Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПОЛУЧЕНИЕ МУТАНТОВ, ПОДБОР СИСТЕМ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПЕРЕНОСА И КЛОНИРОВАНИЕ НЕКОТОРЫХ ГЕНОВ МЕТАНОКИСЛЯЩИХ БАКТЕРИЙ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ПОЛУЧЕНИЕ МУТАНТОВ, ПОДБОР СИСТЕМ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПЕРЕНОСА И КЛОНИРОВАНИЕ НЕКОТОРЫХ ГЕНОВ МЕТАНОКИСЛЯЩИХ БАКТЕРИЙ"

А -ЗОПЬ

ордена ленина и орден*. друибы народов акадшйя №ук укшнской сср

ордена трудового красного знамени

июютг микробиологии и виртоолзгии им. д.к.ЭАВОЛШЮГО

На правах рукописи

СТОЛЯР Сергей Маркович

получив штатов, шдаор СИЛЕН генетического

ПЕРЕНОСА И КЛДООШШБ НЕКОТОРЫХ ГЕНОВ ншкжйслгкщшс ЕАКТЕРИЙ

03.00.07 - микробиология 03.00.18 - генетика.

> Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев - 1991

г г '. .

Работа выполнена в Институте микробиология и вирусология им. Д. К. Заболотного АН УССР

Научные руковопителя: доктор биологических наук

В.А* Романовская

доктор биологических наук Ю.Д. Цыганков

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

член-корр. АН УССР Б. П. Нацелил

4 кандидат биологических наук И.Н, Стехин

Ведущее учреждение: < Кафелра генетики Белорусского

. государственного университета

Защита состоятся "/У" 1991 р. в ^часов

на заседании специализированного совета Д 016. Об. 01 по -защите докторских диссертаций при Институте микробиологии и вирусология им. Д.К, Забоиотного АН УССР по адресу. 252143, Киев-143, ул. Заболотного, 154

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного АН УССР .

Автореферат разослан 1991 г.

. Ученый секретарь специализированного совета . . кандипат биологических наук Э.А. Коваленко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность ^облемы. Последние 30 лет метанохисляющие бактерии (метанотрофы) являются предметом изучения большого числа исследователей во всеы мире. Это обусловлено целым рявом причин. Во-первых, метанокислящие бактерии играют важну» роль в круговороте углерода в биосфере Земли» так как значительная часть биогенного и абиогенного метана превращается в органические вещества и Сй> в результате их жизнедеятельности; они также способны фиксировать молекулярный аэот. Во-вторах, метанокн-сляющие бактерии обладают специфическими особенностями метаболизма: облкгатной зависимостью от метана (и в некоторые случаях от метанола),как источника углерова к энергии; иногже экзогенные органические вещества, являющиеся нормальными метаболитами клетки, подавляют их рост; отсутствует субстратная специфичность ключевых ферментов окисления метана, а также некоторыми другими. Большой интерес метанокисляющие бактерии представляют также в связи с возможностью их применения в биотехнологии для получения кормового белка, полксахаривов, пигментов и вругих биологически активных продуктов из метана.

Понимание роли любого микроорганизма в природных экосистема*, а также использование его в биотехнологии невозможно без изучения путей метаболизма и их регуляции. За последние годы в исследованиях физиологии и биохимии метанокисляющих бактерий достигнуты значительные успехи. Однако отсутствуют систематические работы по изучению генетики ванной группы бактерий. Так,до сир пор не разработаны методы мутагенеза, селекции широкого спектра мутантов, не созданы системы переноса генетической ннформа-М клонирования генов в клетках метанокисляющих бактерий.

ЦЕНТРАЛЬНАЯ

НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА Мс»(. оолискохоз. аиаде*«и н.,;, И. А.<Тимир«9вва

Цель и задачи исследования. Целью панной работы было изучение генетической изменчивости метанотрофов, действия на них ряиа мутагенов, систем генетической рекомбинации и обмена генов, а также возможности клонирования генов в гетерологичных хозяевах.

Для решения этих проблем были поставлены следующие задачи: изучить спонтанную и индуцированную ч/тагенами генетическую изменчивость ряда штаммов метанокисляющих бактерий; исследовать их плазмивы; изучить возможность использования плаэиии с широким кругом бактериальных хозяев в качестве систем генетического обмена у метанокисляющих бактерий; выяснить возможность молекулярного клонирования и экспрессии генов метанокисляюищх бактерий в клетках гетерологичных хозяев <в частности гесА -подобного гена).

Работа выполнена в отделе биологии гаэокисляющих микроорганизмов ftfcTMTyra микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотно-го АН УССР. Работа по созданию банка генов «ethylococcua ther-mopMltte была провезена в лаборатории генетики метклотрофных микроорганизмов ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов Минменбиопрома СССР.

Научная новизна. Изучена спонтанная изменчивость ряда признаков у нескольких штаммов метанокисляющих бактерий. Впервые показано, что ультрафиолетовое (УФ) излучение и нитрозогуанивин (НГ) оказывают мутагенное действие на клетки метанокисляющих бактерий ( в частности М.rubra и M.theimophiius ). Подобраны условия, оптимальные пля мутагенеза этих штаммов. Обнаружены пла-эмкиы в клетках ряда ранее не исследованных штаммов метанокисляющих бактерий. Установлено, чтс плазкивы с широким кругом бактериальны* хозяев способны передаваться из штаммов Б.coli и Р. ри-tida к повверживаться в клетках метанокисляющих бактерий,прояв-

ляя в них свои основные свойства (устойчивость к антибиотикам и конъюгативность). ГЬазмнвь! RP4, Е68.^5 и pULB II J подвержика-ются в клетках Ii, rubra в автономном состоянии, а плазнива pASö-121 - в интегрированном состоянии. Плазмивы R63,'tS и ptJLB II? в клеткак термофильного штамма U. tht»rmophilua подверчиваются в интегрированном состоянии.

Установлено, что плазмины КР4, Е6В.^5 -и pAS3-I2l способны передаваться из клеток метанокисляпщих бактерий в Е. coli, при этом плазмилы, интегрированные в хромосом/ донора, способны при переносе в клетки реципиента захватывать фрагменты хромосом ме-танотрофов.

Впервые осуществлена передача хромосомных генов между различными штаммами метанонисляящих бактерий ( li.raüra ) с помощь» коныогативной плазмивы pASa-121 и показано, что при этом происходит гомологичная рекомбинация между хромосомами донора и реципиента.

Создан банк хромосомных генов l:.themopiUlus на векторной мобилизируемой плаз шве рЛГС 51. Обнаружены иве различные последовательности хромосомы Luthermoptuuiio, несущие в своем составе гены, восстанавливающие йеоА фенотип у дефектных по этому гену штаммов е. coli.

Практическая ценность. Созвана коллекция мутантных и содержащих различные плазмивы штаммов метанокиеляящих бактерий. Разработаны метопы, позволяющие проводить генетический анализ и конструирование новых штаммов метанотрофов - продуцентов различных биологически активных пропуктов.

Апробация работы. Материалы диссертации представлялись на Всесоюзной конференции "Биохимия и физиология метклотрофов" (Пу-щино, 1986); УП Съезде У1Ю (Черновцы. 1989)! конференциях молодых

учены*: HS© АН УССР (Киев, 1984-1990; Канев, 1986); 5th international Symposium on Microbial Growth on СI-compounds ( Baren, Betherlands, 1086) \ etil Internatloaal Syopoaium on Microbial Growth on Cl-compounds ( Güttingen, 198$).

Публикация результатов исследования. Материалы диссертационной работы опубликованы в 16 печатных работах*

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит ' из веепения, обзора литературы (I глава), экспериментальной части (4 главы), заключения, выводов и списка литературы (206 источников) иэ них 20 работ отечественных авторов). Работа изложена на 118 страницах машинописи, совершит 18 таблиц и IS рисунков.

• Объекты и методы^исследования. В работе были использованы следующие штаммы метанокисляющих бактерий : Uethylococcus capaulatue £494 и SU, II. thermophilics III IljMethylovariua ucrainlcua 159 и leitf.U.luteua 55В и 98, U. wbitenburyi TT, U. vinelendli 30, liethylovariue ер. 9<s, BM, 72J, I7o, 9, 21, 1102, 126; Kethylo-monae methanlca Sj и U. rubra 15 Ш и 2T, Ы. alba BGS,

U. agile A20j Uethylоslnus trichosporlum OBJb, 0В5Ъ, ОБ4, A59d, It. sporium 5, 12, A20d, Methyloeinus вр. GK6, IIBJ, 5э, 4э, 80в И 100; iäethylocystle parvus OBBP, A2I, 492, M. eehinoidea C493, Metbylocystis sp. B2I из коллекции отвела биологии гаэокисляющих микроорганизмов ИИВ АН УССР; а также елекующие гетеротрофные бактериальные штаммы И плаз МИШ: ' Escherichia coli i J53 ргоЕ22 raet-F6Jt С600 trh-I leuB6 tonAIlacYI supE44. rfbDI thi-I; С600 srlu TnlO recA56} HBIOI leuB6 pro-22 thi-I lacTI recAIJ end-IvrpsH hadß hsdMj KRI (ИВ101) recA+ hiss ;TnI0j АВ246Д argE3 hisG* ХеиБб Д (gtp-proA)62 thl-I thr-1 ara-I4 lacTI tsxJJ galK2 supEW-rac jngl-51 ipsL3I Jcö^SI xyl-5 mtl-I recAI3i JMI09 recAI endAI

- б -

gir96 thl-I hedltl? supE44 relAI ¿(JLacproAB) /F'traJDje proAB laol 2 UI5/t DP7I HfrH laüI22 eda-I relÄ epoTI thl-I» Pseudomonas aeruginosa UL4262 trp bis ilv mat rifRt Pseudomonas putida BS228 «de. Плаэмиш; HP* tat bla кап tia+ lncP-I) B68*45 tet bla kaa tra* lncP-Ij E2 Ыа kau et г aal tra+ lncP-9t ЙЮа Ъ1а кап etr tra+ lncP-5t RSPIOIO str eul incQi pBEJ£2 tet ЪХац pülBIIJ tet Ъ1а кап tra+ incP-Ii pA£8-I2I tet Ъ1а. кап et г eul tta+ InoP-Ij R75I dfx tra+ incP-It рАТСЗ! Ь1а 1доСЦ pDRI453 bla tet 11 recA t pUCrj bla, полученные нами из лаборатории генетики метилотрофных микроорганизмов (ВНИИгенетика, Москва) к лаборатории биологии плаз ми в (ИБФМ АН СССР, Пущино). Генотипы пла-змии паны в соответствии с рекомендация^« Hovlok et al. <1976). bla, tet, kau, str, dfr, eul обозначают устойчивость к ампициллину, тетрациклину, канамицину* стрептомицину, триметапрюу к суфаниламидам соответственно, tra -конъюгетивность., ine-не- -совместимость.

Выращиванн« метанокиеляющих бактерий осуществляли в атмосфере метана и воздуха в жидкой либо агаризованной среде К (Мала-шенко и соавт., 1993). Дня приготовления твердой среды использовали Baoto агар фирмы " Dtfco " (15 г в литре).

Для культивирования гетеротрофные бактерий использовали полноценные питательные среды: мясопептонный бульон (МПБ) и мясопептонный агар (ША). В некоторых случаях применяли ь -бульон, оля приготовления которого использовали BactO триптон и прож-жевой экстракт фирмы "Difco в качестве минимальной с репы использовали срепу НЭ (Миллер, 1976).

Устойчивость метанокисляищих бактерий к соединениям, инги-бирующим ик рост (антибиотикам, формадьвегиву, аминокислотам), опревеляли путем рассева 0,1 мл суспензии, совержащей ю'-IO8

жизнеспособны* клеток. Минимальную концентрацию, поравляюиото рост бактерий (НТК), оценивали по отсутствию роста на чашках, содержащих различные концентрации ингибиторов. Для оценки уровня спонтанного мутагенеза суспензии клеток рассевали на агариэо-ваннуп с реву (10®-10® клеток на чашку), содержащую определенные концентрации антибиотиков или других соединений, ингибирущих рост данного штамма, подсчитывали количество выросших (устойчивых к ингибиторам) колоний; частоту встречаемости з^гтантов определяли как частное при делении количества этих колоний на количество жизнеспособных клеток, определенных в данном объеме суспензии.

Облучение клеток ультрафиолетом проводили лампой БУВ15 в чашках Петри (d«90 мм, по 5 мл суспензии в чашках). Лозу облучения В определяли с помощью дозиметра ДАУ-81, Цугагенное действие ультрафиолетового излучения оценивали как отношение числа полученных мутантов к числу жизнеспособных клеток в единице объема. Обработку НГ провопили в цитрат-фосфатном буфере (0,1 М) и минеральной среде К по Миллеру (Миллер, 1976).

Дня переноса пяаэмип В68.45, RF4, pASS-121, pULBHj из Pa. putida BS22a и E.coll в метан окисляющие бактерии использовали несколько метопов: скрещивание клеток в жилкой среде, на агариэ о ванной срезе, на фильтре. Коню гационный перенос плаз мир проводили на агаризованной или жидкой среде К.

Скрещивание различных штаммов E.coll осуществляли на М1А в несеяективньвс условиях (2-Э ч при 37 °С). Клетки донора и реципиента подращивали во плотности 10 кл/мл, смешивали в соотношении 1:10. Затем клетки спивали 2 мл 0,9 % раствора HaCl к рассевали на серективные среды.

Трансформацию клеток R.coli плазмндной ДНК провопили

кальциевым методом ( Маниатис и соавт., 1984),

Для обнаружения плаэмидной ДНК в клетках метанокисляющих бактерий и крутых плазмид в клетках гетеротрофных бактерий использовали методы Экхарота ( EcKharit, 1978) и Кыоланда ( How-land et el,, 1984). Полупрепаративное выделение плазмид из клеток метанокисляхадих бактерий осуществляли несколькими методами ( Bimbo Lm, Doly, 1979; Kado, Liu, 1981; Кроса и Фалкоу, 1964), а небольших плаз ми в из Б,coll - по метода ( Holmes, Qulg-ley, 19811» В некоторых случаях очистку плазмид проводили цу-тем ультрацентрифугирования в хлористом цезии с бромистым этиди-ем в течение 48 ч при 44000 об/мин в роторе ti 50 на ультрацентрифуге L-7 "Beetottan".

Хромоеомальную ДНК выделяли по методу, описанному Марцур ( Mcjrmur, 1961) и модифицированное нами для метанокиеляющих бактерий. Рестрикцию ДНК провопили, как описано у Маниатис к соавт. (1984).

Реакцию ник-трансляции проводили по Ригби ( Eigby et al., 1977). Перенос ДНК иэ агароэных гелей на нигроцеллюлоэные фильтры проводили согласно Саузерну t Southern, 1975).

Электрофорез клеточных белков в полиакриламидном геле, содержащем 10 % акриламии, 2,7 % бисакриламида, 0,1 % додедалсуль-фата На в 0,375 М трис буфере рН 8,3,провопили по методу, описанному Лэмли { Laoall, 1980).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение спонтанного мутагенеза у метанокиеляющих бактерий.

Дня определения частоты встречаемости спонтанных мутантов наиболее удобным является метод прямого отбора мутантов, устойчивых к какому-либо ингибирующему агенту. Мы исследовали сшнтан-

ную изменчивость следующих признаков: устойчивость к антибиотикам и аминокиелотам.формальдегиду, а также стабильность пигментации, Предварительно были определены минимальные концентрации используем« веществ, подавляющих рост бактерий. Частота встречаемости спонтанных мутантов, устойчивых к антибиотикам и аминокислотам, составляет в основном 10_7-10~®, что сопоставимо с ' таковыми у других грамогрицательных бактерий.

Особый интерес для понимания метаболизма метанокисляющих бактерий представляет получение цутактов с изменениями в генах, продукты которых участвуют в ключевых этапах трансформации метана, например, получение мутантов с повьпенной устойчивостью х экзогенному формальдегиду (промежуточный продукт метабол из наметана) который токсичен для клеток. № установили, что м.идЬга не растет на метане в присутствии 50 мкг формальдегира/мл среды, при этом частота появления формальрегидустойчивых мутантов -10 . Подобные исследования были проведены нами также на другом модельном объекте - И, Здегаордиив. Этот штамм способен расти при содержании формадьпегияа 15 мкг/мя, а при концентрации этого соединения 50 мкг/мл появлялись отдельные устойчивые колонии

(1 о

с частотой

10" '-10*°. Более ста формальдегидустойчивых клонов, котррые были проверены! обладали практически одинаковой устойчивостью и росли на средах, содержащих не более 60 мкг/мя формальдегида* Какие гены изменены у этих мутантов покажут дальнейшие исследования.

Пигментация колоний является весьма удобным фенотипическим признаком при генетических манипуляциях с бактериями. В связи с этим мы исследовали характер изменчивости пигментации колоний у II. гиЪга к и. хле паорЬИиз С розово-красные и коричнево-черные соответственно), окраска которых обусловлена присутствием в клет-

ках этих бактерий каротиноипа к меланина соответственно (Гринберг, 1984; Романовская с соавт., I983¡ Столяр с соавт., 1986).

Предварительно было установлено, что колонии М. rubra, выращенные в метано-воз .дуемой атмосфере, могут иметь различную интенсивность окраски в независимых экспериментах, однако интенсивность окраски колоний на одной чашке всегда одинакова. Аналогичные результаты были получены в экспериментах с другим розово-окрашенным штаммом U. methanlca Sj, При роста М. rubra на среде с метанолом в присутствии ацетилена (ингибитор метанмоноокси-генаэы) наблпдали различную интенсивность окраски отдельных колоний. Однако обнаружить спонтанные б ее пигментные клоны tí »rubra нам не удалось. В дальнейших экспериментах с использованием мутагенов такие мутанты также не были получены, что может быть свидетельством необходимости кароткноидного пигмента для жизнедеятельности Ы.rubra и M.metheualea Sj на метане в связи о особенностями их метаболизма. Возможно также, что каротинондный пигмент участвует в защите клеток от повреждающего действия активных Форм кислорова, как «то показано у бактерий других таксонов (Феофилова, 1974; Krinsky, 1979; Uethewa-Heth, 1984; Si-efe rmenn-Halma, 1967),

Характер изменчивости пигментации колоний М. thennophilua отличается от такового у u.rubra. Интенсивность окраски колоний у íi.thermopítilus варьирует не только от опыта к опыту, но и различна у колоний, выросших на одной чашке. Частота встречаемости беепигментных или секторных колоний в ряде опытов состав-

О

ляла 10" . Беспигментные мутанты были переклонирована и, после тщательной проверки бактериологической чистоты, исследована их стабильность. Оказалось, что большинство из них при последующих пересевах вновь приобретают бурую, а затем коричневую окра-

ску, В результате были отобраны клоны, которые ревертнровали с

с

низкой частотой (менее 10"). Это может свидетельствовать о том, что в данном случае происходят не точковые цутации, а структурные перестройки в локусах, ответственных за синтез меланинов. Можно полагать, что меланин не выполняет жизненно важные функции при росте »тих бактерий в лабораторных условиях.

Таким образом, проведенные нами исследования демонстрируют, что по уровню спонтанной изменчивости метанокисляющие бактерии не отличаются от других прокариот. Исключение составляет только частота появления беспигментных колоний у 11. t hemophilus.

Изучение индуцированного мутагенеза. Ранее другими исследователями было показано, что ряд »утантов (нитроз огуанидин, эгкл-метансульфоиат и метилметансульфонят) не оказывали мутагенного эффекта на метанокисляющие бактерии. Однако известно, что различные виды одного таксона и даже штаммы одного вида могут различаться по ответу на действие мутагенов ( Se<lgwlclc, Goodwin, 1985). В связи с этим мы изучали действие двух мутагенов: прямого действия - нктроэотуанияина (НГ) и непрямого - УФ-излучения, на выживаемость клеток и стабильность некоторых генов у Ы.rubra и U.t hemophilus, которые ранее в этом плане не исследовались. Для сценки мутагенного эффекта в качестве модельных признаков были использованы устойчивость к стрептомицину у М. rubra и устойчивость к формальдегиду у M.therraopiillus, Мбайты М. rubra, устойчивые к стрептомицину, делятся на две группы: устойчивые к 10 мкг/мя (обозначенные etr-l ), устойчивые к 20 мкг/мл и более (обозначенные str-2 ).

Для того чтобы оценить уровень устойчивости к УФ-излучению и выбрать оптимальные дозы для эффективного мутагенеза мы изучали его летальное действие на клетки ti. rubra и H.theraophi-

lus.Ito устойчивости и УФ-излучению исследованные наш бактерии близки к хорошо изученным группам бактерий { антеробактерияы и псевдомонадам) (рис. I).

I02 * fe.

10

10

-2 .

Рис. I. Зависимость выживаемости В. coll 0600 rettJL+ CD, E.<soli C600 мсЛ* (г), 12.rubra (3) ft U. thernophllue (4)

дозы облучения УФ-светом.

Ось абсцисс - воза облучения, ось ординат - % выживших клеток

13,2

•39^6 ' 66',О

Известно, что энтеробактерии, В частности Б.coli, обладают свбтозависимыми ферментными системами, удаляющими повреждения в ДИК, вызванные УФ-об лучением клеток. Это явление получило название фотореактивации ( gushaer, 1907; Rupert ei., 1959). Поэтому мы исследовали влияние видимого света на выживаемость клеток, облученных УФ. Оказалось, что видимый свет практически не влияет на выживаемость облученных УФ клеток Ы. rub га н Ц, thermophilus.

При изучении цттагенного действия У&-1(злучения на клетки uttrubra установлено, что мутагенный эффект проявляется при условии, если облученные клетки помещали в ростовые, но не селективные условия на 48-72 ч. йлоя цутянтов, устойчивых к стрептомицину (как str^T так и str-a .) возрастал в 150 раз при дозе облучения 26

Облучение клеток U.themophilus давало увеличение выхопй формальпбгивреэистентных кутактов в 500 раз при ооэе облучения 50

Изучение действия HT на выживаемость и мутабильность клеток U.rubra показало* что при концентрации НГ ISO мкг/мл (при проверенных нами временных интервалах обработки) выживаемость клеток плавно изменяется в пределах 5-14 %. Такой уровень выживания считается оптимальным при использовании НГ в качестве мутагена (Миллер, 1976). Оптимальное время обработки НГ составляло 30 мин. Установлено, что при выращивании клеток в неселективных' условиях (48-12. ч после обработки НГ) выход etr-l и str-2 мутантов значительно возрастает ( в 1000 раз) по■сравнению с уровнем спонтанного мутагенеза.

Таким образом, исследованные нами штаммы вавали увеличение, выхода мутантов после обработки мутагенами (УФ и НГ) в отличие от результатов, подученных рядом авторов на других штаммах метанокиеляющих бактерий ( Haiwood et al., 1972; »tíllame et al., 1983), что свидетельствует о наличии у исследованных нами бактерий систем, вызывающих появление и фиксацию ошибок во время репликации хромоеомаль^ой ДНК. Можно предположить, что эти штаммы обладает системами SOS-мутагенеза, сходными с аналогичными системами Б.coli.

Поиск систем генетического обмена для метанокиеляющих бак-терн^. Дня выявления и изоляции плазмид из метанокиеляющих бактерий мы использовали различные методы, описанные в следующих работах ( Bim>olm, Doly, 1979; Eckhardt, 1978; Kado, Liu,1978; Hewland et al., 1984; Кроса и валкоу, 1984). Установлено, что для детекции и выделения плаз ми ц метанокиеляющих бактерий- более пригодны методы, описанные Ньвдэнцом (модифицированный метод Экхардта ( Eckhardt, 1978) и Кроса я йалкоу. Особенность первого состоит в том, что клетки лизируются непосредственно в лунке горизонтального агарозного геля, где затем и проводят электрофоре-

тическое разделение ДНК лизированных клеток. Другой метод оптимален для препаративного выделения плаэмидоых ДШ метанокисляющих бактерий.

Из исследованных нами 31 штамма (16 видов из 5 родов) 13 штаммов метанокисляющих бактерий содержат автономно реплицирующиеся плаэмиды различной величины - от 6 до 210 т.п.о- (тысяч пар оснований). Более того, у некоторых из штаммов было обнаружено по 4-5 плазмип относительно большого размера (более 30 т.п.о.). Сопоставив данные (в частности,данные по устойчивости к различным антибиотикам), представленные в ряде работ (Романовская с соавт., 1984; Ь1<Шгот, «Гора!;, 1984), а также собственные результаты, нам не удалось обнаружить природные плазмиды метанокисляющих бактерий с удобными для генетического анализа фе-нотипическими маркерами. Поэтому мы изучали возможность переноса и экспрессии плазмив Р1 группы несовместимости в клетках метанотрсфов.

Эффективность различных методов коньюгационного переноса была изучена при скрещивании Ы.гиЪга н Р.ри«1йа, несущей плазмиду П68.45.Скрещивания проводили в различных условиях: в жидкой среде, на поверхности агара в селективных и неселективных условиях, варьировали время экспозиции. Оказалось, что в жидкой среде перенос плаэмиды Н68.45 не происходит.. Частота переноса плазмиды Еба,45 при скрещивании на агаризовакной среде (скрещивание в пятне) с канамицином 8 качестве селективного фактора не превышала КГ" на реципиентную клетку, тогда как частота переноса на среде без антибиотика (т.е. в неселективных

условиях с последующим отбором трансконъюгантов на среде с кана--5

мицином) постигала 3*10 на реципиентную клетку. Коньюгатнвный перенос был наиболее эффективен, если скрещивание проводили на

нитроцеллолозном фильтре в метано-воэвуюной атмосфере. Частота

—3 -3

переноса в »том случае составляла 10 - 5*10" в пересчете на клетку реципиента. Подавляющее большинство трансконыогантов оказались чувствительными к 50 мкг тетрациклина/мл, но устойчивыми к ампициллину и канамицину при концентрации юс в среде 300 мкг/мл и 25 мкл/мя соответственно (минимальные концентрации этих антибиотиков, подавляющие рост U.rubra составляют 30, 2 и I мкг/мл соответственно).

Овин из полученных нами устойчивы* к 50 мкг тетрациклина/'мл клонов трансконыогантов (обозначенный »562 ) был исследован более оетально. Он оказался устойчивым к 100 мкг/мл тетрациклина^ 500 мкг/мл ампициллина и 75 мкг/мл канамицина. При электрофорезе в агарозном геле лизата ы. rubra RS62 плаэмида либо не определялась, либо проявлялась на електрофореграммах очень слабо. В то же время у остальных полученных трансконьюгантов четко была определена плазмииа с молекулярным весом, равным молекулярному весу плаэмиды R68.45. Ознако, когда М,rubra HJ62 была использована в качестве оонора при скрещивании его с двумя штаммами Е. coll - J53(K£P ю 10) и НВ 101, был получен ряп клонов Б.coll, которые приобрели все три маркерные устойчивости плазмилы

(частота переноса 1СГ6 на клетку дгонора). На электрофо-реграммах в этих клонах наблюяаяи четкую полосу плазмцвы с молекулярной массой равной молекулярной массе плаэмиды й66.45, что свидетельствует о наличии плаэмиды R68.45 в штамме Ы.rubra R362. Возможно, в клетках штамма KJ62 плазшда Ебв.'+Э интегрирована в тсромосои^.

Мы изучили также возможность переноса других 1псР-1 плазмид (RP4, PULBIIJ и PAS8-I2I из E.ooll в u.iubra. Частота переноса этих плаэмил при скрещиваниях в пятне на поверхности агара

С А ту

составляет 10" , 10 и 10" соответственно. Оказалось, что в клетках и.тоЬга проявляются гены устойчивости к ампициллину и канамицину, но не тетрациклину. Плазмиды ЗР* и pULBll? стабильно наследуются и поддерживаются в автономном состоянии (по ванным электрофоретического анализа). Плаэмида pASa-121, состоящая из ввух репликонов (Col EI и RP4, в которой ген trfA ин-активирован вставкой тракспозона Ти 7), не способна реплицироваться в клетках М.rubra и, очевидно, встраивается в хромосому (плазиипа не виона на электрофореграммах). В клетках Ы. rubra (pAfía-121 ) экспрессируется ген устойчивости к стрептомицину, вносящий в состав транспоэона Тп 7 (рост клеток не ингибируется 100 мкг/мл стрептомицина).

Далее была исследована способность rutas ииды pAS8-l2I переносить хромосомальные гены при скрещиваниях метанотрофов.Для этого нами были сконструированы штаммы Ы.rubra 117 rlf str-2 и ».rubra 125 nal (pASS-121), которые использовались при скрещивании на агаризованной срепе в метано-воздушной атмосфере. В качестве контроля использовали штамм И, rubra, устойггавый к налив иксе вой кислоте, но не несущей плазмияу pASS-121, Колонии, устойчивые к рифвмпицину и палкдиксовой кислоте, появляются с-часто-той Ю по отношению к клеткам реципиента. Иэ проанализированных нами 100 штаммов трансконыегантов ни один не был устойчив к канамицину, что свидетельствует об отсутствии репликона BP'». Таким образом, можно сделать вывод, что плазмила pAS8~l2l пригодна для осуществления переноса хромоеомальныт генов и проведения генетического анализа И.rubra и, что в клетках И. rubra осуществляется гомологическая рекомбинация.

При исследовании возможности переноса плазмивы йба.45 из p.putida & и,thermophiius установлено, что плазмива перепава-

лась реципиенту с частотой 1(Г7 - 1<Гб, при атом экс пресс провались гены устойчивости к ампициллину (100 мкг/мл) и канамицину (25 мкгУмл). Однако при электрофорезе лизатов нескольких транс-конъюгантов плаэмипные полосы не были обнаружены. В то же время при скрещивании овного из полученных клоков ( R300J) с E.coli наблюдали передачу трех плаз ми иных маркеров с частотой Ю-7 на клетку донора. Очевидно, в клетках tä.thennophilus плаэмида Й68.45 не поDверживается в автоношом состоянии, а интегрируется в хромосому.

Следующей задачей было компяементировать некоторые ауксотрсф-" ные мутации в E.coll J¡j5 и HBI0I путем коныогационной переоачи прайм-плаз мир из метанотрофов, содержащих различные плаэмидгы 1нс р—I группы. При использовании штаммов М.гчЪгасодержащих плазмиду нр4 (или R68.) в автонотом состоянии, положительные результаты не были получены (частота возможного появления трансконъюгантов менее 10"®), Поскольку плаэмида риШИЗ образует прайм-плазмиоы с большей эффективностью, чем НР4 я R6B.45 (SdLOOüeJaae, Touseaiat et al., 1983; Al-Taho, ЯГэгпег, 1967; Tsygankov et al., 1990), мы изучили возможность комплементации ауксотрофных маркеров pro и met в штамме J5J и leu в и тате HBI0I путем конъюгационной передачи прайм-Плазмип иэ 11» rubra (püLBllj ). Комплементацию ауксотрофных маркеров в штамме ¿53 нам удалось осуществить. Колонии, не нуждающиеся в прелине или метионине, появлялись с частотой 10"® на реципиентную клетку, что на порядок больше частоты встречаемости спонтанных ревертан-тов. Однако wj не смогли компяементировать маркер leu в штамме HBI0I. При скрещивании И.тмЪга а>бг (содержит плазмиду R60.45 в интегрированном состоянии) с Ei.ooli J53 колонии трансконью-гантов, не нуждающиеся в пролике или метионине, появлялись с час-

8 7

тогой Х(Г - 10" в пересчете на клетку реципиента. Опин из полученных трансконъюгантов не нуждался в пролкне и метионине.

Была сделана,попытка комплементировать ауксотрофные чутации в E.coli АВ2463 pro, Ь1в, are, thr, leu путем конъпгаци-онного переноса прайм-плазмид из li.thermophilus RJOOJ, направляемого интегрированной в хромосому плаз миной Е68.45. Однако такие эксконъюганты не были получены. В то же время при рестрик-цкшном анализе плазмня, выделенных из 20 штаммов Е. coll (которые получили эту плазмилу из метан окис лящего штамма R3003) бшо обнаружено, что практически все они несут в своем составе дополнительные сегменты (20 т.п.о.), которые, очевидно, являются участками хромосомы метанокисляюцего штамма. Можно предположить, что адазмяда Д&8.А-5 в штамме U.tbenaopMlus встроена в хромосому далеко от генов, ответственных за биосинтез аминокислот, и при образовании В' эти гены не захватывались.

Таким образом, показана принципиальная возможность использования плазмив ine P-I группы в качестве инструмента для комплемента циокного и генетического анализа Исследованных нами штаммов K.thermopMlus и М.rubra.

Клонирование и характеристика тесА-подобного гена M.thewio-philus. последние говы появился целый ряд сообщений о клонировании reoА -подобных генов иэ различных бактерий ( Better,Helia ski, 1983; Keener et al., 1984; Goldberg, Uekelanoe, 1986; Gojoelski et al., 1990; ilarphy et; al.,1990 и др.). Все эти гены функционировали в в.coil, компенсируя в большей или меньшей степени функции собственного дефектного Recjt белка. Данные этих исследований позволяют предположить, что, во-первых, гесА -подобные гены даогих бактерий очень сходны и, во-вторых, сходно организованы и системы sos ответа этих бактерий. Исходя из этого«

-Хеками была поставлена задача клонировать и изучить свойства гена ы. ttwrmophilus.

Первым этапом этой работы было сознание банка генов Ы. tbennopixllae в Б.coll red 56 ( Е751)-Д»я этого была использована векторная мобилизуемая плазмида с широким кругом бактериальных хозяев pATGjI, имеющей уникальный сайт узнавания рестрикта-эы Ваш HI ( Chystoeer<iov, Taygankov, 1986), Вставка любой после и овательн ости в это место приводит к экспрессии гена устойчиво сти к стрептомицину.

Хромоеомальную ДНК M.theimophilus поввергали частичному гидролизу рестриктаэой Ват Ш затем центрифугировали в градиенте плотности сахарозы и фракционировали. Фрагмента эгроиосомальной ДНК 11,- theimopbilue и ДНК плаз милы PAICJI, гидролиз о ванные ферментом вал hi, спивали ДНК дигаэой и этой смесь» трансформировали клетки Б.coli* Отбор вели на среде, содержащей стрептомицин и ампициллин (50 мкг/мл). Было отобрано 2000 клонов трансфер-мантов. 70 % трансформантов содержали гибридные плазмиды. Таким образом, б«* сконструирован банк генов И.themophilus,

№ банка генов ll.thernopMlus было отобрано четыре клона (ЗМ, 6И, «I и иг ) с повышенной устойчивостью к митомицину С (0„5 мкг/мл) и УФ-облучению. Плазмилы, содержащиеся в них, обозначены как pMT3I, pffflSI, pirnf4I к pllTU42 соответственно. Определен размер вставок в плазмиаах из вышеуказанных клонов (рис. 2). Показано, что плаз ми иы этих клонов несут дополнительные Bam hi фрагменты ( рШЧЮ2 - 2,5 т.п.о., а гЫПМИ, ркТ31 и рИГ61 - 3 т.п.о.причем последние три, суля по блот-гибриви-зации ДНК-ДЬК, идентичны (при использовании в качестве зонпа плазм* лы ptiTU4l было показано, что она гибрипиэуется с рШЭ1 и рМТ61, но не о pimwä).

I гзЧ 5

Рис. Z. Электрофореграмма плаэмидных ДНК (А) и радиоавтограф блот-гибридизации эти* ДНК с меченой ДНК плазмиды ptMTJ4I - СБ), I - ДНК фага Л , гидролиз ованная ферментом Hind lilt 2-5 - ДШ плаамид plfTU42,FirTO4l рМТЗХ, ptfT&I, гидролизованные ферментом Ваш ЯГ

Проведена количественная оценка устойчивости к У Ф-оСлучению этих клонов, построены кривые выживаемости (рис. 3), Показано, что клоны б, coll с600 Вес а",несущие плаэмиды piiTU4i, pUTU42, рМГ31 и рШЬ! из «. the rraophilu а, значительно уступают, штамцу Е. colt С600 Вес д+ в устойчивости к УФ-облучение, но превосходит штамм Е,coli С600 Reo А"* И E.coli KBIOt Rfta А~ ПО ЭТОМУ признаку. При атом клетки 4X1 более устойчивы, чем 412 (плаз-

МИД& pUTU42 ).

Чтобы доказать наличие в пхазмидах pMTU4l, рОТЭ1 н

рМТ61 ге сА-поцобного гена hi Кв. t ho ппо р h 1.1. и д трансформировал и штаьм HEIOI K.eoit с дефектным гееА геном, отбор вели на среде с ампициллином при 37 °С. Отобранные клоны проверяли на устойчивость к УФ и мнтомицину С полуколичественным методом. Оказалось, что

Рис. 3. Зависимость выживаемости различных штамюв Е. coli 0600 от дозы облучения УФ-светом: I - reo А~ (рИСЛ); Z - recA~CS?5X)i

3 - recA" (pUTtr«, B75I)(

4 - recA" (ркЗОТг, B75I)• Ось абсцисс - поза облучения! ось ординат - % выживших клеток

13,2 39,6 66,0 Дщ/м2

почти все клоны, получившие плаэмивы рЮТ41, PMT3I и рМТ61, обладают повышенной устойчивостью к УФ к митомицину С. Трансформанты, получившие плаэмиду ismita, практически не отличались по чувствительности к ДНК повреждающим факторам от штаммов E.coll с дефектным геном ре ей.В этих трансформантах была обнаружена плазмива (обозначенная ¥Ш№ь2т<1 ) размером 5,5 т.п.о. (исходная lamita содержала 14 т.п.о.). При помощи трех реетриктаз Ваш hi, Fetl и Pvuli была построена физическая карта зтой плазмиш. Учитывая разницу размеров плазмид рцти^г и рютмгта , а также расположение сайтов рестрикции в исховном векторе и его минипро-извоиной, можно свелать вывод, что при попадании плазмивы j рЫЮТ2 в клетки E.coU HBI0I в ней произошли крупные перестройки» в результате которых большая часть вектора pATCjl и вставка леле-тировались, Мы предположили, что в клетках штамма HBIOi при 37 экспрессия пказмквны* генов рыто ад привовит к вестабилйзации

плазмины. Действительно, оказалось, что при отборе трансформантов с плаэмиооП iüTU42 при 30 °С мы получили клоны с повышенной устойчивостью к УФ и митомицину С. Эти клоны не были способны расти при 37 и 42 °с. Можно предположить, что гены K.thaimophi-lus, содержащиеся во вставке pUTU42, активируются при повышении температуры, и Их продукты легальны для клетки E.coli, либо приводят к структурной нестабильности плазмиды.

Проведена блот-гибрипизация по Сауэерну плазмив jCTU^l и pirru^ с плаз ми вой pjjRl^j, в состав которой входят аварах фрагмента хромосомы E.coli С гесА геном и вектор pBRj22 (So-acat, Kupp, 1979). ДНК pDHl^jj, гидролиз о ванную ферментом patl, ДНК плаэмид pUTtKH Ир1ЕПТ4г И хромосомы К.trhemophilus, ГИД-ролизованные ферментом Баш щ, электрофоретическк разделили в агароэном Реле, перенесли на два нитроцкллюлоэных фильтра и гиб-ридизовали с меченными плазмядами piCTü4i и ркти42. Оказалось, что . клонированный Baa HI фрагмент из плазмиды рати« хорошо гибридизуется с фрагментами 6.8 и 1.8 т.п.о. плаэмиоы pDRI't55, несущими re о А ген E.coli. В то время как клонированный Bas HI фрагмент из плазмиды FMTU42 не гибридизуется с этими фрагментами. Вероятно, пяазмида ригши несет последовательность нуклео-тидов очень сходную с последовательностью гена ro«í. Е. coli.

Мы изучили эффективность цутагенеэа, вызванного разными дозами УФ, в штаммах HBIOI, Ш (HBIOI гееА*) и HBI0I с плазмиоами р1ГГ041 и ptiTUtó. Как следует из ванных, представленных в табл.1, штаммы с рекомбинантными плаз ми вами pKTtMl и jMTUtó превосхоплт по уровню мутагенного эффекта штамм НВГ01 в 100 раз и 10 раз соответственно, а при возе облучения 33 Дж/ь^ штамм H3I0I ( pi ЛОМ ) превосходит штамм RI о нормальным геном гесА.

Таким образом, ш клонировали и и о ентифицировали две различные области хромосомы [l.tberraopMlus, содержащие гены, босс тана в-

- 22 -

дивающио ряо функций гесА гена E.coli. гесА-подобные гены из этих, двух последовательностей в клетках гетерологичного хозяина проявляют свои свойства с различной степенью эффективности.

Таблица I

Влияние дозы УФ-облучения на появление рифампицинреэистентных мутантов в пересчете на 10 жизнеспособных клеток

Штамм, генотип, Доза УФ

плазмиды 0 13 20 2665 33 40

HBIOI recAlJ 1,5 2 1.6 3 н.о. 3

HBIOI CpMTU«) 3 20 62 87 370 65

HBIOI (ptlTU42) 4 10 . 33 40 44 21

RI re с А* . 37 54 66 71 128 151

Примечание, н.о. - не определяли. ■

выводи

1. Частота появления спонтанных мутантов метанокисляющюс бактерий сходна с таковой у других прокариот. Ультрафиолетовое излучение и нитрозогуанидин оказывают мутагенное действие на Uethylomoaas rubra, и Methjlococcus thermophllue I повышают частоту появления мутантов X Создана коллекция нутантных штаммов метанокисляющих бактерий.

2. Ряд штаммов метанотрофных бактерий.содержат плазмиды с молекулярной массой от 6 до 150 т.п.о., их функции неизвестны.

3. Конъсгативные плазмиды с широким кругом бактериальных хозяев способны автономно реплицироваться в Мethylomonas rubra ИЛИ интегрироваться В хромосому Uethylococcus thennophilus. Маркерные гены плазмид экспрессируются. в клетках обоих видов ме-

танок ислящих бактерий. Пяаэмипы Й68.45, paS3-I2I и pULBII3 могут быть использованы в качестве инструмента для генетического анализа метанокисляющих бактерий.

4. В клетках метанокисляющих бактерий ( Uethylononas rubra) при конъюгативном переносе хромосомных генов осуществляется гомологичная рекомбинация.

5. Созван банк генов Uethylococcue theraopùllus. Установлено, что гены метанокисляющих бактерий способны экспрессирова-ться в клетках Е. coll. Uethylococcue tbermophilue имеет два

геск-подобных гена, способных функционировать в клетках E.coll,

СПИСОК РАБОТ, ОПУБШЮВАНШХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Романовская В.А., Столяр С.М., Пинчук Г.Э. Плаэмиды бактерий, облигатно и факультативно использующих газообразные углеводороды il Ншфобиол. журн. - 1904. - Т.46, * 5. - С, 70-^Й,

2. Романовская В.А., Столяр С.М., Будкова E.H.. Шатохнна Э.С. Изучение плазмид бактерий, усваивающих газообразные углеводороды // Всесоюз. конф. "Новые направления биотехнологии". (Цущино, 1984) Î Тез. докл. - С. 19.

3. Столяр С.М. Конъюгационный перенос плаз мины К68.Ч-5 в облига-тную метанокисдяющую бактерию iietbylomonaa rubra jj Физиология и биохимия метилотрофных микроорганизмов. - Киев : СОПС АН УССР, 1986. - С. 16-22.

4. Столяр С.М., Дверкиев A.A., Щурова З.П. Пигменты метанокисляющих микроорганизмов // Физиология, генетика и биохимия метилотрофных микроорганизмов. - Киев : СОПС АН УССР, 1986, -

С. 139-145.

5. Романовская В.А., Столяр С.М. Плаэмиды метанокисляющих бакте-

- 24 -

рий // Скмпоз. соц.стран по биотехнологии (Болгария.Варна, 1966) : Тез. покл. - С. 33.

6. Grinbere т.A., Stolyar S.M. Pigments of »ethane-oxidizing bacteria // Abstr. 5th Int. Symp, on tlieroblal Growth on CI compounds (11-16 August,I9S6) Haren, Netherlands /Eds -J.A. Puine, Е.Б. van Verseveld. - AasterdaB i Free Univ. Press. - 1936. - P. 102.

7. Столяр C.M., Ропталовскал В,А. Генетика метан окисляющих бактерия // У съезд ВОГиС : Тез. вокл. - М., 1987. - С. 69.

8. Соколов И.Г., Столяр С.М., Криштаб Т.П., Пинчук Г.Э. Рольме-танмсноэксигенаэы при ассимиляции метанола метанокисляющими

бактериями П Микробиол. журн. - 1989. - Т.51.НЙ,- С.38-46.

9. Соколов И.Г., Столяр С.М., Криштаб Т.П., Кушнир Е.В. Роль метанмонооксигеназы при росте метанокисляющих бактерий на метаноле // УП съеэв УМО : Тез. док. - Киев : Наук.вумка,1989.-Ч. I. - С. 87-88.

10. Столяр С.М., Буркова Е.Н., Шатохина Э.С,, Пол ев о Da Б.В. Пере-' нос генов метанокисляющих бактерий в Escherichia coll //

УП съезд УМО : Тез.вокл. - Киев : Наук, думка,1989.-4,2.-0.32. H.Stolyar S.H., Romenovslcaya V.A., Taygankov Y,D. Cloning of Uethylococeus thermcphilus recA"nke gene in E.coli // Abs. 6th Int. Symp. on Microbial Growth on Cl-compouads. - Gottingen (FRG), I9»9. - P. 536. I2-Stolyar S.M., Budkova Б.Н., Komanevskaya V.A. Conjugation

mediated by plasmid pA£6-I2I In Methylococeus rubra//Ibid.P. J25

13.!lalashmko i,It., Stolyar S.H., Romanovskада V.A. Study of pla-snid R60.45 cotijugative 'ti'Wtsfer in mefchajfie—oxidizing bacterid // Ibid. - p. 335.

14.Романовская B.A., Столяр C.M., Маламенко С.P. Выявление плаз-

мин метанокислящих бактерий У/ Микробиод. журн, - 1991. -Т. 53,» I. - С. 34-38. " 16.Романовская 6.А., Столяр С.М., Бупкоьа E.H., Пинчук Г.Э., Шатохина д.С., Налашенко Ю. Р. Генетическая изменчивость метано кислящих бактерий // Микробнол. журн, - 199I. - Т.53, * I. - С. 38-44. 16,Романовская В.Д., Столяр С.М.* Мадашенко Ю.Р. Систематика . метилотрофных бактерий. - Киев : Наук.румка, 1991. - 440 с.

- ■ ■ ■ - N • — 'V , V '. " - ' ■

Пожпис&но m печать 6.09.91 г. Формат бОжд* / 16 Вунага писчая , Тсл.печ.п. 1.0. Тираж 100 та. Эак.И 1475

Отпечатано ИГОП КФ "Шюжиаапроект" г.Кие» ,Свкс»гмскою,1.