Разнообразие генетических систем катаболизма нафталина штаммов флуоресцирующих псевдомонад

Измалкова, Татьяна Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разнообразие генетических систем катаболизма нафталина штаммов флуоресцирующих псевдомонад
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Разнообразие генетических систем катаболизма нафталина штаммов флуоресцирующих псевдомонад"

На правах рукописи

ИЗМАЖОВА ТАТЬЯНА ЮРЬЕВНА

РАЗНООБРАЗИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ СИСТЕМ КАТАБОЛИЗМА НАФТАЛИНА ШТАММОВ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ ПСЕВДОМОНАД

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ПУЩННО - 2004

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН.

Научные руководители:

член-корр. РАН, доктор биологических наук, профессор А. М. Воронин; кандидат биологических наук И. А. Кошелева.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Н. И. Матвиенко; доктор биологических наук А. С. Яненко.

Ведущая организация:

Филиал Института Биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, Пущино.

Защита диссертации состоится^С^4й^| часов на

заседании Диссертационного совета ДОЮ2.038.01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290 г. Пущино, Московской области, ИБК РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НЦБИ РАН г. Пущино.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного совет! кандидат биологических наук

2ßü7-f7SJ~Z

251 mf

Актуальность проблемы.

Полициклнческие ароматические углеводороды (ПАУ) являются широко распространенными соединениями, загрязняющими окружающую среду. Микробная утилизация является основным процессом, приводящим к деградации ПАУ в природных условиях. Большим метаболическим потенциалом в отношении ароматических углеводородов, таких как нафталин, фенантрен, антрацен, обладают бактерии рода Pseudomonas (Cemiglia, 1984). Гены катаболизма нафталина могут иметь как хромосомную локализацию, так и находиться на коньюгативных плазмидах (Herrick etal., 1997). Генетический контроль деградации нафталина был детально изучен на примере плазмиды NAH7 {Pseudomonas pulida G7) (Dunn and Gunsalus, 1973). Катабопические гены плазмиды NAH7 организованы в даа оперона: nah! (nahAaAbAcAdBFCED) контролирует превращение нафталина в салицилат, nah! (nahGTHINLOMKJf) утилизацию салицилата до ингермедиатов цикла трикарбоновых кислот. Оба оперона находятся под позитивным контролем регуляторного гена nahR (Schell, 1985). Индуктором является салицилат.

Плазмиды биодеградации ПАУ, как правило, относятся к группам несовместимости Р-2, Р-7 и Р-9 (Кочетков и Воронин, 1984). Принадлежность плазмиды к определенной группе несовместимости связана с организацией её базового репликона и определяет круг её бактериальных хозяев. Основные исследования организации катаболических генов проводились на плазмидах 1псР-9 группы. Взаимосвязь между плазмидными репликонами и катаболическими генами, а также определенными группами плазмид биодеградации и их бактериальными хозяевами практически не изучена.

Катабопические опероны часто располагаются внутри мобильных элементов. Область плазмиды NAH7, содержащая все пай-гены, находится на дефектном транспозоне, который становится подвижным в присутствии транспозазы (Tsuda and lino, 1990). Транспозонная организация катаболических оперонов, а также высокая гомология генов биодеградации подразумевают возможность их независимой эволюции путем транспозиционных и рекомбинационных событий. Изучение разнообразия генетических систем деградации ПАУ и распространения в природных сообществах катаболических оперонов способствует пониманию эволюционных процессов, лежащих в основе существующих в настоящее время катаболических

РОС НАЦИОНАЛЬНА! .;.£>, {т

путей. До настоящего времени исследования разнообразия генетических систем катаболизма нафталина касались в основном генов waW-оперона. Цель и задачи работы:

Целью настоящей работы являлся анализ генетических систем катаболизма нафталина пггаммов флуоресцирующих псевдомонад, изолированных из различных географических регионов Российской Федерации, Украины и Беларуси и способных к утилизации нафталина и его производных.

В соответствии целью, в работе были поставлены следующие задачи:

1. Выделение, определение спектра утилизируемых субстратов и генотипический анализ деструкторов нафталина рода Pseudomonas.

2. Определение биохимических путей деградации нафталина, фенантрена и салицилата штаммами-деструкторами.

3. Изучение роли плазмид в генетическом контроле деградации ПАУ.

4. Изучение плазмид катаболизма нафталина, принадлежащих к группам несовместимости Р-7 и Р-9.

5. Анализ полиморфизма ключевых генов биодеградации нафталина. Научная новизна.

Проведен сравнительный анализ организации генетических систем биодеградации нафталина у штаммов флуоресцирующих псевдомонад, включая nahl- и nah2-опероны. Впервые изучено разнообразие генов паЮ, обнаружены два новых варианта последовательностей гена nahG. Выделена новая группа генов nahAc. Обнаружено существование вариаций в организации биодеградативных оперонов. Изучены штаммы, имеющие ген салицилат гидроксилазы в транс-положении по отношению к nahl-оперону. Впервые обнаружено сочетание генов салицилат 5-гидроксилазы nagG с «классическими» nahA - генами. Обнаружено влияние характера синтеза нафталин диоксигеназы на способность микроорганизмов-деструкторов нафталина утилизировать более высокомолекулярные ПАУ (фенантрен). Проведен сравнительный анализ плазмид утилизации нафталина и салицилата групп несовместимости Р-7 и Р-9 и их бактериальных хозяев. Практическая значимость работы.

Изучение организации генетических систем катаболизма ПАУ является основой понимания эволюционных процессов, приводящих к возникновению разнообразия генов катаболических путей и изменению спектра утилизируемых субстратов.

Полученная в настоящей работе информация позволяет расширить -ндттт представления о молекулярных механизмах адаптации микроорганизмов к загрязнению окружающей среды ксенобиотиками.

С прикладной точки зрения, разработанные в настоящей работе специфические праймеры, могут быть использованы для обнаружения и характеристики штаммов-деструкторов, а также для оценки биодеградативного потенциала загрязненной территории. Охарактеризованные в данной работе катаболические плазмиды могут быть использованы для трансформации аборигенных штаммов, с целью получения микроорганизмов с более широким спектром утилизируемых субстратов. Штаммы, способные к утилизации нескольких ПАУ, представляют интерес не только для исследования основных принципов биодеградации ПАУ, но и, по-видимому, перспективны для использования их в биотехнологиях очистки окружающей среды. Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: IV Пущинская конференция молодых ученых, 1999; VII Пущинская конференции молодых ученых, 2003; "Pseudomonas 2001" Congress, Brüssels, Belgium, 2001; Third symposium of tfae EU-concerted action on "Mobile genetic elements" contribution to bacterial adaptability and diversity" (MECBAD), Berlin, Germany, 2001; lst FEMS Congress of European Microbiologists, Ljubljana, Slovénie, 2003. Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 3 статьи и 5 тезисов. Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, включает 6 таблиц и 33 рисунка. Библиография включает 171 наименование, из них 10 отечественных и 161 зарубежная работа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Изоляция и характеристика штаммов-деструкторов нафталина.

В работе исследованы штаммы-деструкторы нафталина, изолированные методом накопительных культур из загрязненных нефтепродуктами почв различных географических регионов Российской Федерации, Украины и Беларуси. (Табл. 1).

Таблица 1. Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в работе.

Штамм Плазмиды nahAc/mhG* Источник

P. putida PpG7 NAH7, IncP-9ß C18/NAH7 I.C.Gunsalus, USA

P. putida BS202 NPL-1, tocP-9ß CI8/pDTGl г.Макеевка, Украина.

P. putida NL10, NL21 pNLIO, IncP-95; pNL21, IncP-9a C18/pDTGl г. Минск, Республика Беларусь

P.fluorescein NL41 pNL41, IncP-9a A88/A88

P.fluorescens NL18 pNL18, IncP-9 C18/C18 г. Гомель, Беларусь

P. putida BS3701 pBS1141,IncP-9ß; PBS1142 C18 /pDTGl г. Видное, Московская область

P. putida BS238 pBS2, IncP-7/9ß C18 /pDTGl г. Нижний Тагил

P. putida 143NF pNF143, IncP-95 C18 / pDTGl Завод «Метоксил», Нижегородская обл.

P. putida BS3710 pBS216, IncP-95 С18/pDTGl г. Магнитогорск

P. putida SN11 pSNll, IncP-95 С18/pDTGl г. Березники Пермская область

P. putida BS3790, P. aeruginosa 94B, P. putida BS3750, 8C, 15C, 16C, 24C, 25C pBS1191,p94B-l, pBS1181,p8C,pl5C, pl6C, 24C, p25C (все IncP-9ß) C18/pDTGl Почвы Западной Сибири, загрязненные мазутом

P. fluorescens A24 pA24-l, IncP-7; pA24-2 A88/NAH7

P.fluorescens A88 pA88, IncP-9ß A88/A88

P.fluorescens AS9 HO"*

P. fluorescens A96 рА9б

P.fluorescens l-\6 pl-161; pl-162

P. putida NK72 рЖ72, IncP-9ß С18/ pDTGl шламонакопитель «Нижнекамск- нефтехим», г. Нижнекамск

P. putida AK1, AK2, AK3, AK4, AK7, AK8, AK9, АКИ НОяй

P. fluorescens NK33, NK43, OS 18, OS 19, FME4, FME5 pNK33, pNK43, pOS18, pOS19, pFME4, pFME5, BceIncP-7

P. putida AK5 pAK5, IncP-7 C18 / -

P. fluorescens NK2 IK, NK22, NK32 pNK21K(22, 32)-l; pNK21K(22, 32)-2 AN10/AN10

P.fluorescens NKNS15 HOÄ*

P. fluorescens NKHS3, NKNS7 HOee AN10/NKNS

P. fluorescens NKNS5 pNKNS5, IncP-9ß

P. fluorescens NKNS6, FME3 HO** AN10/KF715

P. fluorescens 1-1 pl-l AN10/KF715 г. Воскресенск Нижегородская область

P. fluorescens П-9 HOeft

P.fluorescens 37NF pNF37, IncP-9ß C18/NAH7 г. Краснодар

P. aeruginosa 8909N p8909N-l, IncP-95; p8909N-2 С18/pDTGl W.A.Duetz, Нидерланды

типы последовательностей nahAc и nahG; **-плазмиды не обнаружены.

Все 52 отобранных штамма были способны утилизировать нафталин и салиципат в качестве единственных источников углерода и энергии.

На основании морфологических и физиологических свойств, а также рестрикционного анализа продуктов амплификации гена 16S рРНК 25 штаммов отнесены к виду P. putida, 25- к виду P. fluorescens, 2 штамма определены как Р. aeruginosa. Установление филогенетической взаимосвязи между штаммами одного вида методом геномного фингерпринта (REP-PCR) показало, что многие изолированные из различных географически удаленных регионов Российской Федерации деструкторы ПАУ, относящиеся к видам P. fluorescens и P. putida, являются близкородственными.

2. Анализ удельных активностей ферментов биодеградации нафталина, фенантрена и салицилата.

Микроорганизмы, деградирующие нафталин, часто способны к трансформации более высокомолекулярных ПАУ. Известно, что ферменты катаболизма нафталина могут участвовать в трансформации фенантрена до 1-гидрокси-2-нафтойной кислоты. (Sanseverino et al., 1993, Yang et al., 1994). Способность утилизировать фенатрен в качестве единственного источника углерода и энергаи встречается значительно реже. Из 52 исследованных штаммов только 9 (17%) были изначально способны утилизировать фенатрен. Были определены активности ключевых ферментов деградации у деструкторов фенантрена, как природных (BS3790), так и ранее адаптированных к росту на фенантрене методом продолжительного культивирования (BS3701, BS3750, BS3710 и BS202-P). Показано, что все эти штаммы утилизируют фенантрен через 1-гидрокси-2-нафтоат, салицилат и катехол, с дальнейшим расщеплением последнего по орто- и мета-пут (Табл. 1).

Активности ключевых ферментов утилизации нафталина и фенатрена - нафталин диоксигеназы и фенантрен диоксигеназы наблюдались у всех исследованных штаммов, независимо от их способности утилизировать фенантрен. Штаммы, как изначально способные к росту на фенантрене, так и приобретшие эту способность, характеризуются конститутивным синтезом фенантрен (нафталин) диоксигеназы и не требуют наличия индуктора. У микроорганизмов не способных к росту на фенантрене эти активности индуцировались салицилатом или, в случае штамма АК5, нафталином. По-видимому, базального уровня нафталин диоксигеназы, приводящего к

образованию сшпщилата, который затем индуцирует ферменты как "верхнего", так и "нижнего" путей окисления нафталина у МаКЧРЬп микроорганизмов недостаточно для образования салидилата из фенашрена, поскольку биодеградация фенантрена включает значительно большее количество ферментативных реакций.

В штамме Р. риИ<Иа АК5 при росте на салицилате и нафталине отсутствуют активности салицилат гидроксилазы и катехол-2,3-диоксигеназы, но проявляется активность гентизат-1,2-диоксигеназы. Эти данные позволили предположить, что АК5 утилизирует нафталин через салицилат и гентизат (Табл. 1).

Таблица 1. Активности ферментов катаболизма фенантрена и нафталина у штаммов P.putida.

Штамм Фенотип Источник углерода Удельные активности ферментов (нмоль/мин на мг белка)

NDO* PhO SH 1H2N С120 С230 GO

BS202 Nah+Sat+ салицилат сукцинат 16 <1 НО" 266 1 47 3 110 3 <1 3 НО

BS202-P Nah*Saf Phn+ салицилат сукцинат 38 23 15 18 163 <1 32 <1 6 6 16 42 НО

BS3701 Nah+Sal+ Phn+ салицилат сукцинат 15 10 14 11 496 <1 190 <1 272 <1 14 12 НО

BS3790 Nah+Sal+ Phn+ салицилат сукцинат 14 12 10 14 456 <1 61 <1 97 4 4 10 НО

BS3710 Nah+Sal+ Phn+ салицилат сукцинат 36 8 10 9 123 <1 19 <1 75 3 23 <1 НО

BS3750 Nah+Sal+ Phn+ салицилат сукцинат 3 3 5 21 142 <1 49 <1 86 2 2 9 НО

АК2 Nah+Sal+ салицилат сукцинат 2 <1 5 <1 23 <1 9 <1 3 3 1 1 <1 <1

АК8 Nah+Sal+ салицилат сукцинат 9 <1 28 <1 240 <1 56 <1 <1 <1 95 <1 <1 <1

АК5 Nah+Sal+ Gen+ нафталин салицилат сукцинат 4 <1 <1 4 <1 <1 <1 <1 <1 НО <1 НО НО 3 2 НО <1 <1 35 10 <1

* NDO - нафталин 1,2-диоксигеназа; PhO - фенантрен диоксигеназа; SH - салицилат гидроксилаза; 1H2N - 1-гидрокси-2-нафтоат гидроксилаза; С120 - катехол-1,2-диоксигеназа; С230 - катехол-2,3-диоксигеназа; GO - гентизат-1,2-диоксигеназа; /fif НО - активность фермента не определяли.

2. Участие плазмид в генетическом контроле деградации нафталина.

В ходе работы из 37 деструкторов нафталина (из них 17 штаммов P. putida, 18 штаммов P. fluorescens и два - P. aeruginosa) были вьвделены плазмиды размером от 20 до 135 т.п.iL Продемонстрировано, что двадцать плазмид содержат всю необходимую информацию для утилизации нафталина и салидилата и способны к

коньюгационноыу переносу в штаммы P. putida с частотой 10"4 - 10"7. Еще для шеста ппаммов плазмндная локализация ключевых генов биодеградации этих соединений была подтверждена с помощью гибридизации с радиоактивными зондами.

К настоящему времени у псевдомонад описаны плазмиды, принадлежащие к 14 различным группам несовместимости (Boronin, 1992). В настоящей работе проводился анализ плазмид катаболизма нафталина, принадлежащих к группам несовместимости Р-7 и Р-9. Для тестирования плазмид на принадлежность к группам несовместимости IncP-9 и fiicP-7 методом ПЦР использовали пары праймеров korA3F& - rep3Rc, mpJA IF а - korA2R& и repAB, специфичные для репликона IhcP-9 (Krasowiak et al., 2002), а также праймеры, специфичные для Р-7 репликона. Среди 37 плазмидо содержащих штаммов обнаружено 22 штамма-хозяина катаболических Р-9 плазмид, еще восемь штаммов, содержали плазмиды группы несовместимости Р-7, и, наконец, плазмида pBS2 в штамме BS238 обладает слитым репликоном Р-9/ Р-7 и проявляет свойства обеих групп несовместимости.

Из 22 штаммов-хозяев Р-9 плазмид биодеградации 15 предположительно относятся к P. putida, пять штаммов - P. fluorescens, и два - P. aeruginosa. По-видимому, основным хозяином для IncP-9 плазмид биодеградации является P. putida, реже хозяевами IncP-9 плазмид являются другие виды псевдомонад. Напротив, все исследованные штаммы - хозяева плазмид Р-7 группы на основании ARDRA (amplified ribosomal DNA restriction analysis) принадлежат к виду P. fluorescens, за исключением P. putida AK5.

Практически идентичные плазмиды (pSNll и pBS2l6; NAH7 и pNF37) были обнаружены у изолированных из различных регионов филогенетически удаленных штаммов P.putida SN11 (г. Березники) и P.putida 3710 (г. Магнитогорск), а также в штаммах, принадлежащих к разным видам P.putida PpG7 и P.Jluorescens 37NF (г. Краснодар). Эти данные свидетельствуют о широком распространении катаболических плазмид группы IncP-9. В отличие от хозяев Р-9 плазмид , почта все штаммы, содержащие Р-7 катаболические плазмиды, были изолированы либо из почвы территории предприятия «Нижнекамскнефтехим», либо из шламонакопителя того же предприятия, за исключением штамма А24 из почв Западной Сибири. По-видимому, катаболические плазмиды этой группы несовместимости в отличие от плазмид IncP-9 группы, менее распространены в природе.

На сегодняшний день, на основании анализа базовых решшконов плазмиды IncP-9 группы подразделяются на подгруппы (а, ß, у, 5 и т.д.) (Krasowiak et al., 2002; Соколов, неопубликованные данные). Все исследованные нами IncP-9 плазмиды принадлежали к подгруппам: а, ß и 6, за исключением плазмиды pNL18, которая не относится ни к одной из этих подгрупп. Для детального изучения были выбраны шестнадцать плазмид IncP-9 плазмид ß и 6 - подгрупп. Для определения сходства и различий между исследуемыми плазмидами проводился RJFLP (restriction fragment length polymorphism) анализ (Рис.1). Оказалось, что исследуемые плазмиды могут быть поделены на 3 основные группы. К группе А относятся 10 плазмид размером от 100 до 120 т.п.н. Самой малочисленной является подгруппа В, включающая в себя две практически идентичные плазмиды сходного размера, архетипическую плазмиду NAH7 и pNF37. Плазмиды группы С наиболее гетерогенны по размеру - от 80 до 130 т.п.н.

го

100

ни

pBS1141

pBsim

р25С

НИЛ

рас

р15С

piec

р24С

PBS1181

рИК72

MÄH7

рНЕ37

pBS216

psrni

pNF143

pBS1145

pBSZ

Рис. 1. Кластерный анализ плазмид катаболизма нафталина IncP-9 группы. ДНК плазмид обработана эндонуклеазой рестрикции ЯсоМ, фрагменты разделяли в 0.85% агарозном геле. Присутствие или отсутствие фрагментов одного размера подсчитывали вручную. Полученные данные использовали для кластерного анализа с помощью программы TREECON (Van de Peer and De Wächter, 1994).

Наблюдается корреляция между строением репликона (1псР-9р и 1псР-95 -подгруппы) и структурой плазмнды в целом. Плазмнды групп А и В относятся к 1псР-9 р - подгруппе, тогда как третья, наиболее гетерогенная, 1руппа С включает Р-9 плазмнды 5 - подгруппы, плазмиду рЫР143 Р - подгруппы и рВ82, обладающую слитым 1псР7/ Р9р репликоном. По сравнению с 1псР-9 плазмидами деградации нафталина, ЬасР-7 плазмнды демонстрируют большее структурное разнообразие и не образуют какие-либо группы (Рис.2).

Рис. 2. Кластерный анализ ЬсР-7 плазмид катаболизма нафталина на основании данных RFLP-анализа. Относительные дистанции и конечный график построены при помощи программы TREECONE.

3. Полиморфизм ключевых генов биодеградации нафталина.

Изученные к настоящему времени гены катаболизма нафталина у флуоресцирующих псевдомонад обладают большой степенью гомологии. Для исследования генетического разнообразия были выбраны ключевой ген nah1 оперона - ген большой субъединицы нафталин 1,2-диоксигеназы, nahAc, ключевой ген nah2 оперона - ген салицилат гидроксилазы, nahG, а также регуляторный ген naliR.

Для быстрой детекции генов салицилат гидроксилаз на основе известных последовательностей nahG были разработаны выроязденные прайыеры shcl_up и shcljo. Также были разработаны праймеры lf и 585г для амплификации последовательностей регуляторного гена nahR. Поскольку штагш Р. pulida АК5

утилизирует нафталин через салицилат и гентизат (Табл. 2), на основе nagß из Ralstonia sp. U2 (AF036940) и hybB из P.aeruginosa JB2 (AF087482) были разработаны вырожденные праймеры - 458f и 1224г для детекции гена большой субъединицы салицилат-5-гидроксилазы nagG, продукт которого катализирует реакцию превращения салицилата в гентизат.

ПЦР-анализ показал наличие гена паМс, кодирующего большую субъединицу нафталин 1,2-диоксигеназы во всех проанализированных образцах. Анализ полиморфизма генов nahAc проводошся путем RFLP ПЦР продуктов эндонуклеазой рестрикции НаеП1. Ранее, анализ последовательностей генов nahAc привел к разделению этих последовательностей на 2 группы: тип AN 10 (гены гомологичные nahAc из Р. stutzen AN 10) и ran С18 (гомологичные doxB из Pseudomonas sp. С18 и nahAc из P.putida G7) (Ferrero et al., 2002). Рестрикционный анализ ампликонов показал, что в 35 исследованных штаммах присутствует тип С18 гена nahAc. В 11 штаммах последовательность nahAc относится к типу AN10. Картины гидролиза ампликонов nahAc шести штаммов P. fluorescens (NL41, А24, А88, А89, А96, 1-16) были идентичны и не похожи ни на один из описанных типов.

М1234567

663 AN10

862 203 318 429 С18

317 ' 111 ' 437 . ab 4a 4^9 5^8 А88

^ 428 139 298 ^

Рис.З. Электрофореграмма рестрикции и карты гидролиза ПЦР-продуктов амплификации гена nahAc размером 865 п.н. эндонуклеазой НаеШ. типовых штаммов. M -Hyper Ladder lOObp (Bioline); 1 - NAH7; 2 - NK33; 3 - NK21K; 4 - NK22; 5 -NK32; б - А24; 7 - А88. Фрагменты разделяли в 2% агарозе.

Установленные нуклеотидные последовательности фрагментов гена nahAc из штаммов А88, А24 и 1-16 идентичны между собой на 99% и обозначены как тип -•- лея Идентичность нуклеотидных последовательностей nahAc А88, А24 и 1-16

составляет 87-88% как с nahAc из штамма Р. stutzen AN 10, так и с doxB из Pseudomonas sp. С18. Результаты кластерного анализа показали, что последовательности nahAc А88 образуют самостоятельную группу, которая занимает промежуточное положение между группами AN10 и С18 (Рис. 4).

100

10д| mhÄ£.PsLSMN3

Kahfi£.PsÄMlO JEJ' KähAc.PbLS402 L pahA3.PaPAKl

г лаМс.РШЗ KähAr,Pai4N4-l nahAc .PJA24 iahAc.Pfl-16

ШКйе.РЯ[АУ048759)

Ш)

гаВДс.РШрба гаМ.с.РрМСШР81б-4

dosBJPtpClS

nsgAcJtepU2

Рис. 4. Дендротрамма, иллюстрирующая взаимоотношения между внутренними областями генов паМс разных штаммов бактерий. Относительные дистанции и конечный график построены при помощи программы TREECONE. Номера использованных последовательностей в GenBank: Pseudomonas stutzeri LSMN3 (AF306427), P. stutzeri AN 10 (AF039533), P. belearica LS402 (AF306429), P. aeruginosa PAK1 (D84146), P. fluoresces A88 (AY433939), Pseudomonas sp. 4N4-1 (AJ496394), P. fluoresces A24 (AY433941), P. fluorescens 1-16 (AY433941), P. fluoresces (AY048759), P. ptttida G7 (M83949), P. putida BS202 (AF010471), P. fluorescens Lp6a (AY125981), P. putida NCIB9816-4 (AF491307), Ralstonia sp, U2 (AF036940).

Аналогичный подход был применен нами также для исследования разнообразия генов салицилат гадроксилаз. ПЦР-анализ показал наличие гена nahG во всех проанализированных образцах, за исключением производных штаммов BS202, BS3701 и BS3790, имеющих фенотип Nah'Saf, а также штамма Р. putida АК5, реализующего альтернативный пуп, деградации салицилата. Сравнение картин гидролиза эндонуклеазами рестрикции Rsal и Mspl ампликонов nahG исследованных штаммов с рестрикционными картами генов известных салицилат гидроксилаз позволило обнаружить шесть типов последовательностей nahG генов: NAH7, pDTGl, AN10, KF715, NKNS и А88. Два последние варианта nahG не были описаны ранее.

М123456789 10 123456789 10 M

tw — < w» w

Ь)

Рис. 5. Электрофоре1раммы рестрикции ПЦР-продукгов амплификации гена nahG размером 893 п.н. эндонуклеазами йий (А) и Mspl (Б): M -Hyper Ladder lOObp (Bioline); 1 - NAH7; 2 - A88; 3 -NK22 (тип AN10); 4 - OS18 и 5- OS19 (тип pDTGl); 6 - NKNS3, 7 - NKNS5 и 8 - NKNS7 (тип NKNS); 9 - NKNS15 (тип AN10); 10 - П-9 (тип KF715). Фрагменты разделяли в 3% агарозном геле.

Определение и анализ нуклеотидной последовательности фрагмента гена nahG штамма P. fluorescens NKNS3 (AY429511) показали, данный ген проявляет высокую гомологию с nahG штаммов P. putida KF715 и Р. stulzeri АЖО. Различия в последовательностях nahG штаммов NKNS3, AN10 и KF715 возникли за счет точечных мутаций и делеций триплетов. Выведенная аминокислотная последовательность фрагмента гена nahG штамма NKNS3 на 96% идентична аналогичным последовательностям NagG KF715 и AN10 (Рис. 4). Картины гидролиза Rsal и Mspl ампликонов nahG штаммов P. fluorescens NL41, А88, А89, А96 и 1-16 были полностью идентичны друг другу и отличались от картины гидролиза известных nahG генов. Идентичность определенной нуклеотидной последовательности ампликона nahG из штамма P. fluorescens А88 (AY433938) составляет 81-82% с nahG из архетшшческих плазмид NAH7 и pDTGl и 84-86% с nahG штамма NKNS3 и хромосомными генами nahG из Р. stulzeri AN10 и Р. putida KF715. Идентичность аминокислотной последовательности ампликона nahG А88 составляет 86-88% с аналогичными последовательностями вышеперечисленных салицилат гидроксилаз. Результаты кластерного анализа показали, что NahG из штамма А88 занимает обособленное положение (Рис. 6).

NahG KF715

NahG NAH7

NahG AN10

WahG NKWS3

0.01

NahG A88

NahG pDTG1

Рис. б. Дендрограмма, иллюстрирующая взаимоотношения между аминокислотными последовательностями «классических» салицилат гидроксилаз разных штаммов бактерий. Относительные дистанции и конечный график построены при помощи программы TREECONE. Номера использованных последовательностей в GenBank: P. siutzeri AN10 (AF039534), Р. pulida KF715 (S80995), P. ftuorescens NKNS3 (AY429511), P. fluorescera A88 (AY433938), P. pulida G7 (M60055), P. pulida NCÜ39816-4 (AF491307).

4. Вариабельность генетических систем катаболизма нафталина.

Встречаемость различных вариантов генов nahAc и nahG отличалась для исследованных штаммов-деструкторов, принадлежащих к разным видам. Наибольшее разнообразие вариантов последовательностей как nahAc, так и nahG наблюдалось у штаммов P.fluorescens, в то вредш как у представителей вида P.putida был обнаружен лишь один вариант гена большой субъединицы нафталин диоксигеназы - С18 и один вариант гена салицилат гидроксилазы - pDTGl. Исходя из выборки в 25 штаммов P.putida, изолированных из удаленных областей, можно предположить, что для деструкторов ПАУ данного вида сочетание вариантов nahAc - С18 и nahG - pDTGl является типичным. Независимо от видовой принадлежности штамма-хозяина для

плазмид биодеградации нафталина как Р- 7, так и Р-9 трупп несовместимости наиболее характерно сочетание генов nahAc тип С18 и nahG тип pDTGl. Вариант гена nahG, гомологичный nahG архетнпической плазмнды NAH7 Р-9 группы, оказался редким и обнаружен только в 2-х случаях в сочетаниях с различными типами генов nahAc- С18иА88.

Несмотря на продемонстрированное разнообразие вариантов nahAc и nahG, все эти варианты относятся к так называемым «классическим» ндй-генам, гомология последовательностей между собой у которых составляет более 80%. Однако, генетическое разнообразие не исчерпывается данными вариантами. Данные, полученные в настоящей работе, демонстрируют некоторую вариабельность организации катаболических систем биодеградации нафталина.

Qmtí

nahR ZnahGl

орто-щть

nahl -оперон

nahG мета-путь

Хромосома BS202 NPL-1

nahl -оперон

nahG мета -путь

Хромосома BS3701 PBS1141

nahl -оперон PBS1191

щ Хромосома BS3790

PBS1192

Рис. 6. Схема организации генов биодеградации нафталина штаммов Р. pulida BS202, BS3701 и BS3790

Плазмяды NPL-1, pBS1141 и pBS1191 относятся к p-подгруппе Р-9 группы несовместимости, имеют одинаковый размер (ЮОт.п.н.) и проявляют значительное сходство рестрикционных профилей (Рис. 1). Общим для них также является наличие функционирующего иаЫ-оперона и неэкспрессирующегося nahG гена. Штаммы-

хозяева этих плазмид, P. putida BS202, BS3701 и BS3790, способны к росту на нафталине и салицилате в качестве единственного источника углерода и энергии. В хромосоме штамма BS202 присутствует второй ген салицилат гидроксилазы (Соколов и др., 1998). Результаты данной работы также демонстрируют присутствие второго функционирующего гена салицилат гидроксилазы (nahGl) в хромосоме штамма BS3701 и в составе второй плазмиды pBS1192, размером 60 тин, в штамме BS3790 (Рис. 6). Опероны биодеградации часто обнаруживаются у псевдомонад, как в составе плазмидной, так и в хромосомной ДНК (Herrick et al., 1997; Rossello-Mora et al., 1994). Однако двуллазмидный контроль пути утилизации нафталина в литературе до настоящего времени не был описан.

У штаммов P. putida BS202, BS3701 и BS3790, а также у других Р-9 плазмид биодеградации, которые по своей структурной организации принадлежат к группе А, не удалось амплифицировать ре1уляторный ген nahR, последовательность которого отличается высокой консервативностью. Тем не менее, анализ удельных активностей ключевых ферментов биоде1радации показал индуцибельный синтез ферментов паИ2-оперона этих штаммов. Полученные данные мотут указывать на отличия в последовательности регуляторного гена этих штаммов с последовательностями nahR из NAH7 и pDTGl. Регуляторный ген также не удалось амплифицировать у ряда штаммов P. putida, у которых не было обнаружено плазмидной ДНК, таких как АК8 (Табл, 1). Однако, продемонстрированная для АК8 индуцибельность как nahl-, так и nah2-оперона, свидетельствует о наличии белка-регулятора. Таким образом, структура катаболических оперонов может варьировать и включать в себя негомологичные гены nahG и nahR.

6. Салицилат 5-гидроксилаза в штамме P. putida АК5.

Специфичная амплификация гена большой субъединицы салицилат 5-гидроксилазы (nagG) наблюдалась только в случае штамма P. putida АК5, который утилизирует нафталин через салицилат и гентизат. Нуклеотидная последовательность ампликона nagG штамма АК5 была определена, идентичность установленной нуклеотидной последовательности фрапаента гена nagG из штамма P. putida АК5 составила 80% с nagG из Ralstonia sp, U2 и 72% с hybB из P. aeruginosa JB2. Результаты кластерного анализа показали, что NagG из штамма АК5, образуя группу с известными салицилат 5-гидроксилазами, достоверно от них отличается (Рис. 7).

IQOI

Orf2 Burkholderia sp. DNT

NagG Ralstonia sp. U2

78 - NagG R solanacearum GMI1000

HybB P. aeruginosa JB2

100

NdsB Pigmentiphaga sp. NDS-2

NagG P.putida AK5

BphAlc N. aromaticivorans F199

Рис. 7. Дерево, иллюстрирующее взаимоотношения между внутренними областями генов, кодирующих большую субъединицу салицилат-5-гидроксилазы разных штаммов бактерий. Номера использованных последовательностей в GenBank: Burkholderia sp. DNT (AAB09764), Ralstonia sp. U2 (AF036940), Rsolanacearum GMI1000 (NP_519211), P.aeruginosa JB2 (AF087482), Pigmentiphaga sp. NDS-2 (AB098505), Novosphingobium aromaticivorans F199 (AAD04009).

Гомология выведенной аминокислотной последовательности с данными салицилат 5-гидроксилазами составляет от 76 до 83%.

Гибридизация с меченным зондом nagG показала, что последовательность nagG в штамме P. putida АК5 локализована в составе 1псР-7 плазмиды рАК5, где также находится ген nahAc, гомологичный nahAc плазмиды NAH7. Подобная организация генов биодеградации является уникальной. Штаммы, утилизирующие салицилат через гентизат являются менее изученными по сравнению с деструкторами, которые расщепляют салицилат через катехол по мета- или орто-щги. До настоящего времени было известно только две последовательности, кодирующие функциональную салицилат 5-щцроксилазу - nagGH из Ralstonia sp. U2 (Zhou et al., 2002) и hybBC из P.aeruginosa JB2 (Hickey et al., 2001), и только Ralstonia sp. U2 -содержит полный набор генов (nag - оперон), контролирующий утилизацию нафталина через гентизат.

В настоящей работе был впервые проведен сравнительный анализ организации генетических систем биодеградации нафталина штаммов флуоресцирующих псевдомонад, включая как nah]-, так и nah2-оперон. В большинстве случаев распространение катаболических оперонов происходит сцепленно в составе достаточно стабильных плазмид, однако обнаруженные в ряде случаев вариации в организации биодеградативных оперонов свидетельствует о том, что nahl- и nah2-опероны эволюционируют независимо друг от друга. Подтверждением этому являются обнаруженные новые сочетания генов па'пАс и nahG в одном и том же штамме, присутствие негомологичных генов nahG или nahR, сочетание генов салицилат 5-гидроксилазы nagG с «классическими» nahA - генами. Вероятно, благодаря рекомбинационным событиям под селективным давлением окружающей среды возникают новые комбинации катаболических генов и оперонов, которые приводят к появлению штаммов-деструкторов, наиболее приспособленных к существованию в условиях данной экологической ниши. Особый интерес представляют штаммы, имеющие ген салицилат гидроксилазы в транс-положении по отношению к raW-оперону. Процентное соотношение таких штаммов, в сравнении со штаммами, в которых путь деградации нафталина полностью контролируется плазмидами, сравнительно невелико и составляет около 3% от исследованных к настоящему времени штаммов-деструкторов нафталина. Однако, факт, что штаммы с подобной организацией генов биодеградации нафталина выделены из разных географически удаленных территорий, может указывать на одно из направлений эволюционирования генетических систем биодеградации полициклических ароматических углеводородов. По-видимому, существует селективное давление в пользу появления и распространения в популяции псевдомонад подобных вариантов генетических систем деградации ПАУ.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что близкородственные штаммы флуоресцирующих псевдомонад, способные к деградации нафталина и салицилата, широко распространены в географически удаленных регионах России и Украины.

2. Выдвинуто предположение, что основной причиной возникновения у мшфоорганизмов-деструкгоров нафталина способности к росту на фенантрене является изменение регуляции nafti-оперона.

3. Показано, что плазмиды биодеградации нафталина Р-9 группы несовместимости чаще встречаются в штаммах Pseudomonas putida, Р-7 группы - в штаммах Pseudomonas fluorescens.

4. Исследованные в настоящей работе плазмиды биодеградации нафталина 1псР-9 группы по структурной организации подразделяются на 3 группы. Установлена корреляция между строением решшкона (IncP-9ß и IncP-95-подгруппы) и структурой плазмиды в целом.

5. Обнаружено, что структура катаболических оперонов может варьировать. Установлено, что в ряде случаев ключевые гены биодеградации нафталина, а также nah1 и nah2 опероны могут перемещаться и эволюционировать независимо друг от друга, образуя различные сочетания у разных штаммов.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1. Кошелева И.А., Балашова Н.В., Измалкова Т.Ю., Филонов А.Е., Соколов С.Л., Слепенышн А.В., Воронин A.M. Деградация фенангрена мутантными штаммами-деструкторами нафталина. Микробиология, 2000. Т.69. В.6. С.783-789.

2. Кошелева И.А., Измалкова Т.Ю., Соколов С.Л., Сазонова О.И., Воронин A.M.. Структурная и функциональная вариабельность генетических систем катаболизма полицикдических ароматических углеводородов у штаммов Pseudomonas puttda. Генетика. 2003. Т.39. № 9. С.1185-92.

3. Измалкова Т.Ю., Сазонова О.И., Соколов С.Л., Кошелева И.А., Воронин A.M. Разнообразие генетических систем биодеградации нафталина у штаммов Pseudomonas fluoresces II Микробиология, 2005. Т.74. №1.

4. Измалкова Т.Ю., Соколов С.Л., Кошелева И.А. Штамм Pseudomonas fluoresces BS3790 - деструктор полициклических ароматических углеводородов // тезисы докладов IV Путинской конференции молодых ученых. 1999.

5. Boronin А.М., Kosheleva I.A., Mavrodi D.V., Izmalkova T.Y., Sokolov S.L. Diversity of plasmids bearing genes encoding naphthalene catabolism in fluorescent Pseudomonas spp. In: Abstracts Book of "Pseudomonas 2001" Congress, Brussels, Belgium, 2001, P. 149.

6. Kosheleva I.A., Sokolov S.L., Izmalkova T.Y., Mavrodi D.V., Boronin A.M. Diversity of plasmids controlling biodégradation of naphthalene in Pseudomonas strains. In: Abstracts Book of Third symposium of the EU-concerted action on "Mobile genetic elements4 contribution to bacterial adaptability and diversity" (MECBAD), Berlin, Germany, 2001, P.113.

7. Измалкова Т.Ю., Сазонова О.И., Кошелева И.А. Разнообразие генетических систем биодеградации нафталина у штаммов флуоресцирующих псевдомонад // тезисы докладов VII Путинской конференции молодых ученых. 2003.

8. Izmalkova T.Yu., Sokolov S.L., Kosheleva I.A., Boronin A.M. Classification of naphthalene degradation IncP-9 plasmids of fluorescent Pseudomonas strains. In: Abstracts Book of Г1 FEMS Congress of European Microbiologists, Ljubljana, Slovenia, 2003. P. 183.

Принято к исполнению 23/12/2004 Исполнено 24/12/2004

Заказ № 526 Тираж: 80 экз..

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095) 318-40-68 www.autoreferat.ru

РНБ Русский фонд

2QQ7-4 17558

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Измалкова, Татьяна Юрьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИХ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ.

1.2. БИОЛОГИЧЕСКАЯ ДЕСТРУКЦИЯ ПАУ.

1.3. БИОХИМИЧЕСКИЕ ПУТИ МЕТАБОЛИЗМА ПАУ БАКТЕРИЯМИ.

1.3.1. Биохимические пути биодеградации нафталина.

1.3.2. Биохимические пути деградации фенантрена.

1.4. РАЗНООБРАЗИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ

СИСТЕМ ДЕГРАДАЦИИ ПАУ.

1.4.1. Гены катаболизма ПАУ грам - отрицательных бактерий.

1.4.1.1. Организация генов катаболизма нафталина плазмиды NAH7.

1.4.1.2. Регуляция генов катаболизма нафталина плазмиды NAH7.

1.4.1.3. Генетические системы катаболизма нафталина аналогичные nah-тенш плазмиды NAH7.

1.4.1.4. Генетические системы катаболизма нафталина, отличающиеся от архетипа плазмиды NAH7:. а) phd-гены Comamonas testosteroni. б) nag-гены Ralstonia sp. штамм U2. в) /г/ш-гены Burkholderia sp. RP г) гены катаболизма ПАУ бактерий рода Sphingomonas. д)phn-гены Cycloclasticus sp. А5.

1.4.2, Гены катаболизма ПАУ грам - положительных бактерий.

1.4.2.1. war-гены бактерий рода Rhodococcus.

1.4.2.2. Организация генов катаболизма фенантрена Nocardioides sp. КР7.

1.5. УЧАСТИЕ ПЛАЗМИД В БИОДЕГРАДАЦИИ ПАУ.

1.6. ПУТИ ЭВОЛЮЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКИХ СИСТЕМ

КАТАБОЛИЗМА ПАУ.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды.

2.2. Питательные среды и условия роста.

2.3. Выделение бактериальных штаммов из почвенных образцов.

2.4 Выделение тотальной ДНКбактерий.

2.5. Выделение плазмидной ДНК.

2.6. Конъюгационный перенос плазмид.

2.7. Полимеразная цепная реакция.

2.8. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции.

2.9. Электрофорез в агарозном геле.

2.10. Препаративное выделение фрагментов ДНК из агарозного геля.

2.11 Мечение ДНК методом рассеянной затравки.

2.12 Гибридизация ДНК на нейлоновых фильтрах.

2.13. .Цитирование ДНК.

2.14. Приготовление компетентных клеток E.coli.

2.15 Трансформация клеток E.coli плазмидной ДНК.

2.16 Определение нуклеотидной последовательности ДНК.

2.17 Определение удельных активностей ферментов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Изоляция и характеристика штаммов-деструкторов нафталина.

3.2. Генотипический анализ штаммов Р. fluorescens.

3.3. Участие плазмид в генетическом контроле деградации нафталина и фенантрена.

3.4. Анализ удельных активностей ферментов биодеградации нафталина, фенантрена и салицилата.

3.5. Амплификация и RFLP - анализ ключевых генов биодеградации нафталина.

3.6.Анализ генов nahAc штаммов-деструкторов нафталина.

3.7. Анализ генов nahG штаммов-деструкторов.

3.8. Салицилат 5-гидроксилаза в штамме Р. putida АК5.

3.9. Амплификация регуляторного гена nahR.

3.10. Амплификация генов орто- а мета- пути деградации катехола.

3.11. Анализ штаммов на наличие плазмид биодеградации нафталина 1псР-9 группы.

3.12. Геномный фингерпринт (rep-PCR) штаммов-деструкторов нафталина, содержащих Р-9 плазм иды.

3.13. RFLP - анализ плазмид р и 5 -подгрупп Р-9 группы несовместимости.

3.14. Анализ штаммов - деструкторов нафталина на наличие плазмид 1псР-7 группы.

3.15. Локализация генов биодеградации нафталина в штаммах - хозяевах 1псР-7 плазмид.

3.16. RFLP - анализ 1псР-7 плазмид.

4. ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разнообразие генетических систем катаболизма нафталина штаммов флуоресцирующих псевдомонад"

Актуальность проблемы

Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) являются широко распространенными соединениями, загрязняющими окружающую среду. Развитие промышленности приводит к росту загрязнения окружающей среды отходами индустриального производства, в частности, ПАУ. Основную роль в деградации ПАУ в природных условиях играет микробная утилизация. Большим метаболическим потенциалом в отношении ароматических углеводородов обладают бактерии рода Pseudomonas, способные к полной минерализации или частичной трансформации таких соединений как нафталин, фенантрен, флуорен и других (Cerniglia, 1984). Наиболее изученными в настоящее время являются различные аспекты биодеградации нафталина (Sutherland et al., 1995). Генетический контроль деградации нафталина детально изучен на примере архетипической плазмиды NAH7, размером 83 т.п.н., которая является коньюгативной и содержит всю генетическую информацию, необходимую для конверсии нафталина в пируват и ацетальдегид (Dunn and Gunsalus, 1973). Катаболические гены плазмиды NAH7 организованы в два оперона: nah\ (nahAaAbAcAdBFCED) контролирует превращение нафталина в салицилат, nah! (nahGTHINLOMKJ) - утилизацию салицилата до интермедиатов цикла трикарбоновых кислот (Simon et.al., 1993; Eaton, 1994). Экспрессия обоих оперонов находится под позитивным контролем регуляторного гена rtahR (Schell, 1985). У штаммов флуоресцирующих псевдомонад гены утилизации нафталина и его производных могут иметь как плазмидную, так и хромосомную локализацию (Herrick et.al., 1997). Описано несколько групп «а/7-подобных генов обладающих консервативной организацией и высокой степенью гомологии с лай-генами архетипической плазмиды NAH 7: nah- и ndo- гены Pseudomonas putida (Eaton, 1994; Simon etal., 1993; Kurkela et.al., 1988); pah - гены штаммов P. putida, деградирующих фенантрен (Kiyohara et al., 1994; Takizawa et al., 1994), и dox - гены из штамма Pseudomonas sp., утилизирующего дибензотиофен (Denome et.al., 1993).

Адаптация микробных сообществ к условиям окружающей среды в большой степени определяется переносом и перегруппировкой генетического материала. Катаболизм нафталина бактериями рода Pseudomonas часто контролируется конъюгативными плазм идами большого размера, что обеспечивает распространение биодеградативных признаков среди микроорганизмов. Известно, что большинство изученных плазмид биодеградации ПАУ, как правило, относятся к группам несовместимости Р-2, Р-7 и Р-9 (Кочетков и Воронин, 1984). Основные исследования организации катаболических генов проводили на плазмидах NAH7 и pDTGl, которые принадлежат Р-9 группе несовместимости. Плазмиды катаболизма нафталина других групп несовместимости в настоящий момент являются менее изученными. Поскольку несовместимость плазмид связана со спецификой организации их базовых репликонов, принадлежность плазмиды к определенной группе несовместимости определяет круг её бактериальных хозяев, а также возможность совмещения различных признаков в одном штамме микроорганизмов. Вопрос о взаимосвязи между плазмидными репликонами и катаболическими генами, а также определенными группами плазмид биодеградации и их бактериальными хозяевами, остается открытым.

Катаболические опероны часто располагаются внутри мобильных элементов. Транспозонная организация катаболических оперонов, а также высокая гомология генов биодеградации подразумевают возможность их независимой эволюции путем транспозиционных и рекомбинационных событий, что наряду с горизонтальным генетическим переносом является мощным фактором распространения таких оперонов как внутри, так и между микробными популяциями. Изучение разнообразия генетических систем деградации ПАУ способствует пониманию эволюционных процессов, лежащих в основе существующих в настоящее время катаболических путей.

Цель и задачи работы:

Целью настоящей работы являлся анализ генетических систем катаболизма нафталина штаммов флуоресцирующих псевдомонад, изолированных из различных географических регионов Российской Федерации, Украины и Беларуси и способных к утилизации нафталина и его производных.

В соответствии целью, в работе были поставлены следующие задачи:

2. Изучение роли плазмид в генетическом контроле деградации ПАУ.

3. Определение биохимических путей деградации нафталина, фенантрена и салицилата штаммами-деструкторами.

4. Анализ полиморфизма ключевых генов биодеградации нафталина.

5. Изучение плазмид катаболизма нафталина, принадлежащих к группам несовместимости Р-7 и Р-9.

Научная новизна

В настоящей работе проведен анализ генетических систем катаболизма нафталина 52 штаммов флуоресцирующих псевдомонад, изолированных из различных регионов России, Украины и Беларуси. Установление филогенетической взаимосвязи между штаммами одного вида показало, что многие изолированные из различных географически удаленных регионов Российской Федерации деструкторы ПАУ являются близкородственными.

Выделена новая группа генов nahAc. Разработаны новые специфические праймеры для обнаружения методом ПЦР и характеристики генов nahG и nahR. Впервые изучено разнообразие генов nahG, обнаружены два новых варианта последовательностей гена nahG. Показано, что встречаемость различных вариантов генов nahAc и nahG отличается для штаммов-деструкторов, принадлежащих к разным видам. Обнаружено существование вариаций в организации биодеградативных оперонов, включая наличие различных сочетаний генов nahAc и nahG в одном и том же штамме, а также присутствие негомологичных генов nahG или nahR. Впервые обнаружено сочетание генов салицилат 5-гидроксилазы nagG с «классическими» nahA - генами. Изучены штаммы, имеющие ген салицилат гидроксилазы в транс-положении по отношению к иай7-оперону. Подобный двуплазмидный контроль пути утилизации нафталина до настоящего времени не был описан в литературе.

Обнаружено влияние характера синтеза нафталин диоксигеназы на способность микроорганизмов-деструкторов нафталина утилизировать более высокомолекулярные ПАУ (фенантрен).

Проведен анализ плазмид утилизации нафталина и салицилата групп несовместимости Р-7 и Р-9. Показано, что плазмиды биодеградации нафталина Р-9 группы несовместимости чаще встречаются в штаммах Pseudomonas putida, в то время как для плазмид группы несовместимости Р-7, по-видимому, основным хозяином является Р. fluorescens. Исследованные плазмиды деградации нафталина IncP-9 группы по структурной организации подразделяются на три подгруппы (А, В и С). Наблюдается некоторая корреляция между строением репликона (IncP-9ß и IncP-9S - подгруппы) и структурой плазмиды в целом. Плазмиды 1псР-7 отличаются большим структурным разнообразием и не образуют какие-либо группы.

Практическая значимость работы

Анализ генетических систем катаболизма ПАУ представляет несомненный интерес как в фундаментальном, так и в прикладном аспектах. Изучение организации генетических систем катаболизма ПАУ является основой понимания эволюционных процессов, приводящих к возникновению разнообразия генов катаболических путей и изменению спектра утилизируемых субстратов, вследствие горизонтального переноса генов, транспозиционных событий, перестановок в ДНК, слияния генов, точечных мутаций и т.д. Полученная в настоящей работе информация позволяет расширить наши представления об молекулярных механизмах адаптации микроорганизмов к загрязнению окружающей среды ксенобиотиками, а также является предпосылкой для дальнейших исследований.

С прикладной точки зрения, разработанные в настоящей работе специфические праймеры могут быть использованы для обнаружения и характеристики штаммов-деструкторов, а также для мониторинга популяций бактериальных деструкторов в загрязненной почве. Использование ПЦР со специфическими праймерами позволяет также оценить биодеградативный потенциал загрязненной территории. Приобретение новых биодеградативных способностей микроорганизмами под воздействием селективного давления может происходить не только в открытой среде, но и в лабораторных условиях. Охарактеризованные в данной работе катаболические плазмиды могут быть использованы для трансформации аборигенных штаммов, которые более адаптированы к окружающей среде и предпочтительны для биоремедиации, с целью получения микроорганизмов с более широким спектром утилизируемых субстратов. Штаммы, способные к утилизации не одного, а нескольких ПАУ, представляют интерес не только для исследования основных принципов биодеградации ПАУ, но и, по-видимому, перспективны для использования их в биотехнологиях очистки окружающей среды.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: IV Пущи некая конференция молодых ученых, 1999; VII Путинская конференция молодых ученых, 2003; "Pseudomonas 2001" Congress, Brüssels, Belghim, 2001; Third symposium of the EU-concerted action on "Mobile genetic elements' contribution to bacterial adaptability and diversity" (MECBAD), Berlin, Geimany, 2001; 1* FEMS Congress of European Microbiologists, Ljubljana, Slovenia, 2003.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 3 статьи и 5 тезисов.

Структура и объем диссертации

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Измалкова, Татьяна Юрьевна

выводы

2. Выдвинуто предположение, что основной причиной возникновения у микроорганизмов-деструкторов нафталина способности к росту на фенантрене является изменение регуляции nahl-oперона.

4. Исследованные в настоящей работе плазмиды биодеградации нафталина IncP-9 группы по структурной организации подразделяются на 3 группы. Установлена корреляция между строением репликона (IncP-9ß и 1псР-95-подгруппы) и структурой плазмиды в целом.

5. Обнаружено, что структура катаболических оперонов может варьировать. Установлено, что в ряде случаев ключевые гены биодеградации нафталина, а также nahl и паИ2 опероны могут перемещаться и эволюционировать независимо друг от друга, образуя различные сочетания у разных штаммов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Измалкова, Татьяна Юрьевна, Пущино

1. Балашова Н.В., Кошелева И.А., Филонов А.Е., Гаязов Р.Р., Воронин А.М. Штамм Pseudomonas putida BS3701 - деструктор фенантрена и нафталина // Микробиология. 1997. Т. 66. С. 488-493.

2. Воронин А.М., Кулакова А.Н., Цой Т.В., Кошелева И.А., Кочетков В.В. Молчащие гены мета пути окисления катехола в составе плазмид биодеградации нафталина // Биохимия. 1988. Т. 229. N 1. С. 237-240.

3. Доналдсон Н. Химия и технология соединений нафталинового ряда. М.: Наука. 1963. с.655.

4. Кочетков В.В. Плазмиды биодеградации нафталина у бактерий рода Pseudomonas II Дисс. канд. биол. наук, 1985. С. 1-145.

5. Кочетков В.В., Воронин А.М. Сравнительное изучение плазмид, контролирующих биодеградацию нафталина культурой Pseudomonas И Микробиология. 1984. Т. 53. С. 639-644.

6. Кошелева И.А., Балашова Н.В., Измалкова Т.Ю., Филонов А.Е., Соколов C.JL, Слепенькин A.B., Боронин А.М. Деградация фенантрена мутантными штаммами-деструкторами нафталина // Микробиология. 2000. Т.69. В.6. С.783-789.

7. Кошелева И.А., Соколов СЛ., Балашова Н.В., Филонов А.Е., Мелешко Е.И., Гаязов Р.Р., Боронин А.М. Генетический контроль биодеградации нафталина штаммом Pseudomonas sp. 8909NII Генетика. 1997. Т.ЗЗ. № 6. С. 762-768.

8. Кошелева И.А., Цой Т.В., Кулакова А.Н., Боронин А.М. Сравнительный анализ организации плазмиды NPL-1, контролирующей окисление нафталина клетками Pseudomonas putida и ее производных // Генетика. 1986. Т.22. № 10. С. 23892397.

9. Маниатис Т., Фрич Э., Самбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М., «Мир». 1984. 480 с.

10. Ю.Соколов СЛ., Кошелева И.А., Мавроди О.В., Мавроди Д.В., Боронин А.М. Структурная организация и экспрессия гена салицилат гидроксилазы штамма Pseudomonas putida BS814 (pBS106) II Генетика. 1998. T.34. № 2. С. 206-212.

11. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. Basic local alignment search tool // J. Mol. Biol. 1990. V. 215. P. 403-410.

12. Andreoni V, Bernasconi S, Colombo M, van Beilen JB, Cavalca L. Detection of genes for alkane and naphthalene catabolism in Rhodococcus sp. strain 1BN // Environ. Microbiol. 2000. V. 2. P. 572-577.

13. Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., Struhl, K. (ed.), 1999. Shot Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, Inc. 4th ed., p. 1056.

14. Barbas, J.T., Sigman, M.E. and Dabestani, R. Photochemical oxidation of phenanthrene sorbed on silica-gel // Environ. Sci. Technol. 1996. V. 30. P. 17761780.

15. Barnsley E.A. The induction of the enzymes of naphthalene metabolism in Pseudomonads by salicylate and 2-aminobenzoate // J.Gen.Microbiol., 1975. Vol.88. P. 193-195.

16. Barnsley E.A. Naphthalene metabolism by pseudomonas: The oxidation of 1,2-dihydroxynaphthalene to 2-hydroxychromene-2-carboxylic acid and formation of 2'-hydroxybenzalpyruvate. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1976. Vol.72. P. 11161121.

17. Barriault D., Durand J., Maaroufi H., Eltis L.D., Sylvestre M. Degradation of polychlorinated biphenyl metabolites by naphthalene-catabolizing enzymes // Appl. Environm. Microbiol., 1998. Vol.64. P. 4637-4642.

18. Blumer M. Polycyclic aromatic hydrocarbons in nature // Sci. Amer. 1976 V. 234(3). P. 35 45.

19. Boronin, A.M. Diversity of Pseudomonas plasmids: To what extent? // FEMS Microbiology Letters. 1992. V. 100. P. 461-468.

20. Bosch R., Garcia-Valdes E., Moore E.R.B. Genetic characterization and evolutionary implications of a chromosomally encoded naphthalene-degradation upper pathway from Pseudomonas stutzeri AN10 // Gene. 1999a. V.236. P. 149-157.

21. Bosch R, Garcia-Valdes E., Moore E.R.B. Complete nucleotide sequence and evolutionary significance of a chromosomally encoded naphthalene-degradation lower pathway from Pseudomonas stutzeri AN 10 // Gene. 2000. V.245. P. 65-74.

22. Bosch R, Moore E.R.B., Garcia-Valdes E., Pieper D.H. NahW, a novel, inducible salicylate hydroxylase involved in mineralization of naphthalene by Pseudomonas stutzeri AN10 // J.Bacteriol. 1999b. Vol.181. P.2315-2322.

23. Bumpus J.A. Biodégradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by Phanerochaete chrysosporium II Appl. Environm. Microbiol., 1989. Vol.55. P. 154-158.

24. Cane P.A., Williams P.A. The Plasmid-coded Metabolism of Naphthalene and 2-Methylnaphthalene in Pseudomonas strains: Phenotypic Changes Correlated with Structural modification of the Plasmid pWW60-l// J. Gen. Microbiol. 1982. V.128. P. 2281-2290.

25. Cavalieri EL, Rogan EG. Central role of radical cations in metabolic activation of polycyclic aromatic hydrocarbons // Xenobiotica. 1995 V. 25(7). P. 677-88.

26. Cebolla A, Sousa C, de Lorenzo V. Effector specificity mutants of the transcriptional activator NahR of naphthalene degrading Pseudomonas define protein sites involved in binding of aromatic inducers // J Biol Chem. 1997. V. 272. P. 3986-3992.

27. Cerniglia C.E. Biodégradation of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons // Curr. Opin. Biotechnol. 1993. V. 4. P. 331 338.

28. Cerniglia C.E. Microbial Metabolism of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons // Larkin A (Ed) Advances in Applied Microbiology. Academic Press. New York. 1984. V.30. P.31-37.

29. Cerniglia C.E., Yang S.K. Stereoselective metabolism of anthracene and phenanthrene by the fungus Cunninghamella elegans II Appl Environ Microbiol 1984. V. 47(1). P. 119-124.

30. Coates J.D., Woodward J., Allen J., Philp P., Lovley D.R. Anaerobic degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons and alkanes in petroleum-contaminated marine harbor sediments // Appl Environ Microbiol. 1997. V. 63. P. 3589-3593.

31. Crawford R.L. Novel pathway for degradation of protocatechuic acid in Bacillus Species //J. Bacterid., 1974. Vol. 121. P. 531-536.

32. Crawford R.L., Frick T.D. Purification and properties of gentisate-1,2-dioxygenase from Moraxella osloensis II J. Bacteriol. 1975. V.121. P. 794-799.

33. Dagher F, Deziel E, Lirette P, Paquette G, Bisaillon JG, Villemur R. Comparative study of five polycyclic aromatic hydrocarbon degrading bacterial strains isolated from contaminated soils // Can. J. Microbiol. 1997. V. 43. P. 368-377.

34. Dagley S., Evans W.C., Ribbone D.W. New pathways in the oxidative metabolizm of aromatic compounds by microorganisms //Nature, 1960. P. 188-560.

35. Davies J.I., Evans W.C. Oxidative metabolism of naphthalene by soil pseudomonas: The ring-fission mechanism // J. Biochem., 1964. Vol.91. P. 251-261.

36. Dean-Ross D, Moody JD, Freeman JP, Doerge DR, Cerniglia CE. Metabolism of anthracene by a Rhodococcus species // FEMS Microbiol. Lett. 2001. V. 204. P. 205211.

37. Delaney, S.M., Mavrodi, D.V., Bonsall, R.F., Thomashow, L.S., 2001. phzO, a gene for biosynthesis of 2-hydroxylated phenazine compounds in Pseudomonas aureofaciens 30-84. J. Bacteriol. 183, 318-327.

38. Dennis J.J., Zylstra G.J. Complete sequence and genetic organization of pDTGl, the 83 kilobase naphthalene degradation plasmid from Pseudomonas putida strain NCIB 9816-4 // J. Mol.Biot. 2004. V. 341(3). P. 753-768.

39. Denome S.A., Stanley D.C., Olston E.S., Young K.D. Metabolism of dibenzothiophene and naphthalene inPseudomonas strains: complete DNA sequence of an upper naphthalene catabolic pathway // J.Bacteriol., 1993. Vol.176. P. 21582164.

40. Dombek P.E., Johnson L.K., Zimmerley S.T., Sadowsky M.J. Use of repetitive DNA sequences and the PCR to differentiate Escherichia coli isoletes from human and animal sources // Appl.Environnm.Microbiol., 2000. Vol.66. P. 2572-2577.

41. Dua D., Meera S. Purification and characterization of naphthalene oxygenase from Corynebacterium renale II J. Bacterid. 1981. Vol.120. P.461^165.

42. Dunn N.W., Gunsalus I.C. Transmissible plasmid coding early enzymes of naphthalene oxidation in Pseudomonas putida // J.Bacteriol., 1973. Vol. 114. P. 974979.

43. Eaton R.W., Chapman P.J. Bacterial metabolism of naphthalene: Construction and use of recombinant bacteria to study ring cleavage of 1,2-dihydroxynaphthalene and subsequent reactions//J. Bacterid. 1992. V.174. P. 7542-7552.

44. Eaton R.W., Selifonova O.V., Gedney R.M. Isopropylbenzene catabolic pathway in Pseudomonas putida RE204: nucleotide sequence analysis of the ipb operon and neighboring DNA from pRE4 // Biodégradation. 1998. V.9. P. 119-132.

45. Ensley B.D., Gibson D.T. Naphthalene dioxygenase: purification and properties of a terminal oxygenase component // J Bacterid. 1983. V. 155. P. 505-511.

46. Ensley B.D., Haigler E.B. Naphthalene dioxygenase from Pseudomonas NCIB 9816 // Methods in enzymology, 1990. V.188. P. 46-52.

47. Evans C.G.T., Herbert D., Tempest D.B. The continuous cultivation of microorganisms. 2. Construction of a chemostat // Methods in Microbiology. 1970. V.2. P. 277-327.

48. Evans W.C., Fernley H.N. Griffiths E. Oxidative metabolism of phenantrene and anthracene by soil pseudomonads: the ring-fission mechanism // J Biochem., 1965. Vol. 95. P. 819-831.

49. Falco G., Domingo J.L., Llobet J.M., Teixido A., Casas C., Muller L. Polycyclic aromatic hydrocarbons in foods: human exposure through the diet in Catalonia, Spain // J.Food Prot. 2003. V.66. P.2325-2331.

50. Feist C.F., Hegeman G.D. Phenol and benzoate metabolism by Pseudomonas putida of tangential pathways //J.Bacteriol. 1969. V.100. P. 869-877.

51. Flowers-Geary L, Bleczinki W, Harvey RG, Penning TM. Cytotoxicity and mutagenicity of polycyclic aromatic hydrocarbon ortho-quinones produced by dihydrodiol dehydrogenase //Chem Biol Interact. 1996. V. 5;99(l-3). P.55-72.

52. Foght J.M., Westlake D.W. Transposon and spontaneous deletion mutants of plasmid-borne genes encoding polycyclic aromatic hydrocarbon degradation by a strain of Pseudomonas fluorescens II Biodégradation. 1996. V.7. P. 353-366.

53. Fredrickson J.K., Balkwill D.L., Drake G.R, Romine M.F., Ringelberg D.B., White D.C. Aromatic-degrading Sphingomonas isolates from the deep subsurface // Appl. Environ Microbiol. 1995. V. 61. P. 1917-1922.

54. Fuenmayor S.L., Wild M., Boyles A.L., Williams P.A. A gene cluster encoding steps in conversion of naphthalene to gentisate in Pseudomonas sp. strain U2 // J. Bacterid., 1998. Vol.180. P. 2522-2530.

55. Galushko A., Minz D., Schink B., Widdel F. Anaerobic degradation of naphthalene by a pure .culture of a novel type of marine sulphate-reducing bacterium // Environ Microbiol. 1999. V. 1. P. 415-420.

56. Greated A., Thomas C.M. A pair of PCR primers for IncP-9 plasmids // Microbiology. 1999. V.145. P.3003-3004.

57. Gomaa EA, Gray JI, Rabie S, Lopez-Bote C, Booren AM. Polycyclic aromatic hydrocarbons in smoked food products and commercial liquid smoke flavourings // Food Addit Contain. 1993. V.10(5). P. 503-21.

58. Gloyal A.K., Zylstra G.J. Molecular cloning of novel genes for polycyclic aromatic hydrocarbons degradation from Comamonas testosteroni GZ39 // Appl. Environm. Microbiol., 1996. V. 62. P. 230-236.

59. Gloyal A.K., Zylstra G.J. Genetics of naphthalene and phenanthrene degradation by Comamonas testosteroni II J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 1997. V. 19. P. 401-406.

60. Grimm A.C., Harwood C.S. NahY, a catabolic plasmid-encoded receptor required for chemotaxis of Pseudomonas putida to the aromatic hydrocarbon naphthalene // J. Bacterid., 1999. Vol.181. P. 3310-3316.

61. Grand E., Denecke D., Eichenlaub R. Naphthalene degradation via salicylate and gentisate by Rodococcus sp strain B4 // Appl. Environm. Microbiol., 1992. V. 58. P. 1874-1877.

62. Guengerich FP. Metabolic activation of carcinogens // Pharmacol Ther. 1992. V. 54(1). P. 17-61.

63. Habe H., Omori T. Genetics of polycyclic aromatic hydrocarbon metabolism in diverse aerobic bacteria // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003. V.67. P.225-243.

64. Haigler B.E., Gibson D.T. Purification and properties of HA^H-ferredoxinNAP reductase, a component of naphthalene dioxygenase from Pseudomonas sp. strain NCIB 9816 // J Bacterid. 1990a. V. 172. P. 457-464.

65. Haigler B.E., Gibson D.T. Purification and properties of ferredoxinNAP, a component of naphthalene dioxygenase from Pseudomonas sp. strain NCIB 9816 // J Bacteriol. 19906. V. 172. P. 465-468.

66. Hammel K.E., Green B., Gai W.Z. Ring Fission of Anthracene by a Eukaryote // Proc Natl Acad Sci USA. 1991. V. 88(23). P. 10605-10608.

67. Hegeman G.D. Synthesis of enzymes by the wild type // J. Bacteriol. 1966. V.91. P. 1140-1154.

68. Herrick J.B., Stuart-Keil K.G., Ghiorse W.C., Madsen E.L. Natural horizontal transfer of a naphthalene dioxygenase gene between bacteria native to a coal tar-contaminated field site // Appl. Environm. Microbiol., 1997. Vol. 63. P. 2330-2337.

69. Hintner J. P., Lechner C., Riegert U., Kuhm A.E., Storm T., Reemtsma T., Stolz A. Direct ring fission of salicylate by a salicylate 1,2-dioxygenase activity from Pseudaminobacter salicylatoxidans // J. Bacteriol. 2001. V. 183. P. 6936-6942.

70. Hohnstock A.M., Stuart-Keil K.G., Kull E.E., Madsen E.L. Naphthalene and donor cell density influence field conjugation of naphthalene catabolism plasmids // Appl. Environm. Microbiol. 2000. V. 66. P. 3088-3092.

71. Jeffrey A.M., Yeh H.J., Jerina D.M., Patel T.R., Davey J.F., Gibson D.T. Initial reactions in the oxidation of naphthalene by Pseudomonas putida // Biochemistry. 1975. V. 14(3). P. 575-84.

72. Jones R.M., Britt-Compton B., Williams P.A. The naphthalene catabolic (nag) genes of Ralstonia sp. strain U2 are on operon that is regulated by NagR, a LysR-type transcriptional regulator//J. Bacterid. 2003. V.185. P.5847-5853.

73. Ka JO, Tiedje JM. Integration and excision of a 2,4-dichlorophenoxyacetic acid-degradative plasmid in Alcaligenes paradoxus and evidence of its natural intergeneric transfer// J Bacteriol. 1994. V. 176. P. 5284-5289.

74. Kalb VF, Bernlohr RW. A new spectrophotometric assay for protein in cell extract // Anal. Biochem. 1977. V.82. P. 362-366.

75. Kasai Y., Kishira H., Harayama S. Bacteria belonging to the genus Cycloclasticus play a primary role in the degradation of aromatic hydrocarbons released in a marine environment // Appl.Environ.Microbiol., 2002. Vol. 68. P. 5625-5633.

76. Kasai Y., Shindo K., Harayama S., Misawa N. Molecular characterization and the substrate preference of a polycyclic aromatic hydrocarbons dioxygenase from Cycloclasticus sp. strain A5 // Appl.Environ.Microbiol., 2003. Vol. 69. P. 6688-6697.

77. Kauppi B, Lee K, Carredano E, Parales RE, Gibson DT, Eklund H, Ramaswamy S. Structure of an aromatic-ring-hydroxylating dioxygenase-naphthalene 1,2-dioxygenase // Structure. 1998. V. 6. P. 571-586.

78. Kim E, Zylstra GJ. Functional analysis of genes involved in biphenyl, naphthalene, phenanthrene, and m-xylene degradation by Sphingomonas yanoikuyae B1 //J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 1999. V. 23. P. 294-302.

79. Kiyohara H., Nagao K., Nomi R. Degradation of phenanthrene through 0-pthalate by imAeromonas sp., //Agril. Biol. Chem., 1976. Vol.40. P. 1075-1082.

80. Kiyohara H., Nagao K. Enzymatic conversion of l-hydroxy-2-naphthoate in phenanthrene-grown Aeromonas sp.S45Pl // Agril. Biol. Chem., 1977. Vol.41. P. 705-707.

81. Kiyohara H., Nagao K. The Catabolism of phenanthrene and naphthalene by bacteria // J. Gen. Microbiol., 1978. Vol.105. P.69-75.

82. Kiyohara H., Nagao K., Yana K. Rapid screen for bacteria degrading water-insoluble, solid hydrocarbons on agar plates // Appl. Environ. Microbiol. 1982a. V.43. P. 454457.

83. Kiyohara H., Nagao K., Kouno K., Yano K. Phenanthrene-degrading phenotype of Alcaligenes faecalis AFK2 // Appl.Environ.Microbiol., 1982b. Vol. 43. P. 458-461.

84. Keith L.H., Telliard W.A. Priority pollutants I. A perspective view // Environ. Sci. Technol. 1979. V. 13. P. 416-423.

85. Krasowiak, R., Smalla, K., Sokolov, S., Kosheleva, I., Titok, M., Thomas, C.M., 2002. PCR primers for detection and characterization of IncP-9 plasmids. FEMS Microbiol. Ecol. V. 2(2), P. 217-225.

86. Krieg, N.J., Holt J.G. (ed.), 1984.Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Williams & Wilkins, Baltimore, MD.

87. Kulakov LA, Allen CC, Lipscomb DA, Larkin MJ. Cloning and characterization of a novel cis-naphthalene dihydrodiol dehydrogenase gene (narB) from Rhodococcus sp. NCIMB12038 // FEMS Microbiol. Lett. 2000. V. 182. P. 327-331.

88. Kurkela S.H., Lehvaslaiho E.T., Oalva E.T., Teeri T.H. Cloning, nucleotide sequencing and characterisation of genes encoding naphthalene dioxygenase of Pseudomonas putida strain NCIB9816 // Gene, 1988. Vol. 73. P.355-362.

89. Larkin MJ, Allen CC, Kulakov LA, Lipscomb DA. Purification and characterization of a novel naphthalene dioxygenase from Rhodococcus sp. strain NCIMB 12038 // J. Bacteriol. 1999. V. 181. P. 6200-6204.

90. Laurie A.D., Lloyd-Jones G. The phrt genes of Burkholderia sp. strain RP007 constitute a divergent gene cluster for polycyclic aromatic hydrocarbons catabolism // J.Bacteriol., 1999. Vol. 181. P.531-540.

91. Laurie A.D., Lloyd-Jones G. Qualification of phnAc and nahAc in contaminated New Zealand soils by competitive PCR // Appl.Environ.Microbiol., 2000. Vol. 66. P. 1814-1817.

92. Lee J., Oh J., Min K.R., Kim C.K., Min K.H., Lee K.S., Kim Y.C., Lim J. Y., Kim Y. Structure of catechol 2,3-dioxygenase gene encoded in chromosomal DNA of Pseudomonas putida KF715 // Biochem Biophys Res Commun. 1996 V. 224(3). P. 831-836.

93. Lewtas J. Complex mixtures of air pollutants: characterizing the cancer risk of polycyclic organic matter // Environ Health Perspect. 1993. V. 100. P. 211-218.

94. Li W., Shi J., Wang X., Han Y., Tong W., Ma L., Liu B., Cai B. Complete nucleotide sequence and organization of the naphthalene catabolic plasmid pND6-l from Pseudomonas sp. strain ND6 // Gene. 2004. V. 336. P. 231-40.

95. Menn F.-M., Applegate B.M., Sayler G.S. Plasmid-mediated catabolism of naphthalene, phenenthrene and anthracene to naphthoic acid // Appl.Environ.Microbiol., 1993. V. 59. P. 1938-1942.

96. Meyer S., Moser R., Neef A., Stahl U., Kämpfer R. Differential detection of polyaromatic-hydrocarbons-degrading bacteria using PCR and gene probes // Microbiology. 1999. V. 145. P. 1731-1741.

97. Miller E.C., Miller J.A. Searches for ultimate chemical cancirogens and their reactions with cellular macromolecules // Cancer., 1981. Vol.47. P.2327-2345.

98. Moen M.A., Hammel K.E. Lipid Peroxidation by the Manganese Peroxidase of Phanerochaete chrysosporium Is the Basis for Phenanthrene Oxidation by the Intact Fungus // Appl Environ Microbiol. 1994. V. 60. P. 1956-1961.

99. Narro M.L., Cemiglia C.E., Van Baalen C, Gibson D.T. Evidence for an NIH shift in oxydation of naphthalene by the marine cyanobacterium Oscillatoria sp. strain JCM // Appl.Environ.Microbiol., 1992a. Vol. 58. P. 1360-1363.

100. Narro M.L., Cemiglia C.E., Van Baalen C, Gibson D.T. Metabolism of phenanthrene by the marine cyanobacterium Agmenellum quadruplicatum PR-6 // Appl.Environ.Microbiol., 19926. Vol. 58. P. 1351-1359.

101. Nishi A, Tominaga K, Furukawa K. A 90-kilobase conjugative chromosomal element coding for biphenyl and salicylate catabolism in Pseudomonas putida KF715 // J. Bacteriol. 2000. V. 182. P. 1949-1955.

102. Ornston L.N. The conversion of catechol and protocatechuate to beta-ketoadipate by Pseudomonas putida. enzymes of catechol pathway // J. Biol. Chem., 1966. Vol. 166. P.9-14.

103. Parales RE, Parales JV, Gibson DT. Aspartate 205 in the catalytic domain of naphthalene dioxygenase is essential for activity // J Bacteriol. 1999. V. 181. P. 18311837.

104. Parales RE, Lee K, Resnick SM, Jiang H, Lessner DJ, Gibson DT.Substrate Specificity of Naphthalene Dioxygenase: Effect of Specific Amino Acids at the Active Site of the Enzyme // J Bacteriol. 2000. V. 182. P. 1641-1649.

105. Park W, Jeon CO, Madsen EL. Interaction of NahR, a LysR-type transcriptional regulator, with the alpha subunit of RNA polymerase in the naphthalene degrading bacterium, Pseudomonas putida NCIB 9816-4 // FEMS Microbiol Lett. 2002. V. 213. P. 159-65.

106. Rockne K.J., Chee-Sanford J.C., Sanford R.A., Hedlund B.P., Staley J.T., Strand S.E. Anaerobic naphthalene degradation by microbial pure cultures under nitrate-reducing conditions. // Appl Environ Microbiol. 2000. V. 66. P. 1595-1601.

107. Rossello-Mora R.A., Lalucat J., Garcia-Valdes E. Comparative biochemical and genetic analysis of naphthalene degradation among Pseudomonas stutzeri strain // Appl.Environ.Microbiol., 1994. Vol. 60. P. 966-972.

108. Saito A, Iwabuchi T, Harayama S. Characterization of genes for enzymes involved in the phenanthrene degradation in Nocardioides sp. KP7 // Chemosphere. 1999. V. 38. P. 1331-1337.

109. Saito A., Iwabuchi T., Harayama S. A novel phenanthrene dioxygenase from Nocardioides sp. strain KP7: expression in Escherichia coli II J. Bacteriol., 2000. Vol.182. P.2134-2141.

110. Sanseverino J., Applegate B.M., King J.M.H., Sayler G.S. Plasmid-mediated mineralisation of naphthalene, phenenthrene and anthracene // Appl.Environ.Microbiol., 1993. V. 59. P. 1931-1937.

111. Saxton WL, Newton RT, Rorberg J, Sutton J, Johnson LE. Polycyclic aromatic hydrocarbons in seafood from the Gulf of Alaska following a major crude oil spill // Bull Environ Contain Toxicol. 1993. V. 51(4). P. 515-522.

112. Schell M.A. Transcriptional control of the nah and sal hydrocarbon-degradation opérons by the nahR gene product // Gene, 1985. Vol.36. P. 301-303.

113. Schell M.A., Poser E.F. Demonstration, characterization and mutational analysis of NahR protein binding to nah and sal promoters // J. Bacterid., 1989. V. 171. P. 837-846.

114. Schell M.A., Sukordhaman M. Evidence that the transcription activator encoded by the Pseudomonas putida nahR gene is evolutionary related to the transcription activator encoded by the Rhizobium nodD genes // J. Bacteriol., 1989. V. 171. P. 1952-1959.

115. Schell M.A., Wender P.E. Identification of the nahR gene product and nucleotide sequences required for its activation of the sal operon // J. Bacteriol., 1986. V. 166. P. 9-14.

116. Sentchilo V.S., Ravatn R., Werlen C., Zehnder A.J., van der Meer J.R. Unusual integrase gene expression on the clc genomic island in Pseudomonas sp. strain B13 // J Bacteriol. 2003. V. 185. P. 4530-4538.

117. Shamsuzzaman K.M., Barnsley E.A. The regulation of naphthalene metabolism in pseudomonads // Biochem. Biophys. Ree. Comm. 1974a. V.60. P. 582-587.

118. Shamsuzzaman K.M., Barnsley E.A. The Regulation of Oxygenase in Pseudomonas // Journal of General Microbiology. 1974b. V. 83. P. 165 170.

119. Shuttleworth KL, Cerniglia CE. Environmental aspects of PAH biodégradation // Appl Biochem Biotechnol. 1995. V. 54(1-3). P. 291-302.

120. Simon M.J., Osslund D.T., Saunders R., Ensley B. D., Suggs S., Harcourt A., Suen W., Gruden D.T., Zylstra G.J. Sequences of genes encoding naphthalene dioxygenase in Pseudomonas putida strain G7 and NCIB 9816-4 // Gene, 1993. Vol. 127. P. 31-37.

121. Sims J.L., Sims R.N., Matthews J.E. Approach to bioremediation of contaminated soil // Haz.Waste Haz.Matter., 1990. Vol.7. P. 117-149.

122. Strawinski R.J., Stone R.W. Conditions governing the oxidation of naphthalene and the chemical analysis of its products // J.Bacteriol., 1943. Vol. 45. P. 16-24.

123. Sutherland J.B. Detoxification of polycyclic aromatic hydrocarbons by fungi // J Ind Microbiol. 1992. V. 9(1). P. 53-61.

124. Sutherland J.B., Fu P.P., Yang Sh.K., Von Tungeln L.S., Cassilas R.P., Crow S.A., Cemiglia C.E. Enantiomeric composition of the /ram-dihydrodiols produced from phenanthrene by fungi // Appl. Environm. Microbiol. 1993. Vol.59. P. 21452149.

125. Sutherland J.B., Rafll F., Khan A.A., Cerniglia C.E. Mechanisms of polycyclic aromatic hydrocarbon degradation. In: Microbial Transformation and Degradation of Toxic Organic Chemicals // Willey-Liss, Inc., 1995. P. 269-306.

126. Suzuki K., Asao E., Nakamura Y., Nakamura M., Ohnishi K., Fukuda Sh. Overexpression of salicylate hydroxylase and the crucial role of Lys163 as its HA^H binding site // J. Biochem. 2000. V. 128. P. 239-299.

127. Tan H.-M. Bacterial catabolic transposons // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. V. 51. P. 1-12.

128. Top E.M., Moenne-Loccoz Y., Pembroke T., Thomas, C.M. (ed.) Phenotypic traits conferred by plasmids // The horizontal gene pool. Harwood Academic Publishers, Amsterdam, 2000. pp. 249-285.

129. Tsuda M., lino T. Naphthalene degrading genes on plasmid NAH7 are on a defective transposon // Mol. Gen. Genet., 1990. Vol. 223. P.33-39.

130. Van de Peer Y., De Wachter R. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment // Comput. Applic. Biosci. 1994. V.10. P. 569-570.

131. Vazquez-Duhalt R, Westlake DW, Fedorak PM. Lignin Peroxidase Oxidation of Aromatic Compounds in Systems Containing Organic Solvents // Appl Environ Microbiol. 1994. V. 60. P. 459-466.

132. Weisburg W.G., Barnes S.M., Pelletier D.A., Lane D.J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study // Journal of Bacteriology. 1991. Vol.73. P. 697703.

133. Weller, D.M., 1983. Colonization of wheat roots by a fluorescent pseudomonad suppressive to take-all. Phytopathology 73, 1548-1553.

134. Wilkstrom P., Wilklund A., Anderson A.C., Forman M. DNA recovery and PCR quantification of catechol-2,3-dioxygenase genes from different soil types // Journal of Biotechnology. 1996. Vol.52. P. 107-120.

135. Williams P.A., Catterall F.A., Murray K. Metabolism of naphthalene, 2-methylnaphthlene, salicylate, and benzoate by Pseudomonas PG: tangential pathways //J. Bacterid. 1975. V.124. P. 679-685.

136. Williams P.A., Sayers J.R. The evolution of pathway for aromatic hydrocarbons oxidation in Pseudomonas II Biodégradation. 1994. V.5. P. 195-217.

137. Wilson M. S., Bakermans C., Madsen E. L. In situ, real-time catabolic gene expression: extraction and characterization of naphthalene dioxygenase mRNA transcripts from groundwater//Appl.Environ. Microbiol. 1999. V. 65. P.80-87.

138. Yamamoto S., Katagiri M., Maeno H., Hayaishi O. Salicylate hydroxylase, monooxygenase requiring flavin adenine dinucleotide. 1. Purification and general properties // J. Biol. Chem. 1965. V. 230. P. 3408-3413.

139. Yang Y., Chen R.F., Shiaris M.P. Metabolism of naphthalene, fluorene and phenenthrene: preliminary characterization of a cloned gene cluster from Pseudomonas putida NCIB9816 // J.Bacteriol. 1994. V. 176. P. 2158-2164.

140. Yen K.M., Gunsalus I.C. Plasmid gene organization: naphthalene/salicylate oxidation // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 1982. Vol.79. P.874-878.

141. Yen K.M., Gunsalus I.C. Regulation of naphthalene catabolic genes of plasmid NAH7 // J. Bacterid. 1985. V.162. P. 1008-1013.

142. Yen K.M., Serdar C.M. Genetics of naphthalene catabolism in Pseudomonads II CRC CritRev.Microbiol., 1988. Vol. 15. P. 247-268.

143. You IS, Ghosal D, Gunsalus IC. Nucleotide sequence analysis of the Pseudomonas putida PpG7 salicylate hydroxylase gene (nahG) and its 3'-flanking region//Biochemistry. 1991. V. 30. P. 1635-1641.

144. You I.-S., Murray R.I., Jollie D., Gunsalus I.C. Purification and characterization of salicylate hydroxylase from Pseudomonas putida PpG7 I I Biochem. Biophys. Res. Comm. 1990. V.169. P. 1049-1054.

145. Zhou N.Y., Fuenmayor S.L., Williams P.A. nag genes of Ralstonia (formerly Pseudomonas) sp. strain U2 encoding enzymes for gentisate catabolism I I J.Bacteriol., 2001. Vol.183. P. 700-708.

146. Zylstra G.J., Kim E., Gloyal A.K. Comparative Molecular Analysis of Genes for Polycyclic Aromatic Hydrocarbon Degradation // Genetic Engineering., 1997. Vol. 19. P. 257 269.

Информация о работе

Измалкова, Татьяна Юрьевна
кандидата биологических наук
Пущино, 2004
ВАК 03.00.03

Диссертация

Разнообразие генетических систем катаболизма нафталина штаммов флуоресцирующих псевдомонад - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы