Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетический контроль протеолитических процессов в клетках Escherichia coli. Psendomonas aeruginosa u Psendomonas putida.

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетический контроль протеолитических процессов в клетках Escherichia coli. Psendomonas aeruginosa u Psendomonas putida."

м /с1иыс?ьции ос.

ЛЕНИНГРАДСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА 7

И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАЛ1ЕНИ ^л

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ £

На правах рукописи

УДК 577.152.4:577.21.:579.842.24

КИСЕЛЕВ Всеволод Иванович

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В КЛЕТКАХ Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa И Pseudomonas putida

03.00.15. Генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Ленинград 1989

Работа выполнена в Научном центре по разработке и внедре нию современных методов молекулярной диагностики МЗ СССР

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В. Л. Калинин доктор биологических наук Н. И. Матвиенко доктор биологических паук Н. В. Томилин

Ведущее учреждение: Институт молекулярной биологи: АН СССР.

Защита состоится,,_"_1989 г. в_ча(

па заседании специализированного Совета (Д 063.57.21) по за щите диссертации на соискание ученой степени доктора нау при Ленинградском государственном университете (Лениигра;: Университетская наб., 7/9, ауд. А" ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ленинград ского университета.

• Автореферат разослан,,-"-1989 года.

Ученый секретарь специализированного Совет кандидат биологических паук Н. М. Иркаев

. ОНДАЯ ХАРАКТЕНЮТША РАБОТЫ

Дктуальность проблему. Катаболизм белков бактериальных и ©отннх клеток является важной составной частью всего метабо-1зш. В активно делящихся клетках обменивается приблизитель-з 75? белков. При действии на клетки неблагоприятных факторов атенсивность этих процессов возрастает, причем наблюдается элективная деградация белков определенного типа. Именно высо-ая избирательность деградации позволила высказать еще несколъ-о десятилетий назад предположение о том, что внутриклеточной ротеолиз белков - зто не просто механизм формирования авто-: омиого пула аминокислот, а высоко специфичная реакция, осуще-твлявцая регуляцию клеточных процессов и контроль за генетиче-ки детерминированным спектром бактериальных полшшптидов. льфред Гольдберг, исследователь, наиболее плодотворно работшо-[ий в этой области в течение многих лот, в одной из своих пуб-[икаций подчеркивает: "Тот, кто думает, что протеаэа - наив-[нй фермент, наивен сам" ((Зогаъе^ А.Ь., 1976),

В последние годы накопилось множество данных, подтверждаемые правоту этого высказывания. . Сегодня нам известно, что ' гри участии протеаз осуществляется регуляция экспрессии гонов репарации, секреция белков через цитошшзматическузо мембрану ишотных и бактериальных клеток, внутриклеточная комшртмоита-шэация. белков, биогенез митоховдрий, утилизация чужеродных и аномальных полипептидов, устойчивость кладок к действию вирусных агентов, в основе которой лежат селективная деградация вирусных бэлков и т.д. ч

В середина 70-х годов сложилась ситуация, при которой ш узко знали довольно много о том, зачем нужны протеазы клетки, и практически ничего о том, как регулируются эти процессы ' in vivo и как осуществляется их генетический контроль.

Примерно в это же время исследовании ггротеоляза перестают быть чисто фундаментальными п приобретают черты, важные для практики. Етот переход вызван, главнш образом, развитием генетической инженерии и широким развертыванием экспериментов по клонированию и экспрессии генов в новом генетическом окру-Ж9НИП. В первих же работах такого рода было установлено, что синтез белков кивотиого происхождения в бактериальных клетках сопрово-адаотся их быстрой деградацией, что является серьезным препятствием на пути создания суперпродуцентов и разработки технологий получения малодоступных псишпентидоз ( Ktseipv v'.i.

et si., 1982).

Таким образом, назрела необходимость управлять этими процессами. Все эти обстоятельства закономерно привлекли внимание к изз'чегаш механизмов регуляции протэолиза.

Одной из популярных моделей исследования этих процессов стал тепловой шок. Баю известно, .что.з бактериальных и яшзог-иух клетках, подвергнутых тепловому стрессу, регистрируется синтез определенного масса белков, получивших название балков теплового шока (БГШ).

Аналогичную реакция можно индуцировать этанолом, агентами нарушающими спирализацля ДНК (коумермицин). H^Og и, что особенно интересно, появлением в клетка аномальных шли чужеродных белков. Как ввдно; совершенно отличные по своим физическим c&oí сте>ам факторы вызывают однотипную реакций, что евпдетеяьстйует

- J -

Зб оСщол шшени ИХ воздействия ( Heidhardt P.O. et al,, 1304: loff S.A. and Goldberg A,L., 1935).

К мошнту начала настоящей'работы имелись предааритель-Нио .данные о том, что действие перечисленных факторов реаяизу- -. ется' через продукт гена htpH - балок с иол. массой 32 кД. Являясь альтернативной d> -субъединицей, белок utpH замещает в состава голофермента РНК полимаразы (з 70 и, изме-ши таким образом специфичность фермента, обеснечиваег избирательную транскрипцию определенной группы генов (Yrr.emori т., 19В2). '

В какой мере протэсиштическио события в бактериальных _ клетках зависят от белка HtpH и генов теплового шока? В настоящей работе эта проблема явилась основным направлением исследований.

Доле исследования. Основная цель настоящей работа состояла в исследовании генетического контроля и механизмов регуляции протеолитичоских процессов в клетках Escherichia coli и бактериях рода Paeudomonaa • в условиях температурного стресса.

Задач;; исследования. I, Исследовать .транскрипции гена htpB, регулирующего синтез белков теплового шока. 2. Изучить синтез El'ill и процессы деградации аномальных банков в условиях различной регуляции экспрессии гена htpB. 3. Изучить возможность конструирования ннеерциошшх htpH - мутантов е. coli и их использования в качество хозяев при создании штатов, синтезирующих белки, чувствительные к нротеодшу. 4. Исследовать природу низкой эффективности деградации:аномальных поли-поитидов в клетках с нарушенной экспрессией гена htpa. 5. Разработать новые подходы для коррекции протеолитическик процессов,

основанные на использовании антисмысловых РНК. 6. Изучить коп взтизм генов htpE и ion у различию; микроорганизмов.

Даучрая новизна. В разделе, посвященном исследованию tí крипции гена fctpB с помощью сконструированного гибридного oí • на ькраАФТ, в структуре которого экспрессия гена аминоглии фосфотрансферазы (АФТ) подчиняется регуляции промотора гона h было установлено, что транскрипционная активность промотора i htpH не зависит от температуры. Эта данные позволили прийти заключению, что индукция протеолитических процессов и синтез не являются результатом усиления транскрипции гена htpR и нг пают вследствие "включения'1 иных механизмов.

Анализу этих механизмов посвящен второй раздел работы, i тором исследовали протеалитические события и синтез БТШ в усу ях различной регуляции экспрессии гена htpR. Дш этого были сконструированы плазмццы, где экспрессия гена htpH подчинял? контролю твршлздуцибельного промотора бактериофага и n¡ тора триптофанового оперона, индуцируемого индолакриловой ки< той. С помощью сконструированных шазмид нам впервые удалось капать, что температурная индукция -промотора в плазмвде pKVLPs5 вызывает эффективный синтез БГШ и активирует протео. э на читальней, чзм это происходит в контрольнкх штаммах. Одна1 этого не наблюдалось, если экспрессию гена htpfi , находящег под контролем Trp-промотэра активировать индмэлршсвой кис.

На основании полученных результатов мы пришли к заключе; чтэ для индукция синтеза ЕГШ и протеолитпческах процессов не ходнмы два условия: увеличение содержания бэлка HtpR и кали дополнительных факторов, образующихся в клетке только при те вем шоке.

В jadoie впервые сконструирован и детально охарактеризован • эерционный термоустойчивый htpfi - мутант е. coli. Показано, з инсерцконные мутации в гене htpB легальны для клеток при ■лпературе 30°С. В последствии эти данные подтверждены работами упи авторов ( Handecki , 19Б6; Zhou et al., 1988). На основе рмотолерантного ntpB -мутанта сконструирован штамм - продукт Т7-полимеразы.

Впервые разработаны оригинальные подходы длн коррекции ютеолитических процессов, заключающиеся в использовании анти-ш еловых РНК генов htpH и ion. Полученные результаты позволи-I заключить, что снижение интенсивности цротеолиза в htpH'-му-шгах обусловлено как снижением статеза протеазы Ха , так ü еще ^идентифицированных протеолитических ферментов, образование ко-эрых контролируется геном htpH. Эти выводы подтверждены в раз-эле работы, посвященном изучению скорости деградации N -конце-ого фрагмента белка несА , где впервые удалось показать, что акошгение этого пептцца происходит только в .htpB -мутантах и е наблюдается в мутантах по гену, кодирующему протеазу Ьа (Ки-елев В.И. И СоаВТ., 1588; Kiaelev v.l. et al., 1&В8).

Завершающий раздел работы посвящен консерватизму гена utpH, да с помощью оригинальных иптегративных векторов показано, что ■еном клеток Рз. aeruginosa содержит htptt -подобна]! ген. ¡первые установлено, что антишысловая ШК к этому гону наруша-ST протеолитические процессы в клетках Ра. aeruglnoea при тепло-зом шоке..Эти данные позволяют предположить, что гони тонловох-о дока п клетках E.coli и Ps.aeruginosa организованы сходным образом. Впервые клонированы гены is. putida ; гомологичный го-

I

нам htpH и ion из Е, coll. Частично определена нуклеотидкан последовательность reim htpß r«. putida и установлена т.:олс~

гия с геном htpR E.coll.

Практической аначение работы. Сконструированные в работе рекомбинантные плазмиды и бактериальные штамж и некоторые теоретические вывода могут иметь прикладное аначение.

I. Сконструированы удобные векторные плазмиды на основ« гена а»'иногликозидфосфотрансферааы, предназначенные для клонирования промоторов. Разработан метод,определения активности аминогликозидфосфотрансферааы непосредственно в бактериальных колониях. Предложенный метод существенно упрощает определение активности фермента и может быть использован при исследовании природ* лекарственной устойчивости бактериальных штаммов и при работе с векторами, содержащими ген А5Т.

Z. Сконструированы плазмиды, содержащие промотор гена геоА . и предложен способ индукпии гесА -гена.

3. Получены плазмида, кодирующие индуцибельный синтез антисдаслогых РНК генов htpR и ion . которке позволяют снизить интенсивность протеолитических процессов в клетках i'Jcoll в 2,5 - 4 раза.

4. Сконструирована серия интегративных векторных молекул, предназначенных для клонирования генов и получения направленных уутаций в клутяах Pe.aerugtnosa . Сконструированы плазмида, содержащие гены htpH и ion из Ps.putida которые могут быть использованы для получения соответствуй-

мутантое fs.putida и

j/H'y.'i;in-¡.i ot:c!.])«!i;CLa ofux xviiC3 с i;o;.,.;uií,ij am'ucuuato^iu! ШС. ¡1 .úы,1! ¡¡ ¡;iTar.L,:u, сконструщ'-овишию в настсяи-ои расюто, ».x исчимьзумтсн в шкткугнх Aii OtíCP, ..'ишодбиопрогла.

A.Tí.aii'Uiiii рас; от;). П.чтв|<иалу диссертации оили дошгснш па: j) uxoivwux коьшроицлях Ноесопзного научно-иеследоаатольекого i;,¡-стнтуля прикладной кикробаодикш - 19БЗ, 1384 гг.; 2) конференции СССР-ГДР "Шзхшшзш' экспрессии гонов" - Минск, 1983 г.; 2) Itcooo-ьпном соьецанви "Плазмщщ резистентности, их значение в фио?ьхно~ лопш, микробиологии и ыодшиш^" - Саратов, I9U3 г.;' 4) У Вс^спиа- ' иом симпозиума "Лолекулярнио ¡доханизии 1чзнетичоских процессов" -Москва, 1У03 V,; 5) IX JJcucoüsuüm ссБикащш по программе "Ц/ша-л-дч. Гибрндию плазмвды ц экспрессия плазмодии* гоноь" - liymmo-, Í9H4 х--.; С) Двухсторонном симпозиум« СССР-Фрадада "Структура и пункции генсь" - Ноешь, I98G г.; 7) Всесоюзной конференции "Ввдс-дсиш, очистка и ыгмии оишкспшски нктшьшх соединений" - Оухуи;,, 1УЬ7 i'.; в) У1 Виьс&шш сваш.чиуио "Цодокулпрнца шздишши генетических нроа.ессоъ" - Москьа, I9H? г.; 9) ХУ1 Генетическом конгрессе - Канада, I9cB г.

дкссерташш апробирована на мо;.-лаСсратсх'110м ксялоквиуме Института прикладной молекулярной бцедолш í.lo СССР ц на кафедра генетики Лонинг^лского университета.

Публикации, По катериальм диссертации оиуфшкоьано 24 научим работы и вцп,ано три авторских свидетельства,

о^гед и стру^ту^а работу.. Диссертация каюнена на 232 страницах' машинописного текста, шдастрироьана 3 таблицами 'и 65 рисунками, состоит из аведения, обзора литературы (б гляь), результатов собственник исследований и их'^Сбсуздепц.ч (8 глав), выводом. Список цитируемой литературы сэ'ир-и-г :2?,5 и-точниной..

РЕЗУЛЬТАТУ иссяедовдшй

Ka re риалы и методы. В работе использован широкий арсенал míe ро б г.оло гкч о ск их, биохимических, генетических и тлекулярко-биолог! чесасих методов.

Выращивание и трансформация бактериальных клеток плазмидншп ДНК, выделение и конструирование рекомбинантных плазмип; налраме пнй мутагенез генов in rívo ; трансдукция генетических маркеров; внутри- и межвидовые конъюгациокные скрещивания; определение акти шости и ввделение аминогликозидфосфотрансферазы и Н1К-полимераян бактериофага 17.

ОС

Импульсное мечение бактериальных белков / s /-метионином. Анализ полипептаяов с помощью электрофореза в полиакркламидном ге ле; рестрпкционное картирование молекул ДНК. Методы ДНК-ДНК гибра лизации, определение нуклеотидннх последовательностей ДНК.

I. Влияние "дозы" гена htpR на синтез Б ИИ и сротеолити-ческие процессы

Исследование роли гена htpR в регуляции процессов протеолиз мы начали с исследования влияния высокой дозы гена htpR на елнте БТО и сопутствующие процессы» Для этого использовали штаммы е.col содержащие мультикогагйную плаэмвду рКУЗ (30 копий на клетку) с геном htpR. Эффективность экспрессии генов И! оценивали по трем критерия«: I --по степени индуцированной термотодерантносгп} 2 -по эффективности синтеза БТШ, и 3 - по увеличению интенсивности протеолитических процессов.

Результаты по влиянию дозы гена htpa на термоустойчивость счлэток Б. с oil свидетельствуют о том, что максимальная термоусте •швестъ клеток Б. сел наступает после нагрева бактериальных кле ток пру. 42®С з течение 30 мин, чгс соответствует пику синтеза £Tií

при ТОЯЛОШ! шоке. Жизнеспособность клаток уволичлшегся прШ;:рНО и 10-15 раз при предварительном прогреве культуры. Однако йтот пп-римипт не эазисйт ог дозы гейй htpR , хотя дефект в гвиа резко снижает способность клеток К.coll адаптироваться к дейетвлз высоких т-пмнератур { Tobe Т. et al., 1984).

Вкльд дозы гена htpa в терыоивдуцируемые протеолитические щюцессн оценивали по способности клеток деградировать /"Н/~пуро-мицщювпе полипептиды.

. Из полученных результатов следует, что скорость процессов ди~ градации /Ч1/-пуромициноБых полипептидов возрастает в штпшах дикого типа примерно в 4-5 раз при перемещении бактериальной культуры с 30 на 42°С. В штамме К. ooll KI65, несущего шбер-цутацию в гене htpft , наблюдается лишь незначительное усиление протеолиза. Как и в случае термотолерантноста, увеличение дозы гена kvtpii но отражается на интенсивности тер.гошшуцибельного протеолпза, хотя плазмида pKV3 восстанавливала уровень протеолиза в штаг,we t.coli KI65 с iura i. et al., 1984).

Представленные данные свидетельствуют о том, что дт оеноьш;х фенотипичоских проявления экспрессии генов ТШ, а' именно, термотолерантность и протеолиз, не зависят от дозы гена íitpH* Эти даниы.; хорошо согласуются с результатам, полученными при анализе сиитеаа БТШ в исследуемых штаммах, которые показали, что.при теплохш ¡¡¡оке в клетках B.ooii наблюдается интенсивный синтез трех ЮТ на фо«б общего подавления белкового синтеза. Однако присутствие в штамме к. coli К802 плазмид pKV3 не влияет на характер экспрессии генов IUI.

На основании этих данных было высказано предположение, что в клетках к.col i оущиствущ1 определенный запрет, контролирующий о?-церкшше продукта гена htpß или лимитируащий проявление его функ- ■ циональнык свойств.

2, Регуляция транскрипции гена ь^р.к

Проверку этого предположения мы начали с изучения регуляли транскрипции гена ЫрЕ. Для этого использовали подход, предкжог гшй Казадабоиом и соавт. (сазайаЬяа м.,;. сЬ э1., 1990). Он пред; :сматривает конструирование гибридного оперопа, где экспрессия г? выполнявшего роль индикатора, устанавливается под контрель реху; торных элементов исследуемого гена. О этой цельа нами были скон< руярованы плазмиды, удобные для клонирования промоторов и измор( их транскрипционной активности.

Для конструирования специализированного вектора в качес: индикаторного гена был взят ген адашогликозидфосфотрансфераэн (1 расположенный ■ в составе транспозона Тп5 и детерминирующий усто! ВОСГЬ 1'. канамкцину (Веек в. а1., 1982).

Гяя последовательных операций позволил получить нам плазмга содержащую ген АФТ, лишенный собственного промотора. Перед нача> структурной части гена расположен полилинкер из плазмиды риса , Клонирование в любом из сайтов полшшнкера фрагментов ДНК, соде] яапих сигналы инициации транскрипции, приводит к активации эксп] сии гена АФТ, а бактериальные штаммы, содержащие такую плазмиду, приобретают способность роста на средах с канамицином.

Специально разработанный метод определения активности АФТ I посредственно в бактериальных колониях существенно упростил про1 дуру анализа рекомбинанткых клояов (К1зве1еу V.!. е1 е1., 1985) Ветторйая плаэмщга рКР145 бича использована для клонирован! промотора гона МрН. Полученная плазмида, в которой экспрессия з АФТ контролировалась -промотором, была обозначена рКР145Н,

Гтредедеяие первичней структуры клонированного фрагмента Ж позволило обнаружить' каноническую последовательность нуклеогташ соответствующих промотору, сйлэста инициален трансляции и Л та- ^ Дон (Уига Г, е* а1., 198Л/

..-..lüa ¡-л: ■-<;'£■/ .:avvuatca cügi.^-í,»^ i'ÜA ТАЛЫХ liVfCCÍCX.'A Л-ЗС vCÍSaW AOiruiVSCx' ¡ÍCCACSGAAG CGCCAvlU.í.l ТЛ'ГСОАТГГ.Д üA.tlGA'"fl'GA á'CGACTCAC CluI 2I> Ket Thr Aap

Для опрйвелеш'я грздскрцтшошоЗ алтивкоотл промотора гена Vs бактвркалышз глсткп, содержащие плазшщу рКШ45 и находящие-оя в серешш логарифшпеской $ази роете, подгсфггди тепловоз шоку при 42°С. Через опревелошш-з интервалы ppeiwmi ог'бирчди пробы дяя определыыя зктамюсти A vT. 3 результате бито установлен«?, что независимо от температурных условий культивирования удельная активность AíT сосгавлялт примерно К ед. Однако, водя плазиидоЯ jiíPHI трансформировать клоткя coli KI56 (iitpfilGSaa ), то удельная активность АФТ возрастает примерю в 2 раза, Нескольку в г.-том не уровень ;;_ \ политической активности снижен и при 30°С, то уьел\: ченле АОТ могло бить обусловлено увеличением с« водоол"

полужизни.

Однако стоутсмы различил в активности АФТ а штатах k.cgIí KIG5 п ревертанте, полученном па его основе, тршз^ирешреиггшаг плазмидами, с генем к*Д, имеющим природную рогуляцшо, ухазш»: л-то, что возрастание активное та АФТ в е.coli 16 íi ( htj-uiCSaia ), содержащих плазмцду pKFHI45, обусловлено уекдеилш зтанокриглс:;! • htpH-промотора. Зто набхздонпа позволяет шок^ать предполо:.сг-г,^ об авторвгулящш экспрессии гена ktpR (Клселсп В,П. а соаът. Л'.-.7,-. Актшзалая троиокрйтуш htpR -проыотсра в стаи» к. coli ::ojj<o, обусловлено тем, что в этой ¡л'ог.мй при Зй°С не до«т;;г«:с1-с!г полной супрессии aiöop-jjyraiv/j ß ге.ю htpit , что er,ид:..,с..;".до-лошшЙ дефицит Золка iit¡¡: , к./ror-n.i ылнолмтштоя у-.'снш:-:','.* -Г'^:-):рлпц::и гена. Это предположен;;': по.чтпер.-.;,:!...¡л1 Данциг •-- •-•»!•.>

1S37.

3. Синтез ЕПД и протеолитические процесс» в условиях регуляции экспрессии гена htpR промоторами PR и Ггр

Результату по измерению транскрипции гена htpR сввдетельст-зуыт, что при тепловом шоке не происходит активации транскрипции. •Означает ли это, что концентрация белка HtpR в клетке - постояли величина, и регуляция экспрессии генов Till осуществляется лишь за счет образования его изоформ. В этой связи представляло интерес и следогать влияние сверхсинтеза белка HtpR на физиологические сво ства клеток, протеолитические процессы и экспрессию БШ. Для этог была сконструирована плазмида, в которой транскрипция гена htpR регулировалась термоищуцибельнш VR -промотором фага к (Киселев В.И, и соавт., 19893. .

Схема конструирования такой плазмкды изображена на рис. I. I дерээм гтапе в HinduI -сайт плазмдца рКУЗ был встроен ВашНХ-дг кер для того, чтобы облегчить последующее клонирование в штзщде термолвдуцкбзль.чого прсмотора. Источником последнего служила пла< .чада pcqV2, содержащая PR -промотор фага А , п ген термочувств! тельного CI-редрессора, которые расположены на фрагменте ДНК, orj нпченного сайтами для-рестрш:таз EcoRl и ВаяНХ. Клонирование эте го фрагменте. в ялазмцде рюгзь позволяло получить плазмвду, смекая; яолаемув структуру, которая изображена на рис. I.

Клетки К. coll К8С2, содертаиие плазмлду pKVLPR5 , подверг sz тепловому* поку и общепринятыми метода!«! оценивали синтез EIS i протеодлз. Получекнкэ данные ярздетавлены ка рис. 2. На радиоасп vjgJö геля (рпо. 2) дохло гдлеть, что гф^екглрноегг синтеза Ь7Л ю:ег.:а.х в, coli о плазккцой pKVLfK5 , подвергнуты:; тепловому о ху, значигельне зозрасгает.. Контролем в этих экспериментах служи, клеш;' Е. cell, содержание плазмиду ptJBVZ, в котврвй экспресс^ генз Т7 пелякеразы контролируется термзиндуцибельныу. гч-тТрг?тлэт:о

12 3 4

Т?

-6?

«н— -43

Радиоавтограф геля после фракционирования

полкпептидов Б. coli Ш02, содержащих плазмиды рГОдРЕ5 (2) и рКВ72 (4). Беэ-пяазкидный штамм (3). Клетки подвергали тепловозу доку при 42®С в течение 30 мин. (I) - бактериальные клетки выращивали при 3öftC.

ЕсоИ Hindi

ьяиивние ВотШ-шгае

* ЬеИ Т—571

Рис.X Схема конструирования плазмида

ром. При opneü'jii'.u: двух ирспарлтов cöpaqavT игл и-.':: игпманпс гот v'ikt, что т(к.:яерстурная обработка бактериальных клеток в ддентяч-чкх условиях в случае яягжгдч pK'<%rR5 щщуцирует а&^ктившй: синтез БТШ, тогда кш: клетки, несущие плазмкду p№V2, синтезир.у-«уе преимущественно 17 полкморазу. Измерение скорости деградации /"¿¡/-пуромкциновых полипептадов в исследуемых а гаммах показало, 1 :лазмида pKVLPR5 стимулирует оти процессы в 2 раза. Следует подчеркнуть, что нам не удалось зарегистрировать сколько-нибудь значительный синтез белка HtpR. Хотя в аналогичных условиях при помощи плазмиды pCQV2 синтез шлшогликозидфосфотрансферазы и 17 го лкмеразы достигал уровня 10-16? от,суммарных клеточных белков. В то ка гремя значительное увеличение синтеза БТШ указывает на то. что имеет место усиление экспрессии гена htpR , а отсутствие бм ка Ktpii ;:а злектрофореграмые свгаетельствует, по нашему мнению, о его высокой чувствительности к протеазам е.coli , что согласуется с результатами Роджерса, который также упоминавт о быстро! деградации продукта гена btpR (Hogers s., 1986).

Такта,1 образом, получешке результаты позволили нам предположить, что концентрация белка HtpR в клетке является тем факгоро>. который "запускает" синтез БИВ и протесяитические процессы в услс гЖ; теплового стресса. Это предположение подтвервдено в работе ( ätuus D.B. et al., 1987 ), которые установили, что при тепловс "•'■кз в несколько раз возрастает эффективность трансляции mIHK reí ■up/tn увеличивается период полужизни белка HtpR.

Второй вопрос, который тага:е закономерно возникает при апаш зе «мед&аосоя данных, состоит в сведущем. Достаточно ли толы» yi лкчрния покцггттецки белка ütpK в клетке лля индукции синтеза Ш V. прстеолиза Или необходимы еще какие-то ко^хторк. сяитоэ которк наступает при тепловом шоке? Для Ьтвзта ка ?тл вопрос мы скорстр

ироьали пяезшщу, где экспрессия гена htpK находилась под контролем i'rp -промотора. Индукция этого промотора адюдикркдовой кислотой при 30°С ке приводила к синтезу БТШ и активации протеолиза. Эти результаты свидетельствуют о том, что для полной реализации функции белка HtpK как фактора транскрипции генов 'ДЯ помимо увеличения его концентрации необходимы дополнительные условия.

4. Получение и характеристика инсерцноиногр htplt -мутанта Е. coll

Понять функцию гена.во многих случаях помогает изучение свойств соответствующих мутантов. К моменту начала данного раздела работ в литературе был описан единственный htpR -мутант к 15 (tvtpRl65fca) I содержащий амбар-стацию в гене' htpH', которая компенсируется тешературозавцаимои cynpeccopuoti мутацией. Этот штамм обладает рядом недостатков, в частности, высокой частотой ревереш! к "дикому" типу ( Cooper 3. et al., 1975).

Возможно поэтому в литературе существовали противоречивые мнения относительно функциональной роли гена htpfi. Например, группе НеГщхардта не удалось с помощью транедукции перенести ¡иутантяыи аллель htpKl6i>am цз штамма KI65 в шташд ь. coli , не содержало Гб-нц супрессорнцх тПК. Па основании этих дайн их. авторы приходят к выводу о том, что ген htpR необходим для нормальной жизнедеятельности клеток к.coil не только при тепловом шоке. Т. Юра опубликовал прямо противоположные' результаты, утьорадащио, что отсутствие

функции гена htpii не влиявт на жизнеспособность клеток при 30°С (Neidhardt l'.C., №4; v. 'iura et al., 1934).

4

Учитывая изложенное, im предприняли попытку сконструировать шеерционнип htpR -мутант ß. «и методом направленного мутагенеза in vivo. Для этого был использован метод, заключающийся в сЛ£<-

дующем: компетентные клетки Б. coil трансформируют линейной молекулой ЛЖ, содеряащеП маркер лекарственной устойчивости, фланкиро-кшный последовательностями, гомологичндаи хромосомному гену. В случае двойного кроссинговора происходит интеграция молекулы ДВХ в гомологичный район хромосомы. Искомые траноформанты-легко отбирать на селективных средах, содеряащих соответствующие антибиотики, В параллельных экспериментах нам сравнительно легко удалось получить этим методом НосА -мутанты. Что касается HtpR -мутантов, то из трех экспериментов на удалось отобрать ни одного клона с искомым фенотипом. На основании этих данных мы пришли к заключению, что в данном экспериментальном подходе существуют какие-то ограничения на процессы инсещионяой инактиваши гена htpR.

Отсутствие искомых мутантов, по нашему мнению, можно объяснит летальностью инверсионных мутаций в гене htpR. Однако, мы попытались использовать подход, который должен был резко повысить частоту образования искомых мутантов, благодаря более эффективной рекок б к нации между мутантныл и "диким" аллелями гена htpR. с этой целы в Pat -сайге, гш аз милы pKV3, локализованном в 3»-концевой част!: гена МрЯ t (¡¡¡л Елоняротп ген устойчивости к хлорамфениколу, лишенный собственного промотора. Получанная в результате плазмида ргстзсл'1 обладала способностью сообщай, хозяйским клеткам устойчивость к хлорам^ениколу за счет сквозной транскр!ппиш гена Cm с промотора htpii. Как нами установлено ранее, btpR -промотор расположен в тгазмяцо Р^З мекду участкамиузнавания рзстриктазн 01з1.

в

Б результате удаления из pKV3Citf" Glal-фрагмента, содержащего промотор, получена плазмида рКУ?СтЯ.Структура этой плззмцды показан? на рис. 3: ген Cm в ооставе штзмюш фланкирован последовательностями гена htpR. Клетки Е.еоН К802 ( гесА+ ) и HBIOI ( гвсА~);

несуцке плазмиду pKV32ms , при 35°С образовывали колонии на среде

7 9

с хлорауфениколем с частотой 5-IQ" к 10" соответственно, Как слг

дует из схемы, приведенной па рис. 3, воэмо.кны ива юрианта рекомбинации, но в любом из них появление устойчивости к хлорамфенпколу

спязано с нарушением целостности гена htpH в составе хромосомы.

H s

Все полученные сп Ар клоны обладали нормальной' термочувст-витальностью, Лтя повышенная термочувствителъность являзтоя характерным свойством для штаммов, несущих мутацию в гоне htpH , ne скольку у них нарушена репликация ДНК при повышенной температуре (Teunhiao 1'. at ai., 1986 ). Другим признаком htpR -мутации является сниже юге протеолптпческих процессов. Для определения скорости протеолитической деградации экзогенных белков в клетках полученного штамма его трансформировали плазмвдой pARl2l9 .несущей ге ШК-полимеразы фага 37, которая отличается крайней нестабильности в отлоао/ети протеаз B.ooii» Как следует из полученных данных,

в клетках дикого типа ( htpR+ 5, подвергнутых тепловом] шоку, наблюдается 3-кратное ускорение протеолиза. Этот эффект практически снимался в штамме htpR". Дополнительным доказательством ] пользу того, что снижение внутриклеточного протеолиза Т7 полимера-зн обусловлено htpR" фенотипом, являются данные по гибридизации. Fatîee нами было установлено, что ген htpR расположен на EooRi-фрагменте ДИК хромосомы к» coli. Если произошло замещение гена на ген устойчивости к хлорамфениколу согласно схеме, изображенной но рис. 3, го это должно сопровождаться появлением дополнительной KcoRl -сайта в этом локусе, так как ген Cm содержит участок узнавания этой рестргостазы.

Ka.it показали гпбрюшзпциошшэ эксперименты, в локусе хромосм ко-Г: 2îîX штамма к. coll kvit, сслергодем ген htpR , появляется сай; ДЛЯ pSCTpKKTa:-.!.' ï'cnRI.

Перечисленные дзнш-е оЕИцегельсгвуот о том, чт<? в результате проьвдекке* работу получен термотолерантный -мутант ( Kvt7 ! (мутация обелнзчен-з htpRiy у которого частично устранен кеитра,

экспрессии синтеза внутршслеточных протеаз, индуцируемых температурой. Попытки перенести мутантный аллель htpKi7 , маркированный геном CmR методом PI трансдукцш, успеха не принесли. Эти данные свидетельствуют о том, что инсерция в гон htpR сопровождается появлением сопутствующих супрессорных мутаций, которые, вероятно, обеспечивают появление жизнеспособных btpR -«утантов.

Недавно описана мутация suha , которая супрессирует делоцион-нке мутации в гене htpH. По мнению авторов, эта мутация может активировать новую систему транскрипции, отличную от -32, которая обеспечивает экспрессию генов теплового шока (ТоЪе Т. et al.,1987).

После опубликования результатов нащих исследований по получению инсерционншс мутантов htpiT (Киселев-В.И. и соавт., 1987) nb-

явилось сообщение, в котором бшо показано, что делециошшо и ин-

>

серциошше мутанты htpH" сохраняют жизнеспособность лишь при температуре культивирования ниже 20°С (Zhou Y. et al,, 1988).

При переносе мутантов на температуру 30°С наблюдается остановка роста, филамеитация и частичный лизис - бактериальных клеток. Таким образом, эти данные объясняют низкую частоту образования htpK-ыутантов в нашей экспериментальной модели и термотолерантность штамма KV17 , т.к. селекция мутантов проводилась при температуре 30°С.

С учетом данных £hou et al. мы попытались получить инсарци-

_ О

онные мутанты htpR , используя цлазмаду pKV3Cn> , отбирая клоны с фенотипом Сшк при температуре 17°С. Оказалось, что эффективность образования Cm14 -клонов при этой температура равнялась

КГ5, тогда как при 30°С клоны, устойчиша к Cm f образовывались с частотой

5, Исследование природы низком аМ.пктпрноста деградгздии аномальных полипоптидов в клетках с порученной функцией гена htpR

Основная роль в протеолитическоч логралащи аномальных и гете^ рологичннх белков в клетках coll приписывается протеазе La ( Goldberg A-i983t 1985). Ген ion , кодирующий эту протеазу, аходит в состав регулона теплового шока и подчиняется htpK -зависимой регуляций. Возникает вопрос: обусловлено .ли сгакшште интенсивности "протоолиза в htpR -мутантах только неэффективным синтезом протеа-зы La или в этих процессах задействованы другие протеолитическиз ферменты, синтез которых имеет htpR -зависший характер.

О

Вэйкером было показано, что скорость деградации /^/-пуромици новых полипептвдов существенно ниже в двойных мутантах (htpR , ion) чем в клетках, несущих только мутацию в гене ion (Baker, 1984). В этой связи представляло интерес провести сравнительный анализ влияния антисмысловых ШК генов htpK и ion на протеолитические процессы в клетках Е. coli. Длазмцяа, содер™а^ая ген Ion бша .любезно предоставлена В.К. Антоновки (ИЕХ АН СССР). Физическая карт; гена ion представлена на рис. 4. Сегмент ДНГС, расположенный ыежд: сайтами узнавания рестриктаз Hpal и Hindin содержит 5'~концевую область гена, а именно, область инициации трансляции, и начало , структурной части. Для антисыысловой регуляции экспрессии гена loi была оконстру1фована плазмида pUCl9Al , которая кодирует синтез FKK, комплементарной 5*-концу РНК гена Юл. Схема конструирования плазшуш приведена на рис. 4. Фрагмент ДНК гена loa , Еыщепляемы рестриктазами Kpal и Kindiii был клонирован в ptfci9 , предвар: тельно гидролизованной рестркктазами Snal к кшаги.

В полученной плазмиде рис1ЭАЬ транскрипция фрагмента гена loa осуществляется с про.\:оторз 1ас, з результате чего ín vivo

Ion-ген

Hndl №1 h—j-1,-1-h—I

EcoRI Mpal Spill

4. Cxei/a конструирования плазмида ?иС19АХ,кодирупщей антисшсловую RiK гена Хог.

Рис. 5. Схема конструирования плаямиды г,¿£12, кодирующей синтез аятисмысловой РНК гена Ыгра

должна синтезироваться антисмысловая HIK. Эффективность влияния образующейся антисмысловой ШК на экспрессию гена ion бша проверена в следующих экспериментах. Штамм E.coil ABII57 трансформиро вали плазмикой' pUcl9AL , после чего оценивали по стандартной мето дике скорость /"%/-пуромициновых полипептвдоз. В параллельных экспериментах подобному анализу были подвергнуты штаммы е. coüABIIS" с плазмидой рис19 и Lon-мутант ABII89. Результаты экспериментов показали, что скорость деградации /3Н/-пуромициновых полипептидов Е штамме, несущем плазмвду рис 1 sal , практически приближается к таковой у Lou"-мутанта.

Схема конструирования плазмиды, кодирующей синтез антисмысловой IHK гена htpR , изо бранена на рис. 5. ДВК плазмиды pKV3Cms гидролизовали рестриктазой Clal, "липкие" концы достраивали с по-мощбю фрагмента Кленова в присутствии антр, затем ДНК обрабатывали рестриктазой BamHl и полученный препарат фракционировали в Ъ% ПААГе, фрагмент плазмлдной ДНК, содержащей 5'-концевую часть гена htpR, элюировали из геля з клонировали в плазмиде pCQV2 (рис, 5К Эта плазшща содержит PR -промотор бактериофага А , активность ко го poro контролируется термочувствительным CI-репрессором. При 30°С транскрипция о PR-промотора практически отсутствует. ДНК плазмиды pOQY гидролизовали рестриктазой .Snel , однонитевые концы достраивали , фрагментом Кленова и затем гидролизовали рестриктазой BamHl. Этот препарат ДНК смешивали о элшроваянил фрагментом плазмиды pKV3Cms, лидировали и использовали для трансформации клеток E.eoii ABII57. При 42°С происходит дерепрессия PR -промотора, вследствие чего рексмбйнантше ппазмкды, содериадие 5'-концевую область гена htpR в обратной ориентации будут направлять синтез антисмысловой №К. Это должно сопровождаться появлением у соответствующих бактериальных клоков HtpR -фенотипа. Описанная процедура позволила получить нам плазмида pAsia^ кодируицую синтез антисмысловой РНК гена htpR.

- iiö -

Сравнительный анализ влияния плазмдл püöi9AL и pASl2 на скорость деградации аномальных белков показал, что плазмида рАз12 примерно в 2 раза эффективней снижает интенсивность этих процессов. Эти даннне позволяют предположить, что htpR -мутация помимо экспрессии гена Ion нарушает синтез еще каких-то протеаз.' Этот вывод подтвержден нами в другой экспериментальной модели.

Ранее в нашей лаборатории была сконструирована плазмида pKFI45R, где экспрессия гена АФТ подчинена контролю геоА-промотора

(Киселев, 1986). Промотор гена гесА был клонирован в составе НаеШ-

»

фрагмента ДНК, содержащего область инициации транскрипции, sos -бокс, sd -последовательность, atq-кодон и 150' нли, кодирующих 50 аминокислотных остатков Я-конца белка НвоА. В" клетках E« coli К802 (íeoA+ ), несущих плазмиду pKPI45R, яри внесений в культурша-нуго среду налидиксовой кислоты в концентрации 40 мкг/мл наблвдает-ся 6-7-кратное усиление синтеза АФТ. В аналогичных экспериментах, постааченных со штаммом Е. coli ivt? {recA+ , htpRi7) регистрировалось лишь очень незначительное увеличение- активности АФТ. Измерение УФ-чувствительности исследуемых штаммов показало, что облучение клеток Е. coli К802 и KV17 ( htpR") в дозе 40 J/м2 имеет одинаковые последствия для обоих штаммов (рис..В), Однако эти же . штаммы, трансформированные плазмидой pKPI45R, отличались по признаку УФ—устойчивости (рис. 6). Следовательно, на.фоне мутации htpRl7 плазмида pKPI45R нарушает Sos-функции клеток е. colt. . Этот эффект наблюдался также при трансформации' плазмидой pK?I45R штамма ki65 (htpRl65Ain ). Аналогичный факт был отмечен ранее (Sedgwick s.s. and Tarranton G.I., 1982 ) прй Изучения свойств ре-«мбтшаитнкх плазмид, имеющих похожу» структуру. Ими установлено, что приз Hai; чувствительности клеток к УФ-облученио, контролируемой плазмадой, обусловлен синтезом укороченного белка ReeA.

101

10"3

tes-

HtPR+

\ -x^HtPR

Y A-HtpR+pKW5R 4 A"-HtpR~pKPVfôR

20 40 60 Лж/м»

Fflß. y<i>-'lyBCÏÛ]IÏOJi]>!IOOÏJ, ÔilKïCjmiUilIX iaTtVJMQH.

Для объяснения обнаруженного эффекта в качестве рабочей гипотезы мн предположили, что УФ-чувстштельяость штаммов Е. coll , несущх мутацию в гене htpR , обусловлена увеличением стабильности концевого домена белка КесА , кодируемого плазмидой pKPI4S;.

Для проверки этого предположения мн применили два-подхода: во-первых, была сконструирована плазмида, где экспрессия гена АФТ контролировалась промотором гена гесА , лишенным сегмента ДНК, кодирующего н-копцевуго часть бежа HtpR. Во-вторых, была исследована стабильность н-концевого домена в штаммах "дикого" типа и мутанте KV17. '"

Схема конструирования плазмщш представлена на рис. 7i Промотор тесА гена, клонированный ранее в плазмиде pKPI45R, ограничен с 5*-конца сайтом для рестриктазы EcoRX. На расстоянии 8 нуклеоти-дсв от инициирующего кодона АТЗ расположен участок гидролиза рестриктазы Taqi. Таким образом, элюция EcoRl-íaqi- фрагмента ДНК позволила выделить нам промотор гена геоА. Этот фрагмент быЯ клонирован в плазмиде pBR322 , гилролизованной реотриктазами EcoRI-Clal (см. рио. 7). В результате была получена плазмида НРТ.4, в ко-

D

торой ген устойчивости к Тс бьш заменен на ген Km из транспозона

■ jj

Для этого шгазмиду pBRKm2 (источник гена Km ) гидролизовали рестриктазой Bglii (фермент отделяет структурную часть гена от области инициации транскрипции), липкие когщы достраивали фрагментом Кленова в присутствии dNfp и затем гидролизовали рестриктазой. Hindin, выступающие 5»-концы достраивали как и. в случае плазшщн рВЕКш2 и затем гидролизовали рестриктазой Sali. Препараты плазмвд смешивали, лигировали и трансформировали компетентные клетки е.coli К802. Опиоанлзя процедура позволила получить гиаэмкду pRK2 , тлеющую лелеемую структуру (см. рис. 7)., Плазмидой рНК2 трансформировали yjip.fки E.coii К302 htpH+ и htpP". Траио^ормздты выращивали в L -среде до A^q-C.S и э орзду внеопле нэлкдкгЬову»: кислоту до

EcoRI Töql EcoRL £

M66CTATCGÀ450HJ, EcoRI CLa Г

BgLH ть5

Рис. 7. Схема конструирования плазмиды pRK2.

- kt -

концентрации 40 мкг/мл. После 6 час индукции бактериальные белки ! анализировали в полиакрилампдном геле. Результаты эксперимента представлены на рис. .8. Как следует из данных электрофореза» в следуемых итаммах наблюдается эффективная индукция синтеза А5Т (мол. масса АФТ равняется 27,5 кД). Видно, что в соответствующей зоне геля имеется полипептид с аналогичной молекулярной массой (см. рис. 8). Таким образом, экспрессия гена АФТ в плазмидв рП£2 не зависит от генетических характеристик хозяина.

Полученные результаты дозволяют заключить, что признак УФ-чув-ствительности и слабая экспрессия гена АФТ в htpR -мутанте E.ceil детерминируемые плазмвдой pKPI45R, обусловлены сегментом ДЕ£К. кодирующим 50 н-концевых аминокислот белка. Если .этот эффект проявляется только на фоне htpR -мутации, то логично предположить, что он обусловлен повышенной стабильностью Н-концевого пептида, т.к. известно, что в htpR -мутантах снижается эффективность деградации аномальных белков (Goff s.a., 1905 )» Для проверки этого предположения белки штаммов E.coli К802 htpR^n htpR", содержащих плазмиду рКН45в, метили /®з/-метиониноы в присутствии нали-диксовой кислоты. Фракционирование белков поводили в градиентном полиакрилампдном геле (7-25$) с последующей радиоавтографе^ при ~70°С усиливающим экраном в течение 10 дней. Эксперименты показал-.', что в зоне геля, соответствующей положению белков с мол. массой 5000 Д, наблюдается продукт, который отсутствует в препарате бчл-ков штамма в.coli "дикого" типа. На основании этих данных dano одзлапо гпктядашге о том, -что з htpR -мутанте .в.coli увеличивайся период иолужизни if-конпеэого >$рзгмснта белка К«сА , чго усиливает его модулирующий эффект по отношению rc ßG'! -г^ункцияи бактериальных клеток. Связана лн стабилизация Я-концевоГо даггка белка аесА с низким содержанием прстеззы Ьз в htpR -мутзи?г дай нзкоплзкие к-колцеввго фрагжентз обусловлено тем, чт«з g-htpft-

ftic. 8, Электрофорез бактериальных, белков в 10/2 ПААГе: I - ü.coli К802 + pKPI45ir + НаХ, 2- Ii.coli.K802 + ;KPI45h' без Mal.

3 - ii.coll KV 17 + рК*2 + uttl,

4 - К.coli KV17 + I&K2 О'ез Kai.

лутанто нарушай синтез неизвестной экзопептилазы?

Для проверки этого предположения был проведен сравнительной анализ стабильности н-концевого фрагмента белка ЕесА в htpH" н LoiT-мутантах. О стабилизации пептида судили по двум критериям: [. Накоплегаю пептида в условиях импульсного мечения белков исоле-хуемьк штаммов с последующим фракционированием в ПААГе и ралиоав-гографиай бактериальных полипептидоа. 2. Экспрессия гена аминогли-отзцдфосфотрапсферазн в составе гибридного оперояа гесА:АФГ. Известно, что при продолжительной индукции sos генов у ХогГ-мутан-гов наступает филаментация и гибель бактериальных клеток. Поэто!гу лн применили иную тактику работы, которая заключалась в кратковременной индукции транскрипции промотора гвсА. Клетки, содержащие шазмиду pKFI4Si, выращивали на минимальной среде с необходимыми Юбавками до Ag5Q=0,4-0,5 , после чего в среду вносили гионип (100 мкКд/мя) и налидиксовуго кислоту (40 мкг/мл). После 20 жш инкубации клеточные белки анализировали в градиентном ПААГе о гаследумщей радиоавтографией геля. В описанных экспериментальных условиях нам не удалось зарегистрировать накопление продукта с характеристиками л-конце во го фрагмента белка НесА.. Экспрессия reía АФТ в 1оп~-мутант9 с плазмвдой pKFl43t твкде практически не от-ппалась от штаммов "дикого", типа, что является косвеннда указанием на быструю деградацию.пептида.

На,основании представленных данных мы сделали вывод о том, что я-концевой Фрагмент белка RecA не является субстратом для протез-зы La, т.к. мутация в гене ion не влияет на е£о содержанке в бактериальных клетках. Таким образом, повышенная стабильность н. -конце-joro домена в htpR -мутанте B.coli , вероятно, обусловлена стсут-ггвием (или низким содержалиам) в этом штамме неидентифицированная юптццазы. - йи-эмпяско, это свсйстда KtpR.~MjraHTC& окажется полчзкт фн создании штаммов, прбяуиирук&их биологически активнее пептяды.

6. Консерватизм гена htpR

Гены теплового шока являются одной из наиболее консерьативк: гзлетичсских систем ( Lindqulst s., I9S6), В частности, ген, код рущий 70 кД БТШ животного происхоащешш, имеет 50$ гомологии с геном dnaK из Eacharictiia coli (Hardsell 1.0., 1984).

Э. Краиг установила, что имеется па только структурное, но : функциональное родство между геном dnaK и соответствующим геном у дроккей (Cruig Е., 1934).

Каноническая последовательность нуклеотидов, обнаруженная в регуляторной области всех генов теплового шока дрозофиллы cruGAATiïxcï-AOA, объединенная с ^acZ —геном, делает термоивду бельнш синтез £> -галактозвдазы в дрозжах, cos -клетках обезь И В овоцитах вьюна ( Wei R., Wilwinaon H. et al., 1936).

Однако за исключением s. coli , сравнительно мало известно структуре и принципах организации генов теплового шока шкроорга низмов, в том числе генов, ответственных за генетический контрол: протеолитических процессов.

Для исследования консерватизма гена btpii у различных ыикро оргышзмов, соответствующие препараты хромосомных ДНК (10 мкг) г: дролизоьали роотриктазой ЬсоНХ , фракционировали с 0,8£ агарном геле, денатурировали и переносили на штроцедладознш фильтры. Д гибридизации использовали Hindllï-Pvull-фрагмент плазыцда pKV3, ыечешшй методом "тж-траисляции". Kau следует из иолу чинных дан них, гомолог гена htpK содержится в геноме клеток P«. aaruelnou и l'a. putiàd. Пря-.ьм доказательеглом функционального родства эти iv.iiûB явилось бы получении HtpK -фенотипа у зтих шташов а случ направленного нарушения структура htpV. -подобного гона.

Ранее наш сконструирована сиршх шгсзд'х&тишшх шгазмад дня клеток Pseuderoonas aeru^inflsa tja основе плаэмидц pßR325, соде

чащих mob-район плаэмшш НГ4 (Киселев, 1988). В этих плазмидах били клонированы фрагменты хромосомной ДНК Pa.aeruginoea. Одна га этих плазмид рКАРЗ содертег в участке узнавания рестршстазн Pstl фрагмент хромосомной ДНК Ре. aeruginosa размером 1,3 kb ;г четыре уникальных сайта для рестриктаз b'coRl, Hindlll , BtwHi , Saiei , что делает ее удобной при использовании в качестве вектора. Если этой плазмцдой трансформировать штамм Е. ooll S17 , в хромосому которого встроен xra-оперон плазмцды ВР4 , то при коныогационном скрещивании штаммов E.coli S17 , несущих эту плаэ-мзду, с клетками Fa. aeruginosa , происходит эффективный перенос плазмид.„Спасение плазмидн, неспособной к автономной репликации, может быть достигнуто за счет интеграция в хромосому хозяина.

Прямого нарушения структуры гена htpR Pa. aeruginosa нам достичь не удалось, вероятно, потому, что htpR -мутация летагана.

В связи с этим мы предприняли попытку воздействовать на экспрессии гена htpR с помощью антисмысловых ИЖ. Для этого бнла сконструирована плазмида, кодирующая синтез антисмысловой ГНК, соответствующей 5'-концевой части гена htpR.

Схема конструирования изображена на рис. 9i. .Плазмиду ;KVCn, содержащую в структурной части гена htpR , ген устойчивооти, гюх-ролизовали рестрпктазой Clal. Выступающие 5#-концы достраивали с помощью фрагмента Кленова в присутствии ОТТР и затем глдроллзпг'-ли рестриктазой Вашыг.

Орагмеят ДНК, содержащий 5'-концевую область' гена htpii , элю:: роняли из агарозного геля. Плазмиду рКАРЗ расщепляли рсстристлзой saiGi, Tiny.vi- кошт достраивали с помощьп фрагмента Кленова и dWTP, После гидролиза ДНК плапчют рКАРЗ рестриктазой ВчвЯ1, полученный препарат смекивзля с глюкровзккни фрагментом плазчиды рК^З'.'-я, ди-гиреазяи и использовали для трансформации компетентных кяетв«:

Е, col 5 ЙВ 101 ,

EooRI

"aal

— — л

Sally 3

Bam HI

:хе;ла коЕстяучрсвшто .пяазшдн pSAS7, ксдкружей аиивдамяаеуэ И

гек& htPR к Е» coli Е клетках ÏS. putiüa.

S R

Для дальнейшего анализа быта взяты Си Те° -трансформанги, пмекище пониженную скорость роста при 42°С. Этот признак, как установлено ранее, появляется при синтезе антисмысловой РНК гена htpR и является характерным для htpR -мутантов е.coli. Все термочувствительные трансформантк содержали плазмвды с фрагментом ЛЗ'К гена htpR , клонированным в обратной ориентации.

Транскрипция гена Тс?, в котором клонирован фрагмент ДНК из плазмвды рКУЗСт, направлена от сайта Hinaill к сайту Saioi.

п

Следовательно, под контролем промотора гена Тс будет осуществит -ся синтез антисмысловой РНК гена htpR. Этот г§нетический пригм позволяет снизить экспрессию гена, сохранив минимальный, необходимый для жизнедеятельности уровень синтеза белка HtpR.

Одна из плазмид, обозначенная pSAS7, была использована в дальнейших исследованиях. При конъюгационном скрещивании в>, colt' S17, несущих плазмиду pSAS7, и клеток Ра.aeruginosa , были получены клоны Рз. aeruginosa , устойчивые' к хлорамфениколу. Еслт,-

R О

•шнотво Си имело замедленную скорость роста. Как при 30 С, так и при 42°С по сравнению с Сгав-трансконъгагантами, полученными с помощью плазыиды рКАР.

Как уже упоминалось, одним из свойств htpR -мутантов е.all является низкий уровень протеолктической активности в условиях теплового шока.

Протеолитичзские процессы в -трансконъюгантах, несуцих плазмцду PSAS7, оцепивачи по скорости деградации /%/-пуро.уици'но--зых полкпептидов.

Как следует из полученных данных, скорость деградации Л^/-' луромтоиковух полипептидов е штамме Рэ.aeruginosa с плззмягой РКАРЗ возрастает примерно з 3 раза при перемещении бактериальной культура с 30 на 45 С. В трансконыогантах ps« aerug^oea , содержащих: плазмиду, активация пратеолизэ пуремкцкневЕг полипсптадоч

при тепловом шоке били в 2,5 раза мение выражена.

Таким образом, синтез витиамиолопоИ HiK icna in^i. и.coli ± клетках Ре. aeruginosa вызывает появление двух признаков, свопс: венных для htpR-мутантов: тордачувствительность и ошшзнио скорости деградации аномальных белков. Вероятно, продукт htpR -поде но го гена необходим для нормальной жизнедеятельности Ps.aerugino не только в условиях теплового шока. Поэтому нарушение феноткикче ской экспрессии этого гена за счет инактивации транскрипта в дуплексе с антисмысловой РНК снижает ростовые свойства клеток и при ЗС°С. Инсерционное нарушение гена, по всей видимости, летально да клеток, поэтому для коррекции протеолиза необходим индуцибельный синтез антисмысловой РНК.

7. Клонирование гена Pa. putida . гомологичного гену htpR 1^3 S« coli

Как установлено нами ранее, фрагмент ДНК гена htpR из Е. coli гибрвдизуется с хромосомной ДНК Ps.putida. Однако, эти данные н являются достаточным основанием для заключения о там, что этот гомолог выполняет функции, аналогичные гену htpR в E.coii. Док зательства функционального родства этих генов имело бы ванные пр ктические последствия, т.к. нарушение экспрессии reHahtpH лозь лнет существенно снизить протеолитаческие свойства штаммов и тем самым увеличить выход чужородных рекембинантных цолипоптидоз (¿off s.a.. et ai,, 1985). Учитывая перспективность штаммов Ра. patiöu как бцотихиологических объектов, мы предприняли попытку клонировать liti-.Ji -подобию'! ген из Ра. putida.

Библиотека генов ?а. putida быяа сконструароьана на основ? (¡азмиди püi,5 (Яшсонский и др.. 1987).

В качестве зонда для гибридизации использовался Clal-Pvuli фрагшш-.-л плазцц'ш pKV?, содержащий почти всю стдуктуриу" час.

гена htpR. После скрининга 20000 клоноз удалось отобрать 5 клопе?, дававших положительный сигнал при гибридизации. Одну из фазмид (pWH7 ) использовали в дальнейших экспериментах. ДНК фазмшш pWH7 гидролизовали рестриктазаш Hpal и Kpnl , фракционировали в 0,Е£? агарозном геле и переносили на нитроцеллшоэяый фильтр.- Результату

гибридизации ДНК космидн PWH7 , иммобилизованной на фильтре, с

3?

P-CIal-Pvuii фрагментом плазмлды ркуз приведена на рпс. ю.

i

12

Рис. Ю. 1Ъбшдпзация ДНК фазмгаш ... _ Oí О Oft pWH7 , гидролизованной ре-

ШШ ¿i¿.¿.KJ стрикЛзагли Hpal (I) и

tr</íQ Kpnl{214 с фрагментом

, , О ДНК гена htpR из Ш1азм1щк

pKV3. Размеры фрагментов ДНК указаны в тыс. пар оснований.

2027

Как видно из радиоавтографа, гомолог гена htpR расположен на фрагменте ДНК размером 500C н.п., который образуется при гидролизе фазмиды рестриктазой КрШ. Следует, однако, отметить, что гомология меящу генами, обнаруженная в гибридизационных экспериментах; далеко не всегда свидетельствует о родственных функциях этих генов. Поэтому были поставлены эксперименты по комплементации мутации htpR165am ллазмвдой рЬС1 , содержащей Kpnl фрагмент фазмиды pWH7 , которые дали отрицательный результат.

Отсутствие комплементации может быть обусловлено несколкжм причинами. Во-первых, в литературе имеются указания на низкуто эффективность экспрессии генов бактерий рода Poeudomonas в клетках В, сои (АХ]an з. et al., 1983).Во-вторых, нельзя исключить,'что Е пяазмцде vьс1 содержится только часть гомологичного генз. В отзп с этим была предпринята попытка более точной локализаций гомолога гена htpR путем определения его нуклеотядной последовательности. Для этого Kpni-фрэгмент алззмкды pL~1 еырёзался рестряктаэвмк ЕсоЯ1 и BartHX и клениревэлся пс соответствуярм сайтам .в фэге

щЗмр18. Далее, используя метод Р. Дэйла , 1985 ) öua. п

лучен набор делещгашшх вариантов рекоыбннантного jara, содержал; го гомолог гена htpK. В результате проделанной работы нам удалой, локализовать 3»-область искомого гена, которая отстокс от сайта растриктазы üindill фага КПЗ на 246 нуклеотцдов.

Последовательность'аминокислот G-концевой области обнаружен ¡toro полипептида, написанная на основании полученных данных, пре, ставлена на рис. II.

l'sputida - METLysLysLeuArgVaJAlalleGlyAla— fatpR В .coli - MBTLysLysLeuArgAlaAlalleGluAla

Рис. II. Аминокислотные''последовательности, кодируемые 3*-кондовыми районами генов htpR из Е. coll и Pa. putida. Подчеркнуты 'отличающиеся остатки.

Обнаруженная гомология позволяет заключить, что нами клонир ван ген, гомологичный гену htpB из Б. ooli. Поскольку 3»-конец этого гена примыкает к сайту Hindlll рекомбинантного фага, а ра мер всей вставки ДНК Св. putida составляет примерно 4,5 kb, то можно с увзренаостьи сказать, что фаг содержит полноразмерный ге Следовательно, отсутствие комплементации мутации htpKl65am обус, ыено или низкой эффективность» экспрессии гена, или затруднении в сборка ЙЙС-полимеразц новой'специфичности.

й. Клощцдванпо гена Pa. putida . гомологичного гону Ion-из К. coll

Традиционным' объектом биотехнологии является кшвчная палоч шеста с тег.!, с кшим годом возрастает, интерес к поиску новых объектов, ■ обладающих лучшими'технологическими xápaKTepHCTn«af,m.

I этом отношении одним из перспективных направлений следует считать сслсдованяе бактерий рода Pseudomonas. Способность этих микроор-'анизмов усваивать самые разнообразные субстраты может оказаться юсьма полезной при создании продуцентов на их основе.

К сказанному следует добавить,' что для некоторых генов энте-

сбактериального происхождения обнаружен аффект "сверхзкспрессии"

ри переносе в клетки бактерий рода'Pseudomonas (Saksguchi К. at

а., 1982). Это обстоятельство позволяет надеяться на эффектив-

гую экспрессии генов, имеющих "аппарат" транскрипции и трансляции

f.

отечной палочки. Вероятно, при синтезе гетерологичных белков в я.putida могут возникнуть проблемы, связанные' с их протеолитиче-iKoil деградацией. В связи с этим представляли интерес эксперименты, направленные на поиск в геноме Рэ. putida генов, гомологичных 'ену ion.

Гибридизация Hpal-Hpal(I) фрашента ДНК гена Ion (см.рис 13) : хромосомной ДНК Ре. putida показала, что гомологичный ген рас-иложен на фрагменте хромосомной ДНК размером I0-I2 kb (рис. 12).

х, 2

. " ■ ' 21. Рис.-12. Гибридизация Hpal-lipal(I) фраг-

мента ДНК гена lon из в.coli ттт с хромосомными ДНК E.ooiui)

■ja и Ps.. putida (2), гидролЕзо-

• ванными рестршстазой Hpal.

Ш ' "

*

локирование гомологичного гена проводили по следующей схеме; в ■ачестве зонда при цервячнсм скрининге библиотеки Генов был азят Ipal-fipal(I) фрагмента lon .(рис. 13). Выбор, этого фрагмента, был ¡буслсвлвя тем, что этот район гена lon ксдлруе? консервативный ймен, ответственный за связывание АТЧ (Baker гл.е., 158?). Года-

- эе -

логия на уровне аминокислотной последовательность обнаружимте/, в этой области у многих белков бактериального и живзтного происхождения, которые реализуют свои каталитические функции в присух ств1щ А'ГФ.

EcoRj Ato Hiwdffi Pstj Kp»l Bam Hj Hpal stppPstí * HpA ' Hpal Salí 1

i_._il.__________ii—zzz;-"

0 I Ш

iooolm

■- *->

Pac. 13 , Рестрикционная карта гена ion.

При первичном анализе рекомбинантншс фагов было обпаруз&шо 5 клонов, гибридизующихся с Iípal-Hpal(I) фрагментом гена ion. Зь-тем ДНК этих фагов гибрадизоваля с Нра1-йрзКП) фрагментом гена ion, кодирующим ií-концэвую часть и фрагментом Hpal-Sptii , кодирующим С-концевую часть протаиназн La (см. рис, 13). В результат* отих экспериментов было отобрано два рекомбинантных фага, эффективно гибридиэующихся о различными фрагментами гена ion. ДНК одш го из 1шх использовали для дальнейшего анализа. Результаты гибридизации приведены на рис .14.'

1 2 3

.ц-'-чЬ.-,, Рис. 14 .' Рибрщшзашш ДНК фазыиды раьЗЗ, гидролизовашюй рестриктазами **** 2.8 Н1ш 11(1), Hin/iiii(2) и Hpal

1 •■ , ' (3) с Пра1-Нрц1(1)-фрагаинтш .< i гена ion. Размеры фрагментов • указаны в тио. пар оснований.

Г"'

г ■ .

Из представленных данных следует, что ДНК-зонд на центро/шну часть гена ion из . e.cúií эффективно гибрвдизуотся с muaiii-фрагментом фазмзды размером 2,8 kb. Этот жо фрагмент ДНК давал сигнал при гибрадтзшаш с зондажа на К и О-концевш части гена ion.

Трансформация штамма ABI889 ( lonioo ) рекомбинантной фазмщ"'1 не приводила к восстановлению протеолитических функций мутанта. Однако тот факт, что гомолог из Рз. putida эффективно гибридизу-ется с различными сегментами гена Ion позволяет надеяться, что нами клонирован ген, кодирующий АТФ-зависимуи протеиназу Pa.putidn,

i

вывода

1. Сконструирован специализированный вектЛр, предназначенный для клонирования промоторов, в результате встраивания которых происходит восстановление экспрессии гена аминогликозидфосфотранс-феразы (АФТ), лишенного собственных регуляторных элeмeнтoв¿

Разработан оригинальный метод определения АФТ in situ , который защищен авторским свидетельством.

2. Клонирован промотор гена htpR. Установлено, что транскрипционная активность промотора htpR в составе гибридного оперона htpR:АФТ не индуцируется температурой, но возрастает на фоне мутации htpRl65am. Зто наблюдение позволяет высказать предположение об авторегуляции экспрессии гена htpR.

3. Установлено, что синтез БТШ и протесшттические процессы стимулируется, если экспрессия гена htpR регулируется термоинду-цибельным промотором. Однако индукции протеолиза не наблюдается, если ген htpR поставлен под контроль температуронеэависицого промотора. Эти данные свидетельствуют о том, что температура стимулирует образование неких дополнительных факторов, которые требуются для "запуска" экспрессии регулона теплового' шока.

4. Разработаны подходы для направленного мутагенеза in vivo гена htpR. Получен инсерционный мутант htpR~; имзю^ий сниженный уровень протеолиэз.

5. Изучена юзмокность регуляции экспрессии гена htPR с помощью антисмысловых (ас) ,РИК. Установлено, что синтез асИПС нарушает ростовые свойства клеток E.soli при 30 и 42°С. Ллазмида pAS12 с регулируемым синтезом асЕНК в условиях теплового шока снижает интенсивность протеолиза аномальных белков более чем в 4 раза. Эти данные указывают на то, что ген htpR является одним из клачевых генов, контролирующих в клетках е.coli протеолитические процессы.

6. Сконструирована плазмида PUC19AL , кодирующая синтез асШК гена ion. Протеолитическая активность штамма, содержащего эту.плазмиду, приближается к мутантам Ion".

Сравнительный анализ протеодитической активности штаммов, содержащих плазыиды pUC19Al и PAS12 .показал, что антисмысловая Pi ¡К гена btpR.' приводит к более глубокому нарушению протеолитиче-ских процессов, чем асРНК гена Ion.

7." В гибридизационных экспериментах показано, что хромосомы Pa.aeruginosa ц Pa. puticla содержат гены, гомологичные гену htpK из е. coli. Антисмысловая НДС гена btpR ; из в. coli , синтезирующаяся в клетка,х Pa. aeruginosa , нарушает у них термоиндуци-белыше протеолитические процессы. Эти данные позволяют предположить функциональное родство гомологичнцх генов.

8. Клонирован htpH -подобный ген Ре.putida и частично определена его нуклеотидная последовательность. Показана значител*

нал гомология в З'-концевой области с геном htpR из coli.

S. Клонирован гомолог гена' Ion цз Ра. putida.

10. Проведенное исследование свидетельствует о значительной гомологии генов, контролирующих протеолитические процессы в щитках К. ooli , Pa.aeruginosa и Ps.putida. Полученные данные создают реальные предпосылки для управления процессами дегридавд ацомсишшх и чужеродных белков в этих микроорганизмах.

Автор выражает благодарность профессору Е.С.Северину за внимание и помощь в работе; В.О.РечинскоМу за помощь в экспериментальной работе и ценные советы; Л.Г.Чистяковой, Д.Пачкунову, Е.Астаикину, Ю.Мануйлову, Н.Шаниной за сотрудничество в экспериментах.

Автор благодарен д.б.н. В.А.Ланцову за критические замечания и конструктивное обсуждение.

СШСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Kiselev T.I., Denisova G., Kiselev 0., Ishenfco A. and Polyancv-sky 0. Immunochemical identification of products of the mitochondrial cytochromoxidase gene expressed in E. coli cells. Immunology betters, 1982, v.4; I4-5-I4-7.

2. Kiselev V.I., Gorkun A.F., Rechinsli "7.0. Assay of-'aminoglycoside phosphotransferase in situ. Analytical Biochemistry, 1965, v.146, 434-436.

3. Киселёв В.И. Рвчинский B.O., Черная Д.С., МануРлоя Ю.А., Ершов Ю.В. Восстановление активности гена устойчивости к тетрациклину пяазмины pBRS 188. - Молекулярная генетика, 1985,

1« 2, 14-17.

4. Киселёв В.И., Яэчинский В.О., МануРяов Ю.А., Пвчкунов Д.Н. Конструирование векторов для клонирования регулятсрннх элгм?н-тов ДНК. - Молекулярная биология, 1985, б, 1546-1552.

5. Киселёв В.И., Астагкин Е.И. Клонирование промоторов генор

■??о А и hfcpP. Escherichia coll И их функциональная хчрапт«рт!-~ тта. Шпериаяы ВсесотзноР конференции "Экспрессия лляргшгжлг гонор". IbiTHHo, 1985, ^-79.

Q. Киселев В.И., Горкун А.Ф., Асташкин Е.И., Пачкунов Д.М. Синтез аминогликозидфосфотрансферазы под контролем PL -промотора, фага А . - Молекулярная генетика, 1986, № 5, 20-23.

Z. Киселев В.И., Асташкин Е.И. Экспрессия гена аминогликозидфосфотрансферазы под контролем промотора геоА. _ Молекулярная биология, 1986, т.20, 1008-1013.

• У. Киселев В.И., Речинский В.О., Дубейковский А.П., Пачкунов Д.М, Асташкин Е.И. Направленный мутагенез хромосомных генов Escherichia coli in vivo: конструирование recA мутантов. 1У Все, союзный симпозиум "Молекулярные механизмы генетических процессов". Москва, 1987, 167, .'9. Киселев В.И., Пачкунов Д.М., Асташкин Е.И. Регуляция зкспрес сии гена fctpE Escherichia ooli. - Молекулярная биология, 1987 4, I050-Ï054. •

10., Киселев В.И., Дубейковский А.Н., Пачкунов Д.М., Асташкин Е.И. Речинский В.О. Направленный мутагенез хромосомных генов Escherichia coli in vivo: конструирование Reo" и HtpU" -мутантов. - Молекулярная генетика, 1987, Л 4, 43-46. П. Киселев В.И. Канамицин сульфат - индуктор гена recA Escherichia, coli. _ Молекулярная генетика, 1987, № 9, 41-44. 12. Киселев В.И., Тарасова И.М., Глухов А.И. Стабилизация гетере логичных белков в клетках E.coli путем генетической коррекции внутриклеточного протеолиза. Тезисы Всесоюзной■коиферевд "Вццеление, очистка и анализ биологически активных соединена Сухуми, 198?, 66-67, 14. Асташкин Е.И.; Пачкунов Д.М., Киселев В.И. Интеграция плазм]

в.хромосому Paaudomouaa aeruginosa ва счет гомологичных по-■ '

следоваталькостой ДНК, - Молекулярная генетика,1988,Я 2, 21-;

14. Киселёв В.И., Тарасова И.М, Нэгуляция экспрессии гена litpB Escherichia, coli'; с помощью антисмыоловой FHK. - Молекулярная биология, 1968, 2, 454-457.

15 KiseleV V.l., and Tarasova I.M. Eegftlation of proteolysis in Escherichia coli cells by antisehse HHA of htpR gene.'- Biotechnology and applied biochemistry, 1986, 10, 59-62.

16. Киселёв В.И., Глухов А.И., Тарасова И.М., Щеготов М.Е. Накопление н -концевого фрагмента несА -белка в hfcpR -мутанте нарушает sos-функции клеток Escherichia coli.- Молекуляр-

I*

нал биология, 1988, 5, II98-I203.

1'7. Киселёв В.И., Тарасова И.М., Глухов А.И., Мэлинин А.Ю. Получение и свойства термотолерантного htpR -мутанта s.col-i-Молекулярная генетика, 1988, № 9, 21-36.

Ю. Kiselev V.l. Usö of cloned htrpR gene of Escherichia coli to introduce htpR mutation into tha Chromosoms. - fiiotechnoloey snd applied biochemistry, 1988,- 1.0 , 397-401.

19. Киселёв В.И., Чистякова Л.Г. Генетический контроль протеоли-тических процессов в клетках Escherichia coli и Poeudomonan aorus;inoüa . Дути стабилизации гетерологичных белков. Всесоюзная конференция "Новые направления биотехнологии", 1988 , 99.

JO. йлсова Е.В., Киселёв В.И., Чистякова Л.Г. Коррекция протао-литических процессов в клетках 3scherichia coli с помощью антисмнслспмс НЖ генов hfcpn и Ход - В кн.: 1\?яферон. -Ленинград, 1968, 92-95.

Kiaelev V.l., Tarasova I.M., Glukbov A.I. Genetio control of proteolysis in calla oÍ Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa. Way oí stabilization oí heterologous proteins. XVI Intern. oongress of genetics,loronto,Canada, August 20-27, 1988,

,2<J Kiselev V. htpR-like gens controls cell dirieion and proteolysis in Pseudomonas aeruginosa, - Biotechnology and applied biochemistry, 1988, 10, 589-596.

23. Киселев В.И., Тарасова И.М., Щепетов M.E., Грабовецкий B.B. Терморегулируемая экспрессия гена htpR под контролем PR -промотора бактериофагаД индуцирует сверхсинтез белков теплового шока. - Молекулярная биология, 1989, 4, 934-940.

£4. Киселев В.И., Чистякова 1.Г., Антонов В.К. Регуляция протео-логических процессов с помощью антисмысловых IHK генов btpR и Ion е.coli а гетеро- и гомологичных генетических системах. - Биоорганическая химия, 1989, № 9, II5I-II58.