Введение гена десатураз в картофель Solanum tuberosum с целью повышения его холодоустойчивости и изучение физиологических свойств полученных растений-регенерантов

Маали Амири Реза

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Введение гена десатураз в картофель Solanum tuberosum с целью повышения его холодоустойчивости и изучение физиологических свойств полученных растений-регенерантов
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Введение гена десатураз в картофель Solanum tuberosum с целью повышения его холодоустойчивости и изучение физиологических свойств полученных растений-регенерантов"

На правах рукописи

Маали Амири Реза

«Введение гена десатураз в картофель Solatium tuberosum с целью повышения его холодоустойчивости и изучение физиологических свойств полученных растений-регенерантов»

03.00.12 - физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2007

003054308

Работа выполнена на кафедре физиологии растений биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор биологических наук, профессор Носов Александр Михайлович

доктор биологических наук Голденкова-Павлова Ирина Васильевна

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук кандидат биологичесюгх наук

Кузпецов Виктор Васильевич Хадеева Наталья Васильевна

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Московская Сельскохозяйственная Академия им. К.А.Тимирязева (МСХА)

Защита состоится 16 февраля 2007г. в 15-30 на заседании Диссертационного совета Д.501.001.46 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу:

119992, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет. Факс (495) 939-43-09

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан " ^ "__2007г.

Ученый секретарь Ой^У-ОХЛ^^-^

Диссертационного совета, •Л*'} , /

кандидат биологических наук ^ М.А. Гусаковская

1. Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Исследование физиологических и молекулярных механизмов холодоустойчивости растений является одним из наиболее важных направлений современных физиологии и биохимии растений. Растения не могут изменять внутреннюю температуру своего организма, и в процессе эволюции у них сформировались механизмы, обеспечивающие их функционирование при низких температурах окружающей среды. Многие из этих механизмов основаны на синтезе и накоплении протекторных соединений, изменении осмотического потенциала клетки и др. В середине прошлого века была предложена гипотеза, согласно которой основная роль в способности растений к низкотемпературной адаптации отводится мембранным липидам. При продолжительном и сильном снижении температуры окружающей среды текучесть мембран понижается, и они в значительной степени теряют способность поддерживать ионные градиенты и клеточный метаболизм, что приводит к гибели, как отдельных клеток, так и всего организма. Однако существует значительная группа растений, способных адаптироваться к длительному воздействию на них низких температур. Адаптация этих растений к низким температурам обусловлена способностью их клеток повышать текучесть своих мембран посредством увеличения доли полиненасыщенных жирных кислот в мембранных липидах. Важнейшую роль при этом играют десатуразы жирных кислот - ферменты, отвечающие за образование двойных связей, и, следовательно, за изменение физических свойств биологических мембран. Принципиально новые возможности для выяснения роли десатураз в механизмах холодоустойчивости открывают генно-инженерные подходы, в частности получение трансгенных растений, содержащих гены десатураз из гетерологичных организмов. Наибольший интерес в этом аспекте представляют гены ацил-липидных десатураз, формирующие первую (Д9) и вторую (А 12) двойные связи в молекулы жирных кислот. Из подобных десатураз наиболее изученными являются десатуразы цианобактерий desC (Д9-десатураза) и des А (Д12-десатураза). Ранее были получены и исследованы трансгенные по гену десатуразы desC растения табака; было установлено, что экспрессия этого гена приводит к повышению холодоустойчивости растений (Орлова и др., 2003). Использование подобных подходов имеет не только фундаментальное значение,

но и практическую ценность, поскольку они позволяют создавать устойчивые к низким температурам новые сорта сельскохозяйственных культур. Одной из них является картофель - важная пищевая и техническая культура, относительно устойчивая к низким положительным температурам, но значительно повреждаемая весенними заморозками.

Принципиальным моментом при проведении генно-инженерных работ является выбор эффективной репортерной системы для определения уровня экспрессии исследуемых генов и локализации их продуктов. Ранее была предложена новая система, основанная на использовании гена /г'сВ, кодирующего термостабильную лихеназу Clostridium thermocellum. Эта репортерная система имеет ряд преимуществ, прежде всего позволяет осуществлять быстрый отбор трансгенных организмов, определять уровни экспрессии гибридных генов и молекулярные массы белковых продуктов гибридных генов.

Цель исследования: Изучение экспрессии генов des А и desC в клетках про- и эукариот (E.coli и картофеля, Solanum tuberosum), определение жирнокислотного состава их липидов, проверка холодоустойчивости полученных растений-регенерантов, а также изучение возможности использования репортерной системы на основе термостабильной лихеназы (LicB) для получения трансформантов картофеля.

Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:

1. Анализ нуклеотидной последовательности генов desC и des А с целью оценки эффективности их экспрессии в клетках E.coli и Solanum tuberosum.

2. Клонирование нативных и конструирование гибридных генов desC и des А.

3. Конструирование бактериальных экспрессионных векторов в двух системах pQE и рЕТ.

4. Изучение экспрессии генов десатураз в E.coli и состава жирных кислот бактериальных трансформантов.

5. Конструирование растительных экспрессионных векторов, несущих нативные и гибридные гены десатураз.

6. Получение трансформированных растений картофеля и их молекулярный и физиолого-биохимический анализ.

Научная новизна работы.. Впервые для оценки экспрессии генов desC и desA в клетках про- и эукариот использована репортерная система на основе лихеназы (LicBM3). Установлено, что в составе гибридных белков как лихеназная, так и десатуразная активность сохраняется. Впервые получены трансформанты картофеля, несущие ген ацил-липидной Д12-десатуразы. Показано, что экспрессия гетерологичных генов десатураз в растениях приводит к повышению уровня ненасыщенности жирных кислот (ЖК) мембранных липидов.

Апробация результатов работы. Результаты работы были представлены на многих Международных и Российских конференциях, в частности 7th International Conference of Plant Genomics, Harbin, China, 2006; International 15й1 Congress of the Federation of European Societies of Plant Biology FSEPB, Lyon, France, 2006; 43th Annual Meeting of the Society for Cryobiology and Society for Low temperature Biology, Hamburg, Germany,2006; 24th Annual Meeting of ESCPB Stress in Systems Biology", Antwerpen, Belgium, 2006; International Scientific Conference Genetic-Physiological Fundamentals of Plant Growth and Productivity" Vilnius, Lithuania, 2006; Годичном Собрании Общества Физиологов Растений России, Ростов-на-Дону, 2006 и др.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена страницах машинописного текста, включая 4 $ таблиц и 3 8 рисунков.

2. Основное содержание работы

Глава 1. Обзор литературы. В обзоре литературы приведены сведения о типах десатураз жирных кислот цианобактерий и высших растений, анализ строения этих десатураз и структуры кодирующих их генов, механизмы регуляции их экспрессии. Рассмотрены основные механизмы устойчивости растений к низким температурам, роль в них мембранных липидов. Приведена информация о новых репортерных системах на основе лихеназы Clostridium thermocellum.

Список цитируемых литературных источников включает

наименования.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

В работе использовали штаммы E.coli: XLlblue (Stratagene):F'::TnlOtet, proA"1!!* lacl Q, D(lacZ)M 15/recA1, endAl, gyrA96, tlii,hsdR17, (rk-m k+), supE44, relAl,lac; штамм BL21(DE3) ("Novagene"iirraT,CIIIA) F' dem ompT hsd S(r b. m ь.) gal 1ÍDE3); штаммы Agrobacterium tumefaciens AGLO (rec::bla pTiBo542AT, Mop+,CbR). Стандартные процедуры молекулярного клопированпя выполняли согласно методическому руководству Sambrook et al. (2001). Из генома циаяобактерий Synechocystis sp. РСС6803 были клонированы гены des А и desC, с последующим клонированием в промежуточных плазмидных векторах. Конструирование генов desC и des А осуществляли в двух бактериальных экспрессионных системах pQE30 и рЕТ22.

Растения. Использовали растения картофеля Solanum tuberosum сорта <Десница>. Агробактериальпую трансформацию растений картофеля проводили по разработанному ранее в ИФР РАН методу с использованием микроклубней (Дерябин, Юрьева, 1997). Отбор трансформантов и дальнейшее их поддержание проводили на среде MC с добавлением 50-100 мкг/мл канамицинсульфата. Молекульярно-биологпческий анализ первичных трансформантов растений проводили с использованием методов ПЦР, а таже количественных и качесвенных методов определения активности лихеназы.

Методы определения активности. Количественное определение лихеназной активности в бактериальных и растительных белковых лизитах проводили по методу Miller et al. (I960) с модификациями (Голденкова с сотр., 2003). За едикицу активности принимали количество фермента, образующее 1 мкмоль восстанавливающих Сахаров за 1 мин. Зимограммы получали разделением белков в 10% ДСН-ПААГ, содержащем субстрат лихенан, с последующим окрашиванием гелей 0.5% раствором Конго красного (Sigma) и отмыванием в 1 М NaCl. Активность лихеназы в бактериальных колониях методом чашечного теста проводили согласно Teacher & Wood (1982).

Белковые экстракты для определения активности лихеназы получали разрушением клеток в 50мМ трис-HCI, pH 8,0 ультразвуком, с последующим центрифугированием при 12000g в течение 30 мин для получения осветленных препаратов.

Анализ жирных кислот проводили с использованием газо-жидкостной хроматографии по разработанному ранее методу (Верещагин с сотр., 1985, Пчёлкин с сотр.2006).

Устойчивость растений картофеля к окислительному стрессу, индуцированному низкой температурой определяли по накоплению в листьях основного продукта перекисного окисления липидов (ПОЛ) — малонового диальдегида (МДА) (Жиров с сотр. 1982).

Определение пронипаемости мембран при охлаждении оценивали по выходу электролитов из тканей растений (Herburn et al., 1996).

Статистическая обработка данных. Данные в таблицах и на рисунках представляют собой средние арифметические величины и стандартные ошибки, полученные при обработке результатов пяти независимых экспериментов.

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Анализ нуклеотидной последовательности генов desC и des А.

Первым этапом работы был анализ нуклеотидных последовательностей генов desC и des А с целью оценки встречаемости редких кодонов. Были использованы компьютерные базы данных: GENSCAN

(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html - поиск интронов, поли А-сигналов); Codon usage Database (http://www.kazusa.or.jp/codon/; http://gcua.schoedl.de/); Countcodon program (http:/www.kazusa.or.jp/codon/countcodon). Для выравнивания нуклеотидных и аминокислотных последовательностей применяли программу Blastn, Blastp -http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).

Сравнительный анализ встречаемости кодонов у Е. coli, Synechocystis, Solanum tuberosum и генов десатураз цианобактерий позволил заключить, что нуклеотидная последовательность гена Д9-десатуразы содержит 0.4% редких кодонов относительно Е. coli и Synechocystis, в то время как ген Д12-десатуразы содержит 2.3% редких кодонов относительно Е. coli, и не содержит редких кодонов относительно Solanum tuberosum. Таким образом, можно предположить, что в Solanum tuberosum должны эффективно эксперсссироваться оба гена. В клетках Е. coli можно ожидать эффективную экспрессию гена Д9-десатуразы, и не столь высокую - гена Д12-десатуразы

3,2. Конструирование п р ока р и оти чес к их экспресеионных векторов.

Дм изучения экспрессии генов десатураз в модельных организмах был использован подход, заключающийся в конструировании и переносе гибридных генов, в состав которых входят целевой геи и ген репортергого белка термостабильной лихеназы, слитых в рамке считывания. Методами молекулярного клонирования были сконструированы гибридные гены desC-licЪMЗ и ¿еяА-//сВМЗ. Созданные гибридные гены, а также нативные гены скзС и с1е$А были клонированы в экспресснонные вектора для трансформации клеток Е.соИ: рЕТ-de.cC, рТЛеяС-ПсВМЗ, рЕТ-^А, рЕТ-сША-1№Ж (рис.1, а), рОЕЗО-^С, р(ЗЕЗО-йЬС-УгсВМЗ, рОЕЗО-с/еяА, р(}Е30-с!езА-НсВШ (рис, 1.6).

А:

Рис 1. Схема бактериальных экспресс ионных векторов.

А - pET-ifcsC, pET-Je.iСjcBМ3, рЕТ-гЬА, рЕТЧЯюА-йсВМЗ,

Б - pQE30-deiC, pQE30-rfesC-/ieBM3: pQE30-cfoiA, pQE30-AsA-//cBM3.

3.3-1, Молекулярный анализ бактериальных трансформантов, несущи* плазм иды с нативнымн desC, des А и гибридными ifesC-ÖeBM3, <feiA-/)cBM3 генами.

Для сравнения уровня экспрессии генов desC, desA в прокариотических и эукариотических клетках, на первом этапе работы были получены бактериальные трансформанты (штаммы Е.coli XLlblue и BL21), несущие гошмиды, содержащие бактериальные экспресснонные вектора.

Первоначально бактериальные трансформанты были проанализированы методом чашечного теста (рис.2). Активность релортерного белка лихеназы обнаружена только у транс фор мантов, несущих плазмиды. которые содержали последовательность гена йсВМЗ или гибридных генов рЕТ-(/еяС-/(сВМЗ, рОЕЗО-б6г$С-ИсШМЩ рЕТ-с1е.чА-ИсВМ3 и рОЕЗО-<Л«А-/|еВМЗ (рис.2).

Для доказательства синтеза белковых продуктов перенесенных генов в бактериальных трансформ антах белковые экстракты из бактерий были проанализированы методом ПААГ электрофореза (рис.3,4,5). Однако сколь нибудь значимых различий в спектрах полипептидов между индуцированными и контрольными препаратами обнаружено не было. Поэтому для доказательства экспрессии рекомбинантных десатураз был использован метод энзимограмм, основанный на определении активности репортерного гена - лихеназы. (рис.3,4,5). Как видао из представ летных результатов активность термостабильж® лихеназы выявлена только у транс формантов, в состав которых входит релортерный ген термостабильной лихеназы.

А;

Б:

Рис.2. Чашечный тест бактериальных трансформантов, несущих плазмиды: А - рОЕ-ЛсВМЗ (1), рОЕ-А^С (2), рОЕ-Л^С-ИсВШ (3), рЕТ-с/ел'С-// г В М 3 (4) Б - рОЕ-ЫсВМЗ (1), рЕТ-^А-ЛсВМЗ (2), рЕТ-аезА (3). В - рОЕ-НсёШ (1), р<ЗЕ-АмА-ЙеВМЗ (2), рОЕ-с/е.уА (3).

75 кДа 50 кДа

35 кДа 25 кДа

15 кДа

75 кДа 50 кДа

36 кДа 26 кДа

Рис. За. Электрофоре грамм а белковых экстрактов, Полученных из клеток Е.соИ. М - маркер молекулярных масс. 1 - БсзС-ЫсВМЗ; 2 - ОевС; 3 - ЬкВМЗ; 4 -ХЫВ1ие.

Рис 36- Зимограмма белковых экстрактов, полученных из клеток Е.соИ 1- ЭсзС; 2- 1лсВМЗ; 3- ОскС-исВМЗ; М- маркер.

75 кДа 50 кДа

36 кДа

26 кДя

Рис. 4. Электрофоре грамма (слева) и зймограмма (справа) белковьгх экстрактов, полученных из бактериальных трансформантов плазмид рС)Е-Ое5Л-ЕсВМЗ; М-маркер, ЬЭезА; 2-ОеяА-ЫсВМЗ, 3- рОЕ; 4- рОЕ-ОсэА-ПсВМЗ; 5-ЬгсВМЗ

- J-l —J p i,."-.

Таким образом, методом энзимограмм было показано, что лихеназа в составе гибридных белков сохраняет как свою термостабильность, так и активность, и по активности лихеназы можно точно определять молекулярные массы гибридных белков, в состав которых входит лихеназа.

Следует отметить, что молекулярные массы гибридных белков ОсэС-Ь]сВМЗ и РевА-ЫеВМЗ, выявленных методом энзимограмм, соответствует теоретически рассчитанным и составляют около 63 и 66.5 кДа соответственно.

Уровень экспрессии генов может быть определен по количеству образовавшихся мРНК и/или белкового продукта. Мы оценили уровень экспрессии гибридных генов ¿ехА-ЦсВМЗ и <&в6-ЙсВМЗ в клетках прокариот на основании данных количественного определения уровня активности лихеназы, входящей в состав гибридных белков (табл. 1). Для сравнения уровня накопления гибридных белков были использованы полученные нами ранее бактериальные рОЕЗО-^сВМЗ трансформант].!, экспрсссрующие лихеназу. Как видно из представленных данных, уровень экспрессии гибридного гена ¿е*А-//сВМЗ значительно ниже, чем таковой гибридного гена <}езС-НсВМЗ.

Рис. 5. Электрофореграмма (слева) и зимограмма (справа) бел ко вых э к стракто в. полученных из бактериальных трансформантов плазмид рЕТ-DesA-licBM3; M - маркер, 1 -рЕТ; 2-pQE;

3 - р ET-des А;

4 - pET-DesA-licB M 3; 5- pET-DcsA-licBM3; б - LicBM3.

Возможно, низкий уровень экспрессии гибридного гена desA-ИсВМЗ обусловлен наличием в его последовательности кодонов. которые редко используются как в клетках E.coli, так и в клетках циапобактсрий. Можно предположить, что это обусловлено тем, что экспрессия гена des А у

цианобактерий запускается воздействием ряда стрессовых факторов, например таких, как низкие температуры.

Таблица 1. Уровни экспрессии гибридных генов определенных по активности термостабильной лихеназы.

Вариант Активность (ед/мг суммарного белка) Относительная активность в %

Контроль <10^ -

ЫсВМЗ 296 ±3 100

DesC-LicBM3 288 ±2 97

DesA-LicBM3 0,552 ± 0,023 2

3.3.2. Изучение влияния введенных генов ацил-липидных десатураз на состав жирных кислот липидов бактериальных трансформантов.

Несмотря на то, что активный центр десатураз сформирован аминокислотами, расположенными в середине белковой молекулы, удаленной от N- и С-концевой областей фермента, необходима проверка сохранения активности десатураз в составе гибридных белков. Для этого бактериальные трансформанты, несущие плазмиды с нативными и гибридными генами Д9- или Д12-десатураз, были выращены на минимальной среде с добавлением ИПТГ (изопропил-6(1-галактопиронозида) и соответствующего субстрата, в качестве которого для изучения экспрессии гена desC использовали стеарат натрия (18:0), а гена des А -олеат натрия (С18:1). В качестве контроля были использованы бактериальные трансформанты, несущие плазмиды только с репортерным геном термостабильной лихеназы. Далее методом газо-жидкостной хроматографии определили жирнокислотный состав липидов контрольных и трансформированных генами Д9-и Д12-десатуразы клеток E.coli. Полученные результаты представлены в таблицах 2 иЗ.

Из табл. 2 можно видеть, что в клетках, экспрессирующих нативный и гибридный ген desC и выращиваемых на среде, содержащей стеарат натрия, относительное содержание остатков стеариновой кислоты (С 18:0) снижалось, что сопровождалось повышением доли остатков олеиновой кислоты (С18:1д9); уровень С16:1 при этом не изменялся. Это свидетельствует о высокой субстратной специфичности Д9-десатуразы, десатурирующей С18:0, но не С16:0. Содержание

олеиновой кислоты в трансформантах достигало 12% для нативной десатуразы и 9% - для гибридного белка DesC-LicB.

Таблица 2. Изменение состава жирных кислот в клетках Е. соП в результате экспрессии нативного и гибридного генов с1е$С в системе экспрессии рЕТ.*

ЖК Относительное содержание ЖК, % от суммы МЭЖК

контроль рЕТ-Д9 рЕТ-Д9-ИсВ

16:0 31.1 27.1 30.8

16:1 А5 0.1 0.1 0

16:1 Д9 0 0 0

16:1 Д11 4.6 4.9 5.0

17:0" 3.1 3.0 2.5

18:0 58.0 51.0 51.8

18:1 Д9 2.4 12.3 8.7

18:1 Д11 0.3 0.3 0.1

транс-9,\2-\%:2 0.1 0.3 0.5

19:0" 0.4 1.0 0.6

* Во всех случаях статистическая ошибка не превышала 0.1%.

" Суммарное количество двух изомеров, один из которых, возможно, представляет собой циклическую ЖК.

Таблица 3. Изменение состава жирных кислот в клетках Е. coli в результате экспрессии нативного и гибридного генов des А в системах экспрессии pQE и рЕТ .

ЖК Относительное содержание ЖК, % от суммы МЭЖК

Система pQE Система рЕТ

Контр. pQE-A12 pQE-A12-Lic В Контр. рЕТ-Д12 рЕТ-Д12-1Лс В

14:0 1.3 1.0 1.1 0.5 0.5 3.5

16:0 9.1 7.3 9.2 8.3 4.1 10.1

16:1 Д5 0 0 0.2 0 0.2 0

16:1 Д9 0 0.2 0.1 0 0 0

16:1 Д11 1.8 1.8 1.7 1.8 0.9 2.6

V17:0 1.6 1.2 1.2 0.8 0.6 0.2

18:0 1.1 0.4 0.2 0.7 0.5 0.7

18:1 Д9 80.0 83.3 82.3 82.8 86.9 74.8

18:1 Д11 2.3 3.0 1.5 4.6 2.5 3.6

18:2 Д9,12 0 0.2 0.5 0 0.3 1.9

V19:0 1.2 0 0.1 0.4 0.9 0.9

17-Ме-19:0 0 0 0.5 0 0.1 0.4

* Во всех случаях статистическая ошибка не превышала 0.1%.

Изменение состава жирных кислот в клетках Е. соИ в результате экспрессии гена с1еяА представлены в таблице 3. Как известно, в геноме Е.соН этот ген отсутствует, поэтому в нетрансформированных клетках (контроль) линолевая кислота (18:2) не обнаружена, тогда как в трансформированных клетках она появляется. Во всех исследуемых вариантах не обнаружили С 16:2 ЖК. Это свидетельствует о специфичной активности Д12-десатуразы в трансформированных клетках, использующей субстрат С18:1, но не С16:1. Максимальный уровень содержания линолевой кислоты в бактериальных трансформантах не превышал 2% от суммы ЖК. Наблюдаемый относительно низкий уровень экспрессии гена с1евА может быть обусловлен наличием в его последовательности кодонов, которые редко используются в клетках Е. соН.

Таким образом, можно заключить, что сравнительный анализ экспрессии нативного и гибридного генов в клетках бактерий показал, что лихеназа в составе гибридных белков сохраняет активность и термостабильность, а десатуразы сохраняют способность катализировать введение двойной связи в соответствующие жирные кислоты. Следует также отметить, что использование лихеназы как трансляционного репортера позволяет быстро и точно определять уровни экспрессии гибридных генов, в состав которых входит ген термостабильной лихеназы, а также молекулярные массы их белковых продуктов, что является важным при создании трансгенных растений.

На основании полученных результатов был сделан вывод, что для трансформации растений использование гибридных генов, в которых последовательность генов десатураз слита с последовательностью репортерного гена, кодирующего термостабильную лихеназу, весьма перспективно.

3.4. Получение трансформантов картофеля и молекулярно-бнологический анализ полученных растеиий-регенерантов.

В результате процедур молекулярного клонирования был сконструирован растительный экспрессионный вектор рВ1 1 -1Ы-а'е5А-//сВМЗ и рВ^Ш-ГМ-^еяА , в которых гибридный и нативный ген я'мА-//еВМЗ находился под контролем сильного конститутивного промотора 358 РНК СаМУ. В качестве репортерного гена использовали НсВМЗ, а селективного гена - прШ.

Растения-регенераты, трансформированные геном с!езА-НсВМЗ и устойчивые к канамицину, были проанализированы методом качественного определения активности лихеназы. В таблице 4 представлены результаты селекции этих регенерантов на среде с канамицином с последующим отбором первичных трансформантов по активности лихеназы (табл. 5).

Проведенные эксперименты позволили отобрать трансформанты растений картофеля линии ВезА-1лсВМЗ, которые экспрессировали перенесенный гибридный ген. Далее, первичные трансформанты, отобранные на селективном агенте, были проанализированы методом ПЦР. Для анализа первичных трансформантов линий ВезА-ГлсВМЗ и ВсзА использовали специфические праймеры к последовательностям генов desA и /г'сВМЗ. Полученные фрагменты соответствовали размерам этих последовательностей — 1053 п.н. для гена desA и 1700 п.н. для гибридного гена, соответственно.

Таблица 4. Эффективность трансформации гибридными генами desA-licBM3 (Д12-НсВМЗ) и desA (Д12).

Конструкции Д12 Д12-НсВМЗ

Кол-во эксплантов 21 22

Кол-во полученных регенерантов 16 29

Кол-во канамицин-устойчивых регенерантов 6 8

Кол-во трансформированных линий 1 4

Эффективность трансформации (количество трансформированных регенерантов на 1 исходный эксплант) 0.05 0.18

Таблица 5. Эффективность экспрессии гибридных генов, рассчитанная по активности термостабильной лихеназы.

Растительные линии Активность лихеназы, (ед./мг суммарного белка) Уровень накопления рекомбинантных белков (% от суммарного белка)

Линия 1 (ЭезА-УсВМЗ) 0.065 0.0155

Линия 2 (ОеэА-ЫсВМЗ) 0.016 0.007

Линия 3 (ЛезА-ПсВМЗ) 0.066 0.0157

Линия 4 (БезА) 0 0

Контроль, ЫРТИ-познтивный 0 0

Полученные результаты позволяют сделать вывод, что термостабильная лихеназа является удобным трансляционным репортером для отбора трансгенных

организмов. Можно также заключить, что эффективность трансформации (рассчитанная как количество трансформированных линий на исходный эксплант) почти в 3 раза выше в варианте использования гибридного гена ¿еяА-НсВМЗ.

Исходя из полученных результатов, для дальнейшей работы были выбраны трансформированные растения картофеля несущие гибридный ген БезА-ЬюВМЗ (линии 1,2 и 3) и линия 4 с нативным геном ОевА.

3.5. Качественный и количественный состав ЖК трансформированных растений.

Для изучения эффекта Д12-ацил-липидной десатуразы на ЖК-состав липидов надземных частей контрольных и трансформированных растений был проведен анализ абсолютного содержания отдельных ЖК в липидах листьев и стеблей. Полученные результаты представлены в табл. 6.

Установлено, что липиды изученных линий картофеля включали 16-19 индивидуальных видов С14-С20 ЖК. Главными ЖК липидов всех исследованных растений были линоленовая (Д9,12,15-18:3), линолевая (А9,12-18:2) и пальмитиновая (16:0); в значительном количестве содержались также гексадекатриеновая (А7,10,13-16:3), пальмитолеиновая (Д9-16:1). Во всех линиях трансформированных растений, кроме линии 1, в расчете на 1 г сырой массы количество главных полиненасыщенных ЖК (18:2 и 18:3) увеличивался по сравнению с контролем. Так, содержание линолевой кислоты возрастало на 72% (линия 2), 35% (линия 3) и 40% (линия 4), а повышенный уровень линоленовой кислоты отмечен для линии 3, где он был на 41% выше контроля, и линии 4 (на 12%). Соответственно, индекс ненасыщенности ЖК в липидах линий 2, 3 и 4 на 21.4,43 и 21.4% превосходил контрольный.

Наиболее интересным представляется изменения содержания в растениях трансформантах 16:3-ЖК. Известно, что картофель относится к 16:3-растениям, то есть его хлоропласты содержат Д7,10,13-16:3 ЖК. Также известно, что эта кислота, содержащаяся в ¡п-2 положении фосфатидилдиацилглицеринов хлоропластов, играет большую роль в холодоустойчивости 16:3-растений, вероятно, способствуя процессу фотосинтеза при пониженных температурах. Как следует из результатов табл. 6, содержание остатков 16:3-ЖК в липидах линии 3 было почти вдвое выше, чем в контроле. Поскольку при биосинтезе Д7,10,13-16:3

ЖК субстратом служат липиды, включающие в ¡п-2 положении А7,10-16:2, также обнаруженную в липидах картофеля, можно предположить, что в трансформантах картофеля Д12-десатураза в качестве субстрата может использовать не только С18-ЖК, но и С16-ЖК. Возможно, что активность именно этого фермента приводила к значительному увеличению содержания А7,10,13-16:3 ЖК в липидах трансформантов линии 3.

Таблица 6. Абсолютное содержание жирных кислот в листьях различных линий растений картофеля, трансформированных геном Д12-ацил-липидной десатуразы*.

ЖК Состав ЖК, мкмоль/г сырой массы

Контроль Линия 1 Линия 2 Линия 3 Линия 4

14:0 0.05 0.03 0.07 0.04 0.05

13-Ме-14:0 0.05 0.02 0.05 0.09 0.25

15:0 0.02 0.02 0.04 0.01 0.03

изо-16:0 0.12 0.03 0.01 0.13 0.11

16:0 1.48 1.84 2.40 1.74 1.84

Д9-16:1 0.39 0.16 0.08 0.53 0.72

15-Ме-16:0 0 0 0 0 0.03

Д7,10-16:2 0.04 0.04 0.06 0.06 0.05

Д9,12-16:2 0.02 0.01 0.04 0.01 0.02

Д7,10,13-16:3 0.40 0.31 0.48 0.75 0.34

15-Ме-!7:0 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01

18:0 0.13 0.12 0.15 0.14 0.19

Д9-18:1 0.05 0.05 0.09 0.09 0.13

А11-18:1 0.03 0.04 0.03 0.04 0.03

Д9,12-18:2 1.58 1.54 2.73 2.13 2.20

19:0 0.01 0 0.01 0.02 0.02

Д9,12,15-18:3 3.03 2.49 3.13 4.28 3.38

18-Ме-19:0 0 0 0.08 0.07 0

17-Ме-19:0 0 0 0.04 0.01 0

20:0 0.04 0.05 0.11 0.07 0.09

Сумма ЖК 7.44 6.77 9.60 10.22 9.50

ин 0.14 0.12 0.17 0.20 0.17

* Во всех случаях статистическая ошибка не превышала 0.1%.

Из данных табл. 6 можно также видеть, что суммарное количество ЖК у линий 2, 4 и 3 увеличивалось на 28-37%, и только у линии 1 было на 9% ниже уровня контроля. Таким образом, экспрессия гена desA стимулировала биосинтез мембранных липидов у большинства линий трансформантов.

Следует также отметить еще один любопытный факт - в результате введения гена десатуразы des А в трансформированных растениях синтезировались несколько видов минорных ЖК, которые отсутствуют в контроле.

Таким образом, на основании полученных результатов можно заключить, что введение гена Д12-ацил-липидной десатуразы существенно изменяет качественный и количественный состав жирных кислот в липидах растений-регенерантов картофеля. Наибольший интерес с точки зрения возможного повышения устойчивости к низким температурам, представляет линия 3 с повышенным содержанием ЖК с тремя двойными связями.

3.6. Интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) в листьях трансформированных растений картофеля.

Известно, что увеличение количества ди- и триеновых ЖК является результатом активности Д12- и соЗ-десатураз картофеля, которые используют в качестве субстратов ацильные остатки моно- и диненасыщенных ЖК и вводят, соответственно, вторую и третью двойную связь в молекулу жирной кислоты. Поскольку введение второй двойной связи в цепь ЖК является необходимым условием ее дальнейшего десатурирования, то именно Д12-десатураза позволяет преодолеть один из лимитирующих этапов, который необходим для выживания клеток при низких температурах. В этой связи было интересно исследовать физиологические характеристики трансформированных растений-регенерантов, которые характеризуют устойчивость растений к стрессовым факторам.

Как известно, перекисное окисление липидов (ПОЛ) приводит к частичному разрушению, прежде всего, полиненасыщенных ЖК, изменяя тем самым физико-химические свойства мембран. Одной из самых ранних неспецифических реакций клетки на неблагоприятные воздействия окружающей среды, в том числе на низкотемпературный стресс, является развитие окислительного стресса. Последний инициируется активными формами кислорода (АФК) и может приводить к интенсификации перекисного окисления ненасыщенных ЖК липидов

мембран и к увеличению содержания в тканях одного из его конечных продуктов — малонового да альдегида (МДА). Таким образом, содержание МДА служит показателем активности окислительных процессов, обусловленных АФК, которые взаимодействуют с ненасыщенными жирными кислотами, вызывая усиление перекисного окисления липидов (ПОЛ) в плазмалемме и клеточных органеллах. Поэтому для оценки степени холодостойкости трансформированных растений картофеля был использован метод определения интенсивности ПОЛ по содержанию МДА.

Из данных, приведенных на рис. 6, видно, что в результате переохлаждения (выдерживания растений при температуре -ТС в течение 30 мин) содержание МДА в тканях контрольных растений возраста;», а спустя 1 ч после возврата растений в условия с нормальной температурой (22°С) оно на 25% превышало таковое в контроле (неохлаждаемый вариант). Что же касается исследуемых трансформантов картофеля, то даже до охлаждения (22°С) уровень МДА во всех случаях был почти в 1.5 раза ниже, чем в контроле.

22 4С После мин После мин при -7 С и

окп^ждения ПРИ 71С 60 при 27'С

Рис. 6. Интенсивность перекисного окисления липидов в листьях различных трансформированных линий растений картофеля (Solanum tuberosum L.) в норме и после охлаждения.

После искусственного переохлаждения в тканях транс фор мантов линий 1 и 2, в отличие от контрольных растений, увеличения содержания МДА не наблюдалось, а у двух Других линий (3 и 4) этот показатель даже уменьшался на

30 и 25 % соответственно. Последующий перенос растений-трансформантов в оптимальные условия выращивания (22°С) и выдерживание их в течение 1 ч не приводило к изменению содержания МДА в их тканях, и оно продолжало оставаться на исходном уровне.

Таким образом, определение интенсивности ПОЛ в тканях полученных трансформантов картофеля выявило их повышенную по сравнению с контролем устойчивость к окислительному стрессу, вызванному переохлаждением. В то же время усиление накопления продуктов ПОЛ в тканях контрольных растений картофеля при снижении температуры среды свидетельствовало о серьезных повреждениях их мембранных структур.

3.7. Определение устойчивости к низким температурам контрольных и трансформированных растений по выходу электролитов.

Известно, что понижение температуры окружающей среды, увеличивая проницаемость клеточных мембран, главным образом, плазмалеммы, вызывает интенсивный выход ионов из клеток, который легко регистрируется в виде резкого увеличения скорости утечки растворенных веществ из тканей растений после их инфильтрации водой. Этот метод позволяет выявить нарушение структуры клеточных мембран при охлаждении. Показано, что выход ионов зависит от температуры охлаждения и продолжительности ее действия (Wright, Simon, 1973).

Анализ полученных результатов показал, что при оптимальной температуре выращивания 22°С (без охлаждения) контрольные и трансформированые растения, по индексу повреждения значительно отличались (рис.7). Для всех трансформантов, за исключением линии 2, был отмечен более слабый выход электролитов из тканей. Индекс повреждения у линий 1, 3 и 4 был на 32.7%, 41.2% и 41.2 % ниже, чем в контроле. Линия 2 практически не отличалась по этому показателю от контроля при выращивании в оптимальной температуре. Эти результаты свидетельствуют об активности гена des А с промотором 35S РНК CaMV даже при оптимальной температуре.

Охлаждение увеличило проницаемость мембран всех вариантов. Причем наибольшая степень повреждения наблюдалась у растений контрольного варианта: индекс повреждения оказался на 51.7% выше по сравнению с неохлаждаемым вариантом. Индекс повреждения в трансформированных линиях (линии 1, 2, 3 и 4,

соответственно) уменьшался на 36.5%, 46.5%, 31% и 56% по сравнению с контрольными охлажденными растениями.

По изменению индекса повреждения можно судить о нарушениях барьерных свойств плазмалеммы. В связи с этим полученные результаты можно интерпретировать, как значительное снижение барьерных функций плазмалеммы у тканей контрольных растений при охлаждении, что соответствует высокой степени холодового повреждения и свидетельствует о пониженной холодостойкости этих растений. В то же время, трансформированные растения имеют достоверно более низкие значения индекса повреждения, по сравнению с контролем, что позволяет' охарактеризовать их как более устойчивые к пониженной температуре.

Рис.7. Индекс повреждения листьев различных трансформированных линий растений картофеля (Solanum tuberosum L.) в норме и после охлаждения.

Таким образом, в настоящей работе показано, что низкая температура оказывает разнос влияние на линии трансформированного картофеля, различающиеся по уровню экспрессии гена Ди-ацил-липидпой десатуразн, и контрольные растения. Полученные данные подтверждают предположение о важной роли ненасыщенных ЖК в снижении температуры фазового перехода липндов в механизмах устойчивости растений к низкой температуре.

■ Контроль ^Линия 1 ИЛиния 2 □ Линия 3 ШЛиния 4

22 "С

После 3D МИН охлаждения при -ТО

Заключение

Формирование устойчивости растений к низкой температуре является комплексным процессом, запускающим каскад сложных функциональных изменений, в том числе перестройку липидных компонентов мембран, включающих десатурацию жирных кислот. В течение последних двух десятилетий большое внимание уделяется молекулярным механизмам холодоустойчивости растений. Знания биохимии и молекулярной биологии десатураз жирных кислот открывает широкие перспективы в области биотехнологии и сельского хозяйства, поскольку позволяет создание сортов и видов растений, способных переносить ограничения той или иной климатической зоны.

Представленные результаты исследования позволяют заключить следующее: нуклеотидная последовательность, а также кодоновый состав генов могут влиять на их экспрессию в разных организмах, поскольку уровень экспрессии гибридного гена desA-licBM3 в бактериях оказался значительно ниже, чем таковой гибридного гена desC-licBMi. Возможно, низкий уровень экспрессии гибридного гена desA-licBMi на уровне активности репортерного гена и жирнокислотного состава обусловлен наличием в его последовательности кодонов, которые редко используются как в клетках E.coli, так и в клетках цианобакгерий.

Продемонстрировано, что в составе гибридных DesA-LicBM3 и DesC-LicBM3 белков DesA и DesC белки сохраняют свою биологическую активность -катализировать введение двойной связи в цепи ЖК и изменять ЖК-состав липидных мембран в клетках E.coli и растений картофеля, а лихеназа сохраняет основные свойства репортерного белка - термостабильность и активность. Полученные результаты свидетельствует о возможности использования этой репортерной системы при изучении экспрессии генов в клетках про- и эукариотических организмов.

Полученные результаты показывают, что в трансформированных растениях картофеля синтезируется гетерологичная Д12-ацил-липидная десатураза, которая стимулирует биосинтез мембранных липидов и повышает уровень ненасыщенных ЖК, в частности 18:2 и 18:3 и, в ряде случаев, 16:3. Значительные изменения в липидах мембран за счет увеличения ненасыщенности их ЖК свидетельствуют о

том, что десатураза цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 эффективно экепреесируется в листьях картофеля и повышает уровень ЖК 18:2, служащий субстратом для последующего синтеза триеновых ЖК. Таким образом, перенос гена Д12-ацил-липидной десатуразы в геном растений картофеля может приводить к увеличению ненасыщенности мембранных липидов. При этом, увеличение доли полиненасыщенных ЖК в мембранных липидах может приводить к повышению холодостойкости трансформантов картофеля.

Выводы

1. Анализ последовательности генов desC и des А показал, что для эффективной экспрессии в про- и эукариотах нуклеотидные последовательности этих генов в модификации не нуждаются.

2. Показано, что нативные и гибридные гены А9- и Д12-десатураз эффективно экспрессируются в клетках прокариот (Е. coli) и эукариот (картофель). При этом как лихеназа, так и десатуразы сохраняют свои основные свойства.

3. Впервые показано, что гетерологичная ацил-липидная Д12-десатураза эффективно экспрессируется в трансформантах картофеля, вызывает изменения биосинтеза мембранных липидов и повышает уровень ненасыщенности ЖК.

4. В результате экспрессии бактериального гена desA изменяется физиолого-биохимическое состояние растений-регенерантов картофеля, в частности интенсивность перекясного окисления липидов и степень проницаемости мембран. Обнаруженные изменения свидетельствуют о повышении холодостойкости трансформированных растений.

5. Поскольку бактериальные десатуразы сохраняют каталитическую активность в составе гибридных белков, для трансформации высших растений могут быть использованы гибридные гены, в которых последовательности генов десатураз слиты с последовательностью репортерного гена, кодирующего термостабильную лихеназу.

Опубликованные по материалам диссертации работы:

1. Маали А.Р., Шимшилашвили Х.Р., Пчёлкин В.П., Цыдендамбаев В.Д., Носов A.M., Лось Д.А., Голденкова-Павлова И.В. Сравнительное изучение экспрессии нативного и гибридного гена ацил-липидной Д - десатуразы в бактерии Escherichia coli // Генетика, 2007. Т.43, №2. с. 176-182.

2. Maali A.R., Goldenkova-Pavlova I.V., Nosov A.M., Los D.A. New approach for the expression of the gene Д12 acyl-lipid desaturase in plant // Proceeding of the 7th International Conference of Plant Genomics, Harbin, China, 2006, P. 142.

3. Maali A.R., Goldenkova-Pavlova I.V., Nosov A.M., Los D.A., Shimshelashvili X. New approach for the expression of the gene Д12 acyl-lipid desaturase in plant // Proceeding of the International 15th Congress of the Federation of European Societies of Plant Biology FSEPB, Lyon, France, 2006, P. 134.

4. Maali A.R., Goldenkova-Pavlova I.V., Nosov A.M., Los D.A., Shimshelashvili X.P. Expression of the gene delta9 acyl-lipid desaturase in Escherichia coli // Proceeding of the 43 annual meeting of the Society for Cryobiology and Society for Low temperature Biology, Hamburg, Germany, 2006, P. 198.

5. Маали A.P., Голденкова-Павлова И.В., Носов A.M., Лось Д.А., Шимщлащвили X.P. Влияние трансформации Escherichia coli геном Ацил-липидной Д9-десатуразы на устойчивость организма к низкой температуре // Сборник материалов Годичного Собрания Общества Физиологов Растений России, Ростов-на-Дону, России, 2006, с.119.

6. Маали А.Р., Голденкова-Павлова И.В., Носов A.M., Лось Д.А., Шимщлащвили Х.Р. Сравнительное изучение экспрессии нативного и гибридного гена ацил-липидной Д12-десатуразы в клетках Escherichia coli II Сборник материалов международной конференции'Тенетика в России и мир", посвященной 40-летию института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН, Москва, 2006, с. 113.

7. Maali A.R., Goldenkova-Pavlova I.V., Nosov A.M., Los D.A., Shimshelashvili X.P. New approach for the Expression of the gene for the Д9 acyl-lipid desaturase in plant // Proceeding of 24th Annual Meeting of ESCPB "Stress in Systems Biology", Antwerp, Belgium, 2006.

8. Maali A.R , Goldenkova-Pavlova I.V., Pchelkin V.P., Tsydendambaev V.D., Los D.A., Nosov A.M. The study of influence Д12 acyl-lipid desaturase (desA) gene in fatty acid composition of transgenic Potato plants // Proceeding of International Scientific Conference "Genetic-Physiological Fundamentals of Plant Growth and Productivity". Vilnius, Lithuania, 2006.

9. Маали A.P., Голденкова-Павлова И.В., Носов A.M., Лось Д.А., Шимщлашвили Х.Р. Влияние трансформации Escherichia coli геном Ацил-липидной Д12-десатуразы на рост организма к низкой температуре // Сборник материалов международной конференции "Генетика микроорганизмов и биотехнология", посвященной 100-летию со дня рождения С. И. Алиханяна. Пущино, 2006, с.61.

10. Мирахорли Н., Сотченков Д.В., Маали А.Р., Абдеева И.А., Голденкова-Павлова И.В., Пирузян Э.С. Дизайн систем экспрессии для биотехнологии растений // В сборнике: «Факторы экспериментальной эволюции организмов», Научные труды, Редактор Акад. М.В. Ройка, Т.З., Киев - ЛОГОС, 2006, Т. 3, с. 609-613.

11. Шимшилашвили Х.Р., Сотченков Д.В., Маали А.Р., Голденкова-Павлова И.В. Экспериментальные модели для создания трансгенных растений, устойчивых к стрессовым воздействиям // В сборнике: «Факторы экспериментальной эволюции организмов», Научные труды, Редактор Акад. М.В. Ройка, Т.З., Киев - ЛОГОС, 2006, Т. 3, с. 653-657.

Публикации, находящиеся в печати:

1. Maali A.R., Goldenkova-Pavlova I.V., Pchelkin V.P., Tsydendambaev V.D., Los D.A., Nosov A.M. Acyl-lipid A12-desaturase of the cyanobacterium increases the unsaturation degree in transgenic potato {Solatium tuberosum L.) // Biologija, № 2,2007.

2. Маали A.P., Голденкова-Павлова И.В., Юрьева H.O., Пчёлкин В.П., Цыдендамбаев В.Д., Верещагин А.Г., Дерябин А.Н., Трунова Т.И., Лось Д.А., Носов A.M. Жирнокислотный состав липидов растений картофеля, трансформированных Д12-десатуразы Synechocystis sp. РСС6803 // Физиология растений, Т. 54, № 4, 2007.

Принято к исполнению 12/01/2007 Исполнено 15/01/2007

Заказ № 23 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Маали Амири Реза

Введение гена десатураз в картофель Solarium tuberosum с целыо повышения его холодоустойчивости и изучение физиологических свойств полученных растений-регенерантов»

03.00.12 - физиология и биохимия растений

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: Д.б.н., профессор A.M. Носов Д.б.н. И.В. Голденкова-Павлова

Москва

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

Введение.

Глава I. Обзор литературы

1.1. Физиологические и молекулярные механизмы адаптации растений к низким температурам.

1.2. Свойства биологических мембран и их зависимость от температуры.

1.3. Типы десатураз жирных кислог.

1-3-1. Типы десатураз в зависимости от переносчика субстрата.

1-3-2. Типы десатураз в зависимости от донора электронов.

1-3-3. Типы десатураз в зависимости от построения электрон- транспортной цепи.

1.4. Десатуразы про- и эукариотических организмов.

1.4.1. Десатуразы цианобактерий.

1.4.2. Десатуразы высших растений.

1.5. Структура десатураз.

1.6. Экспрессия генов десатураз цианобактерий.

1.7. Экспрессия генов десатураз высших растений.

1.8. Аклиматизация клеток к низким температурам:

Роль десатураз жирных кислот.

1.9. Генетическая инженерия растений как инструмент для изучения физиологических и молекулярных основ защитных ответов, в частности, при устойчивости к низким температурам.

1.10. Репортерные системы для изучения регуляции экспрессии генов в растениях .

Глава II. Материалы и методы.

Глава П1. Результаты и обсуждение

3.1. Анализ нуклеотидной последовательности генов desC и desk.

3.2. Конструирование прокариотических экспрессионных векторов.

3.3. Сравнительный анализ экспрессии нативных и гибридных генов desC и desA в клетках Е coli.

3.3.1. Молекулярный анализ бактериальных трансформантов, несущих плазмиды с нативными desC, и desk и гибридными desC-НсВМЗ и desk-ИсШЛЗ генами.

3.3.2. Изучение действия введенных генов ацил-липидных десатураз на состав жирных кислот в бактериальных трансформантах, несущих плазмиды с нативными desC и desk и гибридными desC-licBM3 и desk-НсЪЫЪ генами .

3.3.3. Изучение действия введенного гена Д9-ацил-липидной десатуразы на рост бактериальных трансформантах, несущих плазмиды с нативным desC и гибридным desC-licQM3 генами.

3.4. Получение трансформантов картофеля и молекулярно-биологический анализ полученных растений-регенерантов .

3.5. Качественный и количественный состав ЖК липидов первичных трансформантов картофеля.

3.6. Определение устойчивости к низким температурам контрольных и грансформангов растений но интенсивности перекисного окисления липидов.

3.7. Определение устойчивости к низким температурам контрольных и трансформантов растений по выходу электролитов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Введение гена десатураз в картофель Solanum tuberosum с целью повышения его холодоустойчивости и изучение физиологических свойств полученных растений-регенерантов"

Температура - важнейший фактор окружающей среды, который определяет распространение и существование живых организмов на планете Исследование физиологических и молекулярных механизмов холодоустойчивости растений является одним из наибопее важных направлении современных физиолоши и биохимии растений

Известно, что уролчай сельскохозяйственных культур во многих районах ограничивается не средними клима1ическими показателями, а короткими периодами воздействия неблагоприятных метрологических факторов, в частности высоких и низких TeMiiepaiyp. Опасность температуры как фактора окружающей среды определяется, прежде всею, ее нестабильностью. В неблаюнриятных природных условиях устойчивость и продуктивность растений определяются рядом признаков, и защитно-приспособигельными реакциями.

Растения не MOiyi изменять внутреннюю температуру своею организма, и в процессе эволюции у них сформировались механизмы, обеспечивающие их функционирование при низких температурах окружающей среды. Многие из этих механизмов основаны на еишезе и накоплении защитных соединений, изменении осмотического потенциала клетки и др.

В 1973 году была предложена гипотеза, согласно которой первичная роль в способносж растений к перенесению холода отводилась мембранным липидам, в частности, их свойству фазовых переходов в зависимости от температуры окружающей среды (Lyons. 1973; Raison, 1973). При воздействии низких температур мембраны изменяют свою текучесть, становятся неспособными поддерживать ионные градиешы и клеточный метаболизм, что, в конце концов, приводит к гибели клеток и все! о организма. Способность растительных клеток к адаптации в таких условиях связывается с их способностью к изменению тек>чести мембран посредством изменения количества ненасыщенных жирных кислот (ЖК) в мембранных липидах. Такой способ сохранения текучею состояния мембраны был обнаружен > бактерий, растений и животных (White and Somero, 1982; Hazel, 1984) Исходя из этой гипотезы, важнейшая роль в устойчивос1И растений к низким температурам оiводится десат)разам жирных кислот - ферментам, отвечающим за образование двойных связей, и, следовательно, за изменение физических свойств биоло1ических мембран.

Принципиально новые возможноеiи для выяснения роли десатураз в механизмах холодоустойчивости открывают 1енно-инженерные подходы, в частности, получение транаенных растений, экспрессирующих гены десатураз из гетероло1ичиых ор1анизмов. В работах группы Мурата показана принципиальная возможность изменения холодоустойчивое!и путем введения в геном растения 1енов десатураз. (Murata ct al., 1992, Cossins, 1994). Наибольпши интерес в этом аспекте представляют гены ацил-липидных десатураз, формирующие первую (Д9) и вторую (А 12) двойные связи в молекулах жирных кислот. Из подобных десатураз наиболее изученными являются десатуразы цианобактерий desC (Д9-десатураза) и desk (Д12-десатураза). Ранее были получены и исследованы транаенпые растения табака, экспрессирующие ген desC Д9-десатуразы, было установлено, что зкспрессия этого iena приводит к повышению холодо>стойчивосги растений (Orlova et al., 2003).

Использование современных подходов имеет не только фундаментальный интерес, но и значительною практическою ценность в области биотехнологии и сельского хозяйства, поскольку позволяет создавать новые сорта ценных сельскохозяйственных культ}р, способные переносить ограничения той или иной климатической зоны Одной из перспективных с этой точки зрения объектов является картофель - важная пищевая и техническая культура, которая является источником не только уьчеводов, но и качественных белков, минералов и витаминов. Несмофя на то, что картофель устойчив к низким положительным температурам, он может значительно повреждаться весенними заморозками.

Принципиальным моментом при проведении 1еино-ипжснсрных работ является выбор эффективной репоргерной системы для определения уровня экспрессии исследуемых 1енов и локализации их продуктов. Ранее была предложена новая система, основанная на использовании iena licB, кодирующего термостабильную лихеназу Clostridium thermocellum (Piruzian et al, 2002). Эта репортерная система имеет ряд преимуществ, прежде всею позволяет осуществлять быстрый отбор транаенных организмов, определять уровни экспрессии гибридных ichob и молекулярные массы белковых продуктов гибридных генов.

Цель исследования: Изучение экспрессии 1енов desA и desC в клетках про- и эукариот (Ecoli и картофеля, Solarium tuberosum), определение жирнокислогною состава их липидов, проверка холодоустойчивости полученных растений-рсгенерантов, а также изучение возможности использования репортерной системы па основе 1ермостабильнои лихеназы (LicB) дчя получения трансформан юв картофеля.

Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:

1. Анализ нуклеотидной последовательности 1енов desС и desk с целью оценки эффективности их экспрессии в клетках Е coli и Solarium tuberosum

2. Клонирование нативных и конструирование гибридных генов desC и desk.

3. Конструирование бактериальных экснрессионных векторов в двух системах pQE и рЕ Г

4. Изучение экспрессии генов десатураз в Е coli и состава жирных кислот бактериальных трансформантов.

5. Конструирование растительных экснрессионных векторов, несущих нативные и гибридные гены десату раз.

6. Получение трансформированных растении картофеля и их молекулярный и физиолого-биохимическии анализ.

Научная иовизна рабсил. Впервые для оценки экспрессии генов desC и desk в клетках про- и эукариот использована ренортерная система на основе лихеназы (LicBM3). Установлено, что в составе шбридных белков как лихеназпая, так и десагуразная активность сохраняется. Впервые получены трансформанты картофеля, экснрессирующие ген ацил-липидной А12-десатуразы. Показано, что экспрессия гетероло1 ичных z епов десатураз в растениях приводит к повышению уровня ненасыщенности жирных кислот (ЖК) мембранных липидов.

Апробация результатов работы. Результаты работы были представлены th на Седьмой международной конференции по Геномикс растений, Китаи, 2006 (7 International Conference of Plant Genomics, Harbin, China, 2006); 15-м Международном конгрессе FSEPB, Франция, 2006 (International 15lh Congress of the

Federation of European Societies of Plant Biology FSEPB, Lyon, France, 2006); 43-м Годичном съезде общества Криобиологов, Германия, 2006 (43th annual meeting of the Society for Cryobiology and Society tor Low temperature Biology, Hamburg, Germany,2006); 24-м Годичном собрании ESCPB, Бельгия, 2006 (24th Annual Meeting of HSCPB "Stress in S>stems Biology", Antwerp, Belgium, 2006); Международной конференции "Генегико-физиологические основы регуляции роста и продуктивности растении, Ла1вия, 2006 (International Scientific Conference "Genetic-Physiological fundamentals of Plant Growth and Productivit>"Designed to the 100th anniversary of Prof. Jonas DAGjs Vilnius, Lithuania, 2006); Годичном Собрании Общества Физиологов Растений России, Ростов-на-Дону„ 2006); Международной конференции "Генетика микрооринизмов и биотехнология", посвященной 100-легию со дня рождения С. И Алихашша, Пущино, Москва, 2006; Международной конференции "Генетика в России и мир", посвященной 40-летию Института общей 1енетики им. П.И. Вавилова РАН, Москва, 2006).

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Маали Амири Реза

Выводы

1. Анализ последовательности ichob desC и desk показал, что для эффективной экспрессии в про- и эукариотах нуклеогидные последовательности этих генов в модификации не нуждаются.

2. Показано, что нативные и гибридные юны А9- и Д12-десат)раз эффективно экспрсссируются в клетках прокариот (Е coli) и эукариот (картофель). При этом как лихеназа, так и десатуразы сохраняют свои основные свойства.

3. Впервые показано, что ютерологичная ацил-липидная Д12-десатураза эффективно экспрессир)ется в трансформантах карюфеля, вызывает изменения биосинтеза мембранных липидов и повышает уровень ненасыщенности ЖК.

4. В результате экспрессии бактериальною гена desk изменяется физиолого-биохимичсское состояние растений-регенсранюв картофеля, в частности интенсивность перекисною окисления липидов и степень проницаемости мембран. Обнаруженные изменения свидетельствуют о повышении холодостойкости трансформированных растений.

5. Поскольку бактериальные десат>разы сохраняют каталитическую активность в составе гибридных белков, для трансформации высших растений мог>т быгь использованы гибридные тентл, в коюрых последовательности юнов десатураз слиты с последовательностью репортерною гена, кодир) тощего термостабильную лихеназу.

Заключение

Формирование устойчивости растений к низкой температуре является комплексным процессом, запускающим каскад сложных функциональных изменений, в том числе перестройку липидных компонентов мембран, включающих десатурацию жирных кислот. В течение последних двух десятилетий большое внимание уделялся молекулярным механизмам холодоустойчивости растений. Знания биохимии и молекулярной биологии десатураз жирных кислот открывает широкие перспективы в области биотехноло1 ии и сельского хозяйства, поскольку позволяет создание сортов и видов растений, способных переносить ограничения той или иной климатической зоны.

Представленные резулыаты исследования позволяют заключить следующее: нуклеотидная последовательность, а также кодоновый состав генов могут влиять на их экспрессию в разных ор1анизмах, поскольку уровень экспрессии 1ибридного гена desA-licBM3 в бактериях оказался значительно ниже, чем таковой гибридною гена desC-ИсВМЗ. Возможно, низкий уровень экспрессии тибридною гена desA-/fcBM3, который отражается на активности репортериого белка и жирнокислотном составе соответствующих бактериальных трансформантов обусловлен наличием в его последовательности кодонов, которые редко используются как в клетках Ecoli, так и в клетках цианобактерий.

Продемонстрировано, что в составе гибридных DesA-LicBM3 и DesC-LicBM3 белков DesA и DesC белки сохраняют свою биологическую активность -катализировать введение двойной связи в цепи ЖК и изменять ЖК-состав липидных мембран в клетках Ecoli и растении картофеля, а лихеназа сохраняет основные свойства ренортерною белка - термостабильность и активность. Полученные результаты свидетельствует о возможности использования этой репортерной системы при изучении экспрессии генов в клетках про- и эукариотических ор1анизмов.

Полученные результаты показывают, что в трансформированных растениях картофеля синтезируется 1етерологичная А12-ацил-липидная дссатураза, которая стимулирует биосинтез мембранных липидов и повышает уровень ненасыщенных ЖК, в частности 18:2 и 18:3 и, в ряде случаев, 16:3 Значительные изменения в липидах мембран за счет увеличения ненасыщенности их ЖК свидетельствуют о том, что десатураза цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 эффективно экспрессируется в листьях картофеля и повышает уровень ЖК 18:2, служащий субстратом для последующею синтеза триеновых ЖК. Таким образом, перенос гена Д12-ацил-липидной десатуразы в юном растений картофеля может приводить к увеличению ненасыщенности мембранных липидов. При этом, увеличение доли полиненасыщенных ЖК в мембранных липидах может приводить к повышению холодостойкости трансформантов картофеля.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Маали Амири Реза, Москва

1. Александров В.Я. (1975) Клетки, макромолекулы и температура. М.: Наука, 329 с.

2. Алехина Н.Д., Балпокин Ю.В., Гавриленко В.Ф. и др. (2005) Физиология растений. Учебник для ВУЗов под ред. И.П.Ермакова., М.:Академия, 635 с.

3. Антонов В.Ф. (1996) Биофизика мембран. Соросовский образовательсный журнал 6,4-12.

4. Барабой В.А. (1991) Механизмы стресса и перекисное окисление липидов. Успехи современной биологии, 111. 923-931.

5. Верещагин, А.Г. (1982) Биохимия тршлицеридов. М . Наука, 1972. 308 с.

6. Верещагин А.Г., Лебедева Н.И., Жуков А.В. (1985) Содержание и состав этерифицированных жирных кислот в митохондриях этиолированных проростков пшеницы. Физиология растений, 32, 124 129.

7. Верещагин А.Г., Ганисва М. (1964) Обмен липидов в созревающих и прорастающих семенах хлопчатника и влияние грамм-излучения на этот процесс. Биохимия, 29, 288-299.

8. Голденкова И.В., Мусийчук К.А., Пирузян Э.С. (2003) Биофункциональные ренортерные 1ены: конструирование и экспрессия в клегках про- и эукариот. Молекуляр. Биочогия, 37, 1-9.

9. Жиров В.К., Мерзляк М.Н., Кузнецов JI.B. (1982) Перекисное окисление мембранных лииидов холодостойких растений при повреждении отрицательными температурами. Физиология растений, 29, 1045-1052.

10. Жуков А.В., Верещагин А.Г. (1980) Современные методы экстракции, очистки и предварительною фракционирования полярных лииидов растений. Физиология растений, 27, 171-188.

11. Зверлов В.В. (1993) Изучение структуры гена лихеназы Clostridium thermocellum Ф7 и характристика продукта данною гена. Москва. ИМГ РАН.

12. Ивков В.Г., Берестовский Г.Н. (1982) Липидный бислой биологических мембран. М.: Hay ка, Москва, 223 С.

13. Комов В.П., Шведова В.Н. (2004) Биохимия. М.: дрофа, 638 с.

14. Кузнецов В.В, Дмитриева Г.А. (2006) Физиоло1ия растении. М.: Высшая школа, 743 с.

15. Кузнецов Вл.В., Радюкина Н.Л., Шевякова Н.И. (2006) Полиамины при стрессе: биологическая роль, метаболизм и регуляция. Физиология растений, 53, 658683.

16. Лось Д.А. (2001) Восприятие сигналов биолотическими мембранами: сенсорные белки и экспрессия генов. Соросовский образовательсный журнал, 7, 14-22.

17. Лось Д.А. (1997) Десатуразы жирных кислот: Адаптивная жспрессия и пртнципы регуляциию. Физиочогия растений, 44, 528-540.

18. Лось Д.А. (2005) Мотекулярные механизмы холодоустойчивости растений. Вестник Российской Академии Наук, 75, 338-345.

19. Маниатис Т., Фрич Э.Д ( 1984) Молекулярное клонирование М Мир, с 480

20. Мусийчук К.А., Голденкова И.В., Абдеев P.M., Кобец Н.С., Пирузян Э.С. (2000) Получение и свойства делеционных вариантов лихеназы Clostridium thermocellum и создание на их основе бифункциональных гибридных белков. Биохимия, 65, 1659-1665.

21. Новицкая Г.В., Астахова Н.В., Суворова Т.А., Трунова Т.И. (1999) Роль липидной компоненты мембран в устойчивости растении огурца к низкой температуре. Физиология растений. 46, 618-625.

22. Новицкая Г.В., Суворова Т.А.( 1994) Изменение липидного состава мембранных фракции проростков озимой пшеницы при низкотемпературной адаптации.Физиология растений, 41, 539-545.

23. Патрушев Л.И. (2000) Экспрессия генов. М.: Наука, 527 с.

24. Пчелкин В.П., Кузнецова Э.И., Цыдендамбаев В.Д., Верещагин А.Г. (2001) Определение позиционно-видового состава запасных триацилглицеринов растений меюдом неполною химическою деацилирования. Физиология растений, 48, 809 816.

25. Салехи Джузани Г.Р., Комахин Р.А., Пирузян Э.С. (2005) Сравнительный анализ экспрессии нативного и модифицированною генов сгуЗа Bacillus thuringiensis в прокариотических и эукариотических клетках. Генетика, 41, 1-7.

26. Степанов А.Е., Краснопольский Ю.М., Щвец В.И. (1991) Физиологически активные липилы. М.: Наука, Москва, 135 с.

27. Цыдендамбаев В.Д., Верещагин А.Г. (1980) Исследование липидов корггя сахарной свеклы в связи с функцией сахаронакопления. 2. Экстрагируемое гь ацилсодержащих липидов паренхимы покоящегося корня. Физиология растений. 27, 778 784.

28. Чиркова Т.В. (1997) Клеточные мембраны и устойчивость растений к стрессовым воздействиям. Соросовский образовательсный журнач, 9,12-17.

29. Aionso A., Queiroz C. S., Mcgalhaes A. C. (1997) Chilling stress leads to increased cell-membrane rigidity in roots of coffee seeding. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes, 1323, 75-84.

30. Badger M.R., Bjorkman 0., Armond P.A. (1982) An analysis of photosyntheticresponse and adaptation to temperature in higher plants: temperature acclimation in the desert evergreen. Nenum oleander L. Plant Cell Environ , 5, 85-99.

31. Barran L.R., Miller R.W. (1976) Temperature-induced alterations in phospholipids of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici. Can. J. Microbiol., 22, 557-62.

32. Bradford M.M. (1976) A Rapid Sensitive Method for Quantification of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal Biochem, 72, 248-254.

33. Browse J., Xin Z. (2001) Temperature sensing and cold acclimation. См/т. Opin Plant Biol, 4, 241-246.

34. Browse J., Warwick N., Somerville C.R., Slack C.R (1986b) Fluxes through the prokaryotic and eukaryotic pathways of lipid synthesis in the '16:3' plant Arabidopsis thaliana. Biochem J 235,25-31.

35. Buda C., Dey I., Balogh N., Horvath L.I., Maderspach K., Juhasz M., Yco Y.K., Farkas T. (1994) Structural order of membranes and composition of phospholipids in fish brain cells during thermal acclimatization. Proc Natl. Acad Sci. USA, 9156, 8234-8238.

36. Bulder H.A.M., Den Nijs A.P.M., Spcek Е.Л., Van Hasselt P.R., Kuiper Р.Л.С. (1991) '1Ъе effect of low root temperature on growth and lipid composition of low temperature tolerant rootstock genotypes for cucumbcr. J Plant Physiol., 138, 661-666.

37. Chintalapati S., Kiran M.D., Shival S. (2004) Role of membrane lipid fatty acids incold adaptation. Cell Mol Biol 50,631-642. Chiu W.L., Niwa Y., Zeng w., Harano Т., Kobayashi H., Sheen J. (1996) Engineering

38. Crespi M.D., Zabaleta Z.J., Pontis H.G., Salerno G.L. (1991) Sucrose synthaseexpression during cold acclimation m w heat. Plant Physiology, 96, 887-91. Cronan J.E., Jr. (1975) Thermal regulation of the membrane lipid composition of

39. Escherichia Coli. J. Biol Chem , 250, 7074-7077. Cubbit А.В., Heim R., Adams S.R., Boyd A.E., Gross L.A., Tsien R.Y. (1995) Understanding, improving and using Green Fluorescent Proteins. Trends Biochem. 5c/., 20,448-455.

40. De Gomez Dumm I.N.T., De Alaniz J.T., Brenner R.R. (1970) Effect of diet on linoleic acid desaturation and on some enzymes of carbohydrate metabolism. J. Lipid res., 11,96-101.

41. De Torrengo M., Brenner R.R. (1976) Influence of environmental temperature on the fatty acid desaturation and elongation activity of fish (Pimelodus Maculatus) liver microsomes. Biochem Biophys Acta, 424, 36-44.

42. Farkas T. (1984) Adaptation of fatty acid composition to temperature a study on carp (Cyprinus carpio L.) liver slices. Comp Biochem Physiol, 79, 531-535.

43. Feige G.B., Heinz E., Wrage K., Cochems N., Ponzelar E. (1980) Discovery of a new glycerolipid biosynthesis. In biogenesis and function of plant lipids. Mazlik, P., Benveniste, P., Costes C., Douce, R., de.P.445-447. Else\ier, Amsterdam.

44. Ferguson Л.Н. (1977) Effect of photoperiod and cold acclimation upon plasma free fatty acid levels in the white rat. Сотр. Biochem Physiol, 56, 265-266.

45. Ferrante G., Ohno Y., Kates M. (1983) Influence of temperature and growth phase on desaturase activity of the mesophilic yeast Candida lipolytica. Can. J Biochem Cell boil, 61, 171-177.

46. Fiedler U., Conrad U. (1995.) High-level production and long-term storage of engineered antibodies in transgenic tobacco seeds. Biotechnology (N Y), 13, 1090-1093.

47. Fofana В., Cloutier S., Duguid S., Ching J., Rampitsch C. (2006) Gene expression of stearoyl-ACP desaturase and A12 fatty acid desaturase 2 is modulated during seed development of Flax (Linum mitatismium). Lipids, 41, 705-712.

48. Fox B.G., Shanklin J., Somerville C., Munck E. (1993) Stearoy I-acyl carrier protein Д9 dcsaturtasc from Ricinus Communis is a diiron-oxo protein. Proc Natl Acad Sci USA, 90, 2486-2490

49. Hamada Т., Kodama H., Takeshita К., Utsumi H., Iba К. (1998) Characterization of transgenic Tobacco with an increased u-Linoplenic Acid level. Plant Physiol, 118,591-598.

50. Hauvermale A., Kuner J., Rosenzweig В., Gucrra D., Diltz S., Metz J.G. (2006) Fatty acid production in Schi/ochytrium sp.: Involvement of a polyunsaturated fatty acid synthase and a type 1 fatty acid synthase. Lipids, 41, 739-747.

51. Hazel J.R (1984) Effects of temperature on the structure and metabolism of cell membranes in fish Am J Phvsiol., 246, R460-R470

52. Hepburn H.A., Naylor F.L., Strokes I).l. (1986) Electrolyte leakage from winter Barley tissue as Indicator of Winter hardiness. Ann Appl Biol., 108, 164-165.

53. Heppard E.P., Kinney A.J., Stccca K.L., Miao G.H. (1996) Developmental and growth temperature regulation of two different microsomal 0)6 dcsaturase genes in soybeans. Plant phvsiol., 110, 311 -319.

54. Herbers K., Sonnewald U. (1999) Production new/modified proteins in transgenic plants. Current opinion in Biotechnology. 10, 163-168.

55. Higashi S., Murata N. (1993) An in vivo study substrate specificities of acyl-lipid desaturases and acyltransferascs in lipid synthesis in Synechocystis sp. PCC 6803. Plant Physiol, 102, 1275-1278.

56. Holaday A.S., Martindale W., Aired R., Brooks A., Leegood R.C. (1992) Changes in activities of enzymes of carbon metabolism in leaves during exposure to low temperature. Plant Physiology, 98. 1105-14.

57. Hollow ay C.T., Hollow ay P.W. (1977) The dietary regulation of stearoyl coenzyme A dcsaturase activity and membrane fluidity in the ret aorta Lipids, 12, 1025-1031.

58. Jeffcoat R., James A.T. (1977) Interrelationship between the dietary regulation of fatty acid synthesis and the fatty acyl-CoA desaturases. Lipids, 12,469-474.

59. Kaneshiro Т., Marr A.G. (1961) Cis-9,10-methylene hexadecanoic acid from the phospholipids of Escherichia coli. J Biol.Chem, 236, 2615-2619.

60. Knivett V.A., Cullen J. (1965) Some factors affecting cyclopropane acid formation in Escherichia coli. Biochem. J, 96, 771-776.

61. Kiseleva L.L., Horvath I., Vigh L., Los D.A. (1999) Temperature-induced specific lipid desaturation in the thermophilic cyanobacterium Synechococcus vulcanus. FEMS Microbiol. Lett., 175, 179-183.

62. Mascaronhas j.P., Hamilton D.A. (1992) Artifacts in the localization of GUS activity in anthers of petunia transformed with a CaMV 35S-GUS construct. Plant J., 2, 405-408.

63. Mazlik P. (1979) Temperature regulation of plant fatty ac> 1 desaturase, in: Low temperature stress in crop plants: I he role of the membrane (Lyons, J.M., Graham, D., Raison, and J.K.), P.391-404, Academic Press, New York.

64. Meesters P.A., Springer J., Eggink G. (1997) Cloning and expression of the Д9 fatty acid desaturase gene Cryptococcus curvatus АГСС 20509 containing histidin boxes and a cytochrome b5 domain. Appl Microbiol. Biotechnol., 47, 663-667.

65. Miquel M., James D., Dooner H., Browse J. (1993) Arabidopsis requires polyunsaturated lipids for low-temperature survival. Proc Natl Acad. Set USA, 90,6208-6212.

66. Monroy A.F., Dhindsa R.S. (1995) Low-temperature signal transduction: induction of cold acclimation-specific genes of alfalfa by calcium at 25 °C. Plant cell, 7,321331.

67. Moon B.Y., Higashi S.I., Gombos Z., Murata N. (1995) Unsaturation of the membrane lipids of chloroplasts stabiles the photosynthetic machinery against low-temperature photoinhibition in transgenic Tobacco plants. Proc Nathl Acad. Sci US, 92.6219-6223

68. Murata N., Wada H. (1995) Acyl-lipid desaturases and theire importance in the tolcrance and acclimatization to cold of cyanobacteria. Biochem J, 308:1-8.

69. Murata N., Los D.A. (1997) Membrane fluidity and temperature perception. Plant Physiol, 115, 875-879.

70. Murata N., Wada H., Gombos Z. (1992) Modes of fatty acid desaturation in cyanobacteria. Plant Cell Physiol, 33, 933-941.

71. Murata N. (1983) Molecular species composition of phosphatidylglycerols from chilling-sensitive and chilling-resistant plants. Paint Cell Physiol, 24, 81-86.

72. Murata N., Nishida 1. (1990) 1 ipids in relation to chilling sensitivity of plants. In chilling injury of crops. Wang, С Y.ed.pp.181-199, Boca Raton, FL, CRC Press, 313 p.

73. Murata N., Nishida 1. (1987) Lipids of blue-green alga (cyanobacteria). In Biochemistry of plants. Stumpf, P.K. ed. 9:315-347. Orlando, Academic Press, 363 p.

74. Nagai J., Bloch K. (1968) Enzymatic desaturation of stearoyl acyl carrier protein. J. Biol. Chem., 241, 1925-1927.

75. Nakashima S., Zhao Y., Nozawa Y. (1996). Molecular cloning of Д9 fatty acid desaturase from the protozoan Tetrahymena thermophila and its mRNA expression during thermal membrane adaptation. Biochem J, 317, 29-34.

76. Nishida I., Murata N. (1996) Chilling sensitivity in plants and cyanobacteria: Ihe crucial contribution of membrane lipid Annu Rev plant Mol Biol ,47, 541-568.

77. O'leary W.M. (1962) S-adenosylmethionine in the biosynthesis of bacterial fatty acidsJ. Bad, 84,967-972.

78. Olsson 0., Koncz C., Szalaj A. (1988) The use of the luxA gene of the bacterial luciferase operon as a reporter gene. Mol Gen Genet, 15, 1-9.

79. Orvar B.L., Sangwan V., Omann F., Dhindsa R. S. (2000) Early steps in cold sensing by plant cells: the role of actin cytoskeleton and membrane fluidity. Plant J., 23, 785-794.

80. Oshino N., Sato R. (1972) The dietary control of the microsomal stearyl COA desaturation enzyme system in rat liver. Arch Biochem Biophys., 149, 369-377.

81. Palta J.P., Whitaker B.A., Weiss L.S. (1993) Plasma membrane lipids associated with genetic variability in freezing tolerance and cold acclimation of Solanum species. Plant Physiol, 103, 793-803.

82. Pehowich D.J., Macdonald P.M., McElhaney R.N., Cossins A.R., Wang L.C. (1988) Calorimetric and spectroscopic studies of lipid thermotropic phase behavior in li\er inner mitochondrial membranes from a mammalian hibernator. Biochemistry, 27,4632-5638.

83. Peyou-Ndi M.M., Watts J.L., Browse J. (2000) Identification and characterization of an animal Д12 fatty acid desaturase gene by heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae Archives of Biochemistry and Biophysics , 376,399408.

84. Piruzian E.S., Monzavi-Karbassi В., Darbinian N.S., Goldcnkova I.V., Kobets N.S., Mochulsky A.V. (1998) The use of a thermoacthe-glucanase gene from Clostridium thermocellum as a reporter gene in plants Mol Gen Genet, 257, 561-567.

85. Piruzian E.S., Goldenkova I.V., Mysiychuk K.A., Abdeev R.M., Volkova L.V., Kobets N.S. (2000) A new reporter system for studying plant gene expression based on lichenase high termostability. Russian J. Plant Physiol. 47,327-336.

86. Pugh E.L., kates M. (1975) Characterization of a membrane-bound phospholipids desaturase system of Candida Lipoidica. Biochim. Biiphys Acta, 380, 442-453.

87. Pugh E.L., Kates M. (1977) Direct desaturation of eicosatrienoyl lecithin to arachidonoyl lecithin by rat liver microsomes. J Biol Chem, 252, 68-73.

88. Pugh E.L., Kates M., Szabo A.G. (1980) fluorescence polarization studies of rat liver microsomes with altered phospholipids desaturase activity. Can J Biochem., 58, 952.

89. Paulsrud J.R., Stewart S.E., Graff G., Holman R.T. (1970) Desaturation of saturated fatly acids by rat lner microsomes. Lipids, 5, 611-616.

90. Quinn, P. J., Joo, F., and Vigh, L. (1989) The role of unsaturated lipids in membrane structure and stability Prog Biophys. Molec Biol. 53, 71-103.

91. Raison, J. K. (1973) The influence of temperature-induced phase changes on kinetics of respiratory and other membrane-associated enzymes. J Bioenerg, 4, 258-309.

92. Riken A., Dill J.W., Bergman D.K. (1993) Correlation between the circadian rhythm of resistance to extreme temperatures and changes in fatty acid composition in cotton seeding. Plant Physiol ,101, 31-36.

93. Rogers S.O., Bendich A.J. (1985) Expression of DNA from milligram amounts of fresh, herbaceum and mummified plant tissues Plant Molecular Biology, 592,69-76.

94. Russel N.J. (1984) Mechanism of thermal adaptation in bacteria: blueprints for survival. Trends biochem Sci, 9, 108-112.

95. Sakamoto Т., Higashi S., Wada H., Murata N., Bryant D.A. (1997) Low-temperature-induced desaturation of fatty acids and expression of desaturase genes in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 7002. FEMS Microbiol Lett, 152, 313320.

96. Sakamoto Т., Wada IL, Nishida 1., Ohmori M., Murata N. (1994) Identification of conserved domains in the Д12 desaturases of cyanobactcria. Plant Mol Biol., 24, 643-650.

97. Samala S., Yan J., Baird W.V. (1998) Changes in polar lipid fatty acid composition during cold acclimation in 'Midiron' and 'U3' bermudagrass. Crop Sci, 38, 188195.

98. Sambrook J., Russel D.W. (2001) Molecular cloning' A laboratory manual.-Cold spring harbor laboratory .3rd edition. 999 p.

99. Sato N., Murata N. (1980) Temperature shift-induced responses in lipids in the blue-green alga, Anabaena variabilis. The central role of diacylmonogalactosylglycerol in thermo-adaptation. Biochim Biophys Acta, 619,353-366.

100. Sato N., Murata N., Miura Y., Ueta N. (1979) Effect of growth temperature on lipid and fatty acid compositions in the blue-green algae, Anabaena Variabilis and Anacystis Nidulans Biochim Biophys Acta, 572, 19-28.

101. Sato N., Murata N. (1982a) Lipid biosynthesis in the bluc-green alga, Anabaena variabilis. I. Lipid classes Biochem Biophys.Acta, 710, 271-278.

102. Sharom M, Willemot C, Thompson JE. (1994) Chilling Injury Induces Lipid Phase Changes in Membranes of Tomato Ггик. Plant Physiol., 105, 305-308.

103. Scott W.A. (1977a) Unsaturated fatty acid mutants of Neurospora Crassa. J. Bacteriol., 130, 1144-1148.

104. Scott W.A. (1977b) Mutations resulting in an unsaturated fatty acid requirement in Neurospora: Evidence for A9-desaqturase defects. Biochemistry, 16, 5274-5280.

105. Sangwan V., Foulds I., Singh J. Dhindsa R.S. (2001) Cold-activation of Brassica napus BN115 promoter is mediated by structural changes in membranes and cytoskeleton, and ca influx. Plant J ,27, 1-12.

106. Scandalios J.G. (1993) Oxygen Stress and Superoxide Dismutases. Plant Physiology, 101,7-12.

107. Seppanen M.M., Majaharju M., Somcrsalo S., Pehu E. (1998) Freezing Tolerance, Cold-Acclimation and Oxidatne Stress in Potato Paraquat Tolerance Is Related to Acclimation But Is a Poor Indicator of Freezing Tolerance. Physiol Plant, 102, 454-460.

108. Shanklin J., Somerville C. (1991) Stearoyl-acyl-carrier-protein desaturase from higher plants is structurally unrelated to the animal and fungal homologs. Proc Natl Acad Sci USA 88,2510-2514.

109. Shanklin J., Whittle E., Fox B.C. (1994) Eight histidin residues are catalytically essential in a membrane-associated iron enzyme, stearoyl-COA desaturase, and are conserved in Alkane Hydroxylase and Xylene Monooxygenase. Biochemistiy, 33, 12787-12794.

110. Shanklin J., Cahoon E.B. (1998) Desaturation and related modification of fatty acids Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol., 49, 611 -641.

111. Spinedi A., Rufini S., Luly P. (1987) Lipid composition and temperature adaptation of the nervous system of the Leech I lirudo Medicinalis L. J Neurochem , 49,45-49.

112. Strittmatter P., Spatz L., Corcoran D., Rogers M.J., Setlow В., Redline R. (1974) Purification and properties of rat liver microsomal stearoyl coenzyme A desaturase. Proc. Natl Acad Sci USA, 71,4565-4569.

113. Stumpf, P. K. (1980) Biosynthesis of saturated and unsaturated fatty acids. In Biochemistry of Plants. Stupmf, P.K. ed. Vol. 4, 177-204. New York, Academic Press, 693 p.

114. Taylor C.B. (1997) Promoter fusion analysis: an insufficient measures of gene expression Plant Cell, 9, 273-275.

115. Tahin Q.S., Blum M., Carafoli E. (1981) The fatty acid composition of subcellular membranes of rat liver, heart, and brain: Diet-induced modification. Eur J Biochem, 121, 5-13.

116. Trayhurn P. (1979) Fatty acid synthesis in vivo in brown adipose tissue, liver and white adipose tissue of the cold acclimated rat. FEBS Lett., 104, 13-16.

117. Trayhurn P. (1980a) Fatty acid synthesis in brown adipose tissue in relation to whole body synthesis in the cold-acclimated golden hamster (Mesocricetm auratus). Biochem. Biophys Acta , 620, 10-17

118. Trayhurn P. (1980b) Fatty acid synthesis in brown adipose tissue of cold-acclimated mice and golden hamsters (Mesocncetus awatus). Biochem Soc Trans., 8, 375.

119. Trayhurn P. (1981) Fatty acid synthesis in mouse brown adipose tissue. The influence of environmental temperature on the proportion of whole-body fatty acid synthesis in brown adipose tissue and the liver. Biochem. Biophys Ada, 664, 549-560.

120. Uemura M., Joseph R.A., Steponkus P.L. (1995) Cold acclimation of Arabidopsis Thaliana. Effect on plasma membrane lipid composition and freeze-induced lesions. Plant Physiol, 109, 15-30.

121. Uemura M., Yoshida S. (1984) Involvement of plasma membrane alterations in cold acclimation of winter rye seedings (Secale cereale L.cv. Puma). Plant Physiol, 75,818-826.

122. Van Golde L.M.G., Van Deenen L.L.M. (1967) Molecular spccies of extracellular phosphatidylethanolamine from Escherichia coli Chem Phys Lipids, 1, 157-164.

123. Vega S.E., Rio A.H.D., Bamberg J., Palta J.P. (2004) Evidence for the up-regulation of Stearoyl-ACP (Delta9) desaturase gene expression during cold acclimation. American Journal of potato Research, Mar/Apr.

124. Vigh, L., Horvath, I., and Thompson, G. A. Jr. (1988) Recovery of Dunaliella salina cells following hy drogenation of lipids in specific membranes by a homogenious palladium cataly st. Btochim Biophys Acta, 937,42-50.

125. Wada H., Murata N. (1989) Synecocystis PCC6803 mutants defective in desaturation of fatty acid. Plant cellphysiol, 30, 971-978.

126. Wada H., Schmidt H., Нешг E., Murata N. (1993) In vitro Ferredoxin-dependent desaturation of fatty acids in eyanobacterial thylakoid membranes. J. Bacteriol., 175, 544-547.

127. Wada H., Avelange-Macherel M.-H., Murata N. (1993) Tha desA gene of the Cyanobactcrium Synechocystis sp. PCC 6803 is the structural gene for Д12 desaturase. J. Bacteriol, 175, 6056-6058.

128. Wada H., Gombos Z., Murata N. (1990) Enhancement of chilling tolerance of a cyanobacterium by genctic manipulation of fatty acid desaturation. Nature, 347, 200-203.

129. Wada H., Murata N. (1990) lemperature- induced changes in the fatty acid composition of the cyanobactcrium, Synechocystis PCC 6803. Plant Physiol, 92, 1062-1069.

130. Walker M.A., McKersie B.D., Pauls K.P. (1991) Effects of chilling on the biochemical and functional properties of thylakoid membranes. Plant Physiol, 97, 663-669.

131. Watson K. (1978) Thermal adaptation in yeasts: correlation of substrate transport with membrane lipid composition in psychrophilic and thermo tolerant yeasts proceedings. Biochem Soc Trans, 6, 293-6.

132. Weiss L.S., Whitaker B.D., Palta J.P. (1993) Temporal changes in plasma membrane lipids during cold acclimation of potato species differing in acclimation capacity. Plant Physiol (Suppl), 102, 463.

133. White F.N., Somero G. (1982) Acid-base regulation and phospholipid adaptations to temperature: time courscs and physiological significance of modifying the milieu for protein function. Physiol Rev , 62,40-90

134. Wilson A.C., Wakil S.J., Joshi V.C. (1976) Induction of microsomal stearyl coenzymeA desaturase in newly hatched chicks. Arch Biochem Biophys, 173, 154-161.

135. Wilson J.M., Crawford R.M. (1974) The acclimation of plants to chilling temperatures in relation to the fatty acid composition of leaf polar lipids. J. Exp. Bot., 25, 121131

136. Wood T.M., Bhat K.M. (1988) Methods for measuring cellulose activities. Meth Enzymol, 160, 87-112.

137. Wright M., Simon E.W. (1973) Chilling injury in cucumber leaves. J Exp Bot, 24, 400-411.

Информация о работе

Маали Амири Реза
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.12

Диссертация

Введение гена десатураз в картофель Solanum tuberosum с целью повышения его холодоустойчивости и изучение физиологических свойств полученных растений-регенерантов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы