Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка технологии микробных РНК и ДНК из метанутилизирующих бактерий Metylococcus capsulatus

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии микробных РНК и ДНК из метанутилизирующих бактерий Metylococcus capsulatus"

РГ6 од

1 1 НОЯ 1996

на правах рукописи

ВОЛКОВА НАТАЛЬЯ ВЛАДИМИРОВНА

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ МИКРОБНЫХ РНК И ДНК ИЗ МЕТАНУТИЛИЗИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ МЕТП-ОСОССиЭ САР51Л.АТ113.

03.00.23. - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА -1986 г.

Работа выполнена в Российском химико-технологическом университете им. Л.И. Менделеева. Научный руководитель: кандидат химических наук,

доцент Крылов Игорь Алексеевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук, заведующий сектором РосНИИ природного и культурного наследия Минкультуры и РАН Бевруков Михаил Георгиевич, доктор химических наук, проф. МГАТХТ им. М.В. Ломоносова Юркевич Александр Морисович

Ведущая организация: Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ (г. Москва, Б. Коммунистическая, 27)

Защита состоится 1996 г. в // часов на заседании диссертационного совета Д 053.34.13 в Российском химико-технологическом университете им. Д.И. Менделеева, 125190, Москва, Миусская пл. д. 9.

С авторефератом диссертации можно ознакомиться в Научно-информационном центре РХТУ им. Д.И. Менделеева.

Автореферат разослан Ч 1996 г.

Ученый секретарь

диссертационного совет, Д 053.34.13, к.б.н.

И.И. Гусева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы: Микробные полинуклеотиды в виде денатурированных РНК и ДКК низких и средних молекулярных масс являются перспективными источниками сырья для производства нуклеозидов и 5'- мо-нонуклестидов, составляющих основу в синтезе современных лекарственных средств, применяемых в лечении широкого круга заболеваний. Интерес к производству данной группы препаратов не только не ослабевает, но и в последнее время значительно растет в связи с угрозой иммунодифицита и с необходимостью создания,прежде всего, высокоэффективных противовирусных средств.

Преимущество микробных РНК и ДНК перед другими источниками сырья состоит в том, что их гидролиз приводит к образованию 4-х основных нуклеозидов или 5'- мононуклеотидов, которые в дальнейшем разделяют и получает очищенные кристалические препараты, используемые в синтезе лекарственных форм. Конкурентноспособность данного способа производства в сравнении с традиционным химическим синтезом зависит, прежде всего, от себестоимости получаемых лслинуклеотидов, которая напрямую связана со стоимостью микробиологического сырья. Это, в свое время, привело к развитию двух подходов в создании технологий микробных полинуклеотидов. Первый из них основывается на гидролизе нуклеопротеинов, извлеченных из микробных клеток, до нуклеозидов в среде с формамидом, а второй - на предварительной глубокой очистке нуклеопротеинов от белковых примесей с последующим гидролизом полученных полинуклеотидов в водном растворе.В том и другом случае образующиеся нуклеозиды разделяют ионным обменом, причем для первого варианта объем стоков с колонн оказывается на порядок выше, чем во втором.

Учитывая зарубежный опыт организации такого производства в промышенно-развитых странах, потенциальными производителями микробных полинуклеотидов и продуктов их гидролиза должны быть биохимзаводы, выпускающие в значительных объемах микробную биомассу в виде дрожжей или бактерий, клетки которых содержат наибольшее количество нуклеиновых кислот. В России такими заводами являются предприятия - производители кормового белка. Сегодня они могут Еыпускать практически только кормовой белок - один вид продукции с высокой себестоимостью из-за высоких цен на сырье и энергию. Это ставит задачу их частичного, по крайней мере, перепрофилирования на выпуск нового вида продукции, полинуклеотидов и продуктов их гидролиза. При этом необходимо учитывать особенности существующего производства кормового белка, построенного на переработке больших объемов водных суспензий и солевых растворов и не использующего, кроме как субстрата, органические вещества.

Целью настоящей работы явилось разработка научных основ технологии препаратов полинуклеотидов (РНК и концентрата ДНК), свободных от белковой примеси из клеток бактерий Ме1Ьу1ососсиз сарзи1а1из -продуцента кормового белка, выращиваемого на природном газе - и

проверка результатов работы в условиях опытного производства.

В задачу работы входило 1) Разработать основные стадии процесса получения очищенных полинуклеотидов, исключающие применение органических растворителей и фенолсодержащих растворов для предварительной обработки клеток бактерий и ферментов в очистке полинуклеотидов от белковой примеси.

2) Изучить количественные закономерности этих стадий и на основе полученных данных построить математические модели, обеспечивающие проведение технологического процесса в оптимальных условиях.

3) Создать нормативно-техническую документацию на организацию опытного производства.

Научная новизна. Впервые показана возможность получения препаратов полинуклеотидов (РНК и ДНК) из клеток бактерий без применения органических растворителей и технических ферментов.

Впервые на примере бактерий проведено количественное изучение и дано описание процессов экстракции нуклеопротеинов, центрифугирования суспензии денуклеинизированных клеток, концентрирования бесклеточных растворов нуклеопротеинов ультрафильтрацией., их осаждения в изоэлектрической точке из водных растворов и очистки от белков в водно-солевом растворе моноаммонийфосфата.

Практическая значимость. Разработана технология препарата РНК из бактерий, не уступающего по качеству дрожжевой РНК, и концентрата ДНК, свободного от белковой примеси, которые можно использовать для последующего гидролиза в нуклеозиды или в 5'-мононуклеотиды. На основе разработанных математических моделей предложены алгоритмы управления основными технологическими стадиями.

Апробация работы: отдельные материалы работы были представлены на конференциях - 1. "Химия и технология лекарственных средств" (С.Пб. 28-30 июня 1994 г.).

Публикации: По материалам работы опубликовано 2 статьи и подана одна авторская заявка на патент РФ " Способ получения нуклеиновых кислот из бактерий."

Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, изложения экспериментальных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и приложений. Работа изложена на____ стр. машинописного текста, проиллюстрирована..... таблицами и ____ рисунками. Библиография включает____ наименований работ, из них____ на иностранных языках.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Материалы и методы

В работе использовали: 1)стендовую культуру метанутилизируюпщх бактерий МеЫчу2ососси5 сарзи1аЬиз ВСБ - 874- промышленного продуцента кормового белка; 2)промышленную биомассу нативных бактерий, выращенных на природном газе в условиях ОПУ Светлоярского завода БВК ( предприятие АО "Биотех") со степенью доминирования основного штамма Ме1Ьу1ососсиз сарзи1а1иБ ВСБ - 874 не ниже 75 %.

Содержание полинуклеотидов (суммарных количеств РНК и ДНК) в

микробных клетках, растворах и препаратах, содержащих РНК и ДНК определяли по методу A.C. Спирина, ДНК в препаратах - по методу Дише, концентрацию фосфат-ионов в растворах - по методу Фиске-Саббороу, белковых веществ - по методу Лоури. Нуклеотидный состав препаратов оценивали по данным гидролиза под действием комплекса ферментов с нуклеазной и фосфатазной активностью, продуцируемого стрептомицетом Str. coelicolor А-165-25, любезно предоставленного АО "Биотехнология".

Спектрофотометрические измерения выполняли на спектрофотометре марки "Specord М-40".

При проведении анализов использовали химреактивы квалификации не ниже "чда", эксперименты проводили в лабораторных условиях и на опытной установке с применением технических минеральных кислот, щелочей и моноаммонийфосфата. Ив водного раствора моноашонийфосфата после отстаивания удаляли шлам. При разработке технологии вышеуказанных препаратов изучали процессы: экстракции нуклеопротеинов из клеток бактерий; получения бесклеточных экстрактов отделением микробных клеток на лабораторных центрифугах; ультраконцентрирования растворов нуклеопротеинов на установке с мембранами из полых волокон марки ВПУ-15-ПА; осаждения нуклеопротеинов и полинуклеотвдов в изоэлекгрической точке нуклеиновых кислот; разложения комплекса белков с нуклеиновыми кислотами в растворе моноаммонийфосфата, сушки очищенных препаратов полинуклеотвдов.

Опытно-промышленную проверку основных результатов работы проводили на установке предприятия АО "Биотех", оснащенной емкостным оборудованием эмалированным изнутри или из нержавеющей стали объемом от 0.1 до 10 м3, сепараторами фирмы "Лаваль", ультрафильтрационной установкой с мембранами вышеуказанной марки и с площадью фильтрующей поверхности 36-48 м2, вакуум-выпарной установкой для концентрирования соли и полочной сушилкой.

Обработку экспериментальных данных проводили с применением компьютерной техники по стандартным программам решения систем алгебраических и дифференциальных уравнений с последующей оптимизацией их параметров. Проверку разработанных математических моделей на адекватность осуществляли по критерию Фишера, отвечающему условию ForiT < FTa6j3. Для уровня значимости 0.05.

2. Результаты и их обсуждение.

2.1. Экстракция нуклеопротелнов из клеток метаиухнлизкрущнх бактерий водно-щелочными растворам«. Количественные закономерности процесса.

Анализ литературных данных показывает, что РНК в виде нуклеоп-ротеиноЕ может быть извлечена из клеток дрожжей обработкой водно-щелочными растворами.

Такая обработка клеток М. capsulatus по данным наших предварительных исследований приводит к извлечении не только РНК, но и ДНК. В нашем случае для оценки перспективы использования щелочных экс-трагентов для раздельного извлечения этих полинуклеотвдов мы были

вынуждены изучить влияние таких факторов как температура, рН среды, концентрация клеток на процесс экстракции нуклеиновых кислот. Для этого мы изучили кинетику данного процесса, используя в качестве объекта исследования нативные клетки М. сарзи1а1иБ частично денук-леинизированные в режиме, обеспечивающем степень извлечения РНК на 98 % и ДНК на 25 %.

На рис. 1 в координатах степень извлечения нуклеиновых кислот (х), время (£) приведены кривые экстракции суммарных нуклеиновых кислот (I) из вышеуказанных клеток при постоянном значении рН среды и при различных температурах и разном содержании клеточного материала (АСВ) в объеме экстрагента.

Ход кривых на рис. 1 и данные анализа препаратов, выделенных из соответствующих им экстрактов, показывают, что в случае частично денуклеинизированных клеток соотношение в них ДНК и РНК с увеличением температуры и времени обработки суспензий растет пропорционально выходу нуклеиновых кислот. Это свидетельствует о различии в скоростях извлечения РНК и ДНК, что можно использовать в создании технологии препаратов, обогащенных одним из видов полинуклеотдов. Для такого рода продукции одним из наилучших вариантов является содержание примесного полинуклеотида в препаратах на уровне 1,0-1,5 %. Ожидаемое содержание примеси в препарате можно прогнозировать, располагая данными исследования кинетики процесса по концентрации клеточного материала в суспензии. Из приведенных на рис. 1 зависимостей видно, что при постоянных температуре, рН среды и Бремени обработки значения х не зависят от концентрации клеточного материала в суспензиях. Это указывает на 1-ый порядок процесса экстракции по АСВ.

Отсутствие точек перегиба на кривых позволяет предложить для каждого вида полинуклеотидов достаточно простую схему последовательных превращений, с помощью которых можно достичь количественного описания процесса экстракции:

ь^ъ- ье

где: Вп - нуклеиновые кислоты (РНК или ДНК) в микробной клетке до воздействия экстрагента, и В1- в объеме экстрагента, а кх - эффективные константы скоростей стадии их извлечения из клетки в объем жидкой фазы.

Кинетические кривые на рис.1 (2), списывающие экстракцию ДНК, использовали для разработки математической модели процесса. Для этого экспериментальные данные были представлены в полулогарифмических координатах ¡пЦ-х),^. В ходе такой обработки были получены зависимости, линейный вид которых подтверждается высокими значениями коэффициентов корреляции гк = (0,985 - 0,998). Тот же вид зависимости был установлен в результате обработки кривых экстракции ДНК, полученных при постоянной температуре 90 °С и различных рН среды в интервале 7.0-8,6. Это подтверждает справедливость выбранной схемы превращений (1) и позволяет найти значение константы

- Б -

кхднк для каждой кинетической кривой.

Чтобы установить влияние температуры и рН на величину константы кь использовали широкоизвестное уравнение Аррениуса и специфического кислотно-основного катализа:

кх = к2-аон-/(Кь+аон-) (2)

где: Кь - константа равновесия образования комплекса внутриклеточного интермедиата с гидроксид-ионом; кг - эффективная константа экстракции, не зависящая от рН среды; аон- - активность гидроксид- иона.

Обработка соответственных серий кривых по методу наименьших квадратов в координатах Аррениуса и 1/к\ - 1/аон- (рис.4) дали линейные зависимости, что позволило найти численные значения констант Кь и к^ и эффективной энергии активации (Е*) для процесса экстракции ДНК, значения которых приведены ниже в табл. 1.

Располагая значениями параметров кг.Кь и Е в уравнениях кинетики экстракции ДНК, можно расчетным путем оценить долю лолиндезок-сирибонуклеинов в составе экстракта нуклеиновых кислот, образующегося при обработке нативных клеток бактерий при в исследуемых интервалах температуры и рН среды. Сопоставление результатов расчетов с данными состава полинуклеотидных препаратов показало, что экстракции ДНК в течение 1-ого часа из клеток бактерий практически не происходит. Это позволило найти параметры экстракции РНК к2рнкдьрнк и Ернк в ходе обработки соответствующих серий кинетических кривых (рис.1) по начальным участкам, используя те же уравнения, что и для экстракции ДНК. Полученные в результате расчета значения параметров приведены ниже в табл.1.

Схема превращений (1), уравнения (2) и Аррениуса при известных значениях их параметров определяют математическую модель процесса экстракции нуклеиновых кислот из клеток исследуемых бактерий, позволяющую предсказывать состав экстракта (соотношение РНК и ДНК) в зависимости от условий его получения. Ее проверка на адекватность путем сопоставления расчетного значения критерия Фишера с табличным подтвердили соблюдения условия Р0пт. < Ртаел.» что позволяет рассчитать оптимальные условия для извлечения РНК и ДНК из клеток исследуемых бактерий. Так, извлечение РНК целесообразно проводить, обрабатывая клетки экстрагентом при значении рН 7,5. При этом доля примесной ДНК минимальна и для режима обработки - 90 °С, 1ч- составляет 4 % при выходе 74 %. В случае ДНК рекомендуется более "жесткий" режим - рН 3,6, 90 °С, 4 ч. Выход ДНК достигает 65 причем, как показали данные эксперимента, увеличение этого показателя не происходит при увеличении времени экстрагирования и рН среды.

2.2. Отделение денукдеинизированних клеток бактерий центрифугированием.

Общеизвестно, что концентрирование клеток бактерий, в отличие от дрожжей,требует применения высокоэффективных сепараторов или бактофуг. После выделения из них полинуклеотидов скорость осаждения

г

| Рис. 2. Вид зависимостей, прегстзьленних на рис. 1 ("), б пслулсга-

| рифммческих координатах.

Ркс.З. ¿азисимэстъ эффективных констант скооости экстракции поли-нуклботидов от величины активности исков пщрзкгида ь среде экстрагента (в обратных координатах) (80 °С). 1 - экстракция РНК; 2 - экстракция ДНК.

бактериальных клеток может измениться в ту или другую сторону. Уменьшение скорости образования осадков ведет к увеличению потерь нуклеиновых кислот с межклеточной влагой. Чтобы составить рекомендации по выбору необходимого оборудования для данного процесса мы исследовали осаждение денуклеинизированных клеток исследуемых бактерий центрифугированием при различных факторах разделения Рг (критерий Фруда).

Объектом изучения явилась суспензия денуклеинизированных клеток бактерий, содержащая 5 % мае. клеточного материала (АСВ). За процессом следили по остаточному содержанию клеток в супернатантах (в ед. значений оптической плотности Б при длине волны 440 нм) после 10-минутного центрифугирования суспензии.

Согласно теории образования осадков при наличии сдвига кинетика осаждения может быть 2-ого и 1-ого порядка по концентрации осаждаемых частиц. Поэтому мы осуществили проверку экспериментальных данных на соответствие их, прежде всего, данным уравнениям.

На рис.4 приведены результаты обработки данной серии экспериментов по уравнениям 1-ого порядка (в координатах 1п Б440, Рг) и второго порядка (в координатах 1/Б440- 1/Во440,Рг). Как видно из рис.4, линейная зависимость (Гк=0.9810) отвечает уравнению 1-ого порядка, что указывает на низкую скорость флокуляции частиц. Даже при самом высоком значении фактора разделения (Рг = 3369) концентрация клеток в осадке не превышает 15 %. Это означает, что потери нуклеиновых кислот с осадком могут достигать 25 % от их содержания в экстракте.

Результаты опытов по центрифугированию подтверждаются и соответствующими экспериментами, выполненный на опытно-промышленном оборудовании. Использование высокоэффективных сепараторов марки "Альфа-Лазаль" производительностью 10 м3/час по суспензии при работе в оптимальном режиме, позволяет сконцентрировать ту же 5%-ную суспензию не более, чем в 2 раза. Таким образом, для сгущения денуклеинизированных клеток необходимо использовать только высокоэффективное сепарационное оборудование.

2.3. Концентрирование растворов нуилешюЕшс кислот удьтра$ия&-трацией.

Получаемые после отделения денуклеинизированных клеток растворы нуклеиновых кислот в виде соответствующих им нугаеопротеинов содержат 1,0 - 4,5 гНК/л. При таких низких концентрациях, как будет показано ниже, проводить осаждение нуклеиновых кислот в изоэлектри-ческой точке нецелеобразно. Как показали предварительные опыты, степень их осаждения невелика и потери могут достигать 80 %. Их можно уменьшить, если провести предварительное концентрирование экстрактов.

Среди возможных технологических приемов можно рекомендовать вакуум-выпаривание. Однако применение вакуум-выпарных установок в данном технологическом процессе, по нашему мнению, нецелесообразно из-за высоких энергозатрат. Кроме того, продолжительное воздействие

высоких температур на растворы биополимеров, как показывает практика эксплуатации таких установок в промышленности, может привести к ухудшению качества готового продукта из-за возникновения побочных реакций конденсации, практически всегда протекающих при повышенных температурах и рН среды, что сопровождается образованием окрашенных соединений. Более приемлемым и перспективным, по нашему мнению, является применение мембранных технологий.

Для концентрирования биополимеров обычно используют ультрафильтрацию, эффективность которой зависит от производительности и удерживающей способности выбранных мембран.

В качестве последних нами были применены широкоиспользуемые в промышленности половолоконныэ мембраны отечественного производства марки ВПУ-15-ПА. Их возможности были исследованы нами на примере изучения концентрирования, прежде всего, нуклеопротеинов РНК, обладающих по сравнению с ДНК меньшими молекулярными массами. При этом объектами исследования явились как нуклеопротеины в составе экстракта, так и изолированные из экстракта РНК в комплексе с белками.

На рис. 5 показано влияние концентрации нуклеиновых кислот и белков в ретанте на селективность (ф), характеризующую удерживающую способность ультрафильтра. Величину селективности рассчитывали по общепринятому для баромембранных процессов уравнению:

у = 1 - С2/С1 (3)

где С1 и Сг - соответственно концентрации вещества в ретанте и пер-меате.

Как видно из рис. 5, для изолированных компонентов нуклеиновых кислот соотношение значений селективностей по нуклеиновым кислотам и белкам во всем диапазоне изменения их концентраций в ретанте одно и то же. Это позволяет сделать вывод о том, что нуклеиновые кислоты в щелочном экстракте, в основном, находятся в виде комплексов с белками.

Наблюдаемые более низкие значения селективностей при концентрировании экстрактов свидетельствует о присутствии в них низкомолекулярных продуктов той же природы.

Наличие значительной доли низкомолекулярных продуктов нуклео-тидной и белковой природы в экстрактах нельзя объяснять только извлечением в экстракт пула свободных нуклеотидов и пептидов из клетки. Видимо, в данном случае имеет место и участие в их образовании внутриклеточных РНК-аз. Присутствие низкомолекулярной примеси снижает эффективность процесса концентрирования нуклеопротеинов ультрафильтрацией. Если воспользоваться зависимостью на рис. 5, то легко рассчитать долю потерь нуклеопротеинов при концентрировании раствора на вышеуказанных полых волокнах. Так., при начальном содержании нуклеиновых кислот в экстракте 3,8 г/л, чтобы достичь концентрации в ретанте 12 г/л, степень изменения объема раствора должна быть равна 4, а потери составят 24 %. При более низкой начальной концентрации 2,5 г/л ту же концентрацию в ретанте можно достичь при

степени изменения объема 8, однако потери достигнут 41 %. Поэтому повышение эффективности мембранного концентрирования напрямую оказывается связанным со снижением доли низкомолекулярных продуктов нуклеотидной и белковой природы в получаемых экстрактах. Из опыта работы производства дрожжевой РНК известно, что стадию горячей экстракции нуклеопротеинов проводят в присутствии ингибитора нуклеаз. И наш случай эту рекомендацию не исключает.

Другим важным параметром мембранного концентрирования является удельная производительность (в). На рис. 6 показано влияние концентрации нуклеиновых кислот в изолированных нуклеопротеинах и в составе экстракта на величину удельной производительности мембранного аппарата. Из этого рисунка видно, что в сравнении с производительностью ультрафильтра по воде параметр 6 для растворов нуклеопротеинов меньше всего в 6,4 раза и сохраняется постоянным до концентрации нуклеиновых кислот до 16 г/л. Выше ее наблюдается линейное падение скорости процесса до нуля. Для описания этого участка кривой можно воспользоваться уравнением мембраны с идеальной селективностью:

в =^1п(Сг/С1) (4)

где О - производительность разделительного аппарата ; Сг - концентрация нуклепротеинов, соответствующая точке гелеобразования, а Я .-коэффициент массоотдачи. ^

Обработка дачных рис.6 по уравнению (4) показала, что уравнение идеальной мембраны вполне применимо для количественного описания данного процесса. Значения г^ для кривых 1 и 2 составляют 0,987 и 0,988 соответственно. Концентрация гелеобразования (83 + 14) г/л, а соответствующие коэффициенты массоотдачи (7,3 + 0,2) и (11,5 + 0,2) л м'г ч-1. Как и следовало ожидать, из-за наличия низкомолекулярной примеси значение ^р . выше для экстрактов чем для растворов изолированных нуклеопротеинов. Высокое значение Сг позволяет считать влияние гелеобразования на скорость процесса несущественным, поскольку реальные концентрации нуклеиновых кислот в перерабатываемых растворах много меньше. Последнее позволяет проводить процесс глубокого ультраконцентрирования без дополнительного увеличения энергозатрат при перекачивании больших объемов экстракта.

2.4. Переработка растворов куклеопротенноз с получением препаратов РНК и концентрата ДИК.

2.4.1. Осахдепие нукдеопротелнов из водных растворов в иноэ-лектричсской точке. Количественные закономерности процесса.

Объектами исследования явились те же изолированные нуклеопро-теины и нукяеопротеины в составе экстракта после их концентрирования ультрафильтрацией. Варьируемыми параметрами процесса были время образования осадков ('2), начальная концентрация нуклеиновых кислот (Сма.о) и рН среды. Все серии экспериментов производили при температуре 4 °С с изменением одного из параметров при постоянстве других.

На рис. 7 в координатах степень осаждения (х3) приведены

таблица 1.

Значения эффективных констант и энергий активации в экстракции лолннуклеотидов из метаиутилизирующих бактерий.

1 |Извлекаемые Iполинуклеотиды |Къ Юб,М 1кг90 с 105,с-1 1 Е.кДж. М"1 1 (икал М"1) I

1 1 | РНК 1 ¡19,4+1,6 ] д * 5,8 64,5 + 2.1 | (15,4 + О,Б) |

1 1 1 ДНК 1 138,0+2,5 1" 1 9,3 + 1,2 35.£ + 2,5 ) (8,4 + 0,6) | >

Рис.4ч Определение концентрационного порядка в кинетике осаждения денукгеинизированных клеток бактерий центрифугированием.

о.:

3.

А

/

1.0

2.0

Рис.5, Влияние,концентрации н' ванных (1) Тз ------ ------емо1

составе экстракта (2

водитель:............._ _

и по белкам.

от и белков иволкро-

Е

НК

линейного из-от давления ш длиде т1» рН Условные обозначения: данные расчетов соответственно по

О )

типичные кинетические кривые образования осадков нуклеопротеиков в экстрактов вблизи изоэлектрической точки нуклеиновых кислот (рН 2,0) при различных начальных концентрациях нуклеиновых кислот. Вид зависимостей на рис. 7 показывает, что с увеличением времени осаждения и начальной концентрации нуклеиновых кислот показатель х3 растет симбатно концентрации последних и достигает в каждом случае своего квазистационарного значения. Как видно из рис. 7, зависимость х3 от начальной концентрации нуклеиновых кислот свидетельствует об концентрационном порядке в кинетике осаждения, отличного от 1.

Чтобы исключить возможное влияние факторов, стабилизирующих суспензию взвешенных, все последующие опыты проводили с использованием центрифуги.

На рис. 8 приведены зависимости показателя я3 от начальной концентрации нуклеиновых кислот при факторе разделения Гг = 2475.

При выборе подхода к количественному описанию зависимостей на рис. 7 и 8 можно воспользоваться данными теории осаждения частиц. Известно, что индуцированные сдвигом скорости зарождения и начального роста частиц осадка описываются уравнением 2-го порядка. В этом случав схему образования осадков можно представить в виде:

гш0 (5),

где ОДНо - "'нуклеопротеины в изоэлектрической точке, (НАНо)г - Ф^0* кулы образующегося осадка, а К3' - константа равновесия, устанавливающаяся между осадком и нуклеопротеинами в растворе, к* и к-1 -константы скоростей образования осадка и его растворения в отсутствии равновесия, соотношение которых определяет величину константы Кв при достижении равновесия.

Схеме превращений (5) отвечает уравнение связи х3 с начальной концентрацией нуклеиновых кислот:

_--V' п (6).

г

Обработка экспериментальных данных в координатах X*) >

дала результаты, приведенные на рис. 9. Обработка результатов по' методу наименьших квадратов дает значение константы К 3 = (650 ± 15) Л'МОЛЬР-1. То же значение константы наблюдается и для нуклеоп-ротеинов в составе экстракта в области высоких концентраций. При их низких значениях вид зависимостей не совпадает.

При исследовании кинетики образования осадка нуклеопротеинов отстаиванием (рис.7) использовали схему превращений (5) с учетом того, что образование и растворение осадка происходит с разными скоростями. Решение численным методом соответствующего этой схеме дифференциального уравнения с использованием установленного выше соотношения К3 = ка/к-1 , дает возможность найти значения констант к1 = (4,1 ¿0,7) л-мольР"1 мин-1 и к-1 = (6,2 + 1,2). 10"3 мин'1, которые позволяют рассчитать время образования осадков нуклеопротеинов при различном их начальном содержании в растворе.

Как было сказано выше, при низких концентрациях нуклеиновых

Рис. 8. влияние начальной концентрации нуклеопрогбинов на степень их осаждения вблизи изсэлектсической точки ГрН £.0.). Условия проведения опытов.- темпэратуоа суспензии осадков 4 °С, скеление ссадкоь иектси^уГизоЕанхем -эи Гг - ',¿¿75. Усобозначения те ке. что и на о;;с.5.

Рис. !

1.СС

0.75

О.ЕО

0.25

40 ао С*.

Линеаризация вавияыосги от Ска. о в сериях слытое по осаждению изолированных нуклеопротеинов и нуклеопрзтек-кое з составе экстракта ьблиги изсэлектрической точки центрифугированием (Кг - Е475).

. . Определение константы К3 графическим путем. Условные обозначения вариантов осадания нуклеопротеинов:«- изолированных, О-в составе экстракта центрифугл-$ рованием; . ...

О 1 2 2 4 5 р

10. газисиыость степени осаждения нуклеопротеинов от рН среды, создаваемой соляной Г») и (иди) ортофосйгаряой (а) кислота-

кислот наблюдаются отклонения экспериментальных значений х3 от результатов расчета по уравнению (5). Количественное описание процесса осаждения нуклеопротеинов в составе экстракта возможно достичь, если учесть, что образованию осадков мешает наличие неконтролируемой нами примеси в среде. Анализ различных схем превращений, учитывающих отрицательное влияние мешающей примеси на скорость образования осадков позволило выделить одну из них, способную количественно описать вид кривой на рис... 7 в области низких концентраций нуклеиновых кислот: УАНи 1.,з&УАНс1.

гА/МГ^^АН6^ .. ..

где: Ь - извлекаемые из клеток низкомолекулярные "мешающие" примеси а МН°]_ и (ЫАН°Ь)2 ~ соответственно образующийся аддукт при их взаимодействии с нуклеопротеинами и флокулами осадка.

На завершающем этапе исследования кинетики осаждения нуклеопротеинов было установлено влияние рН на величину показателя х3.

На рис. 10 показано влияние рН среды на показатель х3. Наличие у кривой четко выраженного максимума в интервале рН 1.5 - 2.5 свидетельствует о заметаем снижении растворимости нуклеопротеинов в области изоэлектрической точки нуклеиновых кислот (рН 2.0). Отсутствие в этой точке 100 %-ного осаждения нуклеопротеинов даже при высокой их концентрации в растворе можно объяснить установлением равновесий между заряженными и нейтрализованными молекулами, прежде всего, нуклеиновых кислот.

Ж/Г+ Н+&УАН0

Такой схеме превращений отвечает уравнение связи начальной концентрации нуклеиновых кислот в растворе и показателя рН среды со степенью их осаждения: { . „ .

хь) ^г (33

где ан+ - величина активности данов водорода в среде. В этом уравнении неизвестными являются значения констант Кх и Кг.

Как показал анализ экспериментальных данных, найти значения констант К1 и Кг можно, если провести раздельную обработку значений х3 на рис. 10, расположенных на кривой слева и справа от максимума. Для левой ее полуветви - области значений рН, где нуклеиновые кислоты заряжены положительно, величина х3 зависит, в основном от величины константы К2, а для правой полуветви, где полинуклеотиды заряжены отрицательно, положение точек на кривой зависит от величины константы Ка- I— .—•

В этом случае зависимостиЧ И»^/у Хд от ан+ или от

ан+-1 оказываются линейными и исходящими из одной точки на оси ординат численно равной величине (К;3)~1/2 и с равными тангенсами угла

наклода,прямых к оси абсцисс, соответственно значениям и

(К 4 * ) -

Результат такого подхода к обработке экспериментальных данных иллюстрирует рис. 11. На основе этих зависимостей можно найти значения констант Кб, Ка и Кг. Они составили: К3 = (1013 + 57) л-мольР, Кх = (460 + 23) л'моль-1 и Кг = (3,0 + 0,9) л-моль-1.

Установленные значения констант К1, Кг и К3 были использованы для проведения расчета показателя р1 - изоэлектрической точки осаждения нуклеопротеинов. Данные расчета совпали с экспериментальными. Они показали, что р! нахэдится в интервале 1,8 - £,2.

Уравнение (<£) и значения констант Кь Кг, К3 определяют математическую модель процесса осаждения нуклеопротеинов из водных растворов в изоэлектрической точке, которое адекватно описывает экспериментальные данные , что позволяет рассчитать параметры оптимального режима проведения процесса и дать соответствующие рекомендации: значение рН осаждения нуклеопротеинов необходимо поддерживать на уровне 2,0 + 0,2; процесс осаждения нуклеопротеинов целесообразно проводить из растворов, с их начальной концентрацией выше 15 гМ/л. При этих условиях возможно достичь степени осаждения 85-90 % путем отстаивания суспензии в течение 1,5 - 2,0 часов.

2.4.2. Разложение нуклеопротеинов в растворе ортофосфата.

По итогам ранее проводенных нами исследований на примере клеток дрожжей и изолированных из них нуклеопротеинов было показано, что соли ортофосфорной кислоты способны вступать в реакции солевого обмена с нуклеопротеинами дрожжей. Образующиеся при этом полинукле-отиды остаются в водно-солевом растворе, а белки, вступая в комплекс с ортофосфатом, выпадают в осадок.

Чтобы проверить возможность применения ортофосфатов для очистки нуклеиновых кислот от белков из метанутилизирующих бактерий были поставлены соответствующие серии опытов по влиянию концентрации -ор-тофосфата на качество получаемых полинуклеотидов. В качестве солевого реагента были выбраны моноаммонийфосфат, используемый в современном производстве кормового белка.

На рис. 12 для изолированных нуклеопротеинов показано изменения относительных концентраций (Х=С/С0) нуклеиновых кислот и белков в супернатантах с различным содержанием соли. Как видно из рис. 12 при различных начальных концентраций нуклеопротеинов увеличение содержания в среде соли ведет к снижению концентрации нуклеиновых кислот и белков в супернатантах, причем кривые Хыа совпадают, а кривые Хр нуклеопротеинов дрожжей сходятся. Аналогичные зависимости имеют место при разложении нуклеопротеинов бактерий в экстракте и это позволило нам использовать ту же математическую модель, разработанную ранее для разложения нуклеопротеинов из дрожжей. Она предполагает распад комплексов полинуклеотидов с белками по схеме солевого обмена и учетывает эффект высаливания нуклеиновых кислот и белков от присутствия в среде ортофосфата. В основе такой модели лежит схема превращений:

.Ьгнеьлпзацйл гаккы:; гагкш;::;: ст-пени осажл-к::;; н.'^гоп-р-гепнп И-Г-л:::.П С Г ':с'-:

Таблица 2.

Состав полкнуклеотидных препаратов (РНК и днк), полученных с применением традиционной технологии сужи (на воздухе ив водно- спиртоеых осадков) и РНК-препарата, высушенного распылительно С*!.

1 Показатели качества Лслкнуклеотигиые препараты |

РНК 1 РНК* | концентрзт[

1 ДНК |

| Содержание: i 1

i основного в-ва (по А.С.Спирину) > 80,0 г 80,0 | > 60,0 |

1 фосфора нуклеиновых кислот » 7,9 7,9 1 > 7,8 |

! обаего азота ""<> 16,0 > 16,0 | ¿"15,5 |

1 РНК > 78,5 > 78,5 | ■10,D |

1 ДНК i 1,5 1,5 ! 40,0 |

| влаги 4 10,0 ч< 10,0 | ч< Ю,0 |

| внешний вид: порошок цвета кремового желтого 1 желтого 1

| молекулярная масса (по белковым I

1 маркерам, hü) 24 i 50?=) 24 (50%)| 1

6 (507.) 6 (50%)| !

2 мель-А

Изменение относительных концентраций нуклеиновых кислот белков (Хр) в растворах изолированных нлаеопрстеннов в гависпмости от содержания ортофоофа-тз (моноашсккйЬэофата; в среде (рН 6,0). (Услознае обозначения: индексы 1,Е - отвечает исходной концентрации нуклеиновых кислот соответственно 15 и 26

__ ^

Т'° Р^З»®НИС КУКДсОД-^ЗсЛ'ЬЫе ОбОг'КсЛе^ПЛ^ *Г:*'-уТСТ! ¿ГГ-'С ОТЬ**!?.^? ягхог-

р. с л ксяаентргааи нуклеикоБыхкйс^бт 1551сЗ.Гг/,^ м

ЛМ-F-t (oftho- CT]

Ш+ (crthe-F) h Ш

fr-nt (Ortho-F) jb УА + P. (crtho''f\\

Или суммарно: к . (10)

sYA-P + n(orUv-P) J~sr у А + ?-(ortho'F)^

где: NA«P, (ortho-F), CID, [11],...,CN-13 - интермедиа™, NA и Р. (ortho-F)n - соответственно массы или концентрации нуклеопротеи-нов, ортофосфата, свободных от белков полинуклеотидов и комплексов белков с ортофосфатом; п - некий стехиометрический коэффициент, а К = ki'kg-.-kn - эффективная константа.

Для нахождения значений Кип в уравнении (iß) необходимо знать равновесные концентрации белков. В зависимости от содержания в среде соли их можно рассчитать по уравнению материального баланса, если известна постоянная высаливания р). Для белков в составе нуклеопротеинов значение последней можно найти путем диффе-ренициальной обработки начальных участков кривых Хр на рис.12. В результате такой обработки удалось установить, что значение с&з? составляет (0,018+0,002). _ '

Для расчета равновесной концентрации белков (Ср) для каждой кривой на рис. 12 мы воспользовались уравнением CD = где Ср - их концентрация в эксперименте, а M-i - ионная сила раствора, создаваемая моноаммонийфосфатом.

Схеме превращений (Ii?) отвечает уравнение связи:

(1-Хр)2/Хр = K-[orthophosphate]0n/Cp,0 <di)

При известных равновесных значениях концентрации соли это уравнение можно использовать для обработки экспериментальных данных.

Для нахождения этих концентраций мы воспользовались данными прямого измерения содержания ионов фосфора в вышеуказанных суперна-тантах. Результаты анализа показали, что на образование малорастворимого комплекса белка с ортофосфатом расходуется не более 3 Z количества соли, взятой на разложение. Это позволило считать концентрацию ортофосфата в уравнении (М) величиной постоянной и равной начальной. Тогда обработку экспериментальных данных можно провести в логарифмических координатах, позволяющих найти значения К и п.

Как видно из рис.13, в этих координатах зависимости являются линейными функциями (гк = 0,985 - 0,987), а значения К = (1,18 + 0,05) г белка нуклеопротеинов-л2-(моль ортофосфата)-3 и п = (3,01 ± 0,02) остаются неизменными, причем теми же самыми что ранее были установлены при разложении нуклеопротеинов дрожжей.

Располагая значениями Кип можно рассчитать оптимальную концентрацию моноаммонийфосфата, обеспечивающую требуемую степень очистки полинуклеотидов от белковой примеси. Так для концентрации нуклеиновых кислот 15 г/л минимально необходимая концентрация соли, обеспечивающая соответствие препаратов требованием технических условий (80 % полинуклеотидов при 4 % белковой примеси), содержание моноаммонийфосфата в среде должно быть на уровне (2,0 + 0,2) моль

Л"1.

2.4.3. Получение растворов полинуклеотидов свободных ох соли ортофосфорной кислоты.

После разложения нуклеопротеинов в среде ортофосфата и отделения осадка белков растворы полинуклеотидов содержат значительное количество соли. Выделить нуклеиновые кислоты из солевых растворов можно осаждением в изоэлектрической точке после добавления к охлажденному раствору соляной или ортофосфорной кислоты. Однако среда с высокой концентрацией ортофосфата обладает большой буферной емкостью, что существенно увеличивает расходную норму минеральной кислоты. Кроме того использование соляной кислоты делает невозможным утилизацию водно-солевого супернатанта в данном технологическом процессе, а применение ортофосфорной кислоты может быть ограничено ее стоимостью.

Как показали предварительные эксперименты, независимо от Еида минеральной кислоты выход полинуклеотидов на стадии осаждения РНК с учетом проведения последующей стадии их доочистки от соли переосаждением составляет 70 X. Для более разбавленных растворов концентрата ДНК потери возрастают до 50 %. Образующиеся в том и другом случае осадки являются пастообразны™ и трудноотделяемыми в условиях многотоннажного производства.

Более перспективным, по нашему мнению, является применение мембранной технологии для освобождения полинуклеотидов от низкомолекулярных соединений. Для этого была исследована возможность использования ультрафильтрационной очистки на половолоконных 'мембранах марки ВПУ 15-ПА.

Предварительные исследования показали, чтобы избежать соосаж-дение моноаммонийфосфата с осадком нуклеиновых кислот необходимо снизить концентрацию соли до 0.03 моль-л-1. Если считать, что селективность мембран по низкомолекулярным соединениям близка к нулю, то можно рассчитать кратность проведения стадий диафильтрации солевого раствора полинуклеотидов, образующегося после отделения белкового осадка. Расчет показывает, что число таких стадий должно быть 6-7. Выполнение такого эксперимента подтвердило это значение. По итогам его проведения была установлена доля теряемых с пермеатом полинуклеотидов. Она оказалась той же самой, что и в случае их осаждения в изоэлектрической точке из водно-солевого раствора (30 %). При диафильтрации солевых растворов концентрата ДНК процент потерь нуклеиновых кислот возрастает до 50 % за счет отвода более низкомолекулярной РНК с пермеатом. В то же время было установлено, что соотношение ДНК и РНК в ретанте увеличивается с 3:5 до 1:1. Кроме того, было обнаружено, что часть ДНК обратимо сорбируется на поверхности мембраны. В дальнейшем, наблюдаемый эффект адсорбции части ДНК мы использовали для снижения ее примеси в РНК-содержащих растворах.

Результат исследования процесса мембранной очистки растворов нуклеиновых кислот от низкомолекулярных примесей позволяет рекомен-

довать применение такой технологии в производстве нуклеотидных препаратов.

2.4.4. Получение сухих форы препаратов РНК и концентрата ДНК.

Традиционно сухие формы очищенных препаратов РНК и ДНК получают путем их предварительного осаждения из кислого водно-спиртового раствора с последующим высушиванием на воздухе или в токе нагретого азота. Как показали наши исследования,получение сухих форм ДНК-содержащих препаратов, более термолабильных по сравнению с РНК, должно осуществляться таким способом. Относительно получения сухих форм препарата РНК мы дополнительно исследовали возможность высушивания водных растворов распылением в токе горячего воздуха. Для этого обессоленный на предыдущей стадии и подкисленный до рН 2,5 ретант был высушен в лабораторной распылительной сушилке до порошкообразного продукта при температуре входящего воздуха 120 - 140 °0 и выходящего - 70 - 80 °С.

Данные анализов препаратов РНК, высушенных разными способами, и препарата ДНК, высушенного по традиционной технологии, приведены ниже в табл. 2. Из них следует, что сушка распылением в токе горячего воздуха не изменяет качество получаемых препаратов РНК. Кроме того, она является предпочтительной, поскольку исключает из технологического процесса стадии применения и последующей регенерации низших спиртов.

2.5. Основы технологии очищенных препаратов РНК и концентрата

ДНК.

По результатам работы предложена следующая схема переработки метанутшшзирующих бактериий с получением РНК и концентрата ДНК (рис.14).

ВЫВОДЫ

1. Разработаны основы технологии очищенных полинуклеотидов (РНК и концентрата ДНК) из метанутилизирующих бактерий Methylосос-cus capsulatus на основе источников сырья, используемых в производстве кормового белка. Впервые удалось отказаться от применения стадий предварительной обработки микробных клеток органическими растворителями и фенолсодержащими растворами, что позволило создать малоотходную технологию с утилизацией стоков как в производстве полинуклеотидов, так и кормового белка.

2. Технологический процесс получения РНК и концентрата ДНК основывается на использовании солей ортофосфорной кислоты (моноаммо-нийфосфата) для очистки полинуклеотидов от белков, что позволило отказаться от применения протеолитических ферментов.

3. Проведено количественное исследование основных стадий технологического процесса - экстракции нуклеопротеинов и их ультраконцентрирования, осаждения из водных растворов в изоэлектрической точке и очистки в среде ортофосфата от белков.

Для управления технологическим процессом разработаны математические модели всех вышеуказанных стадий, адекватно описывающие экспериментальные данные, и рассчитаны значения эффективных констант и

суспензия\ клеток бактерий,

Экстракция нуклеопротеинов слабыми растворами щелочей '•£ =90®С рН 7,5 г=1 ч.

рн

РНК

5,6 4 Ч

.1АН*

Разбавление суспензии денук-леинизированных клеток водой и отделение экстракта центрифугированием

экстракт нуклеопротеинов , ,сод.2,5- , \4,5 гНК/л /

'осадок денуклеини-Л на перера-... , оотку

Концентрирование экстракта ультрафильтрацией (в.¡0..раз)

ретант,содержащий нуклеопроте-игаы 12-15 гНК/л

Осаждение нуклеопротеинов в ИЭТ отстаиванием и декантирование надосадка рН 1,8-2,2

/сырой —п осадок нуклео-\протеи-\нов

Растворение нуклеопротеинов в растворе моноаммонийфосфата и отделение белкового осадка (СмаФ=2,0+0,2 ®ль/л)____

белковый .осадок

Солевой раствор полинуклеотидов 26' гНК/л

Обессоливание раствора полинуклеотидов диафиль-тратаей__

й\

/I на производство кормового Оелка'

Водный раствор полинуклеотидов

Сушка кислого раствора РНК распылением в токе горячего воздуха 1бвх=120-140 °С Ь°вых=70-80 °С

V Сухой препарат РНК_

Осаждение конц.ДНК ^Гводно-спир кислым спиртом \ осадок ДН^

/'Сухой препарат N Vконц.ДНК ;

Рис. 14. Принципиальная схема получения очищенных препаратов полинуклеотидов (РНК и концентрата ДНК).

энергий активации.

4. На основе результатов исследования подготовлена нормативно-техническая документация ТУ на препарат РНК, регламент и исходные данные на проектирование опытно-промышленной установки мощностью 1 т/г.

5. Проведена проверка основных стадий технологии на опытной установке Светлоярского завода БВК ( предприятия АО "Биотех").

Список публикаций по теме диссертации.

1. И.А. Крылов, Н.В. Волкова, Ву Тхи Фыонг Ань, М.Н. Манаков -Кинетика экстракции полинуклеотидов из клеток дрожжей и метанутили-зирующих бактерий. - Биотехнология, 1996, N 7, с. 52-57.

2. И.А. Крылов, В.А. Гунин, Н.В. Волкова, Ву Тхи Фыонг Ань, М.Н. Манаков - Разложение нуклеопротеинов дрожжей и бактерий в среде ортофосфата. - Биотехнология, 1996, N 7, с.58-64.