Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование организации генома цианобактерий на примере desA-ген содержащего фрагмента ДНК Synechocystis PCC6803

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Исследование организации генома цианобактерий на примере desA-ген содержащего фрагмента ДНК Synechocystis PCC6803"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ ИМ. К. А. ТИМИРЯЗЕВА

'' у о л

° На правах рукописи

УДК 581. 132; 582.1

МАЛАХОВ Михаил Павлович

ИССЛЕДОВАНИЕ ОРГАНИЗАЦИИ ГЕНОМА ЦИАНОБАКТЕРИЙ НА ПРИМЕРЕ с1езЛ-ГЕН СОДЕРЖАЩЕГО ФРАГМЕНТА ДНК БупесПосузЫз РСС6803 (03.00.12 - физиология растений)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1993

Работа выполнена в Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор В.Е. Семененко;

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Д.А. Лось.

Официальные оппоненты:

чл.-корр. РАН. профессор C.B.

чл.-корр. РАН, профессор Б. В.

Ведущее учреждение - Институт

Шестаков; Громов.

почвоведения и фотосинтеза РАН

Защита состоится "28" декабря 1993 г. в 13.00 на заседании специализированного совета по присуждению ученой степени кандидата биологических наук К.002.45.01 при Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, д.35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

Автореферат разослан "26" ноября 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета -кандидат биологических наук

Л.И. Сергеева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Цианобактерии (сине-зеленые водоросли) относятся к числу прокариотических организмов, которые способны выполнять оксигенный фотосинтез на свету, а также расти фото- и хемогетеротрофно и отличаются высокой пластичностью метаболизма. что делает их удобным модельным объектом для изучения таких актуальных проблем современной физиологии растений, как генетический контроль и эндогенная регуляция оксигенного фотосинтеза, дыхания, азотного обмена, а также адаптивных свойств фотоавтотрофных клеток. Некоторые цианобактерии, в том числе Synechocystis РСС6803, легко трансформируемы экзогенной ДНК (Shestakov and Khu-yen, 1970; Grlgorleva and Shestakov, 1982), и манипуляции с генами, кодирующими компоненты фотосистем стали привычным делом (Williams, 1988; Smart et al., 1991; Anderson and Mcintosh, 1991a).

Цианобактерии как наиболее вероятные предшественники хлороп-ластов, также являются интересным объектом для изучения эволюции фотосинтеза и взаимодействия фотосинтеза и дыхания. Сине-зеленые водоросли, осуществляющие клеточные синтезы за счет преобразования солнечной энергии, относятся к числу перспективных объектов биотехнологии и микробиологической промышленности, как наиболее выгодные в энергетическом отношении продуценты протеина, липидов, токсинов и других физиологически активных соединений.

Необходимой предпосылкой для использования цианобактерий в качестве объекта для генно-инженерных манипуляций и эволюционных исследований является выяснение организации генома этих организмов и накопление информации о структуре отдельных генов. К настоящему времени охарактеризовано более 300 цианобактериальных генов, в том числе около 100 из Svnechocystis РСС6803, но не предприняты попытки секвенировать протяженные участки хромосомы, что дало бы более юлное представление о принципах организации генома цианобактерий.

В представленной работе, исследован Фрагмент генома цианобактерии Synechocystis РСС6803. содержащий ген desH длиной 12 т.п.н. "ен des^ кодирует десатуразу жирных кислот, подобную хлоропластным-1есатуразам высших растений (Wada et al., 1990). Сёквенирование . хрилежащих к йеэЛ-гену областей генома могло идентифицировать ноше гены вовлеченные в липидный метаболизм в том случае, если этот лен явился бы компонентом кластера функционально связанных генов.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось определение первичной струк-

туры des/1-reH содержащего фрагмента ДНК Synechocystis РСС6803. компьютерная обработка полученной информации, идентификация открытых рамок считывания (ОРС) и физиологическая характеризация идентифицированных генов.

Исходя из цели работы были поставлены следующие задачи:

1. Секвенирование фрагмента ДНК Synechocystis РСС6803 размером 8 т. п.н.. включающего des/1-ген.

2. Компьютерный анализ нуклеотидной последовательности с целью выявления ОРС и идентификации генов.

3. Выяснение физиологической активности идентифицированных генов.

4. Компьютерный анализ известных нуклеотидных последовательностей цианобактерии Synechocystis РСС6803 и выявление частотных олигс нуклеотидов, которые предположительно участвуют в процессах репликации и рекомбинации ДНК.

5. Анализ использования кодонов во всех секвенированых генах Synechocystis РСС6803 и сравнение efo с использованием кодонов в генах высших растений.

6. Сравнительный анализ организации генома цианобактерий и других прокариот на уровне кластрирования генов.

Научная новизна работы.

Впервые определена первичная структура протяженного (суммарная длина 12 т.п.н.) фрагмента генома цианобактерии Synechocystis РСС6803. Проведен компьютерный анализ нуклеотидной последовательности и впервые идентифицированы пять цианобактериальных генов, кодирующих рибосомный белок L9; UDP-MurNAc-пентапептид синтетазу (ЕС 6.3.2.15); новый цитохром С; матуразу, отвечающую за дозревание цитохром С оксидазы; новую ацетилтрансферазу.

На примере генов rpli, murF и суо показано отсутствие генных кластеров в хромосоме Synechocystis РСС6803, что делает поиск ге^ со сходными функциями в одном участке цианобактериального генома нецелесообразным.

Идентифицирован новый цитохром (продукт трансляции гена суtJ возможно представляющий, один из самых примитивных цитохромов. Сконструирован мутант с разрушенным геном cytM и показано, что в нестрессовых условиях кодируемый цитохром не влияет на рост Synei hocystis РСС6803,

В геноме цианобактерии Synechocystis РСС6714 идентифицирова! ген. кодирующий транспозазу, и показано, что эти ферменты принад лежат одному классу транспозаз, ранее идентифицированных в Ana-

- 5 -

baena и Saccharoplyspora erythraea.

Проведен сравнительный анализ, использования кодонов в генах Synechocystis РСС6803 и в генах высших растений.

Впервые проведен статистический анализ известных нуклеотидных последовательностей и выявлен частотный декамер RGCGATCGCY в геноме Synechocystis РСС6803 и геномах других цианобактерий.

Практическая ценность работы.

Идентификация встраивающейся последовательности.позволит сконструировать на ее основе высокоэффективный интегративный вектор. Показано, что использование кодонов в генах Synechocystis РСС6803 и однодольных растений совпадает, что делает данный штамм перспективным акцептором генов из однодольных растений.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на IX Международном конгрессе по фотосинтезу (Нагоя. 1992), на семинарах Зтдела внутриклеточной регуляции ИФР РАН. и Отдела клеточной регуляции Национального Института общей биологии (Оказаки. Япония).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, )бзора литературы. 10 глав экспериментальной части, заключения, шводов и списка литературы, включающего 293 наименования, из них >76 на иностранных языках. Работа изложена на 175 страницах маши-юписного текста и содержит 27 рисунков и 8 таблиц.

|БЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Smechocvstis РСС6714 и Sunechocustis РСС6803 получчили из шлекции культур Пастеровского института и культивировали в среде G-11 при 34°С, (Wada and Murata. 1990).

Для субклонирования ДНК использовали штаммы Е. coli JM109, В101 и XL-1 blue. Штамм Е. со П. мутантный по murF-гену и неспо-обный расти при 42°С - JE6607, был получен из Института генетики Мисима, Япония), и его клетки выращивались при 30°С. Трансформа-ия компетентных клеток выполнялась по Sambrook et al. (1989).

Клонирование ДНК, рестрикция, лигирование, выделение плазмид-эй ДНК и получение делеционных производных выполняли по Sambrook t al. (1989). Плазмида. содержащая ген desA Synechocystis ;С6803. (вставка длиной 7.5 т.п.н.). pTZ19R/8-kbp, получена как тасано ранее (Wada et al., 1990). Из исходного бактериофага, был жже субклонирован EcoRI-EcoRI фрагмент длиной 9 т. п.н., прилезва-1й к des^-ген-содержацему фрагменту (плазмида pES18. см. рис.1).

cytM-ген ¡¡з Synechocystis PCC6714 клонировали, используя геномную библиотеку сконструированную в бактериофаге XDASH II.

Полимеразная цепная реакция (PCR) использовалась для оределе-ния размеров вставок в делеционных вариантах плазмид, для синтеза зондов для Саузерн- и нозерн-блотов, а также для проверки полноты замещения нативных генов cytM или murF из хромосомы Synechocystis РСС6803. Для синтеза зондов использовали синтезированные нами оли-гонуклеотиды и после реакции фрагмент, соответствующий расчетному размеру, очищали из агарозного геля. Для проверки полноты замещения нативных генов суШ или murF в мутантах Synechocystis РСС6803 использовался двухступенчатый гнездовой PCR.

ДНК секвенировали по Sanger et al. (1977) с использованием денатурированной плазмидной ДНК в качестве матрицы. В качестве метки применяли [а-32р] дЦТФ или [а-33Р] дАТФ. Иногда для секвени-рования использовались синтезированные нами праймеры (применялся синтезатор фирмы Applied Biosystems (США).

Компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей осуществлялся пакетами программ DNASIS (Hitachi, Япония). PCGene (IntelliGenetics, Швейцария), DNASUN (ВНИИ Генетика, Россия) и GENETYX (Япония). Для поиска гомологичных последовательностей в базах данных (посредством электронной почты) использовались программы BLAST и FASTA (Altschul et al.,. 1990).

Для Саузерн-блот анализа. ДНК изолировали из цианобактерий по Williams (1988). После рестрикции, ДНК подвергали электрофорезу в агарозном геле и переносили- на мембрану GeneScreen Plus (NEN, США)-. Пробы метили [а-згР] дЦТФ или дАТФ методом ник-трансляции.

Для нозерн-блот анализа, тотальная РНК выделялась из 100. мл клеточной культуры (300 мкг тотального хлорофилла), как описано ранее (Malakhov et al., 1993). РНК в количестве 5 мкг наносилась на 1.5% агарозный гель, содержащий 6.5% формальдегид, и после электрофореза переносилась на мембрану GeneScreen Plus.

.Для конструирования мутантов Synechocystis РСС6803: по murF, , внутренний фрагмент гена был замещен Кшг-касссетой (из плазмиды pUC4KIXX, Pharmacia, Швеция). Для конструирования мутанта по cytM, фрагмент гена длиной 211 п.н., был замещен Ктг-касссетой: Конструкции были использованы для трансформации Synechocystis РСС6803 по Williams (1988).

Поглощение и выделение кислорода суспензией интактных клеток измеряли электродом Кларка (Hansatech. Англия) при 34°С.

по Laudenbach et al. (1990) с некоторыми модификациями. Для элект-рофоретического анализа по Laemmli (1970) белки растворяли в денатурирующем буфере (1% ДСП. 6 M мочевина и 8% сахароза; 70°С. 5 мин). Пероксидазная активность, ассоциированная с гем-содержащими белками (цитохромами). была локализована обработкой геля 3.3',5,5'-тетраметилбензидином и перекисью водорода.

СЕКВЕНИРОВАНИЕ И КОМПЬЮТЕРНЫЙ АНАЛИЗ

Была определена нуклеотидная последовательность фрагмента геномной ДНК цианобактерии Synechocystis РСС6803 размером 6 т.п.н.. прилежащего к гену desX (Wada et al.. 1990), кодирующему Д12 деса-туразу жирных кислот (рис.1). Клон pES18 был секвенирован по одной цепи. Было обнаружено, что один из фрагментов включает в себя участки гомологичные генам ацетилтрансфераз и генам, входящим з состав цитохром-С-оксидазных кластеров других прокариот. Лишь этот Фрагмент был подробно секвенирован.

При поиске прямыми инвертированных,повторов в известных последовательностях Synechocystis РСС6803 чаще других встречался де-камер GGCGATCGCC, представляющий собой палиндром. Оказалось, что его встречаемость в цианобактериальных геномах примерно' в 10 раз превосходит его встречаемость в геномах других прокариот. Исследования цианобактериальных последовательностей содержащих декамер не обнаружили закономерного расположения палиндромов по отношению к кодирующим областям. Наличие в палиндроме сайта для Dam-метилазы позволяет предположить его участие в поддержании структуры и функциональной активности молекулы ДНК. Недавняя работа Gupta et al. (1993) показала, что в изолированном мутанте Synechococcus РСС6301, ген smtß был частично делетирован и вырезанный фрагмент с обеих сторон ограничивался палиндромами GCGATCGC. Авторы также отметили частотность палиндрома в геномах цианобактерий и дали ему название HIP1 .(Highly Iterated Palindrome).

Компьютерный анализ выявил в секвенированной последовательности семь ОРС. Сравнение потенциальных кодирующих фрагментов ДНК. и их возможных белковых продуктов с существующими базами данных, а также функциональные исследования позволили идентифицировать пять из семи ОРС: ген imirF, кодирующий UDP-MurNAc-пентапептидтсинтетазу (ЕС 6.3.2.15); ген rpll, кодирующий рибосомньгй белок L9; ген суШ, кодирующий цитохром С; ген суо, отвечающий за дозревание^цитох-ром-С-оксидазы; и ген act, кодирующий ацетилтрансферазу.

Крп!

Крп1

ЕсоШ ВатШ / АРа/ ЛРа1

\ .Г"/^гл

ЕсоШ

Г

ОРС249 1Р' <1чА

ОРС291

рЕЭПЬ

ОРС457

суШ грИ OPCN

И

рК>18

то МФ

111

суо асI

О о

' ■

а ■ с ■

I I I

8 > 9 10 11 12 13

14 15

16 17 18

Рис. 1 Генетическая карта исследованного фрагмента геномной ДНК цианобактерии БупесЬо-суэЫБ РСС6803. Участки фрагмента секвенированые при выполнении данной работы выделены жирной линией. Участки секвенированые лишь по одной цепи ДНК даны пунктиром. Изображены исходные плаэмиды и некоторые сайты рестрикции. Гены и ОРС над линией транскрибируется слева направо, под линией справа налево. Ромбы обозначают положение декамеоных палиндромов (ЗБЯЗАТССЗСС.

00 I

- 9 -

СТРУКТУРА ГЕНА КОДИРУЮЩЕГО РИБОСОМНЫЙ БЕЛОК L9.

Саузерн-блот показал, что rpU присутствует в одной копии в хромосоме Synechocystis РСС6803. В наибольшей1 степени, цианобакте-риальный белок гомологичен белкам из хлоропластов. хотя гомология с прокариотическими аналогами также высока. Нозерн-блот показал • наличие одного транскрипта гена rpll (Рис.2). Длина транскрипта составила 640 нукл., что совпадает с размером мРНК, рассчитанным по нуклеотидной последовательности.

О *

Рис.2. Влияние высокой температуры -на транскрипцию rpll-reна. изученное с помощью нозерн-блот анализа. Клетки выращенные при 34°С были перенесены с 34°С на 42°С на 0 мин (контроль), линия С; 15 мин, линия 1; 30 мин. линия 2; 60 мин., линия 3; 120 мин. линия 4; или 180 мин. линия 5. Линия R - клетки с 34°С были перенесены на 42°С на 180 мин и возвращены обратно на 34°С на 60 мин

(восстановление). На всех линиях нанесено по 5 мкг мРНК.

СТРУКТУРА ГЕНА. КОДИРУЮЩЕГО UDP-Mur-Mc-ПЕНТАПЕПТИД-СИНТЕТАЗУ

Саузерн-блот показал, что murF-ген присутствует в хромосоме Synechocystis РСС6803 в одной копии. Сравнение аминокислотных последовательностей mirF-генов Е.соИ и Synechocystis, показало, что 5елки имеют"39% идентичных аминокислот, большинство же замен гомологичны. Для проверки функциональной активности murF-гена Synecho-:ystts РСС6803 использовали условно-летальный штамм Е.соИ с поведенным murF-геном и, как следствие лизирующийся при температуре 12°С. Мутант, трансформированный плазмидами содержащими разные ¡ставки с полноразмерным murF геном, нормально росли при 42°с рис.З). Свидетельствуя о том, что murF ген цианобактерии Synecho-'.ystis РСС6803 может транскрибироваться и транслироваться в Е. соЛ, и что продукт экспрессии этого гена катализирует присоединение i-Ala-D-Ala к UDP-Mur-NAc-трипептиду.

Попытка получить мутантный штамм Synechocystis РСС6803 не венчалась успехом. Трансформанты медленно росли, и Саузерн-блот оказал, что в клетках, способных расти на канамицин-содержащей

среде, присутствовали как "дикая", так и нарушенная копии гшгР-гена, даже после пассирования и поддержания культуры на. среде с ка-намицином в течение года.

-«(4 -141

-128 +139 +2«8

murF

♦ pBS17 + pSA21 + pSA21S + pSA217

- PSX2116

- р5Л2118

- рЛВ92

- рВА1Э

Рис.3. Генетическая карта делеционных производных фрагмента des^ - 0РС291 из генома Synechocystis РСС6803. использованных для комплементации температурночувствительного штамма Е. coll с поврежденным murF-геком. Цифры слева обозначают расстояние в нуклеотидах от стартового кодона murF-гена Synechocystis РСС6803: "+" обозначает положительный результат комплементации, "-" обозначает отрицательный результат комплементации.

СТРУКТУРА ГЕНА. КОДИРУЮЩЕГО АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗУ.

Открытая рамка считывания, способная кодировать протеин из 212 аминокислот, была идентифицирована 10 т. п. н. ниже des/i-reHa (Рис. 1). Поиск гомологий в нуклеотидных и аминокислотных банках данных выявил значительную степень гомологии с ацетилтрансферазны-ми генами lacA, cysE, nodL и cat.

Продукт трансляции act-гена наиболее гомологичен хлорамфени-кол-ацетилтрансферазам (ХАТ). Саузерн-блот показал, что данный ген присутствует также в геномах Synechocystis РСС6714 и Synechococcus РСС7002. Ни один из этих штаммов не способен расти в присутствии хлорамфеникола, предполагая, что асt-ген не кодирует ХАТ или экс-прессируется в неизвестных условиях. Для проверки последнего предположения, act-ген клонировали под контоль tacZ-промотора-операто-ра. Клетки Е. coli, трансформированные такой плазмидой, высевали на среды, содержащие изопропил-тиогалактозид необходимый для индукции транскрипции act-гена с tacZpo. Добавление даже минимальных концентраций хлорамфеникола (5 мкг/мл) подавляло рост Е. coli свидетельствуя о том, что act-ген цианобактерии Synechocystis РСС6803 кодирует не ХАТ. а какую-то другую ацетилтрансферазу.

- 11 -

СТРУКТУРА ГЕНА суо И ОТКРЫТЫХ РАМОК СЧИТЫВАНИЯ 0РС457. 0РС291 И OPCN

ОРС, способная кодировать протеин из 316 аминокислот, была идентифицирована 9 т.п.н. низке гена desA (Рис.1). Поиск гомология в нуклеотидных и аминокислотных банках данных выявил значительное сходство с генами, входящими в состав генных кластеров, кодирующих структурные полипептиды цитохром-С-оксидазы (рис.6). Предполагается, что эти гены кодируют матуразу цитохром-С-оксидазы. Гену было дано название суо (cytochrome oxidase).

ОРС. способная кодировать протеин из 457 аминокислот, была идентифицирована между äesA- и murF-генами (Рис.1). 0РС291, способная кодировать протеин из 291 аминокислоты, была идентифицирована в 5'-области гена грЧ (Рис.1). Поиск гомологии в нуклеотид- • ных и пептидных банках данных не обнаружил значительной гомологии 0РС457 и 0РС291 с какой-либо известной последовательностью. Сау-зерн-блот показал, что 0РС457 и 0РС291 представлены единичными копиями в геноме Synechocystis РСС6803.

0PCN, способная кодировать протеин из более 219 аминокислот, была идентифицирована на комплементарной цепи ДНК в 3'-области 0РС291 (Рис. 1). 5'-область гена находящаяся в другом клоне (pES18) не была секвенирована по двум цепям, что позволило бы точно предсказать размер гена и возможного продукта трансляции.

СТРУКТУРА ГЕНОВ КОДИРУЮЩИХ ЦИТОХРОМЫ С Synechocystis.

Между генами rnrF и rpll Synechocystis РСС6803 обнаружили ОРС, гомологичную цитохромам с-типа. Ген был назван суШ и клонирован также'из Synechocystis РСС6714. Гены имеют два потенциальных сайта инициации трансляции. Мол. масса CytM равна 11.4 кДа, если второй метионин является реальным стартовым кодоном. Предсказанный профиль_гидрофобности белкового продукта гена суtM Synechocystis РСС6803 выявил.И-концевой гидрофобный домен, который может быть транзитным пептидом или мембранным якорем. Продукты суШ-гэнов Synechocystis содержат аминокислотный мотив V-L-A/G, удовлетворяющий-правилу "-3,-1" (von Heijne, 1986). Эти данные ведут к заключению, что продукты генов суtff могут процессироваться после транслокации в тилакоид или периплазму, и конечные продукты cytM-генов представляют собой гидрофильные белки с мол.массой 8.3 кДа и pi 7.3.

Для проверки экспрессируемости суШ-гена РНК изолировали из клеток Synechocystis РСС6803 росших в нормальных условиях, прй У/2 '■"С ¿7 °С jf cycc/yfY fc.ee Cfy* * ч- се/

. ' 's- с/ ' (/

условиях и затем инкубированных в темноте 16 ч. Ни в одном из этих случаев не удалось получить видимого гибридизационного сигнала, и для анализа экспрессии cytM-гена нужно искать условия отличные от перечисленных.

Саузерн-блот геномной ДНК, пяти цианобактерий с использованием cytM-гена Synechocystis РСС6803 в качестве зонда показал, что cytAf-ген представлен одной копией в геноме Synechocysits РСС6803. суШ-гены, присутствующие в Synechocystis. не представлены в геномах одноклеточных Synechococcus и геномах нитчатых цианобактерий.

Продукты генов, cytM наиболее гомологичны митохондриальным ци-тохромам С и цитохрому с-550 из В.sub tills (рис.4). К настоящему времени в синезеленых водорослях подробно изучены цитохромы с-553, менее подробно с-550 и лишь отрывочные сведения существуют о с-552. Аминокислотные последовательности CytM и CytA (кислый ци-тохром с-553 из Synechocystis РСС6803) гомологичны лишь на 19%. i Возможность того, что cytAJ-гены кодируют один из описанных цитох-ромов с-550 также невелика, т.к. с-550 имеют почти вдвое большую мол.массу и более кислый pi. Основной цитохром с-552, из A.nidu- ' tans имеет pi и мол.массу, сходные с предсказанными для продуктов генов cytM. Для определения возможности кодирования cytM-генат Synechocystis аналогичного цитохрома, и для выяснения физиологической роли CytM, был сконструирован мутант, в котором часть гена была замещена Кшг-кассетой. Копии cytM-гена дикого типа не были обнаружены, показывая, что мутантные клоны сегрегировали в стабильные культуры, утратившие нативные гены cytM (рис.5). Для сравнения- цитохромной композиции мутанта и дикого типа, и выяснения .возможности кодирования cytM-геном аналога цитохрома с-552 из А. • nldulan§ мы анализировали соответствующие белковые фракции из клеток дикого типа и AcytM-мутанта. Цитохром с мол.массой 9 кДа присутствовал и в диком типе, и в мутанте Synechocystis РСС6803 показывая, что суШ ген не кодирует аналог цитохрома с-552 из A. nidu-lans (.Holton and Myers, 1967), но кодирует новый цитохром С-типа.

Предсказанные pi пластоцианина и цитохрома с-553 из Synechocystis. РСС6803 равны 5.6 и 5.3, соответственно. Изменение специфического реакционного партнера, например ФС I, привело к параллельному изменению pi пластоцианинов и цитохромов с-553 (Но and Krog-mann, 1984), и видимо, CytM имеет низкое сродство к ФС I. CytM более гомологичен цитохрому с-553 из АпаЪаепа в которой с-553 способен донировать электроны на Р^, й ааВозможно гены cytM и cytA

Jfa^Cs/wcyb-tf 'S t

- lb -

cytM-6803 HAPVlEKSPtVATVNASPTGtm—HA&IVSL—VILA-V-ALF3—FHNFD ***** * * ******* ** *** *** * * **** * ***

cytM-6714 HAPVIDKNVTFTKVNASPTGHUI—HAGLVSL—НШ-У—V-ALFS—F1NFD

* * ** *

553-6803 MFKLFNQASRIFFGIALPCLIFLGGI

* *.** *.* ***. *

553-Ana MKKIFSL—VLL—GXALFT—FA---

*. . . ** * * .* *

550-Bac MKWNPLIPFLLIAVLGI—GLTFFLS-VKGLDDSREIG—

cytM-6803

cytM-6714

553-6803

553-Ana

550-Bac

C-Tetr

C-carp

PYV-SQVLALKGDAD-RGRAIFQAI * **** * * * ********!

PYV-SQVL6LEGNAE-RGRAXFQAI ** * *.***

FSLGNTALA—ADL-AHGKAIFAVI * ** .* * **.*<

FS—SPALA—ADV-ANGAKIFSAI

* * **.

**

ASGGESKSAEKKDANASPEEIYKANpl ACrç»< * . , * **** ** **. ,

P-KEPEVTVPEGDAS—AGRDIFDSQfcSAC ^ ** * .*. .* k* **

GDVE-KGKKVFVQK:AQC

ъ-

AVCI ***

АУСф »* *■

:aaci »* **

:ascHAI

------IQADGYIGPSLU1GVSQRRSQSHXIHQ

* ******** ** ** ** ** *

■VQGDGYIGPSLRGVAORKSOGHIVRO • . * *. *

¡GGLNAINPPKTLKMADLEANGKNSVAAIVAQ ***. * ** *

iGGKNUVQAQKTLKKEDLEKFGHYSAEAIIAQ

----ENYEGVSGPSLKGVGDKKDVAEIKTK

*.**. * ** **,

----IEGDSTAAPVLGGVIGRKAGQE-KFA

----VZBKHKVGPNLUGLFGRKTGQAPGFS

CylM-6803 VVSGOTP------------------------PMPQFEP—NP-Q-EMADLLNY-LKTi.

******* ***** * ** * ****** * ***

CytM-6714 VVSGOTP------------------------PMPQFQP—NP-Q-EMADLLDY-LKTV

* «* * - * * * *

553-6803 ITNGNGA----------------------«-HPGFKGRISD90HE—DVAAYVLDQAEKGUI

*..*... ** *.. * * * *, *,»

553-Ana VTNGKNA-------------------------HPAFKGRLKPDQ 1С—DVAAYVLGQADKSUK

550-Bac 1EKGGNG-------------------------MPS—Gt-V—PADKLD—DHAEU*. ÇKXK

. * . *.«.*.. ***. * **.*

C-Tetr YSKGMKGSGXTUNEKHLFVFLKNPSKHVPGTKHA-FAGL—PADKDRADLIAY-LKSV . ... . * * . . « ***. * **,

C-carp YTBABKSKGIVWBZZTLMEYLZBPKKYIPGTKMI—FAGXKK--KGER^DLIAY-LKSATS

Рис.25. Продукты трансляции cytM-генов в сравнении с различными цитохромами. Звездочки - аминокислоты идентичные хотя бы одному из продуктов cytAf, точки - гомологичные замены. Транзитные пептиды подчеркнуты, суtw-6803, продукт гена суШ Synechocystis РСС6803; cytM-6714, суШ Synechocystis РСС6714; 553-Ana, с-553 Anabaena РСС7937; 553-6803, с-553 Synechocystis РСС6803; 550-Bac, c-550 B.subtllls; C-Tetr, цитохром Г.руг!-formls; C-carp, цитохром карпа. В рамке - гем-связывающий сайт.

гена произошла в связи со специализацией по переносу электронов на Р700 (cytA) или на аа3 (суШ).

Мутант, лишенный су£М-гена. рос фотоавтотрофно в стандартной среде Вв-И и в среде без меди с тойже скоростью, что и дикий тип. Измерение выделения 02 на свету и поглощения 02 в темноте не выявили существенной разницы в поведении мутанта и дикого типа. Применение ингибиторов и протонных разобщителей или 'добавление глюкозы (1 мМ). также не выявило различий.

Анализ полипептидной композиции, нозерн-блот и отсутствие фе-нотипических различий позволяют предположить, что в тестированных условиях ген суЬМ неактивен. Предположения относительно участия продукта трансляции гена суШ в переносе электронов по дыхательно!" цепи нуждаются во всесторонней экспериментальной проверке. Активность дыхания повышается в условиях хемогетеротрофного роста или при повышении солености среды. Использование сконструированного мутанта позволит характеризовать физиологическую функцию нового цитохрома. Нами синтезированы два олигопептида представляющих гид рофильные участки Су1М. К олигопептидам получены антитела и, веро ятно, их применение для иммуноблотов позволит охарактеризовать но вый цитохром на уровне белкового продукта.

Рис.5 Саузерн блот анализ геномной ДНК изо- ^ , ;

лированой из дикого типа и ДсуШ мутантов тип Ас^И

AKOAKOAKG

Synechocystls РСС6803. Буквы обозначают эндонуклеазы использованные для рестрикции геномной ДНК: A. Aval: К. Kpnl: 0. £со0109. Б результате встраивания Кшг-гена, в хромо- ° . „ сомах мутантных клонов образовался допол- о®

нительный Aval сайт. Вследствие этого, о

гибридизующийся фрагмент геномной ДНК из мутанта, мигрирует быстрее чем гибридизу- » юдися фрагмент из геномной ДНК дикого типа .]

(линии А). Геномная ДНК наносилась на 0.8% -. - ;

э ■ -—,

гель в количестве 3 мкг на линию.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ К0Д0Н0В В Syr^chocystis РСС6803 И ВЫСШИХ РАСТЕНИЯ) В таблице приведены результаты анализа использования кодонс в Synechocystls РСС6803 в сравнении с использованием кодонов в ( но- и двудольных растениях (Murray et al.. 1989). Общей практик!

геном с целью облегчить получение продукта трансляция. Цианобакте-рии, как фотоавтотрофные акцепторы чужеродных генов, представляют в этой связи особый интерес. Данные полученные нами, показывают, что редкие для Synechocystis РСС6803 кодоны, как правило редки и в высших растениях. Исключение для часто используемых аминокислот (Leu, Thr, Pro, Ala. Glu. Ser, Ile. Gly, Val) составляют в двудольных АСА - Thr, CCA - Pro, GCA - Ala, ATA - Ile, GGA - Gly. что, видимо, будет снижать эффективность трансляции с мРНК двудольных. Для однодольных использование кодонов более сходно ». н« соответствующих кодонов лишь два (CCA - Pro, GAG - Glu) и видимо, экспрессия их генов не будет снижаться.

S D M S D M

TTA-Leu 452 16 10 2 TCT-Ser 258 17 25 13

TTG-Leu 840 29 26 9 TCC-Ser 583 38 18 29

CTT-Leu 258 9 28 13 TCA-Ser 68 4 19 8

CTC-Leu 473 16 19 38 TCG-Ser 86 6 6 17

CTA-Leu 269 9 8 5 AGT-Ser 270 .18 14 6

CTG-Leu 596 21 9 33 AGC-Ser 271 18 18 27

CGT-Arg 289 23 21 10 ATT-Ile 1070. 60 45 21

CGC-Arg 325 25 11 40 АТС-Ile 661 37 37 71

CGA-Arg 93 7 8 3 -, ATA-Ile 48 3 18 8

CGG-Arg 427 33 5 14

AGA-Arg 73 6 30 8 AAT-Asn 477 47 45 23

AGG-Arg 76 6 25 25 AAC-Asn 527 52 55 77

АСТ-ТПг 342 23 35 18 GGT-Gly 829 38 34 17 •

ACC-Thr 862 57 30 49 GGC-Gly 653 30 16 45

ACA-Thr 120 8 27 11 GGA-Gly 257 12 38 16

ACG-Thr 177 12 8 22 GGG-Gly 434 20 Ï2 22

CCT-Pro 242 18 32 15 GTT-Val 486 24 39 17

CCC-Pro 749 56 17 28 GTC-Val 339 17 20 40

CCA-Pro 125 9 42 27 GTA-Val 315 16 12 6

CCG-Pro 212 16 9 30 GTG-Val 855 •43 29 37

GCT-Ala 721 29 42 21 ATG-Met 598 100

GCC-Ala 1183 47 27 43 ATG-fMet 87 92

GCA-Ala 213 9 25 12 GTG-fMet 7 7

GCG-Ala 372 15 6 24 TTG-fMet 1 1

AAA-Lys 817 70 39 14 CAA-Gln 669 59 59 40

AAG-Lys 356 30 61 86 CAG-Gln 463 41 41 60

GAT-Asp 720 59 58 24 TAT-Tyr 404 46 43 16

GAC-Asp 505 41 42 76 TAC-Tyr 471 54 57 84

GAA-Glu 1215 76 49 21 TGT-Cys 130 54 44 27

GAG-Glu 382 24 51 79 TGC-Cys 110 46 56 73

CAT-Hls 197 40 54 30 TTT-Phe 709 57 45 20

CAC-Hls 299 60 46 70 TTC-Phe 531 43 55 80

TGG-Trp 403 100 TGA-stop 10 10 33 37

TAA-stop TAG-stop 49 36 52 38 48 19 35 27

Приведено общее число каждого из кодонов в генах БупесНосузИз РСС6803 и процентное содержание каждого из триплетов кодирующих

АНАЛИЗ КЛАСТРИРОВАНИЯ ГЕНОВ Б-ЦИАНОБАКТЕРИЯХ И ДРУГИХ ПРОКАРИОТАХ

Как видно из'рис.1, в секвенированном фрагменте ДНК подряд расположены гены, отвечающие за синтез десатуразы жирных кислот; фермента, вовлеченного в формирование клеточной стенки; вовлеченного в метаболизм Сахаров; рибосомноГо белка; белка, участвующего в транспорте электронов и т.д. Такая организация генома Synechocystis представляет большой интерес для изучения'механизмов координированной экспрессии генов, кодирующих мультибелковые комплексы. Знание организации генома и первичной структуры генов необходимы как для выяснения таксономического положения биологических видов, так и для понимания эволюционных зависимостей. По результатам секвенирования, компьютерного и функционального анализа столь протяженного фрагмента хромосомы Synechocystis представляется возможным делать выводы об общей организации цианобактериального генома. Некодирующие участки между генами невелики, что характерно для прокариот.

Как видно из рис.6 расположение генов и ОРС в анализированных участках двух штаммов Synechocystis во многом совпадает. Результаты частичного секвенирования фрагмента генома Synechocystis РСС6714 показали, что помимо высокой степени гомологии между генами cytM, 0РС291, 0PCN и ген rpll, в двух штаммах Высоко-гомологичны друг другу. Различие в 3'-области cytM-гена может быть обусловлено встраиванием между cytM- и murF-генами Synechocystis РСС6714 последовательности гомологичной генам транспозаз. При этом вполне возможно, что данный фрагмент действительно представляет собой IS, и подобная перестройка не является эволюционно сложившейся.

Чрезвычайно интересным представляется факт, что гены mrF, rpll и суо являются частью соответствующих кластеров в геномах других прокариот. Ген nrarF в хромосоме Е. coll кластрирован с другими генами, вовлеченными в синтез клеточной стенки и деление. Ген rpll в хромосомах Е. coll и С. trachomatis также кластрирован с другими генами рибосомных белков. Ген суо (или его аналоги) также находите^ в непосредственной близости от функционально связанных цитохром-оксидазных генов в P. denltrlficans. Е, coll и В. subti-lis. Из рис.6 видно, что Synechocystis существенно отличается от других прокариот, в геномах которых преобладает кластерное расположение функционально связанных генов.

dtsA

OPC457

Synechocystis FCC6714 E.coli-cyo E. coll-mur

JZ

murF

OPC291

eyo get а~с£гашаА,'тш>1 l i

cytM rpll OPCN ОРС2Э1

Is ? cytil rpll OPCN

_ cyoD

суоЛ сувВ СУ°С г——, сувЕ

'—II И ^—I

mii/F OPCY murD fliW murG murC

--------1 I-1 I-1 1. I

JL

E.coll-rp

_L

J.

rpll rpsR OPC rpsF

wim

_L

-L

_L

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Рис.27 Исследованные фрагменты геномных ДНК Synechocystis РСС6803 и Synechocystis РСС6714 в сравнении с соответствующими генными кластерами E.coll. Обозначения совпадают с рис.1. Сокращения: E.coll-cyo, кластер цитохром оксидазных генов E.coll (аналогичные кластеры найдены в хромосомах B.subtllls и P.denl ~rif leans); Е.coll-mur, кластер генов E.coll ответственных за синтез муреина и деление клеток; E.coll-rp кластер генов E.coll ответственных за синтез рибосомных белков (аналогичный кластер найден в хромосоме С. trachomatis).

I

- 18 -ВЫВОДЫ

1. Определена первичная структура des/1-ген содержащего фрагменте ДНК цианобактерии Synechocystis РСС6803 длиной 12 т.п.н.

2. В секвенированном фрагменте идентифицированы гены кодирующие:

a) UDP-MurNAc-пентапептид-синтетазу (ЕС6.3.2.15)(ген murF);

b) рибосомный белок L9 (ген rpll);

c) новый цитохром С (ген суЩ;

d) матуразу, отвечающую за дозревание цитохром оксидазы С (ген суо);

e) новую ацетилтрансферазу (ген act).

3. Изучена физиологическая активность, гена murF. Показана способность гена murF из Synechocystis РСС6803 комплемен-тировать мутацию по этому гену в условно летальном штамме E.coli JE6607. -Показано, что мутация по murF-гену является летальной для Synechocystis РСС6803.

4. Изучена экспрессия гена rpll. С помощью нозерн-блот анализа показано, что ген rpll транскрибируется в мРНК длиной 640 нуклеотидов, что соответствует ожидаемому из нуклеотидной последовательности гена размеру. Синтез транскрипта подавляется тепловым шоком. -

5. Сконструирован мутант Synechocystis РСС6803 с инактивиро-ванным суШ-геном и показано, что в нестрессовых условиях мутация по этому гену не влияет на скорость роста и жизнеспособность изученного штамма. Экспрессия этого гена не выявлена в нормальных условиях, в условиях пониженной температуры. теплового шока, при отсутствии меди в среде и при инкубации в темноте в течение суток. Не обнаружено также различий в белковом составе мутанта и дикого типа в

' стандартных условиях и при отсутствии меди в среде. Функция нового цитохрома и условия его экспрессии остаются неизвестными.

6. Клонирован и секвенирован cytM-ген из цианобактерии Synec-hocuzits РСС6714 и показана высокая степень гомологии ко. дарующих и некодирующих областей cytM-генов из двух изученных штаммов Synechocystis. Охарактеризован так же суШ-ген содержащий фрагмент генома Synechocystis РСС6714 и показано, что расположение идентифицированных генов в хромосомах Synechocystis РСС6803 и 6714 частично совпадает.

7. В геноме Synechocystis РСС6714 идентифицирована последовательность гомологичная генам транспозаз из Sacharopolyspo-ra erythraea и Anabaena. Это первая встрвивающаяся последовательность для рода Synechocystis, и на ее основе могут быть созданы новые интеграционные векторы для трансформации цианобактерий.

8. Проведен компьютерный анализ известных нуклеотидных последовательностей цианобактерии Synechocystis РСС6803 и идентифицирован частотный декамер RGCGATCGCY. Показано, что данный декамер встречается в геномах цианобактерий в 10 раз чаще, чем в геномах других прокариот, что может указывать на участие данного декамера в репликации и репарации ДНК цианобактерий.

9. Осуществлен сравнительный анализ использования кодонов в генах Synechocystis РСС6803 и высших растений и показано, что стратегии кодирования в генах данной цианобактерии' и . однодольных растений сходны, и изученный штамм синезеленых водорослей может быть использован ь качестве акцептора генов однодольных растений.

! 0. Показано, что циан о бактериальный геном,, как и геномы других прокариот практически не содержит некодирующих областей. но отличается отсутствием кластрирования генов входящих в состав кластеров у других прокариот.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Malakhov М.. Wada Н., Los D., Sakamoto Т., Murata N. Structure of a cyanobacterial gene for the 50S rlbosomai protein L9. Plant Mol.Biol.-1993.-V.21.-P.913-918.

2. Malakhov M.P., Wada H., Los D. A., Murata N. A new cytochrome gene of Synechocystis PCC6803 // Photosynthesis Researsh.-1992. -V.34.-N. l.-P. 150.

3. Malakhov M.. Wada H.. Los D.. Murata N. A gene for a new c-type cytochrome of Synechocystis PCC6803 // submitted to FEBS Lett.

4. Малахов M.П., Семененко В.E. Использование кодонов в генах цианобактерии Synechocystis РСС6303 // Физиология растений 1994.

N. 2.