Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование генов фотосинтеза цианобактерии Synechocystis 6803

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Клонирование генов фотосинтеза цианобактерии Synechocystis 6803"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ им.¡Г.И. ВАВИЛОВА

На правах рукописи

УДК: 532.232.7:581.132:577.1X3:679.254

СТАНБЕКОВА ГУЛЬШАН ЭСЕНБЕКОВНА

КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНОВ ФОТОСИНТЕЗА ЩАНОБАКТЕРШ ЗУНКСН0СГ^Т1Б 6803

Автореферат диссертации на соисканиэ ученой степени кандидата биологических. наук

(03.00.15 - Генетика)

Москва - 1991

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.

НАУЧНЫЙ РУКОВОдаЕЯЬ:

доктор биологических наук, профессор, член-корр. АН СССР

Шестеков C.B.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук Пирузян Э.С. доктор биологических наук ~ Тарасов В.А.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Центр "Еиоинженерия".

м »,

Защита состоится — -1992 г. в-часо

на заседании специализированного Ученого совета ДО02.49.01 пр Института общей гонегики им. Н.И. Вавилова АН СС!СР (117802 ГСП-1, Москва, В-333, ул. Губкина, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.И.Вавилова АН СССР.

п п

Автореферат разослан - «--19Эг г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических паук

Г.Н.Полухина

ВВЕДЕНИЕ

^туельность_тбш_исслваовагаял Изучение молекулярных механизмов и генетического контроля фотосинтеза имоот ваиюе значение для понимания организации. функционирования и эволюции аппарата фотосинтеза, для создания модолытх фотосинтезирукиугх систем и усовершенствования фотосинтотического аппарата растений с цолью повышего1я эффективности использования солнечной энергии. Удобной моделью для генетического изучения фотосинтеза являются цианобактерии, у которых процесс фотосинтеза, как и у высших растений и водорослей, сопровождается выделением кислорода. Кислородный тип фотосинтеза осуществляется с участием двух фотосистем (ФС I и ФС П), представленных в виде встроенных в тилакоидную мембрану хлорофилл-белковых комплексов.' В последние годы чрезвычайно возрос интерес к фотогетеротрофной цианобактерии ЗупесЪосуаМа вр. рсс 6803, у которой открыта система генетической трансформации [сг1вог-1вуа, БЪваъакоу, 19623 г разработаны методы селекции ФС-мутантов [Аомег оъ о1. 1984; Шестаков И др., 1988). У БупесЬосуеЫз ВВОЗ Клонирован ряд генов фотосинтеза на основе использования генов растений в качестве гибридизациожшх зондов. С ломощью сайт-напровлешюго мутагенеза некоторых гвпов с их последующим возвращением в гейш зуявсьосуаыа 6803 были выяснены зажше особенности строе-ййй й функционирования 01 и 02 белков реакционного центра ФС п еЬ а!., 1987; Ракгаа! ег а!., 1987]. Однако Такой Путь молокулярно-генетического анализа применим для изучения лить укэ Известных белков. Альтернативней подход связан с использо-ЬЬййеМ фотосинтетических мутантов <ФС-мутантов), полученных Путем иейаправлошюго мутагенеза. Трансформируя их к Фотоавто-■фофноста фрагментами ДНК из геномного банка дикого типа мокю

- г -

s

пидоллп. pMiioi) H'UiünnuriiMi) гони, oTüoTCTDoiuiuo nti cmiToo mu: структур!!)!* И рОГуЛИТСфННХ KOMIIOIIOIITOD шпирата фотооиитооо Клонировпншю ципноОпкториплышо Г01111 могут CUTI» В0ТОМ ионоль

ООВШШ II КИЧООТПО ГИбрИДИЗШИОПШХ ОСШДОП ДЛЯ ПОИСКИ НОВЫХ ГО'

1101) ФОТООШ!ТГ"Ч) II хлорогшютноП и /шорной ДНК роотоний.

I¡о л ьи <; с л o/(n у л )| ц jj пшишчоотсл и клонироигшии гшкш фото-СИНТОГЮ ИМ OOIIÜHO HOnOJII.HODUmui ФС-МУТ011Т0П ционооактории Вупе< chocyntln 0003 Ü К/1ЧПОТПО рШ1ШШ011Т1ШХ КЛОТОК ПрИ ТрШЮфОрМП

ции• И зндпчи дшшоП риОоти входило;

1. Ридолонио ДОфОКТ1ШХ 1)0 фОТОСИНТиВУ мутантов Bynechooyetli СООП, НООГЮОООПКХ К фОТОПНТОТрОфИОМу ]ЮСТУ.

Й.ВНДОЛОИИО ИП ГЕНОМНОГО 0Ш1КП IBTOMMO ДИКОГО ТИПО (1рОГМ911ТО|

ЛИК, тршкффкирущш; ФС-мутонтм н фотоаитотрофиости. 3.Идентификация но шюнировшшмн фрагмонтих ДИК гоноо фотооин ТОЭП, ПОИСК СроДИ НИХ 1ЮШХ ГОНОВ, НО ИМООДИХ гомологии о из В00Т1ШМИ Г0Ш1МЙ 'pun'rojmlt и цишгаОпкторий.

Ufiy^l'S'JJJoríDL'Q-b^^líPliSSiSSO^'JíloQIb. Создано коллокци; МУТОНТО» циаиоооктррии SynochoeVatiо 6603, ПООПОСОбНИХ К фОТО

оптотрофному росту. Мутонти такого тюго могут бить испольоопшп для Риохимичоских и биофизических ИССЛОДОВОНМЙ структуры I функции фотосинтетичоского огшорото, ДЛЯ КЛ01Шр0ВаНИЯ ГО но Фотасинтозп.

С помощью гипутичоокой трансформации клоток ФС-мутоитов и

ОИбЛИОТОКИ ГОПОП L'y ni; jhooyoLl в 0003 Г-ЦДОЛОНЫ фрпГМОИТЦ ДНК

йооотанайливв'щиб фотогинтотичоокуи 'функцию ири аводошш «ЛОТКИ ¡MytDHTÜliX итоммоп.

С йсПРльоОйанпэм в качостпо гибридизационних зондов ни

BOOTHUX ГОНОВ фОТООИНТООО 110 ВИДОЛОШШХ <ХрПГМ1)',ГГПХ ДИК мдопти фициронони СЛОДУЩИО ГОШ! фОТОСИСТОМИ и: pnbDl , ряЬС, рпЬЕК

Уотмюалошю ггоиродм мутационных поароадониП » атих го них путем их сокпониропания лоаполит получить ножную информацию о структурно-функционально!! организации болкон 10 п. Пай,дон фраГМОИТ цивнобактвриальной ДИК, 110 ИМиМЦИП ГОМОЛиГИИ О рядом ИиПвСТННХ ГО НОН фОТОШШТОНП. Онродолониа нуклоатлиоя ИСнШДОППГОЛЫНЮТИ

witiBvuio в ном откритую рампу трансляции ра-лмором и .420 ашна. кислотных остатка. Поолодонатолигашч, оккаан по имиот гомологии о иаьиотними к 1901 году гонами <a>i\iiauiio (¿ипь шмнанк пата ЦА!>к ). Иаучонио отого гони можот дать информации о попом ком -попоит« сишарита окоигошюго фотооилтоаа у цшшобакторий и сюу-щоошш. поиок аналогичного гона у растений, ¿Щ}<}08Цаз_Ё0бот1Ц Матириали диооертащш доложи ни но оооеданинх , кофодри РЙНОТИКИ и оолоктш ПИОЛОГИЧОСКОГО '¡ЧПСУЛЬТОТП МГУ и на 20 конфэрашш молодих учоних МГУ, Моокнп, 1909. Отруи^ура^дуооаи'ацийл Дносортлцшт состоит иа введения, оОоорл' литературы, описании материален и мотодоа иоододонаиия, иплсдае-шя результатов и их обсуждения, пшошчония, тшодон и описка цитируемой лнторатури. Робота изложена ли К0отр,, содержит рисунков итаблиц, Список литоратури -ключаот уп наименований.

jatcl'lla/lljj _м12т0д1)

ß работе иоцольпороли йакториологичоски чистую культуру ДИКОГО '¿'Ulla ByriaohQofiyatla ер, рсс епоз И а «ОЛЛОКЦИИ Паоторон-окого института (франция), а такко штаммы к. со и iiiuoi (р~ ha<)20 raqAia era-14 p»'oA2 laoYl в* 1X2 xyl-6 mtl-1 mii<K44

V) [OoHviir.Baolmf.rin, 1070} И JtUOO (rüoAl enJAl uvrUti tl.l" hadHjy аирЕ44г«Ш K" V/tрьМйргрАП Jaoi4At1»6/) [Ooue* , H'ir-

Соликцио оиоиташшх и индуцироьашшх нитроаогуаиидином

ФС-мутаптов проводили с использованием ингибиторов фотосинтеза: нитрофуралтошш ("51еть" .250 юкм) и хлорпромазина (••51еша",500 шкм) по описанной ранео методике (Шестаков и др., 1988].

ВЦДОЛОНИе ТаЛЫГОГО пропорота ДНК ИЗ КЛвТОК ЗупесЬосуаШе 6003 проводили ПО методу [аг1еог1еУа. ВЬеагакоУ, 1962]. Для скрининга Спина гонол использовали метод "¡^"-трансформации

[Пхв1гки1пв, Воцогпс), 1008].

Видолопио плозмидной ДНК из е. сон, обработку рострикта-оами, ДНК-лигпзой и щелочной фосфатаэоЯ, элоктрофоратнчоский анализ и элюцию фрагментов Д!1К из агарогц, перенос ДНК из ага-розшя гелей л и нитроцоллшозшв фил*три, уечоццв, ц^ацедатов ДЬПС т V: ;го методом "рассеянного" ПриЙШфОВШШЯ, Слот-гибридазоцию наводили по осщопринятым методикам сМаниатис и др., 1984]. Фврмонти получены из НПО -Фору,опт- (Вильнюс).

В экспериментах по блот-гибрвдизации в качестве гиОрвдиза-ционшх зондов использовали ¡июш1ромшше гены цианобактерий и растений: раЬА1. из £упос>юсуег1в 6714 [АЛап! еЬ а1., 1989], рвЬВ СЧегта&а et «1., 1997], раЪШС [СЫвЬо1ш, Н1Шшпа, 1980], раЬЕК [Ракгае! еЬ о1. , 1908] рвЬв [5Ье1пти11ог, Вовогай. 1969], рвЬО [.ГЫ1Ьг1ск, гШпокаа, 1909] И раЬК ГгЬапд ох. а1., 1990] ИЗ ЗупесЬосувЪХв евОЗ, роЫ ИЗ ржи [КОЛОСОВ, 1990], рваА, реаВ 51 р£3£.С ИЗ Сщптус1о1по«аа гехгЛ&гсШ СКиок о! аХ. , 1987], petB И ресО ИЗ шпината СИое^о« ^ й1., 1938].

Поршчную нуклоотидуую структуру определяли методом диде-оокситормишрования [Запцег, 1977] в составе врктора тз трЮ.

Концентрацию 0%п орвдо определяли с поедьд электрода Кларка на полярографе хр-7 при температуре 25°С;.

Порвмо1шую флуоросцонцию хлорофилла измеряли,. п$>р помощи двухлучового флуоримотра по методу [Лядский и др>..,„ ща?.].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ I. МУТАНТЫ Syneohocyatla 6503,НЕСПОСООНЫЕ К ФОТОАВТОТРОЖМУ РОСТУ.

1. Получение <$с-мутантов Synechocyatlg ввоз.

Метода селекции ФС-мутантов Synachocyatis 6803 с использованием ингибиторов фотосинтеза в качество солоктиених. агвнтоз ÖUJUI ошюанц В paöOTO Астье С соавторами CAstier at al., 1984J Для обогащения популяции цизнобакториольных клеток ОС-мутантами была применена обработка илгибиторзга фотосинтетического перекоса электронов дауроном и п-хлормеркурибензоатом.

В настоящей работе били использованы другие селективные агенты - хдорпрсмазин и нитрофурантогаь которые ¡шгибируют фо.то-синтетическую цепь электронов на уровне комплекса фотолиза ио0 [Barr, Crane, 1982; Barr et al., 1932; Sherman, Guikema, 1902]. В трех независимых акспериментах было отобрано 13 ФС-мутантов Synachocystle 6803, НеСПОСОбНЫХ К фотоавтотрофному росту.

В первой серии опытов после проведения мутагенеза с помощью нитрозогуашщша клетки инкубировали с хлорпромазином. Из ■152 клонов, выросших на плотной среде с 1% глюкозой, было отобрано 2 клона, утративши-- способность к росту в фотоавтотроф^лх условиях. В дальнейшей работе использовали один из них, получивший обозначение срз.

Во второй серии опытов культуру Synechocystis ввоз не обрабатывали мутагеном, а в качестве селективного агента использовали нитрофурантошь Среди 200 кругашх колоний, образующихся на среде с глюкозой, было отобрано 3 клона, неспособных расти фотоавтотрофно. Мутант, обозначешшй SN5, был выбран .~пя дальнейшего анализа.

Ряд ФС-мутантов бал отобран на среде с глюкозой боз ис-

пользования мутагена и селективных агентов. Отбор производили через 14 дней после рассева жидкой культуры зупвсЬосуаЫв еаоз на агаризовакную среду, обогащенную глюкозой. Чашки помещались в условия низкой освещенности (50 люкс). Среди более 700 круп-, них клонов, выросших на ореде с глюкозой, было отобрано 8 клонов, утративших способность к фотоавтотровному росту. Данная группа мутантов была обозначена как Ек-мутанты. Методика без применения ингибиторов фотосинтеза была разработана с учетом токсического действия глюкозы на клетки дикого типа вупвсЬосуа-ъ1в 6803. Этот эф!>зкт отчетливо проявляется на плотной среде в условиях ткзкой освещенности. В наших опытах доля выживших на среде с глюкозой клонов составляла 0,2-12, среди них доля ФС-мутантов составляла от 1 до 3%. Такая высокая частота встречаемости ФС-мутантов свидетельствует о том, что сама глюкоза является селективным агентом. 2. Анализ фенотипа СС-мутантов«

В таблице 1 приведены некоторые свойства ФС-муталтов

Зупес.)->осузМэ 6803.

Все полученные ФС-мутанты не росли в фотоавтотрофных условиях (свет, С02) и нуждались для своего роста в глюкозе. Скорости роста в фотогвтеротрофши условиях (свет, глюкоза) у различных мутантов сходны между ссбой, '

Клетки дикого тташа $упесЬосувъ1в ееоз, выращенные фото гетеротрофно, активно выделяют С^ а реакции Хилла (активност; ФС и). Активность выделения У большинства ФС-мутантов зна чителыю ниже по сравнению с диким типом, что свидетельствует нарушении фотосм;:етичоского переноса электронов в ФС и клетках ФС-мутантов.

Таблица 1. Свойства ФС-мутантов БупесЬосувиа 6803.

Время генерации Выделение 02

Штамм фото-трофия фото-гетеро-трофия мкМ/мг Хл/час Ф695

дикий тот 18 20 19,3 + 0,76

СРЗ нет роста 19 3,25 - 0.28

нет роста 18 2,7 - 0,26

БК4 нет роста 18 4.7 - 0,22

вКО нет роста 20 3.6 - 0,23

5X11 нет роста 18 1,9 - 0,21

ЭК13 нет роста 19 2.9 - 0,24

ЗК15 нет роста 20 1.8 - 0,25

ек!7 нет роста 20 2,2 0,27

БК18 нет роста 19 14 0.38

вК19 нет роста 20 3,3 - 0,21

Мутант вша характеризуе.ся незначительным снижением видело^я 0% в реакции Хилла по сравнению с дидач типом.

У всех ФС-мутангов, за исключением штамма бкга, в спектрах низкотемпературной флуоресценции отсутствует пик при Х=еэ5 (Ф6Э5), характерный для хлорофилла а ФС и (табл. 1). Как видаю из таблицы 1 значения относителышых величин перемешой флуоресценции отражающих процессы восстановления хинонных акцепторов в ФС и, у ФС-мутантов в 2,0-3,6 ->аза ниже, чем у штамма дикого типа.

Совокупность рассмотренных выше свойств ФС-мугантов позво-

ляет предполагать, что все они имеют нарушения в ФС и. Исключение составляет мутант БК18, который по активности ФС и сходен со штаммом дикого типа. Это указывает на иную природу нарушения в аппарате фотосинтеза у данного мутаь а. 3. Генотическа.. характеристика ФС-мутантов

Нарушения способности к фотосинтезу у ФС-мутантов могуч бить обусловлены дефектам! в различных генах, контролирующий синтез различных структурных и рвгуляторшх компонентов фотосинтетического аппарата. Фенотипически сходные ФС-мутанты могу иметь различные генетические таврезданпя. Об атом .свидетельствуют данные по генетической трансформации по -признаку -фотоовто-трофности кмдого ФС-мутанта тотальными препаратами ДНК, виде-лотшми из клеток других ОС-мутантоз (табл. 2).

На основании данных по перекрестной трансформации ЙС мутанты были разделены на Б г'руш, различающихся по природ мутационных повреждений. В первую группу вошли мутанты БК4 : 8x19, во вторую - 5к9, БК11. 5к13, срз; в треть» - $n5 и 6К1б в четвертую - зк17; в пятую - БК1В.

Трансформация к фотоаЕтотрофности ФС-мутантов каадой груп пы донорной ДНК из клеток штаммов других групп осуществляется высокой частотой, тогда как и^хлу ФС-мутвнташ одной групп трансформация не происходит или осуществляется с очень низко частотой. Так, например, ОС-мутанты второй группы (зкэ, бки бк13, срз) с высокой частотой трансформируются препаратами ДН всех других мутантов, но значительно хуле между собой, что укг зывает на близкое расположение мутаций в указанных штамма? Штаммы БХй? я £К18 образуют отдельные генотмч&скне .группы. Ш трансформируются хромосомной ДНК всех ФС-мутантов., за исключи нием собственной ДНК.

Таблица 3. Перекрестная генетическая трансформация ФС-мутантов по признаку фотоавтотрофности.

Донор ДНК Количество ФС*- трансформантов на 1 мкг ДНК

Штамм - реципиент

БК4 ЗК19 БК9 БКИ БК13 СРЗ ЗК15 ЙК17 БК1В

дикий тип 70 70 200 200 500 400 80 500 500 400

БК4 0 0 200 200 500 400 60 400 400 400

БК19 3 0 200 150 500 400 55 400 400 400

ЭКЭ 5з 60 0 .0 0 15 60 400 400 400

ЙКИ 70 60 0 0 0 3 70 400 500 400

БК13 70 60 0 0 0 62 60 500 500 350

СРЗ 57 . 50 14 10 42 0 70 500 500 400

8Ы5 60 50 150 150 400 400 0 в 500 350

ек15 40 40 . 200 200 500 300 2 0 500 250

БХ17 65 40 200 200 500 300 70 500 0 400

вкхв 70 66 150 200, 5 СО 400 80 500* 500 0

Примечание: приведены усредненные данные 4 опытов.

Всвс исследованные ФС-мутанты с высокой частотой трансформируются К фОТОаВТОТрОфНОСТИ ХРОМОСОМНОЙ ДНК ДИКОГО ТИПа 5упе-сЬосуаг!а ввоз (табл. 2), что позволяет использовать метод генетической трансформации для клонирования генов фотосинтеза из геномного банка цианобекгврии путем фенотиличэской комплементации ФС-мутантов.

II. КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНОВ ФОТОСИНТЕЗА.

г-

1. Выделение фрагментов ДНК ЭупеоЬосуаМа 6803. трансформирующих ФС-мутанты к фотоавтотрофности.

Схема экспериментов по выделению из геномного банка Synechocyetis 6803 фрагментов ДНК. содержащих гены (или участки генов) фотосинтеза приведена на рисунке 1.

Для получения геномного банка хромосомная ДНК дикого типа Synechocystie ввоз обрабатывалась мелкощепящей рестриктазой Sau3A и полученные фрагменты (4-11 т.п.н.) клонировались по bamhi сайту в Еекторной плазмиде pacyci84. Репрезентативный банк содержал 2800 стгтс® клонов е.сои, который-бил разбит на 280 групп по 10 клонов. Из каждой грулш .был выделен суммарный препарат плагмидных ДНК, который использовался для трансформации СС-мутантов к фотоавтотрофности. Поскольку шшзмида pACYCiB-, не реплицируется в клетках Synechocystie 6803, образование фототрофних трансформантов возможно толькй за счет замещения мутантного аллеля в хромосоме ФС-мутантоз в результате гомологичной рекомбинации с фрагментом ДНК дикого типа, клонированного в векторной плазмиде. В каждой группе рекомбинантшп плазмид, трансформировавшей данный мутант к фотоавтотрофности, была идентифицирована индивидуальная плазмида, восстанавливающая способность иутангоз к фотосинтезу. Далее анализировал* клонированный в ней фрагмент цианобактериальной ДНК. В результате было выделано 3 рекомбинантше плазмида: Р19э, восстанавливающая фотосинтез у всех мутантов второй группы (SK9. skii, j?ki3, срз) ; р235 - у мутантов третьей ipynmi (sns и ski5);'p2o: - у ski8. В геномном ^анке не удалось обнаружить рекомбинантну! плазмиду, трансформирующую к фотоавтотрофности мутант SK17 Возможно это связано о токсичностью для клеток к.сои продукт) гена, нарушенного у-мутанта skiï. ФС-мутанты из первой груш SK4 и skis трансформируются к фотоавтотрофности плаэмвдой р31 любезно предоставленной Ермаковой С.Ю.

EcoRI

pACYC 184 ТсГ

Hindlll BOJDHI Sali

Sau3A Sau3A Sau3A

хрокосоыа Synoohocystia 6803

BamHI

датирование

T

Sau3A

Библиотека генов Synechocystlß 6803 ( 2800 (йЛ^клонов В. coli)

Hindill

Sali

Трансформация ФС-мутантов

селекция ФС-клонов

рестрикционный и делеционный анализ клонированного | фрагмента

гибридизация с известныии генами фотосинтеза, секвенирование и иашпсшй анализ последовательностей

Рисунок 1.

Схема выделения и изучения фрагментов ДНК Synechocyatia ввоз, содержащих гены фотосинтеза.

2. Рестрккциошюэ картирование и дэлеционный анализ изолированных плазмид.

Первым этапом в изучении изолированных рекомЗинантных плазмид явилось построение их физических карт. Рестрикционные карты фрагментов ДНК ичанобактерии в составе плазмид р31, р193, р235, р203 приведены на рисунке 2. В составе плазмиды р31 клонирован хромосомный фрагмент ЗупесИосуаМа 6603 размером 6,6 т.п.н., в р193 - 9,7 т.п.н., в р235 - 10.5 т.п.к., в р203 - 6,6 Т.П.Н.

Для Солее точной локализации мутационных повреадений в ДНК ФС-мутачтов плазмиды расцепляли различными рестрнктазами,полученные субфрагманты клонировали в векторной плазмиде е.со11 рис19 и использовали для трансформация 'К-мутантов. У мутантов первой группы способность к фотоавтотрофному росту восстанавливалась при трансформации Ва®н~-н1.пс11п субфрагмвнтом (2,в т.п.н плазмиды р31 (рис. 2А), Мутанты второй группы трансформировались Зта1-ЕсоИ1 участком (2,1 т.п.н.) плазмиды р193 (рис. 2Б). Мутанты третьей группы - хьах-н1пап1 субфрагмвнтом (1,6 т.п.н. плазмиды р235 (рис. 2В). Из хромосомного фрагмента размером 6,6 т.п.н. в составе плазмиды р203 был клонирован ЕеоК1-участок размером 1,4 т.п.н.,которий также трансформировал мутант БК18 к фотоавтотрофности (рис. 2Г). .

3. Идентификация генов фотосинтеза в составе Еыделеншц фрагментов ДНК Syт^echocyзt 1а 6803.

В целях идентификации генов, нарушенных у ФС-мутентов, были проведены эксперименты по блот-гибрвдизации выделенша фрагментов ДНК ТупесЬосуоъАз 6803 с известными генами, кодирующим компоненты аппарата фотосинтеза у цианобакторий и высшш растений. Этот подход осног,<ш на том, что гены, ответственные

А. Р31

(9,6 т.п.н.)

ЙГ Н НРК Эга иШ

рвЬВ

в!iiJJJJJJiJ

2,8т.п.н.

Б.Р193

(13,7 Т.п.и.)

М £т Н

1ллдлтзуити iii мшу ',1^1

МНЫ

реЬЕРЫ

т

2,0 т.П.н. 0,7 т.п.н.

В.Р235

КГ ¡ц в

(10,5 т.п.п.)

К X Н ХЪ

Е ХЬ Н М Бт Ба Б И1

яппия ¿тгиивга мидщ лЬ'тиил!

реЬ01

рзЬС

ХЬ Ка-

-1 1,6 т.п.н.

Рт Ч Н

0,54 т.п.н. — 0,65 т.п.н.

Г.Р203

(10,6 т.п.н.)

М ХЬН Ба. И! ХЬ

Н1 НГХЪ,0,5 М 4 Ч ид ».УлаСТлтш\

0И?32б

1,4 т.п.н.

Рисунок 2. Р&стрикциошшЯ и дэлешзонный анализ фрагментов хро

М0С0Ш0Й ДНК ЗупесИосуаио 6803 ИЗ ПЛЭЗМИД р31(А), р!93(Б), р235(В). р203(Г).

В-ВакН I. Р^и! X , Бш-3та1.3-Ба 11, Н-Н1п<1111. М-ЕсоШ, Ба-БаиЗА

(внутри фрагментов заиЭА сайты не указаны).а-Асс1.№-!»ю1,

ХЬ-ХЬа1.Ма-Наг1,Рт-РпяСХч Е-Есо321;Х-ХЬо1, К-Крп1. . 111 - ДНК гАСТС104, |.Ч1НК181т»(.>1г,г.»«*(1> йяп.ч

ДНК' БупесЬсюуаНе 6803.

Н

за синтез основных структурных белков фотосинтетического аппарата оксигенного фотосинтеза у разных организмов имеют высокую степень ГОМОЛОГИИ СВг-уапЪ а1. , 1986].

По данным Ермаковой С.Ю. ВшпШ-ШпсИИ участок плазмида р31 гибридизуется с Р^-меченным раьв геном БупесЬэоуэ^а бвоз(табл.З). Сопоставление рестрикционных карт этого фрагмента И первичной последовательности. раЬВ гена [Уегтааа еЬ а1., 1987] показало, что ватШ-Н'псПП (фрагмент содержит почти полную последовательность раьв гена за исключением первых 256 п.н.(рис.2А) Таким образом, у ФС-мутантов первой группы 5К4 и эх1Э утрата способности к фотосинтезу связана с мутационными изменениями в рзъв гене, кодирувдим 47 кДа хлорофилл а - связывающий белок ядра ФС и.

Как видно из таблицы 3, этах-ЕсоМ участок плазмида р193 размером 2,1 т.п.н. дает шложительный гибрвдизационный сигнал С кластером генов рэЬЕКЫ £упееЬосув11в 6В03 ЕРакгаа! а1. ,

1888]. Выделешшй ИЗ 5ща1-ЕсоМ фрагмента ЛЬа1-Аос1 участок размером 0,7 т.п.н., содержащий весь оперон. без фланкирующих районов (рис. 2Б), трансформирует к фотоавтотрофяости все мутанты второй группн. Поскольку участие продуктов генов рвьь и рвы в процессе фотосинтеза не установлено, то более вероятно, что у ФС-мутантов второй группы утрата способности к фотосинтезу связана с изменением а или 0 субъединицы цитохрома ь550, синтез которых кодируется соответственно инами раЪЕ и рвьк.

Участок хъа1-Н1па1п }■ • ¡мерой 1,6 т.п.н. из плазмида р235,. трансформирующий к фотоавтотрофности мутанты третьей группы, гибридизуется с зондом, содержащим кластер генов раътраьс из £1 лсЬосувиа 6803 г^ишвшв вь а!.. 1ва7Э (табл. 3). Сопоставление рестрикционных карт клонированных гонов рвЬМо^ьс [ши-

ams et ai., 19S7} и плазмиды р235 показало, что клонированный нами фрагмент содержит последовательности ..эрекрывающихся генов pebDlpebC (рис. 2В).

При дальнейшем субклонировании Xbai-Hinciiii фрагмента были ВЫДелеНЫ Два раЗЛИЧНЫХ участка PinaCI-HindlII (649 П.Н.) И Narl-Pnaci (538 п.н.) (рис. 2В), трансформирующих соответственно штаммы SN5 и SK15. Фрагмент PmaCI-HindlII СОДОряИГ ЧаСТЬ раЬС гена с 121 по 770 п.н., кодирующего 43 кДа хлорофилл-связывакщий белок ФС и. Фрагмент Nari-PmaCi содержит вторую половину psbDi гена (621-1056 п.н.) и начальный участок рвьс гена (1-120 п.н.). Следовательно, мутация в штамме sn5 может затрагивать рвьс ген. Ген psbD. кодирующий синтез D2 белка ре-

вКЦИОННО.'О Центра ССЦ, Представлен В ГеНОМв Syr.echoeystie 6803 двумя функциональными КОПИЯМИ [Williame et al.. 1987], ПОЭТОМУ можно предполагать, что у штамма skis мутация находится также в гене рвьс, или жев области перекрывания двух генов.

EcoRi-фраплент размером 1,4 т.п.н. плазмиды р203, тронсг формирующий к фотоазтотрофности мутант skis, не дал положительного сигнала при блот-гибридизации с зондами ряда известных генов фотосинтеза из цианобактерий и растений. Известно, что в .растениях многие белки, участр"хаше в процессе фотосинтеза, кодируются генами хлоропласта CShinozaki et al., 1986: Ohyama et al.. 1986]. Предполагается, что обнаруженные в хлоропластаом генома высших растений открытые рамки трансляции могут кодировать еще не идентифицированные фотосинтетические белки.

Поиск гомологии между ecoRI-фрагментом из плазмиды р203 и банком хлоропластной ДНК табака rshinozaki et al.. 1986] не дал положительных результатов.

Таблица 3. Влот-гибридизация выделенных фрагментов ДНК БупвсЬосуаыв ввоз с генами фотосинтеза.

•р3-меченннЯ зонд фрагменты ДНК - мишени

ВатН1-Н1п<Ш1 из р31 2,8т.п.н. Бта1-ЕсоЩ ИЗ р193 2.1Т.П.Н ХЬа1-Н1пс1111 ИЗ р235 1.6Т.П.Н. ЕсоШ ИЗ р203 1.4Т.П.Н. банк ХП ДНК табака

рвЬА1 - - - -

рвЬВ + - - -

раЬБЮ •г - + -

раЬЕР - + - -

рэЬа - - - -

рвЪО - - - -

рвЬК - - -

ряЫ - - - -

рааА - - -

рааВ - - - -

рваС - - - -

реЪВ - ' - -

реЬЙ - • - -

ЕооШ фраг- - - - - -

мент из р203

Возможно, что у штамма 8К1В мутационное повреждение затрагивает синтез одного из неизвестных структурных или р^гуляторяых компонентов фотосинтетического аппарата,' кодируемых ядерными генами у растений. Для получения информации о природе гена, нарушенного у мутанта зк1е,. ало осуществлено определение нуклео-твдно? последовательности кооМ-фрагмента (1,4 т.п.н.) из плаз-мада р2оз.

4. Секвенированио фрагмента ДНИ, трансформирующего мутант ак!в. Стратегия отштов по секвонировагано представлена на рисунко з.

ЕсоД1 АрвТ ВврЦН Ара1

2с оШ

1411 п.и.

ЕсоПГ ВорШ!

Ара1

310 п.к. Ара!

460 п.н.

Рисунок 3. Рестрикционный и делеционний анализ фрагмента, трансформирующего мутант экш. Стрелками указаны направление и протяженность секвенированшх участков ДНК.

Внутри ЕсоШ-фрагмента размером 1,4 т.п.н. из плазмидц р203, было обнаружено два сайта Ара1 (рис. 3). Два субфрагмонта дРа1-и Ара1-Еоой1 с размерам!! 0,4 г 0,8 т.п.н. поело обработай концов ДНК П0ЛИШра<50Я I Е. гоИ клонировали В вектор М13тр10 по сайту Бта1. Е результате ев <ваг"тованпя внутри Ар»1 -фрагмента длиной 0,4 т.п.н. шли обнаружены два сайта для рестриктази Ворми на расстожгл 78 п.н. друг от друга (рис. 3>. В результате секвенирования ЕсоН1-Взрмп Фрагмента (0,3 т.п.н.) была определена непрерывная последовательность всего ЕсоШ-Фраг-мэнта длиной 1411 п.н., представленная на рисунке 4.

Куклеотидкая последовательность 1,4 т.п.и. Есонх- фрагмента была проанализирована .на компькЛере (гвм рс/ах ) с помощью пакета програш ••рссене"» "РКОйхз", "тлв15".

Рисунок '4. Нуклеотидная последовательность фрагмента хромосомной ДНК трансформирующего мутант эк18 к фотоавтотрофности.

к в

0Ш28

I Р Т 1 I Г » I I а I 5 I I Н 6 а I I I I в i Г Р в А Ь а Р т i i «

I ь I I в г * в I » « в г г ь о г т р к а « к « к I I I I I т т I

201 Ш5ШС1С115Ш1СИС5СС1П6С!ШССиКанаСШСиАССт1(СШСШШСШПСТС1Ж»ШП1СШи

301 ¿ссгсас1СсссаотссА<5дастс/х5сс''тсаииААКС1Ссшсетс5дгсмсоттссетпашссошс1тс

6 i I 9 У I Т Т 5 I I г в » С I 9 I II I » Р I I II I I в а ? I а

401 КСиТаССАС2ТСАСаССАЯСг!САССТА!С(К!;етА551аОСШ1СА»СМСиССагМАССЦССа!АСШТТНС5ССССССТ(И

с8ра1ка1;19рн0«11а11>с»м(1т1,51в1аад

501 асспссспсссзАзсАсготсзстосисссатсАССАААПптсгАтшссотиАСАТАСссА^ссшсотАгАкигизссгс

I И I 8 V I II 1 I V 5 I I I I в I С Т I » Р в ! I Т I 1 I ( 1 1 5

ео1 сАСААТсссссссссАШАСАишспгсспвштасгсАсетсАскмпдсшАштАГСОТАагаАетытсс 0Ш5Г"

I 8 Р V А А 9 I, В I) г Р Р Б « в Т 6 1 I К I 5 5 I 5 а i а т i i » 1 701 СТСАаТСС(;аГССССаСССААПаСДШТТССС(:СССАЕСТСААТСССГСССГТАСАТ1ССССТСАаТСААПТАа1аССААТ5СаАТШШ5ТА(!

а а I Н I) Ь i I « С I В С I I I 5 I г II I Р а 5 I. I 5 а С I О I а

во1 шшжкшжтттаатттттптпшсстшткататтшат

» i i 2 i 8 i, [, с р р i 5 к а р ! г н а

8 Ь « Ь Р I $ I I V I I » К 1 в» 9 Р I I I » 5 I Р1 в I 5 а I в

801 тсктшм?гасотшосассш5тшсаоттсшсоссш9!ш

е i в i в 5 i ГТ ога

»РРСв»69РЗТС9С«»1Г515РАв»

1Ю1 дшстмсшшшпштсспотшткоик^^

< р р «1 I г в < I > I

1201 шжмшжитпсстшскжтмссяытсстишитспахсс^

1301 сттттсс1жаеттшта.ш1спсп мпасшташсааасиесссиститасстхлашс

( $ ( 5 » Р р т С О вТ'ОЫИ 1401 атамааттс 5' .

- J.» —

По пакету программ "pcgene" с использованием алгоритма

[Kolaskar, Reddy, 1985], В СеКВОНИрОВаННОГ ПОСЛЭДОВаТеЛЬНОСТИ

были обнаружены 4 открытые рамки трансляции corf), для которых предсказывается высокая вероятность кодирования полипептида (табл.4). ^4F56 и 0RF28 имеют противоположную ориентацию транс-•ляции по отношению к ORF326 И ORF156 (р«С 4).

Таблица 4. Открытые рамки трансляции в ec0ri-фрагменте (1,4 г.п.н.) плазмида р203.

ORF Координаты Количество аминокислот Молекулярный вес кДа

ORF326 96-1073 326 36,405

0RF156 605-1073 158 17,105

0RF56 1336-1168 56 5,696 -

0RF28 927-843 28 ■ 3,089 .

С целью выявления онр с мутационным нарушением у штамма SK18, был определен район нахождения мутации путем дополнительного субклонировазия .5coRr-£)p *гменга(рис. 3).Два перекрывающихся субфрагмента EcoRI-Bephl'-' (ЗЮ П.Н.) и Apal-Apal (460 П.Н.) способны трансвэрцщова-гь ^тант skio.. Следовательно, мутация находится в предеtyu Лга!-1>?р«Л1 фрагмента длиной 161 п.н..

Среда обнзр^оннга открытых рамок трансляции, только 0RF326 находится в p,ic;o, где локализована мутация, оккзгв состоит из 978 п.н. ..и может кодировать белок с молекулярной массой 36,4 кДа. Анализ 5--и 3*-фланкирующих районов с использованием алгоритма ^taden, 1334] пакета программ " pcgene" не выявил каких-либо ¡регуляторных последовательностей, характерных

для сайтов инициации транскрипции и трансляции в геноме E.coii. Возможно, ото связано с наличием у некоторых генов циа-нобантерий рогуляторшх элементов, не гомологичных такошм у E-coli.

В банке последовательностей ДНК ( embl genbank data base ) за 1990 год не обнаружено mi одного гона, имеющего достоверную гомологам с 0RF326. Анализ профиля гидрофильное™ по алгоритмам CKyte, Dooiittie, isfl2j 'пакета программ -pRosis" выявил гидрофобный район на i.-конце полипвптидв, которой предположительно кодируется 0RF325. Аминокислотная поелодовательность между 8 и 26 положениями моякэт образовывать район, способный пронизывать тйлаковдную мембрану. ' ■ •' Б. Клошфовошю и сэквотрование мугантной когоат orf326.

С целью идентификации мутационного поврекдения в геноме ш;аша skis было проведено клонирование ecoRI-фрагмента размером 1,4 т.п.н. из хромосомы мутонтного штамма. Клонирование-проводили в векторе puci9, Клош е. coli, содержащие искомый фрагмент, отбирались по гибридизации с р3-мечехдшм EcoRi-фрагментом длиной 1,4 т.п.н. ДНК штамма дикого типа Sy-nechocystie 680Э. Плазмвду, содержащиеся в клонах, давшх положительный радио автографический сигнал, бшш подвергнуты обработке рестриктазйми EcoRI, Apal, BapMII. Поело проверю! идентичности рестрикционных карт ecori-фрагментов, выделещшх из мутанта skiö и дикого tima synechooyotte ечоз. плазмида о -мутантним- геном использовали для трансформации клеток штвша SK1B. Как н ожидалось, трансформации мутанта к фотоавтотрофюс-' tu но наблюдалось. apal-участок (0,46 т.п.н.) одного из ••мутаптншс" ДНК фрагментов Зил клонирован в составе вектора mi 3i-.piо для определения нуклеотидной последовательности в пред-

- ¡il -

полагаемом районе мутации. Сравнение последовательностей в portone Apai-BepMii у штаммов дикого типа и sk.j выявило замену О на А в положении 177 (pic. Б). В опкз20 вто соответствует замене кодоиа тса (серии) на tag (отоп-кодон). что должно приводить к обр-ву синтеза полипоптида после первых 27 аминокислотных остатков.

Рисунок 6. Локализация мутации п штемме екю.

TyrLeuQlyAonThrProSQrAlnlieiiAlnPheThr

ttatctgggcaatacaccoTCGgccttgoctttcacc

ДИКИЙ1 ТИП 167 103

TyrLeuOlyAenThrPro » AlaLeuAlePheThr TTATCTGGGCAATACACCCÎWCCICCTTGOCTTTQACC

6K18 167 103

Функция продукта оикзгв остается неясной, но свойств мутанта вше (табл. 1), ясно, что »тот ген не контролирует активность ФС п. хотя и участвует в контроле способности к фотоавготрофиому росту.

Проведена рвбота по определению копийности гена ошгзгв. Блот-гибридизпция хромосомы syneohooyntiD ввоз, обработанной нуклеазоми рестрикции ЕатШ, Hindin ШМ EooRX О Р^ме'чеШШМ араI-фрагментом ( о,4в т.п.н.), несущим учаоток окрзгд, обнаружила во всех трех анализируемых вариантах одну одинотвенную полосу гибридизации. Эти результаты свидетельствуют о наличии одшшчной последовательности гена он?зге в хромосоме synoeho-cyetie вПОЗ.

0ПГЭ28

ORI'328

ИСХОДЯ ИЗ

ИЛЮДЦ

1. Подучен« коллекция ФС-мутантоо цианобоктерии супвоЪооувив оооа, неспособных к фотоаптотрофному рооту,

2, Клонирована фрагменты ДИК супвоЬооув^в вооз, пааатанавлн-шнодиа способность к фотосинтезу у ФС-мутантов при генетической трансформации, У большинства ФО-мутонтов мутации, приподадио нарушению процесса фотооинтоаа, локализованы и генах раЬВ, раЫН/С, рпЬЕР,' кодирующих СОЛКИ ЯДрО фОТООИОТв-мы , и.

3, Клонирован и сокпо1шрооац фрагмент ДНК, восстанавливающий способность к фотоавтотрофюму рооту у ФС-мутанта шв. Обнаружен ношй гон с открытой рамкой трансляции размером в 326 амшюкиолотных остатка, но имеющий гомологии о хло-

' роштстной ДНК раотоний и иг.лвотними гонами фотосинтеза и продотаьлехишй вдинотвдщюй конной в геноме еупвоЬооуеси саоа,

4. Клонировала и оокпонирована мутантная копия огшга. Утрате способности к фотоаптотрофному рооту у мутанта щца шаршш заменой оер;ша~20 иа стоп-кодой в белке, кодируемом оярзгв.

Оопоышо результаты диссертации ипложонц в следующих публккоци 1, Парений У,Л,.Губанова О.Н.,Еланская И.В..Самуилов В.Д. Станбекова Г.З..Шоотакои С,В. Мутанта иипнобактерии ВупвоЬв супин еаоз о нарушений!.; а переносе олоктронов на донирнс отороно фотосистемы ц.~ Шологичоокио науки, 1989, )У1 с.20-33.

. Ст^Юикош! Г.э. Тшдолшю фрагментов ДНК, трансформирующих

фотопстотрофпости дофочпшо ПО фОТОСИИТООУ МУТ111ГШ ЦИМ1000К-тории Gyhechooyetie еооэ.- D со.: Труди 20 ноушоП конторок-ЦИИ МОЛОДНХ УШ1ШХ биологического факультета МГУ, Москва, 1989, 4.2, 0.1Б2-1Б8.

3. СтопОокосо Г.Э..Ермакоип O.D.«КорОШопо Е.А..ШпхпоОптпн Л.Г. ,ЕЛ0|1ОК0Я И.В..Шостпков С.В. Молокулнрно-гонотичоскиП Я110ЛИО мутиитоп ШШПОООКТОрИИ Synechooyat tra 60СО ДофоКТПНХ по Фотосинтезу.- Биологические наука, 1992, п печати.

4. Ghsetakov В. ,Klanakayn I.«Krmakovn U..Qtnnbokuva Q. , Bibl-kova M.,Droun M. Moleoular arinlynla of «enon for photoaynthi-

nie In Iho eyanobaoterium ßyneohooyetlo 600Э." Abnt . VII Int.

nyeip. on photonynthntlo proknryoten, Atnh«reb, USA, 191J1, р.ЭЭ.

0. ßhukla V., GfcnnbokoVa 0., tihefltakov ¡3., PakraM II. Tho 1)1 Protein ot the Phötoeyetem II Heactlon Cnntnr Complttx Ae<?ti-mulatee In th« Abnnnoo of D2: Analynlв of n Cytoohi'"me bbfiO-leen Mutant of the Cyanobacterlum ßynechocyabla np. l'CC 6003.-Mol. mloroblol., 1992, In preea.