Оценка выживаемости трансгенного штамма Escherichia coli Z905/pPHL7 в водных микрокосмах

Каргатова, Татьяна Васильевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Оценка выживаемости трансгенного штамма Escherichia coli Z905/pPHL7 в водных микрокосмах
ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Оценка выживаемости трансгенного штамма Escherichia coli Z905/pPHL7 в водных микрокосмах"

На правах рукописи

Каргатова Татьяна Васильевна

ОЦЕНКА ВЫЖИВАЕМОСТИ ТРАНСГЕННОГО ШТАММА Escherichia coli Z905/pPHL7 В ВОДНЫХ МИКРОКОСМАХ

03.00.16 - экология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск-2005

Работа выполнена в лаборатории управления биосинтезом гетеротрофов Института биофизики СО РАН (Красноярск) и в ООО Территориально-Ориентированные Информационные Системы («ТОРИНС», Красноярск).

Научный руководитель: кандидат биологических наук, с.н.с.

Попова Людмила Юрьевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Дрююсер Валентин Валерьянович

доктор биологических наук, профессор Сорокин Николай Дмитриевич

Ведущая организация: Институт водных и экологических проблем

ДВО РАН, г.Хабаровск

Защита диссертации состоится «28 » (Ж/УЫ^иА. 2005 г. в У У часов на заседании диссертационного совета Д 212.074.07 при Иркутском государственном университете по адресу: 664003 г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5, Байкальский музей им. профессора М.М.Кожова (ауд.219).

Почтовый адрес: 664003, г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5, биолого-почвенный факультет ИГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Иркутского государственного университета.

Автореферат разослан « Щ/Мйл. 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н.

Е.С. Купчинская

Актуальность работы. Оценка риска попадания трансгенных микроорганизмов (ТМ) в природные экосистемы является необходимым этапом протокола, предваряющим работу с трансгенными штаммами (Cartagena Protocol on Biosafety, 2001). Опасность нарушения естественного микробного биоразнообразия обусловлена использованием ТМ для решения экологических, сельскохозяйственных, промышленных и медицинских проблем, что предполагает возможность неконтролируемого распространения рекомбинантных ДНК. На современном этапе прогнозное изучение последствий интродукции ТМ в окружающую среду (распространения ТМ и их генетического материала) невозможно без предварительного проведения экспериментов в микрокосмах, поскольку эксперименты в открытых системах запрещены. Эксперимента подобного рода позволяют получать прогнозные оценки наиболее вероятного поведения интродуцируемых бактерий в сложных системах, в том числе в сообществе природных микроорганизмов.

Рекомбинантаые штаммы на основе Escherichia coli широко используются в научных исследованиях и биотехнологии. Созданные на ее основе трансгенные штаммы являются традиционными объектами генной инженерии, которые используются для получения целевых продуктов (Kurokawa et al., 2001; Bechor et al., 2002; Schultz et.al., 2005). Наряду с распространенным мнением, что Е. coli не должны выживать в природных условиях с низким содержанием питательных веществ, имеются многочисленные данные об их присутствии в водных экосистемах (Espinosa-Urgel, 1998, Koch, 2001; Kussell et al., 2005). При этом практически отсутствует информация о возможном выживании и изменении свойств трансгенных штаммов, сконструированных на основе Е. coli, при их интродукции в природные экосистемы.

Общепринятой методологии проведения прогнозных исследований экологических характеристик ТМ до настоящего времени не существует. Такие исследования очень трудоемки из-за отсутствия возможности постоянного контроля экспрессии клонированных генов у интродуцируемых штаммов. Поэтому для мониторинга ТМ в микрокосмах и пилотных установках все шире используют репор-терные генетические системы. Гены биолюминесценции, клонированные в плаз-мидах, во многих случаях являются удобной маркерной системой для мониторинга TM (Van Elsas et al., 1998, Sayler, 2001; Bunker et al, 2004; Schultz et al., 2005).

Цель данной работы состояла в изучении выживаемости, динамики численности и гетерогенности популяции трансгенного штамма Escherichia coli Z905/pPHL7 с клонированными генами биолюминесцентной системы после интродукции в водные микрокосмы.

Основные задачи исследования:

1. Оценить способность к выживанию трансгенного штамма Е. coli Z905/pPHL7 (/i£cCDABE,a»2pR) после интродукции в пресноводные микрокосмы.

2. Изучить гетерогенность популяции Е. coli Z905/pPHL7 после интродукции в водные микрокосмы с различной трофической структурой.

3. Провести анализ стабильности сохранения рекомбинантной плазмиды pPHL7 и границ изменения экспрессии плазмидных генов биолюминесценции и устойчивости к ампициллину.

Личный вклад соискателя. Все экспериментальные данные, представленные в диссертации, получены лично Каргатовой Т.В. в лаборатории Управления биосинтезом гетеротрофов Института биофизики СО РАН. Лично автором проводились отбор и анализ проб, высевы микрофлоры, подсчет численности, анализ морфофизиологических свойств гетеротрофных бактерий, их идентификация, проведение самого процесса интродукции, выделение изолятов интродуцированного штамма и анализ их свойств. Анализ и обобщение полученных результатов проводились в ООО «ТОРИНС». Изучение характеристик рекомбинантной плазмиды изолятов из микрокосмов осуществлялось на базе ГНЦ «Вектор» (Новосибирск).

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю к. б. н. Л.Ю. Поповой за поддержку, постоянное и внимательное отношение к работе, д.б.н., профессору Н.С. Печуркину за ценные замечания и помощь в осмыслении результатов исследований, д.б.н. Белявской В.А. за помощь в проведении анализов плазмидных ДНК выделенных изолятов, а также сотрудникам ИБФ д.б.н. Брилькову A.B., к.б.н. Ганусовой Е.Е., к.б.н. Бояндину А.Н., к.бл. Лобовой ТЛ, Крыловой Т.Ю., к.б.н. Могильной O.A. за многолетнюю дружескую поддержку и помощь в проведении исследований, а также сотрудникам ООО «Территориально Ориентированные Информационные Системы», проявивших интерес к моей работе, за всестороннюю поддержку.

Научная новизна работы. Впервые проведены эксперименты по изучению последствий интродукции трансгенного штамма в водные микрокосмы разной сложности. Показано, что независимо от структуры микрокосма трансгенный штамм К coli Z905/pPHL7 (Apr Lux4) длительно сохраняется в сообществе аборигенных микроорганизмов. В результате обобщения данных проведенных экспериментов установлено, что после интродукции в водные микрокосмы в популяции TM Е. coli Z905/pPHL7 (Арг Lux+) проявляется гетерогенность как морфофизиологических характеристик, так и экспрессии плазмидных генов. Визуальное отсутствие экспрессии биолюминесценции у выделенных изолятов не являлось свидетельством потери рекомбинантной плазмиды, что подтверждалось электрофорети-ческим анализом. При периодическом культивировании слабосветящихся клеток К coli Z905/pPHL7, выделенных из микрокосмов, на среде с повышенными концентрациями ампициллина (более 200 мкг/мл) люминесцентный сигнал увеличивался, что позволяло регистрировать его с помощью биолюминометра.

Практическое значение. Впервые исследована гетерогенность трансгенного штамма Е. coli Z905/pPHL7 (Apr Lux+) после интродукции в модельные микрокосмы. Предложен метод эффективного скрининга клеток, содержащих плазмиду pPHL7, при их низкой численности в бактериальном сообществе и сниженном уровне экспрессии плазмидных генов. Показано, что в накопительной культуре плазмидсодержащих клеток с добавлением высоких концентраций ампициллина (более 200 мкг/мл) происходит увеличение люминесцентного сигнала и подавление роста аборигенной микрофлоры, не имеющей плазмидных детерминант устойчивости к антибиотику. Результаты работы являются частью макета экологического паспорта на TM Е. coli Z905/pPHL7, который включен в в достижения РАН в 2000 г (в раздел микробиология) в 2001 г (в раздел биотехнология). Описание экологических характеристик вариантов, трансгенного штамма Е. coli Z905/pPHL7,

выделенных из микрокосмов, включено в состав электронной коллекции природных и трансгенных светящихся микроорганизмов "Biolumbase".

Результаты работы включены в отчеты по грантам РФФИ №94-04-11189, №97-04-49988, №00-07-90111, №01-05-64615, №02-05-64096, №04-05-64188; КФН (гранты №1F0186, №5F0025, №4F0200, №8F0006, №10F195M; ФЦП «Интеграция» №162, проекта СО РАН «Интеграция» №25 и является частью исследований, проводимых по теме: «Биофизические основы функционирования природных экосистем (мониторинг, эксперименты, модели)» (индекс приоритетного направления 4.1.5,4.2.1, номер госрегистрации 01.960004916).

Положения, выносимые на защипу.

1. Трансгенный штамм Е. coli Z905/pPHL7 после интродукции в различные водные микрокосмы со сложной организацией не элиминируется из микробоцено-зов в течение длительного времени.

2. После интродукции TM Е. coli Z905/pPHL7 уровень экспрессии плазмид-ных генов значительно снижается. Во всех изученных микрокосмах отсутствует визуальное проявление люминесценции при сохранении рекомбинантной плазми-

ДО.

3. Использование метода накопительных культур бактериальных клеток, несущих плазмиду pPHL7 в селективной среде с высокими концентрациями ампициллина (более 200 мкг/мл) облегчает мониторинг плазмидсодержащих клеток при их низкой численности в микробных сообществах.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на Всероссийской конференции "Интродукция микроорганизмов в окружающую среду" (Москва, 1994), VT и VII Международной конференции "Новые направления в биотехнологии" (Москва, 1996, 1998), Ассамблеях COSPAR (31 - Бирмингем, 1996; 33 - Варшава, Польша, 2000; 34 - Хьюстон, 2002; 35 - Париж, 2004), Республиканской конференции "Региональное природопользование и экологический мониторинг" (Барнаул, 1996), Международной конференции "Микробное разнообразие" ICEP (Пермь, 1996, 1998, Волгоград-Пермь, 2001), Международной конференции "Современные концепции эволюционной генетики" (Новосибирск, 1997), Международной конференции "Проблемы загрязнения окружающей среды" (Москва, 1998), VII Экологическом Конгрессе INTECOL (Флоренция, Италия, 1998), Международной конференции по биоразнообразию BDENE (Новосибирск, Россия, 2000,2001), Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), конференции молодых ученых «Современные проблемы микробиологии, экологии и иммунологии» (Пермь, 2002), Международном Байкальском симпозиуме по микробиологии IBSM-2003 (Иркутск, 2003), Международной конференции по измерениям, моделированию и информационным системам для изучения окружающей среды (Томск, 2004), Международной конференции по вычислительно-информационным технологиям для наук об окружающей среде (Новосибирск. 2005).

Публикации и личный вклад автора. По материалам диссертации опубликовано 47 научных работ, из них 16 статей в центральных и зарубежных журналах. Экспериментальные данные получены автором как самостоятельно, так и в совместных экспериментах. Основные результаты диссертации вошли в целый ряд

обзорных статей по изучаемой проблеме. Результаты, представленные в диссертации, защищаются впервые.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 144 страницах, содержит 32 рисунка, 19 таблиц. Список литературы включает 251 источник, в том числе 207 в иностранных журналах.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность проблемы, сформулированы цели и задачи исследования.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обсуждаются проблемы, связанные с ограничением использования ТМ в различных сферах деятельности, включая оценку риска интродукции ТМ в окружающую среду. Поскольку неотъемлемым и необходимым инструментом таких прогнозных исследований являются модельные эксперименты, приведен обзор во изучению микроорганизмов, в том числе и ТМ, в различных микрокосмах. Рассматриваются основные причины, вызывающие элиминацию аллохтонных бактерий, адаптационные возможности бактерий в условиях окружающей среды. Показано, что, несмотря на большой интерес к фенотипической изменчивости и гетерогенности микробных популяций, практически отсутствует информация об изменении экспрессии плазмидных генов.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследований являлись трансгенный штамм Escherichia coli Z905, содержащий рекомбинантную плазмиду pPHL7 (Lux+, Ар1) с генами бактериальной люминесцентной системы Photobacterium leiognathi, клонированными в векторе pUC18 под контролем /ас-промотора (Илларионов, Протопопова, 1985), а также варианты этого штамма, выделенные из пресноводных микрокосмов в разное время после его интродукции. Всего было выделено и изучено около 7,5 тыс клонов, выделенных из микрокосмов.

Микрокосмы и интродукция. В качестве микрокосмов были выбраны лабораторные аквариумы с рыбами, которых кормили сухим кормом (сушеный перемолотый Gammarus) (табл. 1, микрокосмы I-Ш). Во второй серии экспериментов, чтобы исключить антропогенное влияние внесенных органических веществ, были сконструированы пресноводные микрокосмы с разным числом консументов (табл. 1, микрокосмы IV-VI). Доминирующие представители микроводорослей Ankistrodesmns sp., Scenedesmus sp., Chlorella sp. Простейшие были представлены: Colpoda sp., Stylonichia sp, Euglerta sp., Infusoria sp. Титр интродукцированного штамма E. coli Z905/pPHL7 в начале эксперимента составлял 106 КОЕ/мл, при общей численности аборигенной микрофлоры 104-103 КОЕ/мл. Предварительно до интродукции проводили идентификацию бактерий, выделенных из микрокосмов, с помощью стандартных тестов (Берги, 1997). Доминирующими являлись представители родов Caulobacter, Pseudomonas, Flavobacterium.

Питательные среды. Для выращивания бактерий использовались жидкие среды: минимальная М9 (Миллер, 1976) с глюкозой или глицерином, метионином (поскольку изучаемый штамм является ауксотрофным), а также модификация этой

среда с добавлением пептона (5 г/л). В качестве селективного фактора в среду добавляли ампициллин до концентрации 50 адкг/мл. Культивирование. Периодическое культивирование проводили в жидкой среде объемом 50 мл в колбах Эрлен-мейера (250 мл) на термостатируемой качалке (28°С). Оптическую плотность бактериальной суспензии измеряли на фотоэлектроколориметре КФК-2 при длине волны 540 нм.

Таблица 1

Характеристика водных модельных систем, в которые проводили интродукцию трансгенного штамма К coli Z905/pPHL7

Характеристи ки микрокосмы с дополнительным поступлением органических веществ микрокосмы без дополнительного поступления органических веществ

I П Ш IV V VI

Объем, л 20 4 20 10 10 10

Время эксперимента 50сут. 150 сут. 6 лет 2 года 2 года

Сезонные условия лето зима

РОВ, мг Ог/л 160-200 5-20

Освещение естественное искусственное, постоянное освещенность 3300 лк

Консументы Protozoa Poecilia reticulata 1) Protozoa 1) Protozoa 2) Daphnia pulex 1) Protozoa 2) Daphnia pulex 3) Poecilia reticulata

Микроводоро ели, кл/мл 5Ю6-ЗЮ7 102-103 2106 — 3 107 105-6105 1 106- 8106

Основные различия между микрокосмами выделены жирным шрифтом

Анализ плазмидвой ДНК. Электрофорез плазмидных ДНК проводился в ГНЦ «Вектор» (г. Бердск). Клетки исследуемых микроорганизмов отбирались из периодической культуры в экспоненциальной фазе. Выделение и анализ плазмид-ной ДНК проводили стандартными методами (Клонирование ДНК, 1988).

Мониторинг популяции Е. coli Z905/pPHL7 в водных микрокосмах проводили обычным методом при высеве проб воды на агаргоованные среды с добавлением разных концентраций селективного фактора. Поскольку численность аборигенных бактерий превышала на 2-3 порядка численность плазмидсодержащих клеток, мониторинг осуществляли путем получения накопительной культуры в селективной среде с антибиотиком. Были использованы концентрации ампициллина от 100 до 500 мкг/мл, которые подавляют рост большинства аборигенных бактерий и способствуют выявлению клеток со сниженной экспрессией /ia-генов. В ходе мониторинга выделено более 25000 клонов, проведено изучение их фенотипических и генотипических характеристик.

Оценка экспрессии плазмндных генов. Экспрессию клонированных в плазмиде генов оценивали по способности к росту на селективных средах и проявлению свечения. Измерение люминесценции проводили с помощью биолюмино-метра с чувствительностью от 106 до 1012 квантов/с. При регистрации светящихся колоний экспрессию люминесценции оценивали визуально (уровень выше 109 квантов/с).

Получение культуральной жидкости: микроорганизмы выращивались в жидкой среде до фазы удвоения оптической плотности (tl), линейной фазы (t2), стационарной фазы (t3). Затем культуральную жидкость центрифугировали 30 мин. при 8 тыс.об./мин. Надосадочную жидкость стерилизовали при 0,5 атм. в течение 10 мин. Супернатант добавляли в соотношении 1:1 в жидкую среду М9 с пептоном(5 г/л) и глюкозой.

Статистическая обработка данных проводилась по стандартным методикам (Лакин, 1973) с использованием программного пакета Microsoft Excel 7.0 для Windows 95. Рассчитывали среднее арифметическое, доверительный интервал, стандартное отклонение. Все расчеты проводились с учетом уровня значимости а=0.05.

Глава 3. ДИНАМИКА ЧИСЛЕННОСТИ И ИЗМЕНЕНИЯ СТРУКТУРЫ

ПОПУЛЯЦИИ ТРАНСГЕННОГО ШТАММА ESCHERICHIA COLI Z905/pPHL7 ПОСЛЕ ИНТРОДУКЦИИ В ВОДНЫЕ МИКРОКОСМЫ

Экспериментальное изучение процессов интродукции ТМ Escherichia coli Z905/pPHL7 показало способность данного штамма сохраняться в искусственных пресноводных модельных системах в течение длительного времени (от двух месяцев до 6 лет). Штамм Е. coli Z905/pPHL7 после интродукции в водные экосистемы с дополнительным поступлением органических веществ сохранялся в течение всего эксперимента (50-150) дней (рис. 1). При этом отмечено снижение в клетках уровня экспрессии гшазмидных генов. Уже через две недели в шпродуцированной популяции отсутствовали клетки с исходным фенотипом. Популяция была представлена клетками со сниженным уровнем люминесценции, причем при низкой численности микроводорослей (102-103 кл/мл, микрокосм Ш) в клетках также снижался уровень экспрессии генов устойчивости к ампициллину. В микрокосмах с высокой численностью микроводорослей (микрокосмы I и П) появления такого фенотипа не наблюдалось.

Чтобы исключить влияние антропогенного фактора были сконструированы микрокосмы без дополнительного поступления питательных веществ. После интродукции в микрокосмы IV-VI уровень численности ннтродуцированной популяции Е. coli Z905/pPHL7 снижался до величин ниже границ определения (рис.2). Изучение изолятов свидетельствовало о гетерогенности клеток популяции Е. coli Z905/pPHL7. Как и в экспериментах с дополнительным поступлением органических веществ через две недели в популяции отсутствуют клетки с исходным уровнем люминесценции.

Время, сутки

-"—- гетеротрофные бактерии;

субпопуляции Е. сок г905/рРНЬ7: Чк— яркосветящигся ампинщишнрезистенгные клетки (исходный фенотип)

—А— тусклые ампициллинрезистентные клетки

тусклые клетки со сниженным порогом ампициллин-резистентности

Рис. 1. Динамика численности аборигенной гетеротрофной микрофлоры (квадраты) и субпопуляций & coli Z905/pPHL7 (треугольники) после интродукции ТМ в водные микрокосмы (I-Ш) с дополнительным поступлением органических веществ при разной численности микроводорослей (структура микрокосмов представлена в табл. 1). Линией отмечена граница достоверного определения численности.

Через 2 недели после интродукции из популяции Е. coli Z905/pPHL7 элиминировались клетки с исходным уровнем свечения и популяция представлена двумя субпопуляциями: клетки со сниженным уровнем биолюминесценции и клетки со сниженным уровнем экспрессии как генов биолюминесценции, так и генов устойчивости к ампициллину. При этом, хотя численность интродуцировашюй популяции снижается до величия менее порога достоверного определения численности, в течении двух лет во всех микрокосмах выявлялись клетки Е. coli Z905/pPHL7 (рис.2).

100

200

300

400

500

600

• гетеротрофные бактерии

Время, сутки

субпопуляции Е coli Z905/pPHL7: , ^ .

—fr— яркосветящиеся амхтциллинрезистентные клетки (исходный фенотип)

—А— темновые и тусклые ампидиллинрезистентные клетки

темновые и тусклые клетки со сниженным порогом устойчивости к ампициллину

Рис. 2. Динамика численности аборигенной гетеротрофной микрофлоры (квадраты) и субпопуляций Е coli Z905/pPHL7 (треугольники) после интродукции ТМ в водные микрокосмы (IV-VI) без дополнительного поступления органических веществ (структура микрокосмов представлена в таблице 1).

Пунктирной линией отмечена граница достоверного определения численности.

Результаты дальнейших наблюдений свидетельствуют о сохранении клеток интродуцированного штамма в течении всего эксперимента (рис. За). Популяции Е. coli Z905/pPHL7 в микрокосмах IV-VI представлены темновыми клетками как сохранившими исходный уровень устойчивости к ампициллину, так и клетками со сниженным уровнем ампициллин-резистентности (рис. 2). Такая структура популяции сохранялась в микрокосме IV и далее в течение следующих 4 лет (рис.Зб), при персистенции клеток Е coli Z905/pPHL7 на уровне 102 - 103 КОЕ/мл.

ЕЭ аборигенные бактерии ¡Э Е.соН Z905/pPHL7

6 -5 -4 -3 -2 -1 -О

Субпопуляции E.coli Z905/pPHL7: □ Lux+-Apr

■ Lux+-Aps

Hilft Ii i

1 2 3 4 5 Годы

Рис. 3. Среднегодовая динамика численности бактерий (а) и субпопуляций Е coli Z905/pPHL7 (б) в микрокосме IV через 2 месяца после интродукции. Lux+-Apr - клетки со сниженным уровнем люминесценции, сохранившие исходную устойчивость к ампициллину, Lux+-Aps - клетки со сниженным уровнем люминесценции, утратившие исходную устойчивость к ампициллину.

Рис. 4. Элекгрофореграммы изолятов Е. coli Z905/pPHL7, выделенных из микрокосмов: 1 - Z905 (исх.), 2 - pPHL7, 3 -Z905-33 (18 недель), 4 - Z905-27 (29 недель), 5 - Z905-103 (327 недель)

Анализ плазмидных ДНК изолятов Е. coli Z905/pPHL7 свидетельствовал о сохранении в клетках плазмиды размером 12,7 т.п.о. (рис. 4).

Таким образом, интродукция в модельные водные микрокосмы показала возможность длительной персистенции клеток TM Е. coli Z905/pPHL7 в модельных системах с аборигенными микроорганизмами. Плазмида в клетках сохранялась, однако достаточно быстро снижался уровень экспрессии плазмидных генов. При высеве на плотные среды колонии были визуально несветящимися. Утрачивалась способность к росту на стандартной селективной

концентрации антибиотика (50 мкг/мл). В микрокосмах IV-VI наряду с изменением экспрессии плазмидных генов происходили изменения морфофизиологических характеристик самих клеток ТМ.

Глава 4. МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ПОПУЛЯЦИИ ТРАНСГЕННОГО ШТАММА Е. coli Z905/pPHL7 ПОСЛЕ ИНТРОДУКЦИИ В МИКРОКОСМЫ

В микрокосмах с дополнительным поступлением органических веществ клетки интродуцированной популяции не изменялись морфологически. В микрокосмах IV-VI (без дополнительного поступления органических веществ) наряду с гетерогенностью популяции по экспрессии плазмидных генов показано изменение морфофизиологических признаков популяции Escherichia coli Z905/pPHL7. Только в течение первого месяца варианты ТМ сохраняли способность к образованию типичных R-колоний на селективной среде с антибиотиком. В дальнейшем в популяции Е. coli Z905/pPHL7 была отмечена гетерогенность по морфологии клеток и колоний (табл.2). В течение 1,5 лет после интродукции выделенные клоны были представлены, в основном, клетками с измененной морфологией, образующими точечные колонии на плотной среде. Биомасса представлена укороченными сцепленными в цепочки клетками, что является характерным для развития микроорганизмов при неблагоприятных условиях.

Таблица 2.

Динамика изменения морфологии клеток и колоний в популяции Escherichia coli Z905/pPHL7 после интродукции в микрокосмы IV-VI

В дальнейшем популяция была представлена промежуточной (Я8)-формой (таблица 2). Для большинства измененных вариантов отмечено увеличение размера колоний после ряда пассажей на богатых средах. В ряде случаев это происходило уже после 1-2 пересевов, хотя в большинстве случаев такое восстановление происходило постепенно только после 10-30 пассажей. Аналогичные колонии ТМ (ЯЯ-форма) выявлялись нами через 1,5 года после интродукции и сохранялись далее на протяжении 6 лет. Период доминирования точечных колоний совпадает с наименьшей плотностью популяции ТМ (КОЕ/мл) в микрокосмах, который продолжался также в течение полугода (рис. 2, табл. 2). Впоследствии численность популяции ТМ возросла до уровня 102-103 КОЕ/мл (рис. 3) и при высеве проб доминировали типичные по размеру для изучаемого штамма колонии.

Время, Размер коло- Форма Морфология

месяцы ний, мм колоний клеток

ini-0,5 3.5 R Н

0,5-1 1-2 R Н

1-5 1-1.5 R И

3-10 точечные S, R И

7-18 точечные S Н

13-28 1 RS Н

29-75 1-2 RS Н

*Н - одиночные клетки с исходной морфологией (0.4-0.5 х 1.0-1.5 мкм),

И - клетки с измененной морфологией (0.2-0.3 х 0.5-0.6 мкм), часто соединенные в цепочки

Одним из механизмов адаптации и улучшения конкурентоспособности вариантов ТМ по сравнению с аборигенной микрофлорой могут бьггь изменения их межклеточных взаимодействий по сравнению со штаммом дикого типа. При периодическом культивировании исходного штамма Е. coli Z905/pPHL7 и некоторых вариантов на среде с добавлением супернатантов Р putida и Р. fluorescens отмечена стимуляция роста ряда вариантов по сравнению с контролем (рис.5). Так прирост бимассы варианта Е. coli Z905-33 на среде с добавлением супернатантов в 1,5-2 раза превышает контроль. В качестве контроля использовали рост изучаемого штамма на среде с добавлением собственного супернатанта. Особенно стимулирующим было влияние супернатантов, полученных из стационарной фазы роста культур, что может свидетельствовать о способности варианта утилизировать вторичные метаболиты псевдомонад. Для варианта Е coli Z905-103, выделенного через 6 лет после интродукции, показано незначительное влияние интермедиатов, выделяемых в фазе линейного роста псевдомонад.

Рис. 5. Влияние супернатантов разных культур (см. легенду) на прирост биомассы исходного штамма Е соН 2905/рРН1.7 и изолятов из микрокосма Е соН 2905-33/рРНЬ7 и К соН 2905-103/рРНЬ7, полученных в разные фазы роста (А - через 2-3 часа, Б - через 6-8 часов (линейная фаза), В - через 9-10 часов (стационарная фаза).

По шкале У отображено отношение прироста исследуемого штамма в среде с добавлением супернатантов (1:1) тестируемых штаммов к приросту контрольного варианта (среда с добавлением собственного супернатанта, к, к=1).

Экспрессия клонированных /мх-генов в клетках ТМ в условиях микрокосмов снижается на несколько порядков, из-за чего мониторинг даже для клеток ТМ со специфичной маркерной системой в открытых экосистемах может быть затруднен. Тем не менее, как было показано выше, потери рекомбинантной плазмиды не обнаружено, поэтому следующей задачей была отработка методов обнаружения клеток ТМ и рекомбинантной плазмиды в бактериальном звене микрокосмов.

Глава 5. МОНИТОРИНГ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДЫ рРНЬ7

(АргЬи*+) В СЛОЖНЫХ СИСТЕМАХ

Присутствие в плазмиде генов биолюминесценции не только облегчает изучите изменения экспрессии плазмидных генов, но и служит удобным маркером самих ТМ, интродуцированных в природные водоемы. На фоне общего снижения люминесцентного сигнала в среде микрокосма из-за низкой численности люми-

несцентных клеток, а также массового появления колоний со значительно сниженным уровнем люминесценции, затрудняется изоляция и идентификация ТМ. В связи с этим была разработана методика мониторинга ТМ и клонированного lux-оперона, позволяющая фиксировать люминесцентный сигнал в процессе инкубации проб воды микрокосмов с ампициллином. Методический подход основан на том, что плазмидная устойчивость обеспечивает ТМ селективное преимущество перед автохтонными бактериями в водной среде с повышенным содержанием селективного фактора.

Периодическое культивирование темновых вариантов Е. coli Z905/pPHL7 в жидкой среде с добавлением ампициллина в большинстве случаев позволяло выявлять люминесценцию (рис.6). Это служило показателем того, что структура гшазмиды сохранялась, а снижение уровня свечения связано с низкой метаболической активностью клеток.

Z905hcx.

Z905-27

О 2 4 6 8 10 Время, часы

8 а

L7 ЛР

0 2 4 б 8 10 Время, часы

Рис. 6. Динамика роста (OD) и уровня люминесценции (LI) клонов Е coli Z905/pPHL7, выделенных из микрокосмов, на среде М9 с пептоном без ампициллина (АрО) и с ампициллином (Ар50 - 50 мкг/мл).

OD - оптическая плотность культуры, отн.ед.опт.пл. LI/OD - удельная люминесценция, кв/с/отн.ед.опт.пл.

Изучение экспрессии плазмидных генов у выделенных из микрокосмов клонов показало, что у большинства темновых изолятов присутствие в среде ампициллина стимулирует развитие биолюминесценции. Так у вариантов Z905-27, Z905-33 на среде без антибиотика люминесценция не регистрируется, в присутствии ампициллина - отмечено увеличение экспрессии люминесценции на 5 поряд-

ков, несмотря на отсутствие прироста биомассы. Для варианта 2905-103 показано отсутствие влияния антибиотика на экспрессию люминесценции, как и для исходного варианта г905/рРНЬ7.

Мониторинг клеток трансгенного штамма в смешанной культуре бактерий состоит в культивировании проб воды из микрокосмов в жидкой среде с добавлением высоких концентраций ампициллина, что приводит к увеличению люминесцентного сигнала и подавлению роста аборигенной микрофлоры, не имеющих плазмидных детерминант устойчивости к антибиотику. При концентрации антибиотика 50 мкг/мл, несмотря на высокую плотность биомассы биолюминесцентный сигнал самый низкий, поскольку наряду с ростом плазмидсодер-жащих клеток происходит также рост аборигенных бактерий. При концентрации более 100 мкг/мл регистрировалось достаточно высокая биолюминесценция, отмечалось подавление роста аборигенной микрофлоры (рис. 7).

Поскольку при значительно высоких концентрациях ампициллина подавляется рост клеток трансгенного штамма со сниженной экспрессией ампициллин-резистентности и возрастает время увеличения биомассы, оптимальными для данного способа мониторинга концентрациями антибиотика является диапазон от 200 до 300 мкг/мл.

Длительная персистенция рекомбинантных плазмид возможна и в некулыи-вируемых формах (Головлев, 1998), при этом штамм может быть донором плазмид для аборигенных микроорганизмов. Высев накопительных культур на агаризиро-ванные среды с разными концентрациями антибиотика позволяет выявлять не только исходный ТМ, но и природные трансформанты, получившие рекомбинант-ную плазмиду со светящимися генами. Таким образом, использование маркерных генов и усовершенствование методов мониторинга может облегчить самую суще-

50 100 200 300 500 Концентрации ампициллина

Рис. 7. Биолюминесценция (Ы, кв/с) и оптическая плотность (СЮ, отн.ед.) накопительных культур проб из микрокосмов на среде М9 с добавлением глицерина с разными концентрациями ампициллина (мкг/мл).

ственную часть прогнозных исследований безопасности применения ТМ. Этот метод позволяет оценить риск миграции рекомбинантной плазмиды и экспрессии клонированных генов в аборигенной микрофлоре, как правило, более многочисленной. Данный метод позволяет осуществлять мониторинг клеток, несущих ре-комбинантную плазмиду pPHL7, среди аборигенных микроорганизмов в водных микрокосмах даже при их низкой численности и значительно сниженном уровне экспрессии люминесцентных генов в клетках.

На основании результатов проведенных исследований выделены основные экологические характеристики трансгенного штамма Escherichia coli Z905/pPHL7 (ApW):

• может длительное время сохраняться в микрокосмах в некультивируемой форме при лимитировании питательными веществами;

• способен к изменению спектра утилизируемых органических субстратов;

• в различных условиях клетки ТМ проявляют тенденцию к снижению уровня экспрессии клонированных генов (на уровне регуляции экспрессии и снижения копийности плазмиды), как правило, сохраняя устойчивость к высоким концентрациям ампициллина;

• в условиях высокой концентрации микроводорослей в модельных системах численность интродуцированного штамма была выше, в популяции доминировали клоны с высокой устойчивостью к ампициллину;

• способен к сосуществованию с представителями аборигенной гетеротрофной микрофлоры, в частности с представителями рода Pseudomonas и Enterobacteri-асеае, вследствие активизации ферментных систем, утилизирующих их вторичные метаболиты;

• способен к передаче рекомбинантной плазмиды микроорганизмам других родов: Caulobacter, Flavobacterium, Enterobacteriaceae, Pseudomonas, но образования устойчивых популяций новых ТМ в водных микрокосмах не наблюдается;

• после интродукции ТМ вытеснения природных видов микроорганизмов не наблюдается, однако отмечено снижение численности отдельных представителей гетеротрофных микроорганизмов {Flavobacterium, Enterobacteriaceae, Pseudomonas), антагонизма между ТМ и аборигенными бактериями не обнаружено.

• передачи природных плазмид от аборигенных гетеротрофных бактерий к ТМ не обнаружено как в условиях микрокосмов, так и в специальных экспериментах

• двойная маркерная генетическая система позволяет осуществлять мониторинг как отдельных клеток ТМ, так и быстрый скрининг наличия рекомбинантных ДНК в бактериальном сообществе природных экосистем.

ВЫВОДЫ

1. В результате экспериментального моделирования процессов интродукции трансгенного штамма Е. coli Z905/pPHL7 в пресноводные микрокосмы показана его потенциальная возможность выживать в течение длительного времени (до 6 лет).

2. Установлено, что после интродукции в микрокосмы, независимо от их структуры, в популяции Е. coli Z905/pPHL7 (Арг Lux+) происходят изменения в экспрессии плазмидных генов: снижение устойчивости к ампициллину и уровня биолюминесценции. В микрокосмах без дополнительного поступления органических веществ выявлены изменения морфофизиологических характеристик штамма.

3. Установлено, что в микрокосмах с высокой численностью микроводорослей (107 кл/мл) в популяции TM Е. coli Z905/pPHL7 доминировали клетки с высоким порогом устойчивости к ампициллину.

4. Выявлено, что визуальное отсутствие экспрессии люминесцентных генов не является свидетельством потери рекомбинантной плазмиды. При культивировании темновых вариантов Е. coli Z905/pPHL7 на средах с добавлением ампициллина (5-50 мкг/мл) отмечена экспрессия биолюминесценции. Присутствие в клетках рекомбинантных плазмид подтверждено результатами электрофореза. Клеток ТМ, утративших рекомбинантную плазмиду не обнаружено.

5. Использование двойной маркерной системы: устойчивости к ампициллину и способности к люминесценции - позволяет осуществлять мониторинг рекомбинантной плазмиды со сниженной экспрессией плазмидных генов при низкой численности интродуцента в микробных сообществах. Предложены 2 способа скрининга клеток ТМ и рекомбинантной плазмиды в микрокосмах. Первый способ основан на изучении характеристик отдельных изолятов, выделенных на агаризо-ванных средах с разной концентрацией селективного фактора. Второй способ может быть полезен для быстрого обнаружения /шс-генов в микробных сообществах. В накопительной культуре с высокими концентрациями ампициллина (более 200 мкг/мл) отмечается увеличение интенсивности свечения до величин, регистрируемых с помощью биолюминометра.

6. Описаны экологические характеристики TM Е. coli Z905/pPHL7, позволяющие ему сосуществовать с аборигенной микрофлорой, сохраняя в клетках рекомбинантную плазмиду с клонированными /их-генами. К основным характеристикам относится снижение метаболической активности клеток в условиях недостатка питательных веществ, в том числе изменение экспрессии плазмидных генов.

ОСНОВНЫЕ РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Попова, Л. Ю. Динамика роста клеток Escherichia coli в экспериментах с водными микроэкосистемами до и после "цветения" зеленых водорослей [Текст] / Л. Ю. Попова, Т. В. Репета. Е. Е. Максимова, А. В. Брильков, Н. С. Печуркин // Биотехнология. -1993.-№10.-С. 35-38.

2. Попова, Л. Ю. Экспрессия клонированных генов бактериальной люминесценции у микроорганизмов, выделенных из лабораторных микрокосмов [Текст] / Л. Ю. Попова, Е. Е. Максимова, Т. В. Репета. А. В. Брильков, Н. С. Печуркин // Биотехнология. -1994,-№5.-С. 6-10.

3. Popova, L. Yu. Prognostication of recombinant strain behaviour in microcosms [Text] / L. Yu. Popova, A. V. Bril'kov, Т. V. Repeta. E. E. Maksimova, I. M. Shirobokova, N. S. Pechurkin / Biospberics: Microecosystems as a models of biotic cycles : trends. - France, 1994.-P. 93-117.

4. Брильков, А. В. Прогнозное исследование выживания и распространения генноин-женерных микроорганизмов в лабораторных водных экосистемах [Текст] / А. В. Брильков, Л. Ю. Попова, Е. А. Баранова, Е. Е. Максимова, Т. В. Репета. Н. С. Печуркин // ДАН. -1995. - Т. 341, № 3. - С.429- 430.

5. Каргагова. Т. В. Фенотипическая изменчивость популяции рекомбинантного люминесцентного ппамма Escherichia coli в водных микрокосмах [Текст] / Т. В. Каргатова, Е. Е. Максимова, Л. Ю. Попова, А. В. Брильков, Н. С. Печуркин, // Микробиология. -1997. - Т. 66, № 1. - С. 101-106.

6. Максимова, Е. Е. Регулируемая экспрессия генов бактериальной люминесценции, клонированных в многокопийной рекомбинангной плазмиде [Текст] / Е. Е. Максимова, Л. Ю. Попова, Т. В. Каргагова. В. В. Шпагина // Микробиология. - 1997. - Т. 66, №2.-С. 223-227.

7. Печуркин, Н. С. К оценке риска неконтролируемого развития генетически модифицированных микроорганизмов (ГММО) в окружающей среде (Методологический подход) [Текст] / Н. С. Печуркин, Л. Ю. Попова, Т. В. Каргатова. Е. Е. Максимова // Сибирский экологический журнал. - 1997. - № 5. - С. 447—452.

8. Попова, Л. Ю. Интродукция и длительное сохранение рекомбинантного люминесцентного штамма Escherichia coli Z90S в лабораторных водных микроэкосистемах [Текст] / Л. Ю. Попова, Е. Е. Максимова, Т. В. Каргатова. А. В. Брильков, Н. С. Печуркин // Известия РАН. Серия, биологическая. - 1998. - № 6. - С. 670-677.

9. Каргагова. Т. В. Сравнительная характеристика роста вариантов рекомбинантного штамма Escherichia coli и представителей аборигенной микрофлоры водных микроэкосистем в селективных и неселективных условиях [Текст] / Т. В. Каргатова, Е. Е. Максимова, Т. Ю. Крылова, Л. Ю. Попова // Известия РАН. Серия биологическая. -1999.-№2.-С. 152-157.

10. Pechurkin, N. S. Modelling of genetically engineered microorganisms introduction in closed artifical microcosms [Text] / N. S. Pechurkin, A. V. Brilkov, V. V. Ganusov, Т. V. Kargatova. E. E. Maksimova, L. Yu. Popova // Advances in Space Research. - 1999. - V. 24, №3,-P. 335-341.

11. Popova, L. Yu. Experimental microcosms as models of natural ecosystems for monitoring survival of genetically modified microorganisms [Text] / L. Yu. Popova, N. S.

Pechurfcin, E. E. Maksimova, Т. V. Kargatova, Т. Yu. Krylova, Т. I. Lobova, A. N. Boyandin U Life Support and Biosphere Science. - 1999. - V. 6, № 3. -P. 193-197.

12. Kargatova. Т. V. Evolution of grampositive and gramnegative transgenic microorganisms in model aquatic ecosystems [Text] / Т. V. Kargatova, E. E. Maksimova, T. Yu. Krylova, L. Yu. Popova // Biodiversity and dynamics of ecosystems in North Eurasia : trends. -Novosibirsk, 2000. -P. 64-66.

13. Каргатова. Т. В. Сосуществование трансгенного штамма Escherichia coli с природными микроорганизмами при совместной интродукции в водные микрокосмы [Текст] / Т. В. Каргатова, Е. Е. Максимова, JI. Ю. Попова // Микробиология. - 2001. -Т. 70, №2. -С. 253-258.

14. Popova, L. Bioluminescence as a criterion of effects of of physical and chemical factors on metabolic activity of microorganisms [Text] / L. Popova, A. Boyandin, T. Kargatova. E.

> Maksimova, T. Lobova, T. Krylova, P. Kormilets / Chemiluminescence at the Turn of the

Millennium : trends. - Dresden : GmbH, Druckerei and Verlag, 2001. - P. 327-334.

15. Popova, L. Yu. Population dynamics of transgenic microorganisms in the different mi-croecosystem conditions [Text] / L. Yu. Popova, Т. I. Lobova, T. Yu. Krylova, Т. V. Kargatova. E. E. Maksimova, A. N. Boyandin, N. S. Pechurkin II Advances in Space Research. -

2001.-V. 27, № 9. - P. 1571-1579.

16. Попова, Л. Ю. Стабильность поддержания рекомбинантных плазмид в клетках трансгенных микроорганизмов при разных условиях существования [Текст] / Л. Ю. Попова, Е. Е. Максимова, Т. И. Лобова, Т. В. Каргатова, А. Н. Бояндин, Т. Ю. Крылова, Н. С. Печуркин // Микробиология. - 2001. - Т. 70, № 6. - С. 796-803.

17. Каргатова. Т. В. Экологический риск интродукции трансгенного штамма Escherichia coli Z905/pPHL7 в водные экосистемы [Текст] / Татьяна Каргатова II «Современные проблемы микробиологии, экологии и иммунологии»: сб. нау. тр. / Пермь,

2002.-С. 54-55.

18. Kargatova, Т. У. Experimental modeling of the processes resulting from the introduction of the transgenic microorganism Escherichia coli Z905/pPHL7 {lux*) into aquatic microcosms [Text] / Т. V. Kargatova, A. N. Boyandin, L. Yu. Popova, N. S. Pechurkin // Advances in Space Research.-2003.-V 31, № 7. - P. 1769-1774.

* 19. Kargatova. Т. V. Survival of transgenic strain Escherichia coli Z905/pPHL7 in aquatic

microcosms of various structural organization [Text] / Т. V. Kargatova // International Baikal symposium on microbiology IBSM- 2003. Microorganisms in ecosystems of lakes, riv-4 ers and reservoirs : trends.- Irkutsk: Publ. House of Inst, of Geography SB RAS, 2003. - P.

61.

20. Медведева, С. E. База данных природных и трансгенных светящихся микроорганизмов "Biolumbase" С. Е. Медведева, А. Н. Бояндин, Ю. П. Ланкин, Д. А. Котов, Т. В. Каргатова. Родичева Э.К., Попова Л.Ю. Н Биомедицинская химия. -2004. - Т. 50, прил. 1.-С. 172-179.

21. Popova, L. Yu. Population Dynamics of Transgenic Strain Escherichia coli Z905/pPHL7 in Freshwater and Saline Lake Water Microcosms with Differing Microbial Community Structures [Text] / L. Yu. Popova, Т. V. Kargatova, E. E. Ganusova, Т. I. Lobova, A. N. Boyandin, O. A. Mogilnaya, N. S. Pechurkin // Advances in Space Research. - 2005. V. 35, № 9. P. 1573-1578.

Подписано к печати 24.08.2005 г. Формат 60x84 1/16 Уч.-изд.л. - 1,0. Тираж 100 экз. Заказ JTO-

Отпечатано в типографии КГТУ 660074, Красноярск, Киренского, 26

№166 89

РНБ Русский фонд

2006-4 13550

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Каргатова, Татьяна Васильевна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ПРОБЛЕМЫ ИНТРОДУКЦИИ ТРАНСГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ В ЭКОСИСТЕМЫ.

1.1. Требования к оценке экологической безопасности ТМ.

1.2. Молельные экосистемы - как необходимый этан, предваряющий использование трансгенных организмов в современной биотехнологии.

1.3. Выживаемость бактерий в условиях окружающей среды.

1.4. Постановка проблемы исследований и обоснование логической структуры работы.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 3. ДИНАМИКА ЧИСЛЕННОСТИ И ИЗМЕНЕНИЯ СТРУКТУРЫ ПОПУЛЯЦИИ ТРАНСГЕННОГО ШТАММА ESCHERICHIA COLI Z905/pPHL7 ПОСЛЕ ИНТРОДУКЦИИ В ВОДНЫЕ МИКРОКОСМЫ.

3.1. Интродукция ТМ Е. coli Z905/pPHL7 в микрокосмы с дополнительным поступлением органических веществ.

3.1.1. Динамика численности Е. coli Z905/pPIIL7 после интродукции.

3.1.2. Экспрессии плазмидных генов у вариантов Escherichia coli Z905/pPIIL7, выделенных в разное время после интродукции.

3.2. Интродукция ТМ Е. coli Z905/pPHL7 в микрокосмы без дополнительного поступления питательных веществ с разной длиной трофической цепи.

3.2.1. Динамика численности Е. coli Z905/pPIIL7 после интродукции.

3.2.2. Изменение экспрессии плазмидных генов у вариантов Escherichia coli Z905/pPHL7, выделенных в разное время после интродукции.

Глава 4. МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕ11Е11ИЯ В ПОГ1УЛЯ1 ЩИ ТРАНСГЕПНОГО ШТАММА Е. coliZ905/pPHL7 ПОСЛЕ ИНТРОДУКЦИИ В МИКРОКОСМЫ.

4.1. Морфофизиологические изменения в популяции Е. coli Z905/pPIIL7 после интродукции в микрокосмы.

4.2. Влияние пребывания в микрокосмах на динамику роста изолятов ТМ Е. coli Z905/pPHL7, выделенных в разное время после интродукции.

4.3. Сосуществование трансгенного штамма Escherichia coli Z905c природными микроорганизмами при совместной интродукции в водные микрокосмы.

Глава 5. МОНИТОРИНГ РЕКОМБПНАП шбй ПЛАЗМИДЫ pPHL7 (AprLux+) В СЛОЖ11ЫХ СИСТЕМАХ.

5.1. Сравнительное изучение порога устойчивости к ампициллину у аборигенных микроорганизмов модельных систем и трансгенного штамма.

5.2. Использование плазмидной устойчивости к ампициллину для мониторинга рекомбинантной плазмиды pPllL7.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Оценка выживаемости трансгенного штамма Escherichia coli Z905/pPHL7 в водных микрокосмах"

Интенсивному и широкомасштабному конструированию трансгенных микроорганизмов (ТМ), полезное действие которых должно проявляться в открытых экосистемах, неизбежно должно сопутствовать изучение как их экологических характеристик и эффективности экспрессии клонированных генов в разных условиях, так и прогнозное изучение последствий их целенаправленного выпуска (Бельков, 2000; LejboIIe, 2000; Ronchel, Ramos, 2001; Lynch et al., 2004). Существуют серьезные опасения, что ТМ способны к выживанию в естественных экосистемах, что может приводить к уменьшению биоразнообразия (Muir and Howard, 2004). Еще более непредсказуемым и опасным может оказаться бесконтрольный перенос чужеродных генов, что может привести к активации или/и к образованию неизвестных ранее патогенов. Оценка выживаемости и конкурентоспособности ТМ и распространения рекомбинантных ДНК в разных условиях природных экосистем является одним из важных аспектов прогнозных исследований риска случайной и целенаправленной интродукции ТМ в окружающую среду.

Необходимость разработки подходов и методов для оценки риска потенциальных опасностей предполагает всестороннее изучение ТМ, как на уровне их собственных характеристик, так и их влияния на другие организмы. Поскольку для решения многих задач невозможно проведение экспериментов в естественных экосистемах, принято для их решения использовать искусственные экосистемы. Исследования в микрокосмах являются компромиссным вариантом, поскольку с одной стороны являются контролируемыми, с другой стороны моделируют условия, наиболее приближенные к естественным. Эксперименты в лабораторных микроэкосистемах, являясь промежуточным этапом между лабораторным культивированием генноинженерных микроорганизмов и полевыми испытаниями, позволяют получить необходимые данные для оценки возможных последствий попадания трансгенных штаммов в природные экосистемы.

Escherichia coli и созданные на их основе трансгенные штаммы - традиционные объекты генной инженерии, используемые для получения целевых продуктов (Grifantini et al., 1998; Hale and Thompson, 1998; Goda et al., 2000; Kholod and Mustelin, 2001; Kurokawa et al., 2001; Lu et al., 2001; Trabbic-Carlson et al.,

2004). На современном этапе рекомбинантные штаммы Escherichia coli используются в биомониторинге (Berno et al., 2004).0ценка риска как случайного попадания так и целенаправленной интродукции таких трансгенных микроорганизмов (ТМ) из микробиологических производств и научных лабораторий в природные экосистемы является необходимым этапом предваряющим работу с трансгенными штаммами (Cartagena Protocol on Biosafety, 2001). Однако, к настоящему времени нет общепринятого мнения о порядке проведения прогнозных исследований.

Эффективность выживания микроорганизмов в условиях окружающей среды зависит от способности клеток адекватно реагировать на изменение концентрации и типа питательных веществ, в сравнении с поддержанием штаммов в лабораторных условиях и в условиях промышленного производства. Естественно, что, попадая в природные экосистемы, клетки лишены богатых источников питания и попадают в условия жесткой конкуренции за имеющийся субстрат с аборигенной микрофлорой, но и еще приспосабливать свои ферментные системы к утилизации новых субстратов и выживать в условиях низких концентраций питательных веществ (Fleming et al., 1998; Lendenmann, Egli, 1998). Известно, что эн-теробактерии часто обнаруживаются в водной среде, где могут представлять угрозу человеческому здоровью (Мойсеенко, 1994; Baur et al., 1996; Solo-Gabriele et al., 2000; Rozen, Belkin, 2001). Однако, практически отсутствует информация об их возможной адаптации к этим условиям (Espinosa-Urgel, Kolter, 1998; Kussell et al., 2005). Еще меньше информации о последствиях случайной интродукции трансгенных штаммов, сконструированных на основе Е. coli. В связи с этим возникает необходимость мониторинга клеток ТМ и клонированных генов (Williamson, 1992; Бельков, 2000; Schultz et al., 2005). Использование методов молекулярной биологии и не всегда эффективно по сравнению с маркерными генетическими системами (Shingleton et al., 1998; Ripp et al., 2000; Sayler et al., 2001; Welsh, Kay, 2005), при этом последние имеют большее преимущество в клонировании гетерологичных генов, особенно это касается генов устойчивости к антибиотикам, кодируемых плазмидами, транспозонами (Bunker et al., 2004). Одной из удобных репортерных систем являются биолюминесцентные гены (1их+), использование которых дает во многих случаях большую чувствительность и экспресс-ность, чем у традиционных маркерных систем (Duffy et al., 1995; Niemann et al., 1997; Van Elsas et al., 1998; Ripp et al., 2000; Sayler, Ripp, 2000; Greer, Szalay, 2002; Chen, Zhu, 2005; Wiles et al., 2005).

E. coli Z905/pPI IL7 (AprLux+) - является удобным модельным объектом для проведения прогнозных исследований и разработки методов скрининга клеток ТМ, не предназначенных для целенаправленной интродукции в окружающую среду.

Основные задачи исследования:

1. Оценить способность к выживанию трансгенного штамма Е. coli Z905/pPHL7 (/w.\-CDABE,ampR) после интродукции в пресноводные микрокосмы.

3. Провести анализ стабильности сохранения рекомбинантной плазмиды pPIIL7 и границ изменения экспрессии плазмидных генов биолюминесценции и устойчивости к ампициллину.

Научная новизна работы. Впервые проведены эксперименты по изучению последствий интродукции трансгенного штамма в водные микрокосмы разной сложности. Показано, что независимо от структуры микрокосма трансгенный штамм Е. coli Z905/pPIIL7 (AprLux+) длительно сохраняется в сообществе аборигенных микроорганизмов. В результате обобщения данных проведенных экспериментов установлено, что после интродукции в водные микрокосмы в популяции ТМ Е. coli Z905/pPHL7 (AprLux+) проявляется гетерогенность как морфофизиоло-гических характеристик, так и экспрессии плазмидных генов. Визуальное отсутствие экспрессии биолюминесценции у выделенных изолятов не являлось свидетельством потери рекомбинантной плазмиды, что подтверждалось электрофоретиче-ским анализом. При периодическом культивировании слабосветящихся клеток Е. coli Z905/pPHL7, выделенных из микрокосмов, на среде с повышенными концентрациями ампициллина (более 200 мкг/мл) люминесцентный сигнал увеличивался, что позволяло регистрировать его с помощью биолюминометра

Практическое значение. Впервые исследована гетерогенность трансгенного штамма Е. coli Z905/pPIIL7 (AprLux+) после интродукции в модельные микрокосмы. Предложен метод эффективного скрининга клеток, содержащих плазмиду pPIIL7, при их низкой численности в бактериальном сообществе и сниженном уровне экспрессии плазмидных генов. Показано, что в накопительной культуре плазмидсодержащих клеток с добавлением высоких концентраций ампициллина (более 200 мкг/мл) происходит увеличение люминесцентного сигнала и подавление роста аборигенной микрофлоры, не имеющей плазмидных детерминант устойчивости к антибиотику. Результаты работы являются частью макета экологического паспорта на ТМ Е. coli Z905/pPHL7, который включен в в достижения РАН в 2000 г (в раздел микробиология), в 2001 г (в раздел биотехнология). Описание экологических характеристик вариантов трансгенного штамма Е. coli Z905/pPHL7, выделенных из микрокосмов, включено в состав базы данных природных и трансгенных светящихся микроорганизмов "Biolumbase".

Результаты работы включены в отчеты по грантам РФФИ №94-04-11189, №97-04-49988, №00-07-90111, №01-05-64615, №02-05-64096, №04-05-64188; КФН (гранты №1F0186, №5F0025, №4F0200, №8F0006, №10F195M; ФЦП «Интеграция» №162, проекта СО РАН «Интеграция» №25 и является частью исследований, проводимых по теме: «Биофизические основы функционирования природных экосистем (мониторинг, эксперименты, модели)» (шиекс приоритетного направления 4.1.5,4.2.1, номер госрегистрации 01.960004916).

Положения, выносимые на защиту.

1. Трансгенный штамм Е. coli Z905/pPHL7 после интродукции в различные водные микрокосмы со сложной организацией не элиминируется из микробоце-нозов в течение длительного времени.

2. После интродукции ТМ Е. coli Z905/pPI IL7 уровень экспрессии плазмидных генов значительно снижается. Во всех изученных микрокосмах отсутствует визуальное проявление люминесценции при сохранении рекомбинантной плазм иды.

3. Использование метода накопительных культур бактериальных клеток, несущих плазмиду pPIIL7 в селективной среде с высокими концентрациями ампициллина (более 200 мкг/мл) облегчает мониторинг плазм идсодержащих клеток при их низкой численности в микробных сообществах.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на Всероссийской конференции "Интродукция микроорганизмов в окружающую среду" (Москва, 1994), VI и VII Международной конференции "Новые направления в биотехнологии" (Москва, 1996, 1998), 31 Ассамблее COSPAR (Бирмингем, Англия, 1996), Республиканской конференции "Региональное природопользование и экологический мониторинг" (Барнаул, 1996), Международной конференции "Микробное разнообразие" ICEP (Пермь, 1996, 1998, Волгоград-Пермь, 2001), Международной конференции "Современные концепции эволюционной генетики (Новосибирск, 1997), Международной конференции "Проблемы загрязнения окружающей среды" (Москва, 1998), 1 Всероссийском семинаре "Моделирование неравновесных систем" (Красноярск, 1998), VII Экологическом Конгрессе INTECOL (Флоренция, Италия, 1998), 33 Ассамблее COSPAR (Варшава, Польша, 2000), ЛЕЙПЦИГ-2000, Международной конференции по биоразнообразию BDENE (Новосибирск, Россия, 2000, 2001), 34 Ассамблее COSPAR (Хьюстон, США, 2000), Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), конференции молодых ученых «Современные проблемы микробиологии, экологии и иммунологии» (Пермь, 2002), Международном Байкальском симпозиуме по микробиологии IBSM-2003 "Microorganisms in ecosystems of lakes, rivers and reservoirs" (Иркутск, 2003), Международной конференции «Регионы нового освоения: стратегия развития» (Хабаровск, 2004); Международной конференции по измерениям, моделированию и информационным системам для изучения окружающей среды (Томск, 2004), Международной конференции и школы молодых ученых по вычислительно-информационным технологиям для наук об окружающей среде (Новосибирск, 2005).

Публикации и личный вклад автора. По материалам диссертации опубликовано 47 научных работ, из них 16 статей в центральных и зарубежных журналах. Опубликованные экспериментальные данные получены автором как самостоятельно (Каргатова и др., 1997; Каргатова и др., 1999; Каргатова и др., 2001; Каргатова, 2002; Kargatova et al., 2000; Kargatova, 2003), так и в совместных экспериментах (Попова и др., 1993; Попова и др., 1994; Максимова и др., 1997; Попова и др., 1998; Pechurkin et al., 1999; Popova et al., 2001; Kargatova et al., 2003; Бояндин и др., 2004; Popova et al., 2005). Полученные автором результаты вошли в обзорные статьи по изучаемой проблеме (Popova et al., 1994; Брильков и др., 1995; Печуркин и др., 1997; Popova et al., 1997; Popova et al., 1999; Popova et al., 2000; Попова и др., 2001; Popova et al., 2001). Результаты, представленные в диссертации, защищаются впер

Заключение Диссертация по теме "Экология", Каргатова, Татьяна Васильевна

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ II ВЫВОДЫ

2. Установлено, что после интродукции в микрокосмы, независимо от их структуры, в популяции Е. coli Z905/pPIIL7 (AprLux+) происходят изменения в экспрессии плазмидных генов: снижение устойчивости к ампициллину и уровня биолюминесценции. В микрокосмах без дополнительного поступления органических веществ выявлены изменения морфофизиологических характеристик штамма.

3. Установлено, что в микрокосмах с высокой численностью микроводорослей (107 кл/мл) в популяции ТМ Е. coli Z905/pPHL7 доминировали клетки с высоким порогом устойчивости к ампициллину.

4. Выявлено, что визуальное отсутствие экспрессии люминесцентных генов не является свидетельством потери рекомбинантной плазмиды. При культивировании темновых вариантов Е. coli Z905/pPI IL7 на средах с добавлением ампициллина (5-50 мкг/мл) отмечена экспрессия биолюминесценции. Присутствие в клетках рекомби-нантных плазмид подтверждено результатами электрофореза. Клеток ТМ, утративших рекомбинантную плазмиду не обнаружено.

5. Использование двойной маркерной системы: устойчивости к ампициллину и способности к люминесценции - позволяет осуществлять мониторинг рекомбинантной плазмиды со сниженной экспрессией плазмидных генов при низкой численности интродуцента в микробных сообществах. Предложены 2 способа скрининга клеток ТМ и рекомбинантной плазмиды в микрокосмах. Первый способ основан на изучении характеристик отдельных изолятов, выделенных на агаризованных средах с разной концентрацией селективного фактора. Второй способ может быть полезен для быстрого обнаружения /шг-генов в микробных сообществах. В накопительной культуре с высокими концентрациями ампициллина (более 200 мкг/мл) отмечается увеличение интенсивности свечения до величин, регистрируемых с помощью биолюминометра.

6. Описаны экологические характеристики ТМ Е. coli Z905/pPHL7, позволяющие ему сосуществовать с аборигенной микрофлорой, сохраняя в клетках рекомбинантную плазмиду с клонированными /шг-генами. К основным характеристикам относится снижение метаболической активности клеток в условиях недостатка питательных веществ, в том числе изменение экспрессии плазмидных генов.

СЛОВАРЬ ОСНОВНЫХ ТЕРМИНОВ

АДАПТАЦИЯ - сложные генетические, физиологические и биохимические процессы, с помощью которых организм приспосабливается к условиям окружающей среды (или отдельным факторам: рН, температуре и др).

АДАПТИРОВАННЫЕ ТРАПСГЕППЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ (ТМ) - штаммы-реципиенты рекомбинантных плазмид, приведшие в соответствие экспрессию генотипа в проявлении фенотипа при: 1) клонировании гетерологичных для клетки-хозяина генов; 2) высокой копийности рекомбинантного вектора (наиболее хорошо изучено на плазм идах), дающей высокую нагрузку на метаболический аппарат клетки-хозяина. АВТОХТОННЫЕ (АБОРИГЕННЫЕ) БАКТЕРИИ - бактерии, обитающие в экосистеме изначально.

АЛЛОХТОППЫЕ БАКТЕРИИ - бактерии, привнесенные в систему извне.

ВАРИАНТ - штамм микроорганизмов, отличающийся по нескольким признакам от типового штамма, т.е. характерного для данного вида.

ВЕКТОР - фрагмент ДНК (хромосома, плазмида, фаг, вирус) в котором может быть клонирован новый информационный участок ДНК (вектор, несущий гетерологичный геном, может способствовать или препятствовать выживаемости ТМ).

ГЕНОТИП - наследственная основа организма, совокупность генов, локализованных в хромосомах; в более широком смысле - совокупность всех наследственных факторов организма - как ядерных, так и неядерных.

ГЕТЕРОЛОГИЧНЫЙ ГЕНОМ - чужеродная для данного вида ДНК (например, ДПК эукариот, клонированная в клетках прокариот). ГМО - генетически модифицированные организмы.

ДИВЕРГЕНЦИЯ ТМ - расслоение популяции ТМ под действием фактоРов среды, происходящее по типу бесплазмидных аналогов, но вследствие отягощения гетерологичным геномом, в популяциях ТМ наблюдается более высокая степень гетерогенности: нарушение программ смерти (переход в споры и некультивиремое состояние) и восстановления жизнеспособности (прорастание спор и переход в культивируемое состояние).

ИНТРОДУКЦИЯ - процесс внесения (попадания) аллохтонных бактерий в экосистему. КЛОП — популяция генетически родственных клеток, полученных из одной родительской клетки.

КОЕ - колопиеобразующие единицы.

КОПИОТРОФЫ - микроорганизмы, для нормальной жизнедеятельности которых необходимы богатые питательными веществами условия.

МИКРОКОСМ - изолированная молельная система, содержащая существенные компоненты природных экосистем и позволяющая поддерживать сосуществование внесенных в него видов популяций достаточно длительное время (от нескольких суток до нескольких лет). ОЛИГОТРОФЫ - микроорганизмы, обнаруживающиеся в местообитаниях с низким уровнем питательных веществ, не способные к росту в условиях с высоким содержанием питательных веществ.

ПЛАЗМИДА - внехромосомпая кольцевая ДНК, реплицирующаяся автономно; рекомбинантная плазмида - плазмида, содержащая клонированные гены. РЕКОМБИНАПТПАЯ ДНК - молекула ДНК, полученная методами генной инженерии. ТРАНСГЕНЫЙ (ГЕННОИНЖЕНЕРНЫЙ) МИКРООРГАНИЗМ (ТМ) - генетически измененный микроорганизм, полученный путем введения в него чужеродной ДНК. ФЕНОТИП - 1) проявление генотипа в данных условиях существования; 2) совокупность всех признаков и свойств организма, сформировавшихся в процессе его индивидуального развития; определяется взаимодействием генотипа с условиями среды, в которых протекает его развитие.

ШТАММ - чистая культура микроорганизмов или вирусов данного вида, выделенная из определенного источника (почвы, воды, организма заболевшего животного и т.п.) и обладающая особыми физиолого-биохимическими свойствами.

ЭКОЛОГИЧЕСКИЙ ПАСПОРТ НА ТМ - прогноз выживания ТМ на разных уровнях биологической иерархии, не зависящий от конкретной экосистемы (например, если ТМ и гетерологичный геном сохранится, то он может поступать по трофическим цепям к животным и человеку из любой экосистемы).

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ - синтез конечных продуктов, кодируемых ДНК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, люминесцентная система светящихся бактерий, изученная достаточно полно на молекулярно-генетическом уровне, использована нами для выявления изолятов, содержащих рекомбинантные плазмиды, и в том числе, с очень низкой способностью к экспрессии клонированных генов. Использование реком-бинантных плазмид с двойной маркерной системой (генами бактериальной люминесценции и устойчивости к ампициллину) позволило провести быстрый скрининг как популяции интродуцированного штамма ТМ, так и природных микроорганизмов, тем или иным способом получивших рекомбинантную плазм иду. Такая маркерная генетическая система оказалась очень удобной и поэтому постоянно использовалась для решения биотехнологических задач данной работы.

В наших экспериментах по интродукции в разные модельные системы было обнаружено очень быстрое (от 10 до 15 дней) исчезновение из популяции ТМ яркосветящихся клеток E.coli Z905/pPHL7. Однако ни в одном исследованном экспериментальном микрокосме появления вариантов E.coli Z905/pPHL7, полностью утративших плазмиду, не наблюдалось. Причем даже у вариантов, практически не проявляющих в фенотипе способность к биолюминесценции, сохранялась устойчивость к ампициллину в концентрациях 0,5-50 мкг/мл и более (при исходной устойчивости исследуемого ТМ более 50 мкг/мл). У всех выделенных из микрокосма вариантов E.coli Z905/pPHL7 не наблюдалось расщепления ре-комбинантных плазмид. В целом гетерогенность по признаку устойчивости к ампициллину была менее вариабельной, чем гетерогенность по признаку биолюминесценции. Снижение максимального уровня биолюминесценции частично обусловлено зависимостью экспрессии клонированного /их-оперона от общеклеточной регуляцией, определяемой функционированием хромосомных генов клетки-хозяина (включающую контроль активности /шг-оперона и обеспеченность субстратами самой люциферазной реакции).

Анализ динамики фенотипической изменчивости популяции ТМ в модельных системах показал, что высокие концентрации микроводорослей способствуют подержанию в клетках более высокого порога устойчивости к ампициллину. Выделяемые в разное время после интродукции в микрокосмы изоляты ТМ E.coli

Z905/pPIIL7 проявляли измененный уровень экспрессии не только генов, кодируемых плазмидными генами, но и признаков, определяемых геномом хромосомы. В первую очередь это проявлялось в изменении морфологии клеток и колоний, снижении скорости роста, изменении активности углеводных субстратов. Нами показано, что в монокультуре Е.соН Z905/pPIIL7 происходят аналогичные морфологические и физиолого-биохимические изменения, но в условиях длительного сосуществования ТМ с аборигенной микрофлорой гетерогенность по этим признакам была выше.

По мере адаптации популяция E.coli Z905/pPHL7 к условиям водных модельных систем заменялась на ряд субпопуляций, характеризующиеся сначала пониженными характеристиками роста, а затем на субпопуляции более адаптированные к условиям существования в микрокосмах. У таких вариантов ТМ было отмечено усиление способности к утилизации вторичных метаболитов аборигенных микроорганизмов рода Pseudomonas, что может быть обусловлено усилением протеолитической активности и изменением профиля утилизации углеводов. В наших экспериментах, кроме того, показано, что метаболиты микроводорослей и метаболиты Pseudomonas fluorescence могут индуцировать экспрессию люминесценцию у клеток ТМ.

Используя клонированные гены биолюминесценции исследовать ТМ гораздо проще, чем любого другого ТМ, несущего другие маркерные системы. Поэтому разработанные в диссертации методы скрининга /ых-генов можно применять как на твердых, так и в жидких селективных средах. Потенциальные возможности метода представлены в таблице 19. Селективность среды обеспечивается добавлением ампициллина, устойчивость к которому кодируется генами использованного для клонирования вектора pUC18. Только наличие двух маркерных систем позволило разработать системы мониторинга ТМ и его вариантов с измененным уровнем экспрессии плазмидных генов (табл. 19).

Варьируя концентрациями ампициллина можно индуцировать биолюминесцентный сигнал у вариантов со сниженным уровнем экспрессии (клеточный уровень) и обнаружить клетки ТМ в ассоциации аборигенных микроорганизмов при значительном снижении их численности в модельной системе (популяционный уровень). При добавлении субстрата в накопительную культуру численность популяции увеличивается на 4-5 порядков, а добавление высоких концентраций селективного фактора (ампициллина) приводит к доминированию в накопительной культуре клеток с плазмидной устойчивостью к антибиотику.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Каргатова, Татьяна Васильевна, Красноярск

1. Вельков, В. В. Интродукция генетически модифицированных микроорганизмов в окружающую среду. Перспективы и риск. Текст. / В. В. Вельков // Генетика. 1994. - Т. 30, № 5. - С. 581- 592.

2. Вельков, В. В. Оценка риска при интродукции генетически модифицированных микроорганизмов в окружающую среду Текст. / В. В. Вельков // Агрохимия. 2000. - № 8. - С. 76- 86.

3. Вячеславов, Л. Г. Высокая мультимеризация плазмиды pBR322 в бактериях E.coli В Текст. / Л. Г. Вячеславов, II. И. Мосевицкий //Молекулулярпая генетика, микробиология и вирусология. 1993. - № 6. - С. 23- 27.

4. Головлев, Е. JI. Введение в биологию стационарной фазы бактерий: механизм общего ответа на стрессы Текст. / Е. JI. Головлев // Микробиология. 1999. -Т. 68, №5.-С. 623-631.

5. Головлев, Е. JI. Другое состояние неспорулирующих бактерий Текст. / Е. Л. Головлев // Микробиология. 1998. - Т. 67, № 6. - С. 725-735.

6. Дебабов, В. Г. Жизнь бактерий за стенами лабораторий Текст. / В. Г. Де-бабов // Молекулярная биология. 1999. - Т. 33, № 6. - С. 1074-1084.

7. Илларионов, Б. А. Клонирование и экспрессия генов люминесцентной системы Photobacterium leiognathi в плазмидном векторе pUC18 Текст. / Б. А. Илларионов, М. В. Протопопова // Генетика. 1985. -№ 6. - С. 10-13.

8. Каргатова, Т. В. Экологический риск интродукции трансгенного штамма Escherichia coli Z905/pPI IL7 в водные экосистемы Текст. / Татьяна Каргатова // «Современные проблемы микробиологии, экологии и иммунологии»: сб. нау, тр. / Пермь, 2002.-С. 54-55.

9. Кодекс добровольно принимаемых правил, которых надлежит придерживаться при интродукции (выпуске) организмов в окружающую среду Текст. // Микробиология. 1993. - Т. 62. - Вып. 2. - С. 367- 380.

10. Конвенция о биологическом разнообразии Текст. / Женева, 1995. 34 с. (Printed in Switzerland, December,95; UNEP/CBD/94/1; 95-03681)

11. Лакин, Г. Ф. Биометрия Текст. / Георгий Лакин. 3-е изд., перераб. и доп.- М.: Высш. школа, 1980. 293 е., ил.; 22 см. - Библиогр.: с. 291-292. - 20000 экз.

12. Максимова, Е. Е. Регулируемая экспрессия генов бактериальной люминесценции, клонированных в многокопийной рекомбинантной плазмиде Текст. / Е. Е. Максимова, Л. Ю. Попова, Т. В. Каргатова, В. В. Шпагина // Микробиология. 1997. - Т. 66, № 2. - С. 223-227.

13. Миллер, Дж. Эксперименты в молекулярной генетике Текст. : [пер. с англ.] / Миллер Дж.; под. ред. С. И. Алихапян. М. : Мир, 1976.- 436с.; 22 см. (в пер.).

14. Михайловский, Г. II. Жизнь и ее организация в пелагиали Мирового океана Текст. / Георгий Михайловский. М.: Паука, 1992. - 269, 1. с.: ил.; 22 см. -Библиогр.: с. 249-262. - 370 экз. - ISBN 5-02-005464-Х.

15. Мойсеенко, II. II. Устойчивые к антибиотикам энтеробактерии в стоках и поверхностных водах водоемов Текст. / II. П. Мойсеенко // Антибиотики и химиотерапия. 1994. - Т. 39, № 2- 3. - С. 64- 68.

16. Определитель бактерий Берджи Текст. : в 2 т. / [Р. Беркли и др.] : [пер. с англ.] / под ред. акад. РАН Г. А. Заварзина. 9-е изд. - М.: Мир, 1997. - 26 см. -10000 экз. - ISBN 5-03-003110-3.

17. Пехов, А. П. Плазмиды бактерий М.: Медицина, 1986. - 224 с. - 22 см. -Библиогр.: с. 213-221.

18. Печуркин, II. С. Популяциоппые объекты биотехнологии. Текст. / А. В. Брильков, Т. В. Марченкова Новосибирск: Паука. Сиб.отд- ние, 1990. -173с.

19. Попова, Jl. Ю. Динамика структу ры популяции рекомбипаптного штамма Escherichia coli при непрерывном культивировании Текст. / Jl. Ю. Попова, II. И.

20. Луцкая, А. А. Богучаров, А. В. Брильков, П. С. Псчуркин // Микробиология. -1992. Т. 61, вып. 4. - С. 598-603.

21. Прозоров, А.А. Трансформация у бактерий / под ред. Б. И. Ильяшспко. -М.: Паука, 1988, 255 е., ил.; 22 см. - Библиогр. : с. 203-248.

22. Романова, Ю. М. Есть ли сходство в механизмах образования "некультиви-руемых" форм у грамотрицательпых бактерий и спор бацилл? Текст. / Ю. М. Романова, А. Л. Гипцбург // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1993. - № 6. - С. 34-36.

23. Сиренко, Л. А. Биологически активные вещества водорослей и качество воды Текст. / Лидия Сиренко. Киев : 11аукова думка, 1988. - 256 с.; 22 см. -(Человек и среда). - Библиогр.: с. 220-254 . - 1000 экз. - ISBN 5-12-000289-7.

24. Современные методы создания промышленных штаммов микроорганизмов Текст. / В.Г. Дебабов, В.А. Лившиц. М. : Высшая школа, 1988. - 206, [2] с. : ил. ; 22 см. - Библиоф.: с. 205. Иредм. указ.: с. 206- 207. - 30000 экз.

25. Сохранение биологического разнообразия в России (первый национальный доклад Российской федерации) Электронный ресурс. . М. : Изд- во Гос. Комитета РФ по охране окружающей среды, 1997. -http://195.208.223.253/~vart/doc/gcf/rcmc/rcport97/contr.html

26. Aertsen, A. Stress and how bacteria cope with death and survival Text. / A. Aertsen, C. W. Michiels // Critical Reviews in Microbiology. 2004. - V. 30, №4. - P. 263-273.

27. Amargcr, N. Genetically modified bacteria in agriculture Text. / N. Amarger // Biochimie. 2002. - V. 82. - P. 1061-1072.

28. Amnions, D. A genetically modified marker strain of Escherichia coli Text. / D. Ammons, J. Rampersad, G. E. Fox // Current Microbiology. 1998. - V. 37. - P. 341346.

29. Amy, P. S. Survival and detection of bacteria in an aquatic environment Text. / P. S. Amy, II. D. Hiatt // Applied and Environmental Microbiology. 1989. - V. 55, № 4. - P. 788-793.

30. Arana, I. Influence of survival process in a freshwater system upon plasmid transfer between Escherichia coli strains Text./ I. Arana, J. I. Justo, M. Pocino, J. Iriberri, I. Barcina // Microbial Ecology. 1997. - V. 33. - P. 41-49.

31. Armada, S. P. Effect of temperature, salinity and nutrient content on the survival responses of Vibrio splendidus biotype I. Text. / S. P. Armada, R. Farto, M. J. Perez, T. P. Nieto // Microbiology. 2003. - V. 149. - P. 369-375.

32. Avila-Campos, M. J. Phenotypic stability and plasmid detection in Actinobacil-lus actinomycetemcomitans Text. / M. J. Avila-Campos, G. Padilla // Brazilian Dental Journal. 2001. - V. 12, № 2. - P. 105-108.

33. Awong, J. Microcosm for assessing survival of genetically engineered microorganisms in aquatic environments Text. / J. Awong, G. Bitton, G. R. Chaudhry // Applied and Environmental Microbiology. 1990. - V. 56, № 4. - P. 977-983.

34. Banning, N. Persistence of biofilm- associated Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa in groundwater and treated effluent in a laboratory model system Text. / N. Banning, S. Tozc, B. J. Mee // Microbiology. 2003. - V. 149. - P. 47- 55.

35. Barcina, I. Survival of allochthonous bacteria in aquatic systems: biological approach Text. /1. Barcina, P. Lebaron, I. Vivcs-Rego // FEMS Microbiology and Ecology. 2000. - V. 1997. - P. 1-9.

36. Bennett, A. F. Phenotypic and evolutionary adaptation of a model bacterial system to stressful thermal environments Text. / A. F. Bennett, R. E. Lcnski // EXS.1997.-V. 83.-P. 135-154.

37. Berno, E. Recombinant Escherichia coli for the biomonitoring of benzene and its derivatives in the air Text. / E. Berno, P. D. F. Marcondes, R. S. Gamalero, M. Eandi // Ecotoxicology and Environmental Safety. 2004. - V. 57, № 2. - P. 118-122.

38. Bernstein, С. Bile salt activation of stress response promoters in Escherichia coli Text. / C. Bernstein, 11. Bernstein, С. M. Payne, S. E. Beard, J. Schneider, J. // Current Microbiology. 1999. - V. 39. - P. 68-72.

39. Bogosian, G. Death of the E. coli K- 12 strain W3110 in soil and water Text. / G. Bogosian, L. E. Sammons, P. J. L. Morris, J. P. O'Neil, M. A. Ileitkamp, D. B. Weber// Applied and Environmental Microbiology. 1996. - V. 62. - P. 4114—4120.

40. Bohannan, B. J. M. The Relative Importance of Competition and Predation Varies with Productivity in a Model Community Text. / B. J. M. Bohannan, R. E. Lenski // American Naturalist. 2000. - V. 156. - P. 329-340.

41. Booth, I. R. Stress and the single cell: intrapopulation diversity is a mechanism to ensure survival upon exposure to stress Text. /1. R. Booth // International Journal of Food Microbiology. 2002. - V. 78, №1-2. P. 19-30.

42. Brettar, I. Influence of ecosystematic factors on survival of E. coli after large-scale release into lake water mesocosm Text. /1. Brettar, M. G. Ilofle // Applied and Environmental Microbiology. 1992. - V. 58. - P. 2201-2210.

43. Burgess, J. G. Microbial antagonism: a neglected avenue of natural products research Text. / J. G. Burgess, M. Elizabeth, J. M. Bregu, M. Mearns-Spragg, K. G. Boyd // Journal of Biotechnology. 1999. - V. 70, № 1- 3. - P. 27-32.

44. Byrd, J. J. Determination of plasmid DNA concentration maintained by noncul-turable Escherichia coli in marine microcosms Text. / J. J. Byrd, J. C. Leahy, R. R. Colwell // Applied and Environmental Microbiology. 1992. - V. 58. - P. 2266-2270.

45. Byrd, J. J. Long-term survival and plasmid maintenance of Escherichia coli in marine microcosms Text. / J. J. Byrd, R. R. Colwell // FEMS Microbiology and Ecology. 1993. - V. 2. - P. 9-14.

46. Caro, A. Physiological changcs of Salmonella typhimurium cells under osmotic and starvation conditions by image analysis Text. / A. Caro, P. Got, B. Baleux // FEMS Microbiology Letters. 1999. - V. 179, № 2. - P. 265-273.

47. Cartagena Protocol on Biosafety Electronic resource./ Convention on Biological Diversity 2001. 25 p.-http://vvww.biodiv.org/biosafety.

48. Chandrasekaran, S. Transfer and expression of amultiple antibiotic resistance plasmid in marine bacteria Text. / S. Chandrasekaran, B. Venkatesh, D. Lalithakumari // Current Microbiology. 1998. - V. 37. - P. 347-351.

49. Chao, W. L. Survival of genetically engineered Escherichia coli in natural soil and river water Text. / W. L. Chao, R. L., Feng // Journal of Applied Bacteriology. -1990.-V. 68.-P. 319-325.

50. Chatterji, D., Ojha, K. A. Revisiting the stringent response, ppGpp and starvation signals Text. / D. Chatterji, K. A. Ojha // Current Opinion in Microbiology. -2001.-V. 4, №2.-P. 160-165.

51. Chen, G. lux-marked Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide production in the presence of rhamnolipid Text. / G. Chen, II. Zhu // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces . 2005. - V. 41, № 1. - P. 43-48.

52. Cooper, V. S. The population genetics of ecological specialization in evolving Escherichia coli populations Text. / V. S. Cooper, R. E. Lcnski // Nature. 2000. - V. 407, № 6805. - P. 736-739.

53. Doblhoff-Dier, O. Safe biotechnology 9: values in risk assessment for the environmental application of microorganisms Text. / O. Doblhoff-Dicr, II. Bahmayer, A. Bennet, G. Brunius, M. Cantley, C. Collins, P. Crooy, A. Elmqvist, C. Frontali-Botti,

54. R. Havenaar, II. Haymerle, II. Lelieveld, M. Lex, J. L. Mahler, L. Martinez, C. Mos-gaard, L. Olsen, J. Pazlarova, F. Rudan, M. Sarvas, II. Stepankova, G. Tzotzos, K. Wagner, R. Werner // Trends in Biotechnology. 1999. - V. 17. - P. 307-311.

55. Droge, M. Horizontal gene transfer among bacteria in terrestrial and aquatic habitats as assessed by microcosm and field studies Text. / M. Droge, A. Puhlcr, W. Selbitschka // Biology and Fertility of Soils. 1999. - V. 29. - P. 221-245.

56. Dykhuizcn, D. E. Santa Rosalia revisited: why are there so many species of bacteria? Text. / D. E. Dykhuizcn // Antonie Van Leeuwenhoek. 1998. - V. 73. - P. 2533.

57. Eisenstark, A. Escherichia coli genes involved in cell survival during dormancy: role of oxidative stress Text. / A. Eisenstark, C. Miller, J. Jones, S. Leven // Biochemical and Biophysical Research Communications. 1992. -V. 188.-P. 1054-1059.

58. Espinosa-Urgcl, M. Escherichia coli genes expressed preferentially in an aquatic environment Text. / M. Espinosa-Urgcl, R. Kolter//Molecular Microbiology. 1998. -V. 28,№2.-P. 325-332.

59. Fcrenci, T. Hungry bacteria definition and properties of a nutritional state Text. / T. Fercnci // Environmental Microbiology. - 2001. - V. 3, № 10. - P. 605611.

60. Fcrenci, T. Regulation by nutrient limitation Text. / T. Fercnci // Current Opinion in Microbiology. 1999. - V. 2. - P. 208-213.

61. Finkel, S. E. Evolution of microbial diversity during prolonged starvation Text. / S. E. Finkel, R. Kolter// Proceedings of the National Academy of Science of the USA. 1999. - V. 96. - P. 4023-4027.

62. Fish, J. T. Influence of freshwater sediment on the survival of Escherichia coli and Salmonella sp. as measured by three methods of enumeration Text. / J. T. Fish , G. W. Pettibone // Letters in Applied Microbiology. 1995. - V. 20, № 5. - P. 277-281.

63. Fleming, J. Т. Optimization of Differential Display of prokaryotic mRNA: application to Pure Culture and soil microcosms Text. / J. T. Fleming, W.-II. Yao, G. S. Sayler // Applied and Environmental Microbiology. 1998. - V. 64,- P. 3422-3428.

64. Foster, P. L. Adaptive mutation: implications for evolution Text. / P. L. Foster // Bioessays. 2000. - V. 22. - P. 1067-1074.

65. Foster, P. L. Mechanisms of mutation in nondividing cells. Insights from the study of adaptive mutation in Escherichia coli Text. / P. L. Foster, W. A. Rosche //Annuals of the New-York Academy of Scicnces. 1999. - V. 870. - P. 133-145.

66. Garci-Lara, J. Effect of previous growth conditions on the starvation- survival of Escherichia coli in seawatcr Text. / J. Garci-Lara, J. Martinez, M. Vilamu, J. Vives-Rego//Journal of General Microbiology. 1993.-V. 139.-P. 1425-1431.

67. Gayte, X. Bactcrial stimulation in mixed cultures of bacteria and organic carbon from river and lake waters Text. / X. Gayte, D. Fontvieille, K. J. Wilkinson // Microbial Ecology. 1999. - V. 38. - P. 285-295.

68. Giard, J.-C. Starvation-induced multiresistance in Enterococcus faecalis J1I2- 2 Text. / J.-C. Giard, A. Ilartke, S. Flahaut, A. Benachour, P. Boutibonnes, Y. Auffray // Current Microbiology. 1996. - V. 32. - P. 264-271.

69. Goda, S. K. Recombinant expression analysis of natural and synthetic bovine alfa- casein in Escherichia coli Text. / S. K. Goda, A. F. Sharman, M. Yates, N.

70. Mann, N. Carr, N. P. Minton, J. K. Brchm // Applied Microbiology and Biotechnology. -2000.-V. 54, № 5. P. 671-676.

71. Gourmelon, M. Surv ival of Escherichia coli exposed to visible light in seawater: analysis of rpoS-dependent effects Text. / M., Gourmelon, D. Touati, M. Pommepuy, M. Cormier // Canadian Journal of Microbiology. 1997. - V. 43, № 11. - P. 10361043.

72. Greer, L. F. 3rd, Szalay, A. A. Imaging of light emission from the expression of luciferases in living cells and organisms: a review Text. / L. F. 3rd Greer, A. A. Szalay // Luminescence. 2002. - V. 17. - P. 43-74.

73. Grifantini, R. Efficient conversion of 5-substituted hydantoins to D-alfa-amino acids using recombinant E. coli strains Text. / R. Grifantini, G. Galli, G. Carpani, C. Pratesi, G. Frascotti, G. Grandi // Microbiology. 1998. - V. 144. - P. 947-954.

74. Gu, M. B. A two- stage minibioreactor system for continuous toxicity monitoring Text. / M. B. Gu, G. C. Gil, J. N. Kim // Biosensors and Bioelectronics. 1999. -V. 14.-P. 355-361.

75. Gurijala, K. R. Explanation for the decline of bacteria introduced into the lake water Text. / K. R. Gurijala, M. Alexander //Microbial Ecology. 1990. - V. 20. - P. 231-244.

76. Ho, M.-W. Gene Technology and Gene Ecology of Infectious Diseases Text. / M.-W. IIo, T. Traavik, O. Olsvik, B. Tappeser, С. V. Howard, C. von Weizsacker, G. C. McGavin // Microbial Ecology in I Icalth and Disease. 1998. - V. 10. - P. 33-59.

77. Kholod, N. Novel vectors for со- expression of two proteins in E. coli Text. / N. Kholod, T. Mustclin // Biotcchniques. 2001. - V. 31, № 2. - P. 322-328.

78. Kim, W. S. Dunn Survival Response and Rearrangement of Plasmid DNA of Lactococcus lactis during Long- Term Starvation Text. / W. S. Kim, J. N. Park, J. Ren, S. Ping, W. Noel // Applied and Environmental Microbiology. 2001. - V. 67, № 10.-P. 4594-4602.

79. Klappcnbach, J. A. rRNA opcron copy number reflects ecological strategics of bactcria Text. / J. A. Klappcnbach, J. M. Dunbar, Т. M. Schmidt // Applied and Environmental Microbiology. 2000. - V. 66, № 4. - P. 1328-1333.

80. Koch, A. L. Oligotrophs versus copiotrophs Text. / A. L. Koch // Bioessays. -2001. V. 23, № 7. - P. 657-661.

81. Kreitlow, S. Cyanobacteria a potential source of new biologically active substances Text. / S. Kreitlow, S. Mundt, U. Lindequist //Journal of Biotechnology. -1999.-V.70, № 1-3.-P. 61-63.

82. Krimsky, S. Biotechnology safety Text. / S. Krimsky // Environment. 1997. -V. 39, №5 . - P. 27- 30.

83. Krimsky, S. Standartyzed microcosms in microbial risk assessment Text. / S. Krimsky, P. P. Wrubcl, I. G. Naess, S. B. Levy, R. E. Wetzler, B. Marshall // Bioscience. 1995. - V. 45, № 9. - P. 590-599.

84. Krocr, N. Microbial trophic interactions in aquatic microcosms designed for testing genetically engineered microorganisms: a field comparison Text. / N. Kroer, R. B. Coffin // Microbial Ecology. 1992. - V. 23. - P. 143-157.

85. Mah, Т. F. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents Text. / T> F. Mah, G. Л. O'Toole // Trends in Microbiology. 2001. - V. 9. - P. 34-39.

86. Mandelbaum, R. T. In situ microcosms in aquifer bioremcdiation studies Text. / R. T. Mandelbaum, M. R. Shati, D. Ronen // FEMS Microbiology Reviews. 1997 -V. 20, №3-4.-P. 489-502.

87. Matin, A. The molecular basis of carbon- stavration- induced general resistance in Escherichia coli Text. / A. Matin // Molecular Microbiology. 1991. - V. 5, № 1. -P. 3-10.

88. McFcters, G. A. Survival of Escherichia coli and Yersinia enterocolitica in stream water: comparison of field and laboratory exposures Text. / G. A. McFcters, S. I. Trezicva // Microbial Ecology. 1991. - V. 22. - P. 65-74.

89. Miller, II. L. UN-based biotechnology regulation: scientific and economic havoc for the 21st century Text. / ILL. Miller // Trends in Biotechnology. 1999. - V. 17. -P.185-190.

90. Miller, R. V. Bacterial gene swapping in nature Text. / R. V. Miller // Science American. 1998. -№ 1. - P. 67-71.

91. Millstone, E. Beyond "substantial equivalence" Text. / E. Millstone, E. Brun-ncr, S. Mayer //Nature. 1999. - V. 401. - P. 525-526.

92. Moller, A. Luminotnetry and PCR- based monitoring of gene- tagged cyanobac-teria in Baltic Sea microcosms Text. / A. Moller, A.-M. Norrby, K. Gustafson, J. Jans-son // FEMS Microbiology Letters. 1995. - V. 129, № 1. - P. 43-50.

93. Moreau, P. L. Non- growing Escherichia coli cclls starv ed for glucose or phosphate use different mechanisms to survive oxidative stressdouble dagger Text. / P. L.

94. Morcau, F. Gerard, N. W. Lutz, P. Cozzone // Molecular Microbiology. 2001. - V. 39, №4.-P. 1048-1060.

95. Morrissey, J. P. Exploitation of genetically modified inoculants for industrial ecology applications Text. / J. P. Morrissey, U. F. Walsh, A. O'Donnell, Y. Moenne-Loccoz, F. O'Gara // Antonie Van Leeuwenhoek. 2002. - V. 81. - P.599-606.

96. Muela, A. Changes in DNA content and cellular Death during a starvation- survival process of Escherichia coli in river water Text. / A. Muela, I. Arana, J. I. Justo, C. Seco, I. Barcina // Microbial Ecology. 1999. - V. 37. - P. 62-69.

97. Muir, W. M. Characterization of environmental risk of genetically engineered (GE) organisms and their potential to control exotic invasive species Text. /W. M. Muir, R. D. I Ioward // Aquatic Scienccs. 2004. - V. 66, № 4. - P. 414-420.

98. Nagel, A. C. Screening for ribosomal- based false positives following prokary-otic mRNA differential display Text. / A. C. Nagcl, J. T. Fleming, G. S. Sayler, K. L. Beattie // Biotechniques. 2001. - V. 30, № 5. - P. 988-996.

99. Neilsen, К. M. Horizontal gene transfer from transgenic plants to terrestial bacteria rare event? Text. / К. M. Neilsen, A. M. Bones, K. Smalla, J. D. van Elsas // FEMS Microbiology Reviews. - 1998. - V. 22, № 1. - P. 79-103.

100. Nelson, S. M. The Effect of Temperature on Viability of Carbon- and Nitrogen-Starved Escherichia coli Text. / S. M. Nelson, R. W. Attwell, M. M. Dawson, C. A. Smith//Microbial Ecology. 1996.-V. 32.-P. 11-21.

101. Nicolopoulou, A. Metabolic and compositional changes in Escherichia coli cells starved in seawater Text. / A. Nicolopoulou, K. Zoumbou, M. Papageorgacopoulou, M. Papapetropoulou // Microbiological Research. 1994. - V. 149, № 4. - P. 343350.

102. Niemann, S. Biocontrol strain Pseudomonas Jluorescens CHAO and its genetically modified derivative with enhanced biocontrol capibility exert comparable effects on the structure of a Sinorhizobium meliloti population in gnotobiotic systems Text. /

103. S. Niemann, С. Keel, A. Puhler, W. Selbitschka // Biology and Fertility of Soils. -1997.-V. 25.-P. 240-244.

104. Notley-MeRobb, L. Adaptive mgl-regulatory mutations and genetic diversity evolving in glucose-limited Escherichia coli populations Text. / L. Notley-MeRobb, T. Ferenci // Environmental Microbiology. 1999. - V. 1, № 1. - P. 33-43.

105. Nystrom, T. Maintenance energy requirement: what is required for stasis survival of Escherichia colP. Text. / T. Nystrom, N. Gustavsson // Biochimical and Biophysical Acta. 1998. V. 1365, № 1-2.-P. 225-231.

106. Nystrom, T. Not quite dead enough: on bacterial life, culturability, senescence, and death Text. / T. Nystrom // Achieves of Microbiology. 2001. - V. 176, № 3. - P. 159- 164.

107. Nystrom, T. Responses to multiple- nutrient starvation in marine Vibrio sp. strain CCUG 15956 Text. / T. Nystrom, K. Flardh, S. Kjelleberg // Journal of Bacteriology. 1990. - V. 172, № 12. - P. 7085-7097.

108. Parveen, A. Biofilm culture of Pseudomonas aeruginosa expressing lux genes as a model to study susceptibility to antimicrobials Text. / A. Parveen, G. Smith, V. Salisbury, S. M. Nelson // FEMS Microbiology Letters. 2001. - V. 199, № 1. - P. 115-118.

109. Perrot, F. Gel immobilization improves survival of Escherichia coli under temperature stress in nutrient- poor natural water Text. / F. Perrot, T. Jouenne, M. Fcuil-loley, H. Vaudry, G.-A. Junter// Water Research. 1998. - V. 32. - P. 3521-3526.

110. Pinhassi, J. Dominant marine bacterioplankton species found among colony-forming bacteria Text. / J. Pinhassi, U. L. Zweifcl, A. Hagstrom // Applied and Environmental Microbiology. 1997. - V. 63, № 9. - P. 3359-3366.

111. Pipke, R. Survival and function of a genetically engineered pseudomonad in aquatic sediment microcosm Text. / R. Pipke, I. Wagner-Dobler, K. N. Timmis, D.

112. Dwyer// Applied and Environmental Microbiology. 1992.-V. 58.-P. 1259-1265.

113. Popova, L. Yu. Population Dynamics of Transgenic Strain Escherichia coli Z905/pPIIL7 in Freshwater and Saline Lake Water Microcosms with Differing Micro-» bial Community Structures Text. / L. Yu. Popova, Т. V. Kargatova, E. E. Ganusova,

114. Т. I. Lobova, А. N. Boyandin, О. A. Mogilnaya, N. S. Pechurkin // Advances in Space v Research. 2005. V. 35, № 9. P. 1573-1578.

115. Ramirez, D. M. Characterization of stress and protein turnover from protein overexpression in fed- batch E. coli cultures Text. / D. M. Ramirez, E. W. Bentlcy //

116. Journal of Biotechnology. 1999. - V. 71. - P. 39-58.

117. Ramos, J. L. Responses of Gram-negative bacteria to certain environmentalistressors Text. / J. L. Ramos, M. Gallegos, S. Marques, M. Ramos-Gonzalez, M. Espinosa-Urgel, A. Segura // Current Opinion in Microbiology. 2001. V. 4. - P. 166171.

118. Ramos, J. L. Survival in soil of an herbicide- resistant Pseudomonas putida strain bearing a recombinant TOL plasmid Text. / J. L. Ramos, E. Duque, M. Ramos-Gonzalez // Applied and Environmental Microbiology. 1991. - V. 57. - P. 260- 266.

119. Riley, M. S. Rapid phenotypic change and diversification of a soil bacteriumduring 1000 generations of experimental evolution Text. / M. S. Riley, V. S. Cooper, R. E. Lenski, L. J. Forney, T. L. Marsh // Microbiology. 2001. - V. 147, № 4. - P. 995-1006.

120. J. L. Ramos-Diaz Ramos // Environmental Microbiology. 2000. - V. 2, № 3. - P. i 319-323.

121. Rosche, W. A. The role of transient hypermutators in adaptive mutation in Escherichia coli Text. / W. A. Rosche, P. L. Foster // Proceeding of National Academy of Sciences of USA. 1999. - V. 96, № 12. - P. 6862-6867.

122. Rosenberg, S. M. Evolving responsivcly: adaptive mutation Text. / S. M. Rosenberg // Nature reviews. 2001. - V. 2. - P. 504-515.

123. Rosenberg, S. M. Transient and heritable mutators in adaptive evolution in the lab and in nature Text. / S. M. Rosenberg, C. Thulin, R. S. Harris // Genetics. 1998. -V. 148.-P. 1559-1566.

124. Roszak, D. B. Survival strategies of bacteria in the natural environment Text. / D. B. Roszak, R. R. Colwell // Microbiological Reviews 1987. - V. 51. - P. 365-379.Ф

125. Rozen, Y. Survival of enteric bacteria in seawater Text. / Y. Rozen, S. Belkin // FEMS Microbiology Reviews. 2001. - V. 25. - P. 513- 529.

126. Saylcr, G. S. Field applications of genetically engineered microorganisms for bioremediation processes Text. / G. S. Saylcr, S. A. Ripp // Current Opinion in Biotechnology. 2000. - V. 11. - P. 286-289.

127. Sayler, G. S. Gene expression monitoring in soils by mRNA analysis and gene lux fusions Text. / G. S. Sayler, J. T. Fleming, D. E. Nivens // Current Opinion in Biotechnology. 2001. - V. 12, №5. - P. 455-460.

128. Schafer, II. Successional changcs in the genetic diversity of a marine bacterial assemblage during confinement Text. / II. Schafcr, P. Servais, G. Muyzer // Achieves of Microbiology.-2000.-V. 173, №2.-P. 138-145.

129. Shim, J. M. Biological control of crown gall: construction and testing of new biological control agents Text. / J. M. Shim, S. K. Farrand, A. Kerr// Phytopathlogy. -1987.-V. 77.-P. 463-466.

130. Smets, В. F. Plasmid introduction in metal- stressed, subsurface- derived microcosms: plasmid fate and community response Text. / B. F. Smets, J. B. Morrow, A. C. Pinedo // Applied and Environmental Microbiology. 2003. - V. 69, № 7. P. 40874097.

131. Smit, E. Risks associated w ith the application of genetically modified microorganisms in terrestrial ecosystems Text. / E. Smit, J. D.van Elsas, J. A. van Veen // FEMS Microbiology Reviews. 1992. - V. 88. - P. 263-278.

132. Sniegowski, P. D. Evolution of high mutation rates in experimental populations of E. coli Text. / P. D. Sniegowski, P. J. Gcrrish, R. E. Lenski // Nature. 1997. - V. 387,№6634.-P. 703-705.

133. Spreng, S. Plasmid maintenance systems suitable for GMO- based bacterial vaccines communities Text. / S. Spreng, J. F. Viret // Vaccine. 2005. - V. 23, № 17- 18.- P. 2060-2065.

134. Stockwell, V. O. Fate of Agrobacterium radiobacter K84 in the environment communities Text. / V. O. Stockwell, L. W. Moore, J. E. Loper // Applied and Environmental Microbiology. 1993. - V. 59. - P. 2112-2120.

135. Takeuchi, K. Expression of red- shifted green fluorescent protein by Escherichia coli 0157:117 as a marker for the detection of cells on fresh produce Text. / K. Takeuchi, J. F. Frank // Journal of Food Protection. 2001. - V. 64, № 3. - P. 298- 304.

136. Tamanai-Shacoori, Z. Conjugal transfer of natural plasmids between Escherichia coli strains in sterile environmental water Text. / Z. Tamanai-Shacoori, M. Arturo, M. Pommepuy, C. Mamez, M. Cormier // Current Microbiology. 1995. - V. 30, №3.-P. 155-160.

137. Tao, II. Functional genomics: expression analysis of Escherichia coli growing on minimal and rich media Text. / II. Tao, C. Bausch, C. Richmond, F. R. Blattncr, T. Conway // Journal of Bacteriology. 1999. - V. 181. - P. 6425-6440.

138. Tenaillon, O. Mutators and sex in bacteria: conflict between adaptive strategics Text. / O. Tenaillon, I I. Le Nagard, B. Godelle, F. Taddci // Proceedings of the National Academy of Science the USA. 2000. - V. 97, № 19. - P. 10465-10470.

139. Thingstad, T. F. A theoretical approach to the question of how trophic interactions control carbon demand, growth rate, abundance, and diversity Text. / T. F. Thingstad, R. Lignell // Aquatic Microbial Ecology. -1997. V. 113. - P. 19-27.

140. Trevors, J. T. Use of microcosms to study genetic interactions between microorganisms Text. / J. T. Trevors // Microbiological Sciences. 1988. - V. 5, № 5. - P. 132-136.

141. Uhlin, В. E. R plasmid gene dosage effect in E. coli K- 12: Cop mutants of the R plasmid RldrdI9 Text. / В. E. Uhlin, K. Nordstrom // Plasmid. 1977. - V. I. - P.l

142. Van Elsas, J. D. Environmental risks and fate of genetically engineered microorganisms in soil Text. / J. D. Van Elsas, J. T. Trevors // Journal of Environmental Sciences and I Iealth. 1991 a. - V. 26. - P. 981 - 1001.

143. Velkov, V.V. Env ironmental genetic engineering: I lope or hazard? Text. / V. V. Velkov // Current Science. 1996. - V. 70. - P. 823- 832.

144. Wai, S. N. How Vibrio cholerae survive during starvation Text. / S. N. Wai, Y. Mizunoe, S. Yoshida // FEMS Microbiology Letters. 1999. - V. 180, № 2. - P. 123— 131.

145. Wang, G. Survival of enterohemorrhagic Escherichia coli 0157:117 in water Text. / G. Wang, M. P. Doyle // Journal of Food Protection. 1998. - V. 61, № 6. - P. 662-667.

146. Wegrzyn, G. Replication of plasmids during bacterial response to amino acid starvation Text. / G. Wegrzyn // Plasmid. 1999. - V. 41. - P. 1-16.

147. Wegrzyn, G. Stress responses and replication of plasmids in bactcrial cells. Electronic resource. / G. Wegrzyn, A. Wegrzyn // Microbial Cell Factory. 2002. -http://www.microbialeellfactories.eom/contcnt/l/l/2.

148. Weikert, C. An Escherichia coli host strain useful for efficient overproduction of secreted recombinant protein Text. / C. Weikert, U. Sauer, J. E. Bailey // Biotechnology and Biocnginecring. 1998. - V. 59, №3. - P. 386-391.

149. Welsh, D. K. Bioluminescence imaging in living organisms Text. / D. K. Welsh, S. A. Kay // Current Opinion in Biotechnology. 2005. - V. 16, № 1. - P. 7378.

150. Williamson, M. Environmental Risk from the Release of Genetically Modified organisms (GMOs) the Need for Molecular Ecology Text. / M. Williamson // Molecular Ecology. - 1992. - V. I, № 1. - P. 3-8.

151. Winding, A. Bacteria and protozoa in soil microhabitats as affected by earthworms Text. / A. Winding, R. Ronn, N. B. Ilendriksen // Biology and Fertility of Soils. 1997. - V. 24. - P. 133-140.

152. Whitman, W. B. Procaryotes: the unseen majority Text. / W. B. Whitman, D. C. Coleman, W. J. Wiebe // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1998. - V. 95. - P. 6578-6583.

153. Wrobel, B. Replication regulation of ColEl- like plasmids in amino acid-starved Escherichia coli Text. / B. Wrobel, G. Weigrzyn // Plasmid. 1998. - V. 39, № 1.- P. 48-62.

154. Yun, J. W. Production of inulo- oligosaccharides from inulin by recombinant E. coli containing endoinulinase activity Text. / J. W. Yun, С. II. Song, J. W. Choi, Y. J. Choi, S. K. Song // Bioprocess Engineering. 1999. -V. 21. - P. 101-106.

155. Zhang, Y. Expression of Eukaryotic Proteins in Soluble Form in Escherichia coli Text. / Y. Zhang, D. R. Olscn, К. B. Nguyen, P. S. Olson, E. T. Rhodes, D. Mascaren-has // Protein Expression and Purification. 1998. - V. 12, № 2. - P. 159-165.

Информация о работе

Каргатова, Татьяна Васильевна
кандидата биологических наук
Красноярск, 2005
ВАК 03.00.16

Диссертация

Оценка выживаемости трансгенного штамма Escherichia coli Z905/pPHL7 в водных микрокосмах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы