Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль сенсорных РНК в регуляции биосинтеза рибофлавина у Escherichia coli и Bacillus subtilis

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Роль сенсорных РНК в регуляции биосинтеза рибофлавина у Escherichia coli и Bacillus subtilis"

/

На правах рукописи

UQ3452476

ЕРЕМИНА Светлана Юрьевна

Роль сенсорных РНК в регуляции биосинтеза рибофлавина у Escherichia coli и Bacillus subtilis

03.00.15-Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 о ип-1

' •■> ........J

Москва 2008

003452476

Работа выполнена в лаборатории биохимической генетики Федерального государственного унитарного предприятия Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов «ФГУТТ ГосНИИгенетика»

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор A.C. Миронов

ФГУП «ГосНИИгенетика»

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор C.B. Машко

Научно-исследовательский институт «Аджиномого-Генетика» (ЗАО «АГРИ»)

кандидат биологических наук И.В. Манухов

ФГУП «ГосНИИ генетика»

Ведущая организация: кафедра генетики биологического факультета

на заседании Диссертационного совета Д 217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д.1 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика»

Автореферат разослан « года

Ученый секретарь диссертационного совета

МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится

кандидат биологических наук

Г. Г. Заиграева

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Важной характеристикой жизнедеятельности микроорганизмов является использование широкого спектра регуляторных механизмов, обеспечивающих многообразие экспрессии генов в ответ на изменение условий внешней среды. Несколько лет назад был обнаружен новый тип регуляторных лидерных мРНК, выступающих в качестве сенсоров специфических метаболитов (малых молекул) и напрямую, без белковых посредников, способных регулировать транскрипцию и трансляцию соответствующих мРНК [Mironov A.S et al, 2002, Winkler W. et al„ 2002]. Такие сенсорные РНК представляют собой природные аптамеры и способны с высокой специфичностью и селективностью распознавать и связывать природные метаболиты, а также формировать альтернативные вторичные структуры в зависимости от присутствия специфического метаболита, включать или выключать процесс элонгации транскрипции мРНК или инициации трансляции этих мРНК.

Открытие нового механизма регуляции экспрессии генов, основанного на специфическом узнавании молекулой сенсорной РНК низкомолекулярных эффекторов, позволяет начать разработку принципиально новой стратегии получения штаммов-продуцентов целевых продуктов, так как эта регуляция осуществляется без участия регуляторных белков, путем прямого взаимодействия сенсорной РНК с низкомолекулярными соединениями, которые могут добавляться непосредственно в ростовую среду и модулировать экспрессию целевых генов. Это обстоятельство существенно упрощает задачу направленного изменения активности целевых генов в связи с тем, что молекула сенсорной РНК является значительно более компактной мишенью для модификации по сравнению со сложными молекулами регуляторных белков, действие которых приходится устранять для обеспечения высокого выхода желаемых продуктов в классических работах по конструированию штаммов-продуцентов. Можно использовать модифицированные сенсорные РНК для направленной реконструкции метаболизма бактерий. Это совершенно новый подход к управлению активностью генов, который позволит включать или выключать целевые гены с помощью сенсорных РНК путем использования простых метаболитов типа аминокислот, витаминов или даже ионов металлов, а в более далекой перспективе сможет послужить основой для создания нового поколения лекарственных препаратов на базе искусственно сконструированных молекул сенсорных РНК.

Несмотря на то, что биосинтез рибофлавина у Bacillus subtihs на протяжении многих лет был объектом интенсивных генетических и биохимических исследований, некоторые аспекты структурно-функциональной организации пб-оперона остаются неясными. С другой стороны, представлялось интересным сравнить роль сенсорных РНК в регуляции биосинтеза рибофлавина у Escherichia coli и Bacillus subtilis.

Цель Ii задачи исследования. Настоящая работа выполнялась с целью проведения исследований по расшифровке механизма регуляции с. участием сенсорных РНК. В качестве объектов исследования использовались сенсорные РНК, кодируемые лидерными областями рибофлавинового {rib) оперона Bacillus subtilis и гена ribB Escherichia coli.

Достижение указанной цели было связано с решением следующих задач:

— компьютерный анализ вторичной структуры лидерных областей модельных сенсорных РНК;

— проведение сайт-направленного мутагенеза лидерных участков п'6-оперона В. subtilis и гена ribB Е. coli для получения модифицированных сенсорных РНК, позволяющих изучить механизм функционирования этих областей;

— конструирование транскрипционных и трансляционных фьюзов лидерной области п'6-оперона В subtilis и гена ribB Е. coli с реперным геном lacZ;

— изучение экспрессии in vivo и in vitro мутантных вариантов лидерных областей пй-оперона В. subtilis и гена ribB Е. coli с нуклеотидными заменами, приводящими к изменению конформации соответствующих сенсорных РНК.

Научная новизна. Результаты проведенного мутационного анализа лидерной области гг'А-оперона В. subtilis и лидерной области гена ribB Е. coli позволили получить новую информацию для расшифровки механизма регуляции биосинтеза рибофлавина с участием сенсорных РНК. Показано, что специфические мутации в лидерной области п'6-оперона В subtilis, стабилизирующие формирование терминирующей шпильки, приводят к полной репрессии этого оперона. С другой стороны, мутации, нарушающие образование шпильки, обеспечивают конститутивную ФМН-независимую экспрессию п'6-оперона. Эти данные уточняют модель регуляции rib-оперона В subtilis с участием специфической ФМН-зависимой сенсорной РНК. В опытах in vitro показано, что ФМН модулирует вторичную структуру сенсорной РНК и влияет на уровень терминации транскрипции пб-оперона.

Впервые проведен структурно-функциональный анализ гена ribB Е coli. На основании данных сайт-направленного мутагенеза и анализа поведения полученных мутантов установлено, что лидерная область гена ribB Е. coli кодирует специфическую ФМН-зависимую сенсорную РНК. Из результатов опытов по гибридизации ЗОБ-субъединицы рибосомы с сенсорной РНК гена ribB можно сделать вывод о том, что ФМН участвует в формировании шпильки, перекрывающей сайт связывания рибосомы. На основе полученных данных была построена модель регуляции гена ribB Е. coli, основанная на изменении конформации сенсорной РНК в зависимости от присутствия эффектора - ФМН. Согласно этой модели, связывание ФМН с сенсорной РНК стабилизирует шпилечную структуру, перекрывающую сайт связывания рибосомы, и тем самым блокирует инициацию трансляции гена ribB.

В ходе проведенной работы было установлено, что главное отличие механизмов регуляции экспрессии генов биосинтеза рибофлавина у В. subtilis и Е coli с участием ФМН-специфической сенсорной РНК состоит в том, что в п'6-опероне В. subtilis контроль осуществляется на уровне терминации транскрипции, в то время как в гене ribB Е coli - на уровне инициации трансляции.

Практическая значимость. Методом сайт-направленного мутагенеза получена коллекция мутантных вариантов лидерной области пб-оперона В subtilis и лидерной области гена ribB Е. coli с нуклеотидными заменами в участках лидерной мРНК, которые влияют на формирование вторичной структуры или на связывание мРНК с эффектором. Коллекция может быть использована для дальнейших исследований в этой области и для конструирования высокоактивных штаммов-продуцентов рибофлавина.

Структура работы. Диссертация изложена на 118 листах машинописного текста, включая 42 рисунка и 9 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов, изложения и обсуждения результатов, выводов и списка используемой литературы. Список литературы включает 150 работ отечественных и зарубежных авторов.

Апробация работы. Материалы исследования по теме диссертации опубликованы в трех статьях. Диссертационная работа была апробирована на семинаре секции «Генетика микроорганизмов» Ученого Совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 25 сентября 2008 года.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы и плазмиды. Использованные в работе бактериальные штаммы и плазмиды, а также их генетические характеристики представлены в Таблице 1.

Таблица 1. Использованные в работе бактериальные штаммы и плазмиды.

Штаммы, плазмиды Генотип Происхождение

В subtilis:

В. subtilis 168 Дикий тип ВКПМ

В subtilis RK99 lvs42 Д.Л Перумов

RK998 ribBilO lvs42 ribB «

RK996 ribC lys42 ribC «

Е coli К-12.

TGI thi supE hsdA5 A(lac-proAB)/F tra A3 6proAB* lacPlacZm\S ВКПМ

MG 1655 Дикий тип ВКПМ

AM4001 Как MG 1655, но ribB■ Tn5, Km* ВКПМ

AM4003 Как MG 1655, но lacZ..TnlO, TcK ВКПМ

АМ4002 Как MG 1655, но lacZ JnlQrtbB Tn5, TcK, KmK Данная работа

Плазмиды

pDG268 amyE lacZ Amp" Cm", присутствует SD последовательность ВКПМ

pLZ pDG268, содержащая £,coRI-BomHI лидерную область пб-оперона В subtihs дикого типа Данная работа

pLZ34, 35,40,49, 59,87, 121, 128, 158, 161,235/265,79/189 Как pLZ, но содержат нуклеотидные замены или делеции в лидерной области rib-оперона »

pJEL250 Малокопийный вектор, Атрк, присутствует SD последовательность П Валентин-Хансен (Дания)

pJEL246 Малокопийный вектор, Атрк П. Валентин-Хансен (Дания)

pBZ pJEL246, содержащая Есо\!Л-ВатШ лидерную область гена ribB* длиной 400 пн (от -120 до +280) Данная работа

pBZ250 pJEL250, содержащая EcoKl-BamKl лидерную область гена пЬВ* длиной 400 пн (от -120 до +280) »

pBZMl, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, M6/M7 Как pBZ, но содержат нуклеотидные замены или делеции в лидерной области гена ribB* »

pBZM9250 Как pBZ250, но содержит делецию Д8-235 »

Манипуляции с ДНК. Трансдукцию бактериофагом PI проводили по стандартной методике [Миллер Дж., 1979]. Выделение плазмидной ДНК, клонирование, трансформацию и анализ рекомбинантных плазмид проводили с использованием стандартных методов, изложенных в [SambrookJ. et al., J989]. Компетентные клетки готовили по методу Манделл [Mandel M, Higa А., 1970].

Сайт-направленный мутагенез. Мутации в лидерной области rib-оперона В subtihs и в лидерной области гена rib В Е. coli получали методом сайт-направленного мутагенеза с помощью ПЦР, используя специфические праймеры.

Полимеразную цепную реакцию проводили на приборе Gene Amp PCR System 2400 (фирма "Perkin-Elmer Cetus"). Температурный режим подбирали с учетом длины амплифицированного фрагмента, длины и состава используемых праймеров. Выделение и очистку ПЦР продуктов проводили с использованием набора "Gene clean" (фирма "Bio 101", La Jolla, США) и GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit (фирма "GE Healthcare"). Присутствие соответствующих мутаций проверяли секвенированием по методу Сэнгера [Sanger F. et al., 1977]

Компьютерный анализ вторичной структуры лндерных РНК.

Потенциальные вторичные структуры мРНК, формирующиеся в процессе транскрипции, были смоделированы с помощью алгоритма Цукера-Тернера [Zuker DH. étal, 1999]

Выделение суммарной РНК проводили методом гуанидинтиоционатной экстракции [Wickieser J К, 2005].

Определение старта транскрипции проводили методом «достройки праймера» с использованием AMV ревертазы, [Р32]-меченного праймера и 70-80 мкг суммарной РНК согласно [Sambrook J et а!, 1989]

Транскрипция in vitro. Синтез лидерной мРНК r/6-оперона дикого типа и ее мутантных вариантов, а также специфической лидерной мРНК гена ribB проводили по методике, описанной в работе [Franklund S. V., Kadner RJ, 1997] с использованием препарата холофермента РНК-полимеразы Е coli ("GE Healthcare").

Гибридизацию РНК с олнгонуклеотндами проводили по методике, описанной в работе [MironovA.S eta!., 2002].

Анализ формирования 30S-MPHK-TPHKn,el иннцнаторного комплекса in vitro (тоупринтинг) проводили по методике согласно [Hartz D. et al., 1988].

Измерение активности ß-галактозидазы. Бактериальные культуры выращивали при 30°С (для Е coli) или 37°С (для В. subtilis) в жидкой среде Спицайзена или М9 с необходимыми добавками и глюкозой (0,4%). Ночные культуры штаммов дважды отмывали, разводили в 20 - 50 раз в свежей минимальной среде, содержащей необходимое количество рибофлавина или его производных (ФАД и ФМН), и выращивали при 30°С или 37°С в течение 2-3 часов до экспоненциальной фазы роста. Активность ß-галактозидазы определяли по методу Миллера [Мичлер Дж. 1979] и выражали в условных единицах, рассчитанных по формуле:

Е = ОП42</ОП45о-1.

Приведенные значения активности - средние из 4 независимых определений.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1 Исследование регуляции рибофлавинового оперона Bacillus subtilis

К моменту начала настоящей работы появились первые данные, свидетельствующие о том, что негативная регуляция рибофлавинового (rib) оперона В. subtilis конечными продуктами биосинтеза рибофлавина осуществляется с помощью принципиально нового механизма аттенюации транскрипции. Настоящая работа является продолжением исследований по расшифровке механизма регуляции с участием сенсорных РНК и посвящена детальному анализу структурно-функциональной организации лидерной области r/Ä-оперона В subtilis, в частности, изучению влияния отдельных нуклеотидных замен в лидерной области r/6-оперона на процесс фолдинга лидерной мРНК и на эффективность связывания с регуляторным метаболитом - ФМН.

1.1 Клонирование и определение нуклеотидной последовательности лидерной области /-/¿-оперена В. ьиЫШ*

Прежде чем приступить к получению мутаций в лидерной области гй-оперона В. знЫШй, необходимо было осуществить её клонирование. Лидерная область пЬ-оперона была амплифицирована с хромосомной ДНК штамма В. ¡иЫИи 168 методом ПЦР с использованием фланкирующих праймеров. Нуклеотидная последовательность данного фрагмента по обеим нитям была определена методом секвенирования по Сэнгеру. Полученная в результате секвенирования нуклеотидная последовательность представлена на Рис. 1. Нуклеотиды в области от +25 до +162 входят в состав так называемого //«-элемента и обнаруживают высокий уровень гомологии при сравнении лидерных областей генов биосинтеза рибофлавина у различных таксономических групп бактерий. Кроме того, в пределах т^я-элемента содержатся, по крайней мере, 6 инвертированных повторов, способных формировать потенциальные шпилечные структуры. Важно подчеркнуть, что один из повторов (I) способен формировать шпильку либо с левым плечом терминатора (VII), способствуя образованию антитерминатора транскрипции, либо с последовательностью I', что может приводить к образованию альтернативной структуры анти-антитерминатора и, соответственно, терминатора транскрипции. Формирование шпильки I - I', вероятно, является решающим событием для последующего фолдинга лидерной мРНК и приводит к образованию терминирующей шпильки УН:У1Г, что, в конечном счете, обусловливает преждевременную терминацию транскрипции мРНК п'6-оперона.

1.2 Сайт-направленный мутагенез лидерной области г/А-оперона В. ьиЫИ'к

Для дальнейшего подтверждения модели регуляции п'6-оперона с участием ФМН проводился мутационный анализ лидерной области оперона. Сайт-направленный мутагенез проводили методом ПЦР с использованием специфических праймеров, содержащих нуклеотидные замены в участках лидерной РНК, которые предположительно влияют на формирование ее вторичной структуры или на связывание сенсорной РНК с эффекторами (ФМН, ФАД). Расположение всех полученных мутаций в лидерной области г/6-оперона показано на Рис. 1. Таким образом, были получены мутанты Ь34 (034—>С) и Ь35 (035—>С), содержащие такие замены в левом плече антитерминатора, которые нарушают формирование шпильки 1:УП и одновременно обеспечивают дополнительную гомологию между нуклеотидами, формирующими шпильку 1.Т. Мутанты Ы58 (1580-}А) и Ы61 (16Ю—>А), напротив, содержат замены, нарушающие формирование шпильки 1:Г анти-антитерминатора, и тем самым увеличивают вероятность образования антитерминатора транскрипции (шпилька 1:УП). Кроме того, получены три пары нуклеотидных замен, нарушающих формирование шпилек: П:1Г - мутанты Ь40

RSI -70

cccgaattc

agggtgatgttttgtttttctcaaattgtaagtttatttcaTTGCGTactttaaaaagga tcccactacaaaacaaaaagagtttaacattcaaataaagtaacgcatgaaatttttcct

I II

....................»• ..........>•

-10 _^ +10 +30 CC A

Г^ . . . TT t

tcgcTATAATaaccaataaggacaaatgaataaagattgz£t /T^GGGGCaggctgga agcgatattattggttattcctgtttacttatttctaacataggaagccccgtcccacct

II' III III' IV ■*.................................................► ..........................................................►

T+50 A +70 T +90

T. T. . t .

aatcccgaccggcggtagtaaagcacatttgctttagagcccgtgacccgtgtgcataag ttagggctggccgccatcatttcgtgtaaacgaaatctcgggcactgggcacacgtattc

t_Д79-189_

IV V V' VI VI' I'

i........................................> ■*.........................► ■*....... -«.................

+110 A T +130 +150 A A

•T T . . . T .T

cacgcggtggattcagtttaagctgaagccgacagtgaaagtctggatggga : :gatg gtgcgccacctaagtcaaattcgacttcggctgtcactttcagacctaccctcttcctac

Д79-189

+170 +190 +210

atgagccgctatgcaaaatgtttaaaaatgcatagtgttatttcctattgcgtaaaatac tactcggcgatacgttttacaaatttttacgtatcacaataaaggataacgcattttatg Д79-189 T

VII VII'

........................................► ........................................

+230 +250 +270

ctaaaGCCCCGAAtt.ttttataaattcggggct.t.ttttgacggtaaataacaaaagaggg

gatttcggggcttaaaaaatatttaagccccgaaaaaactgccatttattgttttctccc t_A235/265_T

+ 290 MEEYYMKLALDLAKQGE

[gaggjgaaacaajatgjgaagagtattatatgaagctggccttagatcttgcgaagcagggcg

ctccctttgtttaccttctcataatatacttcgaccggaatctagaacgcttcgtcccgc

ctaggccc RS2

Рисунок 1. Нуклеотидная последовательность лидерной области гй-оперона

В. subtilis.

Обычным прописным шрифтом выделены -10 и -35 последовательности промотора. Красными буквами обозначены консервативные основания ^-элемента. Потенциальные шпилечные структуры обозначены пунктирными стрелками и римскими цифрами. Голубым цветом выделен терминатор транскрипции (VII - VII'). Зеленым цветом выделен анти-антитерминатор (I - Г). Заглавными жирными буквами обозначены нуклеотиды, формирующие антитерминатор транскрипции (I - VII). Желтым цветом выделены последовательности инвертированных повторов. Заглавными жирными буквами и стрелками над основной последовательностью обозначены нуклеотидные замены, содержащиеся в геноме исследуемых мутантов. Стрелкой указан старт транскрипции. Рамками выделены сайт связывания рибосомы (SD) и старт трансляции. Делеции показаны нижним подчеркиванием и вертикальными стрелками. Нумерация нуклеотидов приведена, начиная со старта транскрипции rib-оперона. Обычными малыми буквами обозначены нуклеотидные последовательности праймеров RS1 и RS2.

(G40—>А) и L49 (С49->Т), Ш:11Г - мутанты L59 (G59-^A) и L87 (С87->Т) и V:V' -мутанты L121 (G121—>А) и L128 (С128->Т). Наконец, были получены два делеционных мутанта: L235/265, у которого практически полностью удален терминатор транскрипции (шпилька VII:VH'), и L79/189, содержащий делецию протяженного участка лидерной области от +79 до +189 нуклеотида (Рис. 1).

Далее было осуществлено клонирование мутаций в лидерной области rib-оперона в составе экспрессионного вектора pDG268 и их интеграция в хромосомный локус атуЕ штаммов В. subtilis RK99, В. subtilis RK998 ribBI 10 и В. subtilis RK996 ribC.

1.3 Изучение экспрессии транскрипционных фыозов ribPL-lacZ в клетках штаммов В. subtilis различного генотипа

Был исследован эффект полученных мутаций в лидерной области в составе транскрипционных фьюзов ribPL-lacZ. В качестве реципиента использовали ауксотрофные по рибофлавину штаммы: RK998 ribBI 10 с мутацией в структурном гене ribB, кодирующем рибофлавинсинтазу, и RK996 ribC с мутацией в гене ribC, контролирующем реакцию синтеза ФМН из рибофлавина.

Из данных Табл. 2, прежде всего, следует, что использование для компенсации ауксотрофности штамма RK998 ribBllO экзогенного рибофлавина в концентрации 0,1 мкМ обеспечивает высокий уровень дерепрессии активности ß-галактозидазы в контрольном штамме с интактной лидерной областью (по сравнению с прототрофным штаммом В. subtilis RK99 - данные не приводятся). В то же время добавление флавинов приводит к существенному подавлению экспрессии этого гибридного оперона: 12-кратному в присутствии рибофлавина, 17-кратному в присутствии ФАД и максимальному - почти 20-кратному - на фоне экзогенного ФМН. Как и ожидалось, в клетках штамма RK998 ribBI 10 ярко проявляются свойства ■ мутаций в лидерной области в отношении их реакции на добавление экзогенных флавинов. Так, в случае штаммов, содержащих делеции лидерной области (L235/265 и L79/189) или точковые мутации (L158 и L161), добавление экзогенных флавинов практически никак не сказывается на уровне экспрессии соответствующих фьюзов. Остальные мутанты также характеризуются существенным (10-15-кратным) снижением уровня регуляции под действием экзогенных флавинов по сравнению с контрольным штаммом.

С другой стороны, уже само по себе присутствие мутации ribC в геноме штамма RK996 приводит к конститутивной экспрессии ß-галактозидазы под контролем лидерной области дикого типа. Более того, у этого штамма не наблюдается какого-либо подавления экспрессии фьюза при добавлении высоких концентраций экзогенного рибофлавина, тогда как в присутствии ФМН и ФАД происходит примерно 5-кратное снижение активности ß-галактозидазы.

Таблица 2. Влияние рибофлавина и его производных на экспрессию транскрипционных фьюзов пЪРЬ-1асЪ в клетках штаммов

В. ьиЬИШ ЮС998 пЪВПО и В. эиЫПк ЮС996 пЬС

Мутант Нуклео-тндная замена Активность Р-галактозидазы в присутствии добавок

В. эиЬПШ ИК998 пЪВПО В. ««¿й/й КК996 пЬС

Риб (0,1 мкМ) Риб (5 мкМ) ФМН (5 мкМ) ФАД (5 мкМ) Риб (1 мкМ) Риб (50 мкМ) ФМН (50 мкМ) ФАД (50 мкМ)

- 550 44 (12,5) 28 (19,6) 32 (17,1) 450 440 (1,0) 88 (5,1) 95(4,7)

Ь34 С34-»С 11 Ю (1,1) 9 (1,2) 10(1,1) 15 14 (1,1) 12 (1,2) 13 (1,1)

Ь35 С35—»С 16 14 (1,2) 13 (1,2) 15 (1,0) 17 16 (1,0) 15(1,1) 16(1,0)

Ь40 С40—>А 340 218 (1,5) 222 (1,5) 234 (1,4) 388 369 (1,0) 272 (1,4) 295 (1,3)

Ь49 С49—>Т 398 290 (1,4) 310 (1,3) 327 (1,2) 414 397 (1,0) 328 (1,3) 346 (1,2)

Ь59 в59-»А 457 265 (1,7) 270 (1,7) 263 (1,7) 461 458 (1,0) 313 (1,5) 324 (1,4)

Ь87 С87—>Т 413 235 (1,8) 214 (1,9) 228 (1,8) 474 450 (1,0) 288 (1,6) 296 (1,6)

Ы21 С121—»А 216 156 (1,4) 145 (1,5) 161 (1,4) 356 349 (1,0) 207 (1,7) 253 (1,4)

Ы28 С128—»Т 238 169 (1,4) 168 (1,4) 171 (1,4) 338 327 (1,0) 225 (1,5) 249 (1,4)

Ь158 С158—»А 198 164 (1,2) 165 (1,2) 160 (1,2) 235 228 (1,0) 198 (1,2) 216(1,1)

Ь161 С161—»А 190 173 (1,1) 179 (1,1) 181 (1,1) 210 198 (1,0) 165 (13) 170 (1,2)

Ь235/265 Д235-265 478 445(1,1) 452 (1,1) 459 (1,1) 512 505 (1,0) 484(1,1) 499 (1,0)

1Л9/189 А79-189 165 161 (1,0) 163 (1,0) 159 (1,0) 265 256 (1,0) 260 (1,0) 262 (1,0)

Ночные культуры штамма В. тЫйн, содержащие в составе хромосомы транскрипционные фьюзы пЬР-1ас'А, разводили в 50 раз в свежей среде Спицайзена и растили при 37°С до СЮбоо=0.2, затем в соответствующие пробы добавляли рибофлавин, ФМН или ФАД в указанных концентрациях и растили еще 2 часа перед определением активности Р-галактозидазы. Активность р-галактозидазы выражена в единицах Миллера В скобках приведены значения уровня репрессии активности р-галактозидазы в присутствии флавинов. Приведенные значения активности - средние из 4 независимых определений.

Качественно такая же картина наблюдается в опытах с мутантами по лидерной области: экзогенный рибофлавин не оказывает сколько-нибудь заметного ингибирующего действия на их экспрессию, в то время как ФМН и ФАД ингибируют экспрессию у мутантов L40, L59, L87, L121, L128. Эти данные свидетельствуют о том, что негативными эффекторами регуляции r/6-оперона служат фосфорилированные производные ФМН или ФАД, но не сам рибофлавин.

Таким образом, характер экспрессии реперного гена lacZ под контролем мутантных лидерных последовательностей полностью согласуется с моделью формирования альтернативных вторичных структур лидерной мРНК в зависимости от присутствия или отсутствия регуляторного метаболита ФМН.

Наиболее показательно в этом отношении поведение мутантов L34 и L35, содержащих нуклеотидные замены, которые нарушают формирование шпильки I:VII и одновременно обеспечивают дополнительную гомологию между нуклеотидами, формирующими шпильку 1:1'. Именно у этих мутантов наблюдается существенное снижение базального уровня экспрессии реперного гена независимо от добавления экзогенных флавинов (Табл. 2). Из этого следует, что стабилизация шпилечной структуры 1:1', которая обусловлена нуклеотидными заменами у мутантов L34 и L35, имеет решающее значение в метаболической регуляции лидерной области rib-оперона, поскольку необратимо приводит к формированию терминатора транскрипции. Анализ фенотипического проявления других мутаций в лидерной области показывает, что нарушение любой из исследованных шпилечных структур (1:1', 11:11', Ш:11Г, V:V') приводит к снижению уровня метаболической регуляции rib-оперона производными рибофлавина. У мутантов с делециями (мутант L235/265 -делеция, перекрывающая терминатор транскрипции или мутант L79/189 - делеция, удаляющая существенную часть rfn-элемента) происходит устранение негативного действия флавинов. Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что метаболическая регуляция п'Ь-оперона осуществляется за счет изменения конфигурации вторичной структуры лидерной мРНК в зависимости от присутствия метаболитов-эффекторов - производных рибофлавина. Однако окончательное заключение о природе метаболита-эффектора на основании опытов in vivo сделать трудно из-за неконтролируемых реакций взаимопревращения флавинов в клетке. Для решения этого вопроса на следующем этапе работы проводили опыты по изучению транскрипции лидерной мРНК r/6-оперона в системе in vitro.

1.4 Транскрипция лидерной мРНК rib-oперона дикого типа и ее мутантных вариантов в системе in vitro

Было изучено влияние рибофлавина и его производных ФМН и ФАД на характер транскрипции лидерной мРНК, синтезируемой с ПЦР-фрагмента, содержащего лидерную область п'й-оперона дикого и мутантных типов. В

предварительных опытах было показано, что максимальное воздействие на терминацию транскрипции п'й-оперона дикого типа обнаруживает ФМН, причем даже в небольших концентрациях (от 1 до 3 мкМ). Аналогичные опыты были выполнены на матрицах, содержащих полученные нами мутации в лидерной области rib-оперона. Как следует из данных, представленных на Рис. 2, в присутствии ФМН 65% мРНК, синтезированной с матрицы, содержащей интактную лидерную область, подвержено преждевременной терминации транскрипции (Рис. 2, дорожка 2). В полном соответствии с данными in vivo у мутантов L34 и L35 наблюдается приблизительно такой же процент преждевременной терминации транскрипции как у дикого типа в присутствии ФМН, причем добавление ФМН в транскрипционную смесь не приводит к заметному увеличению эффективности терминации (Рис. 2, дорожки 3 6).

Мутант wt L34 L35 L158 1.161 L235/265 L79/189

ФМН - + -+ -+ - + - + -+ - +

360- tat- - 1"« — . - wn. „ ж» mm .... *»«.

255 -t , айн Ят НИ

%Т 20 65 63 67 60 62 32 35 25 30 10 10 30 30 № дорожки 12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Рисунок 2. Эффект мутаций, затрагивающих формирование шпилечной структуры 1:1', и делеций в лидерной области ий-оперона на уровень терминации транскрипции в системе in vitro (концентрация ФМН в пробах 5 мкМ).

Зеркальная картина наблюдается у мутантов 1Л58 и Ы61: у обоих мутантов эффективность терминации транскрипции как в присутствии, так и в отсутствие ФМН составляет 25-35% (Рис.2, дорожки 7-НО), что примерно соответствует таковой у дикого типа в отсутствие ФМН. Примерно таким же уровнем терминации характеризуется мутант Ь79/189 с делецией, перекрывающей почти весь //«-элемент, но не затрагивающей терминирующую шпильку VII:VII' (Рис.2, дорожки 13, 14). Наконец, мутант Ь235/265 характеризуется наиболее сильным снижением эффективности терминации транскрипции (до 10%), что вполне объяснимо полным отсутствием в его лидерной области терминирующей шпильки VII:VII' (Рис. 2, дорожки 11,12).

Результаты транскрипционных опытов с остальными мутантами представлены на Рис. 3. Как видно из представленных электрофореграмм, существенным отличием мутантных вариантов является их сниженная чувствительность к добавлению в транскрипционную систему ФМН по сравнению с диким типом.

Мутант wt L40 L49 L59 L87 L121 L128

ФМН - + - + -+ - + -+ _ + - +

360 -, т- • Щщт mrnt «и

255 —> «»жж* im*M

%Т 18 68 45 46 36 32 24 37 31 35 39 46 41 51 № дорожки 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14

Рисунок 3. Эффект мутаций, затрагивающих формирование различных шпилечных структур в лидерной области rib-оперона, на уровень терминации транскрипции в системе in vitro (концентрация ФМН в пробах 5 мкМ).

1.5 Опыты по гибридизации специфических олигонуклеотидов с лидерной РНК rib-оперона

Таким образом, на основании полученных данных можно сделать важное заключение о том, что ФМН является ключевым метаболитом-эффектором rib-оперона и оказывает прямое действие на уровень терминации транскрипции rib-оперона, вероятно модулируя вторичную структуру лидерной мРНК. Для проверки этого предположения были проведены опыты in vitro по гибридизации специфических олигонуклеотидов с меченой [Р32] лидерной мРНК /'/'¿-оперона в присутствии ФМН, ФАД и рибофлавина или в их отсутствие. Один из олигонуклеотидов #1 комплементарен правому плечу шпильки 1:1', а другой #2 -левому плечу шпильки V:V'. Препараты РНК обрабатывали РНКазой Н, которая расщепляет только двунитевые участки гибридов РНК/олигонуклеотид, а затем проводили электрофорез продуктов реакции в полиакриламидном геле.

РНК-аза И ФМН

олигонуклеотид

230 —> 162

116

+ + + ++ + + - + _ +

- - - #1 #1 #2 #2

Рисунок 4. Опыты по

гибридизации лидерной мРНК п'6-оперона со специфическими олигонуклеотидами в присутствии или отсутствие ФМН.

% расщепления № дорожки

0 0 69 33 10 10 1 2 3 4 5 6 7

Из результатов этих опытов (Рис. 4), прежде всего, следует, что в отсутствие олигоиуклеотидов не происходит расщепления меченой лидерной мРНК (размер 230 н.) под действием РНКазы Н (дорожки 2,3). При гибридизации мРНК с олигонуклеотидом #2 наблюдается появление дополнительного фрагмента мРНК (~116н. - дорожки 6,7), интенсивность которого примерно одинакова (-10% ог контроля) независимо от присутствия или отсутствия в системе ФМН. Эти данные согласуются с моделью вторичной структуры лидерной мРНК. В случае олигонуклеотида #1 появляется дополнительный фрагмент (~162 п.), интенсивность которого существенно выше в отсутствие ФМН (69% от контроля - дорожка 4), чем в его присутствии (33% от контроля - дорожка 5). Из этого следует, что ФМН стабилизирует шпильку 1:1', правое плечо которой должно гибридизоваться с праймером #1, тогда как в отсутствие ФМН эта шпилька разрушается и становится более доступной для отжига этого праймера.

Таким образом, совокупность полученных данных in vivo и in vitro подтверждают функциональную значимость нуклеотидных замен в лидерной области r/6-оперона в формировании альтернативных структур терминатора и антитерминатора транскрипции и, кроме того, выявляют роль ФМН в качестве главного регуляторного метаболита в экспрессии rib-оперона В subtilis.

2 Исследование регуляции гена ribB Escherichia coli

В отличие от /-/¿-оперона В. subtilis, у Е coli за синтез рибофлавина отвечают шесть генов. Они не сцеплены на хромосоме, и об их регуляции известно очень немного. Высказывалось предположение, что экспрессия этих генов осуществляется конститутивно [Bacher A et al., 1996]. Было интересно узнать, участвует ли rfn-элемент в регуляции биосинтеза рибофлавина у Е coli. С помощью компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей регуляторных участков rib-генов Е. coli выявили присутствие упомянутого выше консервативного rfn-элемента лишь перед одним геном - ribB, который кодирует синтез фермента 3,4-дигидрокси-2-бутанон-4-фосфатсинтазы [Vitreschak A G. et al, 2002]. Эта часть работы посвящена мутационному анализу лидерной области гена ribB Е. coli с целью выяснения механизма регуляции экспрессии гена ribB флавинами с участием специфической сенсорной РНК.

2.1 Клонирование и определение нуклеотидной последовательности лидерной области гена ribB Escherichia coli

Согласно предварительным данным [Mironov A S et al., 2002] лидерная область гена ribB кодирует сенсорную РНК, которая по своей структуре похожа на сенсорную РНК r/6-оперона В subtilis, но, в отличие от последней, не содержит Rho-независимого терминатора транскрипции (Рис. 5).

Сравнение нуклеотидной последовательности лидерной области ribB с последовательностью лидерной области r/6-оперона В. subtilis выявляет высокий уровень гомологии в районе //«-элемента (нуклеотиды от +3 до +147) (Рис. 5). Более того, лидерная область содержит три пары антипараллельных последовательностей, которые способны формировать потенциальные альтернативные шпилечные структуры: 1:Г и 1П:Ш', либо П:1Г. Расположение этих потенциальных шпилек практически полностью совпадает с таковым в лидерной области /"/¿-опероиа В subtilis. Важное отличие состоит в том, что шпилечная структура Ш:11Г в лидерной области гена ribB Е. coli не включает характерного для rib-оперона В. subtilis Rho-независимого терминатора транскрипции, а вместо этого перекрывает сайт связывания рибосомы (SD) и сайт инициации трансляции (ATG).

Таким образом, можно предположить, что лидерная область гена ribB кодирует сенсорную РНК, которая в присутствии флавинов (ФМН, ФАД) формирует шпилечную структуру Ш:Ш', подавляющую трансляцию гена ribB, а в отсутствие этих эффекторов происходит образование альтернативной конфигурации лидерной мРНК с разрушением шпильки 111:111', при которой осуществляется нормальная трансляция мРНК.

Модель двух наиболее вероятных альтернативных вторичных структур лидерной мРНК гена ribB представлена на Рис. 6. Одна из конфигураций (в присутствии эффектора - ФМН) действительно образуется за счет комплементарного взаимодействия последовательностей I и I' (обозначены зелеными стрелками на Рис. 5, шпилька анти-антисеквестора на Рис. 6) и последовательностей III и III' (фиолетовые стрелки на Рис. 5, шпилька секвестора трансляции на Рис. 6). Образование альтернативной конфигурации (в отсутствие ФМН) происходит за счет формирования шпильки 11:11' (синие стрелки на Рис. 5, шпилька антисеквестора на Рис. 6). В соответствии с моделью, формирование антисеквестора (шпильки П:1Г) приводит к разрушению секвестора (III и III') и обеспечивает доступность сайта SD для связывания рибосомы и, следовательно, возможность последующей инициации трансляции структурного гена ribB.

2.2 Сайт-направленный мутагенез лидерной области гена ribB Е. coli

Для проверки модели регуляции гена ribB, приведенной на Рис. 6 и основанной на изменении конформации сенсорной РНК, был проведен сайт-направленный мутагенез лидерной области гена ribB. Сайт-направленный мутагенез проводили методом ПЦР с использованием специфических праймеров, содержащих нуклеотидные замены в участках лидерной РНК, которые предположительно влияют на формирование ее вторичной структуры или на связывание сенсорной РНК с эффекторами (ФМН, ФАД). Расположение всех полученных мутаций в лидерной области гена ribB показано на Рис. 5 и 6.

rfn-Go кс

1 * ribB

CCC (Ml)

-35 -10 '. . ТТТ

TTGCTGccgctaatcattagcgtTATAGTgaatccgcttattctcagggcggggcgaaat +25

_#1

I -►

II

tccccaccggcggtaaatcaactcagttgaaagcccgcgagcgctttgggtgcgaactca +85

#2

А А А (M2)

ТТТ

aaggacagcagatccggtgtaattccggggccgacggttagagtccggatgggagagagt +145

#4 #3

aacgattctgtcgggcatggacccgctcacgttattttggctatatgccgccactcctaa +205

АА А(М4)

GAC(М5) СС (Мб) СС С(МЗ) GG(М7)

. ТТТ .TT . TT Т __.TT и N Q т RibB

gactgccctgattctggtaaccataattttagt|gagg|tttttttacc^tg]aatcagacg +2 65

<<<<<<<<<<<<<C<<<<<<<<<<<< М8

III

II'

Рисунок 5. Нуклеотидная последовательность лидерной области гена ribB Е. coli. Заглавными буквами выделены -35 и -10 последовательности промотора. Красными буквами обозначены консервативные основания r/n-элемснта. Желтым цветом выделены последовательности, способные формировать шпилечные структуры. Заглавными буквами и стрелками над основной последовательностью обозначены нуклеотидные замены, полученные с помощью сайт-направленного мутагенеза. Подчеркнуты последовательности, комплементарные олигонуклеотидам #1, #2, #3, #4. Стрелкой указан старт транскрипции. Рамками выделены сайт связывания рибосомы (SD) и старт трансляции. Зелеными стрелками (I и I') обозначен анти-антисеквестор, синими стрелками (II и II') - антисеквестор, фиолетовыми стрелками (III и III') - секвестор трансляции. Нумерация нуклеотидов приведена, начиная со старта транскрипции гена ribB Е. coli.

1:1'

111:111'

11:11'

00- и: § - Ч г''

+ФМН ч ..... М4,3 V и- @ л .'*'' ч *

о, @ эб : ..... -ФМН

и: 3 *...... :

6+17 б С

- э

- в - е

0+133

А

и

<3 <3 в

с-в

и-А

с-в -> и-А в уМ2

-. 0

А-и И-А У

и-А+147

+10С

1}

М7

0+21 С

в в

А+204

А

в-С в-.и

С-в в-С

е-с в-с

А-и с-в

М5

@ 0 м4

и-А+216 -> ,, , ЭР

.1ССииАииС+а ОТСР60иААССАЦАА1ШиДА61||дАВд(1ШЩПЛ1иАССАи0ААЦСАеАС0С 11 111 11 |с§ Мб § МЗ [(3§ М7

Рисунок 6. Модель регуляции гена НЪВ, основанная на изменении конформации сенсорной РНК в зависимости от присутствия

эффектора - ФМН.

Нуклеотиды, входящие в состав анти-антисеквсстора, обозначены зеленым цветом; антисеквестора - синим, секвестора - фиолетовым. Стрелками показаны нуклеотидные замены использованных в работе мутантов.

Исходя из этой модели, в присутствии ФМН стабилизируется шпилечная структура I и I' (анти-антисеквестор), что влечет за собой формирование шпилечной структуры III и ПГ (секвестор трансляции), перекрывающей сайт связывания рибосомы (SD) и стартовый кодон трансляции. В отсутствие ФМН происходит формирование альтернативной шпилечной структуры II и И' (антисеквестор), которая приводит к разрушению секвестора (шпилька III и ИГ) и, тем самым, делает сайт SD доступным для связывания рибосомы и последующей инициации трансляции.

Таким образом, мутант Ml (G12—>С, G13—>С, G14—>С) содержит замены в области антисеквестора (левое плечо шпильки Н:1Г), тогда как мутант М2 (G140—>А, G142—>А, G144—>А) - в области анти-антисеквестора (правое плечо шпильки 1:Г). Кроме того, получены пять мутантов, содержащих замены в области секвестора трансляции, причем четыре из них расположены в левом плече шпильки Ш:11Г: МЗ (Т232—>С, Т233—»C, Т235—>С); М4 (Т232->А, Т233-4А, Т235->А); М5 (С213—>G, Т214—>А, G215—>С) и Мб (G221->C, G222->C). Один мутант М7 содержит замены С251—>G, С252—»G в правом плече шпильки 111:111'.

Важно подчеркнуть, что мутант М7 содержит симметричные нуклеотидные замены, компенсирующие эффект мутаций G221—>С, G222—>С (мутант Мб), т.е. у двойного мутанта М6/М7 должна восстанавливаться шпилечная структура Ш:11Г секвестора трансляции (Рис. 6). Наконец, были получены два делеционных мутанта: М8, у которого удалено 26 п.н (Д210-235), т.е. практически все левое плечо (III) секвестора, а также делеционный мутант М9 с полностью делетированной лидерной областью. Полученные мутантные варианты лидерной области гена ribB клонировались в составе векторов pJEL250 и pJEL246 для изучения влияния полученных мутаций на экспрессию гена ribB.

2.3 Изучение экспрессии транскрипционных и трансляционных фьюзов ribB-lacZ в клетках Е. coli

Экспрессионные векторы pJEL250 и pJEL246, содержащие, соответственно, транскрипционные и трансляционные фьюзы ribB-lacZ (Табл. 1) с помощью трансформации переносили в реципиентный штамм АМ4002 ribB::ln5 (KmR) lacZ::TnlO (TcR). У полученных рекомбинантов определяли активность ß-галактозидазы в условиях репрессии активности гена ribB (среда с 300 мкМ рибофлавина) и его дерепрессии (среда с 3 мкМ рибофлавина). Прежде всего мы сравнили уровень репрессии активности ß-галактозидазы рибофлавином у штаммов, содержащих плазмиды pJEL250 и pJEL246, в которые был клонирован один и тот же фрагмент интактной лидерной области гена ribB. В условиях репрессии (300 мкМ рибофлавина) активность ß-галактозидазы у транскрипционного фьюза ribB-lacZ снижается примерно в 1,5 раза (Рис.7), в то время как у трансляционного фьюза наблюдается почти 40-кратное падение активности фермента (Рис.7, Табл. 3). В то же

время присутствие делеции, перекрывающей всю лидерную область гена пЬВ (М9), приводит к примерно одинаковой конститутивной экспрессии как транскрипционного, так и трансляционного фьюзов г1ЪВ-1ас2 даже при наличии высоких концентраций рибофлавина в среде (Рис. 7, Табл. 3). Эти данные указывают на то, что репрессирующее действие рибофлавина (или его производных) осуществляется посредством их взаимодействия с лидерной областью гена пЬВ и реализуется, вероятней всего, на трансляционном уровне. Поэтому в дальнейших опытах по изучению влияния полученных мутаций в лидерной области на экспрессию гена пЬВ мы использовали только трансляционные фьюзы пЪВ-1ас2.

Анализ данных Табл. 3 подтверждает модель регуляции гена пЬВ, основанную на изменении конформации сенсорной РНК в зависимости от присутствия эффекторов - рибофлавина или его производных (Рис. 6). В соответствии с этой схемой у мутанта М1 присутствие нуклеотидных замен в левом плече антисеквестора (шпилька I) приводит к резкому (на несколько порядков) снижению активности р-галактозидазы независимо от присутствия или отсутствия рибофлавина в среде (Табл. 3). Важно подчеркнуть, что эти нуклеотидные замены (012—>С, 013—»С, 014—>С) не только нарушают гомологичное спаривание нуклеотидов в шпильке ПЛГ антисеквестора, но одновременно увеличивают область спаривания оснований в шпильке 1:Г анти-антисеквестора. В свою очередь, формирование более протяженной шпильки 1.Т способствует стабилизации шпильки Ш:11Г, перекрывающей сайт ББ и кодон АТО, что, в конечном счете, практически полностью подавляет трансляцию гена пЬВ (Рис.6).

□ Риб ЗмкМ ■ Риб 300 мкМ

250wt 246wt 250М9 246М9

Рисунок 7. Сравнение уровня активности (3-галактозидазы у штаммов, содержащих транскрипционные (250) и трансляционные (246) фьюзы ribB-lacZ с лидерной областью дикого типа (wt) и ее делеционного варианта (М9).

К противоположному эффекту приводят нуклеотидные замены мутанта М2 (G140—>А, Gl42—+А, G144—>А), которые, в отличие от замен мутанта М1, не способствуют, а препятствуют формированию шпильки 1:Г анти-антисеквестора и, следовательно, секвестора трансляции (шпилька Ш:11Г). В результате у мутанта М2 увеличивается вероятность формирования шпильки 11:11' антисеквестора и повышается ее стабильность. В соответствии с этим, у мутанта М2 наблюдается хотя и более низкий по сравнению с диким типом, но существенно более высокий по сравнению с мутантом М1, уровень экспрессии ribB. При этом репрессирующее действие рибофлавина на экспрессию ribB у мутанта М2 существенно снижается (в 1,5 раза против 37 у дикого типа - Табл. 3).

Таблица 3. Активность Р-галактозидазы у штаммов, содержащих мутации в

лидерной области гена г1ЬВ, в зависимости от концентрации _рибофлавина в среде.*___

Мутация Нуклеотидные замены Активность ß-галактозидазы Уровень репрессии

Риб (ЗмкМ) Риб (ЗООмкМ)

wt - 2600-143 70-4 37

Ml G12—>C,G 13—>C,G 14—>С 7,0-0,6 6,0-0,4 1,1

М2 Gl40—А, Gl42—А, G144—>А 230-10 150-7 1,5

мз Т232-* С, Т233—>С, Т235—С 6,0- 0,5 6,0-0,4 1,0

М4 Т232—»A, Т233—»A, Т->235А 1540-62 86-4 18

М5 С213—>G, Т214—»A, G215—>С 1400-57 550-18 2,5

Мб G221—>С, G222—C 5500-176 900-39 6,1

М7 С251—»G, С252—>G 4500-155 800-43 5,6

М6/М7 G221—>С, G222-+C C251-»G, C252-+G 800-32 40-3 20

М8 Л(210-235) 5400-170 2130-96 2,5

М9 Д(8-235) 5580-237 5470-223 1,0

* Сравнение уровня активности Р-галактозидазы у штаммов, содержащих трансляционные фьюзы пЬВ-1ас2 с лидерной областью дикого типа и ее мутантных вариантов Приведенные значения активности - средние из 4 независимых определений

Функциональная роль шпильки Ш:11Г в качестве секвестора трансляции подтверждается поведением мутанта М8, содержащего делецию левого плеча этой шпильки (Рис. 6). Разрушение шпильки Ш:11Г у этого мутанта приводит к тому, что уровень активности Р-галактозидазы достигает почти максимального уровня и

репрессируется рибофлавином всего в 2,5 раза (Табл. 3). Примерно такой же уровень репрессии наблюдается у мутанта М5, содержащего нуклеотидные замены в основании шпильки Ш:ИГ, которые и приводят к сокращению ее протяженности (Рис. 6). Несколько более высокий уровень репрессии наблюдается у мутантов Мб и М7, содержащих симметричные замены в плечах III (G221—>С, G222—>С) и ИТ (С251—»G, С252—>G) секвестора. Примечательно, что комбинация этих мутаций, в результате которой восстанавливается комплементация в соответствующем участке шпильки ПЫН1 (мутант М6/М7), приводит к существенному восстановлению уровня репрессии рибофлавином (с 6 до 20 раз - Табл. 3). Эти данные еще раз подчеркивают решающую роль шпильки 11Ы1Г в подавлении экспрессии гена ribB флавинами.

Особого внимания заслуживает поведение мутанта МЗ, содержащего нуклеотидные замены Т232—*С, Т233—>С, Т235—»C, которые обеспечивают более жесткое спаривание антипараллельных цепей шпильки Ш.Т1Г в сайте связывания рибосомы SD (Рис. 6). Активность ß-галактозидазы у этого мутанта характеризуется минимальным значением и свидетельствует о практически полном подавлении трансляции даже в отсутствие рибофлавина (Табл. 3). В то же время у мутанта М4, содержащего замены Т232—»A, Т233—>А, Т—>235А, которые, напротив, снижают эффективность спаривания оснований в районе сайта SD, уровень репрессии рибофлавином ниже, чем у дикого типа. Таким образом, полученные данные согласуются с моделью регуляции гена ribB, основанной на формировании альтернативных вторичных структур сенсорной РНК в зависимости от присутствия эффекторов - рибофлавина или его производных. В случае Wb-оперона В subtilis таким эффектором является ФМН и в меньшей степени ФАД, но не рибофлавин. Для выяснения природы эффектора в случае гена ribB Е coli были проведены опыты in vitro.

2.4 Опыты in vitro по идентификации эффекторов сенсорной РНК гена ribB

Для выявления эффектора, модулирующего экспрессию гена ribB Е coli, проводили опыты in vitro по гибридизации специфических олигонуклеотидов, комплементарных различным участкам лидерной мРНК (Рис. 5), с меченной [Р32] лидерной мРНК гена ribB в присутствии ФМН, ФАД и рибофлавина или в их отсутствие. Препараты РНК обрабатывали РНКазой Н, которая расщепляет только двунитевые участки гибридов РНК/олигонуклеотид, а затем проводили электрофорез продуктов реакции в полиакриламидном геле.

Из данных электрофореграммы, представленной на Рис. 8, прежде всего следует, что добавление ФМН (или рибофлавина и ФАД - данные не представлены) не приводит к появлению преждевременно терминированных транскриптов: на дорожках 1 и 2 видны транскрипты (~275 н.), соответствующие полноразмерной лидерной РНК. Эти данные подтверждают сделанное ранее заключение о том, что

регуляция гена г/ЬВ с участием сенсорной РНК осуществляется не на уровне терминации транскрипции, а путем подавления инициации трансляции. При гибридизации РНК с олигонуклеотидами #1 (дорожки 3, 4) и #4 (дорожки 9, 10) также не наблюдается появления дополнительных транскриптов - продуктов расщепления РНКазой Н. Из этого следует, что области лидерной мРНК, комплементарные этим олигонуклеотидам, скорее всего, сильно структурированы как в присутствии, так и в отсутствие ФМН и поэтому недоступны для отжига этих олигонуклеотидов.

#3 #4

+ - +

мщ^

140 —

65 —

% расщепления 0 0 0 0 27 25 43 5 0 0

№ дорожки 123456 78 9 10

Рисунок 8. Опыты по гибридизации сенсорной РНК со специфическими олигонуклеотидами: #1, #2, #3, #4 в присутствии ФМН (дорожки 4, 6, 8, 10) или в отсутствие ФМН (дорожки 3, 5, 7, 9) и последующей обработкой РНКазой Н. Дорожки 1,2- контрольные пробы без добавления олигонуклеотидов (в отсутствие и в присутствии ФМН, соответственно).

Цифрами перед стрелками указаны размеры фрагментов РНК, получаемых после обработки препаратов РНКазой Н.

При гибридизации РНК с праймером #2 наблюдается появление дополнительного фрагмента РНК (~65 н. - дорожки 5, 6), интенсивность которого примерно одинакова (25-27% от контроля) независимо от того, присутствует ли в системе ФМН или нет. В случае праймера #3 появляется дополнительный фрагмент (~140 н.), интенсивность которого существенно выше в отсутствие ФМН (43% от контроля - дорожка 7), чем в его присутствии (5% от контроля - дорожка 8). Из этого следует, что ФМН стабилизирует шпильку 1:1', левое плечо которой должно

ОЛИ г

ФМН

РНКаза Н

#1 #2 + - + - +

275

гибридизоваться с праймером #3, тогда как в отсутствие ФМН эта шпилька разрушается и становится более доступной для отжига этого праймера. Опыты по гибридизации с использованием в качестве эффектора ФАД дали похожую картину, но при значительно больших концентрациях ФАД, тогда как добавление рибофлавина не приводило к снижению интенсивности полосы транскрипта размером 140 н. в случае праймера #3 (данные не представлены).

Таким образом, результаты гибридизации свидетельствуют о том, что основным эффектором сенсорной РНК гена пЬВ является ФМН и, кроме того, указывают на прямое взаимодействие ФМН со шпилечной структурой 1:Г в соответствии с моделью регуляции, представленной на Рис. 6.

2.5 Влияние флавинов на формирование ЗОБ-инициаторного комплекса на лидерной мРНК гена пЬВ

Формирование ЗОБ-инициаторного комплекса на лидерной мРНК гена пЬВ и его зависимость от присутствия флавинов анализировались методом тоупринт-анализа. В качестве праймера использовали олигонуклеотид 1163, комплементарный участку (+283) - (+303) НЬВ мРНК. Как следует из данных Рис. 9, тоупринт-сигнал в районе +16 нуклеотида мРНК появляется только при одновременном присутствии в реакционной смеси ЗОБ-субъединицы и тРНК(Ме1 (дорожка 3). Добавление ФМН, начиная с концентрации 40 мкМ (дорожка 8), снижает интенсивность тоупринт-сигнала (дорожки 7- 10), а при концентрации 60-100 мкМ (дорожки 9, 10) ФМН практически полностью подавляет формирование инициаторного комплекса. Добавление ФАД приводит к снижению интенсивности тоупринт-сигнала только в высокой концентрации -100 мкМ (дорожка 16), тогда как в присутствии рибофлавина (дорожки 17 - 22) ослабления тоупринт-сигнала вообще не наблюдается.

Таким образом, полученные данные однозначно свидетельствуют о том, что ФМН и в меньшей степени ФАД, но не рибофлавин подавляют формирование 30Б-инициаторного комплекса на лидерной мРНК гена пЬВ. Эти данные полностью подтверждают модель регуляции гена пЬВ, в соответствии с которой связывание эффекторов ФМН и ФАД с сенсорной РНК стабилизирует шпилечную структуру, перекрывающую сайт связывания рибосомы, и тем самым блокирует инициацию трансляции.

Рисунок 9. Зависимость формирования ЗОБ-инициаторного комплекса на лидерной мРНК гена пЬВ от присутствия флавинов. С, и, А, й - сиквенсные дорожки. Слева приведена последовательность мРНК, перекрываемая ЗОЭ-субъединицей рибосомы. Стрелками показано положение Ао и С+н; нуклеотидов. Пунктирной стрелкой показано положение тоупринт-сигнала. Контрольные дорожки (№ 1,4, 11, 17) не содержат тРНК™81. Концентрации флавинов указаны в верхней части рисунка.

ВЫВОДЫ

1. Лидерные области rib-оперона В. subtilis и гена ribB Е coli кодируют сенсорные РНК, способные специфически связываться с производными флавинов и модулировать экспрессию прилегающих структурных генов.

2. ФМН является главным эффектором, специфически связывающимся с сенсорными РНК п'й-оперона В. subtilis и гена ribB Е coli.

3. Связывание ФМН с сенсорными РНК приводит к изменению их конформации, что, в свою очередь, обусловливает подавление экспрессии прилегающих генов.

4. Регуляция экспрессии rib-оперона В. subtilis с участием специфической сенсорной РНК и ФМН осуществляется на уровне терминации транскрипции.

5. Регуляция экспрессии гена ribB Е. coli с участием специфической сенсорной РНК и ФМН осуществляется на уровне инициации трансляции.

Основные результаты работы отражены в следующих публикациях:

1 Миронов А.С., Еремина С.Ю. 2007. Фундаментальные и прикладные аспекты исследования регуляции оперона биосинтеза рибофлавина у бацилл. Биотехнология, №5, с.7 - 13.

2. Миронов А.С., Карелов Д.В., Соловьева И.М., Еремина С.Ю., Эрраис Лопес Л., Кренева Р.А., Перумов Д.А. 2008. Исследование связи вторичной структуры и регуляторной активности лидерного транскрипта оперона биосинтеза рибофлавина у Bacillus subtilis. Генетика, т.44, №4, с.1 - 7.

3. Еремина С.Ю., Золотухина М.А., Эрраис Лопес Л., Миронов А.С. 2008. Мутационный анализ лидерной области гена ribB Escherichia coh Биотехнология, №2, с.14 - 22.

Заказ № 143/10/08 Подписано в печать 16 10 2008 Тираж 100 экз Уел пл 1,5

,<<->. ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Еремина, Светлана Юрьевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Цели и задачи исследования

Научная новизна и практическая значимость работы б

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1 Генетический контроль биосинтеза рибофлавина у микроорганизмов

1.1 Флавиногенез у микроорганизмов

1.2 Гены флавиногенеза у микроорганизмов

1.2.1 Гены биосинтеза рибофлавина у В. subtilis и Е. coli

1.2.2 Гены флавокиназы/ФАДсинтазы и флавокиназы у В. subtilis

1.3 Регуляция экспрессии генов рибофлавинового оперона у В. subtilis

Глава 2 Регуляция экспрессии генов с помощью сенсорных РНК

2.1 Механизмы регуляции экспрессии генов у прокариот

2.2 Классификация сенсорных РНК

2.3 Особенности регуляции оперона биосинтеза рибофлавина

2.4 Тиаминпирофосфат-связывающая сенсорная РНК

2.5 Аденозилкобаламин-связывающая сенсорная РНК

2.6 Регуляция метаболизма аминокислот с помощью сенсорных РНК

2.6.1 S-аденозилметионин-связывающая сенсорная РНК

2.6.2 Лизин-связывающая сенсорная РНК

2.6.3 Глицин-связывающая сенсорная РНК

2.7 Пурин-связывающие сенсорные РНК

2.8 Глкжозамин-6-фосфат-связывающая сенсорная РНК

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3 Материалы и методы

3.1 Бактериальные штаммы, плазмиды и среды

3.2 Генно-инженерные методы

3.3 Конструирование рекомбинантных плазмид

3.4 Манипуляции с РНК

Глава 4 Исследование регуляции рибофлавннового оперона Bacillus subtilis

4.1 Клонирование и определение нуклеотидной последовательности лидерной области г/6-оперона В. subtilis

4.2 Компьютерный анализ вторичной структуры лидерной мРНК г/6-оперона

В. subtilis

4.3 Сайт-направленный мутагенез лидерной области г/6-оперона В. subtilis

4.4 Клонирование мутаций в лидерной области г/6-оперона в составе экспрессионного вектора pDG268 и их интеграция в хромосому В. subtilis

4.5 Изучение экспрессии транскрипционных фьюзов ribPL-lacZ в клетках штаммов В. subtilis различного генотипа

4.6 Транскрипция лидерной мРНК г/6-оперона дикого типа и ее мутантных вариантов в системе in vitro

4.7 Опыты по гибридизации специфических олигонуклеотидов с лидерной мРНК г/6-оперона

Глава 5 Исследование регуляции гена ribB Escherichia coli

5.1 Первичная характеристика гена ribB Е. coli.

5.2. Клонирование лидерной области гена ribB

5.3 Определение сайта инициации транскрипции лидерной области гена ribB

5.4 Компьютерный анализ вторичной структуры лидерной мРНК гена ribB Е. coli

5.5 Сайт-направленный мутагенез лидерной области гена ribB

5.6 Изучение экспрессии транскрипционных и трансляционных фьюзов ribB-lacZ в клетках Е. coli

5.7 Опыты in vitro по идентификации эффекторов сенсорной РНК гена ribB

5.8 Влияние флавинов на формирование ЗОБ-инициаторного комплекса на лидерной мРНК гена ribB

ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль сенсорных РНК в регуляции биосинтеза рибофлавина у Escherichia coli и Bacillus subtilis"

Актуальностьтемы

Важной характеристикой жизнедеятельности микроорганизмов является использование широкого спектра регуляторных механизмов, обеспечивающих многообразие экспрессии генов-в ответ на изменение условий внешней среды. Несколько лет назад был обнаружен новый тип регуляторных лидерных мРНК, выступающих- в качестве сенсоров специфических метаболитов (малых молекул), и напрямую, без белковых посредников, способных регулировать транскрипцию и трансляцию соответствующих мРНК [1, 2]. Такие сенсорные РНК представляют собой-природные аптамеры и способны с высокой специфичностью и селективностью распознавать» и связывать природные метаболиты, а также формировать альтернативные вторичные структуры в зависимости от присутствия специфического метаболита, включать или выключать процесс элонгации транскрипции-мРНК или инициации трансляции этих мРНК. Дальнейшие исследования-показали, что сенсорные РНК участвуют в регуляции ряда оперонов В. subtilis и Е. coli, контролирующих биосинтез витаминов, аминокислот, нуклеотидов [3,4,5,6], а также транспорт ионов металлов [7, 8].

Открытие нового механизма регуляции экспрессии генов, основанного на специфическом узнавании молекулой сенсорной РНК низкомолекулярных эффекторов, позволяет начать разработку принципиально новой стратегии получения штаммов-продуцентов целевых продуктов, так как эта регуляция осуществляется без участия регуляторных белков путем прямого взаимодействия сенсорной РНК с низкомолекулярными1 соединениями, которые могут добавляться1 непосредственно- в ростовую среду и модулировать экспрессию целевых генов. Это обстоятельство существенно упрощает задачу направленного изменения активности целевых генов в связи с тем, что молекула сенсорной РНК является значительно более компактной мишенью для модификации по сравнению со сложными- молекулами регуляторных белков, действие которых приходится устранять для обеспечения высокого выхода желаемых продуктов в классических работах по конструированию штаммов-продуцентов. Можно использовать модифицированные сенсорные РНК для направленной реконструкции метаболизма бактерий. Это совершенно новый подход к управлению активностью генов,- который позволит включать или выключать целевые гены с помощью сенсорных РНК путем использования простых метаболитов типа аминокислот, витаминов или даже ионов металлов, а в более далекой перспективе сможет послужить основой для создания нового поколения лекарственных препаратов на базе искусственно сконструированных молекул сенсорных РНК.

Несмотря на то, что биосинтез рибофлавина у Bacillus subtilis на протяжении многих лет был объектом интенсивных генетических и биохимических исследований, некоторые аспекты структурно-функциональной организации с г/6-оперона, остаются неясными. С другой стороны, представлялось интересным сравнить роль сенсорных РНК в регуляции биосинтеза рибофлавина у Escherichia coli и Bacillus subtilis.

Цель и задачи исследования

Настоящая работа выполнялась с целью проведения исследований по расшифровке механизма регуляции' с участием сенсорных РНК. В качестве объектов исследования использовались сенсорные РНК, кодируемые лидерными областями рибофлавинового (rib) оперона Bacillus subtilis и гена ribB Escherichia coli.

Достижение указанной цели было связано с решением следующих задач: компьютерный анализ вторичной структуры лидерных областей модельных сенсорных РНК; проведение сайт-направленного мутагенеза лидерных участков п'6-оперона В. subtilis и гена* ribB Е. coli для получения модифицированных сенсорных РНК, позволяющих изучить механизм функционирования этих областей; конструирование транскрипционных и трансляционных фьюзов лидерной области г/6-оперона В. subtilis и гена ribB Е. coli с реперным геном lacZ; изучение экспрессии in vivo и in vitro мутантных вариантов лидерных областей п'6-оперона В. subtilis и гена ribB Е. coli, содержащих нуклеотидные замены, приводящие к изменению конформации соответствующих сенсорных РНК.

Научная новизна

Результаты проведенного мутационного анализа лидерной области г/6-оперона В. subtilis и лидерной области гена ribB Е. coli позволили получить новую информацию для расшифровки механизма регуляции биосинтеза рибофлавина с участием сенсорных РНК. Показано, что специфические мутации в лидерной области г/6-оперона В. subtilis, стабилизирующие формирование терминирующей шпильки, приводят к полной репрессии этого оперона. С другой стороны, мутации, нарушающие образование шпильки обеспечивают конститутивную ФМН-независимую экспрессию г/6-оперона. Эти данные уточняют модель регуляции г/6-оперона В. subtilis с участием специфической ФМН-зависимой сенсорной РНК. В опытах in vitro показано, что ФМН модулирует вторичную структуру сенсорной РНК и влияет на уровень терминации транскрипции г/6-оперона.

Впервые* проведен структурно-функциональный анализ гена ribB Е. coli. На основании данных сайт-направленного мутагенеза и анализа поведения полученных мутантов установлено, что лидерная> область, гена ribB Е. coli кодирует специфическую ФМН-зависимую сенсорную РНК. Из результатов опытов по гибридизации 30S-субъединицы,рибосомы с сенсорнойРНК гена ribB можно сделать вывод о том, что ФМН участвует в формировании шпильки, перекрывающей сайт связывания рибосомы. Опираясь -на полученные данные, была построена модель регуляции!гена*ribB Е. coli, основанная на изменении конформации сенсорной РНК в зависимости от присутствия1 эффектора — ФМН. Согласно этой модели связывание ФМН с сенсорной РНК стабилизирует шпилечную структуру, перекрывающую сайт связывания рибосомы, и тем самым блокирует инициацию трансляции тепа. ribB.

В ходе проведенной работы-было установлено, что главное отличие механизмов1 регуляции, экспрессии генов биосинтеза рибофлавина у В. subtilis и Е. coli с участием ФМН-специфической сенсорной РНК состоит в том, что- в п'6-опероне В. subtilis контроль, осуществляется на уровне терминации транскрипции, в то время как в гене ribB Е. coli - на уровне инициации трансляции.

Практическая значимость

Методом сайт-направленного мутагенеза получена коллекция мутантных вариантов лидерной области г/6-оперона В. subtilis и лидерной* области, гена ribB Е. coli, с нуклеотидными заменами в участках лидерной мРНК, которые влияют на формирование вторичной, структуры или на связывание мРНК с эффектором. Коллекция может быть использована для дальнейших исследований в этой области и для конструирования высокоактивных штаммов-продуцентов рибофлавина.

Структура* работы. Диссертация изложена на 118" листах машинописного текста, включая 42 рисунка и 9 таблиц. Работа состоит из введения, обзора^ литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов, изложения и обсуждения результатов, выводов и списка используемой литературы. Список литературы включает 150 работ отечественных и зарубежных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Еремина, Светлана Юрьевна

выводы

1. Лидерные области г/6-оперона В. subtilis и гена ribB Е. coli кодируют сенсорные РНК, способные специфически связываться с производными флавинов и модулировать экспрессию прилегающих структурных генов.

2. ФМН является главным эффектором, специфически связывающимся с сенсорными РНК п'6-оперона В. subtilis и гена ribB Е. coli.

3. Связывание ФМН с сенсорными РНК приводит к изменению их конформации, что, в свою очередь, обусловливает подавление экспрессии прилегающих генов.

4. Регуляция экспрессии rib-оперона В. subtilis с участием специфической сенсорной РНК и ФМН осуществляется на уровне терминации транскрипции.

5. Регуляция экспрессии гена ribB Е. coli с участием специфической сенсорной РНК и ФМН осуществляется на уровне инициации трансляции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Еремина, Светлана Юрьевна, Москва

1. Mironov A.S., Gusarov I., Rafikov R„ Lopez L.E., Shatalin' K., Kreneva R.A., Perumov D.A., Nudler E. 2002. Sensing small molecules by nascent RNA: a mechanism to control transcription in bacteria. Cell, v.l 11, p.747-756.

2. Winkler W., Nahvi A, Breaker R.R. 2002. Thiamine derivatives bind messenger RNAs directly to regulate bacterial gene expression. Nature, v.419, p.952-956.

3. Nudler E., Mironov A.S. 2004. The riboswitch control of bacterial metabolism. Trends Biochem. Sci., v.29, p. 11-17.

4. Winkler W.C., Breaker R.R. 2005. Regulation of bacterial gene expression by riboswitches. Annu. Rev. Microbiol., v.59, p.487-517.

5. Vitreschak A.G., Rodionov D.A., Mironov A.A., Gelfand M.S. 2004. Riboswitches: the oldest mechanism for the regulation of gene expression? Trends Genet., v.20, p.44-50.

6. Mandal M., Breaker R.R. 2004. Gene regulation by riboswitches. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., v.5, p.451-463.

7. Cromie M.J:,Shi Y., Latifi T.,Groisman A. 2006. An RNA sensor for intracellular Mg2+. Cell, v. 125, p.71-84.

8. Draper D.E., Grilley D., Soto A.M. 2005. Ions and RNA folding. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., v.34, p.221-243.

9. The Merck Index, Windhold et al., eds. Merck & Co., 1983, p. 1183.

10. Ainsworth G.C., Sussman A.S. The Fungi. 1965. Academic Press, New York, WO 88/09822.

11. HickeyRJ, Production of Riboflavin by Fermentation in Industrial Fermentation/Underkofler, L.A. and Hickey, R.J., eds., pp.157-190, Chemical Publishing Co., New York, 1954.

12. Perlman D. et al., Fermentation Ind. Eng. Chem. 1952. v. 44, p. 1996-2001.

13. WO 93/03183, JP63098399A2, US Pat. 4,794,081.

14. Stepanov A.I., Zhdanov V.G., Kukanova A.I., Khaikinson M.Y., Rabinovich P.M., Iomantas J.V., Galuchkina Z.M. 1984. Method for preparing riboflavin. French patent application №3599355.

15. Козлов Ю.И., Йомантас Ю.А., Плотникова Т.Г., Перумов Д.А., Фрейдкин- И.М., Стеркин В.Э., Дедова О.А., Дебабов В.Г. Штамм бактерий Bacillus subtilis — продуцент рибофлавина. Патент РФ RU 2081906.

16. Миронов А.С., Королькова Н.В., Эррайс JI.JL, Семенова Л.И., Перумов Д.А., КреневаР.А., Глазунов А.В., Акишина Р.И., Йомантас Ю.А., Абалакина Е.Г.,

17. Стойнова Н.В., Козлов Ю.И., Дебабов В.Г. 2005. Способ полученияфибофлавина. Патент РФ RU2261273.

18. Бреслер С.Е., Черепенко Е.И., Черник Т.П., Калинин В.Л., Перумов Д.А. 1970. Исследование оперона биосинтеза рибофлавина у Bacillus subtilis. Сообщение I. Генетическое картирование группы сцепления. Генетика, т.6, с. 116—124.

19. Kreneva R.A., Perumov D.A. 1990: Mol. Gen. Genet., v.222, p.467-469.

20. Mironov V.N., Kraev A.S., Chikindas M.L., Chernov B.K., Stepanov A.I., Skryabin K.G. 1994. Functional organization of the riboflavin biosynthesis operon from Я subtilis SHgw. Mol.Gen.Genet., v.242, p.201-208.

21. Perkins J.B. and Pero J. 2002. Biosynthesis of riboflavin, biotin, folic acid, and cobalamin. In Bacillus Subtillis and Its Closest Relatives: from Genes to Cells, Sonenshein A.L., Hoch J.A., Losick R., eds. (Washington: ASM Press), p.271-286.

22. Perkins J. В., Pero J. G. 1993. Biosynthesis of riboflavin, biotin, folic acid and cobalamin. In: Sonenshein A. L., Hoch J. A., Losick R. (Ed). B. subtilis and other gram-positive bacteria. American Society for Microbiology, Washington, DC., p.319-334.

23. Richter G., Fischer M., Krieger C., Eberhardt S., Luttgen H., Gerstenschlager I., Bacher A. 1997 Biosynthesis of riboflavin: characterization of the bifunctional deaminase-reductase of E. coli and B. subtilis. J.Bacteriol., v. 179, p.2022-2028.

24. Bacher A., Eberhardt S., Fischer M., Kis K., Richter G. 2000. Biosynthesis of vitamin B2 (Riboflavin) Annu.Rev.Nutr., v.20, p.153-167.

25. Nielsen P., Bacher A. 1981. Biosynthesis of riboflavin. Characterization of the product of the deaminase. Biochim. Biophys. Acta., v.662, p.312—317.

26. Bacher A., Eberhardt S., Richter G., Neidhardt F.C. 1996. Esherichia coli and Salmonella typhimurium. Cellular and Molecular biology. Issue II/Ed. F.C.Neidhard. Washington. ASM Press., USA, p.657-664.

27. Richter G., Fischer M., Krieger C., Eberhardt S., Luttgen H., Gerstenschlager I., Bacher A. 1997. Biosynthesis of riboflavin: characterization of the bifunctional deaminase-reductase of E. coli and B. subtilis. J. Bacterid., v. 179, p.2022-2028.

28. Bacher A., Ludvvig H.C., Schnepple H., Ben-Shaul Y.1986. Heavy riboflavin synthase from Bacillus subtilis. Quaternary structure and reaggregation. J.Mol.Biol., v. 187, p.75-86.

29. Bacher A., LeVan Q., Keller P.J., Floss H.G.1985. Biosynthesis of riboflavin. Incorporation of multiply 13C-labeIed precursors into the xylene ring. J.Am.Chem.Soc., v.107, p.6380-6385.

30. LeVan Q., Keller P.J., Brown D.H., Floss H.G., Bacher A. 1985. Biosynthesis of riboflavin in Bacillus subtilis: origin of the four-carbon moiety. J.BacterioI., v. 162, p.1280-1284.

31. Harzer G., Rokos H., Otto M.K., Bacher A., Ghisha S. 1978. Biosynthesis of riboflavin. 6.7-Dimethil-8-ribitillumazine 5-phosphate is not- a substrate for riboflavin synthase. Biochim. Biophys. Acta., v.540, p.48-54.

32. Bacher A., Baur В., Eggers U., Harders H., Otto M.K., Schnepple H. 1980. Riboflavin synthases of Bacillus subtilis: purification and properties. J.Biol. Chem., v.255, p.632-637.

33. Kis K., Bacher A. 1995. Substrat channeling in the lumasine synthase/riboflavin synthase, complex of Bacillus subtilis. J.Biol. Chem., v.270, p. 16788-16795.

34. Гусаров И.И., Кренева Р.А., Йомантас Ю.А., Колибаба Л.Г., Полануер Б.М., Козлов Ю.И., Перумов Д. А. 1997. Первичная структура и функциональная активность гена ribC из Bacillus subtilis. Мол. Биол., т.31, с.825-830.

35. Solovieva I.M., Kreneva R.A., Leak D.J., Perumov D.A. 1999. The ribR gene encodes a monofunctional riboflavin kinase which is involved in regulation of the Bacillus subtilis riboflavin operon. Microbiol., v.145, p.57-73.

36. Бреслер C.E., Калинин В.Л., Кривиский А.С., Перумов Д.А., Черник Т.П. 1969. Мутант Bacillus subtilis, синтезирующий значительные количества рибофлавина. Генетика, т.5, с.133-135.

37. Чикиндас М.Л., Лукьянов В.В., Рабинович П.М., Степанов А.И. 1987. Изучение 210 хромосомы В. subtilis с помощью рекомбинантных плазмид. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, т.2, с.20-24.

38. Миронов В.Н., Перумов Д.А., Краев А.С., Степанов А.И., Скрябин К.Г. 1990. Необычная структура в регуляторной области оперона биосинтеза рибофлавина. у Bacillus subtilis. Молекулярная биология, т.24, с.256-261.

39. Kunst F., Ogasavara N. et al. 1997. The completegenome sequence of the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis. Nature, v.390, p.249-256.

40. Sorokin A., Zumstein E., Azevedo V., Ehrlich S. D., Serror P. 1993. The organization of the B. subtilis 168 chromosome region between the spoVAF and serA genetic loci, based on sequence data. Molecular Microbiol., v. 10, p.385—395.

41. Миронов B.H., Чикиндас M.Jl., Краев A.C., Степанов А.И., Скрябин К.Г. 1990. Оперонная организация генов биосинтеза рибофлавина В. subtilis. ДАН, т.312, с.237— 240.

42. Schott К., Kellerman J., Lottspeich F., Bacher A. 1990. Riboflavin synthases of B. subtilis: purification and amino acid sequence of the subunit. J. Biol. Chem., v.265, p.4204-4209.

43. Bachmann B.J. Linkage map of Escherichia coli K-12, edition 8, Microbiol. Rev., v.54, p. 130-197.

44. Kis K., Volk R., Bacher A. 1995. Biosynthesis of riboflavin. Studies on the reaction mechanism of 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine synthase. Biochemistry, v.34, p.2883-2892.

45. Yang T.-P., Depew R.E. 1992. Physical map of the tolC-htrP region of the Escherichia coli chromosome. J. Bacteriol., v. 174, p. 1700-1701.

46. Taura Т., Ueguchi C., Shiba K., Ito K. 1992. Insertional disruption of the nusB (ssyB) gene leads to cold-sensitive growth of Escherichia coli and suppression of the sec Y24 mutation. Mol. Gen. Genet., v.236, p.727-738.

47. Koh Y.S., Chung W.-H., Lee J.-H., Roe J.-H. 1999. Mol. Gen. Genet, v.261, p.374-380.

48. Перумов Д.А., Кренева P.A. 2007. Регуляция биосинтеза ФМН и ФАД у Bacillus subtilis. Бреслеровские чтения. Санкт-Петербург, с.270-276.

49. Solovieva I.M., Kreneva R.A., Perumov D.A. 2005. The riboflavin kinase encoding gene ribR of Bacillus subtilis is a part of 10 kb operon, which is negatively regulated by the yuzC gene product. FEMS Microbiol.Lett, v.243, p.51-58.

50. Кренева P.А., Перумов Д.A. 1994. Биосинтез рибофлавина у В. subtilis: исследование антивитаминной активности аналогов с модифицированным рибитилом. Биотехнология, т.З, с. 6-10.

51. Морозов Г.И., Рабинович П.М., Емельянов В.В., Степанов А.И. 1985. Оперон биосинтеза рибофлавина В. subtilis содержит дополнительные промоторы. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, т. 12, с. 14-19.

52. Matthias М., Adolphus P., Van Loon G.M., Hohmann Н.-Р. 1998. Regulation of "riboflavin biosynthesis in B. subtilis is affected by the activity of the flavokinase/flavin adenine dinucleotide synthetase encoded by ribC. J. Bact. Feb., № 4, p.950-955.

53. Бреслер C.E., Глазунов E.A., Черник Т.П., Шевченко Т.Н., Перумов Д.А. 1973. Исследование оперона биосинтеза рибофлавина у Bacillus subtilis. Сообщение V. ФМН и ФАД как эффекторы в опероне биосинтеза рибофлавина. Генетика; т.9, с.84— 91.

54. Gusarov I., Kreneva R.A., Rybak K.V., Podcherniaev D.A., Iomantas IuV., Kolibaba L.G., Polanuer B.M., Koslov Iul., Perumov D.A. 1997. Primary structure and functional activity of the Bacillus subtilis ribC gene. Mol. Biol. (Mosk), v.31, p.820-825.

55. Mack M.A., van Loon A.P., Hohmann H.P. 1998. Regulation of riboflavin biosynthesis in Bacillus subtilis is affected by the activity of the flavokinase/flavin adenine dinucleotide synthetase encoded by ribC. J. Bacterid., v.180, p.950-955.

56. Gelfand M.S., Mironov A.A., Jomantas J.V, Kozlov Y.I., Perumov D.A. 1999. A conserved RNA structure element involved in the regulation of bacterial riboflavin synthesis genes. Trends Genet., v. 15, p.439—442.

57. Henkin T.M., Yanofsky C. 2002. Regulation by transcription attenuation in bacteria: how RNA provides instructions for transcription termination/antitermination decisions. Bioessays., v.24, p.700-707.

58. Browning D.T., Busby S.J. 2004. The regulation of bacterial transcription initiation. Nat.Rev.Microbiol., v.257, p.2563-2675.

59. Yanofsky C. 1981. Attenuation in the control of expression of bacterial operons. Nature, v.289, p.751-758.

60. Babitzke, P. et al. 1994. TRAP, the trp RNA-binding attenuation protein of Bacillus subtilis is a multisubunit complex that appears to recognize G/UAG repeats in the trpEDCFBA and trpG transcripts. J. Biol. Chem., v.269, p. 16597-16604.

61. Yanofsky C. et al. 1996. Some novel transcription attenuation mechanisms • used by bacteria. Biochimie, v.78, p. 1017-1024.

62. Babitzke P., Gollnick P. 2001. Posttranscription initiation control of tryptophan metabolism in Bacillus subtilis by the trp RNA-binding attenuation protein (TRAP), anti-TRAP, and RNA structure. J. Bacterial., v. 183, p.5795-5802.

63. Landick R., Yanofsky C. 1984. Stability of an RNA secondary structure affects in vitro transcription pausing in the trp operon leader region. J. Biol. Chem., v.259, p.11550-11555.

64. Grundy F., Henkin T.M. 2004. Regulation of gene expression by effectors that bind to RNA. Current Opinion in Microbiology, v.7, p.126-131.

65. Hannon G.J. 2002. RNA interference. Nature, v.418, p.244-251.

66. Eddy S.R. 2001. Non-coding RNA genes and the modern RNA world. Nature Rev., v.2, p.919-929.

67. Storz G., Altuvia S., Wassarman K.M. 2005. An abudance of RNA regulators. Annu.Rev.Biochem., v.74, p.199-217.

68. Miranda-Rios M., Navarro M. Soberon. 2001. A conserved RNA structure (7/zi-box) is involved in regulation of thiamin biosynthetic gene expression in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.98, p.9736-9741.

69. Vitreschak A.G., Rodionov D.A., Mironov A.A., Gelfand M.S. 2002. Regulation of riboflavin biosynthesis and transport genes in bacteria by transcriptional and translational attenuation. Nucleic Acids Res., v.30, p.3141-3151.

70. Brantl S. 2004. Bacterial gene regulation: from transcription attenuation to riboswitches and ribozymes. Trends Microbiology, v. 12, p.473—475.

71. Grundy F.J., Henken T.M. 2006. From ribosome to riboswich: control of gene expression in bacteria by RNA structural rearrangements. Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol, v.41, p.329-338.

72. Гельфанд M.C., 2006. Цис-регуляторные структуры РНК бактерий. Молекулярная биология, т.40, №4, с.609-619.

73. Winkler W.C., Breaker R.R. 2005. Regulation of bacterial gene expression by riboswitches. Annu. Rev. Microbiol., v.59, p.487-517.

74. Winkler W.C., Cohen-Chalamish S., Breaker R.R. 2002. An mRNA structure that controls gene expression by binding FMN. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.99, p.l5908-15913.

75. Begley T.P., Downs D.M., Ealick S.E., McLafferty F.W., Van Loon A.P., Taylor S., Campobasso N., Chiu H.J., Kinsland C., Reddick J.J., et al. 1999. Thiamin biosynthesis in prokaryotes. Arch. Microbiol., v. 171, p.293-300.

76. Petersen L.A., Downs D.M. 1997. Identification and characterization of an operon in Salmonella typhimunum involved in thiamine biosynthesis. J. Bacteriol., v.179, p.4894-4900.

77. Miranda-Rios J., Morera C., Taboada H. et al 1997. Expression of thiamin biosynthetic genes (thiCOGE) and production of symbiotic terminal oxidase cbb3 in Rhizobium etli. J. Bacterid., v. 179, p.6887-6893.

78. Rodionov D.A., Vitreschak A.A., Mironov A.A., Gelfand M.S. (2002) Comparative genomics of thiamin biosynthesis in prokaryotes New genes and regulatory mechanisms. J. Biol. Chem., v.277, p.48949-48959.

79. Stormo G.D., Ji Y. 2001. Do mRNAs act as direct sensors of small molecules to control their expression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.98, p.9465-9467.

80. Sudarsan N, Barrick J.E., Breaker R.R. 2003. Metabolite-binding RNA domains are present in the genes of eukaryotes. RNA, v.9, p.644-647.

81. Nahvi A., Barrick J.E., Breaker R.R. 2004. Coenzyme B12 riboswitches are widespread genetic control elements in prokaryotes. Nucleic Acids Res., v.32, p. 143-150.

82. Vitreschak A.G., Rodionov D.A., Mironov A.A., Gelfand M.S. 2003. Regulation of the vitamin B12 metabolism and transport in bacteria by a conserved RNA structural element. RNA, v.9, p. 1084-1097.

83. Wei B. Y. et al 1992. Conserved structural and regulatory regions in the Salmonella typhimurium btuB gene for the outer membrane vitamin В12 transport protein. Res. Microbiol., v.143, p.459-466.

84. Escalante—Semerena J.C., Roth J.R. 1987. Regulation of cobalamin biosynthetic operons in Salmonella typhimurium. J. Bacterid., v. 169, p.2251—2258.

85. Lundrigan M.D. et al 1991. Transcribed sequences of the Escherichia coli btuB gene control its expression and regulation by vitamin В12. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.88, p. 1479-1483.

86. Richter-Dahlfors A.A., Anderson D.I. 1994. Vitamin B12 repression of the cob-operon in Salmonella typhimurium translational control of the cbiA gene. Mol. Microbiol., v. 13, p.541-553.

87. Richter-Dahlfors A.A., Andersson D.I. 1992. Cobalamin (vitamin B12) repression of the Co^-operon in Salmonella typhimurium requires sequences within the leader and the first translated open reading frame. Mol. Microbiol., v.6, p.743—749.

88. Ravnum S, Andersson D.I. 1997. Vitamin B12 repression of the btuB gene in Salmonella typhimurium is mediated via a translational control which requires leader and coding sequences. Mol. Microbiol., v.23, p.35-42.

89. Nou X., Kadner R.J. 1998. Coupled changes in translation and transcription during cobalamin-dependent regulation of btuB expression in Escherichia coli. J. Bacterial., v. 180, p.6719-6728.

90. Nou X., Kadner R.J. 2000. Adenosylcobalamin inhibits ribosome binding to btuB RNA. Proc. Natl. Acad. Sci, USA, v.97, p.7190-7195.

91. Nahvi A., Sudarsan N., Ebert M.S., Zou X., Brown K.L., Breaker R.R. 2002. Genetic control by a metabolite binding mRNA. Chem. Biol., v.9, p. 1043-1049.

92. Ravnum S., Andersson D.I. 2001. An adenosyl-cobalamin (coenzyme-B12)-repressed translational enhancer in the cob mRNA of Salmonella typhimurium. Mol. Microbiol, v.39, p. 1585-1594.

93. Franklund S.V., Kadner R.J. 1997. Multiple transcribed elements control expression of the Escherichia coli btuB gene. J. Bacterid., v. 179, p.4039-4042.

94. Grundy F.J., Henkin T.M. 1998. The S box regulon: a new global transcription termination control system for methionine and cysteine biosynthesis genes in gram-positive bacteria. Mol. Microbiol., v.30, p.737-749.

95. Yocum R.R., Perkins J.B., Howitt C.L., Pero J. 1996. Cloning and characterization of the metE gene encoding S-adenosylmethionine synthetase from Bacillus subtilis. J. Bacteriol., v. 178, p.4604-4610.

96. Epshtein V., Mironov A.S., Nudler E. 2003. The riboswitch-mediated control" of sulfur metabolism in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 100, p.5052-5056.

97. Winkler W.C., Nahvi A., Sudarsen N., Barrick J.E., Breaker R.R. 2003. An mRNA structure that controls gene expression by binding S-adenosylmethionine. Nat. Struct. Biol., v.10, p.701-707.

98. McDaniel B.A., Grundy F.J., Artsimovitch I., Henkin T.M. 2003. Transcription termination control of the S box system: direct measurement of .S-adenosylmethionine by the leader RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.100, p.3083-3088.

99. Sudarsan N., Hammond M.C., Block K.F., Welz R., Barrick J.E., Roth A., Breaker R.R. 2006. Tandem riboswitch architectures exhibit complex gene control functions. Science, v.314, p.300-304.

100. Nudler E., Mironov A.S. 2004. The riboswitch control of bacterial metabolism. Trends Biochem. Sci., v.29, p. 11-17.

101. Kochhar S., Paulus H. 1996. Lysine-induced premature transcription termination in the lysC operon of Bacillus subtilis. Microbiology, v. 142, p. 1635-1639.

102. Grundy F.J., Lehman S.C., Henkin T.V. 2003. The L box regulon: lysine sensing by leader RNAs of bacterial lysine biosynthesis genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 100, p.12057-12062.

103. Sudarsan N., Wickiser J.K., Nakamura S., Ebert M.S., Breaker R.R. 2003. An mRNA structure in bacteria that controls gene expression by binding lysine. Genes Dev., v.17, p.2688-2697.

104. Rodionov D.A., Vitreschak A.G., Mironov A.A., Gelfand M.S. 2003. Regulation of lysine biosynthesis and transport genes in bacteria: yet another RNA riboswitch? Nucleic Acids Res., v.31, p.6748-6757.

105. Mandal M., Lee M., Barrick J.E., Weinberg Z., Emilsson G.M., Ruzzo W.L., Breaker R.R. 2004. A glycine dependent riboswitch that uses cooperative binding to control gene expression. Science, v.306, p.275-279.

106. Piggot P. J., Hoch J. 1985. Revised genetic linkage map of Bacillus subtilis. Microbiol. Rev., v.49,p.l58-179.

107. Ebbole D. J., Zalkin H. 1987. Cloning and characterization of a 12-gene cluster from Bacillus subtilis encoding nine enzymes for de novo purine nucleotide synthesis. J. Biol. Chem., v.262, p.8274-8287.

108. Saxild H.H., Mygaard P. 1988. Gene-enzyme relationships of the purine biosynthetic pathway in Bacillus subtilis. Mol. Gen. Genet., v.211, p. 160-167.

109. Zalkin H., Nygaard P. 1996. Biosynthesis of purine nucleotides. In Escherichia coli and Salmonella, p.561-579. (Edited by F.C.Neidhardt and others), Washington, DC: American Society for Microbiology.

110. Switzer R.L., Zalkin H., Saxild H.H. 2002. Purine, pyrimidine, and pyridine nucleotide metabolism. In Bacillus subtilis and Its Closest Relatives: From Genes to Cells. (A.L.Sonenshein, et al., eds ), p.255-269. Washington: ASM Press.

111. Mandal M., Boese В., Barrick J.I., Winkler W.C., Breaker R.R. 2003. Riboswitches control fundamental biochemical pathways in Bacillus subtilis and other bacteria. Cell, v. 113, p.577-586.

112. Batey R.T., Gilbert S.D., Montange R.K. 2004. Structure of a natural guanine-responsiveriboswitch complexed with the metabolite hypoxanthine. Nature, v.432, p.411-415.

113. Mandal M., Breaker R.R. 2004. Adenine riboswitches and gene activation by disruption of a transcription terminator. Nature Struct. Mol. Biol., v.l 1, p.29-35.

114. Wickiser J.K., Cheah M.T., Breaker R.R., Crothers D.M. 2005. The kinetics of. ligand binding by an adenine-sensing riboswitch. Biochemistry, v.44, p.13404-13414.

115. Лобанов K.B., Королькова H.B., Еремина С.Ю., Эррайс Лопес Л., Прошкин С.А., Миронов А.С. 2007. Мутации, приводящие к изменению специфичности сенсорной РНК, кодируемой геномpbnE Bacillus subtilis. Генетика, т.43, №6, с. 1-5.

116. Greenleaf W.J., Frieda K.L., Foster D.A., Woodside M.T., Block S.M. 2008. Direct observation of hierarchical folding in single riboswitch aptamers. Science, v.319, p.630-633.

117. Serganov A., Polonskaia A., Phan A.T., Breaker R.R., Patel DJ. 2006. Structural basis for gene regulation by a thiamine pyrophosphate-sensing riboswitch. Nature, v.441, p. 11671171.

118. Montange R.K., Batey R.T. 2006. Structure of S-adenosylmethionineriboswitch regulatory mRNA element. Nature, v.441, p.l 172-1175.

119. Christiansen L.S., Schou S., Nygaard P., Saxild H.H. 1997. Characterization of the xpt-pbuX oyzron and evidence for purine- and nitrogencontrolled expression of genes involved in xanthine salvageand catabolism. J.Bacteriology, v. 179, p.2540-2550.

120. Johansen L.E., Nygaard P., Lassen C. et al. 2003. Definition of a second Bacillus subtilis pur regulon comprising the pur and xpt-pbuX operons plus pbuG, nupG (yxjA), and pbuE (ydhL). J.Bacteriology, v. 185., p.5200-5209.

121. Winkler W.C. 2005. Riboswitches and the role of noncoding RNAs in bacterial metabolic control. Curr. Opin. Chem. Biol., v.9, p.594-602.

122. Kubodera Т., Watanabe M., Yoshiuchi К. 2003. Thiamine-regulated gene expression of Aspergillus oryzae thiA requires splicing of the intron containing a riboswitch-like domain in 5-UTR. FEBS Lett., v.555, p.516-520.

123. Kaempfer R. 2003. RNA sensors: novel regulators of gene expression. EMBO reports, v.4, p. 1043-1047.

124. Love-Larsen J., Gerdes K., Light J., Molin S. 1984. Low-copy number plasmid-cloning vectors amplifiable by derepression of an inserted foreign promoter. Cene, v.28, p.45-54.

125. Миллер Дж. 1979. Эксперименты в молекулярной генетике. Мир.

126. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis Т. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual /1st and 2nd ed. N.Y./ Cold Spring Harbor Laboratory.

127. Mandel M., Higa A. 1970. Calcium dependent bacteriophage DNA infection. J.Mol.Biol., v.53, p. 154-162.

128. Sanger F.', Nicklen S., Coulson A.R. 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.74, p.5463-5467.

129. Wickieser J.K., Winkler W.C., Breaker R.R. et al. 2005. Molecular Cell, v. 118, p.49-60.

130. Hartz D., McPheeters D., Traut R.s Gold L. 1988. Extension inhibition analysis of translation initiation complexes. Methods Enzymol., v.164, p.419—425.

131. Gelfand M.S. et al. 1999 Trends Genet.,v. 15, p.439-442.

132. Fuchs R.T., Grundy F.J., Henkin T.M. 2007. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 104. p.4876-4880.