Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура и экспрессия ацил-липидной десатуразы из термофильной цианобактерии Synechococcus vulcanus

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Структура и экспрессия ацил-липидной десатуразы из термофильной цианобактерии Synechococcus vulcanus"

На правах рукописи

г г: од

" и ',;пп 2¿СЛ

Киселёва Лариса Леонидовна

СТРУКТУРА И ЭКСПРЕССИЯ АЦИЛ-ЛИТТИДНОЙ 3,Е САТУР АЗЫ ИЗ ТЕРМОФИЛЬНОЙ ЦИАНОБАКТЕРИИ БШЕСНОСОССиБ ПЛСАМШ

Специальность 03.00.12. - физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2000

Работа выполнена в Отделе внутриклеточной регуляции и биотехнологш фотоавтотрофных биосинтезов Института физиологии растений им. К. А Тимирязева Российской Академии Наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук Д. А. Лось

Официальные оппоненты :

доктор биологических наук

В. В. Кузнецов

доктор биологических наук

И. В. Еланская

Ведущее учреждение: Институт общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН

Защита состоится " 6 " июня 2000 г. в 11 час. на заседании Диссертационного совета К 002.45.01 в Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН (127276, Москва, Ботаническая ул., 35)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН

Автореферат разослан " 4 " мая 2000 г.

Ученый секретарь диссертационног кандидат биологических наук

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В настоящее время ведутся интенсивные !сследования в области адаптации растительных организмов к различным эакторам окружающей среды, среди которых большой интерес вызывает пособность адаптации к понижению температур. Низкие температуры 1ызывают значительную перестройку всего клеточного метаболизма. Изменения включают десатурацию жирных кислот, накопление полиолов, минокислот, глицин-бетаина, сахарозы, специфических белков. Считается, 1то ключевую роль в адаптации организмов к понижению температуры 1грает десатурация жирных кислот мембранных липидов (Лось 1997; Мига1а, .об 1997). Выполнение мембранами многообразных функций во многом шределяется особенностями их физико-химической организации. Согласно |бщепринятой жидкостно-мозаичной модели, мембраны представляют собой инамическую систему, основными компонентами которой являются ипидный бислой и различные белки с широким спектром функциональной ктивности. При понижении температуры окружающей среды мембраны из сидкокристаллической фазы переходят в фазу геля, при этом их текучесть меньшается примерно на два порядка. Гелеобразное состояние бислоя елает невозможным нормальное функционирование мембран. Для того, тобы при снижении температуры мембраны не "затвердевали", они должны одержать достаточное количество ненасыщенных липидов: увеличение исла двойных связей приводит к понижению температуры фазового ерехода. Такой способ сохранения текучего состояния мембраны был бнаружен у бактерий, растений и животных. В связи с этим, огромное начение имеет получение знаний о структуре, свойствах и регуляции есатураз жирных кислот - ферментов, отвечающих за образование двойных вязей, и, следовательно, за изменение физических свойств биологических ембран.

Цель и задачи работы. Целью работы являлось клонирование ген; десатурзы из термофильной цианобактерии БупесЬососсиз \ulcanus, изучение его экспрессии в условиях снижения температуры окружающей среды Исходя из цели работы были поставлены следующие задачи:

1. Клонировать ген ацил-липидной десатуразы из БутесЬососсш \>и1сапиз.

2. Выявить особенности аминокислотной последовательности десатуразы и: термофильной цианобактерии 8упес1юсосси$ уикапш.

3. Исследовать температурозависимую экспрессию гена десатуразы нг уровне транскрипции, трансляции и на уровне продуктов функционально? активности десатураз - ненасыщенных жирных кислот мембранных липидов.

Научная новизна. Впервые был клонирован ген, кодирующий Д9-десатуразу термофильного организма и изучены особенности его экспрессии Показаны различия в структуре и экспрессии десатураз термофильных \ мезофильных цианобактерий.

Научно-практическое значение. Сравнительный анализ ферментов и: термофилов и их аналогов из обычных организмов позволит выяснить причины, обуславливающие повышенную стабильность ферментов, а также решить ряд вопросов, связанных с их использованием: 1) получать ферменты, обладающие повышенной стабильностью к высокой температуре: 2) основываясь на структуре генов стабильных ферментов термофильны> организмов, целенаправленными точечными мутациями конструировать еще более стабильные ферменты; 3) создавать принципиально новые биотехнологии с учётом высокой устойчивости ферментоЕ супертермофильных организмов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены : на Международной конференции «Молекулярная генетика и биотехнология», Минск, 1998; Международном конгрессе по фотосинтезу, Будапешт, 1998; Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы адаптации к стрессам», Москва, 1998; 4-м Съезде Российского общества физиологов

растений, Москва, 1999; симпозиуме по биохимии и молекулярной биологии жирных кислот и глицеролипидов растений, Калифорния, 1999.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ в отечественных и зарубежных изданиях.

Структура диссертации. Диссертация состоит из разделов: Введение, Обзор литературы, Объект и методы исследований, Результаты и обсуждение, Заключение, Выводы, Литература. Работа изложена на /35-страницах машинописного текста, включает /5"рисунков, таблиц, список литературы включает203 наименований.

Объект и методы исследований

Штамм цианобактерии. Штамм Synechococcus vulcanus был получен от Др. Хитоси Накамото (Hitoshi Nakamoto, Saitama University, Japan). Культуру выращивали фотоавтотрофно в среде BG-11 при 55°С, непрерывном освещении (100 мкМ м ~2 с "') и подаче газовоздушной смеси, содержащей 2% С02 (Los и др., 1993). Все работы с чистой культурой цианобактерий проводили с соблюдением условий стерильности, общепринятых в микробиологической практике (Владимирова, Семененко, 1962).

Конструирование геномной библиотеки. Геномную ДНК из клеток 5. vulcanus выделяли методом Вильямса (Williams, 1988). Конструирование геномной библиотеки осуществили используя вектор XDASH-II и следуя инструкции изготовителя (Stratagene, США).

Клонирование и секвенирование ДНК. Для клонирования rfesC-гена из 5. vulcanus была использована геномная библиотека, сконструированная в бактериофаге \ DASH-II. Скрининг фаговых колоний проводили на нейлоновых фильтрах Colony/Plaque Screen (NEN Research Products, США). Пробу для скрининга геномной библиотеки получали путём амплификации

фрагмента геномной ДНК используя следующие праймеры: i CA(TC)GA(TC)(TA)(GC)NAA(TC)AA(AG)GGNTT(TC)GTNTGG - к прямой, и 5'- TT(TC)GGNGA(AG)GGNTGGCA(TC)AA(TC)AA(TC)C (TC)CA(TC)GC - как обратный праймеры, которые были сконструированы соответствии с консервативными аминокислотными последовательности?, известных Д9-десатураз цианобактерий: HDSNKGF(W/L)W FGEGWWHNNHHA. Полученный ампликон размером 360 п.н. бь использован для скрининга библиотеки. Исходя из результатов последующ! Саузерн-гибридизации был клонирован Swal-фрагмент геномной ДНК vulcanus размером 6 т.п.н. Нуклеотидная последовательность фрагмента бы. определена с помощью набора Sequenase™ Ver. 2 DNA Sequencing Kit (I Biochemicals, США). Компьютерный анализ нуклеотидной и аминокислотнс последовательностей был осуществлен с помощью программно: обеспечения Lasergene (DNASTAR, США).

Экспрессия гена desC в Е. соН. Для амплификации desC-гена i геномной ДНК S. vulcanus были использованы праймеры: 5' - CATATGA ATCATCCTTAGAATTGC и 5' - TTAGGACAACGCTTTGGGCGGT. Фрагме! ДНК, включающий полноразмерный ген desC, клонировали в pT7Bli (Novagen, США) в двух ориентациях для получения pdesC/F и pdesCfl Путём обработки pdesC/R рестриктазами Muni и Я/лсПП ген desC бь выделен и клонирован по сайтам £coRI и Hindlll в pTrcHisB (Invitroge США). Полученная плазмида, pTrcHis/cfosC, определяла продукцию белк содержащего гистидиновый трек на N-конце укороченной Д9-десатураз] Клетки Е. coli DH5a трансформировали pTrcHis/ifesC и pTrcHisl Трансформированные клетки выращивали при 37°С в среде LB добавлением FeCb в концентрации 10 мкМ и стеарата натрия (С 18:0) концентрации 1 мМ. Экспрессию рекомбинантной десатуразы индуцирова; добавлением IPTG до 0,5 мМ.

Выделение РНК и нозерн-блот-анализ. Выделение тотальной РНК проводили как описано ранее (Kiseleva и др., 2000). Электрофорез и нозерн-блоттинг проводили по стандартным методикам (Sambrook и др., 1989).

Получение антител против Д9-десатуразы и вестерн-блоттинг. Фрагмент плазмиды pdesC/F, полученный в результате рестрикции ферментами ft/I и HindlU, лигировали в соответствующие сайты вектора pTrcHisC (Invitrogen). Кодируемый этим фрагментом ДНК белковый продукт был экспрессирован в клетках Е. coli DH5a и очищен аффинной хроматографией с юмошью набора Xpress™ Purification System (Invitrogen). Очищенный юлипептид использовали для иммунизации пары кроликов. Из антисыворотки зыли аффинно очищены иммуноглобулины с использованием Протеина А и laóopa Immunopure IgG Purification Kit (Pierce, США). Специфичность антител тестировали дот- и вестерн-блоттингом с использованием очищенного антигена. Электрофорез белков мембранных фракций клеток S. vulcanus, полученных как >писано ранее (Mustardy и др., 1996), проводили в 12% ПААГ в денатурирующих словиях (Los и др., 1997) с нагрузкой 50 мкг белка на дорожку при 20 мА в ечение 3 ч. После электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозные (ембраны методом полусухого переноса на аппарате Atto (Япония) при 2 мА см'2 течение 45 мин. Мембраны инкубировали с первичными антителами 1 ч при омнатной температуре и со вторичными антителами, входящими в состав абора Vecstain ABC Rabbit IgG Kit (Vector Laboratories, США). Иммуноблоттинг роводили триады на независимо приготовленных образцах клеточных ембран. Окрашенные нитроцеллюлозные мембраны сканировали на сканере canJet 6200 (Hewlet Packard, США), оптическую плотность (интенсивность «налов) оценивали с использованием программы Discovery Series Quantity One 3io-Rad, США).

Анализ липидов и жирных кислот осуществляли с помощью энскослойной и газо-жидкостной хроматографии, как описано ранее (Sato, [urata 1980, Kiseleva и др., 1999).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Обшая характеристика объекта Ростовые характеристики Я. \ulcanus. На Рис. 1 показаны кривые роста культуры 5. vulcanus при разных температурах, из которых видно, что оптимальная температура роста для изучаемого штамма лежит в районе 55°С. При 45°С скорость роста 5. \ulcanus заметно замедлялась. Температура 35°С вероятно является критической, однако еще не летальной для термофильной цианобактерии. В дальнейших экспериментах по изучению адаптации организма к понижению температуры мы использовали 55°С как оптимальную для роста культуры, а 45°С и 35°С,как стрессовые температуры.

1.0

0.5

I-

о

с

55сС

- р

1 1 1 '350С 1 1 I , 1

0 25 50 75 100

Время инкубации (ч)

о

Рис. 1. Кривые роста 5. \ulcanus пр1 разных температурах. Клети выращивали при постоянно\ освещении (70 мкМ квантов свет; м'2 с'1) на среде ВС-II пр1 постоянном барботировант

культуры газо-воздушной смесью < 1%СО:.

Липидный состав БупесИососсш \4ilcanus. Главным компонентов изучаемых мембран является МГДГ, составляющий 50% от общеп содержания липидов. Кроме того, обнаружены ДГДГ (27%), СХДГ (15%), Ф1 (5%), а также МГлДГ (3%) (Рис. 2). Эти классы липидов входят в соста: мембран всех обычных цианобактерий. Таким образом, в отношени] качественного состава мембранных липидов, термофильная цианобактерия ^ \-uIcams не обнаруживает каких-либо отличий от мезофильных штаммов.

1 2

■4 МГДГ

-4 ФГ

СХДГ м ДГДГ

МГДГ МГлДГ ДГДГ МГДГ МГлДГ ФГ

ФГ СХДГ

1 - липидный состав цианобактсрии S. vulcanus

2 - липидный состав цианобактерии Svnechocvslis sp. РСС 6803.

Рис. 2. Липидный состав 5. vulcanus

- диг&пактозилдиацилглицерин.

- моиоглюкозилдиацилглицерин.

- фосфатидилглнцерин,

- сульфохиновозилдиацилглицерин

- моногалактозилдиацилглицерин.

Жнрнокислотный состав S. vulcanus. В результате исследований жирнокислотного состава липидов мембран S. vulcanus методами газовой хроматографии и масс-спектрометрии установлено, что он представлен семью жирными кислотами (ЖК): миристиновой (С14:0), миристолеиновой (С 14:1), пальмитиновой (С16:0), пальмитолеиновой (С16:1л9), стеариновой (С18:0), олеиновой (С18:1л9) и г/г/с-вакценовой (С18:1лп). Таким образом, по содержанию ЖК S. vulcanus может быть отнесен к цианобактериям группы 1 по классификации Кеньона (1972), штаммы которой содержат только насыщенные и мононенасыщенные жирные кислоты. Н&чичие 18:1Л9 и 16:1Л9 ЖК в мембранных липидах 5. vulcanus позволило заключить, что в этом штамме цианобактерий присутствует только Д9-десатураза.

Мы клонировали ген, кодирующий А9-десатуразу из термофильной цианобактерии 5. \'и1сапи5, используя синтетические вырожденные олигонуклеотиды и полимеразную цепную реакцию. Амплифицированный фрагмент геномной ДНК 5. уи1сапш использовали для скрининга фаговой геномной библиотеки. В итоге, фрагменты ДНК рекомбинантных фагов,

2. Клонирование гена desC нз S. vulcanus

давших позитивный сигнал при скрининге геномной библиотеки 5. гиката были субклонированы в плазмиде рЮ9. В субклонированном фрагмент ДНК была найдена открытая рамка считывания.

г.ти1сализ МТЗВ^ЕЬО-РОТЗКитааГУПХ 22

£.6301 МТ----ЬАХКРИАГШРТАЬ™ 19

£у. 6803 МШР1«1ЕП,УЪБКЬГСЫЗЬ1УГКГО0ЬГЯГГУКГГ1>ГГААЬРКБЗКР1а.ТРА>ГТУ1ГГГ 60

А.^лххаЬЩг МТ----1АТЗТКРС1ОТ»УШ,1.ГТ 19

* . * . * . . * *. **.** **. .****

S. vulcanus GAVHILAAVALF—FFSWSAIAVTIFLHWLFGSIGICLGYHRLLSHRSFQVPQWIXYVIA 80 6301 VAIHIGALZAFLPANITJWPAVffVMVALYYITGCFGITLGWHRLISHRSFEVPKWLEYVZ.V 79

Sy. 6803 TSIHLVALLAFLPQFFSWKAVGMAFLLYVI TGGIGITLGFHRCI SHRSETJVPKWLEYIFV 120

A.variabilis LGLHIGALFAFIPSNFSWAAVGVALLLYWITGGLGITLGFHRLVTHRSFQTPKWLEYFLV 79

S.vul callus WGALAMQGGPIEWAGHRLHHAHTEDEIKDPYSARRGEVWSHMI.WLVYPQSQFFNAEEY 140

S.6301 FCGTLAMQHGPIEHIGLHRHHHLHSDQDV-DHHDSNKGFLWSHTbWMiyEIP---ARTEV 135

Sy. 6803 ICGTLACQGGVFEWVGLHRMHHKFSDTTP-DPHDSNKGFWWSHIGWMMFEIP---AKADI 176

A.variabilis LCGTLACOGGPIEWVGTHRIHHLHSDTDP-DPHDSNKGFWWSHIGWLIYHSP---SHADV 135

S.rulcajius ARFAFDLTRDPFYRWLDRYFLLLQLPIALLLYGLG------GWSWLLWOOMRAVFLKHS 194

S.6301 DKITRDIAGDPVYRFFNKYFFGVQVLIX^bLYAWGEAWVGNGWSFVVWGIFARLVVVYHV 195

Sy. 6803 PRYTKDICDDKFYQFCQNNLILICVALGLILFALG------GHPFVIWGIFVRLVIVFHF 230

A.variabilis PRFTKDIAEDFVYOFLQKYFIFIOIALGLI,U.YLG------GWSFWWGVFFRIVWVYHC 189

S. vulcanus TV^INSATHKWGYRRFETEDNSRNLWWAALLTYGEGWHNNHHAyPHVAKAGWywwEVDPT 254

S. 6301 TWLVNSATHKFGYRSHESGDQSTNCWWVAIJAFGEGWHNNHHAYQYSARHGLQWWEFTiLT 255

Sy. 6603 TWFVNSATHKFGYVSHESNDYSKNCWWVALLTFGEGWHNNHHAYQYSABHGLQWWEVDLT 290

A. vaxiabilis TWLVNS ATHKFGYRTYEAGDRS TNCWHVAVLVFGEGWHNNHHAFQYSARHGLEWWEVDLT 24 9

* * .*** ...... .*.

S. vulcanus WWVIRTLQGLGLAAKVQLPPP-----KALS 27 9

S.6301 TO.IICGLKKVGLARKIKVASP---NN 278

Sy. 6803 WMTIKFLSLLGLAKDIKLPPETAMANKA 318

A.variabilis WMTVQLLQILGLATNVKLA-----DKKQ 272

Рис. 3. Сравнение аминокислотной последовательности Д9-десаг}разы из S. vulcanus известными А9-десатуразами из Synechococcus sp. РСС 6301 (5. 6301), Synechocystis s РСС 6803 (Sy. 6803) и Anabaena variabilis. Звёздочки обозначают идентичнь аминокислоты, точки обозначают гомологичные аминокислотные замены.

Аминокислотная последовательность клонированного гена гомологичр известным Д9-десатуразам цианобакгерий (Рис. 3). Трансляция нуклеотиднс последовательности гена desC, показала, что Д9-десатураза из 5. vulcanus coctoi из 279 аминокислотных остатков. Предполагаемая молекулярная масса бел! 32.8 кДа. Используя номенклатуру, установленную для классификации гене десатураз цианобактерий, клонированный нами ген был определён как desC.

3. Особенности структуры гена desC из S. vulcanus.

Нуклеотидная последовательность гена, кодирующего Д9-десатуразу из 5. vulcanus, отличается высоким содержанием оснований G+C (54%), в то время как аналогичные гены из мезофильных цианобактерий содержат 3540% G+C. Все известные гены S. vulcanus обладают высоким содержанием G+C (54-65%) (Shimizu и др., 1990, 1992а, 1992b), а супертермофильные бактерии, Thermus thermophilus и Т. aquaticus содержат 60-70% G+C (Ichiro и др., 1991; Okamoto и др., 1996).

Таблица 1. Степени идентичности (%) аминокислотных последовательностей Д9-десатураз жирных кислот из разных штаммов цианобактерий.

S. vulcanus 5. 6301* Sy. 6803** A. variabilis

S. vulcanus ***** 41.6 42.1 45.4

S. 6301 51.3 ***** 58.4 63.0

Sy. 6803 54.2 38.6 ***** 63.0

A. variabilis 50.6 35.7 36.0 *****

*Srnechococcus sp. РСС 6301 (S. 6301), **Synechocystis sp. РСС 6803 (Sy. 6803).

А9-десатураза из S. vulcanus обнаруживает 41-46%-ную гомологию с аналогичными белками других цианобактерий, в то время как гомология между "мезофильными" десатуразами Synechocystis sp. РСС 6803, Synechococcus sp. РСС 6301, Anabaena variabilis составляет 63-70% (Табл. 1). Особенности "термофильной" десатуразы следующие. Во-первых, десатураза S. vulcanus содержит один остаток цистеина, в то время как ферменты мезофильных цианобактерий содержат 4-5 таких остатка. Тенденция к сокращению количества цистеина в белках термофилов объясняется тем, что цистеин содержит SH-группу и довольно легко окисляется, что чаще всего приводит к

дестабилизации молекулы фермента. Во-вторых, у S. vulcanus увеличен-соотношение Arg/Lys (15Arg/4Lys). У мезофильных организмов эт-соотношение имеет обратную тенденцию.

4. Экспрессия рекомбинантиой Д9-десатуразы в Е. coli

Для того, чтобы показать специфическую активность Д9-десатуразы, mi экспрессировали desC в клетках Е. coli (Табл. 2). Клетки, трансформирс ванные pTrcHisB и pTrcHis/i/eiC, инкубировали в отсутствие С18:0 в среде, также в присутствии С18:0 с целью обеспечения Д9-десатуразы субстрато; (Табл. 2). Результаты показали, что клетки Е. coli, трансформированны pTrcHisB, содержали характерную для £. coli композицию ЖК: С14:0, С16:( С16:1Л9, С18:1дп и следовые количества С18:0.

Таблица 2. Состав жирных кислот липидов клеток Е. coli, трансформированных рекомбинантным геном des С S. vulcanus.

Жирные кислоты (моль %)

14:0 16:0 16:1Д9 18:0 18: Iй9 18:1дп

pTrxHis 4±1 49±2 2б±1 1 tr 20±3

pTrxHis + IPTG 3±1 50±2 25±1 1 tr 21±2

pTrxHis + 18:0 4±1 24±2 6±1 59±2 1 6±1

pTrxHis + 18:0 + 3±1 22±1 7±X 61±3 1 6±1

IPTG

pTrxHis/ifesC 4+1 44±2 26±1 3±1 1 22±2

pTrxHis/rfcsC + 4±1 44±2 27±1 1 3±1 23+1

IPTG

pTrxHis/ifoC+ 18:0 3±1 22±2 7+1 60±3 1 7±1

pTrxHis/rfesC +18:0 3±1 29±2 9±2 44+1 7+1 8±1

+ IPTG

Результаты двух независимых экспериментов. Тг- следовые количества (меньше 0.6%).

После добавления С 18:0 в среду, в клетках E.coli, трасформированных rcHisIdesC обнаружили уменьшение количества С 18:0 и увеличение 8:1Л9, что является прямым подтверждением функционирования продукта энированного гена, как Д9-десатуразы. Тот факт, что количество 16:0, :1Л9 и 18:1лп в клетках не изменилось, дает основание предполагать, что -десатураза из S. vulcamis специфично использует в качестве субстрата :ариновую кислоту.

5. Температурозависимая экспрессия гена desC в S. vulcamis

Изменение уровня мРНК. При изучении экспрессии desC-reна из S. Icanus на уровне транскрипции использовали метод нозерн-блот-эридизации. Ген desC S. vulcanus образует один транскрипт размером оло 1 т.п.н., что свидетельствует о том, что он транскрибируется как 'ноцистронная единица. Для мезофильной цианобактерии Synechocystis sp. 'С 6803 была показана совместная транскрипция des С и гена, кодирующего етил-КоА-синтетазу, принимающую участие в биосинтезе липидов (Los и ., 1997).

Культуру 5. vulcanus, выращенную при 55°С, переносили на 45°С и °С и следили за изменением количества мРНК desC в течение 24 ч. анскрипция desC возрастала на протяжении первых 4 часов инкубирования и 45°С (Рис. ЗА), а затем постепенно снижалась. Максимальный уровень анскрипта, наблюдаемый через 4 ч после понижения температуры, в 8 раз евышал исходный. Лишь небольшое увеличение (в 2-3 раза) количества 'НК гена desC наблюдали при понижении температуры до 35°С (Рис. ЗБ). ювень транскрипта медленно возрастал на протяжении 8 часов инкубации и 35°С, а затем постепенно снижался.

В ходе этого эксперимента мы так же проследили за изменением анскрипции гена psaA, кодирующего коровый белок фотосистемы I. Как дно из Рис. 3, уровень мРНК psaA не изменялся с понижением

температуры, что говорит о специфичности индукции экспрессии efe.sC-ген низкими температурами в клетках 5. \ulcanus.

(Б) 0 2 4 8 12 24 h desC-* m» цр щр щт

Рис. 3. Нозерн-блот-анализ температурозависимых изменений количестг мРНК <Л?5С-гена. Клетки 5. vulcamis выращивали при 55°С в течение 3-4 дней л плотности 4 х 108 клеток мл'1 при постоянном освещении (70 мкМ квантов м"2с' на среде BG11 при постоянном барботировании культуры газо-воздушнс смесью с 1% С02. Затем культуру переносили на 45°С (А) и 35°С (Б) инкубировали в описанных выше условиях в течение 24 ч. Пробы дj выделения РНК отбирали через 2, 4, 8, 12 и 24 ч после начала инкубации пр низких температурах. Нозерн-блот-гибридизацию проводили по стандартнс схеме. После гибридизации с c/esC-пробой мембраны отмывали и повторь гибридизовали с пробой psaA и затем с рРНК. На каждую дорожку наносили г 5 мкг тотальной РНК.

Результаты этого эксперимента показывают зависимое: транскрипции гена desC S. vulcanus от температуры окружающей сред! Напротив, в мезофильной цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 ген des экспрессируется конститутивно (Los и др., 1997). Такое различие можн вероятно, объяснить тем, что, в отличие от Synechocystis, обладающего 4-n типами десатураз (Д9, Д12, Д6, и соЗ), 5. vulcanus оперирует только одни типом (Д9) десатураз. Таким образом, функция Д9-десатуразы в мезофильнс

цианобактерии заключается не только в изменении физических свойств мембранных липидов путём образования первой двойной связи в жирных кислотах, но и в обеспечении субстратом последующих в цепи реакций десатураз, образующих вторую (Д12), третью (Д6 или юЗ) и четвёртую (соЗ) двойные связи. В термофильной цианобактерии 5. \-и1сапиз единственный путь восстановления необходимого уровня текучести мембраны -десатурация насыщенных жирных кислот мембранных липидов до мононенасыщенных.

Изменение уровня белка. В экспериментах использовали специфические антитела, полученные против Д9-десатуразы 5. \4ilcanus. Иммуноблоттинг мембранных белков показал специфичное связывание антител с одним белком, молекулярная масса которого (32 кДа) совпадала с предполагаемой молекулярной массой Д9-десатуразы из 5. уикапиз. Накопление Д9-десатуразы наблюдали как при снижении температуры до 45°С, так и 35°С. Увеличение количества белка было заметно через два часа после изменения температуры.

А 0 2 4 8 12 24 И

Б

Д9 ►

не. 4. Анатиз экспресаш Д9-десапразы из 5 икатк при снижении температуры методом естерн-блогпшга Клетки выращивали при 5°С и переносили на 24 часа на 45"С (А) или 5°С (Б). Данные представлены в графическом иде (В).

а

3 6 о

г 4

2

и

2 2

э

О

" в

1.1. |.|.т

6 12 18 24

Время инкубации (ч)

8

0

Так, количество белка при 45°С увеличивалось в 8 раз по сравнению t исходным, в то время как в клетках, перенесённых на 35°С, количеств! десатуразы возрастало лишь в три раза (Рис. 4). Надо отметить, что npi понижении температуры до 35°С белок накапливался в течение 12 часов после чего аккумуляция десатуразы прекращалась. В то же время в клетках перенесённых на 45°С, наблюдали непрерывное накопление фермента н протяжении всего времени 24 часовой инкубации. Эти данные хорош* коррелируют с результатами по накоплению транскрипта desC из vulcanu (Рис. 3).

Влияние температуры на состав мембранных липидов S. vulcanus

Клетки S. vulcanus выращивали при 55°С и переносили на 45°С и 35°С. Липид! разделяли на классы с помощью ТСХ и их количество определяли методо; газовой хроматографии. В качестве внутреннего стандарта использовал гептадеценовую кислоту. При изменении температуры были отмечены лиш некоторые колебания в содержании МГДГ, ДГДГ и СХДГ. Но, принимая в внимание аналогичные изменения в количестве вышеперечисленных липидов клетках, не подвергавшихся воздействию низких температур, подобны флуктуации, видимо, можно объяснить старением культуры.

Температурозавнснмые изменения общего содержания жирны кислот мембранных липидов. При инкубации S. vulcanus при низки температурах количество С14:1, С16:0, С16:1А9 и С18:1дп ЖК не изменялоа Понижение температуры окружающей среды коснулось эффективност десатурации стеариновой кислоты. Так, количество олеиновой (С18:1д кислоты увеличилось с 26 до 30% при снижении температуры с 55°С до 45°' и с 26 до 36% при снижении температуры с 55°С до 35°С. Вместе с этик количество стеариновой кислоты уменьшилось в пропорциональны количествах (Табл. 3).

Таблица 3. Температурозависимые изменения состава жирных кислот мембранных липидов S. vulcanus.

Температура Жирные кислоты (моль %)

инкубации 14:1 16:0 1б:1Л9 18:0 18:1й9 18:1а"

55 °С 4 43 8 12 26 7

45 °С 4 42 10 7 30 7

35 °С 4 42 11 5 36 7

Клетки S. vulcanus, культивировавшиеся при 55°С, переносили на 45°С и 35°С и инкубировали в течение 24 часов. Разброс экспериментально определенных значений не превышал ± 1%.

Результаты указывают на то, что у S. vulcanus процесс температурной акклимации на уровне жирных кислот происходит так же, как в мезофильных организмах. Полученные нами данные о преобладании десатурации стеариновой кислоты, нежели пальмитиновой, в условиях пониженных температур вновь подтверждают предположение о специфичности Д9-десатуразы S. vulcanus к С18-жирным кислотам. Необходимо отметить, что Д9-десатураза из мезофильной цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 обладает специфичностью к С16-жирным кислотам (Higashi, Murata, 1993).

Температурозависимые изменения жирнокислотного состава нейтральных липидов S. vulcanus. Анализ ЖК отдельных классов липидов из S. vulcanus показал, что в МГДГ содержится 40% пальмитиновой (С16:0), 10% стеариновой (С18:0), 35% олеиновой (С18:1Д9) и 8% г/ис-вакценовой кислоты (С18:1Д|1). При снижении температуры содержание каждой из ЖК существенно не изменялось (Табл. 4). В состав ДГДГ входило 45% С 16:0, 5% С16:1, 10% С18:0, 30% С18:1Д9 и 12% С18:1д". Как и в МГДГ, понижение температуры не повлияло на содержание ЖК в ДГДГ (представлено в

диссертации). Постепенное уменьшение количества С 18:0 в ДГДГ можн отнести к возрастным изменениям культуры.

В предшественнике МГДГ - МГлДГ - содержание жирных кислс распределилось следующим образом: 40-45% - С 16:0, 5% - С 16:1, 15-25% С 18:0, 20-30% - С18:1д9 и 5% С18:1лп. С изменением температуры количест! С 16:0 и С 16:1 кислот не менялось. При понижении температуры до 45° содержание С18:0 снижалось с 22% до 16%, в то время как содержание С18:1 постепенно возрастало (представлено в диссертации). Эти результаты, однак также можно объяснить старением культуры, т. к. такую же тенденцию изменении содержания С! 8:0 и С18:1 ЖК наблюдали и в клетках, постоянь растущих при 55°С.

Таблица 4. Температурозависимые изменения состава жирных кислс моногалактозилдиацилглицерина S. vulcanus.

Температура Жирные кислоты (моль %)

•« u^/wri/l — инкубации 16:0 16:1й9 18:0 18:1Лу 18:1ЛП

55°С 41 8 10 33 8

45°С, 4 ч 40 9 10 33 8

8 ч 41 9 9 33 8

12 ч 41 9 9 33 8

24 ч 41 10 6 35 8

55°С, 4 ч 40 10 6 36 8

8 ч 40 10 6 36 8

12 ч 40 10 7 35 8

24 ч 41 10 7 34 8

55°С, 24 ч 41 9 8 34 8

55°С, 48 ч 41 9 7 35 8

Клетки & vulcanus, культивировавшиеся при 55°С, переносили на 45°С на 24 часа, а зат обратно на 55°С - вновь на 24 часа. После разделения мембранных липидов методом Т( был определён состав жирных кислот каждого из отдельных классов липидов. Д последние линии таблицы - клетки культивировали постоянно при 55°С в течение 24 и ч. Разброс экспериментально определенных значений не превышал ± 1% (также для табл 5,6).

Температурозавнсимые изменения состава -жирных кислот юлярных липидов S. vulcanus. В фосфолипидах 60% общего содержания КК пришлось на С16:0, 2% С16:1, 13% С 18:0, 22% С18:1А9 и 3% на С18:1лп Табл. 5). Некоторое снижение содержания С16:1 наблюдали при инкубации слеток при 45°С. Более существенные изменения коснулись С18:0 и ,18:1ЖК. Так, количество С 18:0 снижалось с 13% до 7% после 24 часов шкубации культуры при 45°С. Вместе с тем, содержание С 18:1 возрастало с !2% до 29%. При возвращении культуры к оптимальной температуре роста тблюдали медленное увеличение количества С18:0 и уменьшение :оличества С18:1А9 (Табл. 5). Сходную закономерность десатурации :теариновой кислоты наблюдали при понижении температуры до 35°С. Эти >езультаты ясно показывают ускорение десатурации стеариновой кислоты [юсфатидилглицерина S. vulcanus при низких температурах.

Таблица 5. Температурозавнсимые изменения состава жирных кислот фосфоглицерина S. vulcanus.

Температура Жирные кислоты (моль %)

и время

инкубации 16:0 16:1 18:0 18:1Л9 18:1л"

¡5 °С 60 2 13 22 3

15 °С, 4 ч 59 2 11 24 4

8 ч 58 3 10 25 4

12 ч 56 5 9 26 4

24 ч 57 3 7 29 4

¡5 °С, 4 ч 57 4 7 28 4

8 ч 58 4 6 28 4

12 ч 55 3 9 29 4

24 ч 57 3 9 27 4

¡5 °С, 24 ч 57 3 11 25 4

¡5 °С, 48 ч 57 3 10 26 4

В СХДГ S. vulcanus содержалось 54% С 16:0; 4% С 16:1; 30% С 18:0; 9 С18:1 и 3% С18:1 (Табл. 6). Снижение температуры вызывало быстру аккумуляцию олеиновой кислоты и падение уровня стеариновой кислоты. ; 24 часа инкубации клеток при 45°С содержание С18:1Л9 почти утроилос достигнув 25% (Рис. 5А). Одновременно содержание С18:0 снижалось с 30 до 16%. Ещё более драматичные последствия наблюдали при инкубаш клеток при 35°С (Рис. 5Б). После возвращения культуры с 45СС на 55е увеличение количества С18:0 и уменьшение количества С 18:1 наблюда: лишь после 24 часов инкубации при оптимальной температуре. Интересн что при переносе клеток с 35°С на 55°С было замечено более быстр! изменение отношения 18:0/18:1.

Таблица 6. Температурозависимые изменения состава жирных кисл! сульфохиновозилдиаци л глицерина S. vulcanus.

Температура Жирные кислоты (моль %) и время -

инкуоации 16:0 16:1й9 18:0 18:1Л9 18:1Л"

55°С 54 3 31 9 3

45 °С, 4 ч 54 1 28 13 4

8 ч 54 1 27 14 4

12 ч 54 1 25 16 4

24 ч 54 1 16 25 4

55° С, 4 ч 56 1 17 22 4

8 ч 55 1 17 23 4

12 ч 52 1 17 26 4

24 ч 57 1 19 19 4

55 0 С, 24 ч 55 1 29 11 4

55°С, 48 ч 57 1 28 10 4

Таким образом, из всех мембранных липидов 5. vulcanus наибол существенное преобразование в жирнокислотном составе при снижен! температуры претерпевают сульфолипиды. Этот факт указывает на уникальное

ути адаптации к понижению температуры у изучаемой термофильной ианобактерии. В мезофильных цианобактериях, напротив, наблюдаемые зменения в жирнокислотном составе мембранных липидов сводятся к зменению отношения насыщенных и ненасыщенных жирных кислот в ¡ейтральных липидах, а именно в МГДГ (Sato, Murata, 1980; 1988).

1 40

u

2

I 30

¡ 20 и

i 10

J o

Время инкубации (ч)

'не. 5. Температурозависимые изменения количества олеиновой кислоты в >азных классах липидов 5. ги!сатм при переносе клеток с 55НС на 45°С и юратно на 55°С (А), а также с 55°С на 35°С и обратно на 55°С (Б). (Г - □), ЛГДГ; (■ - ■), ДГДГ; (Д - Д), МГлДГ; (▼ - ▼), ФГ; (О -О), СХДГ.

В 5. уи1сапт нейтральные липиды не претерпевали изменений в кирнокислотном составе при переносе клеток на низкие температуры. !аметные изменения происходили в составе жирных кислот заряженных шпидов, а именно в ФГ и СХДГ. Вопрос о физиологической важности 5ыстрой специфической десатурации стеариновой кислоты в сульфолипидах ермофильной цианобактерии 5. \т1сапи$ остаётся открытым.

Все полученные результаты говорят о том, что снижение температуры 1а 10°С ведёт к индукции экспрессии ^С-гена, накоплению активного

фермента, и, следовательно, к десатурации насыщенных жирных кислот мембранных липидов в клетках 5. \ulcanus. При снижении температуры на 20°С затормаживаются процессы транскрипции и трансляции Д9-десатуразы, но, несмотря на это, уровень ненасыщенных жирных кислот мембранных липидов быстро растёт. Эти данные позволяют предположить, что клетки 5. Vикапга имеют, по крайней мере, две стратегии адаптации к снижению температуры. Первая заключается в изменении концентрации активного фермента А9-десатуразы, что ведёт к повышению количества ненасыщенных жирных кислот мембранных липидов. Вторая стратегия, по-видимому, представляет собой модуляцию активности уже существующего пула фермента, что также ведёт к снижению температуры замерзания мембран путём десатурации их липидов.

ВЫВОДЫ

1. Впервые клонирован ген десатуразы жирных кислот из термофильного организма и исследована температурозависимая экспрессия этого гена на уровне мРНК, соответствующего белка и продуктов десатурации. Показано, что с!е$С является единственным геном в геноме 5. \-uIcanus, кодирующим десатуразу жирных кислот.

2. Показано, что снижение температуры окружающей среды может вызывать индукцию экспрессии гена сквС, а также, возможно, увеличение активности предсуществующей Д9-десатуразы.

3. Впервые детально исследованы адаптивные изменения жирнокислотного состава в индивидуальных классах липидов термофильной цианобакгерии.

4. Впервые обнаружено, что, в отличие от мезофильных цианобактерий, в которых при снижении температуры наблюдается десатурация нейтральных липидов мембран, в основном МГДГ, у термофильной цианобакгерии десатурации подвергаются преимущественно заряженные анионные липиды (сульфо- и фосфолипиды).

5. Показано, что ацил-липидная Д9-десатураза 5. \ulcanus, в отличие от известных аналогичных ферментов других цианобактерий, имеет большую специфичность к стеариновой, чем к пальмитиновой кислоте.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы :

. Kiseleva, L.L. and Los, D.A. (1998) Structure and expression of the gene for A9 desaturase in the thermophilic cyanobacterium Synechococcits vulcanus. Proceedings of the International Conference "Molecular genetics and biotechnology". Minsk, Belorus, pp. 197-199.

!. Kiseleva, L.L., Lyukevich, A.A., and Los, D.A. (1998) Expression of fatty acid desaturases in mesophilic and thermophilic cyanobacteria. Abstr. XIth International Congress on Photosynthesis, August 17-28, 1998, Budapest, Hungary, p. 188.

i. Shigapova, N.V., Kiseleva, L.L., and Los, D.A. (1998) The use of the new reporter for studying heat shock gene expression in cyanobacteria. Proceedings of International Symposium "Molecular Mechanisms of Stress Responses in Plants" September 28 - October 1, 1998, Moscow, Russia, p. 146.

L Kiseleva, L.L. and Los, D.A. (1998) Temperature acclimation of the thermophilic cyanobacterium Synechococcits vulcanus. Proceedings of International Symposium "Molecular Mechanisms of Stress Responses in Plants" September 28 - October 1, 1998, Moscow, Russia, p. 121.

5. Kiseleva, L.L. and Los, D.A. (1999) Expression of the Д9 desaturase gene and specific lipid desaturation in the thermophilic cyanobacterium Synechococcus vulcanus. 1999 Biochemistry and Molecular Biology of Plant Fatty Acids and Glycerolipid Symposium. June 9-13 1999, South Lake Tahoe, California, p. 32.

3. Киселёва JI.JI., Серебрийская T.C., Курбесова O.A. и Лось Д.А. (1999) Экспрессия гена ацил-липидной десатуразы в термофильной цианобактерии Synechococcus vulcanus. Тезисы Докл. IV съезда ОФР РАН. Москва, 4-9 октября 1999 г. Т. 1, с. 295.

7. Лось Д.А., Киселёва Л.Л., Люкевич А.А., Малахов М.П., Серебрийска* Т.А. и Клячко-Гурвич Г.Л. (1999) Регуляция экспрессии генов десатура' жирных кислот в цианобактериях и микроводорослях. Тезисы Докл. IV съезда ОФР РАН. Москва, 4-9 октября 1999 г. Т. 1, с. 297.

8. Люкевич А.А., Киселёва Л.Л., Баранова Т.Е., Маслова И.П., Клячко-Гурвич ГЛ. и Лось Д.А. (1999) Клонирование генов десатураз жирны> кислот из необычной цианобактерии Gloeobacter violaceus. Тезисы Докл IV съезда ОФР РАН. Москва, 4-9 октября 1999 г. Т. 1., с. 298.

9. Назаренко Л.В., Киселёва Л.Л. и Лось Д.А. (1999) Воздействш температурного стресса на содержание ионов в термофильно? цианобактерии Synechococcus vulcanus. Тезисы Докл. IV съезда ОФР РАН Москва, 4-9 октября 1999 г. Т. 1, с. 300.

10.Kiseleva, L.L., Horvath, I., Vigh, L., and Los, D.A. (1999) Temperature induced specific lipid desaturation in the thermophilic cyanobacteriun Synechococcus vulcanus. FEMS Microbiol. Lett. 175: 179-183.

11.Kiseleva, L.L., Serebriiskaya, T.S., Horvath, I., Vigh, L., Lyukevich, A.A., an< Los, D.A. (2000) Expression of the gene for the Д9 acyl-lipid desaturase in tb thermophilic cyanobacterium. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2: - в печати.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Киселева, Лариса Леонидовна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Глицеролипиды и жирные кислоты цианобактерий.

1.2. Адаптивные изменения жирнокислотного состава в клетках цианобактерий в зависимости от условий окружающей среды.

1.3. Клонирование генов десатураз цианобактерий.

1.4. Десатуразы жирных кислот цианобактерий: функции, структура, биохимические свойства.

1.5. Температурозависимая экспрессия генов десатураз цианобактерий.

1.6. Физико-химические особенности ферментов термофильных организмов.

Глава II. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Работа со штаммами цианобактерий.

2.2. Конструирование геномной библиотеки.

2.3. Клонирование и секвенирование ДНК.

2.4. Экспрессия desC-гена в клетках Е. coli.

2.5. Выделение РНК и нозерн-блот анализ.

2.6. Получение антител против А9-десатуразы и вестерн-блоттинг.

2.7. Анализ липидов и жирных кислот.

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Общая характеристика объекта.

3.1.1. Ростовые характеристики Synechococcus vulcanus.

3.1.2. Липидный состав Synechococcus vulcanus.

3.1.3. Жирнокислотный состав Synechococcus vulcanus.

3.2. Клонирование гена desC из Synechococcus vulcanus.

3.3. Особенности структуры гена desC из термофильной цианобактерии.

3.4. Экспрессия рекомбинантной А9-десатуразы в Е. coli.

3.5. Температурозависимая экспрессия гена Д9-десатуразы термофильной цианобактерии Synechococcus vulcanus.

3.5.1. Изменение уровня мРНК.

3.5.2. Изменение уровня белка.

3.6. Влияние температуры на состав мембранных липидов Synechococcus vulcanus.

3.7. Температурозависимые изменения общего содержания жирных кислот мембранных липидов.

3.8. Температурозависимые изменения жирнокислотного состава в различных классах липидов.

3.8.1. Температурозависимые изменения жирнокислотного состава нейтральных липидов Synechococcus vulcanus.

3.8.2. Температурозависимые изменения состава жирных кислот полярных липидов Synechococcus vulcanus.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структура и экспрессия ацил-липидной десатуразы из термофильной цианобактерии Synechococcus vulcanus"

Каждому, кто изучает биологию, известно, насколько зависят от температуры распространение вида, скорость физиологических процессов и в конечном счете само выживание организмов. К какому бы уровню биологической организации мы ни обратились, везде можно увидеть, какую важную, а иногда даже главную роль играет температура во взаимоотношении организма с внешней средой. Опасность температуры как фактора окружающей среды заключается, прежде всего, в ее нестабильности. Все живые организмы в большей или меньшей степени подвержены температурным перепадам. Животные могут использовать эффективные поведенческие, анатомические и физиологические пути с целью избегания вредных последствий температурного стресса. Даже эктотермные животные, чья температура тела изменяется в довольно близком соответствии с температурой окружающей среды, тем не менее обладают терморегуляторными поведенческими реакциями, благодаря которым они находят подходящую микросреду чтобы удержать температуру тела в оптимальном диапазоне. Растительные же организмы, лишенные возможности передвигаться, вынуждены использовать адаптивную стратегию иного рода, основанную на компенсаторных изменениях в биохимии клеток. Растения настолько часто бывают подвержены температурным стрессам, что имели бы мало шансов на выживание, если бы не тонкие механизмы молекулярной адаптации, незамедлительно включающиеся при изменении температуры окружающей среды. В последнее время интенсивно изучаются вопросы холодового шока у растений. Нижеизложенную работу также можно отнести к развитию этого направления научных исследований.

Вообще, низкие температуры вызывают значительную перестройку всего клеточного метаболизма (Лось, 1997). Изменения включают десатурацию жирных кислот, накопление голиолов, аминокислот, глицин-бетаина, сахарозы, специфических белков.

Низкие температуры активизируют гены, индуцируемые абсцизовой кислотой, гены дегидринов, белков позднего эмбриогенеза, липидпереносящих белков, некоторых рибосомных и других РНКсвязывающих белков (Лось, 1997). Тем не менее, считается, что ключевую роль в адаптации организмов к снижению температуры играет десатурация жирных кислот мембранных липидов. Приоритет изучению именно этих процессов, присходящих в клетке при снижении температуры, можно легко объяснить, вспомнив об исключительной важности биомембран в жизнедеятельности живых организмов. Ведущая роль мембран в поддержании гомеостаза клеток и одновременном осуществлении тонких изменений своей функциональной активности при действии внешних и внутренних сигналов обусловлена особенностями их физико-химической организации. Согласно общепринятой жидкостно-мозаичной модели

Singer and Nicolson, 1972), мембраны представляют собой динамическую систему, основными компонентами которой являются липидный бислой и белки с очень широким спектром функциональной активности. При снижении температуры окружающей среды из жидкокристаллической фазы мембраны переходят в фазу геля, при этом текучесть уменьшается примерно на два порядка. Структурные и динамические свойства бислоя, находящегося в фазе геля, совершенно не совместимы с организацией и правильным функционированием белковых компонентов в мембране.

Для того, чтобы при снижении температуры мембрана не затвердевала, она должна содержать достаточное количество ненасыщенных липидов: увеличение числа двойных связей приводит к понижению температуры, при которой жидкость превращается в гель. Такой способ сохранения текучего состояния мембраны был обнаружен у бактерий, растений и животных (White and Somero, 1982; Hazel, 1984). Исходя из этого очевидно огромное значение знаний о структуре, свойствах и регуляции десатураз жирных кислот -ферментов, отвечающих за образование двойных связей, и, следовательно, за изменение физических свойств биологических мембран.

Хотя изучение десатурации жирных кислот и структуры ферментов, ее осуществляющих, ведется достаточно давно и интенсивно, исследования проводятся лишь на объектах, живущих в так называемых нормальных условиях. ЗадумыЕ,ая же нижеизложенную работу, нам было интересно узнать, а какие же механизмы лежат в основе адаптации к низкой температуре у термофильных организмов? Насколько сходны механизмы температурной адаптации термофилов и мезофилов? Вторым аспектом, представляющим не только академический, но и практический интерес, явилось приобретение знаний о структуре "термофильных" десатураз. Что лежит в основе термостабильности этих ферментов? Насколько сильны изменения структуры генов, кодирующих десатуразы в термофильных организмах?

Проследить изменения в структуре десатураз от мезофильных к термофильным организмам и предсказать аминокислотные замены, приводящие к термоустойчивости - значит сделать шаг на пути конструирования рекомбинантных белков с заданными физико-химическими свойствами.

Таким образом, наша работа должна была коснуться не только вопросов быстрой адаптации организмов к снижению температуры, но и вопросов эволюционной стратегии в приспособлении к жизни при экстремально высоких температурах.

В качестве объекта исследования мы выбрали цианобактериальный штамм $упескососст уи1сапш. Известно, что некоторые штаммы цианобактерий {БупесНосузйз Бр. РСС 6803,

Бупескососст эр. РСС 7942 и Зупескососст Бр. РСС 7002) обладают способностью включать в свой геном чужеродную ДНК, что делает их важнейшими объектами для изучения принципиальных проблем генетической инженерии, молекулярной и клеточной биологии. Важной для нас особенностью является то, что структура плазматической и тилакоидных мембран цианобактерий по своему липидному составу сходна с таковой мембран хлоропластов высших растений.

Таким образом, цианобактерии очень удобны как модельная система для изучения молекулярных механизмов адаптации к различного рода стрессам, в том числе и к снижению температуры окружающей среды.

Целью нашей работы явилось клонирование генов десатураз из термофильной цианобактерии Зупескососсш мгйсапт, изучение их экспрессии в условиях снижения температуры окружающей среды. Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:

1. Клонировать ген ацил-липидной десатуразы из Бупескососст \и1сапт.

2. Выявить особенности аминокислотной последовательности десатуразы из термофильной цианобактерии Бупескососсш \>и1сапт.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Киселева, Лариса Леонидовна

выводы

1. Впервые клонирован ген десатуразы жирных кислот из термофильного организма и исследована температурозависимая экспрессия этого гена на уровне мРНК, соответствующего белка и продуктов десату рации. Показано, что с/еяС является единственным геном в геноме Бупескососст уикапш, кодирующим десатуразу жирных кислот.

2. Показано, что снижение температуры окружающей среды может вызывать индукцию экспрессии гена ¿/е^С, а также, возможно, увеличение активности предсуществующей А9-десатуразы.

3. Впервые детально исследованы адаптивные изменения жирнокислотного состава в индивидуальных классах липидов термофильной цианобактерии.

4. Впервые обнаружено, что, в отличие от мезофильных цианобактерий, в которых при снижении температуры наблюдается десатурация нейтральных липидов мембран, в основном МГДГ, у термофильной цианобактерии десагурации подвергаются преимущественно заряженные анионные липиды (сульфо- (СХДГ) и фосфо-(ФГ) липиды).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Как известно, состав мембранных липидов клеток растений значительно варьирует взависимости от условий окружающей среды. Это связано с исключительной важностью биомембран в жизнедеятельности живых организмов, в том числе и в их адаптации к разнообразным экологическим ситуациям, в частности к широкому диапазону температур, включая экстремальные.

Свойства липидного бислоя мембран определяются главным образом его гидрофобной частью, состоящей из жирнокислотных цепей ("хвостов") липидов, подвижность которых зависит от степени ненасыщенности. Последняя же определяется функционированием десатураз жирных кислот - добавляющих двойные связи в ацильные цепи. Показано, что при снижении температуры окружающей среды в клетках усиливается экспрессия генов, кодирующих десатуразы жирных кислот. До настоящего времени структура этих генов и их адаптивная экспрессия изучалась лишь на мезофильных организмах. Целью нашей работы было изучение структуры гена ацил-липидной десатуразы и его адаптивной экспрессии из термофильного организма - цианобактерии Бупескососст уи1сапш.

Проведённые нами исследования показали, что снижение температуры окружающей среды приводит к десатурации полярных липидов (СХДГ и ФГ) в Бупескососст угйсапт, в то время как у мезофильных цианобактерий десатурации подвергается в основном нейтральный МГДГ.

Интересны и сами принципы адаптивной регуляции десатурации у термофильной цианобактерии. Снижение температуры на 10°С вызывает индукцию экспрессии гена, кодирующего А9-десатуразу, вследствие чего усиливается синтез фермента, что, в свою очередь, ведёт и к ускорению синтеза мононенасыщенных жирных кислот мембранных липидов. Аналогичные процессы ведут и к восстановлению исходной текучести мембран и в мезофильных цианобактериях.

Понижение температуры на 20°С затармаживает процессы синтеза РНК на ДНК-матрице и, соответственно, синтез белков, в том числе и десатураз, но при этом наблюдаются значительные изменения в жирнокислотном составе мембранных липидов Зупескососст уи1сапт: снижается содержание насыщенных и увеличивается содержание мононенасыщенных жирных кислот. Этот беномен наводит на мысль о возможном увеличении активности фермента при резком снижении температуры. Подобный путь адаптации к снижению температуры на уровне десатурации липидов мембран впервые обнаружен у цианобактерий.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Киселева, Лариса Леонидовна, Москва

1. Владимирова М.Г., Семененко В.Е. (1962) Интенсивная культура одноклеточных водорослей. М. : Изд-во АН СССР. 59 с.

2. Квеситадзе Г. И. (1990) Ферменты микроорганизмов, живущих в экстремальных условиях //42-е Баховское чтение: М.: Наука. 54 С.

3. Клячко-Гурвич, Г.Л. и Семенова, А.Н. (1976) Содержание и жирнокислотный составмоногалактозилтриглицеридов в зависимости от освещенности и фазы роста в накопительной культуре. Физиология растений 23, 726-733.

4. Клячко-Гурвич, Г.Л. и Семенова, А.Н. (1977) Изменение содержания и жирнокислотного состава моногалактозилдиглицеридов (МГДГ) при повышении освещенности клеток хлореллы. Физиология растений 24, 75-82.

5. Клячко-Гурвич, Г.Л., Семенова, А.Н., и Семененко, В.Е. (1980) Липидный обмен хлоропластов при адаптации клеток хлореллы к снижению освещенности. Физиология растений 27, 370-379.

6. Клячко-Гурвич, Г. JI., Цоглин, Л.Н., и Можайцева, Г.И.(1981а) Обмен липидов в ходе онтогенеза хлореллы в связи с активностью фотосинтетического аппарата. Физиология растений 28, 421--429.

7. Клячко-Гурвич, Г.Л., Цоглин, Л.Н., и Семенова, А.Н.(19816) К вопросу об участиимоногалактозилдиглицеринов (МГДГ) с различным составом жирных кислот в организации мембран хлоропласта. Физиология растений 28, 510-518.

8. Лось, Д.А. и Мурата, Н. (1994) Накопление транскрипта desA в Synechocystis РСС68 03 при низких температурах является результатом активации транскрипции и увеличения стабильности РНК. Физиология растений 41, 170-175.

9. Семененко, В.Е. (1985) Саморегулированиефизиологических функций и управление биосинтезом фотосинтезирующих клеток. В кн. Новые направления в физиологии растений. М. Наука. с. 8 4-10 4 .

10. Шульц Г., Ширмер Р. (1982) Принципы структурной организации белков //М.: Мир. С. 354.

11. Юрьева, М.И. (1988) Физиолого-биохимическиеособенности одноклеточной красной водоросли Porphyridium cruentum как продуцентаполиненасыщенных жирных кислот. Дисс. канд. биол. наук. Владивосток, 1988. 165 с.

12. Al-Hasan, R.H., Ali, A.M., and Radwan, S.S. (1989) Effects of light and dark incubation on the lipid and fatty acid composition of marine cyanobacteria. J Gen Microbiol 135, 865-872.

13. Avelange-Macherel, M.H., Macherel, D., Wada, H., and Murata, N. (1995) Site-directed mutagenesis of histidine residues in the delta 12 acyl-lipid desaturase of Synechocystis. FEBS Lett. 361, 111114 .

14. Bendzko P., Hintsche R. (1978) //Proc. XII FEBS Meet. Dresden. P. 3727.

15. Biffen J. H. F., Williams R. A. D. (1976) Enzymes and proteins from thermophilic microorganisms //Ed. H. Zuber. Basel: Brikhauser Verl. P. 187 -197 .

16. Boccu E., Veronese F. M., Fontana A. (1976) Enzymes and proteins from thermophilic microorganisms //Ed. Zuber. Basel H.: Birk.hauser Verl. P. 229 236.

17. Browse, J., McCourt, P.J., and Somerville, C.R. (1986a) Fatty acid composition of leaf lipids determined after combined digestion and fatty acid methyl ester formation from fresh tissue. Anal. Biochem. 152, 141-145.

18. Browse, J., Warwick, N., Somerville, C.R., and Slack, C.R. (1986b) Fluxes through the prokaryotic and eukaryotic pathways of lipid synthesis in the '16:3' plant Arabidopsis thaliana. Biochem. J. 235, 25-31.

19. Bryant D.A. (ed.) (1995) Molecular Biology of Cyanobacteria. Kluwer Acad. Publ. N.Y. 1995, 765 P

20. Charbonnier, F. and Forterre, P. (1994) Comparison of plasmid DNA topology among mesophilic and thermophilic eubacteria and archaebacteria. J. Bacteriol. 1760, 1251-1259.

21. Constantopoulos, G. and Bloch, K. (1967) Effect of light intensity on the lipid composition of Euglena gracilis. J. Biol. Chem. 242, 3538-3542.

22. Cossins, A.R. and Prosser, C.L.(1978) Evolutionary adaptation of membranes to temperature. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 75, 2040-2043.

23. Cossins, A.R. ed. (1994) Temperature adaptation of biological membranes. London, Portland, 227p.

24. Cossins, A.R. (1977) Evolutionary and seasonal adaptation of membranes to temperature. Biochem. Soc. Trans. 5, 106-107.

25. Cossins, A.R.(1983) Adaptive responses of fish membranes to altered environmental temperature. Biochem. Soc. Trans. 11, 332-333.

26. Cossins, A.R. (1991) Physiology. Cold facts and naked truth. Nature 353, 699

27. Cossins, A.R., Behan, M., Jones, G., and Bowler, K.(1987) Lipid-protein interactions in the adaptive regulation of membrane function. Biochem. Soc. Trans. 15, 77-81.

28. Cowan D. A., Daniel R. M. (1982) //Biochem. Et biophys. Acta. V. 705. P. 293 305,

29. Crabb J. W., Murdock A.L., Amelunxen R. E. (1977) //Ibid. V. 16. P. 4840 4847.

30. Distel, R.J., Robinson, G.S., and Spiegelman, B.M. (1992) Fatty acid regulation of gene expression: transcriptional and posttranscriptional mechanisms. J. Biol. Chem. 267, 5937-5941.

31. Douce, R. & Joyard, J. (1990). Biochemistry and function of the plastid envelope. Annu Rev Cell Biol 6, 173-216.

32. Eguchi, H., Wakagi, T., and Oshima, T. (1989) A highly stable NADP-dependent isocitratedehydrogenase from Termus thermophilus HB8: purification and general properties. Biochim. Biophys. Acta. 990, 133-137.

33. Farkas, T. (1984) Adaptation of fatty acid composition to temperature--a study on carp (Cyprinus carpio L.) liver slices. Comp. Biochem. Physiol. B. 79, 531-535.

34. Ferguson, J.H.(1977) Effect of photoperiod and cold acclimation upon plasma free fatty acid levels in the white rat. Comp. Biochem. Physiol. B. 56, 265-266.

35. Fontana J. (1986) Biochemistry, genetics and technology of extremophilis microorganisms //Padua (Itali): Univ. Press. 261 p.

36. Foot, M., Jeffcoat, R., Barratt, M.D., and Russell, N.J. (1983a) The effect of growth temperature on the membrane lipid environment of the psychrophilic bacterium Micrococcuscryophilus. Arch. Biochem. Biophys. 224, 718-727.

37. Foot, M., Jeffcoat, R., and Russell, N.J. (1983b) Some properties, including the substrate in vivo,of the delta 9-desaturase in Micrococcus cryophilus. Biochem. J. 209, 345-353.

38. Fox, B.G., Shanklin, J., Ai, J., Loehr, T.M., and Sanders-Loehr, J. (1994) Resonance Raman evidence for an Fe-O-Fe center in stearoyl-AITB desaturase. Primary sequence identity with other diiron-oxo proteins. Biochemistry 33, 12776-12786.

39. Fox, B.G., Shanklin, J., Somerville, C., and Munck, E.(1993) Stearoyl-acyl carrier protein delta 9 desaturase from Ricinus communis is a diiron-oxo protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 2486-2490.

40. Furuki,M., Tanaka,N., Hiyama,N., and

41. Nakamoto,H.(1996) Cloning, characterization andfunctional analysis of groEL-like gene from thermophilic cyanobacterium Synechococcusvulcanus, which das not form an operon with groES. Biochim. Biophys. Acta.1294, 106-110.

42. Gibson, S., Arondel, V., Iba, K., and Somerville, C.(1994) Cloning of a temperature-regulated gene encoding a chloroplast omega-3 desaturase from Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 106, 16151621.

43. Gombos, Z., Kis, M., Pali, T., and Vigh, L. (1987) Nitrate starvation induces homeoviscous regulation of lipids in the cell envelope of the blue-green alga, Anacystis nidulans. Eur J Biochem 165, 461465 .

44. Gombos, Z., Wada, H., and Murata, N. (1994) The recovery of photosynthesis from low-temperature photoinhibition is accelerated by the unsaturation of membrane lipids: A mechanism of chilling tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 8787-8791.

45. Gombos, Z., Wada, H., Varkonyi, Z., Los, D.A., and Murata, N. (1996) Characterization of the Fadl2mutant of Synechocystis that is defective in delta 12 acyl-lipid desaturase activity. Biochim. Biophys. Acta 1299, 117-123.

46. Gounot, A.M. (1986) . Psychrophilic andpsychrotrophic microorganisms. Experientia 42, 1192-1197.

47. Grau, R. and de Mendoza, D. (1993) Regulation of the synthesis of unsaturated fatty acids by growth temperature in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 8, 535-542.

48. Grau, R., Gardiol, D., Glikin, G.C., and de Mendoza, D.(1994) DNA supercoiling and thermal regulation of unsaturated fatty acid synthesis in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 11, 933-941.

49. Grayburn, W.S., Collins, C.G., and Hildebrand, D.F.(1992) Fatty acid alteration by A9 desaturase in transgenic tobacco tissue. Biotechnology 10, 675-678.

50. Guler, S., Seeliger, A., Hartel, H., Renger, G. & Benning, C. (1996). A null mutant of Synechococcus sp. PCC7942 deficient in the sulfolipidsulfoquinovosyl diacylglycerol. J Biol Chem 271, 7501-7507.

51. Gurr, M.I.(1971) The biosynthesis ofpolyunsaturated fatty acids in plants. Lipids 6, 266-273.

52. Hamada, T., Kodama, H., Nishimura, M., and Iba, K. (1994) Cloning of a cDNA encoding tobacco omega-3 fatty acid desaturase. Gene 147, 293-294.

53. Harris, P. and James, A. T. (1969) The effect of low temperatures on fatty acid biosynthesis in plants. Biochem. J. 112, 325-330.

54. Harwood, J.L. (1988) Fatty acid metabolism. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 39, 101-138.

55. Harwood, J.L. (1980) Plant acyl lipids: structure, distribution, and analysis. In The Biochemistry of Plants. Stumpf, P. K. ed. Vol. 4, 1-55. New York, Academic Press, 693p.

56. Hasegawa A., Amahori K. (1976) //J. Biochem. V. 79, 469 477.

57. Higasi, S. and Murata, N. (1993) An in vivo study on substrate specificities of acyl-lipid desaturases and acyltransferases in lipid synthesis in Synechocystis PCC6803. Plant Physiol., 102, 1275-1278.

58. Hirayama, 0. and Kishida, T.(1991) Temperature-induced changes in the lipid molecular species of a thermophilic cyanobacterium, Mastigocladus laminosus. Agric Biol Chem 55, 781-785.

59. Hitz, W. D., Carlson, T. J., Booth, J. R., Kinney, A. J., Stecca, K. L., and Yadav, N. S.(1994) Cloning of a higher-plant plastid omega-6 fatty acid desaturase cDNA and its expression in a cyanobacterium. Plant Physiol. 105, 635-641.

60. Holloway, P.W. (1983) Fatty acid desaturation. In The Enzymes. Ed. Boyer, P.D., 16, 63-83. New York, Academic Press, 783p.

61. Holmes M. A., Matthews B. W. (1982) //J. Mol. Biol. 160, 623 639.

62. Horvath, I., Torok, Z., Vigh, L., and Kates, M.(1991) Lipid hydrogenation induces elevated 18:l-CoA desaturase activity in Candida lipolytica microsomes. Biochim. Biophys. Acta 1085, 126-130.

63. Jaworski, G.G.(1987) Biosynthesis of monoenic and polyenoic fatty acids. In Stumpf, P.K., ed. The Biochemistry of Plants. Vol.9, 159-174. Orlando, Academic Press, 363p.

64. Jaworski, J.G. and Stumpf, P.K. (1974) Fat metabolism in higher plants. Properties of a soluble stearyl-acyl carrier protein desaturase from maturing Carthamus tinctorius. Arch. Biochem. Biophys. 162, 158-165.

65. Jody W. Deming (1986) //Microbiol. Ecol. V. 12. P. Ill 119.

66. Jones, A.L., Hann, A.C., Harwood, J.L., and Lloyd, D.(1993a) Temperature-induced membrane-lipid adaptation in Acanthamoeba castellanii. Biochem. J. 290, 273-278.

67. Jones, A.L., Lloyd, D., and Harwood, J.L. (1993b) Rapid induction of microsomal delta 12(omega 6)-desaturase activity in chilled Acanthamoeba castellanii. Biochem. J. 296, 183-188.

68. Kasai, R., Kitajima, Y., Martin, C. E., Nozawa, Y., Skriver, L., and Thompson, G.A.(1976) Molecular control of membrane properties during temperature acclimation. Membrane fluidity regulation of fatty acid desaturase action? Biochemistry 15, 5228-5233.

69. Kenyon, C.N. and Stanier, R.Y.(1970) Possible evolutionary significance of polyunsaturated fatty acids in blue-green algae. Nature 227, 1164-1166.

70. Kenyon, C.N. (1972) Fatty acid composition of unicellular strains of blue-green algae. J. Bacterid. 109, 827-834.

71. Kenyon, C.N., Rippka, R., and Stanier, R.Y.(1972) Fatty acid composition and physiological properties of some filamentous blue-green algae. Arch. Microbiol. 83, 216-236.

72. Kiseleva, L.L., Horvath, I., Vigh, L., and Los,D.A.(1999) Temperature-induced specific lipid desaturation in the thermophilic cyanobacterium Synechococcus vulcanus. FEMS Microbiol. Lett. 175, 179-183.

73. Kiseleva, L.L., Serebriiskaya, T.S.,Horvath,I., Vigh, L., and Los, D.A. (2000) Expression of the gene for the A9 acyl-lipid desaturase in the thermophilic cyanobacterium. J.Mol.

74. Microbiol.Biotechnol. 2: in press.

75. Macartney, A., Maresca, B. and Cossins, A.R, (1994) Acyl-CoA desaturases and the adoptive regulation of membrane lipid composition. In Cossins A.R. ed, Temperature Adaptation of Biological Membranes. Portland Press. London, pp.129-139.

76. Maresca, B. and Cossins, A.R. (1993) Cell physiology. Fatty feedback and fluidity. Nature 365, 606-607.

77. Martin, C.E. and Thompson, G.A.(1978) Use of fluorescence polarization to monitor intracellular membrane changes during temperature acclimation. Correlation with lipid compositional and ultrastructural changes. Biochemistry 17, 35813586.

78. McKeon, T.A. and Stumpf, P.K. (1982) Purification and characterization of the stearoyl-acyl carrier protein desaturase and the acyl-acyl carrier protein thioesterase from maturing seeds of safflower. J. Biol. Chem. 257, 12141-12147.

79. Merkler D. J. Farrington C. K., Wedler F. C. (1981) //Intern. J. Peptide and Protein Res. 18, 430 442.

80. Miquel, M. and Browse, J. (1992) Arabidopsis mutants deficient in polyunsaturated fatty acid synthesis. Biochemical and geneticcharacterization of a plant oleoylphosphatidylcholine desaturase. J. Biol. Chem. 267, 1502-1509.

81. Miquel, M., James, D., Dooner, H., and Browse, J. (1993) Arabidopsis requires poliunsaturatedlipids for low-temperature survival. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 6208-6212.

82. Murata N., Wada H. (1995a) Acyl-Lipid Desaturases and Their Importence in the Tolerance and Acclimatization to Colg of Cyanobacteria //Biochem J. 308, 1-8.

83. Murata, N. & Los, D. A. (1997). Membrane fluidity and temperature perception. Plant Physiol 115, 875-879.

84. Murata, N. and Nishida, 1.(1987) Lipids of blue-green alga (cyanobacteria). In Biochemistry of Plants Stumpf, P.K. ed. Vol. 9, 315-347. Orlando, Academic Press, 363p.

85. Murata, N. and Nishida, 1.(1987) Lipids of blue-green alga (cyanobacteria). In Biochemistry of

86. Plants Stumpf, P.K. ed. Vol. 9, 315-347. Orlando, Academic Press, 363p.

87. Murata, N. and Nishida, 1.(1990) Lipids in relation to chilling sensitivity of plants. In Chilling Injury of Crops. Wang, C.Y. ed. pp. 181199, Boca Raton, FL, CRC Press, 313p.

88. Murata, N. and Wada, H. (1995) Acyl-lipid desaturases and their importance in the tolerance and acclimatization to cold of cyanobacteria. Biochem. J. 308, 1-8.

89. Murata, N.(1983) Molecular species composition of phosphatidylglycerols from chilling-sensitive and chilling-resistant plants. Plant Cell Physiol. 24, 81-86.

90. Murata, N.(1989) Low-temperature effects on cyanobacterial membranes. J. Bioenerg. Biomembr. 21, 61-75.

91. Murata, N., Deshnium, P. and Tasaka, Y.(1996) Biosynthesis of gamma-linoleic acid in the cyanobacterium Spirulina platensis. In Gamma-Linolenic Acid: Metabolism and role in Nutritionand Medicine. Champaign, IL. Am. Oil Chem. Soc. pp 22-32.

92. Murata, N., Ishizaki-Nishizawa, O., Higashi, S., Hayashi, H., Tasaka, Y., and Nishida, I. (1992b) Genetically engineered alteration in the chilling sensitivity of plants. Nature 356, 710-713.

93. Murata, N., Wada, H., and Gombos, Z.(1992) Modes of fatty-acid desaturation in cyanobacteria. Plant Cell Physiol. 33, 933-941.

94. Nakamura S., Ohta S., Arai K. (1978) //Europ. J. Biochem. 92, 533 543.

95. Nishida, I. and Murata, N.(1996) Chilling sensitivity in plants and cyanobacteria: the crucial contribution of membrane lipids. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47, 541-568.

96. Nishida, I., Beppu, T., Matsuo, T., and Murata, N.(1992) Nucleotide sequence of a cDNA clone encoding a precursor to stearoyl- (acyl-carrier-protein) desaturase from spinach, Spinacia oleracea. Plant Mol. Biol. 19, 711-713.

97. Nishiuchi, T., Nishimura, M., Arondel, V., and Iba, K.(1994). Genomic nucleotide sequence of a gene encoding a microsomal omega-3 fatty acid desaturase from Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 105, 767-768.

98. Norman, H. A., Smith, L. A., Lynch, D.V., and Thompson, G.A. (1985) Low-temperature-induced changes in intracellular fatty acid fluxes in Dunaliella salina. Arch. Biochem. Biophys. 242, 157-167.

99. Norman, H.A. and Thompson, G.A. (1985) Effects of low-temperature stress on the metabolism of phosphatidylglycerol molecular species in Dunaliella salina. Arch. Biochem. Biophys. 242, 168-175.

100. Norman, H. A. and Thompson, G.A. (1985) Effects of low-temperature stress on the metabolism of phosphatidylglycerol molecular species in Dunaliella salina. Arch. Biochem. Biophys. 242, 168-175.

101. Nussberger, S., Dorr, K., Wang, D. N. & Kuhlbrandt, W. (1993). Lipid-protein interactions in crystals of plant light-harvesting complex. J Mol Biol 234, 347-356.

102. Ogasahara K., Imanishi A., Isemura T. (1970) //J. Biocem. 67, 65 67.

103. Ohki, K., Kasai, R., and Nozawa, Y.(1979) Correlation between fluidity and fatty acid composition of phospholipid species in Tetrahymena pyriformis during temperature acclimation. Biochim. Biophys. Acta 558, 273-281.

104. Omata, T. and Murata, N. (1986) Glycolipid synthesis activities in cytoplasmic and thylakoid membranes from the cyanobacterium Anacystis nidulans. Plant Cell Physiol. 27, 485-490.

105. Orrcut, D.M. and Patterson, G.W.(1974) Effect of light intensity upon lipid composition of Nitschia closterium (Cyclindrotheca fusiformis). Lipids 9, 1000-1003.

106. Oshima T. (1978) Enzymes engineering //Ed. Broun G. B. et al. N. Y.; L.: Plenum press. 4, 41 46.

107. Panpoom, S., Los, D.A., and Murata, N.(1998) Biochemical characterization of a A12 acyl-lipid desaturasw after overexpression of the enzyme in Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta. 1390, 323-332.

108. Paton, J.C., McMurchie, E.J., May, B.K., and Elliott, W.H.(1978) Effect of growth temperature on membrane fatty acid composition and susceptibility to cold shock of Bacillus amyloliquefaciens. J. Bacterid. 135, 754-759.

109. Piorreck, M. and Pohl, P.(1984) Formation of biomass, total protein, chlorophylls, lipids and fatty acids in green and blue-green algae during one growth phase. Phytochemistry 23, 217-223.

110. Polashock, J.J., Chin, C-K., and Martin, C.E. (1992) Expression of the yeast A-9 fatty acid desaturase in Nicotiana tabacum. Plant Physiol. 100, 894-901.

111. Quinn, P.J., Joo, F., and Vigh, L.(1989) The role of unsaturated lipids in membrane structure and stability. Prog.Biophys. Molec. Biol. 53, 71-103.

112. Rainer J. (1981) //Annu. Rev. And Bioeng. 10, 1 -59.

113. Raison, J. K.(1973) The influence of temperature-induced phase changes on kinetics of respiratory and other membrane-associated enzymes. J. Bioenerg. 4, 258-309.

114. Reddy, A.S., Nuccio, M.L., Gross, L.M., and Thomas, T.L.(1993) Isolation of a delta 6-desaturase gene from the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 by gain-of-function expression in Anabaena sp. strain PCC 7120. Plant Mol. Biol. 22, 293-300.

115. Reifarth, F., Christen, G., Seeliger, A. G., Dormann, P., Benning C. & Renger, G. (1997).

116. Modification of the water oxidizing complex in leaves of the dgdl mutant of Arabidopsis thaliana deficient in the galactolipiddigalactosyldiacylglycerol. Biochemistry 36,11769-11776.

117. Ritter, D. and Yopp, J.H. (1993) Plasma membrane lipid composition of the halophilic cyanobacterium Aphanothece halophyca. Arch Microbiol 159, 435439.

118. Roughan, P.G. and Slack, C.R. (1982) Cellular organization of glycerolipid metabolism. Annu. Rev. Plant Physiol. 33, 97-132.

119. Roughan, P.G. (1987) On the control of fatty acid compositions of plant glycerolipids. In Metabolism, Structure, and Function of Plant Lipids. Stumpf, P.K., Mudd, J.B. and Nes, W.D. eds. pp. 247-254. Plenum Press, New York.

120. Sakamoto, T., Los, D.A., Higashi, S., Wada, H., Nishida, I., Ohmori, M., and Murata, N.;i994a) Cloning of omega 3 desaturase from cyanobacteria and its use in altering the degree of membrane-lipid unsaturation. Plant Mol. Biol. 26, 249-263.

121. Sakamoto, T., Wada, H., Nishida, I., Ohmori, M., and Murata, N. (1994c) Identification of conserved domains in the delta 12 desaturases of cyanobacteria. Plant Mol. Biol. 24, 643-650.

122. Sambrook, J., Fritsch, E.T., and Maniatis, T.(1989) Molecular cloning. A Laboratory Manual. 2nd Edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

123. Sato S., Nakazawa K. (1978) //J. Biochem. 83, 1165 1171.

124. Sato, N. and Murata, N. (1980) Temperature shift-induced responses in lipids in the blue-green alga, Anabaena variabilis : the central role of diacylmonogalactosylglycerol in thermo-adaptation. Biochim. Biophys. Acta 619, 353-366.

125. Sato, N. and Murata, N. (1981) Studies en the temperature shift induced desaturation of fatty acids in monogalactosyl diacylglycerol in the blue-green alga (cyanobacterium), Anabaena variabilis. Plant Cell Physiol., 22, 1043-1050.

126. Sato, N. and Murata, N. (1982a) Lipid biosynthesis in the blue-green alga, Anabaena variabilis. I. Lipid classes. Biochim. Biophys. Acta 710, 271278 .

127. Sato, N. and Murata, N. (1982a) Lipid biosynthesis in the blue-green alga, Anabaena variabilis. I. Lipid classes. Biochim. Biophys. Acta 710, 271278 .

128. Sato, N. and Murata, N. (1982b) Lipid biosynthesis in the blue-green alga, Anabaena variabilis. II. Fatty acids and lipid molecular species. Biochim. Biophys. Acta 710, 279-289.

129. Sato, N. (1995) A family of cold-regulated RNA-binding protein genes in the cyanobacterium Anabaena variabilis M3. Nucleic Acids Res. 23, 2161-2167.

130. Sato, N., and Murata, N.(1988) Membrane lipids. Meth. Enzymol. 167, 251-259.

131. Sato, N., Murata, N., Miura, Y., and Ueta, N. (1979) Effect of growth temperature on lipid and fatty acid compositions in the blue-green algae, Anabaena variabilis and Anacystis nidulans. Biochim. Biophys. Acta 572, 19-28.

132. Schneider, G., Lindqvist, Y., Shanklin, J., and Somerville, C.(1992) Preliminary crystallographic data for stearoyl-acyl carrier protein desaturase from castor seed. J. Mol. Biol. 225, 561-564.

133. Selstam, E. & Campbell, D. (1996) . Membrane lipid composition of the unusual cyanobacterium Gloeobacter violaceus sp. PCC 7421, which lacks sulfoquinovosyl diacylglycerol. Arch Microbiol 166, 132-135.

134. Shimizu, T., Hiyama, T., Ikeuchi, and Incue, Y. (1992a) Nucleotide sequences of the psaA and psaB genes encoding the photosystem I core proteins from the thermophilic cyanobacterium Synechococcus vulcanus. Plant Mol. Biol. 18,785-791.

135. Shimizu, T., Hiyama, T., Ikeuchi, and Inoue, Y. (1992b) Nucleotide sequences of a metallothionein gene of the thermophilic cyanobacterium Synechococcus vulcanus. Plant Mol. Biol. 20, 565567 .

136. Shimizu, T., Hiyama, 1., Ikeuchi, M.,Koike, H., and Inoue, Y. (1990) Nucleotide sequence of the psaC gene of the cyanobacterium Synechococcus vulcanus. Nucl. Acids Res. 18, 3644-3646.

137. Singer, S. J., Nicolson, G. L. (1972) The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science, 175, 720-731.

138. Skriver, L. and Thompson, G.A. (1979) Temperature-induced changes in fatty acid unsaturation of

139. Tetrahymena membranes do not require induced fatty acid desaturase synthesis. Biochim. Biophys. Acta 572, 376-381.

140. Somerville, C.R. (1995) Direct tests of the role of membrane lipid composition in low-temperature-induced photoinhibition and chilling sensitivity in plants and cyanobacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92, 6215-6218.

141. Somerville, C.R. and Browse, J. (1991) Plant lipids: metabolism, mutant, and membranes. Science 252, 80-87.

142. Soutschek-Bauer, E., Scholz, W., Grill, E., and Staudenbauer, W.L.(1987) Thermostability and superhelicity of plasmid DNA in Bacillus stearothermophilus. Mol. Gen. Genet. 209, 575-579.

143. Spinedi, A., Rufini, S., and Luly, P. (1987) Lipid composition and temperature adaptation of the nervous system of the leech Hirudo medicinalis L. J. Neurochem. 49, 45-49.

144. Stanier, R.Y., Kunisawa, R., Mandel, M., and Cohen-Bazire, G.(1971) Purification and propertiesof unicellular blue-green algae (order

145. Chroococcales). Bacteriol.Rev. 35, 171-205.

146. Stubbs, C. and Smith, A. D. (1984) The modification of mammalian membrane polyunsaturated fatty acid composition in relation to membrane fluidity and function. Biochim. Biophys. Acta, 779, 89-137.

147. Stumpf, P.K. (1980) Biosynthesis of saturated and unsaturated fatty acids. In Biochemistry of Plants. Stupmf, P.K. ed. Vol. 4, 177-204. New York, Academic Press, 693p.

148. Tanford C. (1980) The Hydrophobic effect: Formation of micelles and biological membranes //N. Y.: Wiley. P. 310.

149. Thomas K. N. J., William R., Kenealy J. (1987) Industrial application of thermostable enzymes //Wilmington (Del). P. 197 213.

150. Thompson, G. A., Jr. (1980) in The Regulation of Membrane Lipid Metabolism (CRC, Boca Raton, FL) , pp. 171-196.

151. Trayhurn, P. (1979) Fatty acid synthesis in vivo in brown adipose tissue, liver and white adipose tissue of the cold-acclimated rat. FEBS Lett. 104, 13-16.

152. Trayhurn, P. (1980a) Fatty acid synthesis in brown adipose tissue in relation to whole body synthesis in the cold-acclimated golden hamster (Mesocricetus auratus). Biochim. Biophys. Acta 620, 10-17.

153. Trayhurn, P. (1980b) Fatty acid synthesis in brown adipose tissue of cold-acclimated mice and golden hamsters (Mesocricetus auratus) . Biochem. Soc. Trans. 8, 375

154. Wada, H. and Murata, N. (1989) Synechocystis PCC6803 mutants defective in desaturation of fatty acids. Plant Cell Physiol. 30, 971-978.

155. Wada, H. and Murata, N.(1990) Temperature-induced changes in the fatty acid composition of the cyanobacterium, Synechocystis PCC6803. Plant Physiol. 92, 1062-1069.

156. Wada, H., Avelange-Macherel, M.-H., and Murata, N.(1993a) The desA gene of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803 is the structuralgene for delta 12 desaturase. J. Bacterid. 175, 6056-6058.

157. Wada, H., Gombos, Z., and Murata, N.(1990) Enhancement of chilling tolerance of a cyanobacterium by genetic manipulation of fatty acid desaturation. Nature 347, 200-203.

158. Wada, H., Gombos, Z., and Murata, N.(1994) Contribution of membrane lipids to the ability of the photosynthetic machinery to tolerate temperature stress. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 4273-4277.

159. Wada, H., Gombos, Z., Sakamoto, T., and Murata, N.(1992a) Genetic manipulation of the extent of desaturation of fatty acids in membrane lipids in the cyanobacterium Synechocystis PCC6803. Plant Cell Physiol. 33, 535-540.

160. Wada, H., Gombos, Z., Sakamoto, T., Higashi, S., Los, D. A., Heinz, E., Schmidt, H., Nishida, I., and Murata, N. (1992b) Fatty acid desaturation in cyanobacteria. In: Biochemistry and Molecular Biology of Membrane and Storage Lipids of Plants.

161. Murata,N. and Somerville,S.R. eds. The American Society of Plant Physiologists, pp. 67-78.

162. Walker J. E., Wonacott A.J., Harris J. (1980) //Europ. J. Biochem.,108, 581 586.

163. Watahiki, M.K. and Yamamoto, K.T.(1994) A new isozyme of plasmid omega-3 fatty acid desaturase in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 105, 14511452 .

164. Wedler F. C., Farrington C. K., Merkler D. J. (1981) //Fed. Proc. 40, 1839.

165. Wedler F. C., Hoffman F. M. (1974) //Biochemistry. 13, 3207 3214.

166. Wedler F. C., Hoffman F. M. (1974) //Biochemistry. 13, 3207 3214.

167. Williams, J.G.K.(1988) Construction of specific mutations in photosystem II photosynthetic reaction center by genetic engineering methods in Synechocystis PCC6803. Meth Enzymol. 167, 766-778.

168. Williams, J.P., Khan, M.U., and Wong, D. (1992a) Low temperature-induced fatty acid desaturation in Brassica . napus: thermal deactivation and reactivation of the process. Biochim. Biophys. Acta 1128, 275-279.

169. Williams, J.P., Williams, K., and Khan, M.U.(1992b) Low temperature-induced fatty acid desaturation in Brassica napus: thermal lability of the process. Biochim. Biophys. Acta 1125, 6267 .

170. Yadav, N.S., Wierzbicki, A., Aegerter, M., Caster, C.S., Perez-Grau, L., Kinney, A.J., Hitz, W.D., Booth, J.R., Schweiger, B., and Stecca, K.L. (1993) Cloning of higher plant omega-3 fatty acid desaturases. Plant Physiol. 103, 467-476.