Участие ∆12-ацил-липидной десатуразы в формировании устойчивости растений картофеля к гипотермии

Демин, Илья Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Участие ∆12-ацил-липидной десатуразы в формировании устойчивости растений картофеля к гипотермии
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Участие ∆12-ацил-липидной десатуразы в формировании устойчивости растений картофеля к гипотермии"

На правах рукописи

у, 'г- ',..

Демин Илья Николаевич

Участие А12-ацил-липидной десатуразы в формировании устойчивости растений картофеля к гипотермии

03.01.05 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2010

"ОЧЬИ!146

004601146

Работа выполнена в лаборатории зимостойкости Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор

Трунова Тамара Ильинична

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук

Шакирова Фарида Миннихановна Носов Александр Владимирович

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Российский государственный аграрный университет — МСХА им. КА. Тимирязева

Защита состоится «27» апреля 2010 г. в 13.00 на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.210.01 при Учреждении Российской академии наук Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, г. Москва, ул. Ботаническая, 35. Факс (495) 977-80-18, e-mail: ifr@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К А. Тимирязева РАН

Автореферат разослан «26» марта 2010 г.

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций,

кандидат биологических наук

М.И. Азаркович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Б о льшая часть растений на Земле, обитающих на 64% территории суши, в течение года испытывают губительное действие низких температур. Значимость этой проблемы возрастает также в связи с глобальным изменением климата на планете, которое сопровождается усиливающейся нестабильностью, выражающейся, в частности, в резких перепадах температуры в относительно короткие промежутки времени (Levitt, 1980; Сандухадзе и др., 2003). Поэтому проблема устойчивости растений к низким температурам имеет большое фундаментальное и прикладное значение в современной науке.

В настоящее время выдвинуто несколько теорий, объясняющих механизмы повреждения растений от действия низких температур, но наиболее изучен этот вопрос в отношении морозостойких растений (Туманов, 1979, Трунова, 2007). Среди причин повреждений теплолюбов от действия экстремальных низких температур наиболее часто называют повышенное образование активных форм кислорода (АФК) (Мерзляк, 1989, Лукаткин 2002, Попов и др., 2006), которые способны необратимо повреждать главным образом липидные компоненты мембран и, в первую очередь, полиненасыщенные жирные кислоты (Tepperman, Dunsmuir, 1990, Apel, Hirt, 2004, Suzuki, Mittler, 2006). Это приводит к повышению вязкости мембран, переходу липидов из жидкокристаллической фазы в фазу геля, увеличению протонной проницаемости, снижению электрической проводимости мембран и инактивации мембранных ферментов (Лось, 1997, Лось 2005). При продолжительном воздействии стресс-факторов такие изменения становятся необратимыми, что ведет к многочисленным нарушениям работы биологических систем и гибели растений. Вместе с тем, причины повреждений и устойчивости группы холодостойких растений к низким температурам, изучены в гораздо меньшей степени. В частности, остаются недостаточно исследованными механизмы, предотвращающие развитие окислительного стресса при гипотермии.

Известно, что способность клеток растений к низкотемпературной адаптации связана с их возможностью изменять текучесть мембран посредством увеличения количества полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) в мембранных липидах. По сравнению с неадаптировнными растениями, в мембранах закаленных растительных организмов наблюдается накопление линолевой (С18:2) и линоленовой (С18:3) жирных кислот (ЖК) (Белоус, Бондаренко, 1982). В связи с этим, важное значение приобретают исследования роли десатураз - ферментов, отвечающих за образование двойных (С=С) связей в цепях ЖК. Первая двойная связь, как правило, формируется после 9-го атома углерода (положение Д9), вторая двойная связь - в положении Д12, третья - в положениях Д15 и Д6. У цианобактерий, растений и практически всех живых организмов существуют специфические десатуразы, ответственные за образование двойных связей в определенных положениях ацильных цепей. В частности, Д12-ацил-липидная десатураза, функциональная роль которой изучается в данной работе, участвует в образовании второй двойной связи при переходе олеиновой (18:1) в линоле-

вую (18:2) кислоту. Однако выяснено, что не все типы десатураз вносят одинаковый вклад в формирование низкотемпературной устойчивости. Так, применительно к циа-нобактериям, считается, что наличие в мембранных липидах линолевой (С18:2) кислоты, а, следовательно, и активность Д12-ацил-липидной десатуразы может служить одним из критериев устойчивости организма к воздействию низкотемпературного стресса (Wada et al., 1990, Tasakaetal., 1996).

У высших растений участие десатураз в формировании низкотемпературной устойчивости до сих пор изучено мало (Маали и др., 2007). Можно предположить, что экспрессия в холодостойких растениях картофеля гена desA Д12-ацил-липидной десатуразы приведёт к увеличению полиненасыщенности жирных кислот мембранных липидов, изменению функционального состояния мембран и, в конечном итоге, повышению устойчивости растений к окислительному стрессу и гипотермии, что может послужить экспериментальным доказательством участия этого фермента в формировании холодоустойчивости растений.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы явилось изучение роли Д12-ацил-липидной десатуразы в формировании устойчивости растений картофеля к окислительному стрессу, вызванному действием гипотермии, на примере картофеля, трансформированного геном desA Д12-ацил-липидной десатуразы цианобактерии Synechocystis sp.

В соответствии с поставленной целью были выдвинуты следующие задачи:

1. Подтвердить наличие и экспрессию гетерологичного гена desA Д12-ацил-липидной десатуразы в тканях растений-трансформактов

2. Изучить влияние введённого гена desA на состав и содержание жирных кислот в мембранных липидах растений картофеля

3. Установить вызванные трансформацией изменения в ультраструктуре хлоропла-стов, как основных поставщиков АФК в растительных клетках и в интенсивности С02-газообмена листьев исследуемых генотипов растений в норме и при пониженных температурах

4. Исследовать изменения интенсивности начальных процессов окислительного стресса и содержания конечных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), а также показатели активности основных ферментов антиоксидантной защиты под влиянием гипотермии у трансформированных и нетрансформиро-ванных растений картофеля

5. Определить различия в устойчивости между контрольными и трансформированными растениями по степени повреждения листьев и выживаемости целых растений после действия гипотермии

6. Установить роль Д12-ацил-липидной десатуразы в предотвращении образования избыточных количеств АФК при окислительном стрессе, вызванном гипотермией, а также без участия низкой температуры путём обработки растений параква-том.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное изучение роли Д12-ацил-липидной десатуразы в формировании устойчивости холодостойких растений к окислительному стрессу, индуцированному гипотермией, с использованием растений картофеля, трансформированных геном (¡езА цианобактерии БупесИосуэИз ьр.

Установлено, что экспрессия гека <1е$А Д12-ацил-липидной десатуразы приводила к увеличению содержания линолевой (18:2), а также линоленовой (18:3) жирных кислот в мембранных липидах листьев картофеля, что сопровождалось повышением общего количества ЖК, и их индекса ненасыщенности.

Увеличение содержания полиненасыщенных жирных кислот в тканях трансформированных растений способствовало формированию более устойчивой к гипотермии структуры хлоропластов, что выражалось в повышении количества гран и общего числа тилакоидов в хлоропластах, а также в поддержании более высокого отношения интенсивности фотосинтеза к темновому дыханию при понижении температуры.

Впервые экспериментально выявлено, что повышение структурно-функциональной стабильности мембран трансформированных растений картофеля, обусловленное активностью Д12-ацил-липидной десатуразы, способствовало предотвращению избыточной генерации АФК. Это привело к снижению интенсивности процессов окислительного стресса и перекисного окисления липидов и, как следствие, к повышению устойчивости трансформантов к гипотермии, что выражалось в меньшей степени повреждения их листовых пластин, а также в большем проценте выживаемости после воздействия низкими температурами.

Впервые для подтверждения важной роли Д12-ацил-липидной десатуразы в предотвращении накопления избыточных количеств АФК была использована модельная система с применением параквата для инициации свободнорадикального окисления у растений, без воздействия низкой температуры, которая показала, что трансформированные растения характеризуются меньшим, по сравнению с контролем, содержанием начальных и конечных продуктов окислительного стресса и перекисного окисления липидов.

Анализ поученных результатов позволил впервые сформулировать гипотетический механизм влияния экспрессии гена с1еяА Д12-ацил-липидной десатуразы на поддержание структуры и функций мембран растительных клеток в период охлаждения, что позволяет сохранить клеточный гомеостаз и, в конечном итоге, повысить выживаемость растений.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные в работе экспериментальные данные о роли Д12-ацил-липидной десатуразы в повышении устойчивости растений картофеля к окислительному стрессу, вызванному гипотермией, имеют существенное значение для понимания механизмов формирования низкотемпературной резистентности у холодостойких растений. Теоретические обобщения и совокуп-

ность экспериментальных данных работы могут быть использованы в курсах лекций для студентов естественнонаучных специальностей разных ВУЗов страны.

Апробация работы. Основные результаты научной работы были представлены на IX международной конференции «Биология клеток in vitro и биотехнология» (Звенигород, 2008), на международной школе-конференции молодых ученых "Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях" (Звенигород 2008), на конференции молодых ученых в Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН (Москва, 2009), а также на семинарах лаборатории зимостойкости Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН (Москва, 2007-2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, из которых 2 статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 148 страницах машинописного текста, включая 5 таблиц, 30 рисунков; библиография содержит 251 название, из которых 163 на иностранном языке.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта исследования были использованы холодостойкие растения картофеля (Solanum tuberosum L., сорт Десница), трансформированные конструкцией, несущей ген des А Д12-ацил-липидной десатуразы цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803. Последовательность гена десатуразы была трансляционно слита с последовательностью репортерного гена ИсВМЗ, кодирующего термостабильную лихеназу. Конструкция гибридных генов находилась под контролем сильного конститутивного промотора 35S CaMV. Трансформанты также содержали маркерный ген устойчивости к канамицину nptll. Контролем служили нетрансформированные растения того же сорта. Растения были получены в результате совместной работы сотрудников ИФР РАН и ИОГен РАН, которым автор выражает глубокую благодарность за предоставленный экспериментальный материал.

Растения размножали микрочеренкованием и выращивали в камере фитотрона ИФР РАН in vitro при 24°С и 16 ч освещении люминесцентными лампами белого света (ЛБ-80, освещенность 100 моль квантов/м2-с) в течение 5 недель в пробирочной культуре на 10-13 мл агаризованной питательной среды, приготовленной по прописи Мурасиге и Скуга (Murashige, Skooge, 1962) с добавлением 2% сахарозы и витаминов.

Холодовую обработку проводили в климатической камере MIR-153 ("SANYO", Япония). Растения в пробирках (без ватно-марлевых пробок) помещали в камеру, предварительно доведя температуру последней до 0°С. В дальнейшем температуру внутри камеры постепенно (со скоростью 0,3°С/мин) снижали до -9°С и выдерживали растения при этой температуре в течение 20, 40 или 60 минут, в зависимости от задач

опыта. Режим температурной обработки растений, т. е. сочетание температуры с продолжительностью её действия был подобран в предварительных опытах, которые показали, что температура -9°С при воздействии от 20 до 60 минут не приводит к нук-леации льда, как правило, губительной для холодостойких растений, но вызывает повреждения, различные по степени в зависимости от устойчивости генотипа, которые отражаются на процессах окислительного стресса. Для исследований использовали листья без черешков, взятые из средней части растений.

Наличие и экспрессию введенных генов подтверждали с использованием молекулярных методов ПЦР и ОТ-ПЦР.

Определение содержания и состава жирных кислот мембранных липидов определяли методом газожидкостной хроматографии (Пчелкин и др.,2001).

Ультраструктуру клеток и хлоропластов листьев контрольных и трансформированных растений исследовали с помощью электронного микроскопа TEMSCAN 100 СХ2 («JEOL», Япония), предварительно получив ультратонкие срезы на ультрамикротоме LKB-3 («LKB», Швеция). Морфометрические исследования проводили на приборе MOP-VIDEOPLAN («Reichert», Австрия) на основании просмотра не менее 100 клеток каждого варианта.

Определение интенсивности фотосинтеза и дыхания проводили с помощью установки открытого типа с инфракрасным газоанализатором URAS 2Т фирмы «Hartmann und Braun». Камера располагалась в рабочем объеме климатического шкафа «Grönland» (Германия). Изменения проводились при температуре 24°С. Скорость газообмена измеряли сразу же после установления заданной температуры в камере. С целью снижения ошибки опыта, связанной с суточной динамикой фотосинтеза, измерения проводили в одно и то же время - с 9:30 до 14:00.

Скорость образования супероксида определяли методом, в основе которого лежит способность этого радикала восстанавливать адреналин в адренохром (Ргауог, 1979). Количество супероксидного анион-радикала выражали в относительных единицах скорости (1 отн. ед. = 10° опт. ед./мин). Специфичность восстановления адреналина супероксидным анион-радикалом была подтверждена ингибированием реакции при добавлении супероксиддисмутазы (100 ед.акт./мин).

Определение содержания перекиси водорода (H2Oj) проводили с помощью метода, основанного на образовании окрашенного соединения - комплекса пероксида титана (Kumar, Knowles, 1993). Концентрацию Н202 рассчитывали по стандартной калибровочной кривой концентрации перекиси водорода и выражали в ммоль/г сырой массы.

Содержание диеновых конъюгатов (ДК) жирных кислот определяли по методу, основанному на свойствах сопряженных двойных и тройных связей, входящих в состав гидроперекисей липидов, интенсивно поглощать в УФ-области с характерными максимумами (232 нм). Количество ДК выражали в ммоль/г сырой массы (Biddlack, Tappel, 1973, Кейтс, 1975).

Содержание малонового диальдегида (МДА) определяли по цветной реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), основанному на образовании в кислой среде окрашенного триметинового комплекса, имеющего характерный спектр поглощения с максимумом X. = 532 нм (Стальная, Гаришвили, 1977). Количество МДА выражали в мкмоль/г сырой массы (Жиров и др., 1982).

Холодостойкость исследуемых генотипов картофеля оценивали по индексу повреждения листовых пластин, который определяли путём измерения степени выхода электролитов из повреждённой холодом (-9°С, 40 минут) ткани в водную фазу (Hepburn et al., 1986), а также прямым методом определения процента выживаемости контрольных и трансформированных растений картофеля после действия краткосрочного жесткого охлаждения (-9°С, 60 минут).

Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли при помощи метода, основанного на способности СОД конкурировать с нитросиним тетразолием за супероксидные радикалы, поступающие из реакции фотоокисления рибофлавина (Beauchamp, Fridovich, 1971). Активность СОД выражали в единицах активности на г сырой массы листьев.

Активность каталазы измеряли по скорости деградации Н202 согласно методике (Kumar, Knowles, 1993). Фиксировали падение оптической плотности за 1 минуту после добавления в ферментный экстракт раствора 100 мкл 0,1М Н202 и выражали активность фермента в ммоль разложившейся перекиси/г сырой массы в минуту.

Определение активности гваякол пероксидазы провдили по методу, основанному на реакции окисления ароматического соединения (гваякола) до окрашенного соединения (тетрагваякола). Активность пероксидазы выражали в ммоль гваякола/г сырой массы в минуту.

Для установления роли Д12-ацил-липидной десатуразы в предотвращении формирования избыточных количеств АФК применили модельную систему для индукции окислительного стресса, основанную на использовании параквата, гербицидные свойства которого связаны с его способностью получать электрон от доноров электрон-транспортных цепей (ЭТЦ) хлоропластов и передавать его на молекулу кислорода с образованием супероксидного аниона, что приводит к нарушениям фотосинтеза и усиленному образованию АФК (Bowler et al., 1992). У контрольных и трансформированных растений определяли основные показатели окислительного стресса (скорость образования супероксидного радикала, накопление МДА и диеновых конъюгатов) и работу ферментативной составляющей антиоксидантной системы (активность СОД, каталазы, гваякол-пероксидазы). Для проведения данного эксперимента использовали методики, описанные выше.

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием программы «Statistica for Windows 9.0» (применяли t-критерий Стьюдента для независимых выборок, Р=0,05) и графопостроителя «Microsoft Office Excel 2007». В экспериментах использовали 4-6-кратную биологическую и 8-12-кратную аналитическую повтор-

ность измерений. В таблицах представлены средние арифметические значения и их стандартные ошибки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Молекулярно-биологический анализ растений-трансформзнтов.В начале исследовательской работы было необходимо провести выбор линий трансформированных растений с признаками активной экспрессии гена ¿/мЛ Д12-ацил-липидной десатуразы цианобактерии БупескосуБйв 5р. РСС 6803. Одним из способов доказательства экспрессии того или иного гена является анализ изменения субстрата соответствующего фермента. В работе Маали и др., 2007 были приведены данные по абсолютному содержанию жирных кислот в листьях различных линий растений картофеля, трансформированных геном ¿еьА. В соответствии с ними были выбраны 2 линии трансформантов, отличающиеся наибольшим содержанием ПНЖК в клетках, а следовательно, обладающие наибольшей активностью Д12-ацил-липидной десатуразы. При этом в одном случае последовательность гена десатуразы была трансляционно слита с последовательностью репортерного гена ИсВМЗ, кодирующего термостабильную лихеназу (¿/мЛ-//сВМЗ-растеIшя), а в другом (¿е$А-растения) - растения несли нативный ген десатуразы с!е5А. В ходе проведенной в дальнейшем экспериментальной работы было показано, что отличия в данных по большинству проводимых нами опытов между ¿езА- и ¿мЛ-//сВЛ/5-растениями были незначительными. Таким образом, можно подтвердить, что десатураза в составе гибридного белка сохраняет способность катализировать образование двойной связи в цепи ЖК и изменять состав ЖК в мембранных липидах (Маали и др., 2007), а лихеназа при этом не привносит побочных эффектов в действие целевого гена десатуразы. В соответствие с этими данными, было решено для изучения роли цианобактериальной Д12-ацил-липидной десатуразы в повышении устойчивости трансформированных растений картофеля к гипотермии использовать (1е$А-НсВМ1-растения, как наиболее удобный объект для периодических анализов экспрессии встроенного гена.

Для подтверждения наличия в тканях трансформированных растений введенных генов был использован метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

На рис. 1 видно, что в тканях трансформантов (в отличие от контрольных растений) присутствуют целевой ген ¿е$А, репортерный ген НсВМЗ и ген устойчивости к канамицину пр1.

Но наличие гетерологичных генов в составе тотальной ДНК ещё не означает, что эти гены экспрессируются, а их белковые продукты выполняют свои функции. Уровень экспрессии генов может быть определен по количеству образовавшихся мРНК и/или белкового продукта.

Мы оценили уровень экспрессии гибридного гена йезА-исВМЗ в клетках растений картофеля на основании метода ПЦР с обратной транкрипцией (ОТ-ПЦР), то есть по образованию мРНК. Результаты показали, что гетерологичные гены, содержащиеся в тканях трансформантов, хорошо экспрес-сируются, по крайней мере, на уровне транскрипции (рис. 2).

Рис. 1. Электрофореграмма продуктов ПЦР-реакции ДНК растений картофеля".

1) контрольные растения

2) скзА-НсВМЗ-растения

3) нуклеотидные маркеры

Качественный ЖК мембранных

и количественный состав липидов контрольных и

трансформированных растений картофеля.

Ферментативная активность Д12-ацил-липидной десатуразы, осуществляющей образование второй двойной связи линолевой кислоты была, подтверждена анализом абсолютного содержания ЖК в листьях контрольных и трансформированных растений.

Данные показали существенные различия в содержании главных ЖК (таблица 1). Так, содержание линолевой (Д9,12-18:2) кислоты - основного продукта активности Д12-десатуразы - увеличилось у трансформантов почти на 30% по отношению к нетрансформированному контролю.

При этом образование линолевой кислоты, являющейся субстратом для последующего превращения в линоленовую (Д9,12,15-18:3) кислоту, привело к увеличению содержания последней более чем на 25%, что мы связываем с работой растительных десатураз. Здесь следует отметить, что активность десатураз зависит от количества соответствующего субстрата (Los, Murata, 1998, Лось 2005), то есть для образования 18:1 требуется ненасыщенная 18:0 кислота, для образования диеновой 18:2 в качестве субстрата необходима моноеновая 18:1 ЖК. Подобным образом можно объяснить то, что количество насыщенной пальмитиновой (18:0) кислоты в тканях трансформантов было меньше, чем у контроля, при этом содержание моноеновой 18:1 ЖК было выше уже у desA-ИсВМЗ-растенш. Выстраивая гипотетическую цепочку биохимических превращений, можно предположить, что активная экспрессия гена desA приводила к увеличению количества 18:2. Это потребовало больше субстрата в виде 18:1, а следовательно, и увеличения активности собственных растительных ферментов, превращающих 18:0 в 18:1. В свою очередь, сама линолевая (18:2) кислота тоже является субстратом для образования 18:3.

Рис. 2. Электрофореграмма продуктов ОТ-ПЦР-реакции мРНК растений картофеля:

1) контрольные растения

2) а,еЫ-//сВА/3-растения

3) нуклеотидные маркеры

Таблица 1. Абсолютное содержание главных жирных кислот в листьях контрольных и трансформированных геном с!е$А Д12-ацил-липидной десатуразы растений картофеля*.

Особый интерес представляют данные по содержанию в растениях-трансформантах 16:3-ЖК. Известно, что картофель относится к !6:3-растениям, то есть его хлоропласты содержат Д7,10,13-16:3 ЖК. Также известно, что эта кислота, содержащаяся в вп-2 положении фосфатидилдиацилглицеринов хлоропластов, играет большую роль в холодоустойчивости 16:3-растений, вероятно, способствуя процессу фотосинтеза при пониженных температурах. Как следует из результатов таблицы 1., содержание остатков 16:3-ЖК в липидах с1е$А-ИсВМЗ-,ра.с1£тй. было на 65% выше, чем в контроле. Поскольку при биосинтезе Д7,10,13-16:3 ЖК субстратом служат липиды, содержащие в вп-2 положении Д7,10-16:2 кислоту, также представленную в растениях картофеля, можно предположить, что цианобактериальная Д12-ацил-липидная десатураза в трансформантах картофеля может использовать в качестве субстрата не только С18-ЖК, но и С16-ЖК. Возможно, что активность именно этого фермента приводила к значительному увеличению содержания Д7,10,13-16:3 ЖК в липидах трансформантов линии ¿¿ел4-/;'сВМЗ.

В конечном итоге трансформация растений привела к увеличению общей суммы ЖК в тканях трансформированных растений, а также индекса ненасыщенности ЖК, что является предпосылкой для увеличения холодостойкости трансформантов.

Исследование ультраструктупной организации хлоропластов контрольных и трансформированных растений картофеля

Общее количество жирных кислот в большой степени влияет на мембранную структуру органелл клетки. Изменения в липидном составе мембран, большая часть которых у растений представлена мембранами хлоропластов, позволяет предположить существенные изменения в структуре этих органелл. Изучение ультраструктуры хлоропластов важно с той точки зрения, что способность к фотосинтезу при низкой

ЖК Состав ЖК, нмоль/г сырой массы

Контроль (кзА-ЧсВМЗ

14:0 82 80

16:0 2801 2924

Д9-16:1 373 552

Д9,12-16:2 65 79

Д7,10,13-16:3 379 626

18:0 296 252

Д9-18.1 271 346

Д9Д2-18:2 2054 2668

Д9,12,15-18:3 6710 8416

19:0 31 23

20:0 131 137

Сумма ЖК 13193 16103

ИН 2,95 3,71

* Во всех случаях статистическая ошибка не превышала 4%.

температуре является необходимым условием формирования устойчивости растений к холоду (Климов, 1997).

Электронно-микроскопические наблюдения показали, что мембранная система трансформированных растений, по сравнению с контролем, хлоропласта которых имеют рыхлую форму, более развита и упорядочена (рис. 3). На основании морфометри-ческого анализа можно заключить, что при почти одинаковой площади хлоропластов у обоих генотипов, число гран в хлоропластах трансгенов увеличено почти на 50%, по сравнению с контролем.

У трансформантов также более, чем на четверть увеличилось количество тила-коидов в гране. Общее же количество тилакоидов в хлоропластах с1езА-ИсВМЗ-растений было почти в 2 раза больше, чем у контрольных растений. Количество пла-стоглобул в хлоропластах трансформантов почти на 20% превышало таковое у не-трансформированных растений (таблица 2).

Рис. 3. Ультраструктурная организация хлоропластов листьев контрольных (слева) и с1езА-ИсВМЗ (справа) растений картофеля.

Таблица 2. Сравнительная характеристика структурных элементов хлоропластов листьев контрольных и ¿еьА-НсВМЗ-растений картофеля.

Площадь хлоропласта (мк ) Площадь крах-мальн. зерна 2 (мк ) Число гран Число тилакоидов в гране Общее число тилакоидов Количество пластогло- бул

Дикий тип 9,10±0,3 1,23±0,1 14,48±0,5 5,75±0,2 83 4,04±0,2

с1езА-ИсВМЗ 9,46±0,3 0,84±0,1 21,48±0,8 7,27±0,2 156 4,81±0,3

По-видимому, все эти изменения ультраструктуры хлоропластов трансформированных растений картофеля, мембраны которых обогащены ненасыщенными жирными кислотами, направлены на поддержание структуры и функции органелл и клеток в целом, что, в конечном итоге, должно приводить к повышению устойчивости.

Определение интенсивности фотосинтеза и дыхания по скорости СО?-газообмена

Изменения, вызванные введением гена десатуразы, отразились не только на структуре, но и на фотосинтетической функции хлоропластов. С точки зрения изучения фотосинтетических процессов, важным показателем холодоустойчивости являет-

ся более высокое соотношение интенсивности фотосинтеза и дыхания (P/R) у растений, подвергнутых низкотемпературному воздействию.

Результаты эксперимента показали, что после 5-дневного пребывания растений в условиях пониженной температуры (8°С) соотношение фотосинтез/дыхание у трансформантов было выше, чем у контрольных растений (рис. 4). Преобладание фотосинтетических процессов свидетельствует о том, что пластическо-энергетический обмен растений-трансформантов является более активным. Это, во-первых, служит предпосылкой для формирования холодоустойчивости растений и накопления в них веществ, защищающих от низкотемпературного стресса (ос-молитов, криопротекгоров и других), а, во-вторых, может свидетельствовать о том, что ЭТЦ хлоропластов трансформированных растений при гипотермии работают более стабильно, чем у контрольных растений.

Влияние Д12-ацил-липидной десатуразы на показатели индуцированного гипотермией окислительного стресса у растений картофеля

Известно, что существует обратная корреляция между устойчивостью растений и индуцированной низкими температурами интенсивностью свободно-радикальных процессов в клетках. В связи с этим, представляется возможным оценить участие Д12-ацил-липидной десатуразы в формировании низкотемпературной устойчивости по показателям окислительного стресса. Кроме того, детальное изучение процессов окислительного стресса, может раскрыть некоторые механизмы повышенной холодостойкости того или иного генотипа.

Согласно современным представлениям, причиной повреждения растений при низких температурах считается нарушение структурно-функционального состояния мембран, возникающее при интенсификации свободно-радикальных процессов, индуцируемых АФК (Скулачев, 1996; Мерзляк, 1999; Лукаткин, 2002). Одним из первых соединений, появляющихся в результате свободно-радикальных процессов, является супероксид-анион. При действии холода в клетках растений происходит разобщение в работе цепей переноса электронов (Suzuki, Mittler, 2006). При этом в ЭТЦ митохондрий и хлоропластов (Foyer et al., 2006), а также при участии различных НАДФН-оксидаз (Apel, Hirt, 2004) лишний электрон "сбрасывается" на молекулярный кислород, что ведет к образованию супероксида. Последний, в свою очередь, является своеобразной базой для генерации остальных АФК (Pastori et al., 2000). В связи с этим, важным показателем инициации окислительного стресса является скорость об-

^ г

S 5 Т

И щ

адж

Дикий ти п desA-licBM3

Рис 4. Соотношение интенсивности фотосинтез/дыхание (P/R) у контрольных и desA-ИсВМЗ-растений картофеля в норме и при гипотермии

(□ - 24°С, ■ - 8°С).

и 5 о. 2

о ^

Контроль

¿еэА-НсВМЗ

Рис. 5. Скорость образования супероксидного аниона в листьях контрольных и ¿е5Л-/;сВМЗ-растений картофеля в норме и после охлаждения (О - 24°С, Я-20 мин, -9°С).

разования радикальных форм кислорода (прежде всего, супероксидного аниона) в растительных клетках.

На рис. 5 можно видеть, что скорость образования супероксидного радикала, как в листьях растений дикого типа, так и у трансформантов, в нормальных условиях имела сходные значения. Однако после гипотерми-ческого воздействия этот показатель значительно вырос (на 55%) у контрольных растений, тогда как у трансформантов достоверно не изменился. Мы связываем это со стабилизацией работы мембран трансформантов при гипотермии, вызванной повышенной активностью Д12-ацил-липидной десатуразы, обеспечивающей более высокую степень ненасыщенности ЖК мембранных липидов.

Другая форма активированного кислорода, перекись водорода, являющаяся результатом ферментативной деградации супероксида супероксиддисмутазой, способна повреждать белки, нуклеиновые кислоты и липиды. Она легко проникает через биологические мембраны и окисляет важные биополимеры не только в месте ее образования, но и в соседних компартментах и клетках, что может в разы увеличивать степень "окислительного" повреждения растительных тканей при стрессе.

В наших опытах содержание перекиси водорода при гипотермии а листьях контрольных растений увеличилось более чем на 80% по сравнен™ с нормальными условиями выращивания. У трансформированных растений это увеличение было не столь значительным (рис. 6). Полученные результаты согласуются с данными, представленными на рис 5., согласно которым скорость генерации супероксида при стрессе сильно увеличивалась у растений дикого типа, а у трансгенных оставалась примерно на том же уровне, что и в нормальных условиях.

Таким образом, изучение двух основных показателей окислительного стресса свидетельствует о более слабой его интенсивности при гипотермии у трансформированных растений, мембранные липиды которых обогащены ПНЖК.

• ай-

5 о -о £

Контроль ¿евА-КсВМЗ

Рис 6. Содержание перекиси водорода в листьях контрольных и с!е$Л-НсВМЗ-растений картофеля в норме и после охлаждения (П - 24°С. ■ - 20 мин. -9°а.

1 о. га

д Л

Контроль

<1е5А-1|сВМЗ

Рис 7. Содержание диеновых конъюга-тов ЖК в листьях контрольных и ¿езЛ-/(сВМЗ-растений картофеля в норме и после охлаждения (□ - 24°С, М - 20 мин, -9°С).

Мы предположили, что снижение генерации избыточных количеств АФК при низкотемпературном стрессе, должно отразиться на процессах перекисного окисления мембранных липидов. В данной работе были изучены первичные и конечные продукты, образующиеся в результате реакций ПОЛ.

Показано, что содержание первичных продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов ЖК, возникающих при непосредственном образовании липогидроперекисей, практически не изменилось у трансформированных растений при действии низких температур, тогда как в листьях контрольных растений наблюдалось увеличение этого показателя почти на 50% (рис.7). Следует отметить, что определение содержания диеновых конъюгатов (ДК) имеет важное значение для оценки ПОЛ, поскольку отражает раннюю стадию окисления (Владимиров, 1989).

Данные по изучению диеновой конъюгации свидетельствуют о том, что активность Д12-ацил-липидной десатуразы, по-видимому, может оказывать заметное стабилизирующее воздействие на липиды мембран и предотвращать их деградацию в ходе окислительного стресса, вызванного низкими температурами.

Конечным стабильным продуктом ПОЛ является малоновый диальдегид (МДА), содержание которого в клетках растений является одним из важнейших показателей их устойчивости к действию низких температур (Лукаткин, 2002). Увеличение количества МДА в клетках при стрессе свидетельствует о деструкции липидных компонентов биомембран в результате окислительного стресса и о более слабой устойчивости растений к гипотермии.

Изменение содержания МДА при гипотермии имеет ту же тенденцию, что и показатели диеновой конъюгации ЖК. Количество МДА у контрольных растений при действии низких температур увеличилось более чем на 75% по сравнению с нормальными условиями выращивания. У трансформантов повышение концентрации МДА в клетках было незначительным (рис. 8).

Контроль с!е5А-НсВМЗ

Рис 8. Содержание малонового ди-альдегида в листьях контрольных и с1езА-ИсВМЗ-растений картофеля в норме и после охлаждения (□ - 24°С, ■ - 20 мин, -9°С).

Таким образом, изменения в структуре мембран, вызванные экспрессией гена Д12-ацил-липидной десатуразы, способствовали предотвращению инициации окислительного стресса при гипотермии и следующего за ним перекисного окисления липи-дов.

Изучение активности антиоксидантных ферментов у контрольных и трансформированных растений при гипотермии

Содержание АФК при действии низких температур в значительной степени определяется уровнем активности антиоксидантной системы растительных клеток. Поэтому было необходимо провести анализ активности основных ферментов антиоксидантной защиты (су-пероксиддисмутазы, каталазы и пероксидазы гваякола), участвующих в детоксикации АФК.

Основным антиоксидантным ферментом является супероксиддисмутаза, которая инак-тивирует супероксидный анион-радикал с образованием перекиси водорода.

В наших опытах повышение активности фермента в условиях гипотермии наблюдалось только у контрольных растений, тогда как в листьях растений, трансформированных геном Д12-ацил-липидной десатуразы, возрастание активности СОД было выражено в гораздо меньшей степени (рис. 9). Следует отметить, что транскрипция генов СОД чувствительна к окислительному стрессу и во многом зависит от интенсивности этого процесса (ЗсапёаПоз, 1993). Учитывая тот факт, что содержание субстрата СОД - супероксидного радикала - на фоне действия повреждающих температур также было повышено только у контрольных растений, (рис. 5), наблюдаемые изменения в активности СОД при гипотермии можно объяснить тем, что низкотемпературное воздействие не вызвало у трансформантов, в отличие от растений дикого типа, сильного окислительного стресса.

Каталаза, как фермент антиоксидантной защиты, отвечает за утилизацию избыточных количеств перекиси водорода. Повышение активности каталазы после охлаждения растений, отмеченное в литературе (Лукаткин, 2002), связывают с увеличением количества Н202 в результате развития окислительного стресса.

Результаты анализов показывают, что в условиях гипотермии уровень активности каталазы в листьях контрольных растений возрос приблизительно в 2 раза, тогда как у трансформантов активность этого фермента увеличилась незначительно (рис. 10).

50 ,-

з 45 Г Т

- ¡3 40 ^^н

11». I _

1!: г"-И |

Контроль <1е5А-4|сВМЗ

Рис 9. Активность супероксиддис-мутазы в листьях контрольных и с1е$А-ИсВМЗ-растений картофеля в норме и после охлаждения (□ -24°С, ■ - 20 мин, -9°С).

Контроль

йевА-ПсВМЗ

Рис 10. Активность каталазы в листьях контрольных и ¿ехА-ИсВМЗ-растений картофеля в норме и после охлаждения (□-24°С,И-20 мин, -9°С).

Изменения активности ещё одного ан-тиоксидантного фермента, участвующего в детоксикации перекиси водорода, мембран-связанной пероксидазы гваякола, имеют сходную тенденцию с показателями активности каталазы (данные не представлены).

Высокую степень сходства в характере изменений активности гваякол-пероксидазы и каталазы можно объяснить тем, что оба эти фермента, нейтрализующие перекись водорода, в равной степени, конкурируют за субстрат.

Влияние А12-ацил-липидной десату-разы на устойчивость растений картофеля к гипотермии

Повышенная устойчивость растений к окислительному стрессу, как правило, сочетается с их более высокой устойчивостью к гипотермии. Одним из наиболее распространенных методов исследования устойчивости теплолюбивых и холодостойких растений к низким температурам является определение уровня повреждений растительных тканей по изменению проницаемости клеточных мембран, что отражается на последующем выходе электролитов из клеток.. Основываясь на том, что гипотерми-ческое воздействие, приводящее к интенсификации ПОЛ, должно предшествовать повреждениям листовых пластинок и выходу электролитов из клеток, в данном опыте мы продлили температурную экспозицию при -9°С до 40 мин (вместо 20 мин в предыдущих экспериментах).

Данные, представленные на рис. 11, показывают, что предложенное нами в этом эксперименте низкотемпературное воздействие вызвало значительные повреждения листовых пластин контрольных растений и практически не отразилось на состоянии трансформантов. Таким образом, можно сделать вывод, что трансформированные растения проявили большую устойчивость к гипотермии по сравнению с контрольным вариантом.

Это было подтверждено и прямым методом определения выживаемости контрольных и трансформированных растений

Контроль ¿еэА-НсВМЗ

Рис 11. Индексы повреждений листовых пластин контрольных и с/етЛ-//сВЛ/З-растений картофеля в норме и после охлаждения (□ - 24°С, ■ - 40 мин, -9°С).

после холодового воздействия -9°С в течение 60 минут. Анализ 80 растений каждого варианта показал, что выживаемость контрольных растений не достигала и 20%, в то время как трансформантов выжило более 70% (таблица 3).

Таким образом, экспрессия гете-рологичного гена с1е$А Д12-ацил-липидной десатуразы в тканях растений картофеля способствует стабилизации состава и функций мембран, тем самым защищая их от негативного воздействия активных кислородных радикалов при гипотермии, что повышает выживаемость растений после действия низких температур.

Роль десатуразы в предотвращении окислительного стресса, индуцированного паракватом

Для подтверждения протекторной роли Д12-ацил-липидной десатуразы в предотвращении генерации избыточных количеств АФК при низкотемпературном стрессе у растений картофеля, была применена модельная система, инициирующая окислительный стресс без охлаждения растений. Такой системой явилась обработка растений паракватом, гербицидные свойства которого связаны с его способностью получать электрон от доноров ЭТЦ хлоропластов и передавать его на молекулу кислорода с образованием супероксидного аниона. В экспериментах использовалась концентрация параквата 1 мМ, которая в предварительно проведённых опытах вызывала наиболее существенные различия в реакциях исследуемых генотипов. Применение подобной системы может дать более чёткое представление о развитии процессов ПОЛ в растительных тканях и о роли цианобактериальной Д12-ацил-липидной десатуразы в предотвращении повреждений мембран при действии оксидативного стресса. У обоих генотипов растений определяли основные показатели окислительного стресса (скорость образования супероксида, накопление МДА и диеновых конъюгатов) и работу ферментативной составляющей антиоксидантной системы (активность СОД, катала-зы, гваякол-пероксидазы).

Согласно нашим данным, скорости образования супероксидного радикала до обработки паракватом у контрольных и трансформированных растений отличались незначительно (рис. 12). После обработки гербицидом этот показатель вырос у обоих генотипов растений, ко если скорость образования 02' в листьях трансформангов увеличилась на 25%, то у контрольных растений увеличение достигло 65%.

Таблица 3. Процент выживаемости контрольных и с1езА-ЧсВМЗ-растений картофеля после действия гипотермии

(-9°С, 60 минут)

Выживаемость, %

Контроль 17±5

ск$А-ПсВМЗ 77±13

Контроль

ймМкВМЗ

Рис. 12. Скорость образования супероксида в листьях контрольных и (¡еяА-/|сВА/З-растений картофеля до и после обработки паракватом (□ - до обработки, М - 1 мМ паракват).

Количество диеновых конъюгатов, отражающее раннюю стадию окисления ЖК мембранных липидов, увеличилось при действии параквата в гораздо большей степени (на 67%) у нетрансформированных растений. У трансформантов прирост этого показателя оказался не столь значительным (на 23%) (рис. 13).

В применённой нами модельной системе (как и при действии гипотермии) мембранные структуры desA-licBMЗ-растений оказались более устойчивыми к действию окислительного стресса уже на начальных этапах, что должно затормозить дальнейшую деградацию мембран в ходе процессов перекисного окисления липидов.

Действительно, содержание МДА, отражающее позднюю и уже необратимую стадию окисления мембранных липидов, более чем в 2 раза увеличилось у контрольных растений после обработки паракватом, тогда у трансформантов этот показатель изменился в гораздо меньшей степени (рис. 14).

Рассматривая эти данные и сравнивая их с предыдущими результатами по оценке окислительного стресса, полученными при действии низкой температуры, можно сделать вывод, что трансформация растений цианобактериальным геном desA Д12-ацил-липидной десатуразы влияет на стабилизацию мембранных структур растительных клеток, за счёт чего при действии параквата, равно как и при гипотермии, предотвращается избыточная генерация АФК уже на начальных стадиях, что не даёт оснований к дальнейшему развитию окислительного стресса и препятствует необратимым повреждениям тканей трансформированных растений картофеля.

Показатели активности основных ферментов антиоксидантной системы при обработке растений паракватом также имели сходную тенденцию с этими же данными при действии гипотермии.

Обработка паракватом, вызвавшая значительное усиление генерации АФК в клетках нетрансформированных растений (рис. 12), способствовала повышению ак-

Рис. 13.

Контроль <1«А-исВМЗ

Содержание диеновых конъюгатов ЖК в листьях контрольных и й5гл4-//с.бМ?-растений картофеля до и после обработки паракватом (□ - до обработки, ■ - 1 мМ паракват).

Контроль ймА-ИсвМЗ

Рис 14. Содержание малонового ди-альдегида в листьях контрольных и (квА-ИсВМЗ-ргхяегшл картофеля до и после обработки паракватом (□ - до обработки, ■ - 1 мМ паракват).

Коктраль

<1е5А-ПсВМЗ

Рис. 15. Активность супероксид-дисмутазы в листьях контрольных и (1тА -//сВА^З-растений картофеля до и после обработки паракватом (□ - до обработки, ■ - 1 мМ паракват).

3 5?

: х _

\ о л

Г ^ и

> ^ о : ю «

й-5

Контроль ймА-ЦсНМЗ

тивности СОД у контрольного варианта почти на 80%. В листьях трансформантов изменение этого показателя было менее заметным (рис. 15).

На рис. 16, отражающем изменение активности каталазы при обработке паракватом, мы также можем видеть значительное повышение активности фермента у контрольного варианта, тогда как у трансформированных растений увеличение активности каталазы было не столь значительным.

Изменение активности гваякол-пероксидазы в опытах с применением пара-квата имеет сходный рисунок с активностью каталазы в этих условиях (данные не представлены).

В общем, как и в опытах с гипотермией, при действии параквата активность основных ферментов антиоксидантной защиты была значительно повышена у нетрансформиро-ванных растений. По нашему мнению, трансформанты ке нуждались в столь сильном увеличении активности антиоксидант-ных ферментов, поскольку окислительный стресс у них был выражен в гораздо меньшей степени по сравнению с контрольными растениями.

Подводя итоги проделанной работы, можно заключить, что гетерологичная Д12-ацил-липидная десатураза способствует увеличению содержания ПНЖК в мембранных липидах, что приводит к более стабильному функционированию мембранных структур и в значительной степени предотвращает "сброс" электрона на кислород и повышенное образование АФК в условиях стресса.

Рис. 16. Активность каталазы в листьях контрольных и с1е$А-НсВМЗ-растений картофеля до и после обработки паракватом (□ - до обработки, ■ - 1 мМ паракват).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на большое количество работ, посвященных исследованию окислительного стресса, возникающего при охлаждении теплолюбивых растений, особенности этого процесса и механизмы защиты от него у холодостойких растений практически мало изучены. При этом данные о роли десатураз в формировании терморезистентности холодостойких растений, а также механизмы проявления протекторного действия конкретных ферментов, осуществляющих десатурацию жирных кислот биомембран, нуждаются в существенном дополнении. В наибольшей степени, это относится к ацил-липидным десатуразам, функциональная активность которых имеет решающее значение в поддержании текучести мембран в период действия низких температур (Lyons, 1976). В связи с этим, использующийся в данной работе типичный представитель группы холодостойких растений картофель (Solanum tuberosum L., сорт Десница), экспрессирующий ген desA А12-ацил-липидной десатуразы цианобак-терии Synechocystis sp. РСС 6803, явился удачной моделью для изучения роли Д12-ацил-липидной десатуразы в формировании устойчивости холодостойких растений к окислительному стрессу, индуцированному гипотермией.

В ходе исследований показано, что экспрессия в тканях растений картофеля ге-терологичного гена desA Д12-ацил-липидной десатуразы приводила к увеличению доли полиненасыщенных жирных кислот в мембранных липидах (в особенности 18:2 и 18:3), а также индекса их ненасыщенности и общего количества жирных кислот.

Повышение уровня содержания ЖК привело к увеличению мембранных структур хлоропластов (в частности, гран и тилакоидов) трансформированных растений. Структурно-функциональная стабильность мембран трансформированных растений картофеля, обусловленная активностью Д12-ацил-липидной десатуразы, способствовала предотвращению избыточной генерации АФК, что привело к снижению интенсивности окислительного стресса и перекисного окисления липидов при гипотермии. За счёт этого трансформанты приобрели повышенную устойчивость и выживаемость после действия низких температур.

Применение модельной системы (обработка разобщающим агентом - параква-том) для инициации окислительного стресса без участия низкой температуры позволило подтвердить важную роль цианобактериальной Д12-ацил-липидной десатуразы в предотвращении формирования избыточных количеств АФК при стрессе и защите важнейших биологических мембран от деструктивного действия процессов свобод-норадикального окисления.

Каким же образом реализуется стресс-протекторное действие введённого в растения картофеля гена Д12-ацил-липидной десатуразы? Анализ полученных в ходе экспериментальной работы данных позволил впервые сформулировать гипотетический механизм влияния экспрессии гетерологичного гена desA Д12-ацил-липидной

Рис. 17. Гипотетическая схема влияния экспрессии гена desA Д12-ацил-липидной десату-

разы на поддержание структуры и функций клеточных мембран растений картофеля

(Solanum tuberosum L., сорт Десница).

I. Транскрипция гена desA происходит в ядре, затем мРНК выходит из ядра через ядерные поры и попадает на рибосомы ЭПР

II. На рибосомах происходит трансляция белка Д12-ацил-липидной десатуразы, после чего ли-пофильный белок попадает в мембранные структуры ЭПР, где катализирует образование второй двойной связи линолевой (18:2) кислоты. По-видимому, далее происходит образование линоленовой (18:3) кислоты за счёт активности собственных растительных десатураз |

III. Образовавшиеся ПНЖК в составе лилосом транспортируются в аппарат Гольджи, где происходит их перераспределение

IV. Далее липосомы переносят ПНЖК из аппарата Го.пьджи в мембранные структуры клеточных ' органелл (митохондрии, хлоропласты, цитоплазматическая мембрана). По-видимому, таким

же образом в составе липосом способен переноситься и белок Д12-ацил-липидной десатуразы.

десатуразы цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 на повышение устойчивости трансформированных растений картофеля к окислительному стрессу, вызванному действием гипотермии (рис. 17). Ь

Очевидно, что целевой ген desA при трансформации растений картофеля встроился в ядерный геном. Соответственно, процесс транскрипции происходит в ядре растительной клетки. После завершения транскрипции мРНК выходит из ядра через ядерные поры и попадает на рибосомальный аппарат эндоплазматического рети-кулума, где и происходит трансляция белка Д12-ацил-липидной десатуразы. Следует отметить, что по структуре и функциям цианобактериальная Д12-ацил-липидная де-сагураза (ген des А) напоминает Д12-ацил-липидную десатуразу растений (ген fadl) (Лось, 1997). По-видимому, после завершения трансляции она, подобно растительному ферменту, попадает с рибосомального аппарата в ЭПР, где и осуществляет образо- 1 вание линолевой (18:2) кислоты из олеата (18:1). В дальнейшем, растительные деса- i туразы могут образовать из линолевой линоленовую (18:3) кислоту. Затем образо-

вавшиеся ПНЖК в составе всевозможных везикул и липосом транспортируются в аппарат Гольджи, откуда происходит дальнейшее их перемещение с последующим встраиванием в мембранные структуры клетки (плазмалемму, митохондрии, хлоро-пласты). Таким же образом из ЭПР и аппарата Гольджи во внешние мембранные структуры может переноситься и сама десатураза.

Таким образом, показано, что постоянное поддержание текучести мембран посредством активной работы Д12-ацил-липидной десатуразы имеет большое значение в формировании устойчивости растений картофеля к окислительному стрессу, развивающемуся в ходе охлаждения. Это происходит благодаря увеличению жидкостных свойств мембран за счёт повышенной активности Д12-ацил-липидной десатуразы, что, во-первых, способствует снижению интенсивности образования активных форм кислорода при низкотемпературном стрессе, а во-вторых, обеспечивает текучесть мембран при охлаждении, тем самым, сохраняя клеточный гомеостаз и поддерживая функциональную активность мембран-связанных белков в условиях гипотермии. Всё это в конечном итоге приводит к повышению устойчивости к действию низких температур картофеля, как типичного представителя группы холодостойких растений.

ВЫВОДЫ

1. Подтверждено наличие и экспрессия гена (¡е$А Д12-ацил-липидной десатуразы цианобактерии 8упес1юсу$Чз ¡р. РСС 6803. в тканях трансформантов картофеля с помощью методов ПЦР, ОТ-ПЦР и анализа продуктов реакции десатурации.

2. Трансформированные растения отличались от контроля повышенным содержанием в листьях полиненасыщенных ЖК, общего количества ЖК, а также индекса их ненасыщенности.

3. Повышение общего количества ЖК в листьях трансформантов отразилось на структуре хлоропластов: отмечено увеличение по сравнению с контролем количества пластоглобул, гран, числа тилакоидов в гране и общего количества тила-коидов.

4. Изменения в структуре хлоропластов, вызванные введением гена десатуразы, отразились на фотосинтетической функции растений: трансформанты отличаются от контроля более высоким отношением интенсивности фотосинтеза к темновому дыханию при гипотермии, что служит показателем повышенной устойчивости мембран к действию низкой температуры.

5. Повышение структурно-функциональной стабильности мембран трансформированных растений картофеля, вызванное действием Д12-ацил-липидной десатуразы, способствовало предотвращению избыточной генерации АФК, что выразилось в меньшей, по сравнению с контролем, интенсивности окислительного стресса и перекисного окисления липидов при гипотермии.

6. Трансформированные растения более устойчивы к гипотермии по сравнению с ^трансформированным контролем, что подтверждено рядом косвенных методов, а также путём прямого охлаждения растений.

7. Эксперименты по обработке растений паракватом, вызывающим окислительный стресс без воздействия низкой температуры, подтвердили протекторную роль Д12-ацил-липидной десатуразы в предотвращении генерации избыточных количеств АФК, что выразилось в гораздо меньшей интенсивности образования супероксидного аниона, а также начальных и конечных продуктов ПОЛ у трансформантов.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Дёмин И.Н., Антипина О.В., Маали А.Р., Юрьева И.О., Дерябин А.Н., Синькевич М.С. (2007) Сравнительный анализ устойчивости к гипотермии разновозрастных листьев трансформантов картофеля с введенным геном Д12-ацил-липидной десатуразы. VII Международный Симпозиум «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования». Материалы симпозиума. М.: Изд-во Рос. ун-та Дружбы народов. Т. 2. С. 121-125.

2. Demin I.N., Deryabin A.N., Sinkevich M.S.,. Antipina O.V, Trunova T.I. (2007) The enhancement of plant tolerance to hypothermic stress by the introducing of A12-acyl-lipid desatorase gene. 2-й Всероссийский симпозиум «Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности». Тезисы докладов. Москва.. С. 34.

3. Дёмин И.Н., Антипина О.В., Дерябин А.Н., Синькевич М.С., Трунова Т.Н. (2007) Применение метода выхода электролитов для определения устойчивости холодостойких растений к гипотермии. Международная Конференция «Современная физиология растений: от молекул до экосистем». Материалы докладов в трёх частях. Сыктывкар. Ч. 2. С. 107-110.

4. Sinkevich M.S., Deryabin A.N., Demin I.N., Trunova T.I. (2007) Chilling tolerance differences of varied potato cultivare and its genotypes acquired through transformation. Abst. 2nd Intern. Symp. "Plant Growth Substances: Intracellular Hormonal Signaling and Applying in Agriculture " 8-12 October, Kyiv, Ukraine. P. 89.

5. Sinkevich M.S., Deryabin A.N., Demin I.N., (2007) Trunova T.I. Effect of potato plant transformation by yeast invertase and delta-12-acyl-lipid desaturase genes at generation of reactive oxygen species during hypothermia. Abstr. 2nd Intern. Symp. "Plant Growth Substances: Intracellular Hormonal Signaling and Applying in Agriculture" 8-12 October, Kyiv, Ukraine. P. 111.

6. Дёмин И.Н., Дерябин A.H., Синькевич M.C., Трунова Т.И. (2008) Введение гена desA ацил-липидной десатуразы цианобактерии повышает устойчивость растений картофеля к окислительному стрессу, вызванному гипотермией. Физиология растений. Т. 55. №5. С. 710-720.

7. Дёмин И.Н. (2008) Содержание диеновых конъюгатов в листьях растений картофеля, трансформированных геном des А. при гипотермии. Материалы VIII Междуна-

родной конференции «Интродукция нетрадиционных и редких растений», г. Мичуринск, 8-12 июня. Т. 3. С. 32-36.

8. Демин И.Н. (2008) Дерябин А.Н., Синькевич М.С., Трунова Т.И.. Влияние гипотермии на генерацию супероксидного радикала и активность супероксиддисмутазы в листьях растений картофеля, траснформированного геном Д12-десатуразы. Материалы VIII Международной конференции «Интродукция нетрадиционных и редких растений», г. Мичуринск, 8-12 июня,. Т. 3. С. 36-40.

9. Дёмин И.Н., Юрьева Н.О., Дерябин А.Н., Синькевич М.С., Трунова Т.И. (2008) Экспрессия гена дельта-12-десатуразы цианобактерии в трансформантах картофеля снижает интенсивность совбоднорадикальных процессов. IX международная конференция "биология клеток in vitro и биотехнология". Звенигород. 8-12 ноября. Сборник тезисов. С. 108-109.

10. Дёмин И.Н., Дерябин А.Н., Синькевич М.С., Трунова Т.И. (2008) Влияние экспрессии гена desA в листьях растений картофеля на интенсивность свободнорадикальных процессов при гипотермии. Годичное собрание ОФР "Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений". Тезисы докладов международной научной конференции. Екатеринбург. 6-10 Октября. С. 157-158.

11. Маали Амири Р., Голденкова-Павлова И.В., Юрьева Н.О., Пчёлкин В.П., Цыдендам-баев В.Д., Дерябин А.Н., Дёмин И.Н., Трунова Т.И., Лось Д.А., Носов A.M. (2008) Экспрессия гена ацил-липидной десатуразы Synechocystis sp. РСС 6803 повышает устойчивость растений картофеля к холодовому стрессу. Тезисы докладов международной научной конференции "Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений". Екатеринбург. 6-10 Октября. С. 255-256.

12. Юрьева Н.О., Дерябин А Н., Мали Амири Реза, Голденкова-Павлова И.В., Соболько-ва Г.И., Дёмин И.Н. (2008) Холодостойкость трансгенных растений картофеля, экс-прессирующих модифицированный ген DES-A. IX международная конференция "биология клеток in vitro и биотехнология". Звенигород. 8-12 ноября. Сборник тезисов. С. 454-455.

13. Demiti I. N. (2008) The content of dienoic and trienoic conjugates in leaves of potato plants transformed with a gene of Д 12-acil-lipid desaturase under hypothermia. Abst. Int. Sc. Conf. «Actualities in Plant Physiology». Lithuanian Soc.Plant Physiol., Babtai, June 1213. P.53.

14. Шимшилашвили X.P., Демин И.Н. (2008) Создание трансгенных растений картофеля устойчивых к стрессовым факторам. Международная школа-конференция молодых учёных: "Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях". Звенигород. 7-12 декабря. Сборник тезисов. С. 79.

15. Sinkevich M.S., Deryabin A.N., Demin I.N., Trunova T.I. (2009) Dynamics of Superoxide Dismutase and Catalase Activities during Acclimation to Hypothermia of Wild-Type and Transformed Potato Plants. Vagos. V. 83 (36). P. 72-76.

Подписано в печать:

22.03.2010

Заказ № 3429 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Демин, Илья Николаевич

I. Введение 7 Список сокращений

II. Обзор литературы

2.1. Основные понятия и термины, относящиеся к низкотемпературному стрессу

2.2. Повреждения растений при гипотермии

2.3. Свободно-радикальные процессы в растительной

Клетке

2.4. Антиоксидантные системы растений

2.5. Адаптация растений к низкотемпературному стрессу

2.6. Роль мембранных липидов в устойчивости растений к гипотермии

2.7. Роль десатураз в устойчивости растений к низкотемпературному стрессу

2.8. Использование достижений генетической инженерии в исследованиях холодоустойчивости растений

III. Объекты и методы исследования

3.1. Объект исследования

3.2. Культивирование растений

3.3. Доказательства наличия и экспрессии зетерологичного гена десатуразы

3.3.1. Выделение тотальной растительной ДНК

3.3.2. Проведение полимеразной цепной реакции

3.3.3. Электрофорез ДНК в агарозном геле

3.3.4. Выделение тотальной растительной РНК

3.3.5. Проведение полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией

3.4. Определение содержания и состава жирных кислот липидов контрольных и трансгенных растений картофеля

3.5. Электромикроскопическое и морфометрическое исследование ультраструктуры хлоропластов

3.6. Определение интенсивности фотосинтеза и дыхания по скорости С02-газообмена

3.1. Определение скорости генерации активных форм кислорода

3.8. Определение содержания перекиси водорода

3.9. Определение содержания продуктов ПОЛ по реакции с тиобарбитуровой кислотой

3.10. Определение содержания диеновых конъюгатов

3.11. Определение устойчивости по выходу электролитов

3.12. Определение процента выживаемости контрольных и трансформированных растений

3.13. Исследование работы антиоксидантной системы контрольных и трансформированных растений

3.13.1. Определение активности супероксиддисмутазы

3.13.2. Определение активности каталазы

3.13.3. Определение активности гваякол пероксидазы

3.14. Моделирование окислительного стресса растений путем обработки их паракватом

3.15. Статистическая обработка результатов 73 IV. Результаты и обсуждение

4.1. Молекулярно-биологический анализ растений-трансформантов

4.2. Качественный и количественный состав ЖК мембранных липидов контрольных и трансформированных растений картофеля

4.3. Исследование ультраструктурной организации хлоропластов контрольных и трансформированных растений картофеля

4.4. Определение интенсивности фотосинтеза и дыхания по скорости С02-газоо6мена

4.5. Устойчивость трансформированных и нетрансформированных растений к окислительному стрессу, вызванному действием повреждающих низких температур

4.5.1. Скорость генерации активных форм кислорода в клетках контрольных и трансформированных растений картофеля при гипотермии

4.5.2. Содержание перекиси водорода в клетках контрольных и трансформированных растений картофеля при гипотермии

4.5.3. Содержание диеновых конъюгатов жирных кислот в клетках контрольных и трансформированных растений картофеля при гипотермии

4.5.4. Содержание малонового диальдегида в клетках контрольных и трансформированных растений картофеля при гипотермии

4.5.5. Изменение степени проницаемости мембран контрольных и desA-НсВМЗ-растений при гипотермии

4.5.6. Определение процента выживаемости контрольных и desA-НсВМЗ-растений после действия гипотермии

4.6. Активность антиоксидантных ферментов контрольных и трансформированных растений при гипотермии

4.6.1. Анализ изменений активности супероксиддисмутазы в листьях контрольных и desA-НсВМЗ-растений при гипотермии

4.6.2. Анализ изменений активности каталазы в листьях контрольных и desA-НсВМЗ-растений при гипотермии

4.6.3. Анализ изменений активности пероксидазы в листьях контрольных и desA-НсВМЗ-растений при гипотермии

4.7. Роль А12-ацил-липидной десатуразы в предотвращении окислительного стресса, индуцированного паракватом у трансформированных и нетрансформированных растений картофеля

4.7.1. Скорость генерации супероксидного аниона в клетках контрольных и трансформированных растений при действии параквата

4.7.2. Определение диеновой конъюгации жирных кислот в клетках контрольных и трансформированных растений при действии параквата

4.7.3. Определение содержания малонового диальдегида в клетках контрольных и трансформированных растений при действии параквата

4.8. Изучение активности антиоксидантных ферментов в клетках контрольных и трансформированных растений при действии параквата

4.8.1. Изучение активности супероксиддисмутазы в клетках контрольных и трансформированных растений при действии параквата

4.8.2. Изучение активности каталазы в клетках контрольных и трансформированных растений при действии параквата

4.8.3. Изучение активности пероксидазы в клетках контрольных и трансформированных растений при действии параквата

Введение Диссертация по биологии, на тему "Участие ∆12-ацил-липидной десатуразы в формировании устойчивости растений картофеля к гипотермии"

Большая часть растений на Земле в течение года подвергается действию холода, мороза и других неблагоприятных факторов окружающей среды. В субтропиках температура часто опускается ниже 0°С, в умеренных зонах - до минус 20-40°С. В общем, растения, обитающие на 64% территории суши, испытывают повреждающее действие низких температур. Пшеница, кукуруза, рис, картофель и соя - пять самых употребляемых человеком в пищу растений. Все они подвергаются воздействию пониженных температур различной длительности, и только пшеница обладает относительно высокой степенью устойчивости к низким температурам (Levitt, 1980; Сандухадзе и др., 2003, Трунова, 2007). Значимость этой проблемы возрастает также в связи с глобальным изменением климата на планете, которое сопровождается усиливающейся нестабильностью, выражающейся, в частности, в резких перепадах температуры в относительно короткие промежутки времени (Levitt, 1980, Sakai, Larcher, 1987). В силу этих причин внимание ученых все больше концентрируется на изучении механизмов толерантности и адаптации высших растений к гипотермии.

На основании ряда исследований выдвинуто несколько теорий, объясняющих механизм повреждений от мороза, а также устойчивость и адаптацию некоторых видов растений к отрицательным температурам (Lyons, 1973; Туманов, 1979). Во второй половине 20 века особое внимание уделялось изучению механизмов межклеточного льдообразования, позволяющего зимостойким растениям выживать после действия сильных отрицательных температур (Красавцев, 1972, Самыгин, 1974, Kozloff et al., 1991). Однако механизмы устойчивости группы холодостойких растений к низким температурам, не вызывающим внутриклеточную нуклеацию льда, изучены в гораздо меньшей степени (Дроздов и др., 1984). По этой причине исследованиям физиологических и молекулярных основ холодостойкости растений следует уделить значительное внимание.

Среди причин повреждений теплолюбивых и холодостойких растений от действия экстремальных низких температур, наиболее изученным' является повышенное образование активных форм кислорода (АФК) (Мерзляк, 1989, Лукаткин 2002(a), Попов и др., 2006(а,б)), которые в избыточном количестве способны необратимо повреждать структурные компоненты растительных клеток (Alscher et al., 1997, Креславский и др., 2007). В результате проведенных исследований было установлено, что повреждения растений при гипотермии начинаются с нарушений в структуре мембран, являющихся основной мишенью атаки АФК при холодовом стрессе. Такие высокоактивные формы кислорода, как супероксид-анион (02'), перекись водорода (Н2О2), гидроксил-радикал ( ОН) могут вызывать пероксидацию мембранных липидов (Tepperman, Dunsmuir, 1990, Apel, Hirt, 2004, Suzuki, Mittler, 2006). Разумеется, это отражается на свойствах биологических мембран. В первую очередь, в результате перекисного окисления липидов (ПОЛ) снижается количество ненасыщенных жирных кислот (ЖК), что приводит к повышению вязкости мембран, переходу липидов из жидкокристаллической фазы в фазу геля, увеличению протонной проницаемости, снижению электрической проводимости мехмбран и инактивации мембранных ферментов (Лось, 1997, Лось 2005). При продолжительном воздействии стресс-факторов такие изменения становятся необратимыми, что ведет к многочисленным нарушениям работы биологических систем и гибели растений.

Способность клеток растений к низкотемпературной адаптации связана с их генетическими особенностями, дающими возможность изменять текучесть мембран посредством увеличения количества ненасыщенных ЖК в мембранных липидах.

В связи с этим, важное значение приобретают исследования роли десатураз -ферментов, отвечающих за образование двойных (С=С) связей в цепях ЖК и, следовательно, за изменение физических свойств биологических мембран. Десатуразы обладают высокой специфичностью, как по отношению к длине t углеводородной цепи, так и к месту возникновения двойной связи. Первая двойная связь, как правило, формируется после 9-го атома углерода (положение Д9), вторая двойная связь - в положении А12, третья - в положениях А15 и А6. У цианобактерии Synechocystis за это ответственны ацил-липидные десатуразы - А9-десатураза (ген desC), Д12-десатураза (ген desA), Д15-десатураза (ген desB), А6-десатураза (ген desD). У растений существуют еще несколько типов десатураз, формирующих двойные связи в иных позициях цепей ЖК.

Эксперименты по изучению роли отдельных растительных десатураз (обозначаются аббревиатурой fad) в формировании низкотемпературной устойчивости растений показали, что мутанты A. thalicina, дефектные по генам fad5 и fad6 (с нарушенным синтезом хлоропластных дя-2-пальмитолеил-А12- и sn-l-олеоил-Д12-десатуразы, соответственно) характеризуются хлорозом листьев, замедлением роста и изхменением формы хлоропластов при низких температурах. У мутанта по гену fad2 при 16°С снижается скорость удлинения стебля, а при 6°С он погибает (Miquel, Browse, 1992). Экспрессия fad7 десатуразы A. thaliana в Nicotiana tabacum приводит к повышению устойчивости семян табака к низким температурам (Murakami et al., 2000).

Однако выяснено, что не все типы десатураз вносят одинаковый вклад в формирование низкотемпературной устойчивости. Например, мутанты цианобактерий, дефектные по десатуразам ЖК, ведут себя по-разному при снижении температуры, в зависимости от характера мутации. Так, нарушение генов А6- и соЗ-десатураз не влияет на устойчивость цианобактерий к низким температурам. В то же время, нарушение в экспрессии гена Д12-десатуразы снижает холодостойкость (Wada et al., 1990, Tasaka et al., 1996). Можно утверждать, что способность клеток выживать при низких температурах в значительной степени определяется наличием именно этого гена и способностью клеток синтезировать диеновые (18:2) ЖК. Это утверждение подкрепляется данными по трансформации Synechococcus sp. РСС 7942 с помощью гена desA. Клетки Synechococcus, получившие возможность синтезировать диеновые ЖК, оказались способными, в отличие от дикого типа, расти при 20 - 22°С (Wada et al., 1990). Таким образом, активность А12-десатуразы а, следовательно, и наличие в мембранных липидах линолевой (С 18:2) кислоты, может служить одним из критериев устойчивости растительного организма к воздействию низкотемпературного стресса.

Успехи современной молекулярной биологии и биотехнологии позволяют создавать генетически модифицированные растения с повышенной устойчивостью к действию неблагоприятных факторов. Применение этих технологий на практике привело к созданию новых линий растений картофеля, трансформированных геном desA Д12-ацил-липидной десатуразы (Маали Амири и др., 2007) с использованием фотосинтезирующих клеткок цианобактерий (Gombos et al., 1994, Kanervo et al., 1997). В последнее время успешно налажена технология получения трансгенных растений, экспрессирующих гены различных десатураз цианобактерий. (Kodama et al., 1994, Kiseleva et al., 2000, Orlova et al., 2003, Голденкова, 2002). Это открывает большие перспективы использования таких растений в качестве моделей исследования эффектов искусственно введенных генов.

В связи с вышеизложенным, была поставлена цель данной работы: определить роль Д12-ацил-липидной десатуразы в формировании устойчивости растений картофеля к окислительному стрессу, вызванному действием гипотермии j на примере картофеля (Solatium tuberosum L., cv Десница) трансформированного геном desA цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803. В соответствии с целью f были поставлены следующие задачи: t

1. Подтвердить наличие и экспрессию гетерологичного гена desA Д12-ацил-липидной десатуразы в тканях растений-трансформантов

3. Установить вызванные трансформацией изменения в ультраструктуре хлоропластов, как основных поставщиков АФК в растительных клетках и в интенсивности ССЬ-тазообмена листьев исследуемых генотипов растений в норме и при пониженных температурах

4. Исследовать изменения интенсивности начальных процессов окислительного стресса и содержания конечных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), а также показатели активности основных ферментов антиоксидантной защиты под влиянием гипотермии у трансформированных и ^трансформированных растений картофеля

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АБК - абсцизовая кислота

АПБ - ацил-переносящий белок

АТФ - аденозинтрифосфат

АФК - активные формы кислорода

ДАО - доиорно-акцепторные отношения

ДК - диеновые конъюгаты (жирных кислот)

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ЖК - жирные кислоты

ИН - индекс ненасыщенности

МДА - малоновый диальдегид

МЭЖК - метиловые эфиры жирных кислот

НАДФ - никотинамидадениндинуклеотид фосфат

ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

СОД - супероксиддисмутаза

ТСХ - тонкослойная хроматография

УФ - ультрафиолет

ФС1, ФСП - фотосистемы I и II, соответственно ЧПФ - чистая продуктивность фотосинтеза ЭПР - эндоплазматический ретикулум ЭТЦ - электрон-транспортная цепь

И. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Демин, Илья Николаевич

V. выводы

1. Подтверждена экспрессия гена desA Д12-ацил-липидной десатуразы цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803. в тканях трансформантов картофеля с помощью методов ПЦР, ОТ-ПЦР и анализа продуктов реакции десатурации

2. Трансформированные растения отличались от контроля повышенным содержанием в листьях полиненасыщенных ЖК, общего количества ЖК, а также индекса их ненасыщенности

6. Трансформированные растения более устойчивы к гипотермии по сравнению с нетрансформированным контролем, что подтверждено рядом косвенных методов, а таюке путём прямого охлаждения растений

7. Эксперименты по обработке растений паракватом, вызывающим окислительный стресс без воздействия низкой температуры, подтвердили протекторную роль Д12-ацил-липидной десатуразы в предотвращении генерации избыточных количеств АФК, что выразилось в гораздо меньшей интенсивности образования супероксидного аниона, а таюке начальных и конечных продуктов ПОЛ у трансформантов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на большое количество работ, посвященных исследованию окислительного стресса, возникающего при охлаждении теплолюбивых растений, особенности этого процесса и механизмы защиты от него у холодостойких растений практически не изучены. При этом данные о роли дееатураз в формировании терморезистентности холодостойких растений, а также механизмы проявления протекторного действия конкретных ферментов, осуществляющих десатурацию жирных кислот биомембран, нуждаются в существенном дополнении. В наибольшей степени, это относится к ацил-липидным десатуразам - ферментам, функциональная активность которых имеет решающее значение в поддержании текучести мембран в период действия низких температур (Lyons, 1976). В связи с этим, использованные в данной работе холодостойкие растения картофеля {Solarium tuberosum L., cv Десница), экспрессирующие ген desA Д12-ацил-липидной десатуразы цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803, явились удачной моделью для изучения роли Л12-ацил-липидной десатуразы в формировании устойчивости холодостойких растений к окислительному стрессу, индуцированному гипотермией.

В ходе исследований показано, что экспрессия в тканях растений картофеля гетерологичного гена Д12-ацил-липидной десатуразы приводила к увеличению доли полиненасыщенных жирных кислот в мембранных липидах, что выражалось в повышенном количестве в тканях грансформантов линолевой (18:2), линоленовой (18:3) и пальмитлиноленовой (16:3) жирных кислот. Таким образом, экспрессия гена Д12-ацил-липидной десатуразы стимулирует биосинтез мембранных липидов и существенно изменяет качественный и количественный состав жирных кислот в липидах трансформированных растений за счёт повышения содержания ПНЖК в условиях оптимальных температур.

Трансформация растений повлияла и на мембранную ультраструктуру хлоропластов - основных поставщиков АФК в клетке. Мембранная система хлоропластов растений-трансформантов оказалась более развитой и упорядоченной по сравнению с нетрансформированным контролем. В хлоропластах трансгенов было обнаружено существенное увеличение количества таких мембранных структур, как гилакоиды и граны, а также повышенное количество пластоглобул, что свидетельствует о более интенсивном липидном обмене трансформированных растений.

Увеличение количества ПНЖК в мембранах клеток трансформированных растений, а также изменения в ультраструктуре хлоропластов, мембраны которых обогащены ненасыщенными жирными кислотами, способствуют поддержанию структуры и функций органелл и клеток в целом, что, в конечном итоге, приводит к повышению устойчивости растений картофеля, экспрессирующих ген цианобактериальной Д12-ацил-липидной десатуразы, к действию неблагоприятных факторов внешней среды и, в том числе, к низкой температуре. Эго выражается в пониженной по сравнению с контрольными растениями интенсивности процессов перекисного окисления липидов в тканях трансформантов, снижении их степени повреждения и большем проценте выживаемости трансформированных растений при гипотермии.

Активность основных ферментов антиоксидантной защиты трансформированных растений при действии низких температур была понижена по сравнению с контрольным вариантом, что также свидетельствует о том, что процессы свободнорадикального окисления в условиях гипотермии в гораздо меньшей степени выражены у трансгенов.

Применение модельной системы (обработка разобщающим агентом -паракватом) для инициации окислительного стресса без участия низкой температуры позволило подтвердить важную роль цианобактериальной Д12-ацил-липидной десатуразы в предотвращении формирования избыточных количеств АФК при стрессе и защите важнейших биологических мембран от деструктивного действия процессов свободнорадикального окисления.

Анализ полученных в ходе экспериментальной работы данных позволяет впервые сформулировать гипотетический механизм действия введённого гена desA Д12-ацил-липидной десатуразы цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803, направленный на повышение устойчивости трансформированных растений картофеля к окислительному стрессу, вызванному действием гипотермии (рис. 30).

Рис 30. Гипотетическая схема влияния экспрессии гена desA Д12-ацил-липидной десатуразы на поддержание структуры и свойств клеточных мембран растений картофеля (Solatium tuberosum L., cv Десница).

II. На рибосомах происходит трансляция белка Д12-ацил-липидной десатуразы, после чего липофильный белок попадает в мембранные структуры ЭПР, где катализирует образование второй двойной связи линолевой (18:2) кислоты. По-видимому, далее происходит образование линоленовой (18:3) кислоты за счёт активности собственных растительных десатураз

III. Образовавшиеся ПНЖК в составе липосом транспортируются в аппарат Гольджи, где происходит их перераспределение

IV.Далее липосомы переносят ПНЖК из аппарата Гольджи в мембранные структуры клеточных органелл (митохондрии, хлоропласты, цитоплазматическая мембрана). По-видимому, таким же образом в составе липисом способен переноситься и белок Д12-ацил-липидной десатуразы.

118 через ядерные поры и попадает на рибосомальный аппарат эндоплазматического ретикулума, где и происходит трансляция белка Д12-ацил-липидной десатуразы. Следует отметить, что по структуре и функциям цианобактериальная Д12-ацил-липидная дссатураза (ген desA) напоминает Д12-ацил-липидную десатуразу растений (ген fad2) (Лось, 1997). По-видимому, после завершения трансляции она, подобно растительному ферменту, попадает с рибосомального аппарата в ЭПР, где и осуществляет образование линолевой (18:2) кислоты из олеата (18:1). В дальнейшем, растительные десатуразы могут образовать из линолевой линоленовую (18:3) кислоту. Затем образовавшиеся ПНЖК в составе всевозможных везикул и липосом транспортируются в аппарат Гольджи, откуда происходит дальнейшее их перемещение с последующим встраиванием в мембранные структуры клетки (плазмалемму, митохондрии, хлоропласты). Таким же образом из ЭПР и аппарата Гольджи во внешние мембранные структуры может переноситься и сама десатураза.

Таким образом, показано, что постоянное поддержание текучести мембран посредством активной работы Д12-ацил-липидной десатуразы имеет большое значение в формировании устойчивости растений картофеля к окислительному стрессу, развивающемуся в ходе охлаждения. Это происходит благодаря увеличению жидкостных свойств мембран за счёт повышенной активности А12-ацил-липидной десатуразы, что, во-первых, способствует снижению интенсивности образования активных форм кислорода при низкотемпературном стрессе, а во-вторых, обеспечивает текучесть мембран при охлаждении, тем самым, сохраняя клеточный гомеостаз и поддерживая функциональную активность мембран-связанных белков в условиях гипотермии. Всё это в конечном итоге приводит к повышению устойчивости к действию низких температур картофеля, как типичного представителя группы холодостойких растений.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Демин, Илья Николаевич, Москва

1. Аверьянов А.А., Николаев О.Н., Лапикова В.П. (2000) Антиокислительная защита возбудителя пирикуляриоза необходима ему для преодоления окислительной обороны растений риса. Журнал Русского общества фитопатологов. Т.1. №1. С. 45-50.

2. Алехина Н.Д. (1983) Усвоение азота злаками в зависимости от температуры среды. Вестник Московского ун-та, сер. Биология. № 4. С. 43-49.

3. Алехина Н.Д., Клюйкова А.И. (1986) Усвоение азота растениями при пониженной температуре. Физиология растений. Т.ЗЗ. Вып. 2. С.372-387.

4. Астахова Н.В., Климов С.В., Райхман Л.А., Трунова Т.И. (1991) Влияние холодового закаливания на ультраструктуру клеток озимой пшеницы. Докл. АН. Т.320. С. 252-255.

5. Белоус A.M., Бондаренко В.А. (1982) Структурные изменения биологических мембран при охлаждении. Киев: Наук, думка. 255 с.

6. Бутенко Р.Г. (1999) Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. Уч. пособие, Москва, «РБК-пресс» (МГУ). 159 с.

7. Верещагин А.Г., Лебедева П.И., Жуков А.В. (1985) Содержание и состав этерифицированных жирных кислот в митохондриях этиолированных проростков пшеницы. Физиология растений. Т. 32. С. 124-129.

8. Веселовский А.В. (1987) Надежность растительной клетки и стресс. Надежность и гомеостаз биологических систем. Киев: Наукова думка. С. 96100.

9. Владимиров Ю.А. (1989) Роль нарушений свойств липидного слоя мембран в развитии патологических процессов. Патол. физиология и эксперим. терапия. № 4. С. 7-19.

10. Ю.Волкова Л. А., Маевская С. Н., Бургутин А. Б., Носов А. М. (2007) Влияние экзогенных стероидных гликозидов на культивируемые клетки картофеля при окислительном стрессе. Физиология растений. Т. 54. С. 722— 729.

11. П.Гималов Ф.Р., Вахитов В.А., Чемерис А.В. (1991) Индукция белков холодового шока у пшеницы. Генетические механизмы устойчивости растений к неблагоприятным факторам окружающей среды. Новосибирск. С 90-91.

12. Голденкова И.В. (2002) Репортерные системы. Возможности для изучения различных аспектов регуляции экспрессии генов. Успехи соврем, биологии. Т. 122. С. 515-526.

13. Голденкова И.В., Мусийчук К.А., Пирузян Э.С. (2003) Бифункциональные репортерные гены: конструирование и экспрессия в клетках про- и эукариот. Молекулярная биология Т. 37. С. 1-9.

14. Деви С.Р., Прасад М.Н.В. (2005) Антиокислительная активность растений Brassica juncea, подвергнутых действию высоких концентраций меди. Физиология растений. Т.52. №2. С. 233-237.

15. Дёмин И.Н, Дерябин А.Н., Синькевич М.С., Трунова Т.И. (2008) Введение гена desA ацил-липидной десатуразы цианобактерии повышает устойчивость растений картофеля к окислительному стрессу, вызванному гипотермией. Физиология растений. Т. 55 №5. С. 710-720

16. Дроздов С.Н., Курец В.К. (2003) Некоторые аспекты экологической физиологии растений. Петрозаводск: изд-во Карел, науч. центра. 170 с.

17. Дроздов С.Н., Курец В.К., Титов А.Ф. (1984) Терморезистентность активно вегетирующих растений. Л. Наука. 186 с.

18. Зверева С.Д., Романов Г.А. (2000) Репортерные гены для генетической инженерии растений: характеристика и методы исследования. Физиология растений. Т. 47 №3. С. 479-488

19. Ищенко А. А., Васильева Г. Г., Миронова Н. В., Глянько А. К. (2006) Влияние гербицида параквата на рост, содержание пероксида водорода и активность каталазы в корнях проростков гороха при инокуляции клубеньковыми бактериями. Агрохимия. № 8. С. 47 51.

20. Кейтс М. (1975) Техника липидологии. М.: Мир. 324 с.

21. Кения М.В., Лукаш А.И., Гуськов Е.П. (1993) Роль низкомолекулярных антиоксидантов при окислительном стрессе. Успехи современной биологии. Т.113. №4. С. 456-470.

22. Кислюк И.М., Мирославов Е.А., Палеева Т.В. (1995) Стимуляция дыхания листьев пшеницы и пролиферация митохондрий в их клетках под влиянием охлаждения. Физиология растений. Т. 42. С. 603-606.

23. Климов С. В. (1987) Биоэнергетические аспекты адаптации и устойчивости зимующих злаков к морозу. Успехи современной биологии. Т. 104. С. 251267.

24. Климов С.В. (2001) Пути адаптации растений к низким температурам. Успехи современной биологи. Т. 121. С. 3-22.

25. Климов С.В., Астахова Н.В., Трунова Т.И. (1997) Связь холодоустойчивости растений с фотосинтезом и ультраструктурой хлоропластов и клеток. Физиология растений. Т. 44. С. 794-801.

26. Кондратьев М.Н., Васюков Ю.В., Аладина О.Н. (1983) Кинетика поглощения растениями кукурузы ионов аммония и нитрата при перепадах температуры. С.-х. Биология. № 10. С.68-73.

27. Красавцев О.А. (1972) Калориметрия растений. М.: Наука. 116 с.

28. Красавцев О.А. (1988) Свойства плазмалеммы морозостойких растительных клеток. Успехи соврем, биологии. Т. 106. №1(4). С. 143-157.

29. Креславский В. Д., Карпентиер Р., Климов В.В., Мурата Н., Аллахвердиев С.И. (2007) Молекулярные механизмы устойчивости фотосинтетического аппарата к стрессу. Бгюл. мембраны. Т. 24. С. 195-217.

30. Кузнецов Вл.В., Дмитриева Г.А. (2005) Физиология растений. Учебн. для вузов. М.: Высш. гик. 736 с.

31. Кузнецов Вл.В., H.JI. Радюкина, Шевякова Н.И. (2006) Полиамины при стрессе: биологическая роль, метаболизм и регуляция. Физиология растений. Т.53. №5. С. 658-683

32. Кузьменко А.И., Морозова Р.П., Николеико И.А., Корпиец Г.В., Холодова Ю.Д. (1997) Влияние витамина Д3 и экдистерона на свободно-радикальное окисление липидов. Биохимия. Т.62. №6. С. 712-715.

33. Кулииский В.И. (1999) Активные формы кислорода и оксидативная модификация макромолекул: польза, вред, защита. Соросовский образовательный журнал. № 1. С. 2-7.

34. Лось Д.А. (1997.) Десатуразы жирных кислот: адаптивная экспрессия и принципы регуляции. Физиология растений. Т. 44. С. 528-540.

35. Лось Д.А. (2005) Молекулярные механизмы холодоустойчивости растений. Вестн. РАН. Т. 75. С. 338-345.

36. Лось Д. А. (2007) Восприятие стрессовых сигналов биологическими мембранами. Сборн. науч. трудов. «Проблемы регуляции в биологических системах. Биофизические аспекты» под ред. А.Б Рубина. М.: РХД. 480 с.

37. Лукаткин А.С. (2002) Холодовое повреждение теплолюбивых растений и окислительный стресс. Изд-во Мордовского университета, Саранск, 208 с.

38. Лукаткин А.С. (2005) Инициация и развитие холодового повреждения в листьях теплолюбивых растений. Физиология растений. Т.52. №4. С. 608613.

39. Маали Амнри Р., Голденкова-Павлова И.В., Юрьева Н.А., Пчёлкин

40. B.П., Цыдендамбаев В.Д., Верещагин А.Г., Дерябин А.Н., Трунова Т.И., Лось Д.А., Носов A.M. (2007) Жирнокислотный состав липидов растений картофеля, трансформированных геном А12-десатуразы цианобактерии. Физиология растений. Т. 54. С. 678-685.

41. Меныцикова Е.Б., Зенков Н.К. (1993) Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов. Успехи совр.биологии. Т.113. № 4.1. C. 442-455.

42. Меныцикова Е.Б., Зенков Н.К. (1993) Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов. Успехи совр. биологии. Т.113. № 4. С. 442-455.

43. Мерзляк М.Н. (1989) Активированный кислород и окислительные процессы в мехмбранах растительной клетки. Итоги науки и техники. Сер. Физиология растений. Т.6. 167с.

44. Мерзляк М.Н. (1999) Активированный кислород и жизнедеятельность растений. Соросовский образовательный лсурнал. № 9. С. 20-26

45. Мирославов Е.А. (1994) Структурные адаптации растений к холодному климату. Ботан. журн. Т. 9. № 2. С. 20-26.

46. Новицкая Г.В., Трунова Т.Н. (2000) Связь холодостойкости растений с содержанием липидов мембран хлоропластов. Докл. акад. наук. Т. 371. № 2. С. 258-260.

47. Панкратова С.И., Хохлова Л.П. (1977) Особенности фосфолипидного обмена различных по морозостойкости сортов озимой пшеницы в период подготовки к зимним условиям. Сб. работ Ин-та цитологии АН СССР. Вып. 17. 73с.

48. Пирузян Э.С., Голденкова И.В., Мусийчук К.А., Абдеев P.M., Волкова125

49. JI.B., Кобец Н.С. (2000) Новая репортерная система, основанная на высокой термостабильности лихеназы, для изучения регуляции экспрессии генов у растений. Физиология растений. Т.47. С.382-389.

50. Поплавский В.А. (1989) Природный холод. Киев.: Наук, думка,. 171 с.

51. Приходько Н.В. (1977) Изменение проницаемости клеточных мембран как общее звено механизмов неспецифической реакции растений на внешние воздействия. Физиол. и биохгш. культ, раст. Т.9. С. 301-309.

52. Пчелкин В.П., Кузнецова Э.И., Цыдендамбаев В.Д., Верещагин А.Г.2001) Определение позиционно-видового состава запасных триацилглицеринов растений методом неполного химического деацитилирования. Физиология растений. Т. 48. С. 809-816.

53. Пьянков В. И., Васьковский М. Д. (1994) Температурная! адаптация фотосинтетического аппарата растений арктической тундры о. Врангеля Oxyria digyna и Alopecurus alpinus. Физиология растений. Т. 41. С. 517-525.

54. Радюкина H.JT., Шашукова А.В., Шевякова Н.И., Кузнецов Вл.В. (2008) Участие пролина в системе am иоксидантной защиты у шалфея при действии NaCl и параквата. Физиология растений. Т. 55. С. 721-730.

55. Самыгин Г.А. (1974) Причины вымерзания растений. М.: Наука. 190 с.

56. Сандухадзе Б.И., Рыбакова М.И., Морозова З.А. (2003) Научные основы селекции озимой пшеницы в нечерноземной зоне России. Москва МГИУ. 426 с.

57. Селье Г. (1972) На уровне целого организма. М.: Наука, 122 с.

58. Синькевич М. С., Дерябин А. А., Трунова Т. И. (2009) Особенности окислительного стресса у растений картофеля с измененным углеводным метаболизмом. Физиология растений. Т. 56. С. 186-192.

59. Скулачев В.П. (1996) Кислород в живой клетке: добро и зло. Соросовский Образовательный журнал. № 3. С.4-10.

60. Скулачев В.П. (2001) Явления запрограмированной смерти. Митохондрии, клетки, органы: роль АФК. Соросовский образовательный журнал. Т.7. №6. С. 4-10.

61. Спирин А.С. (1997) Современная биология и биологическая безопасность. Вестник РАН. №7, С.579-588.

62. Третьяков Н.Н., Папичкин Л.А., Кондратьев М.Н. (2003) Сельскохозяйственная биотехнология; под. ред. Третьякова Н.Н. Высшая школа. 472 с'.

63. Трунова Т.И. (1970) Накопление Сахаров в хлороиластах растений озимой пшеницы во время закаливания к морозу. Физиология растений. Т. 17. С. 902-909

64. Трунова Т.И. (2007) Растение и низкотемпературный стресс. 64-е Тимирязевское чтение. М.: Наука, 54 с.

65. Трунова Т.И., Астахова Н.В. (1995) Адаптивные изменения ультраструктуры клеток тома га под действием низкой температуры. Докл. АН. Т.343. №3. С.427-430.

66. Трунова Т.И., Астахова Н.В. (1998) Роль ультраструктуры клеток в формировании морозостойкости озимой пшеницы. Доклады АН. Т.359. С. 120-122.

67. Трунова Т.И., Астахова Н.В., Дерябин А.Н., Сабельникова Е.П. (2003) Ультраструктурная организация хлоропластов листьев растений картофеля, трансформированного геном дрожжевой инвертазы, в норме и при гипотермии. Доклады АН. Т. 389. С. 842-845.

68. Туманов И.И. (1979) Физиология закаливания и морозостойкости растений. М.: Наука. 352 с.

69. Тюрина М.М. (1957) Исследование морозостойкости растений в условиях высокогорий Памира. Наука. Таджикистан. Сталинабад. 124 с.

70. Фердман Д.Л. (1966) Учебник «Биохимия». М.; изд. Наука, 588 с.

71. Хачачка П., Сомеро Дж. (1988) Стратегия биохимической адаптации. М.: Мир. 568 с.

72. Хохлова Л.П., Олиневич О.В., Панкратова О.В. (1997) Изменение водоудерживающей способности тканей озимой пшеницы под влиянием структурных модификаторов цитоскелета. Физиология растений. Т. 44. №3. С. 379-384.

73. Часов А.В., Гордон Л.Х., Колесников О.П., Минибаева Ф.В. (2002) Пероксидаза клеточной поверхности генератор супероксид-аниона в корневых клетках пшеницы при раневом стрессе. Цитология. Т. 44. С. 691696.

74. Чиркова Т.В. (1997) Клеточные мембраны и устойчивость растений к стрессовым воздействиям. Соросовский Образовательный э!сурнал. № 9. С.12-17.

75. Чиркова Т.В. (2002) Физиологические основы устойчивости растений. Учебное пособие, 240 с.

76. Шевякова Н. И., Бакулина Е. А., Кузнецов Вл. В. (2008) Антиоксидантная роль пролина у галофита хрустальной травки при действии засоления и параквата, инициирующих окислительный стресс. Физиология растений. Т. 56. С. 736-742.

77. AIscher R.G., Donahue J.L., Cramer C.L. (1997) Reactive Oxygen Species and Antioxidants: Relationships in Green Cells. Physiol. Plant., V. 100. P. 224-233.

78. Anamnart S., Tomita Т., Fukui F., Fujimori K., Harashima S., Yamada Y., Oshima Y. (1997) The P-OLE1 gene of Pichia angusta encodes a A9-fatty acid desaturase and complements the olel mutation of Saccharomyces cerevisiae. Gene. V. 184. P. 299-306

79. Anderson J.V., Li Q.B., Haskell D.W., Guy C.L. (1993) Spinach BIP and an

80. HSP70 are differentially regulated during cold acclimation. Plant Physiology V.102.P. 149.

81. Apel K., Hirt H. (2004) Reactive Oxygen Species: Metabolism, Oxidative Stress, and Signal Transduction. Annu. Rev. Plant Biol. V. 55. P. 373-399.

82. Aragao F.J.L., Brasiliero A.C.M. (2002) Positive, negative and marker-free strategies for transgenic plant selection. Brazilian journal of plant physiology, V.14(l). P. 1-10

83. Avelange-Macherel M. II., Macherel D., Wada H., Murata N. (1995) Site-directed mutagenesis of histidine residues in the delta 12 acyl-lipid desaturase of Synechocystis. FEBS letters. V.361(l). P. 111-114.

84. BiddIack W.R., Tappel A.I. (1973) Fluorescent Products of Phospholipids Peroxidation. Lipids. V. 8. P. 203-209.

85. Bligh E., Dyier W.I. (1959) Rapid Methods of Total Lipid Extraction and Purification. Can. J. Biochem. Physiol. Y. 37. P. 911-917.

86. Bossie M.A., Martin C.E. (1989) Nutritional regulation of yeast A9 fatty acid129desaturase activity, J. Bacteriol. V.171. P. 6409-6413.

87. Bowler C., Camp W. van, Montague M. van, Inze D. (1994) Superoxide dismutase in plants. Critical Rev. Plant Sci. V.13. P. 199-218.

88. Bowler C., Van Montagu M., Inze D. (1992) Superoxide Dismutase and Stress Tolerance. Annual review of plant physiology and plant molecular biology. V.42. P. 83-116.

89. Broun P., Shanklin J., Whittle E., Somerville C. (1998) Catalytic plasticity of fatty acid modification enzymes underlying chemical diversity of plant lipids. Science. V.282. P. 1315-1317.

90. Browse J., McConn M., James D.J., Miquel M. (1993) Mutants of Arabidopsis deficient in the synthesis of alpha-linolenate. Biochemical and genetic characterization of the endoplasmic reticulum linoleoyl desaturase. J. Biol. Chem. V. 268. P.16345-16351

91. Buchanan B.B., Gruissem W., Jones R.L. (2000) Biochemistry and molecular biology of plants, chap. 22 Responses to abiotic stresses. American society of plant physiologists, Rockville, Mariland. V.35(l). P. 105-106

92. Cahoon E.B., Cough Ian S.J., Shanklin J. (1997) Characterization of a structurally and functionally diverged acyl-acyl carrier protein desaturase from milkweed seed. Plant Mol. Biol. V.33 P. 1106-1110.

93. Cahoon E.B., Lindqvist Y., Schneider G., Shanklin J. (1997) Redesign of soluble fatty acid desaturases from plants for altered substrate specificity and double bond position. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 94. P. 4872-4877

94. Casano L. M., Martin M., Sabater B. (1994) Sensitivity to superoxide dosmutase transcript levels and activities to oxidative stressis lower in mature-senescent than in young barley leaves. Plant Physiol. V. 106. P. 1033-1039.

95. Chen Y., Patterson B.D. (1998) The effect of chilling temperature on the level of superoxide dismutase. catalase and hydrogen in some plant leaves. Acta phytophysiol. V.14. P. 323-328.

96. Choi S.M., Jeong S.W., Jeong W.J., Kwon S.Y., Chow W.S., Park Y.I.2002) Chloroplast Cu/Zn-superoxide dismutase is a highly sensitive site in cucumber leaves chilled in the light. Planta. V.216. № 2. P.315-24.

97. Crotty W. J., Ledbetter M. C. (1973). Membrane Continuities Involving Chloroplasts and Other Organelles in Plant Cells. Science V.182. P. 839-841

98. Csapo В., Kovacs J., Paldi E., Szigeti Z. (1991) Fluorescence induction characteristics of maize inbred lines after long-term chilling treatment during the early phase of development. Pliotosynthetica. V.25. № 1. P. 26-29.

99. Deryabin A.N., Dubinina I.M., Burakhanova E.A., Astakhova N.V., Sabelnikova E.P., Sinkevich M.S., Trunova T.I. (2004) Cold tolerance of potato plants transformed with yeast invertase gene. Acta Agrobotanica, V.57. P. 31-39.

100. Falcone D.L., Gibson S., Lemieux В., Somerville C. (1994) Identification of a gene that complements an Arabidopsis mutant deficient in chloroplast omega 6 desaturase activity. Plant Physiol. V. 106(4). P. 1453-1459.

101. Fenton H.J.H. (1899) Oxidation of certain organic acids in the presence of ferrous salts. Proc. Chem. Soc. V.25. 224 p.

102. Flint H.L., Boyce B.R., Beattie D.J. (1967) Index of Injury a Useful Expression of Freezing Injury to Plant Tissues as Determined by the Electrolytic Method. Can. J. Plant Sci. V. 47. P. 229-230.

103. Fox B.G., Shanklin J., Somerville C., Munk E. (1993) Stearoyl-acylcarrier protein delta-9 desaturase from Ricinus communis is a diiron-oxo protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 90. P. 2486-2490

104. Foyer C. (1993) Ascorbic acid. In: Antioxidants in higher plants. R.G. Alscher, J.L. Hess (edits). CRC Press, Boca Raton, P. 31-58.

105. Foyer C.H., Vanacker H., Gomez L.D., Harbinson J. (2002) Regulation of Photosynthesis and Antioxidant Metabolism in Maize Leaves at Optimal and Chilling Temperatures: Review. Plant Physiol. Biochem. V. 40. P. 659-668.

106. Gesch R.W., Heilman J.L. (1999) Responses of photosynthesis and phosphorylation of the light-harvesting complex of photosystem II to chilling temperature in ecologically divergent cultivars of rice. Environ. Exp. Bot. V.41. №3. P. 257-266.

107. Gibson S, Arondel V, Iba K, Somerville C. (1994) Cloning of a temperature-regulated gene encoding a chloroplast omega-3 desaturase from Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. V.106(4). P. 1615-1621

108. Gombos Z, Wada H, Murata N. (1994) The recovery of photosynthesis from low-temperature photo inhibition is accelerated by the unsaturation of membrane lipids: a mechanism of chilling tolerance. Proc Natl Acad Sci U.S.A. V.91(19) P. 8787-8791.

109. Griffith M., Antikaenen M. (1996) Extracellular ice formation in freezing tolerant plants. Adv. Low-Temp. Biol.V.3. P. 107-139.

110. Guinn G. (1971) Chilling injury in cotton seedlings: Changes in permeability of cotyledons. Crop Sci. V.ll. P.101-102.

111. Gupta A.S., Heinen J.L., Holaday A.S., Burke J.J., Allen R.D. (1993) Increased resistance to oxidative stress in transgenic plants that overexpress chloroplastic Cu/Zn superoxide dismutase. Proc. Natl. Sci. USA. V.90. P. 16921633.

112. Guy C.L. (1990) Cold acclimation and freezing stress tolerance: Role of protein metabolism. Annu Rev Plant Physiol. And Plant Mol. Biol. 1990. V. 41. P. 187-223.

113. Haber F., Weiss J (1934) The catalytic decomposition of hydrogen peroxide by iron salts. Proc Royal Soc. A. V.147. 332 p.

114. Halliwell В., Guttcridgc J.M.C. (1989) Free radicals in biology and medicine. Oxloid. Clarendon press.

115. Hamada Т., Kodama H., Takeshita K., Utsumi H., Iba K. (1998) Characterization of transgenic tobacco with an increased a-linolenic acid level. Plant Physiol. V. 118. P. 591-598.

116. Harker F. R., Maindonald J.H. (1994) Ripening of nectarine fruit. Changes in the cell wall, vacuole, and membranes detected using electrical impedance measurements. Plant Phisiol. V.106. № 1. P. 165-171.

117. Hartmann H.D., Liptau A. (1985) Effects of low temperature on the mineral uptake of tomato seedlings. Gartenbau Wisenschaft. V.50. № 2. P. 60-62.

118. Heath R. J., Rock С. O. (1996) Roles of the FabA and FabZ beta-hydroxyacyl-acyl carrier protein dehydratases in Escherichia coli fatty acid biosynthesis. J. Biol. Chem. V. 271. P. 1833-1836.

119. Heim R., Cubbit А.В. Tsien R.Y. (1995) Improved green fluorescence. Nature. V.373. P. 663-664

120. Hepburn H.A., Nayllor F.L., Strokes D.I. (1986) Electrolyte Leakage from Winter Barley Tissue as Indicator of Winterhardiness. Ann. Appl. Biol. V. 108. P. 164-165.

121. Hodges D. M., Andrews C.J., Johnson D.A., Hamilton R.I. (1997) Antioxidant enzyme and compound to chilling stress and their combining abilities in differentially sensitive. Crop Sci. V.37. № 3. p. 857-863.

122. Hsieh Т., Yang P., Chiu L., Charng Y., Wang Y., Chan M. (2002)133

123. Heterology Expression of the Arabidopsis С-Repeat/ Dehydration Response Element Binding Factor 1 Gene Confers Elevated Tolerance to Chilling and Oxidative Stresses in Transgenic Tomato. Plant Physiol. V.129. P. 1086-1094.

124. Iba K. (2002) Acclimative response to temperature stress in higher plants: approaches of gene engineering for temperature tolerance. Annu. Rev. Plant Biol. V.53 P. 225-245.

125. Inaba M., Suzuki I., Szalontai В., Kanesaki Y., Los D. A., Hayashi H., Murata N. (2003) Gene-engineered rigidification of membrane lipids enhances the cold inducibility of gene expression in Synechocystis. J. Biol. Chem. V.278. P. 12191-12198.

126. Ishizaki-Nishizawa O., Fuji Т., Azuma M., Sekiguchi K., Murata N., Ohtani Т., Toguri T. (1996) Low temperature resistance of higher plants is significantly anhanced by a nonspecific cyanobacterial desatutase. Nature Biotechnol, V.14. P. 1003-1006.

127. Itzhaki II., Pauls K.P., Borochov A. (1991) Effects of cold hardening on microsomal membrane properties and phosphatidylcholine biosynthesis in canola (Brassica napus) leaves. J.Plant Physiol. V.138. № 1. P.75-79.

128. J.R. II azel. (1995) Thermal adaptation in biological membranes: is homeoviscous adaptation the explanation? Annu. Rev. Physiol. V.57. P. 19-42.

129. Janda Т., Szalai G., Kissimon J., Paldi E., Marton C., Szigetti Z. (1994) Role of irradiance in the chilling injury of young maize plants studied by chlorophyll fluorescence induction measurements. Photosynthetica. V.30. № 2. P. 293-299.

130. Jaworski J.G. (1987) The Biochemistry of Plants. Ed. P.K.Stumpf. Orlando: Acad.Press. P. 159-174.

131. Jaworski, J. G., Tai, H., Ohlrogge, J. B, Post-Beittenrailler D. (1994) The initial reactions of fatty acid biosynthesis in plants. Prog Lipid Res. V.33.1. Р.47-54.

132. Jefferson R.A. (1987)Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene fusion system. Plant Mol. Biol Rep. V. 5. P. 387-405

133. Kanervo E; Tasaka Y; Murata N; Aro E M. (1997) Membrane lipid unsaturation modulates processing of the photosystem II reaction-center protein D1 at low temperatures. Plant physiology. V.114(3). P. 841-849.

134. Kim J.C., Lee S.H., Cheong Y.H., Yoo C.M., Chun H.J., Hong J.C., Lee

135. S.Y., Li in C.O., Cho M.J. (2001) A novel cold-inducible zinc-finger protein from soybean, scof-1. enhances cold tolerance in transgenic plants. Plant. J. V. 25. №3.1. P. 247-259

136. Kim Y. C., Ntambi J. M. (1999) Regulating stearoyl-CoA desaturase genes' role in cellular metabolism and preadipocyte differentiation. Biochem. Biophys Res Com V.266. P 1-4.

137. Kiseleva L.L., Serebriiskaya T.S., Horvath I. (2000) Expression of the Gene for the A9 Acyl-Lipid Desaturase in the Thermophilic Cyanobacterium. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. V. 2. P. 331-338.

138. Kodama H., Hamada Т., Horiuchi G. (1994) Genetic Enhancement of Cold Tolerance by Expression of a Gene for Chloroplast co-3 Fatty Acid Desaturase in Transgenic Tobacco. Plant. Physiol. V. 105. P. 601-605.

139. Kotyk A., Janacek K., Koruta J. (1988) Biophysical chemistry of membrane functions. Chichester etc.: J. Wiley and Sons. 377 p.

140. Kozloff L.M., Turner M.A. (1991) Formation of bacterial membraneice-nucleating lipoglicoprotein complexes. J. Bacteriol. V.173. P. 6528-6536.

141. Kumar G.N., Knowles N.R. (1993) Changes in Lipid Peroxidation and Lipolytic and Free-Radical Scavenging Enzyme during Aging and Sprouting of Potato {Solanum tuberosum L.) Seed-Tubers. Plant Physiol. V. 102. P. 115-124.

142. L. Aravind, V. Anantharaman, L.M. Iyer. (2003) Evolutionary connections between bacterial and eukaryotic signaling systems: a genomic perspective. Curr. Opin. Microbiol. V.6. P.490-507.

143. Lenaz G., Castelli G.P. (1985) Structure and pro perties of cell membranes. Boca Ration: CRC Press. 93 p.135

144. Levitt J. (1980) Responses of plants to environmental stresses. V.l. Chilling, Freezing and high temperature stresses. N.Y.: Acad. Press, 426 p.

145. Lindqvist Y., Huang W., Schneider G., Shanklin J. (1996) Crystal structure of delta9 stearoyl-acyl carrier protein desaturase from castor seed and its relationship to other di-iron proteins. EMBO J. V.15. P. 4081-4092.

146. Los D.A., Murata N. (1998) Structure and Expression of FattyAcid Desaturases. Biochim. Biophys. Acta. V. 1394. P. 3-15.

147. Los D.A., Murata N. (1999) Responses to cold shock in cyanobacteria. J

148. Mol MicrobiolBiotechnol. V.2. P. 221-30.

149. Los D.A., Ray M.K., Murata N. (1997) Differences in the control of the temperature-dependent expression of four genes for desaturases in Synechocystis sp. PCC 6803. Mol Microbiol. V. 25(6). P. 1167-1175

150. Lyons J.M. (1973) Chilling injury in plants. Annu. Rev. Plant.Physiol. V.24. P.445-466.

151. Macartney A.I., Maresca В., Cossins A.R. (1994) Acyl-CoA desaturases and the adaptive regulation of membrane lipid composition, in: A.R. Cossins (Ed.). Temperature Adaptation of Biological Membranes. Portland Press, London. P. 129-139.

152. Macartney A.I., Maresca В., Cossins A.R. (1994) Temperature Adaptation of Biological Membranes. Ed. A.RCossins. London: Portland Press. P.129-139.

153. MacDougald O.A., Lane M.D. (1995) Transcriptional regulation of gene expression during adipocyte differentiation. Annu Rev Biochem. V.64. P.345-373.

154. Maruyama S., Yatomi M., Nakamura J. (1990) Response of rise leaves to low temperature. 1. Changes in basic biochemical parameters. Plant Cell Physiol. V.31. №3. P. 303-309.

155. Matsunuira, I., Wallingford, J. В., Surana, N. K., Vize, P. D., Ellington,

156. A. D. (1999). Directed evolution of the surface chemistry of the reporter enzyme beta- glucuronidase. Nature Biotech. V.17(7). P. 696-701.

157. Miquel M, Browse J. (1992) Arabidopsis mutants deficient in polyunsaturated fatty acid synthesis. Biochemical and genetic characterization of a136plant oleoyl-phosphatidylcholine desaturasc. J. Biol. Chem. V. 267. P. 1502-1509.

158. Monroy A.F., Dhindsa R.S. (1995) Low-temperature signal transduction: induction of cold acclimation-specific genes of alfalfa by calcium at 25oC. Plant Cell. V.7.P.321-331.

159. Murakami Y., Tsuyama M., Kobayashi Y., Kodama H., Iba K. (2000) Trienoic fatty acids and plant tolerance of high temperature. Science. V. 287. P. 476-479.

160. Murashige Т., Skoog F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. Y.15. P. 473-497.

161. Murata N., Ishizaki-Nishizawa Q., Higashi S., Hayashi H., Tasaka Y., Nishida I. (1992) Genetically engineered alteration in the chilling sensitivity of plants. Nature. V.356. P. 710-713.

162. Murata N., Wada H. (1995) Acyl-lipid desaturases and their importance in the tolerance and acclimatization to cold of cyanobacteria. Biochem. J. V.308. P.l-8.

163. Neven, LG, Haskell, DW, Guy, CL, Denslow, N, Klein, PA, Green, LG, Silverman, A. (1992) Association of 70-kilodalton heat- shock cognate proteins with acclimation to cold. Plant Physiol. V. 99 P. 1362-1369.

164. Nie G. Y., Robertson E. J., Fryer M. J., Leech R. M., Baker N. R. (1995) Response of the Photosynthetic apparatus in maize leaves grown at low temperature on transfer to normal growth temperature. Plant cell Environm. V.18. №1. P.l-12.

165. Nishiuchi Т., Kodama IE, Yanagisawa S., Iba K. (1999) Wound-induced expression of the FAD7 gene is mediated by different regulatory domains of its promoter in leaves/stems and roots. Plant physiology. V.121(4). P. 1239-46.

166. О'Kane D., Gill V., Boyd P., Burdon R. (1996) Chilling, Oxidative Stress and Antioxidant Responses in Arabidopsis thaliana Callus. Planta. V. 198. P. 371-377.

167. Okane D., Gill V., Boyd P.,Burdon B. (1996) Chilling, oxidative stress and antioxinant responses in Arabidopsis thaliana callus. Planta. V.198. P. 371377.

168. Ortiz-Lopez A., Ying N.G., Ort D.R., Baker N.R. (1990) The involvement of the photoinhibition of photosystem II and impaired membrane anergization in the reduced quantum yield of carbon assimilation in chilled maize. Planta. V.181. № 1 . P.78-84.

169. Panpoom, S., Los, D.A., Murata, N. (1998) Biochemical characterization of a D12 acyl-lipid desaturase after overexpression of the enzyme in Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta. V. 1390. P. 323-332.

170. Pastori G., Foyer C.H., Mullineaux P. (2000) Low-Temperature Induced Changes in the Distribution of H202 and Antioxidants in the Bundle Sheath and Mesophyll Cells of Maize Leaves. J. Exp. Bot. V. 51. P. 107-113.

171. Pauli W. (1925) Uber den Zusammenhang des Abschlusses der Elektronengruppen im Atom mit der Komplexstruktur der Spektren. Z. f. Phys. У.31. P. 765-783.

172. Perera N.H., Hartmann E., Holaday A.S. (1995) Regulation of cotton photosynthesis during moderate chilling. Plant. Sci. V.lll. № 2. P. 133-143.

173. Pray or W.A. (1979) Why Is the Hydroxide Radical the Only Radical That Commonly Adds to DNA. Free Radic. Boil. Med. V. 4. P. 219-223.

174. Qin L., Dutta R., ICurokawa H., Ikura M., Inouye M. (2000) A monomeric histidine kinase derived from EnvZ, an Escherichia coli osmosensor. Mol.Microbiol V.36. P.24-32

175. Raitt D.C., Posas F., Saito H. (2000) Yeast Cdc42 GTPase and Ste20 PAK-like kinase regulate Shol-dependent activation of the Hogl MAP kinase pathway, EMBO J. V.19. P. 4623-4631.

176. Rajashekar С. В., Lafta A. (1996) Cell-Wall Changes and Cell Tension in Response to Cold Acclimation and Exogenous Abscisic Acid in Leaves and Cell. Cultures Plant Physiol. V.lll. P. 605-612.

177. Ristic Z., Salzman R., Ashworth E.N., Bordelon B. (1993) Changes in lipid metabolism in the leaf tissue of Arabidopsis thaliana during rapid cold acclimation. Plant Physiol (Suppl.). V.102. №1. P.92.

178. Rogers S. O., Bendich A. J. (1985) Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues. Plant Molecular Biology. V.5. P. 69-76.

179. Roxas V.P., Smith R.K.Jr., Allen E.R., Allen R.D. (1997) Overexpression of glutathione S-transferasc / glutathione peroxidase enhanced the growth of transgenic tobacco seedlings during stress. Nat. Biotech. V.15. P. 988-991.

180. Sakai A., Larcher W. (1987) Frost survival of plants. Responses and adaptation to freezing stress. Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 321 p.

181. Sakamoto T, Los DA, Higashi S, Wada H, Nishida I, Ohmori M, Murata N. (1994) Cloning of omega 3 desaturase from cyanobacteria and its use in altering the degree of membrane-lipid unsaturation. Plant Mol Biol. V.26(l). P. 249-263.

182. Sangwan V., Orvar B.L., Beyerly J., Hirt H., Dhindsa R.S. (2002) Opposite changes in membrane fluidity mimic cold and heat stress activation of distinct plant MAP kinase pathways. Plant J. V.31 P.629-638.

183. Scandalios J.G. (1990) Response of plant antioxidant defense genes to environmental stress. Adv. Genet. V. 28. P. 1-41.

184. Scandalios J.G. (1993) Oxygen Stress and Superoxide Dismutases/ Plant Physiology. V.101. P. 7-12.

185. Scandalios J.G. (2005) Oxidative stress: molecular perception and transduction of signals triggering antioxidant gene defenses. Braz. J. Med. Biol. Res. V. 38. №7. P. 995-1014.

186. Seki M., Katsumi M. (1993) Effect of brassinolide on cortical microtubule arrangements under chilling stress. 15th Int. Bot. Congr., Yokogama. Aug. 28 Sept. 3. P. 457.

187. Shanklin J., Cahoon E.B. (1998) Desaturation and related modifications of fatty acids. Annu. Rev. Plant. Physiol. Plant. Mol. Biol. V.49. P.611-641.

188. Shanklin J., Guy J.E., Mishra G., and Lindqvist Y. (2009) Desaturases: Emerging models for understanding functional diversification of diiron-containing enzymes. Journal of Biological Chemistry. V.284. P. 18559-18563

189. Sliarom M., Willemot С ., Thompson J. E. (1994) Chilling injuri induces lipid phase changes in membrasnes of tomato fruit. Plant Phisiol. V.105. № 1. P.305-308.

190. Simon E.W. (1974) Phospholipids and plant membrane permeability. New Phytol. V.73. P.377-420.

191. Skriver, K., Mundy J. (1990) Gene expression in response to abscisic acid and osmotic stress. The Plant Cell. Y. 2(6). P. 503-512.

192. Slocombe S.P., Cummins I., Jarvis R.P., Murphy D.J. (1992) Nucleotide sequence and temporal regulation of a seed-specific Brassica napus cDNA encoding a stearoyl-acyl carrier protein (ACP) desaturase. Plant Mol. Biol. V. 20. P. 151-155

193. Slocombe S.P., Piffanelly P., Fairbairn D., Bowra S., Hatzopoulos P., Tsiantis M, Murphy D.J. (1994) Temporal and tissue-specific regulation of a Brassica napus stearoyl-acyl carrier protein desaturase gene. Plant Physiol. V.104.1401. P. 1167-1176

194. Somerville С. (1995) Direct tests of the role of membrane lipid composition in low-temperature-induced photoinhibition and chilling sensitivity in plants and cyanobacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 92. P. 6215-6218.

195. Sonoike K. (1996) Photoinhibition of photosystem I its physiological significance in the chilling sensitivity of plants. Plant Cell Physiol. V. 37. № 3. P.239-247.

196. Sowinski P., Dalbiak A., Ochodzki P., Adamczyk J., Krolikowski

197. Z.(1999) Carbohydrate accumulation in maize leaves at moderate low temperature under controlled conditions and early field characteristics of flint and dent genotypes adapted to polish climate. Plant Breed. Seed.Sci. V.43. № 2. P. 39-48.

198. Stamp P. (1985) Sprossentwicklung und Auspragung photosynthetischer Merkmale junger maispflanzen bei Kuhle. Bayer. Landwirt. Jahrb. Bd. 62. № 1. P. 76-80.

199. Stukey J.E., McDonough V.M., Martin C.E. (1990) The OLE1 gene of Saccharomyccs cerevisiae encodes the delta 9 fatty acid desaturase and can be functionally replaced by the rat stearoyl-CoA desaturase gene. J. Biol. Chem. V.265. P.20144-20149.

200. Stukey J.E., McDonough, V.M., Martin, C.E. (1990) The OLE1 Gene Encodes the Д9 Fatty acid Desaturase and Can be Functionally Replaced by the Rat Stearoyl-CoA Desaturase Gene. J. Biol. Chem. V.265. P. 20144-20149.

201. Stumpf P.K. (1980) Biosynthesis of saturated and unsaturated fatty acids. Biochemistry of plants. V. 4. P. 177-204

202. Suzuki I., Kanesaki Y., Mikami K., Kanehisa M., Murata N.2001)Cold-regulated genes under control of the cold sensor Hik33 in Synechocystis. Mol. Microbiol. V. 40. P.235-244.

203. Suzuki I., Los D.A., Kanesaki Y., Mikami K., Murata N. (2000) The pathway for perception and transduction of low-temperature signals in Synechocystis. EMBO J. V.19. P. 1327-1334.

204. Suzuki I., Los D.A., Murata N. (2000) Perception and transduction of lowtemperature signals to induce desaturation of fatty acids. Biochem. Soc. Trans. V.28. P.628-630.

205. Suzuki N., Mittler R. (2006) Reactive Oxygen Species and Ttemperature Stresses: A Delicate Balance between Signaling and Destruction. Physiol. Plant. V.126. P. 45-51.

206. Taylor B.L., Zhulin I.B. (1999) PAS domains: internal sensors of oxygen, redox potential, and light, Microbiol. Mol. Biol. Rev. V.63. P. 479-506.

207. Tebbey P.W., Van Cleave S., Buttke T.M. (1994) Induction of stearoyl-CoA desaturase 2 gene expression correlates with fatty acid changes in phosphatidylcholine. Biochem Mol Biol Int. V.33. №5. P.991-1000.

208. Tepperinan J.M., Dunsmuir P. (1990) Transformed Plants with Elevated Levels of Chloroplastic SOD Are Not More Resistant to Superoxide Toxicity. Plant Mol. Biol. V. 14. P. 501-511.

209. Thomashow M.F. (1999) Regulation of plant cold acclimation. Plant Response to Environment Stress. Ed. by M. Smallwood et al. BIOS Sci. Publ. P. 75-82.

210. Thompson G.A. (1989) Molecular changes in membrane lipids during cold stress in Environmental stress in plants: biochemical and physiological mechanisms. NATO ASISeries. Ser. G.: Ecological Sci. V. 19. P. 249-257.

211. Thompson GA., Jr (1989) Membrane acclimation by unicellular organisms in response to temperature change. JBioenerg Biomembr. V.21(l) P.43-60.

212. Uemura M., Steponkus P.L. (1997) Effect of cold acclimation on the lipid composition of the inner and outer membran of the chloroplast envelope isolated from rye leaves. Plant Physiol V.114. P. 1493-1499.

213. Uoshida S., Sakai A. (1973) Phospholipid changes associated with the cold hardiness of cortical cells from polar stem. Plant and Cell Physiol. V.14. P. 353.

214. Urao Т., Yakubov В., Satoh R., Yamaguchi-Shinozaki K., Seki M., Hirayama Т., Shinozaki K. (1999) A transmembrane hybrid-type histidine kinase in Arabidopsis functions as an osmosensor. Plant Cell. V.ll. P. 1743-1754.

215. Van Camp W., Capiau K., van Montagu M., Inze D., Slooten L. (1996) Enhancement of oxidative stress tolerance in transgenic tobacco plants overproducing Fe-superoxide dismutase in chloroplasts. Plant Physiol. V.112. P.1703-1714.

216. Vereshchagin A.G., Trunova T.I., Shayakhmetova I.S., Tsydendambaev V.D. (1990) On the role of cell membrane lipids in cold hardening of winter wheat leaves and crowns. Plant Physiol. Biochem. V.25. № 5. P. 623-630.

217. Vranova E., Inze D., Breusegem F.V. (2002) Signal transduction during oxidative stress. Journal of experimental botany. V. 53 (372). P. 1227-1236

218. Wada H., Gombos Z., Murata N. (1990) Enhancement of chilling tolerance of a cyanobacterium by genetic manipulation of fatty acid desaturation. Nature. V. 6289. №347 P.200-203.

219. Wada H., Murata N. Synechocystis (1989) PCC 6803 mutants defective in desaturation of fatty acyds. Plant Cell Physiol. V. 30. P. 971-978

220. Wada H., Schmidt H., Heinz E., Murata N. (1993) In vitro ferredoxin-dependent desaturation of fatty acids in cyanobacterial thylakoid membranes. J. Bacteriol. V.I75. P. 544-547.

221. Walker M.A., McKersie B.D., Pauls K.P. (1991) Effects of chilling on the biochemical and functional properties of thylakoid membrsnes. Plant Physiol. V.97. № 2. P. 663-669.

222. Williams R.J. (1992.) Anomalious behavior of ice in solutions of ice-binding arabinoxylans. Thermochim. acta. V.212. P. 105-113.

223. Williams S.B, Stewart V. (1999) Functional similarities among two-component sensors and methyl-accepting chemotaxis proteins suggest a role for linker region amphipathic helices in transmembrane signal transduction. Mo I. Microbiol. V.33. P.1093-1102.

224. Winzeler M., McCulIough D. E., and Hunt L. A. (1989) Leaf Gas Exchange and Plant Growth of Winter Rye, Triticale, and Wheat under Contrasting Temperature Regimes. Crop Science. V. 29. P. 1256-1260

225. Wright M., Simon E.W. (1973) Chilling injury in cucumber leaves. J. Exp. Bot. V.24. P. 400-411.

226. Xiong L., Schumaker K.S., Zhu J.K. (2002) Cell signaling during cold, drought, and salt stress in: Plant Cell, Supplement. P. 165-183.

227. Yan J., Li Q., Hwang J., Patterson C., Zhang H. (2003) AtCHIP, a U-box-containing E3 ubiquitin ligase, plays a critical role in temperature stress tolerance in Arabidopsis. Plant Physiol. V.132. P.861-869.

228. Zhang J.X., Cui S.P., Li J.M., Wei J.K., Kirkham M.B. (1995) Protoplasmic factors, antioxadant responses, and chilling resistance in maize. Plant Physiol. Biochem. V. 33. P. 567-575.

229. Zia M.S., Salim M., Gill M.A., Rahmatullah. (1994) Effect of low temperature of irrigation water on rice growth and nutrient uptake. J. Agr. Crop. Sci. V. 173. № l.P. 22-31.

230. Zsoldos F. (1985) Effects of environmental factors onion uptake by plants. Acta Biol. Szeged. V. 31. № 1-4. P.55-69.1. VII. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

231. Sinkevich M.S., Deryabin A.N., Demin I.N., Trunova T.I. (2009) Dynamics of Superoxide Dismutase and Catalase Activities during Acclimation to Hypothermia of Wild-Type and Transformed Potato Plants. Vagos. V. 83 (36). P. 72-76.

Информация о работе

Демин, Илья Николаевич
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.05

Диссертация

Участие ∆12-ацил-липидной десатуразы в формировании устойчивости растений картофеля к гипотермии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы