Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние стресс-зависимых изменений текучести мембран на экспрессию генов у цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Влияние стресс-зависимых изменений текучести мембран на экспрессию генов у цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803"

4853629

МИРОНОВ Кирилл Сергеевич

Влияние стресс-зависимых изменений текучести мембран на экспрессию генов у цианобактерии БупесИосуБйБ ер. РСС 6803

03.01.05 — физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

2 9 СЕН 2011

Москва — 2011

4853629

Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ внутриклеточной регуляции Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, г. Москва.

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор Лось Дмитрий Анатольевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

доцент Голденкова-Павлова Ирина Васильевна

доктор биологических наук,

профессор Балнокин Юрий Владимирович

Ведущая организация: Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, г. Москва

Защита состоится «11» октября 2011 г. в 13 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.210.01 при Учреждении Российской академии наук Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35.

Факс: (495) 977 8018, электронная почта: m-azarkovich@ippras.ru: ifr@ippras.ru

Автореферат размещен на сайте ИФР РАН по адресу www.ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждении Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

Автореферат разослан «7» сентября 2011 г.

Учёный секретарь

совета по защите докторских /

и кандидатских диссертаций, <уу

кандидат биологических наук ^ п М.И. Азаркович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Принято считать, что предшественниками хлоропластов высших растений были цианобактерии, типичным представителем которых является Synechocystis sp. РСС 6803 (далее Synechocystis). Этот одноклеточный организм повсеместно используется в качестве модельного объекта для изучения стрессовых воздействий, поскольку характеризуется высокими скоростями роста в широком спектре условий, а также обладает способностью к генетической трансформации путем двойной гомологичной рекомбинации (Grigorieva & Shestakov, 1982). Кроме того, известна полная нуклеотидная последовательность генома Synechocystis (Kaneko et al., 1996).

К сегодняшнему дню накоплено достаточно много знаний относительно ответа Synechocystis на холодовое воздействие. Клетки Synechocystis испытывают состояние холодового шока, если температура окружающей среды снижается по крайней мере на 6 градусов относительно температуры, к которой были адаптированы клетки. При этом индуцируется экспрессия ряда генов: десатураз жирных кислот (ЖК), РНК-связывающих белков, РНК-хеликаз, рибосомных белков, протеаз и др. — это было продемонстрировано с использованием микрочипов (Los et al., 1993; 2008). Известно, что часть этих генов экспрессируется под контролем гистидин-киназы Hik33, являющейся сенсором низкой температуры у Synechocystis (Suzuki et al., 2000). Другая часть генов регулируется изменением степени сверхспирализации молекул ДНК Synechocystis (Prakash et al., 2009). Упомянутые регуляторные механизмы играют основную роль в формировании ответа на холодовой стресс. Кроме этого, имеется единичная работа (Kis et al., 1998), выполненная на адаптированных к гетеротрофному росту в присутствии глюкозы клетках Synechocystis, в которой описана индукция транскрипции генов десатураз ЖК при освещении. Однако, вопрос регуляции экспрессии данной группы генов светом в условиях фотоавтотрофного роста так и остаётся открытым.

Снижение температуры окружающей среды в первую очередь сказывается на клеточных мембранах, поскольку жидкокристаллическое состояние липидов при этом сменяется кристаллическим (Hazel et al., 1995). В этом случае основной стратегией адаптации к действию пониженных температур представляется повышение степени ненасыщенности остатков ЖК в составе мембран. Известно, что инактивация генов десатураз ЖК desA и desD, отвечающих за синтез полиненасыщенных ЖК в липидах мембран, приводила к снижению текучести мембран у двойного мутанта desA'/desD' (Tasaka et al., 1996). На этом штамме с применением геномных микрочипов было показано влияние изменения текучести мембран на экспрессию генов (Inaba et al., 2003). Следует иметь ввиду, что упомянутый мутант был получен с использованием кассеты устойчивости к антибиотику хлорамфениколу, который является ингибитором фотосинтеза, поскольку опосредует передачу электронов с фотосистемы

I на кислород. Поэтому этот мутант не вполне подходит для изучения физиологических аспектов светозависимой адаптации к условиям стресса.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучить влияние физического состояния клеточных мембран на экспрессию генов в условиях холодового стресса у цианобактерии Synechocystis. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1) сконструировать двойной мутант по генам des А и desD и охарактеризовать его способность регулировать ЖК состав в различных условиях;

2) сравнить ростовые характеристики мутанта desAVdesD' и клеток дикого типа в нормальных условиях и при пониженной температуре;

3) исследовать температуро-зависимое изменение текучести мембран у мутанта desA 7desD~ по сравнению с диким типом;

4) исследовать индукцию экспрессии генов холодового ответа в зависимости от физического состояния (текучести/вязкости) биологических мембран;

5) исследовать влияние света на индукцию экспрессии генов ответа на низкотемпературный стресс.

Научная новизна. Впервые для различных типов клеточных мембран цианобактерий (наружной, плазматической и тилакоидных) были измерены величины анизотропии поляризации флуоресценции, характеризующие вязкость мембран клеток, выращенных на свету и в темноте. Впервые проведено исследование дифференциальной экспрессии генов при воздействии различными температурами на клетки Synechocystis в зависимости от текучести/вязкости клеточных мембран. Впервые показана светозависимость индукции генов холодового стресса, находящихся под контролем сенсорной гистидин-киназы Hik33.

Апробация работы. Основные результаты научной работы были представлены на конференциях (Москва, 2009, 2010) и семинаре (Москва, 2011) молодых учёных ИФР РАН; на V молодёжной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2009), на Всероссийских научных конференциях «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2009), «Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2009), «Физиология трансгенного растения и фундаментальные основы биобезопасности» (Москва, 2010) и «Растение и стресс» (Москва, 2010), Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2011).

Публикации: по материалам диссертационной работы опубликовано 10 печатных работ, из них 5 являются статьями в рецензируемых журналах.

Структура и объем работы: Диссертация построена по стандартной схеме и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и их обсуждение, заключение, выводы, список литературы и приложения.

Работа изложена на 122 страницах машинописного текста и содержит 9 таблиц и 32 рисунка. Список цитированной литературы содержит 186 наименований, из которых 168 на иностранных языках.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования в настоящей работе служила культура цианобактерий Synechocyslis sp. РСС 6803, штамм GT (Williams, 1988; Ikeuchi & Tabata, 2001). Аксеничные культуры цианобактерий поддерживали на агаризованной среде BG-11, забуференной 20 мМ HEPES-NaOH, рН7,5 на чашках Петри при температуре 32°С и постоянном освещении люминесцентными лампами интенсивностью 70 мкЕм" -с . Мутантные культуры цианобактерий поддерживали на той же среде с добавлением

соответствующих антибиотиков.

Интенсивные культуры цианобактерий выращивали асептически в культуральных сосудах при температуре 32°С, освещённости 70 мкЕ м^ с , с постоянным барботированием стерильной газовоздушной смесью, обогащенной С02 до концентрации 1,6%. Для перевода в условия интенсивной культуры цианобактерии разводили в необходимом объеме стерильной среды BG-11, перемешивали, и разливали по культуральным сосудам. Таким образом осуществляли синхронизацию роста культур на нескольких сосудах. На 2-4 сутки (OD750 = 2) цианобактерии переносили в условия эксперимента. В качестве показателя роста использовали зависимость OD75o суспензии клеток от времени (в сутках культивирования). ,

Выделение РНК из клеток Synechocystis. Для выделения РНК экспериментальные образцы (50 мл интенсивной культуры цианобактерий OD750 = 2) фиксировали равным объёмом ледяного этилового спирта с 0,5% фенола, после чего выделяли РНК согласно описанным ранее методикам (Kiseleva et а/., , 2000). Содержание РНК в пробе оценивали спектрофотометрически.

Анализ экспрессии генов с помощью обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР).

1. Дополнительная очистка РНК от ДНК с помощью дезоксирибонуклеазы. Очистку проводили с помощью DNase I (Fermentas) в соответствии с методиками производителя. Об отсутствии ДНК в образцах РНК судили по результатам ПЦР (см. п.4).

2. Гель-электрофорез РНК. Степень деградации РНК определяли с помощью гель-электрофореза. Для этого 1 мкг РНК разделяли в 1% агарозном геле при постоянном токе напряжённостью 11 В/см в течение 15 минут. В норме после разделения РНК в геле в присутствии бромистого этидия при освещении ультрафиолетом 254 нм наблюдали 3 мажорных линии, соответствующие рибосомной

РНК, при отсутствии следов её деградации.

3. Обратная транскрипция. Для постановки реакции ОТ использовали обратную транскриптазу Superscript III (Invitrogen, США). Реакцию проводили в

-5-

соответствии с протоколами фирмы-изготовителя фермента, при этом в реакционную смесь добавляли 2 мкг тотальной РНК и обратные ПЦР-праймеры (каждого по 2 пмоль, Табл. 1).

Табл. 1. Праймеры для (ОТ-)ПЦР

Рамка Название Прямой праймер Обратный праймер Длина ПЦР-

считывания гена 5'—3' 5'—3' продукта, п.н.

slrI350 desA atgactgccacgattccccc aacttttttcagggagccgaa 1 053

sll0262 desD atgctaacagcggaaagaatt cgatgctttgccctaggcctc 1 077

slr0083 crhR gactaatactttgactagtacc ctgttggcgatcactataggc 1 474

ssr2595 hliB gactagccgcggatttcgcc gagagagagcaaccaacccac 208

S111441 desB cgtctagaaatttcatcgcc ggtttctffigatatccacc 1 073

¡110517 rbpA gtcaatttatgtaggcaacc gtagcggctaccaccatagc 300

Олигонуклеотиды, использованные в качестве праймеров, были синтезированы НПФ "ЛИТЕХ" (Россия).

4. Полимеразная цепная реакция. Амплификацию фрагментов всех исследуемых генов проводили для каждого образца кДНК, полученного в ходе реакции обратной транскрипции, независимо. Реакцию проводили с использованием Hot Start Гй^-полимеразы согласно методикам фирмы-изготовителя (Fermetas). Для каждого гена условия проведения реакции, количество кДНК подбирали эмпирически. Отрицательным контролем служила ПЦР с праймерами к гену rbpAl с добавлением вместо кДНК эквивалентного количества тотальной РНК. Для всех препаратов РНК на электрофорезе отсутствовали 300 п.н.-продукты ПЦР.

5. Гель-электрофорез ПЦР смеси проводили в 1% агарозном геле.

6. Анализ результатов ОТ-ПЦР. Агарозный гель фотографировали и сохраняли в формате tiff для последующего анализа. Для каждой /-полосы на форезе денситометрически определялась интенсивность свечения (/,) в программе Adobe Photoshop CS5. Каждому эксперименту соответствовало своё суммарное значение интенсивностей свечения всех полос ITo,ai = Полученные значения для каждой пробы использовали для численной оценки относительной величины экспрессии для каждой пробы: Et = (Quackenbush, 2002). Таким образом, Е, оказывались

1Total

нормализованными и допускали качественное сравнение между разными экспериментами. Для всех Е было посчитано среднее значение и стандартное отклонение.

Направленный мутагенез генов Synechocystis. Штамм Synechocystis sp. РСС 6803 GT может быть трансформирован путём двойной гомологичной рекомбинации между хромосомной и экзогенной ДНК (Grigorieva & Shestakov, 1982). Полной сегрегации ДНК, несущей мутированный ген, добивались рассеванием цианобактерий

до одиночных колоний. О замене гена дикого типа мутантным судили по результатам ПЦР.

Определение содержания жирных кислот (ЖК) в глицерофосфолипидах и индекса ненасыщенности остатков ЖК. Метиловые эфиры жирных кислот (МЭЖК) суммарных липидов из клеток Synechocystis sp. получали согласно известным методикам (Zhukov е/ а!., 1970). Очистку МЭЖК проводили методом препаративной тонкослойной хроматографии. Состав МЭЖК определяли с помощью ГЖХ-МС на приборе Agilent 7890А GC (Agilent Technologies, Inc., США) с 60 м капиллярной колонкой внутренним диаметром 0.25 мм (DB-23, Ser. № US8897617H). Колонка содержала привитую (50% цианопропил)-метилполисилоксановую полярную жидкую фазу толщиной слоя 0.25 мкм (Tsydendambaev et al., 2004). Для идентификации индивидуальных видов МЭЖК и расчёта их количественного содержания в смеси использовали расширенный пакет встроенных рабочих программ MSD Chem Station G1701EA Е.02.00.493 и библиотекой спектровNIST.

Индекс ненасыщенности (ИН) суммы ЖК вычисляли как среднее взвешенное количества двойных связей у /-ЖК (N,) с относггельными молярными

концентрациями /-ЖК (С,): ИН = £"=0^iQ-

Разделение клеточных мембран Synechocystis в двухфазной системе. 1,5 л суспензии цианобакгерий, выращенных в условиях интенсивной культуры, осаждали, промывали 5 мМ калий-фосфатным буфером рН7,8 с 0,25 М сахарозы, после чего клетки разрушали в прессе Френча при 70 МПа. Полученную суспензию обрабатывали гомогенизатором Потгера и с помощью дифференциального центрифугирования (3 000 g, 10 мин, затем 100 000 g, 30 мин) отделяли клеточные мембраны. Фракционирование мембран проводили в двухфазных 10 граммовых системах на основе полиэтиленгликоля с массовым числом 3 350 г/моль и декстрана Т-500 (Amersham) согласно методикам Nörting et al. (1998), Nörting (2000) и Huang ei

al., 2004).

Определение содержания белков в пробе проводили с использованием бицинхониновой кислоты (ВСА Protein Assay Reagent, Bio-Rad). Белок солюбилизировали в 2% водном растворе лаурилсульфата натрия, центрифугировали 5 мин при 16 000 g, после чего аликвоту супернатанта использовали для определения белка согласно рекомендациям производителя. Калибровочную кривую строили с использованием разведений раствора БСА в 2% лаурилсульфате натрия.

Разделение белков и вестерн-блотгинг. 20 мкг (на одну пробу) белка разделяли в ПААГ согласно Laemmli (1970). Гель для визуализации фиксировали 50% этанолом с 3% ортофосфорной кислоты, после чего окрашивали коллоидным Кумасси G-250 по Neuhoff et al. (1985). Гель использовали для переноса белков на нитроцеллюлозою мембрану (45 мкм, Hybond-C Extra, GE Healthcare, UK). Перенос осуществляли с помощью Trans-Blot SD Electrophoretic Semi-Dry Transfer Cell (Bio Rad). Мембрану обрабатывали кроличьими антителами против Dl-белка

-7-

фотосистемы II (Agrisera, Швеция), который использовали в качестве маркерного белка тилакоидных мембран. Для визуализации использовали антикроличьи антитела, меченные пероксидазой хрена (GE Healthcare).

Определение анизотропии поляризации флуоресценции (АПФ). Характеристикой вязкости биологических мембран служит АПФ встраиваемого в мембраны в качестве зонда 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриена (ДФГ) (van Blitterswijk et al., 1981; Jameson & Ross, 2010). Встраивание ДФГ в мембраны Synechocystis sp. проводили в 3 мл системе на основе PBS-буфера (Medicago АВ), содержавшей мембраны (50 мкг белка) и 0,2 мкМ ДФГ. Для этого 3 мкл 0,2 мМ ДФГ в ацетоне медленно добавляли к суспензии мембран в PBS при сильном перемешивании, после чего инкубировали, перемешивая, на льду 30 минут. Величины АПФ, спектры флуоресценции ДФГ, а также суспензий мембран анализировали на флуоресцентном спектрофотометре Fluorescense Specrtophotometer 850 (Hitachi). Критерием встраивания ДФГ служило появление характерных пиков на спектре возбуждения при постоянной длине волны испускающего света 430 нм.

АПФ измеряли при длине волны поглощаемого света 360 нм, испускаемого — 430 нм при температурах от 15° до 50°С с интервалом в 5°С. Расчёт величины АПФ проводили по формуле:

'w — (-Р1) ¡VH

АПФ = -ZfL-(

/vv + 2(/^)/vH

где /гу — интенсивность флуоресценции; индексы обозначают поляризаторы возбуждающего (/') и испускаемого (/) света; «Н» обозначает горизонтальное положение поляризатора, «V» — вертикальное (Shi & Herschlag, 2009).

Статистическая обработка данных производилась для выборок численных величин по результатам трёх повторностей экспериментов. Все данные представлены в виде среднего со стандартным отклонением.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Инактивация генов desA и desD у Synechocystis. Гены десатураз Synechocystis sp. РСС 6803 инактивировали последовательно. Сначала цианобактерий трансформировали плазмидной ДНК, несущей ген desA, разрушенный кассетой устойчивости к канамицину. Замещение фрагмента гена desA кассетой устойчивости к канамицину в клетках цианобактерий происходило путём двойной гомологичной рекомбинации по участкам ДНК, фланкирующим ген устойчивости к канамицину. Таким образом был получен мутант desA'. После этого аналогичным образом был получен двойной мутант desA 7desD'{см. Рис. 1)

desA, 1053 п.н.

1,5 т.п.н.

Рис. 1 Инактивация генов <1е$А (а) и (б) йупесИосузвз

др дд _ прямой и обратный праймеры для амплификации фрагмента гена ¿еяЛ; иЬ, ик — для\iesD (см. Табл. 1); стрелками показаны места отжига праймеров. Кт , Бр — кассеты устойчивости к канамиц™^

спектиномицину, соотв. Фрагмент ¿е*А длиной 456 п.н. был заменен кассетой устойчивости к канамицину. Полученную конструкцию использовали для

трансформации ЗупескосуНи эр. Путем обмена гомологичными участками ген дикого типа был заменен мутантным. Ген аези был разрушен аналогичным способом.

Степень сегрегации мутантных хромосом тестировали с помощью ПЦР с использованием ДНК БупесИосувШ ер. РСС 6803 дикого типа, плазмидной ДНК, использованной для получения мутанта, а также геномной ДНК, выделенной из полученного мутанта.

На Рис. 2 приведена электрофореграмма результатов ПЦР-проверки сегрегации мутантных хромосом. Присутствие лишь одной

полосы на электрофореграмме свидетельствует в пользу того, что имела место полная сегрегация мутантных хромосом, в ходе которой все гены и (порядка 1

т.п.н.) были заменены мутантными (2,5-2,7 т.п.н.).

2,5-2,7 т.п.н.

1 т.п.н.

(а) Доказательство мутаншости^еток Матрицей служила геномная ДНК, вьщелев разрушенный ген desA,

ДНК, использованная для трансформации ^Ao^b^h^J^^W^^ танта

Возможность полного разрушения генов desA и desD говорит о том, что в оптимальных условиях роста клетки Synechocystis sp. РСС 6803 могут обходиться без соответствующих десатураз.

1ии

Жирнокислотный состав липидов <&ж/Г/А»/>--:мутанта. Цианобактер культивировали в условиях интенсивной кулыуры при 32°С. Результаты определения содержания ЖК в составе липидов Бупес/юсуу/й приведены на Рис. 3.

Дикий тип А>лЛ7Ач/Г

ш

Ш-Л

(Г 18

V

\

¡¡¡Ш

h^r J

\11,5% yr

щ

16:1;-/ 5,2%

18:0; _

0,8% 18:0;

0,8% 16:1. 4,9%

Рис. 3. ЖК-состав desA~/desD~.

Клетки выращивали при 32°С, после чего анализировали ЖК* состав липидов мембран В клетках дикого типа присутствовали 16:0, 9-16:1, 18:0, 9-181 9 12-18 2 и v-lT? ЖК Цифрами обозначено их относительное содержание мол.% В клеткаГ мутанта обнаруживались лишь мононенасыщенные ЖК, 16:0. 9- 6:1 18 0 9-18'Г следоватмшо десатуразы DesA и DesD в клетках мутанта были неактивны следовательно.

На диаграмме даны условные обозначение ЖК* и их содержание мол.%. В клетках дикого типа накапливались moho-, ди- и триненасыщенные ЖК. В клетках des A 7desD~ отсутствовали ПНЖК, что говорило об отсутствии активностей DesA и DesD в клетках двойного мутанта (Los & Murata, 1998).

Таким образом, нами был получен двойной мутант Synechocystis sp. РСС 6803 по генам des А и desD, кодирующим ацил-липидные Д12- и Дб-десатуразы. Доказательствами мутантности полученного штамма служили:

1) культивирование на селективной среде, что исключает возможность роста клеток дикого типа;

2) результаты ПЦР, свидетельствующие о полной сегрегации хромосом, несущих мутантные гены десатураз;

3) анализ ЖК-состава липидов.

Параметры роста клеток desAVdesD- Ростовые кривые были получены для клеток дикого типа и двойного мутанта desA'/desD' в условиях интенсивной кулыуры. Начальная OD750 составляла 0,1±0,01. Клетки инкубировали при температуре 32°С (нормальная температура роста) и при пониженной температуре, 22°С (холодовой стресс). Полученные данные типичного эксперимента представлены на Рис. 4. При 32°С клетки дикого типа сразу вступали в экспоненциальную фазу

углевод ^°7°ЗНаЧеНЫ <<Х-¥:2»' где Х - Д-™меРа связей (если они есть); V- число атомов

углерода в ЖК; Ъ — количество двойных связей в ЖК.

роста а клетки ¿гвА'ШМ' характеризовались непродолжительной лаг-фазои. Впоследствии скорость роста мутанта приближалась к скорости роста клеток дикото типа При пониженных температурах клетки дикого типа росли менее интенсивно, ае5А-МезО-- клетки гибли. Таким образом, мутантные ЛевА'^ потеряли

способность расти при пониженных температурах.

Для всех ^-образных ростовых кривых были рассчитаны периоды удвоения (Т1/2), максимальные скорости роста (Утах) и времена, за которые скорости роста клеток достигали своих максимальных значений (Ту) см. Табл. 2.

СЮ

О Дикий тип, 32°С □ ¿еэА~/с1е50~32°С Дикий тип, 22°С - (/г.у/Г/Л»/)~ 22°С

10 12 Время, сут

Рис. 4. Кривые роста клеток 5упесИ<щ^ дикого и ^У^ при 32°С и 224:

Клетки выращивали в условиях интенсивной культуры при 32 С и 22 С. Начальная ии750 0,1.

Табл. 2. Параметры роста клеток цианобаетерий при 32°С и 22°С

Дикий тип, 32°С с!езА'ШвУ. 32°С Дикий тип, 22°С

Т„2 [час] ^тах [1/суг] Ту [час]

13,6 ± 1,2 0,96 ± 0,02 47 ± 5

14,2 ±2,1 0,93 ± 0,03 68 ±4

19,1 ± 1,5 0,79 ± 0,03 88 ± 7

Наиболее коротким периодом удвоения характеризовались клетки дикого типа, росшие при 32°С (13,6 часов). Для клеток мутанта в тех же условиях Т1в - 14,2 часа. Кривая роста мутанта лежит ниже кривой дикого типа при нормальной

температуре, что обусловлено более длительным периодом удвоения, а также более

поздним временем достижения Vmax (после петых суток). Тем не менее значение максимальной скорости роста мутанта почти не отличалось от рассчитанного для клеток дикого типа. Следовательно, отсутствие ПНЖК не сказывается на способности мутанта расти при нормальной температуре. Меняются только параметры роста. Так, кривая des Aide sD' при 32°С характеризуется более протяжённым линейным участком.

Светозависимость изменения ЖК-состава при пониженной температуре.

Клетки выращивали в условиях интенсивной культуры, после чего инкубировали при пониженной температуре (22°С) 16 часов. При этом часть клеток инкубировали на свету, часть — в полной темноте. Результаты определения содержания ЖК липидов мембран представлены в Табл. 3.

В клетках дикого типа на свету при нормальной температуре накапливаются 16:0; 9-16:1; 9-18:1; 9,12-18:2 и у-18:3-ЖК - для которых массовая доля больше 1%. ИН был равен 0,77. При 22°С содержание олеиновой кислоты (18:1) снижалось более, чем в четыре раза; массовая доля у-линоленовой кислоты увеличивалась в полтора раза. Это связано с активацией десатураз ЖК (в частности, DesB) под воздействием пониженных температур и хорошо согласуется с опубликованными данными (Los et al.y 1993). Кроме того, в результате проявления под действием пониженных температур активности шЗ-десатуразы, появлялись а-18:3 и 6,9,12,15-18:4-ЖК, которых не было при нормальной температуре. При этом ИН = 1,03. В темноте при 32°С в клетках дикого типа существенных изменений ЖК-состава не наблюдалось. При воздействии пониженной температуры в темноте в клетках дикого типа ЖК-состав количественно соответствовал таковому при нормальных условиях. Качественно же расширялся спектр наблюдаемых второстепенных ЖК. Так, были обнаружены 10:0, 12:0, 15:0 и 11-18:1 ЖК.

В клетках мутанта количественно состав ЖК не менялся в различных условиях (ИН = 0,42 ± 0,05 — для всех вариантов эксперимента). Качественные изменения были заметны при действии низкой температуры в темноте, когда обнаруживались 11-18:1 и 15:0 ЖК. Следовательно, desAldesD'-иутат не способен регулировать ЖК-состав при понижении температуры.

На основании полученных данных была построена схема функционирования системы десатурации ЖК Synechocystis при различных условиях, см. Рис. 5.

Табл. 3. ЖК состав клеток цианобактерий на свету и в темноте Свет

_Содержание ЖК, мол.%_

32°С_22°С

ЖК Дикий тип ёеяА Мея О Дикий тип йе$А /с1с<;0

14:0 0,4 ± 0,1 0,5 ± 0,2 0,3 ± 0,1 0,4 ± 0,1

16:0 57,7 ± 2,5 57,2 ± 1,0 55,8 ± 1,6 57,6 ± 5,1

9-16:1 4,7 ± 0,6 5,0 ± 0,1 5,7 ± 0,4 4,3 ± 0,6

17:0 0,2 ± 0,1 0,2 ± 0,1 0,2 ±0,1 0,3 ± 0,1

10-17:1 0,7 ± 0,2 1,1 ± 0,3 0,5 ± 0,1 1,2 ± 0,3

18:0 0,7 ± 0,3 0,7 ± 0,3 0,3 ± 0,1 0,6 ± 0,3

9-18:1 10,8 ± 0,9 35,4 ± 1,1 2,6 ± 0,1 35,6 ± 3,0

9,12-18:2 13,1 ± 1,3 0 13,1 ± 0,6 0

у-18:3 11,7 ± 0,8 0 17,2 ± 0,5 0

а-18:3 0 0 3,0 ± 0,5 0

6,9,12,15-18:4 0 0 1,4 ± 0,3 0

ИН 0,77 ± 0,05 0,41 ± 0,01 1,01 ± 0,03 0,41 ± 0,05

Темнота

_Содержание ЖК, мол.%_

32°С _22°С

ЖК Дикий тип деяЛ МеяИ Дикий тип*

14:0 0,4 ±0,1 0,4 ± 0,2 0,8 ± 0,1 0,5 ± 0,1

16:0 58,3 ±3,0 57,0 ± 1,0 56,7 ± 1,6 56,8 ±5,1

9-16:1 4,8 ± 0,5 4,8 ± 0,1 5,4 ± 0,4 5,6 ± 0,6

17:0 0,3 ±0,1 0,3 ±0,1 0,3 ± 0,1 0,2 ± 0,1

10-17:1 0,7 ± 0,2 1,2 ± 0,3 0,8 ± 0,1 1,3 ± 0,3

18:0 0,7 ± 0,4 0,6 ± 0,3 0,6 ± 0,1 0,5 ± 0,3

9-18:1 8,4 ± 0,7 35,7 ± 1,1 9,2 ± 0,1 35,0 ± 3,0

9,12-18:2 14,2 ± 1,5 0 12,8 ± 0,6 0

у-18:3 12,3 ± 1,0 0 12,5 ± 0,5 0

а-18:3 0 0 0 0

6,9,12,15-18:4 0 0 0 0

ИН 0,79 ± 0,05 0,42 ± 0,01 0,79 ± 0,03 0,42 ± 0,05

* Появляются ЖК: 10:0, 12:0,13:0,15:0, —в сумме 1,0%.

** Появляется 15:0 — 0,1%.

Рис. 5. Схема десатурации ЖК Synechocystis в различных условиях.

На основании данных по ЖК в темноте и на свету была построена схема функционирования генов десатураз в зависимости от света при нормальной по пониженной температурах. На свету при холодовом воздействии клетками синтезируются а-18:3 и 6,9,12,15-18:4, которые отсутствуют при нормальной температуре. В темноте DesB неактивна (указано пунктиром), поэтому упомянутые ЖК отсутствуют даже при инкубации в условиях пониженных температур. Специфика дегидрирования: DesC, Д9; DesA, Д12; DesD, Д6; DesB, Д15 (или <о3).

Регуляция физического состояния клеточных мембран светом.

Synechocystis sp. выращивали в условиях интенсивной культуры, после чего инкубировали при 22°С 16 часов на свету и в темноте. Для каждого варианта эксперимента выделяли фракции наружной, плазматической и тилакоидных мембран (НМ, ПМ и ТМ, соотв.). В соответствии с методиками фракции НМ и ПМ могут быть загрязнены ТМ (Norling et al„ 1997, 1998; Huang et a/.,2004).

Поэтому для доказательства чистоты исследуемых фракций использовали вестерн-блоттинг. Мембранные белки разделяли в ПААГ (Т = 12,5%, С = 2,7%) и переносили на мембрану, которую обрабатывали первичными антителами к 01-белку фотосистемы II. Результаты вестерн-блоттинга представлены на Рис. 6.

Положение полос на мембране соответствует молекулярному весу 01-белка, который обнаруживался во фракциях тотальных мембран и ТМ, соответствующих тотальным и тилакоидным мембранам. Т.о. нами было показано отсутствие примеси тилакоидных мембран во фракциях плазматической и наружной мембран.

3 4

мм

кДа

- 150"

- 100"

50

30

20

г)

Рис. 6. Анализ белков мембранных фракций ЪупесИосуьйн

(а) Электрофореграмма белков мембранных фракций после двухфазного разделения.

(б) Вестерн-блот.

«1» — тотальные мембраны; «2» — фракция ПМ; «3» — < >ракция ТМ; «4» — фракция НМ.

Измерение анизотропии

поляризации флуоресценции (АПФ) проводили для трёх типов клеточных мембран цианобактерий: НМ, ПМ и ТМ. Наиболее хорошо ДФГ встраивался в плазматическую мембрану. Для нее уровень фоновой флуоресценции составил не более 5% от максимального.

В то время, как препараты тилакоидных и внешней мембран характеризовались более низким выходом флуоресценции. Результаты измерения АПФ представлены в виде графиков зависимости АПФ от температуры на Рис. 7.

Полученные данные позволяют сделать следующие выводы:

1) мембраны клеток БупесИосузНв, адаптированных к пониженным температурам, характеризуются сниженной вязкостью, при этом сильнее всего это заметно для НМ; 2) мембраны клеток ¿еэА 'ШзО' для всех вариантов опыта и для всех фракций характеризуются большей величиной упорядоченности липидов по сравнению с клетками дикого типа; 3) регуляция вязкости клеточных мембран носит светозависимый характер; 4) несмотря на неспособность регулировать степень ненасыщенности ЖК липидов мембран, клетки ¿езА'МезО' регулировали вязкость мембран в условиях холодового стресса; 5) в формировании ответа на холодовой стресс в клетках БупескосузШ посредством изменения величины упорядоченности липидов мембран участвуют несколько факторов, одним из которых представляется индекс ненасыщенности ЖК липидов мембран.

0,31 0,29 0,27 0,25 0,23 0,21 0,19 0,17 0,15

0,31 0,29 0,27 0,25 0,23 0,21 0,19 0,17 0,15

0,31 0,29 0,27 0,25 0,23 0,21 0,19 0,17 0,15

Дикий тип, 32°С

10

20

30

40

Дикий тип, 22°С, свет

10

20

30

40

Дикий тип, 22°С, темнота

ОНМ □ ПМ ЛТМ

10

20

30

40

0,31 0,29 0,27 0,25 0,23 0,21 0,19 0,17 0,15

50

10

0,31 0,29 0,27 0,25 0,23 0,21 0,19 0,17 0,15

50

10

0,31 0,29 0,27 0,25 0,23 0,21 0,19 0,17 0,15

50

10

20

20

20

30

40

с/е5А'/с!езО' 22°С, свет

50

30

40

50

с1еэЛ 7с/езО~ 22°С, темнота

>НМ I ПМ ^тм

30

40

50

Рис. 7. Результаты анализа величины АПФ для различных мембранных фракций.

Ось абсцисс — температура, °С; ось ординат — АПФ. Клетки выращивали при 32°С после чего инкубировали при 22°С в темноте и на свет)' 16 часов. Показаны результаты измерения АПФ для трех фракций мембран для каждого варианта условий.

Светозависимость экспрессии генов холодового ответа Бупес1юсу$й$ от температуры. Клетки инкубировали при различных температурах (от 32° до 18° с интервалом 2"С) в течение 30 минут. Варианты эксперимента: клетки дикого типа, (¡езА'Мезй', «свет», «темнота», «мутант ЫкЗЗ~» и «диурон (ОСМи), 20 мкМ», Для проб «22°С» из каждого варианта эксперимента реакцию ОТ-ПЦР проводили отдельно, после чего продукты реакций разделяли на электрофорезе и денситометрически определяли уровень свечения полос (£). Эти значения Е служили для пересчёта данных между различными вариантами эксперимента.

- 16-

Е2'5

2,0

Темнота -ОД

(А)

■ -0-32 30 28 26 24 22 20 18 ГС 32 30 28 26 24 22 20 181°'

■ I

д м

К Д ЫкЗЗ Д Д М М М т И т и

ч

Свет

Темнота (Б)

И ИВ -о д

К ДЫкЗЗД д м м м Т И Т и I- 22°С -1

Рис. 8. Экспрессия генов йен В и А ИВ ЗупескосузИх при различных температурах.

«Е» _ экспрессия в относительных единицах; «Д» — дикий тип; «М» — мутант ¿езА У^й'; «К» — контроль (32°С); «Т» — темнота: «Ь1кЗЗ» — мутант по гену гистидин-киназы Н1Ш; «И» — ингибитор фотосинтеза, диурон (20 мкМ). Клетки инкубировали при разлитых температурах 30 мин, после чего анализировали экспрессию генов методом Ш-11ЦГ. Диаграммы показывают относительные численные значения светимости полос на электрофорезе. Внизу каждой панели показано сравнение уровней экспрессии генов в различных условиях и у мутанта ЫкЗЗ при холодовом воздействии 22 С :>0 мин.

Свет

Темнота

АевА А/еаМ

32 30 28 26 24 22 20 18 ^С 32 30 28 26 24 22 20 18 1°'

Д м

| ТТШВнр.-ИТПД.«» а

- • ттв** ттт ттт тот ттм шт м! яшт тщ. етщ ртщ

К Д Ь1кЗЗ Д Д М М М

т И т и

1- 22°С -1

Свет

Темнота

32 30 28 26 24 22 20 18

1 ш&т ттт ттт ттт ттт ттт

п1,5

0,5

гЬрА I Р1

й

К ДЫкЗЗД Д М М М

т и т И

1- 22°С -1

Рис. 9. Экспрессия генов сгкК и гЬрАI Яупес/юсуьГ^ь при различных температурах.

«Е» — экспрессия в относительных единицах; «Д» — дикий тип; «М» — мутант с1еъА «К» — контроль (32°С); «Т» — темнота; «ЫкЗЗ» — мутант по гену гистидин-киназы ЬПкЗЗ; «И» — ингибитор фотосинтеза, диурон (20 мкМ). Клетки инкубировали при различных температурах 30 мин, после чего анализировали экспрессию генов методом ОТ-ПЦР. Диаграммы показывают относительные численные значения светимости полос на электрофорезе. Внизу каждой панели показано сравнение уровней экспрессии генов в различных условиях и у мутанта И/кЗЗ' при холодовом воздействии 22°С 30 мин.

Так за единицу экспрессии была принята величина светимости полосы на электрофорезе, соответствующая пробе «22°С» для клеток дикого типа на свету.

Гены ¿мВ и ИНВ (см. Рис. 8, панели А и Б, соотв.) демонстрировали светозависимый характер экспрессии, которая в свою очередь зависела от вязкости клеточных мембран. Оба гена находятся под контролем гистидин-киназы ШкЗЗ.

Индукция генов сгИЧ и гЬрА! (см. Рис. 9, панели А и Б соотв.) низкими температурами наблюдалась во всех вариантах эксперимента. Экспрессия этих генов не регулировалась ШкЗЗ и не носила светозависимый характер.

Гены йеьВ, ИНВ и сгкк усиливали экспрессию при добавлении диурона. Очевидно, что на их экспрессию оказывает влияние окислительно-восстановительный статус фотосинтетического аппарата.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, вязкость клеточных мембран оказывает влияние на экспрессию генов при низкотемпературном стрессе. Гены, отвечающие на холодовой стресс у ЗупесИосуяНз можно разделить на две группы. К первой группе относятся гены, экспрессия которых при холодовом стрессе зависит от вязкости клеточных мембран (например, ИНВ, (1езВ). Эта группа генов находится под контролем сенсорной гистидин-киназы ШкЗЗ. Ко второй относятся гены, экспрессия которых индуцируется при снижении температуры независимо от вязкости клеточных мембран (например, сгкК, гЬрА1).

Гены, экспрессия которых зависит от вязкости мембран и находится под контролем НЖЗЗ, демонстрируют исключительно светозависимый характер низкотемпературной индукции. Эксперименты с использованием диурона показали, что эта зависимость не связана с активностью фотосинтетического аппарата.

выводы

1. Накопление ПНЖК в клетках ¿[упес/юсп'^й, индуцированное снижением температуры окружающей среды, носит светозависимый характер. Десатурация в положениях Д12 и Д6 зависит от света, тогда как и3 (Д15) осуществляется только на свету. Образование первой двойной связи в положении Д9, сопровождающее синтез мононенасыщенных ЖК не зависит от температуры и/или света.

2. Сконструированный двойной мутант ¿езА'МаО' не способен синтезировать ПНЖК и изменять ЖК-состав клеточных мембран, вследствие чего клетки мутанта desA~/desD' не способны адаптироваться к пониженным температурам ни на свету, ни в темноте.

3. Клетки ¿улес/госу-у/м способны регулировать текучесть клеточных мембран при снижении температуры только на свету. Мутант desA'/desD' может повышать текучесть клеточных мембран при низкотемпературном воздействии, несмотря на полную неспособность синтезировать ПНЖК и регулировать ЖК-состав липидов мембран. Таким образом, обнаружено существование неизвестного ранее механизма регуляции текучести мембран, который не связан с изменениями состава ЖК мембранных липидов.

4. Экспрессия генов (например, desB, М/В), индуцируемая низкими температурами и находящаяся под контролем сенсорной гистидин-киназы ШкЗЗ, зависит от текучести клеточных мембран. Экспрессия генов низкотемпературного ответа (например, гЬрА1, сгИЯ), не регулируемых №кЗЗ, не зависит от текучести клеточных мембран.

5. Физическое состояние мембран (их текучесть/вязкость) определяет температурную зависимость экспрессии генов холодового ответа, находящихся под контролем гистидин-киназы ШкЗЗ. Экспрессия носит светозависимый характер, но не зависит от активности фотосинтетического аппарата.

Список публикаций

1. Миронов К.С. (2009) Изучение экспрессии гена соЗ-десатуразы, des В, у мутанта Synechocystis sp. РСС 6803 с измененным жирнокислотным составом мембранных липидов. XVI международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2009», тезисы докладов, с. 98.

2. Миронов К.С.. Лось Д.А. (2009) Влияние текучести клеточных мембран на экспрессию гена desB у Synechocystis sp. РСС 6803. Бюллетень МОИП. Отдел биологический Т. 114(2): 141-142.

3. Миронов К.С.. Лось Д.А. (2010) Экспрессия гена соЗ-десатуразы жирных кислот регулируется физическим состоянием клеточных мембран у Synechocystis sp. РСС 6803. Годичное собрание общества физиологов растений России. Тезисы докладов, Москва, с. 75.

4. Синетова М.П., Миронов К.С.. Зорина A.A., Зинченко В.В., Лось Д.А. (2010) Функциональная геномика цианобактерий: мутагенез регуляторных компонентов, вовлеченных в стрессовые ответы. Тезисы трудов Ш-го Всероссийского симпозиума «Физиология трансгенного растения и фундаментальные основы биобезопасности». Москва, с. 74.

5. Лось Д.А., Зорина A.A., Синетова М.П., Миронов К.С. (2010) Сенсорные системы цианобактерий. Тезисы Всероссийского симпозиума «Растение и стресс», Москва, с. 221.

6. Los D.A., Zorina A., Sinetova V., Kryazhov S., Mironov К.. Zinchenko V.V.

(2010) Stress sensors and signal transducers in cyanobacteria. Sensors 10:2386-2415.

7. Миронов K.C.. Максимов Е.Г., Лось Д.А. (2011) Влияние изменения вязкости клеточных мембран на экспрессию гена desB у Synechocystis sp. РСС 6803. Международной конференции "Рецепторы и внутриклеточная сигнализация". Тезисы докладов, Москва, 323.

8. Зорина A.A., Миронов К.С.. Степанченко Н.С., Синетова М.А., Коробан Н.В., Зинченко В.В., Куприянова Е.В., Аллахвердиев С.И., Лось Д.А. (2011) Системы регуляции стрессовых ответов у цианобактерий. Физиология растений 58: 643-663.

9. Миронов К.С., Максимов Е.Г., Максимов Г.В., Бедбенов B.C., Лось Д.А.

(2011) Обратная связь между текучестью мембран и транскрипцией гена desB, кодирующего юЗ-десатуразу жирных кислот у цианобакгерии Synechocystis. Молекулярная биология - в печати.

10. Mironov K.S., Sidorov R.A., Trofimova M.S., Bedbenov V.S., Tsydendambaev V.S., Allakhverdiev S.I., Los D.A. (2011) Light-dependent cold-induced fatty acid unsaturation, changes in membrane fluidity, and alterations in gene expression in Synechocystis. Biochim. Biophys. Acta (Bioenergetics) - in press.

Подписано в печать: 06.09.11

Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 150 экз. Заказ № 470 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, Страстной бульвар, 6/1 (495) 978-43-34; www.reglet.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Миронов, Кирилл Сергеевич

Введение.б

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.1.

1.1. Структура липидов биологических мембран.

1.1.1. Основные липиды мембран растений.

1.1.2. Липиды тилакоидных мембран хлоропластов высших растений и цианобактерий.

1.1.3. ЖК-состав липидов мембран.

1.2. Свойства биологических мембран.

1.2.1. Плавление остатков жирных кислот.

1.2.2. Фазовые переходы в биологических мембранах.

1.2.3. Фазы клеточных мембран.

1.2.4. Связь между вязкостью и ненасыщенностью жирных кислот.

1.2.5. Роль мембранных белков.

1.2.6. Измерение величины упорядоченности липидного бислоя.

1.3. Конверсия насыщенных жирных кислот в ненасыщенные.

1.3.1. Синтез ненасыщеных жирных кил от у Е. coli.

1.3.2. Десатуразы жирных кислот.

1.3.3. Ацил-КоА десатуразы животных и грибов.

1.3.4. Ацил-АПБ десатуразы высших растений.

1.3.5. Ацил-липидные десатуразы цианобактерий и высших растений.

1.3.6. Разнообразие и функционирование ацил-липидных десатураз.

1.3.7. Система десатурации жирных кислот у Synechocystis sp.

1.4. Адаптация к пониженным температурам у Synechocystis sp.

1.4.1. Гены холодого ответа у Synechocystis sp.

1.4.2. Двухкомпонентные системы регуляции у Synechocystis sp.

1.4.3. Hik33 — рецептор холодового шока у Synechocystis sp.

1.4.4. Роль света в формировании ответа на холодовое воздействие.

1.4.5. Компакггизация ДНК и гены холодого ответа Synechocystis sp.

1.4.6. Модель для изучения ответа на понижение температуры.

Глава П. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Synechocystis sp., объект исследования.

2.1.1. Условия культивирования Synechocystis sp.

2:1.2. Трансформация Synechocystis sp.

2.1.3. Ростовые кривые.

2.1.4. Расчет параметров роста.

2.1.5. Выделение ДНК из Synechocystis sp.

2.1.6. Определение содержания нуклеиновых кислот в пробе.

2.1.7. Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле.

2.2. Этапы клонирования ДНК.

2.2.1. Работа с базами данных.

2.2.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

2.2.3. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля.

2.2.4. Дотирование.

2.2.5. Клонирование ПЦР-продукта.

2.2.6. Процедура трансформации Е. coli.

2.2.7. Выделение плазмидной ДНК из культуры Е. coli.

2.2.8. Рестрикция.

2.3. Анализ экспрессии генов Synechocystis sp.

2.3.1. Фиксация проб и выделение РНК из Synechocystis sp.

2.3.2. ОТ-ПЦР.

2.3.3. Анализ результатов ОТ-ПЦР.

2.4. Определение содержания жирных кислот в мембранах.

2.5. Фракционирование клеточных мембран Synechocystis sp.

2.5.1. Определение содержания белков в пробе.

2.5.2. Разделение белков и вестерн-блоттинг.

2.6. Анизотропия поляризации флуоресценции (АПФ).

Глава П1. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Инактивация генов десатураз Зупескосуэ¿¿у яр.

3.1.1. Клонирование фрагментов генов десатураз.

3.1.2. Инактивация генов ёезА и ¿ехО у ЗупесУюсузНз эр.

3.1.3. Жирнокислотный состав липидов ЗупесИосузИя ер.

3.2. Воздействие пониженных температур на клетки ¿еяА'МеяО'.

3.2.1. Выбор условий эксперимента.

3.2.2. Рост клеток с1еяА7йехО~щт пониженной температуре.

3.3. Светозависгшый эффект действия пониженных температур.

3.3.1. Светозависимость изменения ЖК-состава при пониженной температуре

3.3.2. Регуляция физического состояния клеточных мембран светом.

3.3.3. Анализ экспрессии генов методом ОТ-ПЦР: выбор условий эксперимента.

3.3.4. Влияние вязкости клеточных мембран на светозависимую индукцию генов пониженными температурами.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние стресс-зависимых изменений текучести мембран на экспрессию генов у цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803"

Принято считать, что предшественниками хлоропластов высших растений' были цианобактерии, типичным представителем которых является Synechocystis sp. РСС 6803 (далее Synechocystis sp.)- Этот одноклеточный организм широко используется в качестве модельного объекта для изучения стрессовых воздействий, поскольку характеризуется высокими скоростями роста в широком спектре условий, обладает способностью к генетической трансформации путём двойной гомологичной рекомбинации (Grigorieva & Shestakov, 1982). Кроме того, известна полная нуклеотидная последовательность генома Synechocystis sp. (Kaneko et al, 1996).

Сейчас достаточно много известно относительно ответа Synechocystis sp. на холодовое воздействие. Клетки Synechocystis sp. испытывают состояние холодового шока если температура окружающей среды снижается, по крайней мере, на 6 градусов (Los et al, 1993). При этом индуцируется экспрессия ряда генов: десатураз жирных кислот (ЖК), РНК-связывающих белков, РНК-хеликаз, рибосомных белков, протеаз и др. — это было продемонстрировано с использованием ДНК-микрочипов (Los et al, 2008). Известно, что часть этих генов экспрессируется под контролем гистидин-киназы Hik33, являющейся сенсором низкой температуры у Synechocystis sp. (Suzuki et al, 2000). Другая часть генов регулируется изменением степени сверхспирализации молекул ДНК Synechocystis sp. (Prakash et al, 2009). Упомянутые регуляторные механизмы играют основную роль в формировании ответа на холодовой стресс. Кроме этого имеется единичная работа, показывающая индукцию светом экспрессии генов десатураз (Kis et al, 1996), выполненная на клетках Synechocystis sp., адаптированных к гетеротрофному росту в присутствии глюкозы. В этом случае индукция транскрипции генов десатураз ЖК наблюдалась при освещении. Однако вопрос регуляции экспрессии данной группы генов светом в условиях фотоавтотрофного роста так и оставался открытым.

Снижение температуры окружающей среды в первую очередь сказывается на клеточных мембранах, поскольку жидкокристаллическое состояние липидов при этом сменяется кристаллическим (Hazel et al., 1995). В этом случае основной стратегией адаптации к действию пониженных температур представляется повышение степени ненасыщенности остатков ЖК в составе мембран. Известно, что инактивация генов десатураз ЖК desA и desD у Synechocystis sp., отвечающих за синтез полиненасыщенных ЖК в липидах мембран, приводила к снижению текучести мембран у двойного мутанта desAldesD" (Tasaka et al., 1996). На этом штамме с применением геномных микрочипов было показано влияние изменения текучести мембран на экспрессию генов (Inaba et al., 2003). Следует иметь ввиду, что упомянутый мутант был получен с использованием кассеты устойчивости к t антибиотику хлорамфиниколу, который является ингибитором фотосинтеза, поскольку опосредует передачу электронов с фотосистемы I на кислород (Okada et al, 1991). Поэтому данный < мутант не вполне подходит для изучения физиологических аспектов адаптации к условиям стресса на свету.

Цели и задачи» исследования. Целью настоящей работы было изучить влияние физического состояния клеточных мембран на экспрессию генов в условиях холодового стресса у цианобактерии Synechocystis sp. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1) сконструировать двойной мутант по генам desA и desD и охарактеризовать его способность регулировать ЖК состав в различных условиях;

2) сравнить ростовые характеристики мутанта desA ~/desD~ и клеток дикого типа в нормальных условиях и при пониженной температуре;

3) исследовать температуро-зависимое изменение текучести мембран у мутанта desA~/desD~ по сравнению с диким типом;

4) исследовать индукцию экспрессии генов холодового ответа в зависимости от физического состояния (текучести/вязкости) биологических мембран;

5) исследовать влияние света на индукцию экспрессии генов ответа на низкотемпературный стресс.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Миронов, Кирилл Сергеевич

выводы

1. Накопление ПНЖК в клетках Synechocystis sp., индуцированное снижением температуры окружающей среды,, носит светозависимый; характер. Десатурация в положениях А12 и А6 зависит : от света, тогда как со3 (А15) осуществляется-только на свету. Образование первой двойной связи в положении-А9, сопровождающее синтез: мононенасыщенных ЖК не зависит от температуры; и/или света.

2. Сконструированный двойной-, мутант desA~/desDТ не способен синтезировать ПНЖК и изменять ЖК-состав клеточных-мембран; вследствие чего клетки мутанта desA VdesD'iie способны адаптироваться к пониженным-температурам ни на свету, ни в темноте.

3. Клетки Synechocystis sp: способны регулировать текучесть; клеточных мембран при; снижении температуры только на' свету. Мутант desA'/desD"может повышать текучесть клеточных мембран« при низкотемпературном воздействии, несмотря на полную неспособность синтезировать ПНЖК и регулировать ЖК-состав липидов мембран. Таким образом, обнаружено существование неизвестного ранее механизма регуляции текучести мембран, который не связан с: изменениями состава ЖК мембранных липидов.

4. Экспрессия генов (например, desB, HUB, ndhD2), индуцируемая низкими температурами и находящаяся под контролем сенсорной гистидин-киназы Hik33, зависит от текучести клеточных мембран: Экспрессия генов-низкотемпературного ответа (например, rbpAl, crhR), не регулируемых Hik33, не зависит от текучести клеточных мембран.

5. Физическое состояние мембран (их текучесть/вязкость) определяет температурную зависимость экспрессии генов холодового: ответа, находящихся под? контролем гистидин-киназы Hik33. Экспрессия носит светозависимый характер, но не зависит от активности фотосинтетического аппарата.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, вязкость клеточных мембран оказывает влияние на экспрессию генов при низкотемпературном стрессе. Гены, отвечающие на холодовой стресс у ЗупескосузШ можно разделить на две группы. К первой группе относятся гены, экспрессия которых при холодовом стрессе зависит от вязкости клеточных мембран (например, кИВ, ¿еэВ, гиШО!). Эта группа генов находится под контролем сенсорной гистидин-киназы НдкЗЗ. Ко второй относятся гены, экспрессия которых индуцируется при снижении температуры независимо от вязкости клеточных мембран (сгкЯ, гЬрА1).

Гены, экспрессия которых зависит от вязкости мембран и находится под контролем НУсЗЗ, демонстрируют исключительно светозависимый характер низкотемпературной индукции. Эксперименты с использованием диурона показали, что эта зависимость не связана с активностью фотосинтетического аппарата.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Миронов, Кирилл Сергеевич, Москва

1. Еланская. И.В., Бибикова М.В., Богданова С.Л., Бабыкин М.М., Шестаков C.B. (1987) Бирепликонные векторные плазмиды для цианобактерии Synechocystis 6803 и Escherichia coli. Доклады АН СССР, 293, 716-719.

2. Зинченко В.В., Пивен И.В., Мельник В.А., Шестаков C.B. (1999) Векторы для комплементационного анализа мутантов цианобактерий. Генетика, 35, 291-296.

3. Зорина A.A., Миронов К.С., Степанченко Н.С., Синетова М.А., Куприянова Е.В., Аллахвердиев С.И., Лось Д.А. (2011) Системы регуляции стрессовых ответов у цианобактерий. Физиология растений, 57, 121.

4. Клячко-Гурвич Г.Л., Пронина H.A., Ладыгин В.Г., Цоглин Л.Н., Семененко В.Е. (2000) Разобщённое функционирование отдельных фотосистем. I. Особенности и роль десатурации жирных кислот. Физиология' растений, 47, 688-698.

5. Клячко-Гурвич Г.Л., Семенова А.Н., Семененко В.Е. (1980) Липидный обмен хлоропластов при адаптации клеток хлореллы к снижению освещённости. Физиология растений, 27, 370-379.

6. Лось Д., А. (2001) Структура, регуляция экспрессии и функционирование десатураз жирных кислот. Успехи биологической химии, 41, 163-198.

7. Лось Д.А. (2010) Сенсорные системы цианобактерий. М.: Научный мир, 218 с.

8. Маргелис Л. (1983) Роль симбиоза в эволюции клетки. М., Мир, 354 с.

9. Маслова И.П., Мурадян Е.А., Лапина С.С., Клячко-Гурвич Г.Л., Лось Д.А. (2004) Жирнокислотный состав липидов и термофильность цианобактерий. Физиология растений, 51, 396-403.

10. Новикова Г.В., Мошков И.Е., Лось Д.А. (2007) Белковые сенсоры и передатчики холодового и осмотического стрессов у цианобактерий и растений. Молекулярная биология, 41,478-490.

11. Шестаков С.В., Еланская И.В., Бибикова М.В. (1985) Векторы интеграциидля цианобактерии Synechocystis sp. 6803 .Доклады АН СССР, 282, 176-179.100

12. Aguilar P.S., De Mendoza D. (2006) Control of fatty acid desaturation: a mechanism conserved from bacteria to humans. Mol. Microbiol., 62, 1507-1514.1. V

13. Ajdzanovic V., Spasojevic I.', Sosic-Jurjevic B., Filipovic B., Trifunovic S., Sekulic M., Milosevic V. (2011) The negative effect of soy extract on erythrocyte membrane-fluidity: An electron paramagnetic resonance study. J. Membr. Biol., 239, 131-135.

14. Andreeva A., Popova A. (2010) Integration of P-carotene molecules in small" liposomes. Journal of Physics: Conference Series, 253, 012066.

15. Andreu V., Lagunas B., Collados R., Picorel Ri, Alfonso Mi (2010) The GmFAD7 gene family from soybean: identification of novel genes and tissue -specific conformations of the FAD7 enzyme involved in desaturase activity. J. Exp.Bot., 61,3371-3384.

16. Aronsson H. (2008) The galactolipid monogalactosyldiacylglycerob (MGDG) contributes to photosynthesis-related processes in Arabidopsis thaliana. Plant Signaling & Behavior, 3, 1093-1095.

17. Babbitt B., Huang L., Freire E. (1984) Thermotropic and dynamic characterization of interactions of acylated alpha-bungarotoxin with phospholipid bilayer membranes. Biochemistry, 23, 3920-3926.

18. Barkan L., Vijayan P., Carlsson A.S., Mekhedov S., Browse J. (2006) A suppressor of fabl challenges hypotheses on the role of thylakoid unsaturation in photosynthetic function. Plant Physiol., 141, 1012-1020.

19. Bausch A.R., Ziemann F., Boulbitch A.A., Jacobson K., Sackmann E. (1998) Local measurements of viscoelastic parameters of adherent cell surfaces by magnetic bead microrheometry. Biophy. J., 75, 2038-2049.

20. Behan M.K., Macdonald A.G., Jones G.R., Cossins A.R. (1992) Homeoviscous adaptation under pressure: the pressure dependence of membrane order in brain myelin membranes of deep-sea fish. Biochim. Biophys. Acta, 1103, 317-323.

21. Bonaventure G., Salas J.J., Pollard M.R:, Ohlrogge J.B. (2003) Disruption of the FATB gene in Arabidopsis demonstrates an essential role of saturated fatty acids in plant growth. Plant Cell, 15, 1020-1033.

22. Brown D.A. (2006) Lipid rafts, detergent-resistant membranes, and raft targeting signals. Physiology, 21,430-439.

23. Bullock W.O., Fernandez J.M., Short J.M. (1987) XLl-Blue: a high efficiency plasmid transforming recA Escherichia coll strain with p-galactosidase selection. Biotechniques, 5, 376-379.

24. Cahoon E.B., Lindqvist Y., Schneider G., Shanklin J. (1997) Redesign of soluble fatty acid desaturases from plants for altered substrate specificity and double bond position. Proc. Natl Acad. Set U.S.A., 94, 4872-4877.

25. Carisey A., Stroud M., Tsang R., Ballestrem C. (2011) Fluorescence recovery after photobleaching. Meth. Mol. Biol, 769, 387-402.

26. Casali N. (2003) Escherichia coli host strains. In: Methods in Molecular Biology, 235, Casali N., Preston A. (eds.). Totowa, NJ: Humana Press Inc., pp. 27-48.

27. Chapman D., Quinn P.J. (1976) A method for the modulation of membrane fluidity: homogeneous catalytic hydrogenation of phospholipids and phospholipids and phospholipid-water model biomembranes. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 73, 3971-3975.

28. Chen Q., Nimal J., Li W., Liu X., Cao W. (2011) Д-6 desaturase from borage converts linoleic acid to y-linolenic acid in HEK293 cells. Biochem. Biophys. Res. Commun., 410, 484-488.

29. Chochina S.V., Avdulov N.A., Igbavboa U., Cleary J.P., O'hare E.O., Wood W.G. (2001) Amyloid beta-peptide 1-40 increases neuronal membrane fluidity: role of cholesterol and brain region. J. Lipid Res., 42, 1292-1297.

30. Glerico E., M.; Ditty, J., L.; Golden, S., S. (2007) Specialized techniques for site-directed mutagenesis in cyanobacteria. In: Methods in Molecular Biology, 362, Rosato E. (ed.). Totowa, NJ: Humana Press Inc., pp. 155-171.

31. DeLong, E.F., Yayanos A. A. (1985) Adaptation of the membrane lipids of a deep-sea bacterium to changes in hydrostatic pressure. Science, 228, 1101-1102.

32. Duysen M., Huckle L., Mogen K., Freeman T. (1987) Chloramphenicol effects on chlorophyll degradation and photosystem I assembly in the chlorina CD3 wheat mutant. Photosynth. Res, 14, 159-169.

33. Duysen M.E., Freeman T.P., Williams N.D., Huckle L.L. (1985) Chloramphenicol stimulation of light harvesting chlorophyll protein complex accumulation in a chlorophyll b deficient wheat mutant. Plant Physiol., 78, 531536.

34. Dyer D.H., Lyle K.S., Rayment I., Fox B.G. (2005) X-ray. structure of putative acyl-ACP desaturase DesA2 from Mycobacterium tuberculosis H37Rv. Prot. Sci., 14, 1508-1517.

35. Dyer J.M., Mullen R.T. (2001) Immunocytological localization of two plant fatty acid desaturases in the endoplasmic reticulum. FEBS letters, 494, 44-47.

36. Ehrt S., Schnappinger D. (2003) Isolation of plasmids from E. coli by alkaline lysis; In: Methods in Molecular Biology, 235, Gâsali N., Preston A. (eds.). Totowa, NJ: Humana Press Inc., pp. 75-78.

37. Falcone D.L., Gibson S., Lemieux B., Somerville G. (1994) Identification of a gene that; complements an; Arabidopsis mutant deficient in chloroplast ©6 desaturase activity. Plant Physiol, 106, 1453-1459.

38. Freire E., Markello T., Rigell G., Holloway P.W. (1983) Calorimetric and fluorescence characterization of interactions between- cytochrome 65 and phosphatidylcholine bW&y&xs. Biochemistry, 22,1675-16801.

39. Fudge D.S., Stcvcns E.D., Ballantyne J.S. (1998) No evidence for homeoviscous adaptation in a heterothermic tissue: tuna heat-exchangers. Am. J. Physiol., 275, R818-823.

40. Gibson S.A., Arondeli V.; Iba K., Somerville C. (1994) Cloning of a temperature-regulated gene encoding a chloroplast co3 desaturase from Arabidopsis thaliana. Plant Physiol, 106, 1615-1621.

41. Goni F.M:, Alonso A., Bagatolli L.A., Brown R.E., Marsh D., Prieto M., Thewalt .l.L. (2008) Phase diagrams of lipid mixtures relevant to the study of membrane rafts. Biochim. Biophys. Acta, 1781, 665-684.

42. Goodwin T.V., Mercer E.I. (1983) Introduction to Plant Biochemistry. Oxford: Pergamon Press, 677 p.

43. Guillou H., D'andrea S., Rioux V., Barnouin R., Dalaine S., Pedrono F., Jan S., Legrand P. (2004) Distinct roles of endoplasmic reticulum cytochrome b5 and fused cytochrome b5-like domain for rat A6-desaturase activity. J. Lipid Res., 45, 32-40.

44. Guler S., Seeliger A., Hartel H., Renger G., Benning C. (1996) A null mutant of Synechococcus sp. PCC7942 deficient in the sulfolipid sulfoquinovosyl diacylglycerol. J. Biol. Chem., 271, 7501-7507.

45. Gurr M.I., Harwood J.L., Frayn K.N. (2002) Lipid biochemistry: an introduction. Oxford: Blackwell Science Ltd., 336 p.

46. Guy C. (1999) Molecular responses of plants to cold shock and cold acclimation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 1, 231-242.

47. Hagio M., Gombos Z., Varkonyi Z., Masamoto K., Sato N., Tsuzuki M., Wada H. (2000) Direct evidence for requirement of phosphatidylglycerol in photosystem II of photosynthesis. Plant Physiol., 124, 795-804.

48. Haidekker M.A., Ling T., Anglo M., Stevens H.Y., Frangos J.A., Theodorakis E.A. (2001) New fluorescent probes for the measurement of cell membrane viscosity. Chemistry & Biology, 8, 123-131.

49. Haidl G., Opper C. (1997) Changes in lipids and membrane anisotropy in human spermatozoa during epididymal maturation. Human Reproduction, 12, 2720-2723.

50. Hastings N., Agaba M., Tocher D.R., Leaver M.J., Dick J.R., Sargent J.R., Teale A.J. (2001) A vertebrate fatty acid desaturase with A5 and A6 activities. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 98, 14304-14309.

51. Hazel J.R. (1995) Thermal adaptation in biological membranes: is homeoviscous adaptation the explanation? Annu. Rev. Physiol., 57, 19-42.

52. Heilmann I., Pidkowich M.S., Girke T., Shanklin J. (2004) Switching desaturase enzyme specificity by alternate subcellular targeting. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 101, 10266-10271.

53. Heimburg T. (2009) Physical properties of biological membranes. In: Handbook-of Molecular. Biophysics: Methods and Applications. Bohr H.G. (ed.) Wiley-VCH, 1074 p.

54. Higashi S., Murata N. (1993) An in v/vo-study of substrate specificities of acyl-lipid desaturases and acyltransferases in lipid synthesis in Synechocystis PCC6803. Plant Physiol, 102, 1275-1278.

55. Hihara Y., Sonoike K., Kanehisa Mi, Ikeuchi M. (2003) DNA Microarray analysis of redox-responsive genes in the genome of the cyanobacterium Synechocystis sp. strainPCC 6803. J. Bacteriol., 185, 1719-1725:

56. Hodzic A., Rappolt M., Amenitsch H., Laggner P., Pabst G. (2008) Differential modulation of membrane structure and; fluctuations by plant sterols and-cholesterol. Biophys. J., 94, 3935-3944.

57. Horvath I., Multhoff G., Sonnleitner A., Vigh L. (2008) Membrane-associated stress proteins: more than simply chaperones. Biochim. Biophys. Aacta, 1778, 1653-1664.

58. Huang F., Hedman E., Funk C., Kieselbach T., Schroder W.P., B. N. (2004) Isolation of outer membrane of Synechocystis sp. PCC 6803 and itsiproteomic characterization. Mol. Cell. Proteom., 3, 586-595.

59. Ikeuchi Mi, Tabata S. (2001) Synechocystis sp; PCC 6803 — a useful tool in the study of the genetics of cyanobacteria. Photosynth. Res:, 70, 73 -83 .

60. Kachroo A., Fu D.Q., Havens W., Navarre D., Kachroo P., Ghabrial S.A. (2008): An oleic acid-mediated pathway induces^ constitutive defense signaling and enhanced resistance to multiple pathogens- in soybean. Mol. Plant Microbe Interact., 21,:564-575.

61. Kachroo A., Kachroo P. (2009)* Fatty acid-derived signals in'plant: defense. Annn. Rev. Phytopathol., 41, 153-176.

62. Kamp F., Beyer K. (2006) Binding of a-synuclein affects, the lipid packing in bilayers of small vesicles. J. Biol. Chem., 281, 9251-9259.

63. Kaneko T., Nakamura Y., Sasamoto S., Watanabe A., Kohara M., Matsumoto M., Shimpo S., Yamada M., Tabata S. (2003) Structural analysis of four large*plasmids harboring in a unicellular cyanobacterium, Synechocystis sp. PCC 6803. DNA'Res., 10, 221-228.

64. Kaneko T., Tabata S. (1997) Complete genome structure of the unicellular cyanobsLCtevium^Synechocystis sp. PCC 6803. Plant Cell Physiol., 38, 1171-1176.

65. Kang D., Gho Y.S., Suh M.; Kang C. (2002) Highly sensitive and fast protein detection with coomassie brilliant blue in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Bull. Korean Chem. Soc., 23, 1511-1512.

66. KargiotidouA., Deli D., Galanopoulou D., Tsaftaris A., Farmaki T. (2008) Low temperature and light regulate A12 fatty acid desaturases (FAD2) at a< transcriptional level in cotton (Gossypium hirsutum). J. Exp. Bot., 59, 2043-2056.

67. Kis M.Z., O.; Farkas, T.; Wada, H.; Nagy, F.; Gombos, Z. (1998) Light-induced expression of fatty acid desaturase genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 95, 4209-4214.

68. Kiseleva L.L., Serebriiskaya T.S., Horvath I.,Vigh L., Lyukevich A.A., Los D.A. (2000) Expression of the gene for the A9 acyi-lipid desaturase in the thermophilic cyanobacterium. J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 2, 331-338.

69. Klyachko-Gurvich G.L., Tsoglin L.N., Doucha J., Kopetskii J., Shebalina (Ryabykh) I.B., Semenenko V.E. (1999) Desaturation of fatty acids as an adaptive response to shifts in light intensity. Physiol. Plantarum 107, 240-249.

70. Kotani H., Kaneko T., Matsubayashi T., Sato S., Sugiura M., Tabata S. (1994) A physical map of the genome of a unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. StrainPCC 6803. DNA Res., 1, 303-307.

71. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227,

72. Liberton M., Pakrasi H.B. (2008) Membrane systems in cyanobacteria.-In: The Cyanobacteria: Molecular Biology, Genetics and Evolution. Eds. A. Herrero, E. Flores, Caister Academic Press, Norfolk, UK, pp. 271-288.

73. Los D., Horvath L, Vigh L., Murata N. (1993) The temperature-dependent expression of the desaturase gene desA in Synechocystis PCC 6803. FEBS Lett., 318, 57-60.

74. Los D.A., Murata N. (1998) Structure and expression of fatty acid desaturases. Biochim. Biophys. Acta, 1394, 3-15.

75. Los D.A., Murata N. (2004) Membrane fluidity and its roles in the perception of environmental signals. Biochim. Biophys. Acta, 1666, 142-157.

76. Los D.A., Ray M.K., Murata N. (1997) Differences in the control of the temperature-dependent expression of four genes for desaturases in Synechocystis sp. PCC 6803. Mol. Microbiol. 25, 1167-1176.

77. Los D.A., Zinchenko V.V. (2009) Regulatory role of membrane fluidity in gene expression. In: Lipids in Photosynthesis: Essential and Regulatory Functions, Wada H., Murata N., Govingee (eds.) Springer Science + Business Media B.V., pp. 329-348.

78. Los D.A., Zorina A., Sinetova M., Kryazhov S., Mironov K., Zinchenko V.V.2010) Stress sensors and signal transducers in cyanobacteria. Sensors, 10, 23862415.

79. Luddy F. (1979) Physical properties of fatty acids. J. Am. Oil Chem. Soc., 56, 759A-759A.

80. Mansilla M.C., Cybulski L.E., Albanesi D., De Mendoza D. (2004) Control of membrane lipid fluidity by molecular thermosensors. J. Bacteriol, 186, 66816688.

81. Maresca В., Schwartz J.H. (2006) Sudden origins: a general mechanism of evolution based on stress protein concentration and rapid environmental change. Anatomical Record. PartB, New Anatomist, 289, 38-46.

82. M'Baye G., Mely Y., Duportail G., Klymchenko A.S. (2008) Liquid ordered and gel phases of lipid bilayers: fluorescent probes reveal close fluidity but different hydration. Biophys. J., 95, 1217-1225.

83. Megha, Sawatzki P., Kolter T., Bittman R., London E. (2007) Effect of ceramide N-acyl chain and polar headgroup structure on the properties of ordered lipid domains (lipid rafts). Biochim. Biophys. Acta, 1768, 2205-2212.

84. Mitchell A., G.; Martin, С., E. (1995) A novel cytochrome ¿>5-like domain is linked to the carboxyl terminus of the Saccharomyces cerevisiae Л9 fatty acid desaturase. J. Biol. Chem., 270, 29766-29772.

85. Mizuno T., Kaneko T., Tabata S. (1996) Compilation of all genes encoding bacterial two-component signal transducers in the genome of the cyanobacterium, Synechocystis sp. strain PCC 6803. DNA Res., 3,407-414.

86. Mourek J., Mourek J., Jr. (2011) Developmentally dependent and different roles of fatty acids co6 and ©3. Prague Med. Rep., 112, 81-92.

87. Mouritsen O.G., Jorgensen K. (1994) Dynamical order and disorder in lipid bilayers. Chem. Phys. Lipids, 73, 3-25.

88. Murata N., Los D.A. (2006) Histidine kinase Hik33 is an important participant in cold-signal transduction in cyanobacteria. Physiologia Plantarum, 126,17-27.

89. Murata N., Wada H. (1995) Acyl-lipid desaturases and their importance in thetolerance and acclimatization to cold of cyanobacteria. The Biochemical journal, 308 (Pt 1), 1-8.

90. Nakamura Y., Kaneko T., Hirosawa M., Miyajima N., Tabata S. (1998) Cyanobase, a www database containing the complete nucleotide sequence of the genome of Synechocystis sp. strain PCC 6803. Nucleic Acids Research, 26, 63-67.

91. Nakamura Y., Kaneko T., Tabata S. (2000) Cyanobase, the genome database for synechocysts sp. Strain pcc6803: Status for the year 2000. Nucleic Acids Research, 28, 72.

92. Neuhoff V., Stamm R., Hansjorg E. (1985) Clear background and highlysensitive protein staining with coomassie blue dyes in polyacrylamide gels:A systematic analysis. Electrophoresis, 6, 427-448.

93. Nichols W.A. (2003) Cloning per products with t-vectors. In: Methods in Molecular Biology, 235, Casali N., Preston A. (eds.). Totowa, NJ: Humana Press Inc., pp. 141-152.

94. Nipper M.E., Majd S., Mayer M., Lee J.C., Theodorakis E.A., Haidekker M.A. (2008) Characterization of changes in the viscosity of lipid membranes with the molecular rotor FCVJ. Biochimica et biophysica acta, 1778,1148-1153.

95. Norling B., Zak E., Andersson B., Parkasi H. (1998) 2d-isolation of pure plasma and thylakoid membranes from the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. FEBSLetters., 436, 189-192.

96. Norling B., Zarka A., Boussiba S. (1997) Isolation and characterization of plasma membranes from cyanobacteria. Physiol. Plantarum., 99, 495-504.

97. Novo C., Fonseca E. (1989) Change of the unsaturation of the lymphocyte plasma membrane by ethanol and fatty acids. Actas Bioq., 2, 63-70.

98. Ntambi J.M. (1999) Regulation of stearoyl-CoA desaturase by polyunsaturated fatty acids and cholesterol. Journal of Lipid Research, 40, 1549-1558.

99. Okada K., Satoh K., Katoh S. (1991) Chloramphenicol is an inhibitor of photosynthesis. FEBS, 295, 155-158.

100. Panpoom S., Los D.A., Murata N. (1998) Biochemical characterization of a A12 acyl-lipid desaturase after overexpression of the enzyme in Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta, 1390, 323-332.

101. Phetsuksiri B., Jackson M., Scherman H., Mcneil M., Besra G.S., Baulard

102. A.R., Slayden R.A., Debarber A.E., Barry C.E. 3rd, Baird M.S., Crick D.C., Brennan P.J. (2003) Unique mechanism of action of the thiourea drug isoxyl on Mycobacterium tuberculosis. J. Biol. Chem., 278, 53123-53130.

103. Pisareva T., Kwon J., Oh J., Kim S., Ge C., Wieslander A., Choi J.S., Norling

104. B. (2011) A model for membrane organization and protein sorting in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 inferred from' proteomics and multivariate sequence analyses. J. Proteome Res., 10, 3617-3631.

105. Ponting C.P., Aravind L. (1997) PAS: a multifunctional domain family comes to light. Curr. Biol., 7, 674-677.

106. Prakash J.S., Sinetova M., Zorina A., Kupriyanova E., Suzuki I., Murata N., Los D.A. (2009) DNA supercoiling regulates the stress-inducible expression of genes in the cyanobacterium Synecliocystis. Mol. BioSys., 5, 1904-1912.

107. Quackenbush J. (2002) Microarray data normalization and transformation. Nat. Genet. Suppl., 32, 496-501.

108. Raffaele S., Leger A., Roby, D. (2009) Veiy long chain fatty acid and lipid signaling in the response of plants to pathogens. Plant Signaling & Behavior, 4, 94-99.

109. Reddy A.S., Nuccio M.L., Gross L.M., Thomas T.L. (1993) Isolation of a A6-desaturase gene from the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 by gain-of-function expression in Anabaena sp. strain PCC 7120. Plant Mol. Biol., 22,293-300.

110. Rippka R., Deruelles J., Waterbury J., Herdman M., Stanier R. (1979) Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria. Gen. Microbiol., Ill, 1-61.

111. Russell N.J., Evans R.I., ter Steeg P.F., Hellemons J., Verhuel A., Abee T.1995) Membranes as a target for stress adaptation. Int. J. Food Microbiol., 28, 255-261.

112. Ryan B.J. (2011) Differential precipitation and solubilization of proteins. In: Methods in Molecular Biology, 681, Walls D., Loughran S.T.T. (eds.). Totowa, NJ: Humana Press Inc., pp. 203-212.

113. Sakamoto T., Los D.A., Higashi S., Wada H., Nishida I., Ohmori M., Murata N. (1994a) Cloning of oo3 desaturase from cyanobacteria and its use in altering the degree of membrane-lipid unsaturation. Plant Mol. Biol., 26, 249-263.

114. Sakamoto T., Wada H., Nishida I., Ohmori M., Murata N. (1994b) Identification of conserved domains in the A12 desaturases of cyanobacteria. Plant Mol. Biol., 24, 643-650.

115. Sakayori T., Shiraiwa Y., Suzuki I. (2009) A Synechocystis homo log of SipA protein, Ssl3451, enhances the activity of the histidine kinase Hik33. Plant Cell Physiol., 50, 1439-1448.

116. Sakurai I., Shen J.-R., Leng J., Ohashi S., Kobayashi M., Wada H. (2006) Lipids in oxygen-evolving photosystem II complexes of cyanobacteria and higher plants. J. Biochem., 140, 201-209.

117. Sambrook J., Frisch E.F., Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Lab. Press, 1659 p.

118. Sato M., Theret D.P., Wheeler L.T., Ohshima N., Nerem R.M. (1990) Application of the micropipette technique to the measurement of cultured porcine aortic endothelial cell viscoelastic properties. J. Biomech. Eng. 112, 263-268.

119. Sato N., Wada H. (2009) Lipid biosynthesis and its regulation in cyanobacteria. In: Lipids in Photosynthesis: Essential and Regulatory Functions. Wada H., Murata N. (eds.) Springer Science + Business Media B.V., pp. 157-177.

120. Sato S., Shimoda Y., Muraki A., Kohara M., Nakamura Y., Tabata S. (2007) A large-scale protein-protein interaction analysis in Synechocystis sp. PCC 6803. DNA Research, 14, 207-216.

121. Schultz D.J., Suh M.C., Ohlrogge J.B. (2000) Stearoyl-acyl carrier protein and unusual acyl-acyl carrier protein desaturase activities are differentially influenced by ferredoxin. Plant Physiol, 124, 681-692.

122. Scrimgeour C. (2005) Chemistry of Fatty Acids. In: Bailey's Industrial Oil and Fat Products,Shahidi F. (ed.) John Wiley & Sons, Inc., pp. 1-43.

123. Selstam E., Campbell D. (1996) Membrane lipid composition of the unusual cyano bacterium Gloeobacter violaceus sp. PCC 742 T, which lacks sulfoquinovosyl diacylglycerol. Arch Microbiol, 166, 132-135.

124. Shanklin J., Somerville C. (1991) Stearoyl-acyl-carrier-protein desaturase from higher plants is structurally unrelated to the animal and fungal homologs. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 88, 2510-2514.

125. Shi X., Herschlag D. (2009) Fluorescence polarization anisotropy to measure RNA dynamics. Meth. Enzymol., 469, 287-302.

126. Simons K., Ikonen E. (1997) Functional rafts in cell membranes. Nature, 387, 569-572.

127. Sinensky M. (1974) Homeoviscous adaptation—a' homeostatic process that regulates the viscosity of membrane lipids in Escherichia coli. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 71, 522-525.

128. Singer S.J., Nicolson G.L. (1972) The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science, 175, 720-731.

129. Stein J.R. (1973) Handbook of phycological methods: culture methods and growth measurements. New York: Cambridge University Press, 460 p.

130. Strittmatter P., Spatz L., Corcoran D., Rogers M.J., Setlow B., Redline R. (1974) Purification and properties of rat liver microsomal stearyl coenzyme A desaturase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 71, 4565-4569.

131. Subczynski W., K.; Wisniewska, A. (2000) Physical properties of lipid bilayer membranes: relevance to membrane biological functions. Acta Biochim. Pol., 47, 613-625.

132. Suzuki I., Kanesaki Y., Mikami K., Kanehisa M., Murata, N. (2001) Cold-regulated genes under control of the cold sensor Hik33 in Synechocystis. Mol. Microbiol., 40, 235-244.

133. Suzuki I., Los D.A., Kanesaki Y., Mikami K., Murata N. (2000) The pathway for perception and transduction of low-temperature signals in Synechocystis. EMBOJ., 19, 1327-1334.

134. Swords W.E. (2003) Chemical transformation of E. coli. In: Methods in Molecular Biology, 235, Casali N., Preston A. (eds.). Totowa, NJ: Humana'Press Inc., pp. 49-53.

135. Tan X., Zhu T., Shen S., Yin C., Gao H., Xu X. (2011) Role of Rbpl in the acquired chill-light tolerance of cyanobacteria. J. Bacteriol., 193, 2675-2683.

136. Tasaka Y., Gombos Z., Nishiyama Y., Mohanty P., Ohba T., Ohki K., Murata

137. N. (1996) Targeted mutagenesis of acyl-lipid desaturases in Synechocystis: Evidence for the important roles of polyunsaturated membrane lipids in growth, respiration and photosynthesis. EMBOJ., 15, 6416-6425.

138. Taylor B.L., Zhulin I.B. (1999) PAS Domains: Internal sensors of oxygen, redox potential, and light. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 63, 479-506.

139. Torres-Franklin M.-L., Repellin A., Huynh V.-B., D'arcy-Lameta A., Zuily-Fodil Y., Pham-Thi A.-T. (2009) Omega-3 fatty acid desaturase (FAD3, FAD7,

140. FADS) gene expression and linolenic acid content in cowpea leaves submitted to drought and after rehydration. Environ. Exp. Bot., 65, 162-169.

141. Vigh L., Nakamoto H., Landry J., Gomez-Munoz A., Harwood J.L., Horvath1. (2007) Membrane regulation of the stress response from prokaryotic models to mammalian cells. Ann. NY Acad. Set, 1113, 40-51.

142. Vioque A. (1992) Analysis of the gene encoding the RNA subunit of ribonuclease P from cyanobacteria. Nucleic Acids Res., 20, 6331 -6337.

143. Wada H., Murata N. (1990) Temperature-induced changes in the fatty acid composition of the cyanobacterium, Synechocystis PCC6803. Plant Physiol., 92, 1062-1069.

144. Wada, H., Schmidt H., Heinz E., Murata N. (1993) In vitro ferredoxin-dependent desaturation of fatty acids in cyanobacterial thylakoid membranes. J. Bacteriol., 175, 544-547.

145. Wang Y., Xu W., Chitnis P. (2009) Identification and bioinformatic analysis of the membrane proteins of Synechocystis sp. PCC 6803. Proteome Sci., 7, 11.

146. Whittle E.J., Tremblay A.E., Buist P.H., Shanklin J. (2008) Revealing the catalytic potential of an acyl-ACP desaturase: tandem selective oxidation of saturated fatty acids. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 105, 14738-14743.

147. Williams C.M., Burdge G. (2007) Long-chain n-3 PUFA: plant v. marine sources. Proc. Nutr. Society, 65, 42-50.

148. Williams J.G.K. (1988) Construction-of specific mutations in photosystem II photosynthetic reaction center by genetic engineering methods in Synechocystis 6803. Methods Enzymol., 167, 766-778:

149. Wu G., Truksa M., Datla N., Vrinten P., Bauer J., Zank T., Cirpus P., Heinz E., Qiu X. (2005) Stepwise engineering to produce high yields of very long-chain polyunsaturated fatty acids in plants. Nature Biotechnology, 23, 1013-1017.

150. Yamajx-Hasegawa A., Tsujimoto M. (2006) Asymmetric distribution of phospholipids in biomembranes. Biological & Pharmaceutical Bulletin, 29, 15471553.

151. Yu B., Xu C., Benning C. (2002) Arabidopsis disrupted in SQD2 encoding sulfolipid synthase is impaired in phosphate-limited growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 99, 5732-5737.

152. Zang X., Liu B., Liu S., Arunakumara K.K.I.U., Zhang X. (2007) Optimum conditions for transformation of Synechocystis sp. PCC 6803. J. Microbiol., 45, 241-245.

153. Zhukov A.V., Yereshchagin A.G. (1970) Heptadecanoic acid as an internal standart in the gas chromatographic weight determination of fatty acids. J. Chromatogr., 51, 155-166.