Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция экспрессии генов десатураз жирных кислот: молекулярные механизмы низкотемпературной адаптации

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Регуляция экспрессии генов десатураз жирных кислот: молекулярные механизмы низкотемпературной адаптации"

\ г о оа 1 1 ИОЙ да

На правах рукописи

ЛОСЬ Дмитрий Анатольевич

РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ДЕСАТУРАЗ ЖИРНЫХ КИСЛОТ; МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЙ АДАПТАЦИИ

03.00.12 - физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в Отделе внутриклеточной регуляции и биотехнологии фотоавтотрофных биосинтезов Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской Академии Наук

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор

В.Е. Семененко

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук

С.В. Шестаков Э.С. Пирузян В. В. Кузнецов

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н.Баха Российской Академии наук

Защита состоится " " ноября 1996 г. в // час. на заседании Докторского Совета Д.002.45.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН (127276 Москва, Ботаническая ул., 35)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН

Автореферат разослан октября 1996 г.

Ученый секретарь Докторского Совета кандидат биологических наук

Н.В. Загоскина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актусиъпостъ работы. Живые организмы способны приспосабливаться к меняющимся условиям окружающей среды, подключая раангчные механизмы адаптации. Центральной проблемой исследования при этом является изучение принципов внутриклеточной регуляции, позволяющей организму изменять направленность или интенсивность метаболизма, так чтобы динамика внутриклеточных процессов оптимальным образом обеспечивала его жизнедеятельность. В последние годы предпринимаются многочисленные попытки выявления и изучения путей передачи низкотемпературного сигнала в растениях. Низкие температуры вызывают сильные изменения всего клеточного метаболизма. Эти изменения включают десатурашпо жирных кислот (чему целиком посвящена данная работа), накопление полиолов, аминокислот, глипин-бетаина, сахарозы, многочисленных белков и индукцию огромного числа генов. Среди генов, индуцируемых низкими температурами, гены дегидринов; белков позднего эмбриогенеза; белков, индуцируемых абсцизовой кислотой; лнпид-переносящих белков; фактора элонгации трансляции; некоторых рибосомальных и других РНК-связывающих белков. Перестройка клеточного метаболизма при изменении температуры происходит согласованно под строгим контролем генетического аппарата клетки. Таким образом, изучение регуляции адаптивной регуляции экспрессии генов является необходимой и основной задачей для понимания механизмов адаптации.

Изучение механизмов адаптации растений к меняющимся условиям среды является не только академической проблемой. Современные возможности направленного изменения биохимических путей с помошыо генетической инженерш! предлагает ученым, работающим в области молекулярной биологии, биохимии и физиологии растений, неограниченное поле деятельности для модификации метаболизма трансгенных растений в сторону получения ценных специфических продуктов. Одна из стратегии развития прикладных исследований состоит в создании новых конкурентных продуктов, позволяющих расширить имеющиеся или создать новые рынки сбыта. При этом наблюдается тенденция поворота напраштения исследований от создания новых сортов растений для поднятия урожайности к поиску и дизайну таких сортов, которые производили бы ценное сырье или очень специфические химические соед1шения для нужд промышленности и ме-

дншшы. В частности, жирные кислоты растений нашли широкое применение в промышленности в качестве смазочных и шлифоваль-ньгх материалов, размягчителей и т.п. Фактически треть всех производимых в мире растительных масел уже используется не для пищевых нужд. Таким образом, кроме непосредственного использования в пищу, масляные культуры растений могут рассматриваться как эффективные, безопасные для окружающей среды, химические заводы, преобразующие солнечную энергию в огромное количество ценных химических продуктов с широчайшим спектром использования. Успехи в создании новых растительных масел обещают принести немалую выгоду: во-первых, сокращение государственных дотаций на производство сельскохозяйственной продукции; во-вторых, предоставление обновляемого сырья для промышленности с вытеснением дорогих, иногда импортируемых, продуктов нефтяной переработки; кроме того, может быть повышено качество тех двух третей производимых растительных масел, которые используются в пищевой промышленности, что обусловит долгосрочные выгоды, поскольку способствует улучшению здоровья населешш.

Знание биохимических путей и молекулярных механизмов биосинтеза жирных кислот и лнпндов в растениях необходимы для понимания механизмов адаптации растений к меняющимся услов(шм окружающей среды. Так, последние два десятилетия огромное внимание уделяется молекулярным механизмам холодоустойчивости растений. В 1973 году была предложена гипотеза, согласно которой первичная роль в способности растений к перенесению холода отводилась мембранным липидам, в частности, их свойству фазовых переходов в зависимости от температуры окружающей среды (Lyons, 1973; Raison, 1973). При воздействии низких температур мембраны с разделенной фазой становятся неспособными поддерживать ионные градиенты, и клеточный метаболизм становится разобщенным, что в конце концов приводит к гибели клеток и всего организма. Способность растительных клеток к адаптации в таких условиях связывается с их способностью к изменению текучести мембран посредством изменения количества ненасыщенных жирных кислот в мембранных липидхх. Знания биохимии п молекулярной биологии десатураз жирных кислот открывает широкие перспективы в области биотехнологии и сельского хозяйства, поскольку позволяет создание сортов и видов растений, способных переносить ограничения той или иной климатсиеской зоны.

Цели и задачи исыедования. Целью настоящей работы являлось выяснение структурных и биохимических особенностей десатураз жирных кислот, молекулярно-генетических механизмов регуляции экспрессии генов десатураз, а также роли этих ферментов в адаптации растительных клеток к условиям понижения температуры окружающей среды. Задачи работы были следующие:

1. Клонировать различные гены десатураз жирных кислот с целью изучения структурных особенностей соответствующих ферментов.

2. Изучить особенности температурозависимой экспрессии генов десатураз с целью выяснения их роли в адаптации организма к низким температурам: на уровне транскрипции; на посттраскрипционном уровне, на уровне трансляции.

3. Изучить особенности внутриклеточной локализации десатураз с целью выяснения их роли в адаптационных изменениях мембран растительной клетки в условиях снижения температуры окружающей среды.

4. Исследовать роль десатураз жирных кислот в способности организма к адаптации к низким температурам.

5. Изучить зависимость экспрессии генов десатураз от текучести биологических мембран с целью выяснения первичных клеточных сенсоров изменения температуры окружающей среды.

6. Изучить молекулярные механизмы, передающие сигнал изменения температуры окружающей среды к регуляторным областям генов, необходимых для адаптации.

Научная новизна работы. На основе знаний первичной структуры и особенностей аминокислотных последовательностей десатураз жирных кислот, представлена схема строения и расположения десатураз в мембранах. Впервые изучены особенности температурозависимой экспрессии генов десатураз. Показано, что синтез полиненасыщенных жирных кислот при снижении температуры происходит благодаря индуцированному синтезу соответствующих десатураз. Впервые изучены особенности внутриклеточной локализации десатураз. Показано, что десатуразы цианобакхерий локализованы как в тилакоидных, так и в шггоплазматической мембранах клетки. Установлено, что десатуразы выецпгх растений характеризуются высокой специфичностью локализации. Выявлено, что Д12 десатураза РА02 АгаЫИорвя ЛаИапа, ранее считавшаяся ферментом эндоплазматического ретикулума, локализована в шггоплазматической мембране. Продемонстрирована

температурная зависимость накопления РАО2 в шггоплазматической мембране корней и листьев АгаЬМорБ'и. Таким образом впервые экспериментально доказана роль цитоплазматической мембраны, как места синтеза полиненасыщенных жирных кислот, в низкотемпературной адаптации. Впервые исследована роль индивидуальных десатураз жирных кислот в способности организма к адаптации к низким температурам. Продемонстрирована непосредственная связь адаптивных свойств клеток со способностью к синтезу полиненасыщенных жирных кислот. Показана ключевая роль Д12 десатуразы в низкотемпературной адаптации. Впервые экспериментально показана прямая зависимость экспрессии генов десатураз от текучести биологических мембран и высказано предположение о сенсорной роли цитоплазматической мембраны в адаптивном ответе растительных клеток при измене-нни температуры окружающей среды. Предложена схема молекулярных механизмов адаптации растительных клеток к низким температурам.

Научная и практическая значимость. Получены новые данные о структуре, экспрессии и субклеточной локхтизации десатураз жирных кислот в клетках растений и цианобактерий, а также исследованы механизмы регуляции генов десатураз в зависимости от меняющихся условий окружающей среды. Полученные данные могут служить основой для выведения и генетического конструирования растений, устойчивых к низким температурам, а также для конструирования штаммов бактерий - продуцентов жирных кислот для нужд промышленности и медицины. Данные представленные в работе могут послужить основой для создания лекционных курсов для студентов биологических специальностей.

Апробация работы. Результаты исследований и основные положения диссерташш доложены и обсуждены на следующих научных конференциях: 8-м Международном фотосинтетическом конгрессе (Швеция, 1989), Международной конференции "Биохимия и молекулярная биология мембран и запасных липидов в растешшх" (США, 1992), 9-м Международном фотосинтетическом конгрессе (Япония, Нагойя, 1992), 15-м Международном ботаническом конгрессе (Япония, Иокогама, 1993), 32-й Международной конференции Национального Института общей биологии "Стресс-индуинруемые гены растений с акцентом на их функшш" (Япония, Оказаки, 1994), 11-й конференции по лишшам растений (Франция, Париж, 1994), Ежегод-

ной конференции Японского Общества физиологии растений (Япония, Цукуба, 1994), 4-м Международном конгрессе по молекулярной биологии растений (Голландия, Амстердам, 1994), 17-й Конференции японского общества молекулярной биологии (Япония, Ко-бэ, 1994), 10-м Международном фотосинтетическом конгрессе (Франция, Монпельер, 1995), Семинаре "Гены и их продукты в устойчивости растений к физическим стрессам" (Италия, Маратеа, 1995), Семинаре по передаче сигналов (Япония, Йокогама, 1995), Зб-й Международной конференции Национального Института общей биологии "Стрессовые сигналы и стрессовые ответы в растениях" (Япония, Оказаки, 1996), 12-й конференции по липидам растений (Торонто, Канада, 1996), Международном симпозиуме по стрессу и ассимиляции неорганического азота (Россия, Москва, 1996).

Публикации. ГТо результатам исследований опубликовано 57 работ, непосредственно по материалам диссертации опубликовано 34 работы.

Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: 7 глав, включающих результаты, обсуждение, обзор литературы и методы исследования, заключение, выводы, список цитируемой литературы. Работа изложена на 223 страницах машинописного текста, содержит 41 рисунок, 16 таблиц, список литературы включает 435 наименований.

о

1. ГЛИЦЕРОЛИПИДЫ И ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ ЦИАНОБАКТЕРИЙ

Глицеролипиды. Цианобактерии содержат 4 основных класса глнцеролипидов: моногалактозшщиацилглицерин (МГДГ). дигалакто-зюдиацил глицерин (ДГДГ), сульфохиновозилдиацнлглицерин (СХДГ) и фосфатидилглшерин (ФГ), а также в минорных количествах встречается глюкозилдиацилглицерин (ГлДГ)- МГДГ составляет около 50% от всех глнцеролипидов, ДГДГ, СХДГ и ФГ дают до 10-20%, а ГлДГ не превышает 1%. ГлДГ служит для первых предшественником в синтезе МГДГ. В целом, однако, процесс биосинтеза глнцеролипидов в цианобактериях изучен недостаточно.

Жирные кислоты. Жирные кислоты встречающиеся в цианобактериях - 16:0, 16: li9, 16:2Л9-12, 18:0, 18:1Л9, 18:1Л11, 18:2i9.12, lS:3i.9,i2.J5(-3)j 18:3^-».12 и lS^-MUSCO). Все цианобактерии могут быть классифицированы на 4 группы по содержанию жирных кислот. Штаммы группы 1 содержат только насыщенные и мононенасыщенные (16:1"19 и IS: Lжирные кислоты. Группа 2 характеризуется наличием а-лнноленовой [3:3Л5.12,15("3) кислоты. Группа 3 имеет у-линоленовую кислоту, IS^-9-12, а группа 4 - 18:4^.9.12,15<«3)_ Отсутствие в цианобактериях десатурации жирных кислот в формах ацил-АПБ или ацил-КоА, когда переносчиками жирных кислот являются ацил-переносяишй белок, либо ацил-коэнзим А, подтверждается экспериментами на Synechococctis sp. РСС 7942, Anabaena variabilis и iVostoc. По всей видимости, отсутствие ацил-АПБ и ацил-КоА десатуращш характерно для всех цнанобакгерий. Десатуразная акпганость в этих организмах ассоциирована только с мембранами (Wada et al., 1993а,b), поэтому следует предположить, что в цианобактериях десатураши жирных кислот осуществляется в липид-связанной форме.

Специфичность десатурации может быть рассмотрена с двух позиций: 1) Специфичность к положению жирной кислоты на глицериновой молекуле (s/i-положение). 2) Специфичность узнавания позиции десатурации в углеродной цепи жирной кислоты. Глицеролипиды характеризуются наличием двух жирных кислот в положениях s/i-l и sn-2 на глицериновой молекуле. Таблица 1 суммирует знания, о способах десатурации жирных кислот в различных группах цнанобактерий. Общим свойством десатураз высших растений и цианобакгерий является их высочайшая специфичность к положенюо углеродных атомов, между которыми эти ферменты образуют двойную связь. Synechocystis sp.

РСС 6803, принадлежащий к 4-й группе, десатурирует Cls жирные кислоты только в положении sn-1. Специфика образования двойных связей была изучена при добавлении в среду роста гегггановой (Суд), либо гексановой кислот (С&о). Добавление С^ не повлияло на жирно-кислотный состав. Добавление С7:о привело к синтезу Си, С17 и С15 жирных кислот со всеми их производными: 15:0, 15: li9, 17:0, 17:1ЛЭ, 17:2*4 17:2^.12, 17:3^9.12, 17:3Л9-12-14 и 17:4^.9.12.^, а так же 19:0, 19:1Л', 19:2*4 19:2^, 19:3^9.12, 17:349.12-16 и 19:4^.12.16. Ясно, что четвертая двойная связь образуется в о-положении, т. е., отсчет происходит от карбоксильного конца. Поэтому Д15 де сатур аза переименована в свЗ десатуразу (Higashi and Murata, 1993). В дальнейшем мы будем придерживаться именно этой классификации десатураз.

Таблица 1. Способы десатурацин жирных кислот в цианобактериях.

Д - ПОЗИЦИИ ДЕСАТУРАЦИИ

МГДГ и ДГДГ СХДГ и ФГ

S/7-1 (С, 8) sn-2 (С, 6) S/J-1 (С, 8) 5/7-2 (С, 6)

Группа 1 9 9 9 нет

Группа 2 9, 12, 15 9, 12 9, 12, 15 нет

Группа 3 6, 9. 12 нет 9, 12 нет

Группа 4 6, 9, 12, 15 нет 9, 12, 15 нет

Практически все живые организмы способны к изменению степени ненасыщенности жирных кислот в ответ на меняющиеся условия окружающей среды: температуры, интенсивности света, концентрации соли и осмолитов. При снижении температуры с 38 до 22°С содержание 18:1 в Anabaena variabilis снижается с 20 до 10%, в то время как содержание 18:3 возрастает с 0.1-0.5% до 25-30% за 48 часов. Содержание 18:2 возрастает за первые 6-10 часов воздействия низкой температуры, а затем снижается, поскольку 18:2 служит субстратом для иЗ десатура-зы. В Synechocystis sp. РСС 6803 снижение температуры с 34 до 22°С также приводит к снижению содержаши моно и диеновых жирных кислот и к накоплению терминальных продуктов десатурации - ctlS:3 и 18:4. Аналогичный ответ наблюдается и в других цианобактериях, водорослях, высших растениях, и животных.

Особенно важным адаптивным свойством фотосютгезируюших организмов является способность адаптировать свои мембраны при

изменении интенсивности света. У Chlorella происходит накопление а-линоленовой кислоты, у красной водоросли Porphyridium значительно повышается содержание эйкозапентаеновой кислоты (20:5). Мы исследовали влияние интенсивности света на синтез полиненасыщенных жирных кислот в цианобактерии Synechocystis IPPAS В-284 и выяснили, что при возрастании интенсивности света увеличивается содержание линолевой и у-линоленовой кислоты.

2. ГЕНЫ ДЕСАТУРАЗ ЖИРНЫХ КИСЛОТ

Первый ген десатуразы был клонирован из печени крысы. Стеа-рил-КоА-десатуразу из Saccharomyces cerevisiae клонировали путем комплементации мутанта olel, дефектного по Д9 десатуразе и неспособного к росту на среде без добавления олеата. Гомрлогия между этими белками составила лишь около 40%, однако кДНК Д9 десатуразы крысы, экспрессированная в мутантных дрожжах, успешно ком-плементировала o/el-мутацига.

Июиировапие генов десатураз цианобактерии. Впервые ген ацил-липиднои десатуразы был клонирован из цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6S03 (Wada et al., 1990). Мутант, дефектный по Д12 десатуразе (Fadl2), неспособен «штезировать 18:2, 13:3 и 18:4 жирные кислоты и расти при низкой температуре (22°С). Комплементация мутации различными фрагментами ДНК из Synechocystis дикого нота привела к выделению фрагмента, несущего ген А12 десатуразы, desA. Ген Дб десатуразы, desD, из Synechocystis sp. РСС 6803, был клонирован с помощью экспрессии фрагментов ДНК в Anabaena variabilis, неспособной к десатурации в Дб положении (Reddy et al., 1993). Ген шЗ десатуразы, desB, клонирован с использованием метода гетерологичной гибридизации зонда desA с фаговой библиотекой Synechocystis 6S03::Arfes/l -штамма полученного при замещении полной кодирующей последовательности desA геном устойчивости к канамицину. Это исключило гибридизацию зонда с гомологичным участком хромосомной ДНК, увеличив вероятность получения большого количества позитивных сигналов при гибридизации с искомым desB геном. Гомология между продуктами desA и desB составила всего 28%. Ген Д9 десатуразы был клонирован из цианобактерии по счастливой случайности. При клонировании desA из Anabaena variabilis обнаружилось, что вверх по течению от этого гена находится еще один ген, напоминающий по струк-

туре ацил-липидную десатуразу. Этот ген, названный desC, был экс-прессирован в Escherichia coli, неспособной к десатурации в Д9 положении. Экспрессия пршела к накоплению олеиновой кислоты, что явилось подтверждением десатуразной природы вновь обнаруженного гена (Sakamoto et al., 1994b). Данные по десатуразам Synechocystis суммированы в Табл. 2.

Структура генов десатураз. Десатуразы цианобакгерий представляют собой полипептиды примерно одинакового размера. Несмотря на общее свойство десатураз - дегидрогеназную активность, эти ферменты значительно отличаются друг от друга по первичной структуре. Важной объединяющей особенностью, вытекающей из анализа первичной структуры десатураз, является наличие в полипептидных последовательностях трех гистидиновых кластеров, по всей видимости участвующих в связывании атомов железа в активном центре десатуразы. Таблица 3 показывает расположение и структуру гистидиновых кластеров, обнаруженных в десатуразах Synechocystis sp. РСС 6803. Все ацил-липидные десатуразы латаются гидрофобными мембранными белками с тремя выраженными гидрофобными доменами, пронизывающими мембраны.

Таблица 2. Некоторые характеристики десатураз цианобактерин Synechocystis sp. РСС 6803.

Некоторые характеристики десатураз Гомология между белками

Ген Десатураза Кол-во Мол. Д9 Д12 Д 6 оЗ

АА масса desC desA desD desB

№)

desC Д9 318 37.2 • 12 10 9

desA Д12 351 40.5 12 - 20 28

desD Дб 360 41.4 10 20 - 21

desB оЗ 359 41.9 9 28 21 -

Десатуразы Synechocystis зр. РСС 6303 не имеют транзитных последовательностей и встраиваются в мембраны, видимо, за счет особенностей третичной и, возможно, четвертичной структур.

Десатуразы высших растений подразделяются по субстратам на ацнл-АПБ и ацшс-литщные десатуразы. В эндосперме семян ТИипЬегц'ш аШа была обнаружена активность и клонирован ген растворимой ацил-АПБ Дб десатуразы (СаЬооп е: а!., 1994а). Ацил-лигошные десатуразы высипсх растений могут быть локализованы в разных ком-партментах клетки. Считается, что эти ферменты в основном находятся в пластидах и эндоплазматическом ретикулуме (ЭР). Все десатуразы растений кодируются ядерным геномом, поэтому десатуразы, локализованные в пластидах имеют транзитные пептиды на М-конце, ведущие фермент от места синтеза (ЭР) к месту локализации.

Таблица 3. Консервативные гистндиновые кластеры в ацил-лнпидных десатуразах Synechocystis sp. РСС 6803.

Дссатураза 1-й положение 2-й положепие 3-й положение

(зк) (ак) (ак)

д9 НххххН 101-106 НххНН 138-142 НххНН 268-272

Д12 НхххН 90-94 НхННН 126-130 НххНН 287-291

дб НхххН 88-92 НхххНН 123-128 НхххНН 302-308

шЗ НхххН 89-93 НххНН 125-129 НххНН 288-292

Рис. 1. Модельная схема положения десатуразы в мембране. Показаны три гистидиновых кластера, способных связывать 2 атома железа. Гидрофобные домены I и И показаны как один трансмембранный домен.

Десатуразы жирных кислот животных и дрожжей относятся к классу аши-Ко А десатураз. В отличие от растворимых Д9 ацил-АПБ десатураз растений, Д9 и Дб ацил-КоА десатуразы животных являются гидрофобными мембранными белками, по этим свойствам напоминая ацил-липидные десатуразы цианобакгерий.

Моде.1ъ структуры мембранных десатураз. На основе анализа аминокислотных последовательностей десатураз можно предложить структурную схему фермента, встроенного в мембрану (Рис. 1).

Четыре (или три) трансмембранных домена пронизывают мембрану таким образом, что три Нй-кластера оказываются на одной стороне мембраны близко друг к другу. Эти кластеры способны связать два атома железа, необходимых для активности фермента. Анализ аминокислотных последовательностей мембранных десатураз жирных кислот животных, растений, грибов, насекомых и цианобакгерий показывает, что упомянутые выше гистидиновые кластеры консервативны во всех ферментах. Сайт-направленный мутагенез в стеарил-КоА-десатуразе крысы (БЬапкНп ее а1., 1994) и в Д12 ацил-липидной десату-разе БупесИосуз^ Бр. РСС 6803 (Ауе1ап§е-МасЬеге1 Л а1., 1995) показал, что любое замещение консервативных гистишшов приводит к полной потере десатуразной активности. Мутагенез "неконсервативных" гис-тидинов, к потере активности не пртодил.

Десатуразы являются терминальным компонентом сложной цепи биохимических реакций, включающей Суг Ь5 или ферредоксин, в качестве электронных доноров, и Суг Ь5 редукгазу или Рё-КАОР"1"-оксидоредуктазу. Электронные доноры для различных типов десатураз могут быть разными: ацил-КоА десатуразы животных, и ацил-липидные десатуразы растений, локализованные в ЭР, используют Суг Ь5, в то вре.\ш как десатуразы цианобактерий, а также пластидные ацил-АПБ и ацил-липидные десатуразы растенш! используют Бс! (Рис. 2). Активная десатураза связывает два атома высоко валентного железа, которые формируют реактивный комплекс с атомом кислорода: Ре-О-Ре. Этот комплекс способен разорвать неактивированные -С-Н-связи, в конечном итоге приводя к образованию -С=С- двойных связей в цепях жирных кислот.

ацнл-КоА десатуразы (животные, грибы, дрожжи) - СН2 - СН2 СН = СН - 18:0-КоА -> 18:14»-КоА -> 18:24«-9-КоА

2cytb5(red) 2cytbS(ox) +02

Ацил-АПБ десатуразы (растения - строма xtopoittacmoe) - СН2 • СН2 - - СН = СН - 18:0-АПБ -> 18:1Л»-АПБ

2Fd(red) 2Fd(ox) +02

Ацнл-липидные десатуразы I (растения - ЭР)

- СН2 - СН2 СН = СН - Гл-18:14» -> Гл-18:2Л»-" -> Гл-18:34'-12-*3

2cytb5(red) 2cytb3(ox) +02

Адил-лнпидные десатуразы II (цианобактерии, растения -гиастиды)

- СН2 - СН-» - --* - СН = СН - Гл-18:0 -> Гл-18:1Л' -> Гл-18:2д9-12->

Г Л -> Гл-18:34«-»-12 -> Гл-^:^«-»-'2-"3

2Fd(red) 2Fd(ox) +02

Рис. 2. Механизмы действия различных типов десатураз. Cytb5 - цито-хром Ь5, Fd - ферредокснн. Red - восстановленная форма, Ох - окисленная форма, Гл - глицеролипнд.

3. ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ДЕСАТУРАЗ

Клонирование генов десатураз из растительных и иианобакгери-альных клеток в последние годы сделало возможным изучение их экспрессии и роли жирных кислот в процессах адаптации.

Экспрессия генов десатураз циаиобактерий. Приведем схему последовательности десатурации жирных кислот в цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6S03 с указанием жирных кислот - продуктов десатурации, и генов десатураз, отвечающих за определенные стадии реакции десатурации (Рис. 3). До последнего времени вопрос о молекулярных механизмах синтеза ненасыщенных жирных кислот оставался

открытым. Предполагаюсь, что низкие температуры могут вызывать повышение активности пресинтезированных десатураз. Альтернативная схема предполагала, что при низких температурах замедляется de novo синтез насыщенных жирных кислот, в то время как активность десатураз остается без изменения. Мы предположили участие de novo синтеза самих десатураз (транскрипцию и трансляцию) при низких температурах.

desC des A desB

(<19 дссатураза) (л 12 дссатураза) (оЗ дссатураза)

18:0 -> 18:1л® -> 18:2ЛЭ'" ->

18:3

18:2

.оЛв.Э

desD (Дб десатураза)

I

-> |l8:3A,'*,12| ->

18:4

Рис. 3. Обща5( схема десатурации жирных кислот ашш-липидными де-сатуразами в цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803. Пунктиром показан неакпганый путь десатурации.

Изменение количества мРНК десатураз под действием низких температур. При снижении температуры с 36-34°С (нормальная) до 25-22"С (низкая) происходит быстрое накопление транскриптов генов clesA. desD и des В, кодирующих Д12, Дб и оЗ десатуразы, соответственно (Рис. 4). Ген desA образует один транскриггг размером в 1.3 т.н., что свидетельствует о том, что он транскрибируется как одиночный ген. Гены desD и des В также образуют одиночные транскрипты одинакового размера - по 1.4 т.н. При повышении температуры с 22°С до 34°С количество мРНК Д12, Дб и аЗ десатураз снижается до исходного низкого. Количество мРНК Д9 десатуразы практически не меняется с изменением температуры. Уровень транскрипции desC-rem значитель-но превышает таковой генов других десатураз.

При сн!скенни температуры с 34 до 22°С мРНК Д12 десатуразы накапливается постепенно: через 30 мин после изменения температуры количество транскрипта увелтивается в 5 раз, а через 1 час - достигает максимума (в 10 раз больше исходного уровня). Количество мРНК Дб десатуразы увеличивается примерно в 6-8 раз, но ответ этого

гена на низкотемпературное воздействие происходит быстрее, чем гена desA. Резче всего на снижение температуры реагирует ген шЗ десатура-зы. Транскрипт почти не заметен при нормальной температуре (34°С), однако количество мРНК увелшивается почти в 10 раз уже через 15 мин после изменен™ температур, достигая максимума (в 15 раз больше исходного уровня) в течение 30 мин (Рис. 4). Этот факт согласуется с результатами жирнокислотного анализа Synechocystis sp. РСС 6803: а!8:3 н 18:4 жирные кислоты не обнаруживаются при высоких температурах, однако быстро синтезируются при снижении температуры. Накопление транскриптов генов десатураз, отвечающих за синтез по-лпненасыщенных жирных кислот, говорит о том, что, возможно, активация десатурации при снижении температуры является результатом индукции транскрипции этих генов. Вместе с тем, не исключена возможность и постгранскрипционного контроля, например, увелшения времени жизни мРНК при снижении температуры.

Влияние ингибиторов па накошепие транскриптов генов десатураз при низких температурах. Мы использовали рифамшщин, церуле-нпн - ингибитор синтеза жирных кислот, и DCMU (диурон) - ингибитор фотосинтеза, для исследования их влияния на транскрипцию гена desA (Л 12 десатуразы), отвечающего за образование 2-й двойной связи в жирных кислотах. Из рис. 5 видно, что рифампицин и дтгурок полностью подавляют, а церуленин практически не влияет на накопление транскрипта desA при снижении температуры. Вероятно, что накопление мРНК desA происходит за счет активации транскрипции, поскольку рифампицин ингкбирует de novo «[нтез РНК и не атияет на стабильность матриц.

Транскрипция генов десатураз. Для анализа регуляции транскрипции генов десатураз необходимо определить положение регуля-торных элементов, в частности - промоторов. Локализация промоторов десатуразных генов делает возможным выяснеть в каких точкхх начинается транскрипция генов при высоких и низких температурах. Эта информация, в свою очередь, необходима для того, чтобы судить о возможном участии нескольких форм РНК.-полимераз в транскрипции десатураз при изменении условий окружающей среды.

Промоторы генов десатураз цианобактерий. Сайты начала транскрипции всех четырех десатураз Synechocystis не меняются при изменении температуры. Транскрипция desC начинается с положения -III, считая от первого нуклеотида кодирующей области гена.

50

100

= 50

Ü 0

а

а

g 100

j

3 50

= 0

Г 100

-□—QCD-O-

50

34 С

22 С

34 С

-а-

desC;

J_I_I_I_I_I_I_L

I 1 t i

д_д-

А des В

34°С 22'С 22'С 22°С 22°С

+ rif +cer +dcmu

-30 О 30 60 90 120 150 180

Время(мин) Рис. 4. Влияние низких температур на количество транскриптов генов десатураз в цианобакгерии ¿упес/юсуиЬ Бр. РСС 6803. Графические данные приведены по результатам сканирования ра-диоавтограмм, полученных при нозерн-блот гибридизации. За 100% принято макаемальное количество мРНК, детектируемое за 2 ч после снижения температуры.

Рис. 5. Влияние ингибиторов на накопление мРНК гена desA при низких температурах. Клетки выращенные при 34°С, инкубировали при 22°С в течение 30 мин в присутствии 15 мкг мл"1 рифампицина (Rif), 10 мкг мл"1 церуленина (Сег) или 15 мкг мл"1 DCMU.

Интенсивность радиоактивных сигналов полученных от мРНК desC одинакова при 34 и 22°С, что еще раз свидетельствует о конститутивной транскрипции гена.Транскригашя desA начинается с положения -118. Интенсивность сигнала, полученного от мРНК с 22°С примерно в 10 раз превышала интенсивность сигнала от РНК с 34°С, что согласуется с данными . нозерн-блот анализа. Транскрипция des В гена начинается с положения -35, desD гена - с положения -347. Интенсивность

г г

сигналов от мРНК с разных температур повторяет картину, полученную для мРНК ¿езЛ и ¿езВ - генов. Начало транскрипщги (¡иИ удалено от кодирующей последовательности гена почти на 400 нуклеотидов. Такой "дальний" сайт начала транскрипции является достаточно необычным для компактной организации генов в геноме БупесИосуз^ Бр. РСС 6803 (Рис. 6).

Сравнение нуклеотидных последовательностей вблизи промо-торных участков показало, что они в большой степени гомологичны друг другу (Рис. 7). Функциональная роль консенсуса АТАКОТТТОТТТ, обнаруженного вокруг точек начала транскрипции и являющегося характерной особенностью генов десатураз цианобак-терий, к настоящему времени не известна. Можно лишь предположить, что эта последовательность вовлечена в регуляцию низкотемпературной индукции транскрипции, либо необходима для* стабилизации транскршггов.

desC (Д9) -111 Г"*

des А (Д12) -114 Г*

desB (ш3) -35 п

-347 desD [Лб] '

I

-400

I

-300

•200

-100

Рис. 6. Схема расположения точек начала транскрипции относительно кодирующей последовательности генов десатураз Synechocystis sp. РСС 6803. Прямоугольники показывают кодирующие последовательности генов. Точки начала транскрнтщии обозначены стрелками. Положение точек указано над стрелками. Положение "Г соответствует положению первого нуклеотида стартового кодона гена (ATG для desA, des В и desD, и GTG для des В). Сайты начала транскрипции определялись методом удлинения праймеров для мРНК десатураз, из культур, которые росли при 34°С, или были инкубированы при 22°С в течение часа.

-133 СТССАТТТСССЛАААСАТТСаСАСТАаСТТТТСТТСТССТТСТТТААССААССТСО ёезС

* * * * * * *

-14 0 СААТСССААСеТСТТАТАААААСААААСТТТСТТТАССТСАСТАТТААТТССТАСС ёезА *•» ** * * * ******

-62 СТТТСААСАТТТАССАТАСААТСАТАСдАТТСГТГТССССТСАТАСССССТААСАТ с!езВ ***** *****

-374 ААСТАСЗААААТААСТТТААТТСА?ААСТ(ЗАСТТТТАСТССТААААААСТСАСАТА ¿езО консенсус: АТАКОТТТСТТТ

Рис. 7. Сравнение нуклеотидных последовательностей, расположенных вокруг точек начала транскрипции генов десатураз ЗупесИосух^ зр. РСС 6803. Точки начала транскрипции подчеркнуты двойной линией. Возможные "-10" боксы промоторов подчеркнуты одной линией. Гомология показана между парами генов (последующего и предыдущего). Положение нуклеотидов считалось от первого нуклеотида кодирующей части гена.

Исыедование индукции транскрипции генов десатураз с помощью химерных генов. Для исследования низкотемпературной индукции промоторов десатуразных генов мы использовали химерные конструкции из промоторов desA или des В и генов luxAB, кодирующих субьеди-шшы люциферазы Vibrio harveii: конструкции были интегрированы в геном Synechocystis sp. РСС 6803 по принципу двойной гомологичной рекомбинации. Штаммы DesA-Lux и DesB-Lux были использованы для изучения действия низких температур на активность этих промоторов. Изменения люминесценции исследованных штаммов Synechocystis под действием низкой температуры показаны на рис. 8.

Время, ч

Рис. 8. Изменение люминесценции в штаммах DesA-Lux и DesB-Lux под действием низкой температуры. Клетки выращивали при 34°С и затем переносили на 25°С. Активность люциферазы измеряли при 30°С с помощью люмюю-метра (Hamamatsu Photonics, Япония). Одна единица относительной активности люциферазы соответствует испусканию света в 104 фотонов с"1. Закрытыми символами обозначена люминесценция контрольного штамма LacZ-Lux.

При снижении температуры с 34°С до 25°С люминесценция возрастала в 5-8 раз. Это свидетельствует о том, что промоторы генов ¿езА и (1е5В активируются низкой температурой. Активация промотора ¿езВ происходила быстрее, чем активация промотора ёе$А, что согласуется с данными по нозерн-блот анализу. Контрольная химерная конструкция, состоящая их /(«-генов под контролем промотора 1ас2, показала увеличение люминесценции в 1.2-1.5 раз, что может быть связано со стабилизацией люциферазы при низкой температуре.

Посттранскрипционная регуляция: время жизни мРНК десату-раз при разных температурах. Чтобы оценить роль поспранскрипци-онных процессов в регуляции экспрессии генов де сатур аз цианобакте-рий, мы оценили время жизни индивидуальных мРНК при нормальной и низкой температурах. Для этого к клеткам ЗупесИосузИз зр. РСС 6303 был добавлен рифампишсн - ингибитор транскрипции. После инкубации с рифампицином в течение определенного времени, из клеток была выделена РНК и проведен нозерн-анализ специфических транс-криптов генов десатураз. Время полужизни мРНК оценивх'Ш по ослаблению гибридизационных аггнадов. Эти эксперименты показали, что время полужизни мРНК с!е$Л при 34°С составляет около 2 мин, в то вре\ш как при 22°С оно возрастает до 15-20 мин. Время полужизни мРНК (1езВ и также увеличивается в 3-10 раз при снижении температуры. Время полужизни мРНК ¿езС, кодирующего Д9 десатуразу, составляет 10 мин как при 34, так и при 22°С. Таким образом, под действием низких температур увеличивается стабильность мРНК генов Л12, оЗ и Дб десатураз, тогда как стабильность мРНК гена Д9 десатура-зы не изменяется. Мы полагаем, что в процессе увеличения количества мРНК десатураз участвуют, по крайней мере, два механизма: низкотемпературная активация транскрипции и увеличение стабильности мРНК.

Трансигция десатураз. Для изучения трансляции десатураз мы синтезировали антитела в кроликхх, используя в качестве антигенов синтетические 15-мерные олигопептиды, соответствующие карбоксильным концам индивидуальных десатураз. Блоттинг мембранных белков из клеток, выращенных при 36°С и из клеток, инкубированных при 25°С, показал, что количество Д9 десатуразы не меняется при снижении температуры (Рис. 9).

Рис. 9. Всстерн-блот анализ экспрессии десатураз Synecho-cystis sp. РСС 6803 при снижении температуры с 36 до 25°С. Клетки выращивали при 36°С и переносили на 25°С на 2, 4, б и 8 часов (ч). Мембранные фракции выделяли по Omata and Murata (1986). После электрофореза в 12% ПААГ белки переносили на мембрану и проводили блоттинг со специфическими антителами против десатураз (Sambrook et al., 1989) с помощью вторичных антител, меченых 125I (Amersham). Специфические иммуноглобулины (IgG) предварительно очищали из ангисыворотки с помощью набора imtnuiioPure [gG Purification Kit (Pierce). Белки детектировали с помощью радиоавтографшг.

Как и предполагалось, при снижении температуры наблюдается накопление Л12, Дб и аЗ десатураз в .мембранах цианобактерии. При этом, количество шЗ десатуразы увеличивается значительно быстрее, чем Д12 и Дб десатураз.

Динамика экспрессии генов десатураз. Таким образом, можно заключить, что индукция синтеза полиненасыщенных жирных кислот при снижении температуры обусловлена индукцией экспрессии генов десатураз жирных кислот, включающей акселерацию транскрипции генов и, как следствие, повышенный уровень синтеза соответствующих белков (Табл. 4). При снижении температуры синтез мРНК генов десатураз жирных кислот активируется уже через несколько минут после температурного сдвига. За 10-30 мин количество мРНК десатураз увеличивается в 7-S раз. Накопление соответствующих белков происходит в интервале 1-4 часов после снижения температуры. И, наконец, повышение доли полиненасыщенных жирных кислот заметно через 2-6 часов. Эта динамика отражает последовательность событий при низкотемпературной индукщги экспрессии генов десатураз в Synechocystis sp. 6S03 и может служить модельной схемой температурозависимой экспрессии анхтогичных генов в других организмах.

25°С

36°С 2ч 4ч 6ч 8ч

Таблица 4. Динамика экспрессии генов десатураз в Synechocystis sp. РСС 6803 под действием низких температур.

Время ответа гена на снижение температуры

Ген десатуразы Синтез Синтез белка Десатурацня

мРНК жирных кислот

desC (Д9) - - -

desA (А 12) 15-30 мин 2-6 часов 6-8 часов

desD (Дб) 10 - 15 мин 2-4 часа 4-6 часов

desB (соЗ) 10 - 15 мин 1 - 2 часа 2-4 часа

4. ЛОКАЛИЗАЦИЯ ДЕСАТУРАЗ

Субк.геточная локыизация десатураз циаяобактерий. В Synechocystis sp. РСС 6803 имеется максимально возможный для циа-нобактерий набор десатураз. Мембранная система цианобактерий включает в себя три типа мембран: наружную и шггоплазматическую мембраны, а также комплекс тилакоидных мембран. Десатуразы, таю im образом, могут быть локализованы в разных компартментах клетки. Для субклеточной локализации десатураз жирных кислот в Synechocystis sp. РСС 6S03 мы использовали антитела, получение которых описано выше. Специфичность антител проверялась на антигенах, полученных в процессе экспрессии десатураз в Е. coli или на изолированных мембранах Synechocystis. На рис. 10 приведена электронная микрофотография клети Synechocystis sp. РСС 6S03, показывающая локализацию Л12 десатуразы. Эта десатураза локхтизована в тилакоидных мембранах клетки, а также в плазмалемме. Невысокое количество коллоидного золота, соответствующее нахождению десатуразы в клетке, объясняется тем, что антнтела специфичны только к 15 аминокислотам карбоксильного конца полипептида. Как негативный контроль мы использовали клетки Synechocystis Fadl2 - мутант, дефектный по синтезу Д12 десатуразы. Клетки мутанта не связывают антитела против Д12 десатуразы. Эксперимент по локализации десатураз был также проведен и на изолированных тилакоидных мембранах Synechocystis (Рис. 10). Статистический анализ распределения сетнхтов в клетках (Табл. 5) показал, что десатуразы Synechocystis действительно локализованы как в тилакоидных, так и в плазматической мембранах клетки.

Рис. 10. Локализация Д12 десатуразы в клетках и в изолированных ти-лакоидных мембранах Synechocystis sp. РСС 6S03 при 34°С. А - клетки дикого типа; Б - клетки мутанта Fadl2; В - тилакоидные мембраны из клеток дикого типа; В - тилакоидные мембраны из мутанта Fad 12. Мутант Fad 12 описан в работах Wada and Murata, 1989 и Gombos et al., 1996. Тилакоидные мембраны выделяли по методу Murata and Omata, 19SS. Методы электронной микроскопии описаны Mustardy et al., 1996. В качестве вторичных антител использовали анти-кроличьи IgG, конъюгпрованные с коллоидными частицами золота размером 10 нм (GARIO; BioCell, Cardiff, U.K.). Электронная микроскопия проводилась на микроскопе Jeol 100СХ (Jeol Ltd., Tokyo, Japan).

Таблица 5. Распределение частиц иммуно-золота в клетках Syncchocystis.

Десатураза Плазмалемма Тилакоидные мембраны Цитоплазма

(количество частиц золота на мкм2)

Д9 17.9 + 5.6 16.8 ± 5.2 2.2 ± 1.5

Д12 20.8 ± 6.2 17.8 ± 5.3 2.3 ± 1.8

Дб 28.4 ± 7.6 36.7 ± 8.8 3.6 ± 2.1

соЗ 4.8 ± 2.7 5.2 ± 2.9 2.1 ± 1.4

тЗ (25°С)* 19.2 ± 4.3 25.2 ± 9.5 3.1 ± 1.2

'Определение проводилось на клетках, выращенных при 34°С и затем инкубированных при 25°С в течение 3 часов. Вычисления представлены по результатам 20 определений для каждой десатуразы в трех независимых экспериментах.

Таким образом, десатуразы цианобактерии способны десатурировать жирные кислоты во всех мембранных образованиях клетки. Вопросы экспрессии, локализации и функциональной роли <аЗ десатуразы остаются интригующей проблемой. Дело в том, что, по всей видимости, ген desB экспрессируется и при высоких температурах, однако его экспрессия может зависеть от фазы роста клетки. К примеру, мы обнаружили, что при 34°С <аЗ десатураза локализована исключительно в зоне деления клеток (Рис. 11). Обнаружить этот фермент в тилакоидных мембранах или по периметру плазмалеммы при этой температуре не удается (см. выше). Эти данные наводят на мысль о том, что шЗ десатураза может быть вовлечена в процессы деления (или разделения) клеток. Косвенные данные, свидетельствующие в пользу этого предположения, были получены при исследовании жирнокислотного состава клеток Chlorella в клеточном цикле в синхронной культуре (Клячко-Гурвич и др., 1980, 1981а,б). Было обнаружено, что количество а-линоленовой кислоты (продукта иЗ десатуразы) увеличивается в клетках в период активного деления.

Субклеточная локализация десатураз высших растений. К настоящему времени клонировано несколько десятков генов десатураз жирных кислот из различных источников, в основном из Arabidopsis thallana. Как принято считать, ацил-лигащные десатуразы жирных ки-

слот высших растении локализованы в тилакоидных мембранах пластид, либо в эндоплазматическом ретикулуме.

Соответственно, местами десатурации жирных кислот считаются эти мембраны Также известно, что полиненасыщенные жирные кислоты находятся и в плазмалемме. Кроме того, считается, что именно десатурация жирных кислот в плазмалемме необходима для прежде всего для адаптации растений к низким температурам. Име-ются многочисленные предположения о транспорте десатурированных липи-дов из ЭР в плазмалемму для обеспечения- оптимальной текучести этой мембраны при изменении температур. Однако, ничего не известно о существовании специфических для плазмалеммы десатураз. Чтобы проверить возможность локализации десатураз в плазмалемме высших растений мы использовали иммуноэлектронную микроскопию, как и в случае с Synechocystis sp. РСС 6803. В качестве антигенов для получения антител были использованы олигопептиды, соответствующие 15-ти аминокислотам С-конца индивидуальных белков. В особенности нас интересовало распределение в клетке десатураз хлоропластов и эндоплазматического ретикулума, Fad7 и Fad2 , а также их реакция на снижение температуры окружающей среды.

Специфичность полученных антител проверяли на выделенных тилакоидных мембранах A. thaliana, а также на антигенах, полученных в результате экспрессии гибридного белка, состоящего их тиоредокси-на и карбоксильного олигопептида соответствующей десатуразы, в E.coli. Иммунолокализация Fad7 десатуразы показала, что этот фер-

Рис. 11. Локализация шЗ десатуразы в зоне деления клеток Synechocystis sp. РСС 6803 при 34°С. Электронная микроскопия проводилась как это описано для Рис. 10.

мент, действительно, находится в тилакоидных мембранах хлоропла-стов (Рис. 12).

Рис. 12. Иммунолокализация десатуразы показывает специфичес-

Рас17 в клетках листьев (А) и в изоли- _____„„„ ? „„

4 '„ . ,., . кое распределение ш3 де-рованных хлоропластах (Б) АгаЬшорзя

возраста. Иммуномикроскопия срезов корней и листьев А. ШаИапа показала, что Рас12 десатураза, которая по литературным данным должна находиться в эндоплазматическом ретикулуме (Оки1еу й а1., 1994), присутствует в обоих органах (Рис. 13). При 25°С всего несколько частиц золота заметно на микрофотографиях. При этом Баё2 десатураза локализована не в эндоплазматическом ретикулуме, а в районе цито-плазматическон мембраны (Рис. 13А,В). Микрофотографии срезов из листьев и корней, полученные из растений, инкубированных при 16°С в течении трех дней, показали резкое увеличение количества Рас12 десатуразы в этих органах, практически все частицы золота, были обнаружены в цитоплазматической мембране (Рис. 13Б,Г). Обнаружение нами Д12 десатуразы, Рас12, в плазмалемме, а не в эндоплазматическом ретикулуме, заставляет пересмотреть имеющиеся представления о субклеточной локализации этих ферментов и о местах синтеза полинена-

Частицы золота были обнаружены только в мембранах и совершенно не заметны вне пластид и в строме. Кроме того, была обнаружена специфическая концентрация частиц золота в хлоропластах молодых клеток, расположенных по краям листьев - в зонах роста листьев А. ЛаИапа. Хлоро-пласты старых клеток демонстрировали значительно более слабое узнавание антигена антителами против Рас17. Этот феномен интересен тем, что

ЛаГшпа.

сатуразы Рас17 в хлоропластах в зависимости от их

сыщенных жирных кислот в растениях. Согласно известным представлениям, образование олеиновой кислоты (18:1Л9) происходит только в строме хлоропластов (Stumpf, 1980; Slocombe et al., 1994).

Рис. 13. Иммунолокализашш десатуразы Fad2 в клетках Arabidopsis thaliana. Клетки из листьев растений выращенных при 24°С (А) и из листьев растений, инкубированных при 15°С в течение трех дней (Б), а также из корней растений при 24°С (В) и при 15°С (Г). CP - хлоропласт; ER - эндоплазматический ретикулум; IS - межклеточное пространство (intercellular space). М - митохондрия; W - клеточная стенка.

Олеиновая кислота, связанная с АПБ, может транспортироваться в мембраны как хлоропластов, так и вне хлоропластов - в ЭР, для последующей десатурации в лигтад-связанной форме. Десатурация жирных кислот может происходит либо в хлоропластах, либо в эндоплаз-матическом ретикулуме (Roughan and Slack, 1982), откуда полиненасыщенные жирные кислоты в липид-связанной форме транспортируются в плазмалемму (Arondel et al., 1990). Ранее также считалось, что плазмалемма не имеет собственных десатураз для образования полиненасыщенных жирных кислот. Полученные нами данные опровергают эту точку зрения. Совершенно очевидное нахождение десатуразы жирных кислот в плазмалемме говорит о том, что эта мембрана сама способна отвечать за десатурацщо. Усиление синтеза Fad2 под действием низких температур, выражающееся в увеличении количества этого белка в плазмалемме, свидетельствует, во-первых, об адаптивной экспрессии Д12 десатуразы и, во-вторых, о потенциальной способности плазмалеммы к адаптивной перестройке по средством синтеза полиненасыщенных жирных кислот.

5. РОЛЬ ДЕСАТУРАЗ В АДАПТАЦИИ

Мутанты по десатуразам жирных кислот. Путем создания конструкций с нарушенной структурой генов десатураз мы получили ряд мутантов Synechocystis sp. РСС 6803, дефектных по тем или иным десатуразам. Набор этих мутантов представлен в табл. 6. Нарушение генов Дб и шЗ десатураз не влияет на устойчивость цианобактерии к низким температурам. Несмотря на индукцию генов этих ферментов при низких температурах и накопление а-линоленовой и у-линоленовой кислот, а также 18:4, активность этих десатураз, похоже, не является критическим фактором для выживания организма. В тоже время, нарушения гена для Д12 десатуразы приводит к резкому снижению способности организма переносить низкие температуры. Поскольку в описанных выше мутантах нарушены строго определенные гены, кодирующие десатуразы жирных кислот, можно с уверенностью утверждать, что способность клеток выживать при низких температурах определяется наличием именно этих генов и способностью клеток синтезировать полиненасыщенные жирные кислоты. Способность выживать при низких температурах коррелнруется с наличием в мембранах полиненасыщенных жирных кислот и у высших растешш.

Так мутанты A. thaliana fad.5 и fad6 (дефектные по синтезу sn-2-пальмитин-десатуразы и хлоропластной Д12 десатуразы, соответственно), характеризуются хлорозом листьев, замедлением роста и изменением морфологии хлоропластов при низких температурах (Somerville and Browse, 1991).

У мутанта fad2 при 16°С снижается скорость удлинения стебля, и он погибает при 6°С (Miquel at al., 1992, 1993). Экспрессия Fad7 десатуразы Arabidopsis thaliana в Nicotiana tabacum приводит к устойчивости семян табака к низким температурам (Kodama et al., 1994).

Таблица 8. Мутанты Synechocystis sp. FCC 6803 по синтезу ненасыщенных жирных кислот.

Отсут- Отсутствующие Имеющиеся

Название Генотип ствующие десатуразы жирные кислоты жирные кислоты

18:1ЛЭ,

18:2Л9'12,

WT дикий тип 18:Зл6,9'12, 18:349'12'"3, 18:4Д6,Э,12,„,3

18:2д912, 18:1лЭ

desA' AdesA Д12 18:3i5,9,12, 18:Зл9'12"3, 18:4Л6,9.12.0,3 18:2л6,9(мало)

18:3ЛЭИ2.Ш3> 18:1"9,

desB' AdesB оЗ 18:4Д6,9,12.о,3 18;2Д9,12> 13:3Д6,9,12

18:3Л6'9'12, 18:1"э,

desD' desD' Д6 18:4Д6,9,12,<.3 18:2л9'12, 18.3Д9,12.„З

18:2л9,12, 18:1лЭ

desAV Д des A, Д12, Д6 18:3Л6,9'12,

desD' desD' 18:ЗдЭ'12'"3, 18:4i6'9,12'"3

18:3aS'9,12, 18:1лЭ,

desB'l AdesB, соЗ, Д6 18:Зл9'12'"3, 13:2ДЭ,12

desD' desD' 18:4Д6.9,12.Ш3

Состояние и поведение мембран. Как обсуждалось выше, чувствительность организмов к низким температурам связывают с изменением текучести биологических мембран. При этом никому не удавалось экспериментально соотнести наличие или отсутствие генов специфических десатураз, с изменением текучести мембран. Чтобы прямо продемонстрировать эту зависимость, мы использовали метод дифференциальной сканирующей колориметрии на изолированных тилакоидных мембранах штаммов БупесЬосузН.г, дефектных по разным десатуразам жирных кислот. Рис. 14 показывает, что фазовые переходы в тилакоидных мембранах клеток дикого типа БупесИосуз^ Бр. РСС бБОЗ и мутантов йезГГ, (1е5В~/(1ез1У~ происходят при 15, 13 и 12°С, соответственно. Таким образом, отсутствие в мембранных липидах у-линоленовой и а-лшюленовой кислот практически не влияет на физические свойства мембран. В мутанте (1е$Л~/с1е51У фазовый переход начинается уже при 28°С (Рис. 14), т.о., наличие в мембранных липидах олеиновой кислоты является критическим для формирования характерной для организма структуры мембраны.

\л/т

1 ДуК К ' |Г \ЛО|1<)ф|1Л.\с1|''

Рис. 14. Профили фазовых переходов в тилакоидных мембранах штаммов ф'«ес//0су.г/м, полученные с помощью дифференциальной сканирующей кхторимет-рии. Сканирование проводилось на калориметре ДАСМ-4 (Пущино-на-Оке, Российская федерация). Показаны результаты второго сканирования после необратимой денатурации белков.

10

20

30

40

50

60

70

Т>\и[орпгурл ("О)

6. ТЕКУЧЕСТЬ МЕМБРАН И ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ДЕСАТУРАЗ ЖИРНЫХ КИСЛОТ: ОБРАТНАЯ СВЯЗЬ

Моде.1Ь молекумрных механизмов адаптации клеток к низким температурам. После того как мы рассмотрели структуру, экспрессию, локализацию и функцшг отдельных десатураз в клетке, можно перейти непосредственно к вопросам, касающимся молекулярных механизмов регуляции экспрессии десатуразных генов. Этот вопрос связан с общими проблемами регуляции экспрессии генов при стрессовых воздействиях: каким образом организм чувствует изменение температуры и каким образом сигнал изменения температуры передается на регуляторные области генов, приводя к их активации или репрессии. Данные, полученные нами и изложенные в предыдущих разделах позволяют схематично обобщить представления о молекулярных механизмах акклиматизации клеток к понижающимся температурам (Рис. 15). При снижении температуры уменьшается текучесть мембран. Организм чувствует это изменение. Вопрос о сенсорах остается открытым, и мы показываем этот этап на рисунке знаком вопроса.

Снижение температуры

>

Уменьшение

текучести

мембран

1 >

Распознавание с шихта изменения температуры_

? >

Передача сигнала

Индукция транскрипции десатуразных генов

Индукции синтеза десатураз

Усиленная десатурация

Восстановление нормальной текучести мембран

>

Восстановление физиологической активности

Рис. 15. Модель акклиматизации организма к низким температурам.

Дхтее сигнхл от сенсор(а)ов передается к регуляторным молекулам, которые тоже неизвестны, или непосредственно воспринимается регуляторными последовательностями генов десатураз. Вследствие этого индуцируется экспрессия этих генов, что приводит к усиленному синтезу десатураз в клетке и к ускорению синтеза полиненасышенных

жирных кислот в мембранных липидах. В конечном итоге восстанавливает«! исходная (функционхльно) текучесть мембран и физиологическая активность связанных с нюш систем, в частности, фотосинтез.

В этой модели ведущая роль в запускании адаптационных механизмов отводится мембранам и их физическому состоянию, выражаемому текучестью, зависящей от степени ненасыщенности жирных кислот в мембранных липидхх.

Состав жирных кислот и экспрессия генов десатураз: зависимость уровня мРНК <1езА-гена от температуры преадаптации. Основываясь на логике приведенной выше схемы адаптации, мы предположили, что активация генов десатураз должна происходить в организме, при каком-то критическом состоянии мембраны, зависящим от степени ненасыщенности жирных кислот. Для того, чтобы оценить величину температурного сдвига (разницу температур), необходимого для активации транскрипции гена Д12 десаягуразы, </е&4, мы адаптировали клетки 5упес/юсуай Бр. РСС 6803 к разным температурам и затем снижали температуру на несколько градусов, следуя динамике изменения количества мРНК (Рис. 16).

В клетках, адаптированных к 36°С индукция транскрипции ёезА наблюдалась при 28°С, в то время как в клетках, адаптированных к 32°С, пн-дукшм была заметна лишь при 25-26°С. Эти данные говорят о том, что организм чувствует не изменение абсолютной температуры, а относительный сдвиг температур. Температуры, вызывающие акпгаацию экспресса гена, зависят от температуры преадаптации организма и должны превышать 6°С.

Индукция экспрессии гена Л12 десатуразы путем каталитического насыщения двойных связей в жирных кис.ютах липидов цитолюз-

20 24 28 32 ( 36

Рис. 16. Про<1)1Ш?теЖерэтурозави-снмой экспрессии гена desA. Клетки Synechocysiis sp. РСС 6803 выращивали при 36 (О - О) или 32°С (Д -А) в течение 3-х дней и инкубировали в течение 30 мин при указанных температурах. Кривые построены по результатам нозерн-блот анхшза.

матической мембраны. Если экспрессия генов десатураз индуцируется при изменении жирнокислотного состава мембранных липидов, или текучести мембран, при низких температурах, то в таком случае было бы возможно вызвать индукцию этих генов, искусственным путем снизив количество ненасыщенных жирных кислот и уменьшив там самым текучесть мембран. Для того чтобы обойти глобальный эффект снижения температуры мы использовали метод каталитической гидрогенизации жирных кислот мембранных липидов в клетках, выращенных при 36°С. Метод гидрогенизации жирных кислот с использованием плати-но-палладиевого катализатора широко используется в различных модельных клеточных системах, включая прокариотические и эукариоти-ческие организмы ее а1., 1988; 1оо ее а!., 1991). Техника гомогенной каталитической пирогенизации позволяет контролируемое насыщение двойных связей в цепях жирных кислот мембранных липидов. При этом катализатор действует очень специфично именно на жирные кислоты, тем самым меняя текучесть мембран, и не проявляет какого бы то ни было побочного эффекта (С^иит ее а1., 1989). Гидрогенизация мембран клеток Бупес/юсуаЬ яр. РСС 6803, выращенных при 36°С проводилась в течение короткого времени, так чтобы не нарушить фотосинтетическую активность клеток. При этом мы исследовали изменения жирнокислотного состава и изменения экспрессии гена ёезА на уровне его мРНК, с тем чтобы вьшвить корреляцию между изменением текучести мембраны и экспрессией гена десатуразы жирных кислот.

Изменения состава жирных кислот и фотосинтетической аютга-ности клеток показаны на Рис. 17. Как видно уровень полиненасыщенных жирных кислот (18:2Л9-12 и 13:3^'9'12) заметно снижается, в то время как уровень стеариновой кислоты (18:0) возрастает. Содержание олеиновой кислоты (13: И9) практически не меняется, что объясняется пополнением пула этой кислоты при гидрогенизации линолевой и •/-линоленовой кислот. Следует отметить, что активность фотосинтеза резко падает посте 6 мин гидрогенизации (Рис. 17). Поэтому в дальнейших экспериментах мы проводили гидрогенизацию в пределах от 1 до 4 мин. Необходимо также остановиться на специфичности гидрогенизации в наших опытах, как к мембранам клетки (плазмалемме и ти-лакоидам), так и к шшгакдуальным классам липидов. Каталитическая гидрогенизация в течение 4 мин коснулась в основном липидов плаз-матичекой мембраны. Наиболее подверженным насыщению двойных связей оказался ФГ, составляющий лишь 10% от общего количества

глицеролипидов. Изменение уровня транскриггга гена йюА, кодирующего Д12 десатуразу, при после гидрогенизации пермеапластов БупгскосуаЬ показано на Рис. 18. Действительно, после четырехминутно и гидрогенизацшг наблюдается индукция транскрипции ¿езА, и за 30 мин после гидрогенизации при 36°С уровень транскрипта достигает того же уровня, что при низкотемпературной индукции (Рис. 4).

Церуленин, ингибитор синтеза жирных кислот не влиял на активацию транскрипции <1езА после гидрогенизации. Рифам-пицин и диурон значительно ингибировали накопление ' транскршгга. Все перечисленные эффекты ингибиторов на изменение уровня мРНК с!е$А после гидрогенизации идентичны действто аналогичных ингибиторов на накопление транс-кри1ггы этого гена при низких температурах. Таких« образом, эффекты каталитической гидрогенизации и снижения температуры, выражающиеся в снижении текучести мембран, приводят к одному и тому же ответу -индукции генов десатураз жирных кислот, участвующих в формировании физической структуры мембран и поддержания их текучести на оптимальном уровне.

Текучесть мембран и экспрессия генов десатураз жирных кислот: прямая зависимость. Для подтверждения наших выводов о решающей роли текучести мембран в экспрессии генов десатураз мы использовали мутантов $упескосу$П5 Бр. РСС 6803, дефектных по генам десатураз жирных кислот (Табл. 8). Этот мутант был использован для исследова-

0 5 10 15

Время гидрогенизации (мин)

Рис. 17. Изменение состава жирных кислот и фотосинтетической активности при гидрогенизации пермеапластов Synechocystis sp. РСС 6803. Пермеапласты получат и по Papageourgiou and Lagoyanni, 1985.

Н1Ш температурозависимой экспрессии гена ¿жВ, кодирующего "терминальную" оЗ десатуразу. На рис. 19 показано изменение экспрессии гена desB в мутантах ¿евА:16е$И~ и ¿аГГ при последовательном снижении температур. Заметная индукция 6е$В в диком типе происходит в интервале 23-2б°С, а в мутанте ¿е$А~!(1езО~ - заметна уже при 32°С.

Динамика ответа йезВ в мутанте ёеяО' на снижение температуры аналогична ответу дикого типа, ¿упес/госуз&, но наблюдается более интенсивная транскрипция. Результаты этих опытов свидетельствуют о непосредственной зависимости экспрессии гена десатуразы от физических параметров мембран и еще раз подтверждают гипотезу об обратной связи между текучестью мембран и регуляцией экспрессии генов де-сатураз жирных кислот.

Мембраны как сенсор изменения температуры окружающей среды. Для того, чтобы в дальнейшем обсуждать вопросы о роли биологических мембран в адаптивном ответе генетического аппарата клетки, обобщим некоторые данные, приведенные в предыдущих разделах. 1) Для активации генов десатураз жирных кислот при снижении температуры решающее значение имеет не абсолютное значение температуры, а разница температур прездаптации и активации, которая должна превышать 6°С. 2) Индукция генов десатураз жирных кислот зависит от физического состояния мембран. Чем выше содержание насыщенных жирных кислот в мембранных липидах и выше текучесть мембран, тем легче активируются гены десатураз. 3) Активашгю экс-

j: -15 0 15 30 45 60 — Врсми инкубации (мин)

Рис. 18. Изменение уровня мРНК гена desA после гидрогенизации пермеапла-стов Synechocystis sp. РСС 6803. Пермеа-пласты, полученные из клеток, выращенных при Зб°С, гидрогенизировали в течение 4 мин при 36°С и затем инкубировали на свету в аэробных условрсях при Зб°С. Уровни мРНК desA определяли с помощью нозерн-блотгинга. Уровнь транскрипта выражен в процентах от уровня мРНК через 60 мин после пирогенизации. (О - О) пермеапласты без пирогенизации, контроль; (• - •) пермеапласты после гидрогенизации.

прессии генов десатураз можно вызвать не только снижением температуры, но и другими факторами, снижающими текучесть мембран.

4) Гидрогенизация, преимущественно цито плазматической мембраны, способна вызвать ответную индукцию экспрессии гена десатуразы, что свидетельствует о наличии обратной связи между текучестью мембраны и экспрессией генов, вовлеченных в формировании свойств мембран. 3) Индукция экспрессии гена десатуразы путе№ гидрогенизации жирных кислот лигошов шггоплазматической мембраны и наличие обратной связи "текучесть мембраны - экспрессия десатураз" позволяет предположить, что клеточным сенсором изменения температуры окружающей среды является именно цитоплазматиче-ская мембрана.

7. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ЭКПРЕССИИ ГЕНОВ ДЕСАТУРАЗ ЖИРНЫХ КИСЛОТ

При исследовании проблем регуляции возможны два дополняющих друг друга подхода, основанных на разных представлениях о принципах регуляции экспрессии генов. Во-первых, следует принять во внимание "глобальный" характер воздействия изменяющейся температуры окружающей среды на структуру и метаболизм клетки. При таком подходе вырисовывается необходимость поиска неких универсальных регуляторных факторов, способных в общем влиять экспрессию генов, в том числе и генов десатураз жирных кислот (изменение окислительно-восстановительного потенциала в мембранхх, изменение соотношения энерго-содержащих молекул АТФ/АДФ, изменение

Температура С Рис. 19. Температурные профили экспрессии гена des В в диком типе Synechocystis sp. РСС 6803 (WT) (■ -■), мутанте desD~ (Д - Д) и мутанте desA'/ des Er (О - О). Клетки выращивали при 36°С и переносили на 30 мин на указанные температуры. Кривые построены по результатам нозерн-блот анхчиза.

"компетенции" регуляторных участков соответствующих генов в результате изменения степени сверхсгшрализации хромосомной ДНК, ионная регуляция и т.д.). Второй подход основан на детальных знаниях некоторых регуляторных генетических систем, включающие такие компоненты как локхчьные сенсоры, белки-переносчики сигнхта (киназные и фосфатазные системы), белки регуляторы (индукторы и репрессоры) и, наконец, регуляторные последовательности конечных генов-исполнителей (промоторы, операторы, энхансеры).

Температурозависимая регуляция экспрессии генов десатураз посредством изменения степени сверхспирализации хромосомной ДНК. Компетентность ДНК в восприятии регуляторного фактора определяется степенью ее сверхспирализации, которая подвержена флуктуаци-ям, в зависимости от энергетического состояния клетки и от условий окружающей среды. Эти флуктуации состояния ДНК привели к возникновению и развтгию представлений о "динамической структуре ДНК" (Droge, 1994). В большинстве прокариот ДНК представляет собой кольцевую молекулу, ассоциированную с белками. Большинство белков способны изменять конформащоо и степень сверхспирализации ДНК при связывании с ней. ДНК ассоциирована с шггоплазмати-ческой или ядерной мембранами клетки (Parks et al, 1982; Freeman and Wilson, 1990). Ассоциашм хромосомной ДНК с мембраной несет за собой ряд физиологических и регуляторных феноменов. Во-первых, от физического состояния мембраны и ее адаптивных свойств зависит репликация как геномной, так и экстрахромосомной ДНК, а также сегрегация бактериальных хромосом при делении клеток. Изменение состава жирных кислот липидов и текучести мембран оказывают прямое влияние на процессы репликации ДНК и меняют динамику клеточного цикла (Mei et al., 1995). Связь хромосомной ДНК с мембраной обусловливает изменения степени сверхспирализации ДНК в зависимости от текучести мембраны.

Блокирование синтеза полиненасыщенных жирных кис.ют при низких температурах путем ингибирования активности ДНК-гиразы. Для выяснения роли сверхспирализашш хромосомной ДНК в синтезе полпненасыщенных жирных кислот при снижении температуры мы использовали специфический тгибитор активности ДНК-гиразы, но-вобиоиин. Действие этого антибиотика основано на конкурентном связывании с АТФ-связывающим центром GyrB субъединииы ДНК-гиразы (Geliert et al., 1976).

Таблица 16. Влияние ингибитора активности ДНК гиразы новобиоцина на десатурацию жирных кислот при низких температурах в цианобактерии Synechocystis sp. FCC 6803.

Жирные кислоты (%)

Температура 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 18:3, 18:3„ 18:4

38°С 56 2.7 1.4 17.1 14.9 8.3 0.10 0.02

25°С

2 ч - НБ 55 2.7 1.2 17.1 14.7 8.6 0.40 0.10

2 ч + НБ 55 2.3 1.9 18.0 14.6 8.6 0.10 0.02

4 ч - НБ 54 3.3 0.9 15.7 15.0 10.0 0.90 0.20

4 ч + НБ 55 2.4 1.8 18.2 13.9 8.3 0.15 0.04

6 ч - НБ 55 2.5 0.9 13.1 15.0 11.9 1.30 0.35

6 ч + НБ 56 1.9 1.7 18.7 13.2 8.3 0.20 0.04

8 ч - НБ 54 3.0 1.0 10.8 14.8 13.6 1.90 0.90

8 ч + НБ 55 2.5 1.8 19.4 13.3 7.9 0.20 0.04

24 ч - НБ 53 5.0 0.3 6.3 12.8 18.6 3.00 1.90

24 ч + НБ 55 2.4 1.9 21.4 12.8 7.3 0.20 0.04

Перед снижением температуры мы добавляли сублетальные концентрации новобиоцина к клеткам Synechocystis sp. РСС 6803 и следили за эффектом этого антибиотика на изменение состава жирных кислот (Табл. 9). Как было описано выше, при снижении температуры происходит активация экспрессии генов десатураз и синтез полиненасыщенных жирных кислот. Если без новобиоцина содержание 13:4 увеличивается почти в 20 раз за 24 ч при 25°С, то новобиоцин полностью подавляет образование этой кислоты, а также синтез 18:3у, осуществляемый шЗ десатуразой. Ингибирование активности ДНК-гиразы, приводящее к релаксации хромосомной ДНК Synechocystis, блокирует синтез полиненасыщенных жирных кислот при низких температурах. Эти результаты дают основания предполагать, что одним из универсальных механизмов регуляции экспрессии генов десатураз жирных кислот является изменение степени сверхспирализации хромосомной ДНК при изменении температуры окружающей среды.

Влияние ингибитора активности ДНК-гиразы на экспрессию генов десатураз жирных кис.ют. Влияние новобиоцина на экспрессию генов десатураз исследовалось с помощью нозерн-блот гибридизации (Рис. 21). Клетки Synechocystis усиленно транскрибировали мРНК Д12,

Дб и оЗ десатураз при снижении температуры с Зб°С до 25°С. Однако, в присутствии ингибитора ДНК-гиразы активации транскрипции не наблюдаюсь. Полностью блокировалась транскрипция desB, кодирующего оЗ десатуразу.

WT

WT + NB

NB + NB

WT

WT + NB

NB + NB

desC (Д9) 25°С

36°С 0.5ч 1ч 2ч 4ч бч

• tfl

LLI

desD (Дб)

«г

i »II

Kl.

И - Щ

raí

desA (Л12) 25"С

36°С 0.5ч 1ч 2ч 4ч бч

I

desB (аЗ)

-г

г

V

Рис. 20. Влияние новобиоцина на индукцию транскрипшш генов десатураз Synechocystis sp. РСС 6S03 при низких температурах. Клетки выращивали при Зб°С и переносили на 25°С на указанное время в отсутствии или присутствии 50 мкг мл"1 новобиоцина (+NB). WT - клетки дикого типа; NBr - мутант Synechocystis sp. РСС 6803 устойч1Гвый к новобиоцину. РНК выделялась и анализировалась как описано в других аналогичных экспериментах.

Спонтанный мутант Synechocystis, устойчивый к новобиоцину (N'Br), способен расти при 200 мкг мл"1 новобиоцина, в то время как клетки дикого типа не выдерживают и 5 мкг su"1. Этот мутант ведет себя в присутствии новобиоцина так же как дикий тип Synechocystis sp. РСС 6S03 без антибиотика (Рис. 20). Таким образом, индукция транскрипции генов десатураз жирных кислот при низких температурах в ццанобактерии Synechocystis зависит от активности ДНК-гиразы,

одного из ферментов, определяющих степень сверхспирхтизацин геномной ДНК.

Данные по транскрипции подтверждаются также и анхчпзом действия новобноцнна на синтез соответствующих полшгегггидов. Вес-терн-блоттинг показал, что новобиошш практически не влияет на синтез Д9 и Д12 десатураз и их локхчизацию в мембранах Synechocystis. В тоже время синтез соЗ десатуразы полностью ингибируется. Полученные результаты позволяют дополнить гипотетическую схему регуляции десатурации жирных кислот мембранных липидов (Рис. 15). При снижении температуры происходит уменьшение текучести цитоплазмати-ческой мембраны, что приводит к изменению топологии ДНК, связанной с этой мембраной. Вследствие этого изменяется структура промоторов соответствующих генов десатураз жирных кислот и происходит активация транскрипции и т. д. Не исключена возможность, что в регуляции температурозависимой экспрессии генов десатураз принимают участие специфические транс-факторы, которые являются медиаторами между физическим состоянием мембраны, топологией ДНК и транскрипцией индивидуального гена. Такая система регуляции предполагает наличие по крайней мере одного дополнительного белкового фактора, кроме РНК-полимеразы, участвующего в регуляции транскрипции.

Специфические регу.игторпые факторы: цис- и трапе- факторы. Поскольку ген соЗ десатуразы, des В, наиболее резко реагирует на снижение температуры окружающей среды, мы использовхти этот ген в качестве модельной системы для поиска и изучения специфических цпс-регуляторных сайтов и взаимодействующих с ними белковых транс-факторов, способных модулировать транскрипцию гена при изменении температуры. Дтя этого мы системно делегировали фрагменты 5'-конца гена des В и заменили в клетках Synechocystis sp. РСС 6S03 ген дикого типа на ген с ^модифицированной кодирующей частью, но с измененной регуляторной последовательностью. Набор "делетантов" представлен на рис. 21.

Практически нам удалось сделать делеции, перекрывающие весь 5'-конец гена des В. Фрагменты с делениями были субклонированы в подготовленный вектор для трансформашги, несущий ген Spr и структурную часть desB, так что субклонированные мутагенезированные фрагменты восстановили структурную и промоторную части гена с соответствующими модификациями.

-2С0

-1С0

-35 (начало транскрипции) /

4 <*взв !

№ Название

клона активн.

-11 1. 1253/111 0

-25 *» [253/251 0

•253 -53 3 ¡253/531 28

•253 -132 4. [253/132] 100

-195 5 [253/1951 100

-175 ■ 11 б [173/111 0

-*75 •75 г !' 76,251 а

-Со -53 3 ;!73. =3] 37

-!7.3 32 9 г 176.132] 100

.116 -:1 10 [1 16 1М >3

-"6 -25 1' М 16'25] 0

• Мб -63 12 [1 16 53] 40

* I' * 3 ¡73/1 0

•а [73 2=1 0

15 ;7с 53!

13 [5с. '] 0

---о 17 [56.251 а

■ -6 -V 13. [36.1 I] а

•36 -25 13 [33-251 0

„

1С0

Рис.21. Схема делений в 5'-области гена с1аВ ЗупгсИосузИз Бр. РСС 6803. Пунктиром показаны делегированные фрагменты. Транскрипция начинается с позиции -35, счотая от ОТО -первого кодона кодирующей области гена (+1). Поз1щия -269 соответствует стоп-кодону рамки считывания, расположенной перед геном ¿мЯ.

%

Подготовленные плазмидные конструкции были трансформированы с штамм ДА^В, и полученные клоны были отобраны по устойчивости к спекгиномицину. Таким образом нам удалось получить 20 штаммов Бупескосу$!Ь, в которых 5'-концевая область гена й&В была систематически делегирована (Рис. 22). Эти штаммы БупесИосуЛи были тестированы на способность ¿езВ-гена к низкотемпературной индукции. Эксперименты заключались в нозерн-блот анхлизе РНК, выделенной из разных мутантных штаммов, выращенных при 34°С и [шкубированных при 22°С в течение 1 часа. Они показали, что для низкотемпературной индукции гена ё&В требуется участок 5'-обласги гена, локализованный в районе позиций от -76 до -58. Дальнейшие эксперименты по гель-ретардации обнаружили специфическое связывание этого участка с белком, полученным при фракционировании на гепарин-сефарозе растворимых белков БупесИосузИз, инкубированного при 22°С. В настоящее время ведутся работы по очистке этого белка и клонированию соответствующего гена.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исходя из цели настоящей работы, заключающейся в выяснение структурных и биохимических особенностей десатураз жирных кислот, молекулярно-генетических механизмов регуляции экспрессии генов десатураз, а также роли этих ферментов в адаптации растительных клеток к условиям понижения температуры окружающей среды, необходимо сделать ряд обобщений.

Структурно-биохимические особенности. Знания структурных особенностей генов и ферментов, обусловливающих адаптивные свойства биологических мембран, уже в настоящее время предоставляет возможность получения новых сортов растенш! и штаммов микроорганизмов с измененными путями биосинтеза жирных кислот. Эти знания открывают перспективы более глубокого изучения структурно-био.химических особенностей десатураз с применением направленного мутагенеза и кристаллографа.

Экспрессия генов десатураз жирных кис.ют. Особенности экспрессии генов десатураз жирных кислот изучены нами впервые. В цианобактерии Зупескосузги 5р. РСС 6803 имеется 4 десатуразы жирных кислот - Дб, Д9, Д12 и шЗ десатуразы. Экспрессия гена ¿«С, кодирующего Д9 десатуразу, отвечающего за образование первой двойной связи

(реакция стеарат -> олеат), не зависит от температуры и осуществляется очень интенсивно и конститутивно. Экспрессия остальных десату-раз активируется при снижении температуры окружающей среды, что приводит к ускорению синтеза полиненасыщенных жирных кислот. Наиболее резко на изменение температуры реагирует ген desB, кодирующий саЗ десатуразу. Вслед за видимым изменением транскрипционной активности температурозависимых генов десатураз происходит накопление продуктов трансляции - соответствующих ферментов. Затем наблюдается синтез полиненасыщенных жирных кислот - продуктов активности индуцированных десатураз. При обратном повышении температуры транскрипционная активность соответствующих промоторов снижается, что приводит к прекращению de novo трансляции десатураз и постепенному снижению доли полиненасыщенных жирных кислот в мембранных липидах.

Субклеточная локализация десатураз жирных кислот. В данной работе впервые представлены данные о субклеточной локализации десатураз жирных кислот в растительных и цианобакгерихтьных клетках. Все четыре ацил-лштидные десатуразы Synechocystis были обнаружены как в цитоплазматической, так и в тилакоидных мембранах клетки. Эти данные однозначно свидетельствуют о наличии по крайней мере двух мест десатурации жирных кислот в клетках и подтверждают факт быстрого адаптивного ответа биологических мембран (на уровне синтеза полиненасыщенных жирных кислот) на изменение температуры окружающей среды. В клетках высших растетш имеется несколько классов десатураз жирных кислот, различающихся по свойствам, электронным донорам и субклеточной локализации. Мы впервые экспериментально локализовали десатуразы жирных кислот в клетках высших растений (Arabidopsis thal'tana) и показали, что шЗ десатураза FAD7 специфически локализована в хлоропластах. Считавшаяся ранее десатура-зой ЭР Д12 десатураза, FAD2, была локализована нами в цитоплазма-тпческой мембране. Этот факт заставляет пересмотреть имевшиеся ранее представления о местах биосинтеза полиненасыщенных жирных кислот в растениях, согласно которым такими местами служат только тсиакоидные мембраны и ЭР, а в шпоплазматическую мембрану жирные кислоты поставляются уже в пресинтезированном лиши-связанном виде. Наши результаты говорят о том, что щггоплазматиче-ская мембрана сама по себе является местом десатурации. Кроме того, мы обнаружили, что количество FAD7 и FAD2 десатураз возрастает

при снижении температуры, что свидетельствует о температурной зависимости экспрессии этих генов в высших растениях.

Функции индивидуа.1ьных десатураз в клетке: роль в адаптации. Данные по экспрессии генов десатураз жирных кислот и субклеточной локализации десатураз, а также результаты анализа мутантов, дефектных по той или (гной десатуразе, позволяют сделать следующие обобщена:

А9 десатураза. Экспрессия Д9 десатуразы в Synechocystis происходит конститутивно и очень интенсивно. Постоянно высокий уровень экспрессии этого гена соответствует сложившимся представлениям о ключевой роли первой двойной связи в цепях жирных кислот в определении физических свойств биологических мембран.

А12 десатураза. Экспрессия гена Д12 десатуразы находится под температурным контролем. Мутации этого гена приводят к возникновению температуро-зависимого фенотипа. Трансформация desA в тем-пературочувствительный штамм Synechococctis sp. РСС 7942 позволяет трансформанту переносить температуры, летальные для дикого типа. Эти данные позволяют рассматривать Д12 десатуразу как фермент, играющий ключевую роль в низкотемпературной адаптации.

Дб десатураза. Роль Дб десатуразы в жизнедеятельности клеток не выяснена. В цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 этот фермент занимает положение на разветвлении путей биосинтеза а- и -/-линоленовых кислот.

гаЗ десатураза. Роль оЗ десатуразы также до конца не выяснена. Как и делеция desD, делеция des В не влияет на выживаемость клеток при низких температурхх. Тем не менее, ген соЗ десатуразы наиболее сильно индуцируется низкими температурами. Локализация этого фермента в зоне деления клеток при оптимальных температурах роста позволяет предполагать его участие в процессе деления (разделения) клеток.

Зависимость экспрессии генов десатураз жирных кислот от текучести биологических мембран. Нами впервые экспериментально обнаружена обратная связь между физическим состоянием биологических мембран (выражаемым текучестью, или вязкостью) и экспрессией генов десатураз жирных кислот, участвующих в поддержанш! текучести мембран. Каталитическая пирогенизация мембран показывает, что при насыщении жирных кислот и уменьшении текучести шггоплазма-тической мембраны активируется транскрипция генов десатураз, отве-

чающих за возвращение мембраны в состояние "нормальной" текучести. Данные по экспрессии гена соЗ десатуразы в мутантах ЗупесИосузГи, дефектных по десатуразам жирных кислот, также демонстрируют прямую зависимость экспрессии генов десатураз от состояния мембраны. Суммирование упомянутых выше экспериментов и данных по температурной зависимости экспрессии генов десатураз жирных кислот позволили предложить схему молекулярных механизмов адаптации клеток растений к меняющимся температурам окружающей среды. Эта схема отводит роль сенсора изменения температуры цитоплазматиче-ской мембране клетки, текучесть которой снижается при снижении температуры окружающей среды. Способность клеток к низкотемпературной адаптации связывается в нашей модели со способностью к адаптивной экспрессии генов десатураз и синтезу полиненасыщенных жирных кислот, что необходимо для восстановления нормальной текучести мембран и для восстановления функциональной активности фотосинтетического аппарата.

Молеку.игрные механизмы экспрессии генов десатураз жирных кис.ют. К глобальным факторам, регулирующим экспрессию генов десатураз при изменении температуры окружающей среды мы относим динамическую структуру хромосомной ДНК. Индукция транскрипции исследованных генов вызывается, по нашему мнению, изменением степени сверхспирализации хромосомной ДНК при изменении температуры. Низкотемпературная индукция транскрипции генов десатураз зависит от активности одного из ключевых ферментов, определяющих топологическое состояние хромосомной ДНК в клетке, ДНК-шразы.

Изучение специфических регуляторных факторов, отвечающих за температурозависимуго экспрессию генов десатураз, на примере гена ыЗ десатуразы, позволило нам локализовать участок регуляторной области гена размеров в 18 нуклеотидов, необходимый для индукции транскрипции при снижении температуры.

ВЫВОДЫ

1. Цианобактерия БупесИосузИу эр. РСС 6803 имеет четыре десатуразы жирных кислот. На основании результатов клонирования их генов и данных иммуно-электронной микроскопии клеток цианобакте-рии установлена внутриклеточная локализация этих ферментов. Показано, что десатуразы ЯупесИосуня локхтизованы как в штто-

плазматической, так и в тилакоидных мембранах клетки. На основе знаний о первичной структуре белков предложена схема строения и расположения десатураз в мембранах.

2. В результате исследования особенностей температурозависимой экспрессии генов десатураз на уровнях транскрипции, посттраск-рипционных событий и трансляциии установлено, что Д9 десатура-за экспрессируется конститутивно, независимо от изменения температуры окружающей среды, в то время как экспрессия генов Д12, Дб и саЗ десатураз индуцируется низкими температурами. Доказано, что у БупесНосуыЬ образование полиненасьпценных жирных кислот при снижении температуры происходит благодаря индуцированному синтезу соответствующих десатураз.

3. Установлено, что десатуразы высших растений характеризуются высокой специфичностью внутриклеточной локализации.

4. Выявлено, что Д12 десатураза РАБ2 АгаЬШорзЬ ¡ИаИапа, ранее считавшаяся ферментом эндоплазматического ретикулума, локализована в цитоплазматической мембране. Продемонстрирована температурная зависимость накопления этой десатуразы в цитоплазматической мембране корней и листьев, что свидетельствует о роли этой мембраны, как места образования полиненасыщенных жирных кислот, в низкотемпературной адаптации АгаЫйорьЬ.

5. В результате использования специально сконструированных мутантов ЯупескосузИз, дефектных по различным десатуразам жирных кислот, выявлена роль индивидуальных десатураз в способности этой иианобактерни адаптироваться к низким температурам. Продемонстрирована непосредственная связь роста и выживания клеток при низких температурах с их способностью к синтезу полиненасыщенных жирных кислот. Показана ключевая роль Д12 десатуразы в низкотемпературной адаптации ЯупескосузИз.

6. Показана прямая зависимость экспресаш генов десатураз от текучести биологических мембран. Высказано предположение о сенсорной роли щгтоплазматической мембраны в адаптивном ответе растительных клеток при изменении температуры окружающей среды. Предложена схема молекулярных механизмов адаптации растительных клеток к низким температурам.

7. В ходе изучения передачи сигнала об изменении температуры окружающей среды к регуляторным областям генов, необходимых для адаптации клетки, выявлена роль ДНК-гиразы и сверхсгигрхти-

зацшг хромосомной ДНК в адаптивной экспрессии генов десатураз. Для гена оЗ десатуразы обнаружен цис-фактор (последовательность регуляторной области), отвечающий за низкотемпературную ин-дукшпо транскрипции.

8. Сформулирована концепция о ключевой роли обратной связи между состоянием биологической мембраны и экспрессией генов, кон-тролнруюипгх уровень ненасыщенности жирных кислот мембранных липидов. Предложены стратегические и методические подходы к дальнейшему изучению молекулярных механизмов температуро-зависимой экспрессш генов десатураз жирных кислот и передачи сигнала об изменении температуры окружающей среды от сенсоров к регуляторным областям генов.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лось, Д.А., Лебедева, Н.В., и Семененко, В.Е. (1989) Клонирование фрагментов хлоропластной ДНК Dunaliella sallna, обладающих промоторной активностью в Е. coli. Физиология растений 36, 732739.

2. Malakhov, М.Р., Wada, Н., Los, D.A., and Murata, N.(1992) A New cytochrome gene of Syiicchocystis VCC6ZQZ. Photosynthesis Research, 34: 134.

3. Wada, H„ Gombos, Z., Sakamoto, Т., Higashi, S., Los, D.A., Heinz, E., Schmidt, H., Nishida, I., and Murata, N. (1992) Fatty acid desaturation in cyanobacteria. Irv. Biochemistry and Molccutar Biology of Membrane and Storage Lipids of Plants. N. Murata and C.R. Somerville, eds. The American Society of Plant Physiologists, pp.67-78.

4. Lehel, C., Los, D.A., Wada, H., Gyorgyey, A, Horvath, I., Kovacs, E., Murata, N.. and .Vigh, L. (1993) A Second groEL-like gene, organized in a groESL operon is present in the genome of Synechocystis sp. PCC6803. J. Biol. Chem. 268: 1799-1804.

5. Los, D.A., Vigh, L., Horvath, I., and Murata, N. (1993) The temperature-sensing mechanism in cold-induced desaturation of membrane lipids in the cyanobacterium. Abstr. XV International Botanical Congress. August 23 -September 3, 1993. p. 405. Yokohama, Japan,

6. Los, D.A., Horvath, I., Vigh, L., and Murata, N. (1993) The temperature-dependent expression of the desaturase gene desA in Synechocystis PCC6S03. FEBSLett. 378: 57-60.

7. Malakhov, M.P., Wada, H„ Los, D.A., Sakamoto, Т., and Murata, N. (1993) Structure of a cyanobacterial gene encoding the 50S ribosomal protein L9. Plant Mo/. Biol. 21: 913-918.

8. Vigh, L., Los, D.A., Horvath, L, and Murata, N. (1993) The primary signal in the biological perception of temperature: Pd-catalyzed hydrogenation of membrane lipids stimulates the expression of the desA gene in Synechocystis PCC6803. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 9090-9094.

9. Лось, Д.А. и Мурата, H. (1994) Накопление транскриггга desA в Synechocystis РСС6803 при низких температурах является результатом активации транскрипции и увеличения стабильности РНК. Физиология растений 41: 170-175.

10. Los, D.A., Vigh, L., and Murata, N. (1994) Membrane fluidity and gene regulation: triggering the expression of the desaturase gene. In: Proceedings of 32™1 NIBB Conference "Stress-Induced Genes of Plants With'Emphasis on Their Function", pp.36-38. January 6-8, 1994. Okazaki, Japan.

11. Los, D.A., Vigh, L., and Murata, N. (1994) Regulation of the expression of the cyanobacterial desaturase gene by membrane fluidity. Abstr. Annual Meeting of the Japanese Society of Plant Physiology. March 28-30, 1994. Tsukuba, Japan. (Published in a Supplement to Plant Cell Physio/.)

12. Los, D.A., Wada, H., Sakamoto, Т., and Murata, N. (1994) Low-temperature-dependent expression of the desaturase genes in cyanobacteria. Abstr. The It Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan, December 13-16, 1994. Kobe, Japan,.

13. Malakhov, M.P., Los. D.A.. Wada, H„ Semenenko, V.E., and Murata, N. (1994) A new type of cytochrome с from Synechocystis PCC6S03. J. Plant Physiol 144: 259-264.

14. Murata, N.. Los, D.A., Gombos, Z., and Wada, H. (1994) Cyanobacterial desaturases and alteration of the lipid composition by genetic engineering. Abstr. V4 international Congress of Plant Molecular Biology. June 19-24, 1994. Amsterdam, Netherlands.

15. Murata, N.. Higashi, S., Wada, H„ Sakamoto, Т., Macherel, M.-H., Macherel, D., Tasaka, Y., and Los, D A. (1994) The cyanobacterial desaturases: aspects of their structure and regulation. In: Proceedings of the /¡Л Plant Lipid Meeting. pp. 53-53. June 26 - July I, 1994. Paris, France.

16. Sakamoto, Т., Los, D.A., Higashi, S., Wada, H„ Nishida, I., Ohmori, M., and Murata, N. (1994) The genetic manipulation of membrane-Iipid unsaturation with the a3 desaturase in cyanobacteria. Plant Mo/. Biol 26: 249-263.

17. Vigh, L„ Los, D.A., Murata, N.. Aeatz, A, Kovacz, E., and Horvath, I. (1994) Is the membrane the primary target in the biological perception of temperature? Effect of membrane physical state on the expression of stress-defence genes. Abstr. //" Plant Lipid Meeting. June 26 - July 1, 1994. Paris, France.

13. Vigh, L., Los, D.A., Murata, N.. Aeatz, A, Kovacs, E., and Horvath, I. (1994) The primary target in the biological perception of temperature is the membrane: effect of membrane physical state on gene expression. Abstr. 11J' Plant Lipid Meeting. June 26 - July 1, 1994. Paris, France.

19. Deshnium, P., Los, D.A., Hayashi, H., and Murata, N. (1995) Transformation of Synechococcus sp. PCC 7942 with the gene for choline oxidase enhances tolerance to salt stress. Abstr. X Intl. Photosyn. Congress, 20-25 August, 1995, Montpellier, France, Photosynth. Res. Suppl. 1, 1995, p. 206.

20. Deshnium, P., Los, D.A, Hayashi, H., and Murata, N. (1995) Glycinebetaine enhances tolerance to salt stress in transgenic cyanobacterium. In: Photosynthesis: from light to biosphere, ed. P. Mathis. Kluwer Acad. Pub!. Vol. IV: 637-640.

21. Deshnium, P., Los, D.A, Hayashi, H., Mustardy, L., and Murata, N. (1995) Transformation of Synechococcus with the gene for choline oxidase enhances tolerance to salt stress. Plant MoI.Biol: 19: 897-907.

22. Los, D.A. and Murata, N. (1995) Temperature-dependent expression of the desaturase genes in cyanobacterium: putative mechanisms of temperature sensing. Seminar on Signal Transduction. Kihara Institute for Biological Research. August 21-22, 1995. Yokohama, Japan.

23. Malakhov, M.P., Wada, H., Los, D.A, Semenenko, V.E., and Murata, N. (1995) Characterization of the murFgene of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6S03. Microbiology 141: 163-169.

24. Murata, N., Wada, H., Sakamoto, T., Tasaka, Y., Gombos, Z., Moon, B. Y., Deshnium, P., Los, D.A, and Hayashi, H. (1995) Genes for fatty acid desaturases and choline oxidase are responsible for tolerance to low-temperature and salinity stress in cyanobacteria and plants. In: Proceedings of the Workshop on Genes and their products for tolerance to physical stresses in plants. September 24 - 27, 1995. Maratea, Italy.

25. Mustardy, L., Los, D.A, Gombos, Z., and Murata, N. (1995) Localization of the membrane bound A12 desaturase in Synechocystis sp. PCC 6803. In: Photosynthesis: from light to biosphere, ed. P. Mathis. Kluwer Acad. Publ. Vol. Ill: 973-976.

26. Mustardy, L., Los, D.A, Gombos, Z., and Murata, N. (1995) Localization of the memUrane-bound A12 desaturase in Synechocystis sp. PCC 6803. Abstr. X Intl.

Photosyn. Congress, 20-25 August, 1995. Montpellier, France. Photosynth. Res. Suppl. 1, 1995, p. 164.

27. Gombos, Z., Wada, H., Varkonyi, Z., Los, D.A., and Murata, N. (1996) Characterization of the Fadl2 mutant of Synechocystis that is defective in Д12 acyl-lipid desaturase activity. Biochem. Biophys. Acta 1299: 117-123.

23. Los, D.A., Mustardy, L., and Murata, N. (1996) Temperature-dependent expression of four desaturase genes in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6303. Abstr. 36A Conference of National Institute for Basic Biology "Stress signaling and stress responses in plantf. January 9-11, 1996. Okazaki, Japan.

29. Los, D.A., Ray, M.K., Malakhov, M.P., and Murata, N. (1996) Low-temperature-induced gene expression of acyl-lipid desaturases. Abstr. 36* Conference of National Institute for Basic Biology. "Stress signaling and stress responses in plantí'. January 9-11, 1996. Okazaki, Japan.

30. Malakhov, M.P., Wada, H., Los, D.A. and Murata, N. (1996)'The coxD gene for heme О synthase in Synechocystis. Biochem. Biophys. Acta 1273: 84-86.

31. Mustardy, L., Los, D.A., Gombos, Z., and Murata, N. (1996) Immunocytochemical localization of acyl-lipid desaturases in cyanobacterial cells: evidence that the thylakoid membranes are the sites of lipid desaturation. Proc. Nat/. Acad. Sci USA 93: 10524-10527.

32. Mustardy, L., Los, D.A., Gombos, Z., Tsvetkova, N., Nishida, I., and Murata, N. (1996) Intercellular distribution of fatty acid desaturases in cyanobacterial cells and higher-plant chloropasts. Proceedings of 12th international Symposium on Plant Lipids. Toronto, Canada. - в печати.

33. Los, D.A. and Murata, N. (1996) Temperature-dependent expression of the desaturase genes in cyanobacterium: putative mechanisms of temperature sensing. In: Stress Signaling and Signal Transduction. Tokyo. - в печати.

34. Los, D.A., Ray, M.K., and Murata, N. Temperature-dependent expression of four desaturase genes in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. EMBO J. -в печати.