возрастает клиническое значение ОактериЛ реда Pseudomcnas (Беляков В.Д. и др.. 1990; Мороз А.Ф. к др.. 1968). Среди них особое место занкмгг? P.pseudomallei и P. mal let, который является этиологическими агентами иелиекдоэа и сача, л относятся к микроорганизмам второй группы патогенности. На территории Рос-

Z\"'. ииепсюгти и пгаишпщ^» «я 1жгвитии- ,

руются. Однако э связи с развитием экономических связей со странами Юго-Восточной Азии, Австралией, Турцией, Китаем, Монголией и др., эндемичными по мелиондозу и сапу, возможен их завоз в нашу страну. Примерами распространения этих инфекций могут служить случаи формирования очага мелиоидоза во Франции к первое списание заоолезания мелиокдозем s Японии (Gallmand M., Dodln А., 1982; Arakawa V. et al.. 1S93). Отмечались случаи регистрации положительной аллергической пробы на сап у ло~ садей, попадавших в России из Монголии (Ьлифаисв Г.Ф., 1863).

Б лабораторной практике идентификация и дифференциация клинически значимых псевдомонад, в основном, осуществляется по культуральньы, биохимическим и серологическим признагсач (Илзп-х;:н Б. И.. 1085). Одяам» внутривидовая дифференциация патогенных псевдсмснад, а такха идентификация их атипичных культур представляет- значительные трудности.

Для решения этих проблем необходимо применение методов геноснотсматики и хемотаксскомни, н в том число злектрсфсрета-ческого анализа бактериальных Селкоз (Блохииа И.Н. и др., 1992). Используя данные строения белков, которые вместе с РКК и ДНК непосредственно отражают з организмах хранение и реали-

зацив генетической информации, мсисно судить о степени родства между микроорганизмами. Однако сопоставление белков по составу аминокислот очень сложно. Принято использовать сопоставление спектров белковых систем клетки, полученных различными методе-ми фракционирования (Дегтева Г.К.. Блохина И.Н.. 1084). Наиболее эффективным и высокоспецифи юским методом разделения белков является электрофорез в полиакриламидном геле, позволяющий составлять пептидограмкы штаммов бактерий («erstens К.. De Ley J., 1976). Результаты их сравнительного анализа хорошо согласуются с данными ДНК-ДНК гибридизации (Jackman P.J.H., 1987; Hertel С. et al., 1993).

Использование сопоставления злектрофоретических спектров бактериальных белков поаволкло таксономически изучить микроорганизмы различных родов, уточнить в ряде случаев их систематическое положение (Tamaoka J. et al.. 1987: Yanderín L. et al.. 1990). Надежность и простота электрофоретического анализа белков определили успешное применение этого метода в эпидемиологической практике (Hallas G., 1Q88; Costas М. et al.. 199t). Исследовались алектрофоретическими методами и бактерии, относящиеся к возбудителям особо опасных инфекций (Abath F. В. С. et al.. 1909; Зайцев A.A.. Филимонова JO. А. . 1994). Однако работ по применению электрофоретического анализа 6eÍKoa при таксономическом изучении патогенных видов псевдомонад нами не обнаружено.

Цель работы: изучение возможности дифференциации и "дентификации патогенных псевдомонад на основе сравнительного анализа злектрофоретических протеинограмм с применением компьютерных программ.

- Ь -

Задачи исследования:

1. Определение оптимальных условий получения стандартных электрофореграмм белков патогенных псевдомонад.

2. Оценка возможности применения данных сравнительного анализа электрофоретических протеинограмм для дифференциации и идентификации патогегпп« псевдомонад.

3. Разработка алгоритмов анализа протеинограмм и написание компьютерных программ.

Ü ау";'.» «йвл;:;.

Разработаны стандартные условия получения воспроизводи*™, электрофореграмм суммарных клеточных белкоз патогенных псевдомонад.

Впервые проведена дифференциация штаммов P.pseudomallei и P.mallel на основе сравнительного анализа спектров суммарных

клеточных белков, полученных методом электрофореза в ПААГ а ЛСН.

Впервые изучены спектры суммарных клеточных белков патогенных псевдомонад методом изоэлектрсфокусирования и проведен их сравнительный ачализ с п ро т е и н о грачмам и других видов рода Pseudooonas.

v Оценена возможность применения сравнительного анализа электрофореграмм суумарн?« клеточных белков для определения таксономической позиции патогенных видов среди бактррий рода Pseudomonas, имеющих клиническое аначение. На основе кластерного анализа матрицы коэффициентов корреляции денситограмм, записанных с протеинограмм суммарных клеточных белков клинически значимых псевдомонад, виды P.pseudomallei, P.mallel и P.cepacla выделены э отдельную группу на уровне сходства 802.

Составлена схема идентификации патогенных видов иа группы бактерий рода Рзеийотопаэ. имеющих клиническое значение на основе кластерного анализа протеинограмм суммарных клеточных белков и применения методов математической статистики.

Разработаны новые алгоритмы математической обработки ден-ситограма и написаны реализующие гл компьютерные программы.

Практическая ценность.

Материалы диссертационной работа использованы при оформлении методических рекомендаций "Лабораторная диагностика, лечение и профилактика мелиоидоза", утвержденных 1.11.1994г. вам. председателя Госкомсанэпиднадаора России Г.Г. Онищенко.

По итогам выполнения исследований составлены методические рекомендации " Анализ электрофореграш общеклеточных белков патогенных псевдомонад с применением компьютерных программ", утвержденные 14.06.1994 г. директором Волгоградского НЙПЧИ проф. Н. Г. Тихоновым, сфэрмлены два рационализаторских предложения.

Разработанный нами пакет.компьютерных программ используется в лабораториях Волгоградского НИПЧИ при сравнительном изучении протеинограмм различных микроорганизмов.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены на Российской научной конференции "Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций". Волгоград, 21-22 октября 1092 года и на научных институтских и межлабораторных конференциях Волгоградского НИПЧИ в 1988- 1994г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, отражающих основное ее содержание.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Стандартизуя условий выращивания, дезинтеграции клеток и экстракции белков патогеннш псепдсшнад обеспечивает поучение воспроизводимых и достоверно сопоставимых протекког-рамм.

2. Сравнительный анализ злектрофорегрлмм суммарных клеточных белков позволяет дифференцировать ата^-.а видов патоген-пвл "" ""'^^т'^ппсм уровне, что предполагает возможность использ'оунпгп """ а"»»|-»<1или. маркирования.

3. Нумерический аначиз мер близости протеинограмм обеспечивает идентификация и таксономическое группирование штаммов клинически значимых видов псевдомонад, коррелируемое с результатами геносистематики.

4. Предлагасхый нами пакет компьютерных программ - оч&гк-тивный инструмент анализа электрсфореграмм белков, позволяющий производить коррекция и вычислять меры близости сопоставляемых денситограмм, составлять матрицу сходства и на основе ее кластерного анализа дифференцировать сравниваемые микроорганизмы и выявлять обкие и индивидуальные бэлковые фракции.

СБЪВ! и СТРУКТУРА ДлСсертаг^

Диссертацил кзлсзена на 137 листа;', машинописного текста и состоит из введения, сбзора литературы, собственных исследований с 7 таблицами и 25 рисунками, заключения, выводов и библиографического указателя, вкяочавдзго 187 источников, в том число 73 отечественных и 114 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛУ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы 22 штамма возбудителя мелиои-доза и 14 штаммов возбудителя сала, видовая принадлежность которых подтверждена иммунологическими и бактериологическими методами. ¡[ля сравнительного анализа были тагасе взяты музейные штаммы условно патогенных псевдомонад следующих видов - P. aeruginosa (Н2, НЗ, Н10, РАО-1, 13525). P.cepacla (8235, 8236, 8237. 3181, 25416). P.putida (ВКМ-1301, ВКМ-901. 2300). P.flu-orescens (12633. В-1602), P.mendoclna 25411, P.stut2erl 17588. P.testosteronl 11996 и штамм Ejscherlchla coll K-12.

В качестве твердых питательных сред для выращивания псевдомонад испольэовалк триптиказо-соевый (ТСА), питательный, F -агары (Dlfco) и минимальную среду Gllardi 6.L. (1968) с добавлением глицерина (42) при рН 6,8.

Бакмаосу выращивали на матрацах при 37 °С. После 18 ч роста (логарифмическая фаза), смывали 0,1 М NaCl и стерилизовали охлажденным до -40° С ацетоном в соотношении по объему 1:3. Проверка на стерильность вирулентных штаммов включала посев на

кадкие и плотные питательные среды и заражение золотистых хо~ £

мячков (0,5 мл 5x10 м.к.). Бакмассу отделяли от ацетона центрифугированием (15 мин, 15000 g) и сушили в вытяжном шкафу.

Для получения внутриклеточных белков суспендированные в буфере клетки альтернативно разрушали методами многократного замораживания - оттаивания, обработкой на Х-прессе и ультразвук: и. Суспензию центрифугировали (25 мин 15000 g). суперна-тант отбирали, лиофильно сушили и использовали в опытах.

Суммарные клеточные белки получали, используя лизирувдие

растворы: а) с анионным детергентом' додецклсульфатом натрия

(ДСН) по Laeircnll U.K. (1970); б) с ненонкыы детергентса нони-детсц Р-40 по O'Farrell P.H. (1975) и дополнительной обработкой на шаровой мелыгаце по Нютте! W.. Kula M.-R. (1S89).

Количество белка а экстрактах определяли стандартными методами Lowry 0. et al. (1951) и Bradford M.M. (1976).

Диск-электрофорез внутриклеточных растворимых белков проводили по методике Davis B.J., Crnstein L. (1959).

Суммарные гае точные белки фракционировали электрофорезом а 7ÎAAT С ЛСГ' ZZ ',rr7,V w nam«XKTI, numunuunoanv-

по O'Farrell P.H. (1975).

Для сравнительного анализа денситограмн был разработан пакет компьютерных программ ELAN, позволявший производить коррекции денситограмм, выявление пиков, соответствующих белковым фракциям, их подсчет, вычисление мер близости денситограмн и группирование' исследуемых птсьаюз на основе критерия средней связи и парногруппового метода с построением декдрограима сходстза. В качестве мер-' близости денситограмм использовали коэффициент корреляции и коэффициент сходства Дайса. Расположение фракций на геле характеризовали злектрофоретнческой подвижностью Rf - процентным относениен подвижности фракций к подвижности бром>5енолового синего. Гомологичными считали фракции не отлкчашиеся более IX по Rf и 0,01 по рН.

Статистическую обработку результатов проводили по методам, описанным Мерковыи Ф.М., Поляковым Л.Е. (1974).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

До настоящего времени патогенные псевдомонады практически не исследовались злектрофоретическими методами. Поэтому одним из основных разделов работы явилось выяснение условий получения стандартных протеинограмм (Jackman P.J.H., 1987). Методики выращивания бактериальной массы патогенных псевдомонад на твердых питательных средах были разработаны ранее (Ширяев Д.Т., 1976). Нами было изучено влияние состава питательных сред для выращивания псевдомонад на злектрофоретический профиль суммарных клеточных белков. Для этого были взяты "богатые" среды: триптиказо-соевый, питательный и F-агары (Dlfco), и в качестве "бедной" - минимальная среда Gllardl G.K. (1968). На чашки с твердой питательной средой засевали штаммы P.pseu-domallel VPA, P.aeruginosa 13525, P.cepacia 25416. Бакмассу собирали после 18 часов роста при 37еС, что соответствует логарифмической фазе кривой роста м.к. . Белки экстрагировали из ацотонвысушенных клеток по методике Laemmll U.K. (1970) и подвергали электрофорезу в ПААГ с ДСН.

Анализ полученных протеинограмм показал, что общее количество белковых фракций варьировало от 30 до 34 и было достаточно для проведения достоверного сравнительного анализа. При зтом наблюдались различия в количестве фракций» их интенсивности окраски для культур одного и того же штамма, в зависимости от состава сред. Эти данные совпадали с результатами исследования других микроорганизмов и выявили известный недостаток метода, заключающийся в невозможности получения строго воспроизводимых результатов, проведенных в разных лабораториях из-за варьирования качества питательных сред (Kersters К.. De

Ley J., 1975). Для электрофоретического анализа клеточных белков псевдомонад в данной работе бакмассу вырапшвали на ТСА.

При получен;ш оелковнх экстрактов на бактерий применяют различные методы клеточной дезинтеграции (Скоупс Р., 1985). Нами было оценено влияние способов дезинтеграции на количественный выход и на состав спектра растворимых внутриклеточных Оелкон. Для разрушения клеток применяли: многократное з&чора-живание при -20"С и оттаивание при +25^ С, дезинтеграции и. к.

"•¡Л " ГГР-СС" " tJuUcmXiinr . *-*-'."•".. ----~«т«л«»п

белка, измеренное методом Lc**ry 0. et al. (1S51), экстрагировалось при обработке клеток ультразвуком (8,7 иг/ил). Число фракций на электрофореграымах после разделения экстрактов методом диск-электрофореза было также максимальным (12-15) при ультразвуковой дезинтеграции клеток. При этом отмечено, что для получения полноценного белкового экстракта из обработанных ультразвуком м.к.. требовалось меньшее количество клеточной суспензии.

Для экстрагирования суммарных клеточных белков, исследуемых изозлектрофокусированием, применяли лизирование клеток растворами, содержащими неионные детергенты NP-40 и тритон Х-100, с дополнительным разруиениеи на варовой мельнице. Сравнение изопротеинограмм экстрактов, полученных с применением и без применения механического воздействия, показало практически полное совпадение белковых профилей. Однако, в первом случав незначительно увеличивалась четкость и интенсивность некоторых фракций. . . .

Сушарные клеточные белки, используемые в электрофорезе по методу Laemll U.K. (1970), экстрагируют из клеток, лизиро-взнных раствором сДСН. Нами было установлено отсутствие алия-

кия на злектрофоретические белковые спектры наличия в лизирую-щем растворе 50 мМ NaHCOj и 10 мМ ЭДТА и кипячения суспензий в течение 2-10 мин.

Метод электрофореза в ПААГ с ДСН обеспечивает фракционирование белков в зависимости только от одного параметра - молекулярной массы. Jackman P.J.H. (1987) считает, что электро-, фореа в 102 ПААГ с ДСН, ввиду возможности стандартизации одномерных протеинограмм. является наиболее подходящим для применения в систематике микроорганизмов.

Возможность внутривидовой дифференциации бактерий P. pseu-domallel оценивали, сопоставляя протеинограмыы 22 штаммов. Количество фракций в спектрах составило 30-36 с мол.м. от 13 до 125 кОа. При этом 8-9 из них были крупными. Фракции с Rf 46, 76, 80 присутствовали на всех протеинограммах. Количественные отличия белковых профилей имели место в зоне с Rf от 13 до 37 (мол.м. 75-125 кЛа). Различия фракций по интенсивности окраски наблюдали во второй вариабельной зоне с Rf от 42 до 57. Эта зона аналогична вариабельной зоне протеинограмм суммарных клеточных белков метициллин-устойчивых штаммов Staphylococcus aureus (Cosias М. et al., 1989). Дефицит высокомолекулярных фракций на злектрофореграмые штамма P.pseudomallel VPA, являющегося ауксотрофным мутантом P.pseudomallel С-141, согласуется с его фекотипическим проявлением - отсутствием ряда антигенов при анализе е иммуноэлектрофореэе (Пивень Н.Н. и др., 1994).

Полученные данные по группированию штаммов мелиовдоза на оси эве вычисления коэффициентов корреляции денситограмм показали возможность их дифференциации. Изучаемые штаммы были разделены на 4 группы на уровне сходства 90Z (рис.1). Эти данные в настоящее время трудно сопоставить с другими вариантами ти-

Ккоц iOQ $ZMHk¡

90

80

r <

г —

bi

5

6

Гl

i -l_ g

r <o 11 12

ti -1

-1k -■

15 IB

П /В

19

20 21

u 21

Рис.1. Депдрограмма кластерного анализа, построенная на основе коэффициентов корреляции профилей суммарных клеточных белков птаммов P.pseudortallel. Цифрами обозначены штаммы: 1 - С 141. 2 - 134. 3 - НО. 4 - УРА. 5 - БКМ 500 . 6 - 140, 7-07, 8 - 105, 9-111, 10 - 107, 11 - 108. Гс - 133,

13 - 101, 14 - 98. 15 - 103, 16 - 57576, 17 - 100, 18 - Vanj. 19 - 115. 20 - 118, 21 - 56770, 22 - ССЕВ 860.

пирования, так как имелись только попытки группирования по антигенному составу (Dodln A., Fournler J.. 1970) и способности к фагопродукции (Манзеюэк О.Ю. и др.. 1994). Возможно применение полученных данных по группированию штаммов в качестве эпи-

демиодогических маркеров.

Результаты анализа протеинограмм штаммов P.mallel выявили в их составе от 30 до 37 фракций. Вариабельные участки по количеству фракций и интенсивности окраски на этих протеинограм-мах находились, как и у штаммов Р.pseudomallel, в зоне Rf 10-64. Однако дифференциация этих штаммов на основе вычисления коэффициентов корреляции денситограмм позволила выделить группы из девяти и двух штаммов на уровне сходства 912. Три штамма на втом уровне не были сгруппированы, так как имели с образованными группами коэффициенты корреляции < 802. .

Для выявления возможности таксономического группирования видов рода Pseudomonas и выяснения места патогенных псевдомонад среди других представителей этого рода на основе сопоставления суммарных клеточных белков нами были взяты штаммы P.mallel 10230, P.pseudomallel С-141, Р. aeruginosa 13525, P.fluo-rescens 12633, P.cepacla 25416, P.putlda 1301, P.mendoclna 25411, P.testosteronl 11996, P.stut2erl 17588 и E.coll K-12.

Результаты визуального анализа выявили близость протеинограмм псевдомонад по крупным фракциям (рис.2). Так у всех штаммов имелась крупная белковая фракция с Rf 46. Штаммы P.pseudomallel С-141. P.mallel 10230, P.cepacla 25416 имели белковые спектры высокой степени сходства как по всему составу фракций, гак и по крупным фракциям. В составе их протеинограмм присутствовали крупные фракции с Rf 46, 75.

На основе вычисленных коэффициентов корреляции денситог-рам) эти виды были разбиты на две группы (рис.3). В первую группу вошли штаммы P.pseudomallel, P.mallel, P.cepacla. Уровень сходства их денситограмм был > 802. Выделение данной группы совпадает с результатами филогенетической классификации

Rf(%) Mï№)

Рис. 2. Схемы электрофореграмм суммарных клеточных Сел-ков штаммов рода Pseudomonas. Цифрами обозначены штаммы: 1 - P.stutserl 17588 , 2 - P. testosteroni 11996, 3 - P.mendoci-na 25411, 4 -"маркерные белки, Б - P. put Ida 1301, б - P. fliro-rescens 12633 , 7 - P.aeruginosa 1352b, ä - F.inallei 10230, 9 - P.pseudomallel C141. 10 - P.cepacia 25-116. 11 - E.coli K12.

псевдомонад Palleronl N.G. (1984), согласно которой эти штаммы также отнесены к одной группе, названной группой Pseudoallel - cepacia. Что аналогично результатам типироьания на основе учета фенстипических признаков (Gilardi G.I., 1371) и исследования общих, перекрестно реагирующих и видовых зкстракле-точных антигенов (Пив^нь H.H., 1987). Остальные штаммы были отнесены ко второй группе. Наличие в составе протеинограмм трех вьееуказаяных видов 1-й группы крупной фракции с кг 75. отсутствующей у видов второй группы, позволяет предположить возможность использования этого белка для конструирования груп-

Ккср

100

Феноны i

[í

L3

r k

5

6

7

8 ^ 9

90 80 10 60 %

Рис. 3. Дендрограмма кластерного анализа, построенная на основе коэффициентов корреляции профилей суммарных клеточных белков бактерий рода Pseudomonas. Цифрами обозначены штаммы: 1 - P.mallei 10230 , 2 - P.pseudomallel С 141. '3 - P.cepacla 25416, 4 - P.stutEerl 17588. 5 - Р.testosteronl 11996, б - P.fluorescens 12633. 7 - P.putlda 1301, 8 - P.aeruglnosa 13525, 9 - P.mendoclna 25411.

поспецифического сывороточного диагностикума.

Используя полученные денситограммы фореграмм суммарных клеточных белков после электрофореза в ПЛАТ с ДСН, была изучена возможность идентификации неизвестных видов изолятов. относящихся к роду Рэеийотопаз. Для этого нами был выбран вариант, сравнения денситограммы идентифицируемого штамма с денситог-раммами референтных штаммов псевдомонад. Эгот вариант иденти-' фикации позволяет применять статистические методы обработки результатов, повышааде их достоверность.

- 17 -

Предложенная нами схема сравнения средних коэффициентов корреляции денситогрлмм птамма неизвестного вида н штамма«)! "контрольного" вида и среднего коэффициента корреляции денси-тогрз«м етаммов внутри контрольного r-ида позволила /ос?ор«фно идентифицировать неизвестные штаммы, относящиеся к ciutcviy vb контрольных видов. Принятая в качестье ыер.ч близости, разность средних значений коэффициент-» корреляции денсктограммы итамма P-aerui?lnosa РА01, взятого а качестве "неизвестного", с денси-"читишш!,»;; гт"1 ^пии ^ ■* <^прлнкм значением коэффициента корреляции денситогракл ¡сснтршгп.«.» этого вида между собой Оыла равна О.. Эта разность с штаммами других контрольных видов была > 6,03. В первом случае разность. вычисляемая на основании критерия Стыотенда, была не-доставерной, а в остальных - достоверной. Эти соотношения позволили идентифицировать "ногзвестный" птакак относящийся к Estay P.aeruginosa. Аналогично идентифицировались и другие виды псевдомонал. имеющие клиническое значение. Эти предложения реализованы з компьютерной программе ELADIO,

С помощьи нэоэлектрофокусирования суммарные клето<.лые белки псевдомонаа были фракционирован в зависимости от значений их заряда в зоне рн 3-9 (рис.4). На протеиногратаах было ьырьлено от '¿0 дс 32 белковых фракций, расположенных, в основном. ь ?оне рн 5.0-6.? (Ь9-73Г„ фрсгашй). Эти результаты коррелировали с данными, полученными при разделении Селкевы* зг-о-трактов из клеток штаммов U.urealytlcum (Sing S.P. et al., 1987).

Анализ изопротеинограмм штаммов внутри видов P. pseudomal -lei и Р.nallei показал их близкое сходство (коэффициент Дайса > 71Z). Внутривидовая дифференциации была затруднена.

pH

5,0

6,0

ю

8.0

12 3 4 5 6 7

Рис. 4. Схемы изоэлектрофореграмм суммарных клеточных Оел-ков псевдомонад. Цифрами обозначены штаммы: 1 - P.mallel PI, 2 - P.pseudomallel 57576, 3 - P.putlda 1301. 4 - P.aeruglnosa PA01, 5 - P.cepacla 25416, 6 - P.fluorescens 12633, 7 - E.coll K-12.

Для оценки возможности дифференциации клинически значимых видов рода Pseudomonas на основе сопоставления изоэлектрофо-реграмм были взяты штаммы P.pseudornallel 57576, P.mallel PI, P.cepacla 25416, Р.aeruginosa PA01, P.fluorescens 12833 и для

контроля атамм E.coll К12. Коэффициент сходства Дайса лротек-нограмм псеадомонзд составил -14-77Х. Спектр балкоз E.coll значительно отличался от спектр! ксепдомс'.'и. Ко-*К.к:;;!<?к7 схгдс-тва между ними был ниже 402. НагЯсдьвий коэффициент сходоти, равный f>8X, был определен между кзопротеинсграмчами P. p.<;fi:f!o-гд!1е1 57576 и P.xillel Pi. Коэффициент сходства мезду протеи-нограммами этих видов и остатними иьучайша/я rrwe«» п;.г«до-

иам ~ w I/.

Таким образом, сопостамлпл.... irr^^oKTu^^irrr""" сходство видоэ P. pseudomal 1 е 1 и P.mallei, что подтвердило ;:;: близость, установленную по другим фенотипическим признакам. А также показана возможность использования данного метода для таксономической дифференциации патогенных видов из группы клинически амачш«' плевдомонад. На протеинограммах птаммоа P. aeruginosa РА01 и P.fluoresce!is 12f>33 6tum or>i!;4pyxc:w с рН 5,4, 5,7 и 5,72, имевшие в своем состава пигм»и'г. По наличию подобных фракций на изоэлектроЗореграчмах ао»мог.н,ч идентификация этих видов.

Для проведения злектрофоретического анализа была разр. мотана автоматизированная система злектрсфоретичоского анализа, состоягля из этапа получения протеинограмм и этапа магекагк-ческой обработки деиситограмм, Перг-ый этап проводился согласно существующим методикам и результата;,! яааих исследований. Д-'я достоверного сравнения денситограмм на основе вычисления мер близости и статистической обработки результатоз нами был написан пакет компьютерных программ.

Перед тем, как приступить к написанию програум, нам;: проведен анализ помех, вызывающих появление искажений па дг'н-ситограммах. Фоновый уровень сигнала между пиками на денситог-

раммах определяется качеством красителя, сорбирующими свойствами геля, параметрами электрофореза и инерционностью записы-ващего устройства. При этом средний фон не значительно влияет на амплитуду пиков, соответствующих белковым фракциям. Поэтому корректирование амплитуд пиков относительно уровня "фона" не всегда является правомерным.

В отличие от коммерческих программ, пакет программ "ELAN" позволяет вычислять четыре вида мер близости: коэффициенты корреляции, расстояния Эвклида, косинусы многомерного пространства и коэффициенты сходства Дайса. При этом коэффициент Дайса в программе ELAN5 рассчитывается в трех вариантах: для всех пиков, для крупных пиков (амплитуда которых >0,5 амплитуды максимального пика), для "крупных" пикоз по площади под пиком. Группирование сравниваемых объектов проводится с по-У мощью программы ELAN7. Для этого на основе матрицы сходства и критерия средней связи и парногруппового метода производится разбивка сравниваемых денситограмм на группы по степени их ' близости между собой (Socal R.R., Sneath Р.Н.А.,1963). Результаты группирования выводятся на экран в виде дендрограммы.

Программа ELAN6 позволяет получать информацию об общих и индивидуальных белковых фракциях на сравниваемых протеинограм-мах. Эти результаты могут быть полезны при анализе белковых спектров и выявлении фракций, которые можно было бы использо-. вать при конструировании иммунологических диагностических препаратов.

Программа ELAN10 позволяет идентифицировать штаммы видов микроорганизмов, принадлежащие известному роду на основе вычисления коэффициентов корреляции.

ВЫВОДЫ

1. Проведена стандартизация получения воспрсигводимых электорофореграмм суммарных клеточных белков патогенных псевдомонад. При отборе питательных сред предпочтение отдано трип-ТНкаь^- -»anv (OJfeo). Длительность кипячения (от 2 до 10 мин), наличие ¡¡ Ю мМ ЭДТА, 50 мМ двууглекислого натрия не оказывали с-утдагь,.:::-^!! ^г:-«»« „с *«»*-ковый спектр.

2. На основании сопоставления спектров суммарных клеточных белков, полученных методом электрофореза в ПЛАГ с ДСН, проведена внутривидовая дифференциация штаммов P. pseudomallel (4 фенона на уровне сходства > Я0Z) и Р.mal lei ( 2 фенона на уровне сходства > 907.).

3. Виды P.pseudomallei, P.mallei, P.cepacia на основе сравнительного электрофоретического анализа суммарных клеточных белков были выделены в отдельную группу (уровень сходства > 80%), что коррелирует с группированием методом pPíiX-ДНК . о-УСЛОГИИ.

4. На основание вычисления коэффициентов корреляции дек-ситограмм, вапиелгпгых с протегасграмм псспдомонад и статистической оценки их разности, показала гюзкокиссть идентифъ'л-яи патогенах видов с доверительной вероятностью 95%.

5. Изучен спектр суммарных клеточных белков патоге»ных псевдомонад «етодом изозлектрофокусирования. Белковые фракции располагались на протеинограмме, в основном, а зоне рн 5,6-6,7 (59-73Z фракций). Выявлена высокая степень сходства белковьи профилей штаммов P. pseudomallel и Р. mal leí (коэффициент Дайса

составил 662). Коэффициент сходства белковых спектров P.pseu-domallel и P.mallei со спектрами остальных клинически значимых видов был < 60%, что позволило выделить первых в отдельную группу.

б. Объективность анализа злектрофореграмм обеспечена разработкой пакета компьютерных программ ELAN, которые позволяют корректировать денситограммы, вычислять меры близости сравниваемых денситограмм, составлять матрицу сходства из значений мер близости, дифференцировать изучаемые штаммы на основе кластерного анализа матрщи сходства, идентифицировать неизвестные штаммы и выявлять общие и индивидуальные белковые Фракции на сравниваемых протеинограммах.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Вудченко A.A., Замаркк А.Е. Оценка различных методов' дезинтеграции клеток возбудителя мелиоидоза при изучении его белкового спектра // Особо опасные инспекционные заболевания: иммунология, генетика и биологические свойства возбудителей. Сборник научных работ. - Волгоград, 1989. -Вып.5.- С.60-67.

2. Антонов Ю.В., Вудченко A.A., Поповцева Л.Д. Протеиног-раммы природных и антибиотикочувствителышх мутантов возбудителя мелиоидоза // Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций: Тез. докл. Всес. конф. 22-24 октября U91 г. - М.: 1991. - 4.1. - С.18-19.

3. Вудченко A.A., Викторов Д.В. Белковый спектр патогенных псевдомонад, выращенных на различных питательных средах // Генетика и биохимия вирулентноеfи возбудителей особо опас-нах инфекций, материалы Российской научной конференции: Тез. докл. - Волгоград. 1992. - С.74.

4. Вудченко A.A.. Викторов Д.В. Компьютерный анализ изоз-лектрофореграмм клеточных белков (антигенов) микроорганизмов рода Pseudomonas // Там же. - С.75.

5. Викторов Д.В., Вудченко A.A. Сравнительное изучение протеинограмм патогенных псевдомонад с использованием компьютерного анализа // Там же.- С.31.

6. Вудченко A.A., Викторов Л-В. Система анализа белковых спектров псепдомонад // Проблемная комиссия по эпидемиологии и •мкробиологии особо опасных инфекций. Информ.бюлл. - Саратов, 1У93. - С.24-25.

7. Вудченко A.A. Сравнение белковых спектров imurftmaix псевдсмонад методом иаоэлоктро]пкуеиргпач:м // Оовррменшк? аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактика алл\1 опасных инфекционных болезней: Тез. докл. науч. конф.. Омск, октябрь 1993.- Ставрополь, 1993. - С.Г/в-179.

8. Вудченко A.A., Замарин А.Е., Викторов Д. В., Подзолкова Г.Г. Электрофоретичоский анализ зкстрадашмярных «антигенов патогенных псевдомонад // Иммунология и спенифич^-скал нро'и-«яктика СОИ. Матераш Российской науч. ко»1>. - ют.

С

9. Вудченко л.л. ü.Ccp гр^тт««««

электрофореграмм бактериальных биополкке^/п .7 "'"""""«^...о:: ный научный совет по санитарно-эпидемиологической охрана территории PI1. Информ. бшл. - Саратов. 1994. - С.15.

10. Илюхин В.И., Агеева Л.П.. Антонов В.А., Батмачов В.П.. Вудченко A.A., Дунаев Г.С.. Замараев B.C.. Замарин А. К., Ларионов P.M.. Пивень H.H., Яковлев А.Т., Гришкина Т.А. Лабораторная диагностика, лечение и профилактика мелиоидоза // Там же.- С.30.