Генетические системы деградации салицилата у флуоресцирующих псевдомонад

Сазонова, Олеся Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генетические системы деградации салицилата у флуоресцирующих псевдомонад
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Генетические системы деградации салицилата у флуоресцирующих псевдомонад"

003462816

На правах рукописи

САЗОНОВА ОЛЕСЯ ИВАНОВНА

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ ДЕГРАДАЦИИ САЛИЦИЛАТА У ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ ПСЕВДОМОНАД

Специальность 03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации иа соискание ученой степени кандидата биологических наук

... . О ЩЬ'^

г • 1'

НУЩИНО-2009

003462816

Работа выполнена в лаборатории биологии плазмид Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущинском государственном университете.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Кошелева Ирина Адольфовна. Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Бурьянов Ярослав Иванович; кандидат биологических наук Солонин Александр Сергеевич.

Ведущая организация:

Институт молекулярной генетики РАН, Москва.

Защита диссертации состоится^^года в часов на

заседании Диссертационного совета Д 002.038.01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, г. Пущино, Московской области, ул. Институтская 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики клетки РАН, г. Пущино.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного кандидат биологических наук

Т.И. Смолихина

Актуальность проблемы

Салицилат является широко распространенным в природе соединением, важным звеном метаболизма животных, растений и микроорганизмов. Он служит ключевым шгтермедиатом в бактериальных путях биодеградации таких токсичных и канцерогенных соединений как нафталин, фенангрен, антрацен, карбарил и др. (Davies and Evans, 1964; Evans et al., 1965; Shamsuzzaman and Barasley, 1974). Бактерии рода Pseudomonas могут утилизировать салицилат двумя способами: во-первых, трансформируя его в катехол с помощью салицилат 1-монооксигеназы (салицилат гидроксилазы) с дальнейшим расщеплепием последнего по орто- или мета-пут; во-вторых, окисляя его салицилат 5-гидроксилазой в гентизиновую кислоту.

Изучение как биохимических, так и генетических аспектов метаболизма салицилата тесно связано с исследованием системы утилизации его высокомолекулярного предшественника - нафталина. Имеющиеся данные указывают на то, что генетический контроль катаболизма как нафталина, так и салицилата у флуоресцирующих псевдомонад является весьма консервативным. Вероятно, это объясняется тем, что организацию генов деградации салицилата изучали на штаммах-деструкторах нафталина. Кроме того, у этой группы микроорганизмов исследование касалось в основном генов, контролирующих деградацию салицилата по мета-пути расщепления катехола. Несмотря на широкое распространение салицилата в природе разнообразие генетических систем биодеградации данного соединения у штаммов-деструкторов салицилата (но не нафталина) до настоящего времени не изучалось. Штаммы, метаболизирующие только салицилат, могут иметь отличную от деструкторов нафталина организацию катаболических генов и, возможно, другие пути утилизации данного соединения. Кроме того, интерес представляет изучение менее распространенного среди псевдомонад альтернативного пути деградации салицилата через гентизиновую кислоту.

У флуоресцирующих псевдомонад гены катаболизма различных ароматических углеводородов, в том числе салицилата, могут располагаться на конъюгативных плазмидах большого размера (Yen and Serdar, 1988; Herrick et.al., 1997). Известно, что гены биодеградации могут находиться в составе различных транспозонов (Tsuda and lino, 1990; Bosch et.al., 1999b; Tan, 1999). Транспозонная организация катаболических генов, их расположение на конъюгативных плазмидах способствует распространению

биодеградативных признаков как внутри, так и между микробными популяциями и играет ключевую роль в адаптации микробных сообществ к возрастающему загрязнению окружающей среды. Рекомбинация между гомологичными областями может привести к делении несущественных генов и последовательностей ДИК. В результате образуется структура оперона, наиболее эффективная для транскрипции всего катаболического пути. Исследование разнообразия и распространения генетических систем биодеструкции ароматических углеводородов позволяет понять молекулярные механизмы адаптации микроорганизмов к загрязнению окружающей среды ксенобиотиками. Цель и задачи работы

Целью данной работы являлось изучение разнообразия и распространения генетических систем катаболизма салицилата у штаммов флуоресцирующих псевдомонад, изолированных из загрязненных нефтепродуктами почв различных географически удаленных регионов.

В соответствии целью, в работе были поставлены следующие задачи:

1. Определение субстратной специфичности и генотипический анализ штаммов-деструкторов салицилата бактерий рода Pseudomonas изолированных из образцов почв, загрязненных нефтепродуктами.

2. Определение путей биодеградации салицилата вновь изолированными штаммами-деструкторами.

3. Исследование разнообразия генов салицилат 1-монооксигеназы, ключевого фермента биодеградации салицилата.

4. Изучение генетического контроля деградации салицилата штаммом Р. putida АК5, метаболизирующим данное соединение через гентизиновую кислоту.

Научная новизна

В настоящей работе проведен анализ генетических систем деградации салицилата 16 штаммов Р. putida, изолированных из загрязненных почв различных географических регионов.

Исследованы штаммы, содержащие несколько негомологичных друг другу последовательностей, кодирующих салицилат гидроксилазу.

Изучена организация генов катаболизма нафталина и салицилата штамма P.putida ЛК5, утилизирующего нафталин через салицилат и гентизиновую кислоту. Исследована организация нового, не описанного ранее, л£р-онерона, контролирующего деградацию салицилата в данном иггамме. Практическая значимость работы

Результаты, полученные в настоящей работе, представляют иитерес как с фундаментальной точки зрения, так и имеют практическое применение.

Полученная в настоящей работе информация позволяет расширить представления о молекулярных механизмах адаптации микроорганизмов к загрязнению ксенобиотиками, приводящих к возникновению разнообразия генов катаболичсских путей и изменению спектра утилизируемых субстратов.

Специфические праймеры для детекции генов салицилат гидроксилаз, подобранные в ходе данной работы, могут быть использованы для обнаружения и характеристики штаммов-деструкторов, а также для мониторинга популяций бактериальных десгруктороа в загрязненной почве. Подобраные праймеры, наряду с праймерами для детекции других ключевых генов биодеградации ароматических углеводородов (например, гена большой субъединицы нафталин 1,2-диоксигеназы -nahAc и катехол 2,3-диоксигеназы - nahH) можно использовать для создания ПЦР тест - систем для более точной оценки биодеградативного потенциала загрязненной территории. Поскольку полученные данные свидетельствуют о большей каталитической активности салицилат гидроксилазы NahU по сравнению с «классическими» салицилат гвдроксилазами NahG, этот факт следует учитывать при выборе штаммов, используемых в биотехнологиях очистки окружающей среды. Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: International Conference on Environmental Biotechnology ISEB ESEB JSEB, Leipzig, 2006; Российская школа-конференция молодых ученых «Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии», 2006; международная школа-конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященная 100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна, 2006;

Российская школа - конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология»,

посвященная 40-летаю создания института ГосНИИгенетика, 2008.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано В работ, из них 3 статьи и 5 тезисов. Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на ■•/Л страниц машинописного текста, включает таблиц и рисунка. Библиография включает 16( наименования, из них отечественных и У ¿^зарубежных работ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Изоляция и характеристика штаммов-деструкторов салицилата.

В работе использовали штаммы, способные утилизировать салицилат в качестве единственного источника углерода и энергии, как коллекции лаборатории, так и изолированные в ходе настоящей работы (Табл. 1). Таблица 1. Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в работе.

Штамм Плазмиды паЬОИпаки* Источник

Р. риНсЬ ВЪ202 ВБ3790 / N156 Коллекция лаборатории, г.Макеевка, Украина.

Р. рЫ1(1а ВБ3701 рВЭ1141 рВБ!142 В53790/№>6 Коллекция лаборатории, г. Видное, Московская область

Р. ршШа В53790 рВЭ1191 рВЭ1192 BS3790/ND6 Коллекция лаборатории, почвы Западной Сибири, загрязненные мазутом

Р. риМа АК5 рАК5 Коллекция лаборатории, шламонакопитель «Нижнекамск-нефтехим», г. Нижнекамск

Р.ршШ ё15 Р, g20Р, g24 И р015, рС20, рв24 Почвенные образцы обочины автомагистрали г. Кандалакша, Мурманская область

Р:ршШатТ,№\5, N517,N818, N524 рК57-1, рМ57-2; рЫ515;р№17; pNS24 - /N1)6 ■ Почвенные образцы территории ОАО «Щекиноазот», г. Щекино, Тульская область

N820, N522, рКБИ-!, рИБН-г; р№12-1, рЫ512-2; pNS20-l, pNS20-2; рМ522-1, р№22-2; В83790 / N06

*- типы последовательностей паИС! и паИи.

Из коллекции лаборатории были выбраны деструкторы нафталина Р. pulida BS202, BS3701, BS3790, поскольку ранее было установлено, что во всех этих штаммах присутствуют два нсгомологичных друг другу гена салицилат гадроксилазы. В работе также использовали штамм P. putida АК5, поскольку он реализует альтернативный путь деградации нафталина через салицилат и гентизат. Методом накопительных культур из двух образцов почв Мурманской и Тульской областей загрязненных нефтепродуктами в данной работе были изолированы штаммы-деструкторы салицилата, не способные к утилизации нафталина. На основании морфологических и физиологических свойств, а также на основании данных рестрикционного анализа продуктов амплификации гена 16S рРНК 25 штаммов отнесены к виду P. putida. Для дальнейшей работы из 25 представителей Р. pulida было выбрано 12 штаммов, различающихся между собой по фенотипу. Все отобранные штаммы были способны к росту на салицилате, семь из них росли также на толуоле, четыре - на бензоле, два штамма - на БТЭК. Кроме того, четыре из 12 штаммов способны к деградации гентизата и девять - капролактама. Микроорганизмы могут утилизировать бензол и толуол, как и салицилат, с образованием одного и того же промежуточного соединения - катехола. Последний, далее деградируется либо по орто-пути (ß-кетоадипатному), либо по мета-пути до интермедиатов цикла Кребса (Davies and Evans, 1964; Reiner, 1971). Вероятно, наличие одних и тех же промежуточных соединений в путях деградации различных ароматических углеводородов обеспечивает штаммам-деструкторам дополнительные адаптивные возможности при минимальном наборе генов.

Установление филогенетических различий методом геномного фингерпринта между вновь изолирозашшми штаммами P. putida, показало, что многие из них являются близкородственными. Оказалось, что штаммы P. putida NS11, NS12, NS20 являю гея близкородственными ранее описанным деструкторам нафталина и салицилата P. putida BS202 и BS3701, несмотря на то, что они были выделены из географически удаленных регионов. Эти данные согласуются с полученными ранее результатами исследования филогенетического родства деструкторов нафталина рода Pseudomonas (Измалкова и др., 2005; Izmalkova et al., 2006).

2. Участие плазмид в генетическом контроле деградации салицилата.

Известно, что у флуоресцирующих псевдомоцад гены, ответственные за

деградацию различных ароматических углеводородов, в том числе салицилата, могут

находиться на коньюгативкых плазмидах большого размера (Yen and Serdar, 1988; Herrick et.al., 1997). Для штаммов коллекции лаборатории плазмидная локализация катаболических оперонов была показана ранее (Соколов и др., 1998; Кошелева и др., 2003; Измалкова и др., 2005). В 12-и новых штаммах-деструкторах салицилата путем инвертированного электрофореза обнаружены плазмидные ДНК размером ~170-180 т.п.н., причем у пяти штаммов также присутствует вторая плазмида гораздо большего размера (~280 т.п.н.). Эксперименты по коньюгационному переносу в рецепиентный Sal' штамм Р. pulida КТ2442 не дали положительных результатов. Наличие гена катехол-2,3-диоксигеназы (nahH), кодирующего ключевой фермент мета-пути расщепления катехола, является косвенным свидетельством штазмидной локализации оперонов биодеградации (Timmis et al., 1985). Однако у всех новых деструкторов салицилата этот ген не был обнаружен. Таким образом, вопрос о локализации генов биодеградации салицилата у 12-и новых исследованных штаммов остается открытым.

3. Анализ удельных активностей ферментов биодеградации салицилата.

Все использованные в работе штаммы Р. pulida деградируют салицилат, трансформируя его в катехол посредством салицилат гидроксилазы, за исключением P. putida АК5, который утилизирует данное соединение через гентизиновую кислоту при участии салицилат 5-гидроксилазы. Ранее было показано, что штаммы Р. putida BS3701 и BS3790 деградируют салицилат как по орто-, так и по мета-пути расщепления катехола. Р. putida BS202 содержит «молчащий» ген катехол 2,3-диоксигеназы, утилизация салицилата данным штаммом осуществляется только по орто-пути.

Были определены удельные активности ключевых ферментов деградации салицилата у 12-и новых штаммов. У всех исследованных штаммов присутствует активность салицилат гидроксилазы (Табл. 2). Во всех штаммах была также обнаружена активность катехол 1,2-диоксигеназы - фермента орто-пути расщепления катехола. Данные активности являются индуцируемыми салицилатом и отсутствуют при выращивании штаммов на сукцинате. Активность катехол-2,3-диоксигеназы - ключевого фермента расщепления катехола по мета-пути не выявлялась ни в одном из вновь изолированных штаммов - деструкторов салицилата. Таким образом, все новые штаммы-деструкторы утилизируют салицилат по орто-пуги расщепления катехола.

Таблица 2. Удельные активности ферментов бнодеградации салицилата у штаммов Р.

pulida (нмоль/мин на мг белка).

Штамм Салицилат шдроксилаза C120 C230

Sal* 3McSal 5ClSal

Р. pulida gl5f 293 108 55 924 <1

Р. pulida g20f 377 175 74 1142 <1

Р. pulida g24f 10 5 5 839 <1

Р. putidaNSl 214 102 48 718 <1

Р. pulida NS11 290 154 66 646 <1

I>. pulida NS\2 218 109 36 475 <1

P. pulida NS15 484 242 104 1350 <1

P. pitó/a NS 17 291 158 54 1055 <1

P.putidam\& 204 118 66 887 <1

P. pulida NS20 340 161 63 380 <1

P. putida NS22 38 14 17 217 <1

P. pulida NS24 348 165 36 1172 <1

* Sal - салицилат; 3McSaI - 3-метилсалицилат, 5ClSal - 5-хлорсалвдилат; С120 -катехол-1,2-диоксигеназа; С230 - катехол-2,3-диоксигеназа.

Салицилат гидроксилаза 12-и деструкторов салицилата Р. pulida обладает широкой субстратной специфичностью и эффективна также в отношении метилированных и хлорированных производных салицилата (Табл. 2). Это дает преимущество штаммам-деструкторам, т.к. в окружающей среде ароматические углеводороды находятся в основном в виде замещенных соединений. Однако исследуемые штаммы не способны к росту на метилированных производных, несмотря на то, что салицилат гидроксилаза окисляет данные соединения с образованием метилкатехолов. Это связано с тем, что у них отсутствует активность фермента мета-пути окисления - катехол 2,3- диоксигеназы, а при орто-расщсплении метилированных катехолов, образуются токсичные для клеток соединения. Неспособность к росту на хлорированных производных салицилата связано с отсутствием модифицировашюго орто-пути расщепления.

4. Амплификация ключевых генов бнодеградации салицилата.

Для обнаружения генов деградации салицилата у исследуемых штаммов использовали полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Для ПЦР - анализа были выбраны гены, кодирующие следующие ключевые ферменты деградации салицилата

микроорганизмами: салицилат гидроксилазу (nahG), катсхол-2,3-диоксигеназу (nahfí) и катехол-1,2-диоксигеназу (calA). Кроме того, поскольку, как следует из полученных данных, у изучаемых штаммов активности салицилат гидроксилазы и катехол-1,2-диоксигеназы являются индуцируемыми, штаммы проверяли на наличие регуляторного гена nahR.

Исследованные к настоящему времени гены, кодирующие салицилат гидроксилазу, у флуоресцирующих псевдомонад в большинстве случаев гомологичны между собой и относятся к т.н. «классическим» последовательностям, поскольку структура и организация подобна генам nahG архетипических плазмид NAH7 и pDTGl. У штаммов-деструкторов нафталина коллекции лаборатории Р. pulida BS202, BS3701 и BS3790, содержащих в своем геноме «классическую» pDTGl-подобную последовательность салицилат гидроксилазы, эта последовательность является молчащей. Ранее было показано, что в данных штаммах присутствует второй функциональный ген салицилат гидроксилазы (nahGl), негомологичный «классическому». Он локализован в штаммах BS202 и BS3701 в составе хромосомной ДНК, а в штамме BS3790 - на плазмиде pBS1192. У новых штаммов-деструкторов салицилата последовательности «классического» гена салицилат гидроксилазы nahG, регуляторного гена nahR, а также второго маркерного гена шА2-оперона - гена катехол 2,3-диоксигеназы не были обнаружены. Специфичная амплификация гена катехол 1,2-диоксигеназы, catA, наблюдалась во всех проанализированных образцах. Амплификация ключевых генов катаболизма салицилата и анализ ферментативных активностей свидетельствовали о том, что в новых штаммах-деструкторах салицилата, как и в штаммах BS202, BS3701, BS3790, за трансформацию салицилата отвечает ген салицилат гидроксилазы, негомологичный «классическим» генам nahG.

5. Идентификация последовательностей, кодирующих функциональную салицилат гидроксилазу в штаммах P.putida

В связи с тем, что второй ген салицилат гидроксилазы (nahGl) в штаммах Р.

putida BS202, BS3701 и BS3790 не проявлял гомологии с nahG плазмиды NAH7, были

подобраны вырожденные праймеры для амплифицикации любой из известных

последовательностей салицилат гидроксилаз. Используя такую пару праймеров, не

удалось получить специфичной амплификации. Однако, в ПЦР - продуктах

присутствовала мажорная полоса нужного размера (750 п.н.), которую клонировали в

вектор pGEM-Teasy. Определение и анализ нуклеотидной последовательности

ампликона штамма BS3790 показали, что данная последовательность гомологична на 98% хромосомной последовательности предполагаемой салицилат гидроксилазы штамма P. pulida КТ2440. ПЦР-анализ 15-и штаммов - деструкторов с использованием новых праймеров, специфичных только к «КТ-подобным» генам салицилат гидроксилаз, позволил обнаружить 10 штаммов, содержащих ген nahGI. Анализ полиморфизма генов nahGI проводился путем RFLP (restriction fragment length polymorphism) ПЦР-продуктов эндонуклеазами рестрикции НаеIII и Msp\. Рестрикционный анализ ампликонов показал, что у исследуемых штаммов присутствуют два новых варианта гена nahGI (BS3790 и g20f) (Рис.1).

М123456789М М123456789М

Рис. 1. Электрофореграмма рестрикции продуктов амплификации двух вариантов гена nahGI размером 994 п.н. эндонуклеазами рестрикции Нае Ш (А) и Mspl (Б): М - ДНК-маркер 50 п.н. ("Fermentas", Литва), 1 - Р. pulida gl5f, 2 - Р. pulida g20f, 3 - Р.pulida g24f, 4 - Р. pulida NS11, 5 - Р. pulida NS12, 6 - Р. pulida NS20, 7 - Р. pulida NS24, 8 - Р. pulida BS3790, 9 - Р. pulida K.T2440.

Интересно, что салицилат гидроксилаза штамма Р. pulida КТ2440 не является функциональной и сам штамм не способен использовать салицилат в качестве единственного источника углерода и энергии (Nelson et.al., 2002). Чтобы выяснить, экспрессируется ли ген «КТ-подобной» салицилат гидроксилазы, nahGI, у Р. putida BS202, BS3701 и BS3790 при выращивании штаммов на нафталине и салицилате, в работе проводили ОТ-ПЦР с транскриптов клеток выращенных на нафталине. В качестве положительного контроля использовали ОТ-ПЦР гена большой субъединицы нафталин 1,2-диоксигеназы (nahAc), для отрицательного контроля брали тотальную РНК, необработанную обратной транскриптазой. В результате амплификации генов nahAc и nahGI со специфичными праймерами был получен ПЦР-продукт только в случае гена большой субъединицы нафталин 1,2-

диоксигеназы. Размер амттлифицированного фрагмента соответствовал ожидаемому (Рис. 2). Амплификация гена паИАс не наблюдалась с тотальной РНК исследуемого штамма, если данную РНК предварительно не обрабатывали обратной транскриптазой. В случае гена nahGl продукты амплификации присутствовали только, если в качестве матрицы использовали тотальную ДНК Р. putida BS3701 (Рис. 2). Пример результатов одного из ОТ-ПЦР представлен на рисунке 2. Таким образом, изучение экспрессии «КТ-подобного» гена салицилат гидроксилазы {nahGl) методом ОТ-ПЦР продемонстрировало, что в штаммах BS202, BS3701 и BS3790, как и в случае штамма Р. putida КТ2440, последовательность данного гена является молчащей. Вероятно, что и в остальных исследованных штаммах Р. putida последовательность nahGl является псевдогеном (Рис.2).

МП 2 3 MI 1 2 3 М2 1 2 3

Рис. 2. Электрофореграмма результатов ОТ-ПЦР генов nahGl, nahU и паИАс штамма Р. putida BS3701.

MI - ДНК-маркер 1 T.n.H.("Fermentas", Литва), М2 - ДНК-маркер Мб («Экобиотехнология»),

В качестве матрицы использовали: 1 - кДНК, 2 - тотальная РНК BS3701 необработанная обратной транскриптазой, 3 - тотальная ДНК Р. putida BS3701

Поскольку в штаммах Р. putida BS202, BS3701 и BS3790 отсутствовала экспрессия гена КТ-подобной салицилат гидроксилазы nahGl оставался открытым вопрос, какой же ген отвечает за Sal+ фенотип данных штаммов. К этому моменту в базе данных появилась полная нуклеотидная последовательность плазмиды pND6-l штамма-деструктора нафталина P.putida ND6 (GenBank Асс. № AY208917). Особенностью данной плазмиды является наличие двух негомологичных друг другу функциональных генов салицилат гидроксилаз, nahU и nahG. N-концевой участок выведенной аминокислотной последовательности салицилат гидроксилазы NahU оказался идентичен на 100% N-концевому участку салицилат гидроксилазы штамма Р. putida BS202, ранее определенному Балашовой с соавторами (2001). На основании

последовательности гена nahl) в настоящей работе были подобраны праймеры nahGU_244f и nahU_898r. ПЦР-продукты присутствовали во всех проанализированных образцах. Чтобы подтвердить, что именно ген nahU отвечает за Sal+ фенотип в штамме Р. pulida BS3701 в данной работе также, как и в случае гена nahGl, проводили ОТ-ПЦР с транскриптов клеток штамма Р. pulida BS3701. ПЦР-продукты соответствующих размеров были получены как в случае гена nahAc, так и nahU (Рис.2). Амплификация генов nahAc и nahil не наблюдалась с тотальной РНК исследуемого штамма, если данную РНК предварительно не обрабатывали обратной транскриптазой.

Полиморфизм гена салицилат гидроксилазы nahU исследовали путем RFLP-анализа. У исследуемых штаммов обнаружены два варианта последовательностей гена nahU(ND6 и g20f) (Рис.3). Вариант g20f обнаружен впервые.

М1 2 345678 9 10 ИМ

Рис. 3. Электрофореграмма рестрикции ампликонов гена nahU размером 654 п.н. эндонуклеазой рестрикции Rsal: М - ДНК-маркер 50 п.н. ("Fermentas", Литва), 1 - Р. pulida gl5f, 2 - Р. pulida g20f, 3 - Р. pulida g24f, 4 - Р. pulida NS7, 5 - Р. pulida NS11, 6 - Р. pulida NS12,1 - Р. pulida NS15, 8 - i3, pulida NS17, 9 - P. pulida NS18, 10 - P. pulida 202, 11 -P.putida 3701, 12- P. pulida 3790.

Ген nahU штамма P.putida ND6, так же как и ген салицилат гидроксилазы nahW штамма P.putida AN10 (AF039534), располагается обособленно от иа/й-оперона и функционально дублирует в этих штаммах ген «классической» салицилат гидроксилазы nahG. Обе салицилат гидроксилазы, NahG и NahW P.stutzeri AN10, имеют широкую субстратную специфичность. Однако относительные скорости деградации замещенных аналогов салицилата значительно отличаются. Так хлорсалицилаты лучше метаболизируются NahW, в то время как NahG более эффективна в отношении метилированных производных салицилата (Bosch et.al., 1999). Салицилат гидроксилазы, NahG и NahU P.putida ND6, также демонстрируют

широкую субстратную специфичность и метаболизируют салицилат, сульфосалицилат, 3- и 5-метилсалицилаты, 5-хлорсалицилат и 3,5-динитросалицилат (Zhao Н. et al., 2005). Однако, NahU, по сравнению с NahG, обладает большим сродством к салицилату и кофакторам, а также большей каталитической активностью. По-видимому, последовательности, подобные nahU и nahW, не являющиеся частью катаболических оперонов, перемещаясь и включаясь в метаболическую цепь штамма - хозяина, расширяют спектр утилизируемых субстратов и тем самым способствуют адаптации микроорганизмов к условиям окружающей среды. Подобные «бродячие» последовательности, вероятно в результате каких-либо перестроек, могут терять свою функциональность, как это произошло в случае псевдогена салицилат гидроксилазы штамма Р. pulida КТ2440. Тогда вследствие давления факторов окружающей среды возникает необходимость приобретения очередного функционального гена. Так многие исследованные штаммы содержат по 2 последовательности салицилат гидроксилазы, а в штаммах BS202, BS3701 и BS3790 обнаружены даже три негомологичных друг другу гена (nahG, nahGl и nahU), причем только один из них (nahU) является функционирующим.

б. Деградация салицилата штаммом P. putida АК5

Альтернативный путь утилизации салицилата через гентизиновую кислоту при участии салицилат 5-гидроксилазы у флуоресцирующих псевдомонад является менее распространенным, в отличие от хорошо изученного пути деградации салицилата через катехол. На данный момент генетический контроль «гентизатного» пути деградации салицилата детально изучен только у представителей р-протеобактерий (Ralstonia, Polaromonas и Achromobacter). Однако впервые деградация салицилата через гентизат была описана Старовойтовым с соавторами именно у псевдомонад еще в 1975 году на примере деструктора нафталина P. fluoresceins (Старовойтов и др., 1975), тем не менее, его генетическая организация не была исследована.

Штамм P. putida АК5 был выбран для исследования, поскольку утилизирует

нафталин через салицилат и гентизат. Ранее на основании определения удельных

активностей ферментов, амплификации ключевых генов биодеградации нафталина и

салицилата и гибридизационного анализа было выдвинуто предположение, что в

штамме P. putida АК5 за «верхний» путь деградации нафталина отвечает

«классический» шй1-оперон. Дальнейшая утилизация салицилата до интермедиатов

цикла Кребса происходит при участии мультисубъединичного фермента салицилат 514

гидроксилазы, которая является компонентом цепи транспорта электронов (Измалкова и др., 2005). Для подтверждения данного предположения в настоящей работе были определены последовательности участков плазмиды рАК.5, несущие гены катаболизма нафталина и салицилата.

Обнаружено, что за деградацию нафталина до салицилата в штамме АК5 отвечает «классический» ш/jl-onepon под контролем регуляторного гена nahR, подобный naftl-оперонам плазмид катаболизма нафталина pDTGl, pND6-l и pLP6a. В отличие от вышеназванных плазмид, в штамме АК5 отсутствует nah2-oперон, отвечающий за деградацию салицилата через л(едиа-путь расщепления катехола до интермедиатов цикла Кребса. Данный оперон либо был утерян плазмидой рАК5, либо не приобретался Бовсе.

Гены катаболизма салицилата через гентизат, в отличие от штаммов Ralstonia sp. U2 и Polaromonas naphthalenivorans CJ2, локализованы отдельно от генов «верхнего» пути деградации нафталина и имеют оперонную структуру. Исследованный в данной работе оперон деградации салицилата, названный, sgp-оперон (salicylate-gentisate pathway), включает 6 структурных генов, sgpAlKGHB, кодирующих четыре субъединицы салицилат 5-гидроксилазы (SgpAGHB), гентизат 1,2-диоксигеназу (Sgpl) и фумарилацетоацетат гидролазу (SgpK) (Рис. 4).

I-1-1-1-1-1-г-

0 г 4 6 3 10 12 kb

HintJIII BamHI Kpnlj_EtoRI^_Kpnf^ |взшН1 ВашШ ^BamHI ^Kpnl_EcoRI

otfl ssfK sgpH sgpB MerR off!

EcoRI_^EcoRI

PAK5-12

Kpnl xpni

|-1

pAK6-4.5

Рис. 4. Карта клонированного кластера генов деградации салицилата плазмиды рАК5.

¿¿р-опер он предположительно находится под п озшивным коггтролем регуляторного гена который располагается выше гена редуктазы (sgpA) и

ориентирован от него в противоположном направлении. Продукт гена sgpR принадлежит к семейству прокариотических транскрипционных активаторов LysR и имеет консервативный ДНК связывающий (спираль-поворот-спираль) домен в N-концевой области. Таким образом, утилизация нафталина через салицилат и гентизат в штамме P.putida АК5 осуществляется при участии 2-х катаболических оперонов, каждый из которых регулируется своим собственным белком-регулятором. P. piitida АК5 является первым природным штаммом, в котором было обнаружено сочетание оперона деградации салицилата через гентизат с «классическим» nah\ - опероном. Исследованная в настоящей работе организация генов деградации нафталина и салицилата в штамме P. putida АК5 отличается как от организации «классических» катаболических оперонов плазмид NAH7 и pDTGl, так и от nag-генов штаммов Ralstonia sp. U2 и Polaromonas naphthalenivorans CJ2.

Структурная организация sgp-опероиа несколько напоминает организацию оперонов деградации салицилата морской бактерии Marinomonas sp. MWYL1 и штаммов-патогенов растений с широким кругом хозяев, в частности Ralstonia solanacearum GMI1000 (Рис.6). Основным отличием Jgp-опероиа является инсерция генов гентизат 1,2-диоксигеназы (sgpí) и фумарилацетоацетат гидролазы (sgpK) в кластер sgpAGHB, после гена sgp А, кодирующего редуктазный компонент салицилат 5-гидроксилазы. Подобным образом организован кластер генов деградации салицилата в штамме Polaromonas sp. JS666 (Mattes et al., 2008) (Рис.5). Различия между sgpí и sgpK генами и другими областями sgp-оперона, которые были обнаружены в G+C составе и при анализе филогенетического родства отдельных полипептидов с соответствующими гомологами, позволили предположить, что гены гентизат 1,2-диоксигеназы и фумарилацетоацетат гидролазы могли эволюционировать отдельно от остальных последовательностей sgp-onepona и приобретены штаммом - хозяином независимо от них.

Инсерция генов sgpí и sgp К в кластер салицилат 5-гидроксилазы аналогична ситуации, наблюдаемой в штаммах Ralstonia sp. U2 и Polaromonas naphthalenivorans CJ2. В дашшх штаммах гены nagGII, кодирующих субъединицы салицилат-5-гидроксилазы, встроились в кластер генов нафталин 1,2-диоксигеназы, также после ее редуктазного компонента (Рис.5). По-видимому, данная область не столь значима для транскрипции всего субъединичного комплекса.

пвдУ R Аа G Н Ab Ac Ad В F С Q Е О J I К L М N lysR редуктаза sh5a sh5b ферредоксин cds cds mpi gdo faa cds

в»

lysR nagAa nagG nagH nagAb nagl nagK nagL

n ОФОФООО^ОФОч)

nagR1 nagAa nagl nagK nagG nagH nagAb mpi mgR2 oxyg ABC

Д, :; ::>;:;i;>i:=;>-> ООО

sgpR sgpA sgpl sgpK sgpG sgpH sgpB mpi

P«c. 5. Организация генов катаболизма салицилата у штаммов Ralslonia sp. U2 (A), Marinomonas sp. MWYL1 (Б), Ralstonia solanacearitni GM11 ООО (В), Polaromonas sp. JS666 (Г). P-putida AK5 (Д). Области, не отвечающие за деградации салицилата, обозначены серым цветом. Различная заливка стрелок, обозначающих гены igp-оперона, отражает его мозаичную структуру.

sh5a - большая су^ъединица салицилат 5-гидроксилазы, sh5b - малая субьединица салицилат 5-гадроксилазы, gdo - гентизат 1,2-диоксигеназа, faa - фумарилацетоацетат гидролаза, mpi - малеилацетоацетат изомераза.

Структурная организация jgp-оперона, за исключением перестановок генов sgpl и sgpK напоминает организацию генов в опероне деградации салнцилата штаммов - патогенов растений с широким крутом хозяев, в частности Ralslonia solanacearum GMI1000. Тем не менее, кластерный анализ, не выявил между ними близкого родства. Обособленное положение sgp-oncpoHa и кодируемых им аминокислогных последовательностей особенно хорошо иллюстрирует дендрограмма родства редуктазиых компонентов ароматических диоксигеназ (Рис.6). Группу I образуют оксидоредуктазы нафталин 1,2-диоксигеназ/ салицилат 5-гидроксилаз штаммов Ralstonia sp. U2 и Polaromonas naphthalenivorans CJ2, а также родственных им нитроареновых диоксигеназ; группу II - оксидоредуктазы нафталин 1,2-диоксигеназ, группу III - редуктазпые компоненты салицилат 5-гидроксилаз штаммов - деструкторов салицилата.

100

Ralstonia sp. U2 (AAD12606) Pseudomonas sp. JS42 (AAB40380) B. cepacia R34 (AAL50024) -Burkhalderia sp. RASC (AAB09763)

_«22| PoL naphthalenivorans CJ2 (EAQ21S2) 'Pol. naphthalenivorans Cll (AAZ93384) mr~P. putida G7 (AAA25900)

'—P. putida NCIB 9816-4 (AAA25904)

lttOj p. Stützen AN10 (AAD02134) ' P. aeruginosa PaKl (ВЛА12238) — Polaromonas sp. JS666 (EAM40629)

-Pigmentiphaga sp. NDS-2 (BAC535S9)

ioo| Л. xylosoxulan A8 (CA147S)

^ P. aeruginosa JB2 (AAC69483) looj— R. solanacearum UVV5U (EAP71233)

I— D

III

- P. putida KT2440 (AAN68771)

" R. solanacearum GMUOOO (CAD14793)> " P. putida ЛК5

Рис. 6, Дендрограмма, иллюстрирующая взаимоотношения между выведенной аминокислотной последовательностью редуктазного компонента салицилат 5-гидроксилазы штамма P.putida АК5 и гомологичными последовательностями других штаммов. Относительные дистанции и конечный график построены при помощи программы TREECONE (Van de Peer and De Wächter, 1994).

Полученные результаты филогенетического анализа выведенных аминокислотных последовательностей, порядок и GC-состав генов sg/г-оперона свидетельствует о его мозаичной структуре. На рис.6 разным цветом показаны последовательности, имеющие различное происхождение.

Ген малеилпируват изомсразы, который в кластерах генов, ответственных за деградацию гентизата, обычно находится после гена, кодирующего фумарилацетоацетат гидролазу, вероятно, был утеря! при встраивании генов sgpl и sgpK в кластер sgpAGHB. Тем не менее, обособлешго, сразу за терминатором транскрипции igp-оперона находится ген mpi, продукт которого вероятно является недостающей малеилпируват изомеразой. Разница в GC-составе данной последовательности с генами sgpl и sgpK и результаты анализа филогенетического родства выведенной аминокислотной последовательности MPI, говорит о том, что ген mpi имеет эволюционное происхождение, отличное от всех генов, входящих в состав ¿¿р-оперона.

Полученные в настоящей работе данные согласуются с «модульной теорией эволюции современных катаболических путей», которая была предложена Williams в 1994 году и постулирует сборку отдельных катаболических модулей путем транспозиционных событий (Williams et al., 1994). Впоследствии может происходить слияние или перестройка катаболических генов благодаря рекомбинации между гомологичными областями. Хромосомные перестройки и делеции несущественных генов и других областей ДНК приводят .к образованию структуры оперона, эффективной для транскрипции всего катаболического пути.

выводы

1. Установлено, что штаммы - деструкторы салицилата, выделенные из различных регионов, являются близкородственными штаммам - деструкторам нафталина.

2. Обнаружено, что тринадцать исследованных штаммов P.putida утилизируют салицилат по орто-ауш расщепления катехола без участия ферментов мета-пути, кодируемых «классическим» /юй2-опероном.

3. У исследуемых штаммов P.putida обнаружены новые типы генов салицилат пвдроксилаз: nahU и nahGl. Метаболизм салицилата штаммами, осуществляется при участии гена nahU. Во всех изучаемых штаммах ген nahGl является молчащим.

4. Впервые описана организация генов катаболизма нафталина через салицилат и гентизат у бактерий рода Pseudomonas на примере штамма P.putida АК5, в котором обнаружено сочетание оиерона деградации салицилата через гентизат с «классическим» nah\ - опероном. Утилизация салицилата происходит под контролем не описанного ранее igp-onepoHa.

5. Структурная организация генов .sgp-оиерона у P.putida АК5 подтверждает «модульную теорию эволюции катаболичеекпх путей».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. О.И. Сазонова. Т.Ю. Измалкова, И.А. Кошелева, А.М. Воронин. Деградация салицилата штаммами Pseudomonas putida без участия «классического» ra/i2-оперона. Микробиология, 2008 т.77, № 6, с. 798 - 804.

2. Т.Ю. Измалкова, О.И. Сазонова. С.Л. Соколов, И.А. Кошелева, А.М. Воронин. Плазмиды биодеградации нафталина и салицилата Р-7 группы несовместимости в штаммах флуоресцирующих пссвдомонад. Микробиология, 2005 т.74, № 3, с. 342 -348.

3. И.А. Кошелева, Т.Ю. Измалкова, С.Л. Соколов, О.И. Сазонова. А.М. Воронин. Структурная и функциональная вариабельность генетических систем катаболизма полициклических ароматических углеводородов у штаммов Pseudomonas putida. Генетика. 2003. Т.39, N° 9, с. 997-1004.

4. О.И. Сазонова. Т.Ю. Измалкова, И.А. Кошелева, А.М. Воронин. Новые аспекты деградации салицилата у флуоресцирующих псевдомонад // тезисы докладов международной школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященная 40-летию создания института ГосНИИгенетика, 2008. С.76.

5. Измалкова Т.Ю., Сазонова О.И.. Кошелева И.А., Воронин А.М. Новая организация генов деградации нафталина через салицилат и гентизат в штамме P.putida АК5 // тезисы докладов международной школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященной 100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна, 2006. С.48.

6. Сазонова О.И.. Измалкова Т.Ю., Кошелева И.А., Воронин А.М. Разнообразие генов салицилат гидроксилаз в штаммах флуоресцирующих псевдомонад // Сборник статей российской школы-конференции молодых ученых «Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии». 2006. С. 11-12.

7. Izmalkova T.Y., Sazonova Q.I.. Sokolov S.L., Kosheleva I.A., Boronin A.M.The IncP-7 plasmids responsible for naphthalene and salicylate biodégradation in fluorescent Pseudomonas strains // Abstract book of International Conférence on Environmental Biotechnology ISEB ESEB JSEB 2006. Leipzig. 2006. P. 148.

8. Sazonova O.I., Izmalkova T.Y., Sokolov S.L., Kosheleva I.A., Boronin A.M. Diversity of Salicylate Hydroxylase Genes (nahG) in Fluorescent Pseudomonas strains // Abstract book of International Conference on Environmental Biotechnology ISEB ESEB JSEB 2006. Leipzig. 2006. P. 232.

Подписано в печать:

18.02.2009

Заказ № 1608 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сазонова, Олеся Ивановна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 САЛИЦИЛОВАЯ КИСЛОТА. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА.

1.2 САЛИЦИЛАТ - КЛЮЧЕВОЙ ИНТЕРМЕДИАТ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ДЕГРАДАЦИИ

РЯДА АРОМАТИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ.

1.2.1 Катаболизм индолил 3-уксусной кислоты - гормона растений.

1.2.2 Салицилат - промежуточный продукт деградации карбарила.

1.2.3 Салицилат - ключевой промежуточный продукт микробной деградации нафталина, фенантрена и антрацена.

1.3 БИОХИМИЧЕСКИЕ ПУТИ

БИОДЕГРАДАЦИИ САЛИЦИЛАТА.

1.4 РАЗНООБРАЗИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ СИСТЕМ ДЕГРАДАЦИИ САЛИЦИЛАТА У БАКТЕРИЙ.

1.4.1 Организация генов катаболизма нафталина и салнцилата плазмиды NAH7.

1.4.2 Генетические системы катаболизма салицилата аналогичные nah-генам плазмиды NAH7.

1.4.3 nag-Yoabi штаммов-деструкторов нафталина Ralstonia sp. штамм U и Polaromonas naphthalenivorans CJ2.

1.4.4 Гены биодеградации салицилата штамма Polaromonas sp. JS666.

1.4.5 /гу/ьгены Pseudomonas aeruginosa JB2 и Achromobacter xylosoxidans A8.

1.4.6 Гены катаболизма ПАУ бактерий рода Sphingobium и родственных им родов.

1.4.7 Гены катаболизма салицилата грам - положительной бактерии Streptomyces sp. WA46.

1.5 Регуляция генов биодеградации салицилата.

Салицилат - индуктор экспрессии некоторых оперонов.

1.6 РАСПРОСТРАНЕНИЕ И ЭВОЛЮЦИЯ КАТАБОЛИЧЕСКИХ ОПЕРОНОВ.37 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды.

2.2. Питательные среды и условия роста.

2.3. Выделение бактериальных штаммов из почвенных образцов.

2.4 Выделение тотальной ДНК бактерий.

2.5. Выделение плазмидной ДНК.

2.6. Приготовление блок-вставок.

2.7. Конъюгациопный перенос плазмид.

2.8. Полимеразная цепная реакция.

2.9. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции.

2.10. Электрофорез в агарозном геле.

2.11. Препаративное выделение фрагментов ДНК из агарозного геля.

2.12 Мечение ДНК методом рассеянной затравки.

2.13 Гибридизация ДНК на нейлоновых фильтрах.

2.14. Лигирование ДНК.

2.15. Приготовление компетентных клеток E.coli.

2.16 Трансформация клеток E.coli плазмидной ДНК.

2.17 Определение нуклеотидной последовательности ДНК.49 '

2.18 Определение удельных активностей ферментов.

2.19 Выделение тотальной РНК.

2.20 Синтез первой цепи кДНЕС.

2.21 Картирование стартовой точки транскрипции.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Изоляция и характеристика штаммов-деструкторов салицилата.

3.2. Участие плазмид в генетическом контроле деградации салицилата.

3.3. Анализ удельных активностей ферментов биодеградации салицилата.

3.4. Амплификация ключевых генов биодеградации салицилата.

3.5. Поиск последовательностей, отвечающих за утилизацию салицилата, в исследуемых штаммах.

3.6. Анализ генов nahGl штаммов-деструкторов салицилата.

3.7. Изучение экспрессии гена nahGl у исследуемых штаммов.

3.8. Идентификация последовательностей, кодирующих функциональную салицилат гидроксилазу в штаммах P. putida.

3.9. Анализ генов nahUштаммов-деструкторов салицилата.

3.10. Деградация салицилата штаммом P. putida АК5.

3.11. Клонирование генов катаболизма нафталина плазмиды рАК5.

3.12. Клонирование генов катаболизма салицилата плазмиды рАК5.

3.13. Анализ нуклеотидной последовательности генов биодеградации салицилата плазмиды рАК5.

4. ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетические системы деградации салицилата у флуоресцирующих псевдомонад"

Актуальность проблемы

Салицилат является широко распространенным в природе соединением, важным звеном метаболизма животных, растений и микроорганизмов. Он служит ключевым интермедиатом в бактериальных путях биодеградации нафталина, фенантрена, антрацена, карбарила и других токсичных и канцерогенных соединений, загрязняющих окружающую среду (Davies and Evans, 1964; Evans et al., 1965; Shamsuzzaman and Barnsley, 1974). Салицилат также играет важную роль в регуляции экспрессии некоторых бактериальных генов. Многие микроорганизмы способны использовать салицилат в качестве единственного источника углерода и энергии. Однако накопление салицилатов в среде может подавлять рост микроорганизмов. К настоящему времени биохимические пути деградации салицилата у микроорганизмов достаточно хорошо исследованы. Бактерии рода Psendomonas могут утилизировать салицилат двумя способами: во-первых, трансформируя его в катехол с помощью салицилат гидроксилазы с дальнейшим расщеплением последнего по орто- или мета-пути; во-вторых, окисляя его посредством салицилат 5-гидроксилазы в гентизиновую кислоту.

Особый интерес представляет изучение менее распространенного среди псевдомонад альтернативного пути деградации салицилата через гентизиновую кислоту.

У флуоресцирующих псевдомонад гены катаболизма различных ароматических углеводородов, в том числе салицилата, могут располагаться на коньюгативных плазмидах большого размера (Yen and Serdar, 1988; Herrick et.al., 1997). Известно, что гены биодеградации могут находиться в составе различных транспозонов (Tsuda and lino, 1990; Bosch et.al., 1999b; Tan, 1999). Транспозонная организация катаболических генов, их расположение на коньюгативных плазмидах способствует распространению биодеградативных признаков как внутри, так и между микробными популяциями и играет ключевую роль в адаптации микробных сообществ к возрастающему загрязнению окружающей среды. Рекомбинация между гомологичными областями может привести к делеции несущественных генов и последовательностей ДНК. В результате образуется структура оперона, наиболее эффективная для транскрипции всего катаболического пути. Исследование разнообразия и распространения генетических систем биодеструкции ароматических углеводородов позволяет понять молекулярные1 механизмы адаптации микроорганизмов к загрязнению окружающей среды ксенобиотиками.

Цель и задачи работы

В соответствии целью, в работе были поставлены следующие задачи:

2. Определение путей биодеградации салицилата вновь изолированными штаммами-деструкторами.

3. Исследование разнообразия генов салицилат 1-монооксигеназы, ключевого фермента биодеградации салицилата.

4. Изучение генетического контроля деградации салицилата штаммом Р. putida АК5, метаболизирующим данное соединение через гентизнновую кислоту.

Научная новизна

В настоящей работе проведен анализ генетических систем деградации салицилата 16 штаммов P. putida, изолированных из загрязненных почв различных географических регионов.

Подобраны новые специфические праймеры для обнаружения методом ПЦР и характеристики генов салицилат гидроксилаз, nahGl и nahU, негомологичных «классическим». Впервые изучено разнообразие данных генов, обнаружены два новых варианта последовательностей гена nahGl и один новый вариант гена nahU. Исследованы штаммы, содержащие несколько негомологичных друг другу последовательностей, кодирующих салицилат гидроксилазу.

Изучена организация генов катаболизма нафталина и салицилата штамма P.putida АК5, утилизирующего нафталин через салицилат и гентнзиновую кислоту. Исследована организация нового, не описанного ранее, .sgp-оперона, контролирующего деградацию салицилата в данном штамме.

Практическая значимость работы

Результаты, полученные в настоящей работе, представляют интерес как с фундаментальной точки зрения, так и имеют практическое применение.

Полученная в настоящей работе информация позволяет расширить представления о молекулярных механизмах адаптации микроорганизмов к загрязнению ксенобиотиками, приводящих к возникновению разнообразия генов катаболических путей и изменению спектра утилизируемых субстратов.

Специфические праймеры для детекции генов салицилат гидроксилаз, подобранные в ходе данной работы, могут быть использованы для обнаружения и характеристики штаммов-деструкторов, а также для мониторинга популяций бактериальных деструкторов в загрязненной почве. Подобранные праймеры, наряду с праймерами для детекции других ключевых генов биодеградации ароматических углеводородов (например, гена большой субъединицы нафталин 1,2-диоксигеназы - nahAc и катехол 2,3-дноксигеназы - nahH) можно использовать для создания ПЦР тест - систем для более точной оценки биодеградативного потенциала загрязненной территории. Поскольку полученные данные свидетельствуют о большей каталитической активности салицилат гидроксилазы NahU по сравнению с «классическими» салицилат гидроксилазами NahG, этот факт следует учитывать при выборе штаммов, используемых в биотехнологиях очистки окружающей среды.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: International Conference on Environmental Biotechnology ISEB ESEB JSEB, Leipzig, 2006; Российская школа-конференция молодых ученых «Экотокснкология: современные биоаналитические системы, методы и технологии», 2006; международная школа-конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященная 100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна. 2006; Российская школа - конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященная 40-летию создания института ГосНИИгенетика, 2008.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 3 статьи и 5 тезисов.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 113 страницах машинописного текста, включает 5 таблиц и 32 рисунка. Библиография включает 181 наименования, из них 8 отечественных и 173 зарубежных работ.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Сазонова, Олеся Ивановна

выводы

2. Обнаружено, что тринадцать исследованных штаммов P.putida утилизируют салицилат по орто-пути расщепления катехола без участия ферментов мета-пути, кодируемых «классическим» /7аЛ2-опероном.

3. У исследуемых штаммов P.putida обнаружены новые типы генов салицилат гидроксилаз: nahU и nahGl. Метаболизм салицилата штаммами, осуществляется при участии гена nahU. Во всех изучаемых штаммах ген nahGl является молчащим.

4. Впервые описана организация генов катаболизма нафталина через салицилат и гентизат у бактерий рода Pseudomonas на примере штамма P.putida АК5, в котором обнаружено сочетание оперона деградации салицилата через гентизат с «классическим» nah\ - опероном. Утилизация салицилата происходит под контролем не описанного ранее .sgp-onepoHa.

5. Структурная организация генов sgp-оперона у P.putida АК5 подтверждает «модульную теорию эволюции катаболических путей».

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сазонова, Олеся Ивановна, Пущино

1. Воронин A.M., Кулакова А.Н., Цой Т.В., Кошелева И.А., Кочетков В.В. Молчащие гены мета пути окисления катехола в составе плазмид биодеградации нафталина //Биохимия. 1988. Т. 229. № 1. С. 237-240.

2. Измалкова Т.Ю., О.И. Сазонова, C.J1. Соколов, И.А. Кошелева, A.M. Воронин. Плазмиды биодеградации нафталина и салицилата Р-7 группы несовместимости в штаммах флуоресцирующих псевдомонад // Микробиология. 2005а. Т.74. № 3. С. 342 -348.

3. Измалкова Т.Ю., О.И. Сазонова, C.JI. Соколов, И.А. Кошелева, A.M. Воронин. Разнообразие генетических систем биодеградации нафталина у штаммов Pseudomonas fluorescens // Микробиология. 20056. Т.74. № 1. С. 70-78

4. Кошелева И.А., Цой Т.В., Кулакова А.Н., Воронин A.M. Сравнительный анализ организации плазмиды NPL-1, контролирующей окисление нафталина клетками Pseudomonas putida и ее производных // Генетика. 1986. Т.22. № 10. С. 23892397.

5. Маниатис Т., Фрич Э., Самбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М., «Мир». 1984. 480 с.

6. Соколов C.JI., Кошелева И.А., Мавроди О.В., Мавроди Д.В., Воронин A.M. Структурная организация и экспрессия гена салицилат гидроксилазы штамма Pseudomonas putida BS814 (pBS106) // Генетика. 1998. Т.34. № 2. С. 206-212.

7. Старовойтов И.И., Нефедова М.Ю., Яковлев Г.И., Зякун A.M., Аданин В.М. Гентизиновая кислота продукт микробного окисления нафталина // Изв. Акад. Наук. Сер. Хим. 1975. № 9. 2091-2092.

8. Alonso R., Martin A., Pelaez Т., Marin М., Rodriguez-Creixems М., Bouza Е. An improved protocol for pulsed-field gel electrophoresis typing of Clostridium difficile IIJ Med Microbiol. 2005. Vol.54. № 2. P. 155-157.

9. Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., Struhl, K. (ed.), 1999. Shot Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, Inc. 4lh ed., p.1056.

10. Bayly R.C., Chapman P.J., Dagley S., Di Berardino D. Purification and some properties of maleylpyruvate hydrolase and fumarylpyruvate hydrolase from Pseudomonas alcaligenes // J Bacteriol. 1980. Vol.143. № 1. P.70-77.

11. Bosch R., Garcia-Valdes E., Moore E.R.B. Genetic characterization and evolutionary implications of a chromosomally encoded naphthalene-degradation upper pathway from Pseudomonas stutzeri АШ01/ Gene. 1999a. Vol. 236. P. 149-157.

12. Bosch R., Moore E.R.B., Garcia-Valdes E., Pieper D.H. NahW, a novel, inducible salicylate hydroxylase involved in mineralization of naphthalene by Pseudomonas stutzeri AN10 // J.Bacteriol. 1999b. Vol.181. P.2315-2322.

13. Bosch R., Garcia-Valdes E., Moore E.R.B. Complete nucleotide sequence and evolutionary significance of a chromosomally encoded naphthalene-degradation lower pathway from Pseudomonas stutzeri AN 10 // Gene. 2000. Vol.245. P. 65-74.

14. Bhushan В., Halasz A., Spain J.C., Hawaii J. Initial reaction(s) in biotransformation of CL-20 is catalyzed by salicylate 1-monooxygenase from Pseudomonas sp. strain АТС С 29352 // Appl. Environ. Microbiol. 2004. Vol. 70. № 7. P. 4040-7.

15. Cane P.A., Williams P.A. The Plasmid-coded Metabolism of Naphthalene and 2-Methylnaphthalene in Pseudomonas strains: Phenotypic Changes Correlated with Structural modification of the Plasmid pWW60-l // J. Gen. Microbiol. 1982. Vol.128. P. 2281-2290.

16. Cerniglia C.E. Microbial Metabolism of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons // Larkin A (Ed) Advances in Applied Microbiology. Academic Press. New York. 1984. Vol.30. P.31-37.

17. Cerniglia C.E. Biodegradation of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons // Curr. Opin. Biotechnol. 1993. Vol. 4. P. 331 -338.

18. Chapalamadugu S., Chaudhry G. R. Hydrolysis of carbaryl by a Pseudomonas sp. and construction of a microbial consortium that completely metabolizes carbaryl // Appl. Environ. Microbiol. 1991. Vol. 57. P. 744-750.

19. Chapalmadugu S., Chaudhry G. R. Isolation of constitutively expressed enzyme for hydrolysis of carbaryl in Pseudomonas aeruginosa II J. Bacteriol. 1993. Vol. 175. P. 6711-6716.

20. Chaudhry G. R., Mateen A., Kaskar В., Bloda M., Riazuddin S. Purification and biochemical characterization of the carbamate hydrolase from Pseudomonas sp. 50432 // Biotechnol. Appl. Biochem. 2002. Vol. 36. P. 63-70.

21. Chen Z., Klessig D.F. Identification of a soluble salicylic acid-binding protein that may function in signal transduction in the plant disease-resistance response // Proc. Nath. Acad. Sci. USA. 1991. Vol. 88. № 18. P. 8179-8183.

22. Cohen S.P., Levy S.B., Foulds J., Rosner J.L. Salicylate Induction of Antibiotic Resistance in Escherichia coli: Activation of the mar Operon and a mar-Independent Pathway // J. Bacteriol. 1993a. Vol. 175. № 24. P. 7856-7862.

23. Cohen S. P., Hachier H., Levy S. B. Genetic and functional analysis of the multiple antibiotic resistance (mar) locus in Escherichia coli // J. Bacteriol. 1993b. Vol. 175. №24. P. 1484-1492.

24. Costacurta A., Vanderleyden J. Synthesis of phytohormones by plant-associated bacteria// Crit. Rev. Microbiol. 1995. Vol. 21. P. 1-18.

25. Claus G. Kutzner HJ. Degradation of indole by Alcaligenes spec // System. Appl. Microbiol. 1983. Vol. 4. P. 169-180.

26. Dagley S., Evans W.C., Ribbone D.W. New pathways in the oxidative metabolizm of aromatic compounds by microorganisms //Nature. 1960. P. 188-560.

27. Sl.Dagher F., Deziel E., Lirettc P., Paquette G., Bisaillon J.G., Villemur R. Comparative study of five polycyclie aromatic hydrocarbon degrading bacterial strains isolated from contaminated soils // Can. J. Microbiol. 1997. Vol. 43. P. 368-377.

28. Davies J.I., Evans W.C. Oxidative metabolism of naphthalene by soil pseudomonas: The ring-fission mechanism // J. Biochem. 1964. Vol. 91. P. 251-261.

29. Delaney S.M., Mavrodi D.V., Bonsall R.F., Thomashow L.S., phzO, a gene for ' biosynthesis of 2-hydroxylated phenazine compounds in Pseudomonas aureofaciens30.84 // J. Bacteriol. 2001. Vol. 183. P. 318-327.

30. Denome S.A., Stanley D.C., Olston E.S., Young K.D. Metabolism of dibenzothiophene and naphthalene in Pseudomonas strains: complete DNA sequence of an upper naphthalene catabolic pathway // J.Bacteriol. 1993. Vol. 176. P. 21582164.

31. Deslandes В., Gariepy C.} Houde A. Review of microbiological and biochemical effects of skatole on animal production // Livestock Production Sci. 2001. Vol. 71. P. 193-200.

32. Doddamani H. P., Ninnekar H. Z. Biodegradation of carbaryl by a Micrococcus species // Curr. Microbiol. 2001. Vol. 43. P. 69-73.

33. Dombek P.E., Johnson L.K., Zimmerley S.T., Sadowsky M.J. Use of repetitive DNA sequences and the PCR to differentiate Escherichia coli isolates from human and animal sources // Appl. Environm. Microbiol. 2000. Vol. 66. P. 2572-2577.

34. Dunn N.W., Gunsalus I.C. Transmissible plasmid coding early enzymes of naphthalene oxidation in Pseudomonas putida // J.Bacteriol. 1973. Vol. 114. P. 974979.

35. Durrant W. E., Dong X. Systemic acquired resistance // Annu. Rev. Phytopathol. 2004. Vol. 42. P. 185-209.

36. Einarsdottir G.H., Stankovich M.T., Tu S.C. Studies of electron-transfer properties of salicylate hydroxylase from Pseudomonas cepacia and effects of salicylate and benzoate binding // Biochemistry. 1988. Vol. 27. № 9. P. 3277-3285.

37. Ensley B.D., Ratzkin B.J., Osslund T.D., Simon M.J., Wackett L.P., Gibson D.T. Expression of naphthalene oxidation genes in Escherichia coli results in the biosynthesis of indigo // Science. 1983. Vol. 222. № 4620. P. 167-169.

38. Evans W.C., Fernley H.N. Griffiths E. Oxidative metabolism of phenantrene and anthracene by soil pseudomonads: the ring-fission mechanism // J. Biochem. 1965. Vol. 95. P. 819-831.

39. Evans C.G.T., Herbert D., Tempest D.B. The continuous cultivation of microorganisms. 2. Construction of a chemostat // Methods in Microbiology. 1970. Vol. 2. P. 277-327.

40. Evans W.C., Fichs G. Anaerobic degradation of aromatic compounds // Annu. Rev. Microbiol. 1988. Vol. 42. P. 289-317.

41. Fuenmayor S.L., Wild M., Boyles A.L., Williams P.A. A gene cluster encoding steps in conversion of naphthalene to gentisatc in Pseudomonas sp. strain U2 // J. Bacteriol. 1998. Vol. 180. P. 2522-2530.

42. Gaille C., Kast P., Haas D. Salicylate biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa II J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277. P. 21768-21775.

43. Gieg L.M., Otter A., Fedorak P.M. Carbazole degradation by Pseudomonas sp LD2: metabolic characteristics and the identification of some metabolites // Environ. Sci. Technol. 1996. Vol. 30. P. 575-585.

44. Goethals K., Van Montagu M., Holsters M. Conserved motifs in a divergent nod box of Azorhizobium caulinodans ORS571 reveal a common structure in promoters regulated by LysR-type proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992 Vol. 89. № 5. P. 1646-50.

45. Grimm A.C., Harwood C.S. NahY, a catabolic plasmid-encoded receptor required for chemotaxis of Pseudomonas putida to the aromatic hydrocarbon naphthalene // J. Bacteriol. 1999. Vol.181. P. 3310-3316.

46. Grund E., Denecke D., Eichenlaub R. Naphthalene degradation via salicylate and gentisate by Rodococcus sp strain B4 // Appl. Environm. Microbiol. 1992. Vol. 58. P. 1874-1877.

47. Grund E., Knorr C., Eichenlaub R. Catabolism of benzoate and monohydroxylated benzoates by Amycolatopsis and Streptomyces spp. // Appl. Environ. Microbiol. 1990. Vol. 56. №5. P. 1459-1464.

48. Habe H., Omori T. Genetics of polycyclic aromatic hydrocarbon metabolism in diverse aerobic bacteria//Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003. Vol. 67. P.225-243.

49. Hahlbrock K., Scheel D. Physiology and molecular biology of phenypropanoid metabolism // Annual Review of Plant Physiology of Plant Molecular Biology. 1989. Vol. 40. P. 347.

50. Hachler H., Cohen S. P., Levy S. B. marA, a regulated locus which controls expression of chromosomal multiple antibiotic resistance in Escherichia coli // J. Bacterid. 1991. Vol. 173. P. 5532-5538.

51. Hamzah R.Y., Tu S.C. Determination of the position of monooxygenation in the formation of catechol catalyzed by salicylate hydroxylase // J. Biol. Chem. 1981. Vol. 256. № 12. P. 6392-6394.

52. Harpel M.R., Lipscomb J.D. Gentisate 1,2-dioxygenase from Pseudomonas. Substrate1Acoordination to active site Fe and mechanism of turnover // J. Biol. Chem. 1990 Vol. 265. №36. P. 22187-22196.

53. Harpel M.R., Lipscomb J.D. Gentisate 1,2-dioxygenase from pseudomonas. Purification, characterization, and comparison of the enzymes from Pseudomonas testosteroni and Pseudomonas acidovorans // J. Biol. Chem. 1990. Vol. 265. № 11. P. 6301-6311.

54. Hayatsu M., Hirano M., Nagata T. Involvement of two plasmids in the degradation of carbaryl by Arthrobacter sp. strain RC100 // Appl. Environ. Microbiol. 1999. Vol. 65. P. 1015-1019.

55. Herrick J.B., Stuart-Keil K.G., Ghiorse W.C., Madsen E.L. Natural horizontal transfer of a naphthalene dioxygenase gene between bacteria native to a coal tar-contaminated field site //Appl. Environm. Microbiol. 1997. Vol. 63. P. 2330-2337.

56. Hintner J. P., Lechner C., Riegert U., Kuhm A.E., Storm Т., Reemtsma Т., Stolz A. Direct ring fission of salicylate by a salicylate 1,2-dioxygenase activity from Pseudaminobacter salicylatoxidans II J. Bacteriol. 2001. Vol. 183. P. 6936-6942.

57. Hopper DJ, Chapman PJ, Dagley S. Enzymic formation of D-malate // Biochem J. 1968. Vol. 110. № 4. P. 798-800.

58. Izmalkova T.Y., Mavrodi D.V., Sokolov S.L., Kosheleva I.A., Smalla K., Thomas C.M., Boronin A.M. Molecular classification of IncP-9 naphthalene degradation plasmids // Plasmid. 2006. Vol. 56. № 1. P. 1-10.

59. Ishiyama D., Vujaklija D., Davies J. Novel pathway of salicylate degradation by Streptomyces sp. strain WA46 // Appl. Environ. Microbiol. 2004. Vol .70. № 3. P. 1297-306

60. James W.O., Beevers H. The respiration of Arum spadix. A rapid respiration, resistant to cyanide // New Phytol. 1950. Vol. 49. P. 353-374.

61. Jensen J.B., Egsgaard H., Vanonckelen H., Jochimsen B.U. Catabolism of indole-3-acetic-acid and 4-chloroindole-3- acetic and 5-chloroindole-3-acetic acid in Bradyrhizobium japonicum II J. Bacteriol. 1995. Vol. 177. P. 5762-5766.

62. Jones D.C., Cooper R.A. Catabolism of 3-hydroxybenzoate by the gentisate pathway in Klebsiella pneumoniae M5al // Arch. Microbiol. 1990. Vol. 154. № 5. P. 489-495.

63. Jones R.M., Britt-Compton В., Williams P.A. The naphthalene catabolic (nag) genes of Ralstonia sp. strain U2 are on operon that is regulated by NagR, a LysR-type transcriptional regulator//J. Bacteriol. 2003. Vol. 185. P. 5847-5853.

64. Jouanneau Y., Micoud J., Meyer C. Purification and characterization of a three-component salicylate 1-hydroxylase from Sphingomonas sp. strain CHY-1 // Appl Environ Microbiol. 2007. Vol. 73. № 23. P. 7515-7521.

65. Ka J.O., Tiedje J.M. Integration and excision of a 2,4-dichlorophenoxyacetic acid-degradative plasmid in Alcaligenes paradoxus and evidence of its natural intergeneric transfer//J. Bacteriol. 1994. Vol. 176. P. 5284-5289.

66. Katagiri M., Yamamoto S., Hayaishi O. Flavin adenine dinucleotide requirement for the enzymic hydroxylation and decarboxylation of salicylic acid // J. Biol.Chem. 1962. Vol. 237. №7. P. 2413-2414.

67. Kim E., Zylstra G.J. Functional analysis of genes involved in biphenyl, naphthalene, phenanthrene, and m-xylene degradation by Sphingomonas yanoikuyae B1 //J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 1999. Vol. 23. P. 294-302.

68. Kiyohara H., Nagao K., Yana K. Rapid screen for bacteria degrading water-insoluble, solid hydrocarbons on agar plates // Appl. Environ. Microbiol. 1982a. Vol.43. P. 454457.

69. Sl.Krieg, N.J., Holt J.G. (ed.). Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Williams & Wilkins, Baltimore, Md, 1. 1984.

70. Krupasagar V., Sequeira L. Auxin destruction by Marasmius perniciosus. II Am. J. Bot. 1969. Vol. 56. P. 390-397.

71. Kurkela S.H., Lehvaslaiho E.T., Oalva E.T., Teeri Т.Н. Cloning, nucleotide sequencing and characterisation of genes encoding naphthalene dioxygenase of Pseudomonas putida strain NCIB9816 // Gene. 1988. Vol. 73. P.355-362.

72. Lack L. The enzymic oxidation of gentisic acid // Biochim. Biophys. Acta. 1959. Vol. 34. P. 117-123.

73. Lack L. Enzymic cis-trans isomerization of maleylpyruvic acid. // J. Biol. Chem. 1961. Vol. 236. P. 2835-2840.

74. Larkin M. J., Day M. J. The metabolism of carbaryl by three bacterial isolates, Pseudomonas sp. (NCIB 12042 & 12043) and Rhodococcus sp. (NCIB 12038) from garden soil // J. Appl. Bacteriol. 1986. Vol. 60. P. 233-242.

75. Laurie A.D., Lloyd-Jones G. Quanification ofphnAc and nahAc in contaminated New Zealand soils by competitive PCR // Appl.Environ.Microbiol. 2000. Vol. 66. P. 18141817.

76. Lendenmann U, Spain JC. 2-aminophenol 1,6-dioxygenase: a novel aromatic ring cleavage enzyme purified from Pseudomonas pseudoalcaligenes JS45 // J. Bacteriol. 1996. Vol. 178. № 21. P. 6227-6232.

77. Leveau J.H.J., Lindow S.E. Utilization of the plant hormone indole-3-acetic acid for growth by Pseudomonas putida strain 1290 // Appl. Environ. Microbiol. 2005. Vol. 71. P. 2365-2371.

78. Li W., Shi J., Wang X., Han Y., Tong W., Ma L., Liu В., Cai B. Complete nucleotide sequence and organization of the naphthalene catabolic plasmid pND6-l from Pseudomonas sp. strain ND6 // Gene. 2004. Vol. 336. P. 231-40.

79. Loffler F., Miiller R. Identification of 4-chlorobenzoyl-coenzyme A as intermediate in the dehalogenation catalyzed by 4-chlorobenzoate dehalogenase from Pseudomonas sp. CBS3 // FEBS Lett. 1991. Vol. 290. № 1-2. P. 224-226.

80. Meeuse В.J.D., Raskin I. Sexual reproduction in the arum, lily family, with emphasis on thermogenicity // Sex. Plant. Reprod. 1988. Vol. 1. P. 3-15.

81. Menn F.-M., Applegate B.M., Sayler G.S. Plasmid-mediated catabolism of naphthalene, phenenthrene and anthracene to naphthoic acid // Appl.Environ.Microbiol. 1993. Vol. 59. P. 1938-1942.

82. Mino Y. Studies on destruction of indole-3-acetic acid by a species of Arthrobacter. IV. Decomposition products // Plant Cell Physiol. 1970. Vol. 11. P. 129.

83. Monticello D.J., Bakker D., Schell M., Finnerty W.R. Plasmid-borne Tn5 insertion mutation resulting in accumulation of gentisate from salicylate // Appl. Environ. Microbiol. 1985. Vol. 49. № 4. P. 761-764.

84. Mulbry W. W., Eaton R. W. Purification and characterization of iV-methylcarbamate hydrolase from Pseudomonas strain CRL-OK //Appl. Environ. Microbiol. 1991. Vol. 57. P. 3679-3682.

85. Mtiller U., Lingens F. Degradation of 1, 4-naphthoquinones by Pseudomonas putida II Biol. Chem. Hoppe Seyler. 1988. Vol. 369. № 9. P. 1031-1043.

86. Nakai C., Kagamiyama H., Saeki Y., Nozaki M. Nonidentical subunits of pyrocatechase from Pseudomonas arvilla C-l // Arch. Biochem. Biophys. 1979. Vol. 195. № i.p. 12-22.

87. Nakai C., Nakazawa Т., Nozaki M. Purification and properties of catechol 1,2-dioxygenase (pyrocatechase) from Pseudomonas putida mt-2 in comparison with that from Pseudomonas arvilla C-l // Arch. Biochem. Biophys. 1988. Vol. 267. № 2. P. 701-713.

88. Nozaki M. Oxygenases and dioxygenases // Top. Curr. Chem. 1979. Vol. 78. P. 145-186.

89. Okujo N., Saito M., Yamamoto S., Yoshida Т., Miyoshi S., Shinoda S. Structure of vulnibactin, a new polyamine-containing siderophore from Vibrio vulnificus II Biometals. 1994. Vol. 7. P. 109-116.

90. Ornston L.N. The conversion of catechol and protocatechuate to beta-ketoadipate by Pseudomonas putida. enzymes of catechol pathway I I J. Biol. Chein. 1966. Vol. 166. P.9-14.

91. Park M, Jeon Y., Jang H.H., Ro H.S., Park W., Madsen E.L., Jeon C.O. Molecular and biochemical characterization of 3-hydroxybenzoate 6-hydroxylase from Polaromonas naphthalenivorans CJ2 // Appl. Environ. Microbiol. 2007. Vol. 73. № 16. P. 5146-5152.

92. Patten C.L., Glick B.R. Bacterial biosynthesis on indole-3-acetic acid // Can. J. Microbiol. 1996. Vol. 42. P. 207-220.

93. Pinyakong O., Habe H., Yoshida Т., Nojiri PI., Omori T. Identification of three novel salicylate 1-hydroxylases involved in the phenanthrene degradation of Sphingobium sp. strain P2 // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. Vol. 301. № 2. P. 350-357.

94. Proctor M.H. Bacterial dissimilation of indoleacetic acid new route of breakdown of the indole nucleu//Nature. 1958. Vol. 181. P. 1345-1345.

95. Rajgopal B. S.,. Rao V. R, Nagendraappa G., Sethunathan N. Metabolism of carbaryl and carbofuran by soil enrichment and bacterial cultures // Can. J. Microbiol. 1984. Vol. 30. P. 1458-1466.

96. Raskin I. Salicylate, A New Plant Hormone // Plant Physiol. 1992. Vol. 99. P. 799803.

97. Reiner A.M. Metabolism of benzoic acid by bacteria: 3,5-cyclohexadiene-l,2-diol-1-carboxylic acid is an intermediate in the formation of catechol // J. Bacteriol. 1971 Vol. 108. № l.P. 89-94.

98. Robson N.D., Parrott S., Cooper R.A. In vitro formation of a catabolic plasmid carrying Klebsiella pneumoniae DNA that allows growth of Escherichia coli K-12 on 3-hydroxybenzoate // Microbiology. 1996. Vol. 142. P. 2115-2120.

99. Rosner, J. L. Nonheritable resistance to chloramphenicol and other antibiotics induced by salicylates and other chemotactic repellents in Escherichia coli K-12 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. Vol. 82. P. 8771-8774.

100. Rossello-Mora R.A., Lalucat J., Garcia-Valdes E. Comparative biochemical and genetic analysis of naphthalene degradation among Pseudomonas stutzeri strain // Appl.Environ.Microbiol. 1994. Vol. 60. P. 966-972.

101. Sanseverino J., Applegate B.M., King J.M.H., Sayler G.S. Plasmid-mediated mineralisation of naphthalene, phenenthrene and anthracene // Appl.Environ.Microbiol. 1993. Vol. 59. P. 1931-1937.

102. Schell M.A., Sukordhaman M. Evidence that the transcription activator encoded by the Pseudomonas putida nahR gene is evolutionary related to the transcription activator encoded by the Rhizobium nodD genes // J. Bacteriol. 1989. Vol. 171. P. 1952-1959.

103. Sentchilo V.S., Ravatn R., Werlen C., Zehnder A.J., van der Meer J.R. Unusual integrase gene expression on the clc genomic island in Pseudomonas sp. strain В13 // J. Bacteriol. 2003. Vol. 185. P. 4530-4538.

104. Shamsuzzaman K.M., Barnsley E.A. The regulation of naphthalene metabolism in pseudomonads // Biochem. Biophys. Rec. Comm. 1974. Vol.60. P. 582-587.

105. Schell M.A. Transcriptional control of the nah and sal hydrocarbon-degradation operons by the nahR gene product // Gene. 1985. Vol.36. P. 301-303.

106. Schell M.A., Brown P.H., Raju S. Use of saturation mutagenesis to localize probable functional domains in the NahR protein, a LysR-type transcription activator //J. Biol. Chem. 1990. Vol. 265. № 7. P. 3844-3850.

107. Scholten J.D., Chang K.H., Babbitt P.C., Charest H., Sylvestre M., Dunaway-Mariano D. Novel enzymic hydrolytic dehalogenation of a chlorinated aromatic // Science. 1991. Vol. 253. № 5016. P. 182-185.

108. Silakowski В., Kunze В., Nordsiek G., Blocker H., Hofle G., Mttller R. The myxochelin iron transport regulon of the myxobacterium Stigmatella aurantiaca Sg al5 //Eur. J. Biochem. 2000. Vol. 267. №21. P. 6476-6485.

109. Simon M.J., Osslund D.T., Saunders R., Ensley B. D., Suggs S., Harcourt A., Suen W., Gruden D.T., Zylstra G.J. Sequences of genes encoding naphthalene dioxygenase in Pseudomonas putida strain G7 and NCIB 9816-4 // Gene. 1993. Vol. 127. P. 31 -37.

110. Sims J.L., Sims R.N., Matthews J.E. Approach to bioremediation of contaminated soil // Haz.Waste Haz.Matter. 1990. Vol.7. P. 117-149.

111. Sokol P.A., Lewis C.J., Dennis J.J. Isolation of a novel siderophore from Pseudomonas cepacia //J. Med. Microbiol. 1992. Vol. 36. P. 184-189.

112. Spaepen S., Vanderleyden J., Remans R. Indole 3-acetic acid in microbial and microorganism-plant signaling // FEMS Microbiol. Rev. 2007. Vol. 31. P. 425-448.

113. Stolz A., Nortemann В., Knackmuss H.J. Bacterial metabolism of 5-aminosalicylic acid. Initial ring cleavage // J.Biochem. 1992. Vol. 282. (Pt 3). P. 675-680.

114. Strawinski R.J., Stone R.W. Conditions governing the oxidation of naphthalene and the chemical analysis of its products // J.Bacteriol. 1943. Vol. 45. P.16-24.

115. Suemori A., Nakajima K. Kurane R., Nakamura Y. o-, m- and p-hydroxybenzoate degradative pathways in Rhodococcus erythropolis II FEMS Microbiol. Lett. 1995. Vol. 125. № 1. P. 31-35.

116. Suzuki K., Katagiri M. Mechanism of salicylate hydroxylase-catalyzed decarboxylation// Biochim. Biophys. Acta. 1981. Vol. 657. № 2. P. 530-534.

117. Suzuki K., Ohnishi K. Functional modification of an arginine residue on salicylate hydroxylase // Biochim. Biophys. Acta. 1990. Vol. 1040. № 3. P. 327-336.

118. Suzuki К., Gomi Т., Kaidoh Т., Itagaki E. Hydroxylation of o-halogenophenol and o-nitrophenol by salicylate hydroxylase // J. Biochem. 1991a. Vol. 109. № 2. P. 34853.

119. Suzuki K., Gomi Т., Itagaki E. Intermediate and mechanism of hydroxylation of o-iodophenol by salicylate hydroxylase // J. Biochem. 1991b. Vol. 109. № 5. P. 791-797.

120. Suzuki K., Mizuguchi M., Gomi Т., Itagaki E. Identification of a lysine residue in the NADH-binding site of salicylate hydroxylase from Pseudomonas putida S-l I I J. Biochem. 1995. Vol. 117. № 3. P. 579-585.

121. Suzuki K., Mizuguchi M., Ohnishi K., Itagaki E. Structure of chromosomal DNA coding for Pseudomonas putida S-l salicylate hydroxylase I I Biochim. Biophys. Acta. 1996. Vol. 1275. № 3. P. 154-156.

122. Suzuki K., Asao E., Nakamura Y., Nakamura M., Ohnishi K., Fukuda Sh. Overexpression of salicylate hydroxylase and the crucial role of Lys as its NADH binding site // J. Biochem. 2000. Vol. 128. P. 239-299.

123. Swetha V.P., Phale P.S. Metabolism of Carbaryl via 1,2-Dihydroxynaphthalene by Soil Isolates Pseudomonas sp. Strains C4, C5, and C6 // Appl. Environm. Microbiol. 2005. Vol. 71. № 10. P. 5951-5956.

124. Takemori S., Yasuda H., Mihara K., Suzuki K., Katagiri M. Mechanism of the salicylate hydroxylase reaction. II. The enzyme-substrate complex // Biochim. Biophys. Acta. 1969. Vol. 191. № 1. P. 58-68.

125. Takemori S., Nakamura M., Suzuki K., Katagiri M., Nakamura T. The kinetics of salicylate hydroxylase reaction // FEBS Lett. 1970. Vol. 6. № 4. P. 305-308.

126. Tan H.-M. Bacterial catabolic transposons // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. Vol. 51. P. 1-12.

127. Teale W.D., Paponov I.A., Palme K. Auxin in action: signalling, transport and the control of plant growth and development // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2006. Vol. 7. P. 847-859.

128. Top E.M., Moenne-Loccoz Y., Pembroke Т., Thomas, C.M. (ed.) Phenotypic traits conferred by plasmids // The horizontal gene pool. Harwood Academic Publishers, Amsterdam, 2000. pp. 249-285.

129. Tropel D., van der Meer J.R. Bacterial transcriptional regulators for degradation pathways of aromatic compounds // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2004. Vol. 68. № 3. P. 474-500.

130. Tsubokura S., Sakamoto Y., Ichihara K. The bacterial decomposition of indoleacetic acid//J. Biochem. 1961. Vol. 49. P. 38.

131. Tsuda M., lino T. Naphthalene degrading genes on plasmid NAH7 are on a defective transposon // Mol. Gen. Genet. 1990. Vol. 223. P.33-39.

132. Tu S.C., Romero F.A., Wang L.H. Uncoupling of the substrate monooxygenation and reduced pyridine nucleotide oxidation activities of salicylate hydroxylase by flavins // Arch. Biochem. Biophys. 1981. Vol. 209. № 2. P. 423-432.

133. Vane J. R., Botting R. M. The history of aspirin. In J. R. Vane and R. M. Botting (ed.), Aspirin and other salicylates. Chapman and Hall, London, United Kingdom. 1992. p. 3-34.

134. Visca, P., Ciervo A., Sanfilippo V. Orsi N. Iron-regulated Salicylate synthesis by Pseudomonas spp. // J. Gen. Microbiol. 1993. Vol. 139. P. 1995-2001.

135. Vontor Т., Socha J., Vecera M. Kinetics and mechanism of hydrolysis of 1-naphthyl, //-methylcarbamate and AW-dimethylcarbamates // Collect. Czech. Chem. Commun. 1972. Vol. 37. P. 2183-2196.

136. Wang L.H., Tu S.C. The kinetic mechanism of salicylate hydroxylase as studied by initial rate measurement, rapid reaction kinetics, and isotope effects // J. Biol. Chem. 1984. Vol. 259. № 17. P. 10682-10688.

137. Wang L.H., Tu S.C. Lusk R.C. Apoenzyme of Pseudomonas cepacia salicylate hydroxylase. Preparation, fluorescence property, and nature of flavin binding // J. Biol. Chem. 1984. Vol. 259. № 2. P. 1136-1142.

138. Weisburg W.G., Barnes S.M., Pelletier D.A., Lane D.J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study // J. Bacteriol. 1991. Vol.73. P. 697-703.

139. Weller D.M. Colonization of wheat roots by a fluorescent pseudomonad suppressive to take-all // Phytopathology. 1983. Vol. 73. P. 1548-1553.

140. White-Stevens R.H., Kamin H. Uncoupling of oxygen activation from hydroxylation in a bacterial salicylate hydroxylase // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1970. Vol. 38. №> 5. P. 882-889.

141. White-Stevens R.H., Kamin H., Gibson Q.H. Studies of a flavoprotein, salicylate hydroxylse. I. Enzyme mechanism // J. Biol. Chem. 1972. Vol. 247. № 8. P. 23712381.

142. Williams P.A., Catterall F.A., Murray K. Metabolism of naphthalene, 2-methylnaphthlene, salicylate, and benzoate by Pseudomonas PG: tangential pathways // J. Bacteriol. 1975. V.124. P. 679-685.

143. Wikstrom P., Wiklund A., Andersson A.C., Forsman M. DNA recovery and PCR quantification of catechol-2,3-dioxygenase genes from different soil types // Journal of Biotechnology. 1996. Vol.52. P. 107-120.

144. Williams P.A., Sayers J.R. The evolution of pathway for aromatic hydrocarbons oxidation in Pseudomonas II Biodegradation. 1994. Vol.5. P. 195-217.

145. Yamamoto S., Katagiri M., Maeno H., Hayaishi O. Salicylate hydroxylase, monooxygenase requiring flavin adenine dinucleotide. 1. Purification and general properties // J. Biol. Chem. 1965. Vol. 230. P. 3408-3413.

146. Yen K.M., Serdar C.M. Genetics of naphthalene catabolism in Pseudomonads II CRC Crit.Rev.Microbiol. 1988. Vol. 15. P. 247-268.

147. Yen K.M., Gunsalus I.C. Regulation of naphthalene catabolic genes of plasmid NAH7 // J. Bacteriol. 1985. Vol.162. P.1008-1013.

148. Yen K.M., Gunsalus I.C. Plasmid gene organization: naphthalene/salicylate oxidation //Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1982. Vol.79. P.874-878

149. You I.-S., Murray R.I., Jollie D., Gunsalus I.C. Purification and characterization of salicylate hydroxylase from Pseudomonas putida PpG7 // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1990. Vol.169. P. 1049-1054.

150. You I.S., Ghosal D, Gunsalus I.C. Nucleotide sequence analysis of the Pseudomonas putida PpG7 salicylate hydroxylase gene (nahG) and its 3'-flanking region//Biochemistry. 1991. Vol. 30. P. 1635-1641.

151. Yokoyama M.T., Carlson J.R., Holdeman L.V. Isolation and characteristics of a skatole-producing Lactobacillus sp from the bovine rumen // Appl. Environ. Microbiol. 1977. Vol. 34. P. 837-842.

152. Zabinski R., Munck E., Champion P.M., Wood J.M. Kinetic and Mossbauer studies on the mechanism of protocatechuic acid 4,5-oxygenase // Biochemistry. 1972. Vol. 11. № 17. P. 3212-3219.

153. Zhao H, Chen D, Li Y, Cai B. Overexpression, purification and characterization of a new salicylate hydroxylase from naphthalene-degrading Pseudomonas sp. strain ND6 // Microbiol. Res. 2005. Vol. 160. № 3. p. 307-313.

154. Zhou N.Y., Fuenmayor S.L., Williams P.A. nag genes of Ralstonia (formerly Pseudomonas) sp. strain U2 encoding enzymes for gentisate catabolism // J.Bacteriol. 2001. Vol.183. P. 700-708.

155. Zylstra G.J., Kim E., Goyal A.K. Comparative Molecular Analysis of Genes for Polycyclic Aromatic Hydrocarbon Degradation // Genetic Engineering. 1997. Vol.19. P. 257-269.

156. Особую благодарность автор выражает своим наставникам и учителям чл.-корр РАН., проф. Воронину А. М., к.б.н. Кошелевой И.А. и к.б.н. Измалковой Т.Ю. за чуткое и умелое руководство, постоянное внимание и поддержку.

Информация о работе

Сазонова, Олеся Ивановна
кандидата биологических наук
Пущино, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Генетические системы деградации салицилата у флуоресцирующих псевдомонад - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы