Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение, свойства и практическое применение некоторых термостабильных ферментов обмена нуклеиновых кислот

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Выделение, свойства и практическое применение некоторых термостабильных ферментов обмена нуклеиновых кислот"

РОССИЙСКИЙ ХИМИКО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ р г 5 ОД ИМЕНИ Д. И. МЕНДЕЛЕЕВА

г з опт воз

На правах рукописи ЗАМКА Александр Иванович

ВЫДЕЛЕНИЕ, СВОЙСТВА И ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ТЕРМОСТАБИЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ ОБМЕНА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1995

Работа выполнена в акционерном обществе "ВОСТОК" и Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Научные руководители:

доктор биологических наук Александр Сергеевич Миронов

кандидат химических наук Борис Вадимович Тяглов

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Игорь Александрович Ямсков

кандидат химических наук Елена Александровна Гурковская

Ведущая организация:

институт микробиологии РАН

Защита диссертации состоится "12 " декабря 1995 г. в Л22_ час. на заседании диссертационного совета Д 053.34.13 в конференцзале Российского химико-технологического университета им. Д.И. МЕНДЕЛЕЕВА по адресу: 125047 Миусская пл., д.9.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского химико-технологического университета им. Д.И. МЕНДЕЛЕЕВА.

Автореферат разослан "_ 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук И.И. Гусева

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Ферменты обмена нуклеиновых кислот играют ключевую роль в метаболизме клетки, обеспечивая протекание таких жизненно важных, процессов, как репликация, рекомбинация и репарация генетического материала. Особую группу составляют ферменты обмена нуклеиновых кислот, выделенные из. термофильных и некоторых мезофильных микроорганизмов, которые обнаруживают свойства термостабильности и термофильности. Благодаря своим уникальным свойствам, эти ферменты находят широкое практическое применение. Наиболее ярким примером является использование термостабильных ДНК-полимераз в циклической полимеразной реакции, секвенировании и ряде других современных методов молекулярной биологии и генетики. Несмотря на значительный прогресс в изучении термостабильных ферментов, их физико-химические свойства, а также механизмы функционирования исследованы недостаточно. В частности, сравнительно мало изучены механизмы взаимодействия термостабильных ДНК-полимераз с субстратами и особенности репликации ДНК у термофильных микроорганизмов. Также весьма ограничены сведения о свойствах термостабильных ферментов, используемых для гидролиза нуклеиновых кислот. Исследование свойств этих ферментов играет важную роль в разработке новых технологий получения компонентов нуклеиновых кислот.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлось выделение и изучение свойств некоторых практически значимых ферментов обмена нуклеиновых кислот, разработка на их основе новых технологий получения компонентов нуклеиновых кислот. В работе были поставлены следующие задачи:

выделить термофильные нуклеазы из гриба Бркапа ую1асеа и изучить их физико-химические свойства и субстратную специфичность;

разработать новой способ получения 2'-дезоксирибонуклеозид-5'-мо-нофосфатов;

разработать новый метод выделения ДНК-полимеразы из термофильной бактерии ТЬеппив аяиа^сиБ;

изучить свойства ДНК-полимеразы Тая и исследовать эффективность взаимодействия праймеров различной длины с ферментом. Научная новизна и практическая ценность работы. В данной работе изучены термофильные нуклеазы из мицелия гриба Бросала Ую1асеа. Впервые был получен гомогенный препарат нуклеазы, определены некоторые физико-химические свойства и субстратная специфичность фермента. Разработан способ получения 2'-дезоксирибонуклеозид-5'-мо-нофосфатов на основе гидролиза ДНК нуклеазами из гриба Бркапа ую!асеа и проведены промышленные испытания данной технологии.

В работе также был предложен эффективный способ выделения ДНК-полимеразы из бактерии ТЬегшиэ адиаИсиБ, который внедрен и в настоящее время используется для получения фермента на Омутнинском химическом заводе. Были исследованы физико-химические свойства ДНК-полимеразы Тая 11 впервые изучена эффективность взаимодействия олигонуклсотидов-прсммераъ различней сЫны с этим срермчнтом. Нами найдены величины Км и Умакс для праймеров оН£о(с1А)п , где п—2-14. Показано, что величины -1цКм и ^Умакс линейно возрастают с увеличением длины праймера до п=10. При увеличении длины праймера на одно нуклеотидное звено (в интервале п=2-10) происходило возрастание его сродства к ферменту в 3.3 раза. Сделано предположение о том, что оптимальный размер праймера равен 10 нуклеотидным звеньям.

Структура работы. Диссертация включает 114 стр. машинописи, 24 рисунка, 11 таблиц и список литературы (113 ссылок). Работа состоит из введения (2 стр.), обзора литературы (28 стр.), описания материалов и методов (13 стр.), описания полученных результатов и их обсуждения (45 стр.), а также выводов, списка цитируемой литературы и приложения (22 стр.)

Публикации. По материалам опубликовано 4 печатные работы и поданы 2 заявки на патент.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Выделение нуклеаз из гриба 5р!сапа \'!о!асеа штамм ВКПМ Р-273. Изучение свойств нуклеаз.

Влажный мицелий гриба экстрагировали при интенсивном перемешивании в течение 1 часа в 50 мМ трис-НС1 буфере, рН 8.7 при температуре 45°С, а затем полученный экстракт центрифугировали (фракция 1).

Все дальнейшие операции по выделению ферментов проводили при температуре 4°С. Экстракт концентрировали методом ультрафильтрации на полых волокнах (фракция 2). Осаждение белков в полученном концентрате проводили 70 % сульфатом аммония (фракция 3). Осадок диализовали и наносили на хроматографическую колонку (1.5*8 см) с голубой сефарозой. Колонку промывали буфером и элюировали линейным градиентом концентрации КС1 (от 10 мМ до 1.0 М). Хроматография на голубой сефарозе показала наличие двух фракций, которые обладали нуклеазной активностью, одну из которых назвали нуклеазой 1 (элюировалась при более высокой ионной силе), а вторую -нуклеазой 2 (фракция 4). Фосфатазы в процессе хроматографии также разделились на две фракции, первая из которых элюировалась в свободном объеме, а вторая между фракциями нуклеаз, плохо отделяясь

от нуклеазы 2 (рис. 1).

Нуклеаза 1 была, дополнительно очищена с помощью хроматографии на колонке (1*8 см) с ДЭАЭ-целлюлозой. Колонку промывали буфером и фермент элюировали линейным градиентом КС1 (от 10 мМ до 0.4 М). (рис. 2). Фракции, содержащие нуклеазную активность, объединяли и диализовали против 20 мМ трис-НС1 буфера, содержащего 50% глицерина (фракция 5). Результаты выделения ферментов приведены в табл. 1.

Электрофорез нуклеазы 1 в полиакриламидном геле в нативных и денатурирующих условиях показал, что фермент представлен одной полосой, с которой связана нуклеазная активность (рис. 3). Определение молекулярной массы фермента проводили методом электрофореза. Согласно полученным данным, она составляла 75 кДа.

Некоторые свойства ферментов приведены в табл. 2.

Таблица 1. Очистка нуклеаз из гриба Бркапа ую1асеа.

№ Стадия очистки Суммарная активность, ед. Удельная активность, ед/мг белка Выход, /о

1 Экстракт 72000 35.4 100

2 Концентрат 65000 49.1 90

3 Осаждение суль-

фатом аммония 9300 230 13

4 Хроматография на

голубой сефарозе

нуклеаза 1 - 3100 830 4.3

нуклеаза 2 - 890 120 1.2

5 Хроматография

нуклеазы 1 на

ДЭАЭ-целлюлозе 1460 1820 2

Нуклеазы обладали высокой термостабильностью, которая повышалась в присутствии субстрата - нуклеиновой кислоты. Ферменты не теряли активность при температуре 60°С в течение 40 минут и инактивировались полностью за 5 минут при 85°С. Для проявления каталитической активности ферментам необходимо присутствие ионов М§2+ или Мп2+ , а ЭДТА, фосфомолибденовая кислота, молибдат и фторид натрия подавляли их активность. Нуклеазы гидролизовали высокомолекулярную ДНК до олигонуклеотидов и 5'-моконуклеотидов, а также расщепляли линейную, кольцевую, суперспирализованную ДНК (плазмиды р]Ж 322). Гидролиз РНК проходил с образованием

ркбоиуклеозидмонофосфатов. Препарат нуклеазы 2 проявлял неспецифнческую фосфодиэстеразную активность: гидролнзослл бнс-(п-нитрофенил)-фосфат кальция. Аналогичной активностью обладали фракции фссфатаз. ~

1 > i 1

и 1

д А

V

KCI.'.i !

/I &

I l.i 1

I/ Ш' \ -н г= 4 vv \ Г Ч »

яаыор fpsse^sit

«1 М

8 «

'.mo.Q -Ъ.о -Ъ о

1» s

Рис. 1. Очистка нуклсаз на колонке с голубой сефарозой. 1-поглощс/шс прк 280 ни (A2SC,), 2-нуклеазкас активность, (ел/мл), 3-фосфатазная активность (сд/мл), 4 - концентрация KCl, (М).

Рис. 2. Очистка нуклеазы 1 на колонке с ДЭАЭ-деллюлозой. 1 -поглощение при 280 нм (А280), 2-нуклеазная активность, (ед/мл), 3 - концентрация KCl, (М).

кДа----'я

- 95

С--? ,,

- 66

- 45 \ •. >

к- •

- 29 ¿^

'А Б

Рис. 3. Анализ нуклеазы 1 методом электрофореза в денатурирующих условиях. А - белки-маркеры, Б - препарат нуклеазы 1.

Таблица 2. Свойства нуклеаз, выделенных из гриба Бркапа ую!асеа.

Оптимум ("С, мМ) Нуклеаза 1 Нуклеаза 2

Т ^орг АС> 9.0 70 20 8.5 65 3 - 5

2. Получение 2'-дезоксирибонуклеозид-5'-монофос4>атов путем гидролиза ДНК термофильными нуклеазами из гриба Бр'к^па \'1о!асеа.

Ферментативный гидролиз ДНК является одним из широко известных способов получения дезоксирибонуклеотидов, где в качестве гидролизующих агентов предлагается использовать различные нуклеазы. В частности, до последнего времени для промышленного получения использовали фосфодиэстеразу из змеиного яда. Этот способ имеет ряд существенных недостатков: длительность и многостадийнссть процесса, высокая стоимость змеиного яда и другие.

В связи с этим нами в качестве альтернативы было предложено

использовать для получения дсзокс:грибонуклсот:!дсг. т.":. нуклеазы г риса Ьрасапа \ло1е,сеа. Не. незло,. отпали'. гю.а\ . л л застр^лат

оермсптос ;i3 дигислиг грноа и затем его'кепцег.триронзля с помоптыо у;.ьтj"a'.¡uíлoTOtiUii;í. ди!С из .молол логоса перод.'гзеззл;; др;: тс*.:пеп.тгуре

00-65"С и pí! 5.2-5.5. используя полученный концентрат, npii это,vi полнота ;ллролааа ДНК соегавснпа 95% (за 5-7 ч;,еоа/.

Препаративное выделение нуклеотидов из елдралнеата осуществляли с помощью хроматографии на колонке с а^лоалейлелле,, смолен ЛВ-'7.

1-1гаСЮщь0Ся в п«др0Л1.затс нуалеозлда: г:ре;.л.зрительно эд1сир0|.али / М юствопом мочевины, а для разделения нуклеотидов использовали гп!1.миент KOHwCHipuM.;;.; ^г.зтгзра Л|!-! !-ч.Ч)- , ;>п o.ö ни С „о 1MÍ, г сто:' случае олюция нуклеотидов осуществлялась в оюдующе." i.oc.-.едэ-вательности: дЦМФ-ТМФ-дАМФ-дГМФ. Выход нуклеотидов составлял 60% от общего количества материала, нанесенного на колонку.

Проведенные нами исследования показали, что выделенные таким методом нухлеотиды не отличаются от препаратов, полученных путем гидролиза ДНК фосфодиэстеразой из яда гюрзы. Содержание УФ-поглощающих примесей, связанных в , основном с дезаминированнем ;:у::лег>т!1доя - не более 1-2%, содержг.ттттг основного вен>сства составляло

Í ..■ V О С О '■ - .

лез.-о.млглл! излеохсиноса ,\,сллло сдслаега сакл.очение, avo

С; i. i С; -Ю:: л с ovo ¡ !л;С,етл га алрол \ lavaoiaicro агента a ¡ 7.) ~ j л a раз, ооааааеаао

необходимости ¿. бг.ктсриоста лччесслх а гейте г.. л ре с re va

получения концентрата нуклеаз. Все это в конечном счете ведет к

Изучение физико-химических свойств ДНК-полимеразы Taq.

Все операции по выделению фермента проводились при температуре ГС. Т?::с:.:г.ссу гяетог. б?ктерии Thermus aquaticus суспсндцрозалн в

Т)еиилметилсульфонилфтор»;да, дезлнтсе^-ре,..ала улотразьулл:: ;22 лГл/ затем тголучеппай ллзат цситрпфуспрсзал,: аррплцля 1). Очттсгг:у от а. лс..л лщ ладе а а; с а с/. о с т : а ел ас.л. i Pea / /0 ,. е..;. ал~ л е. е а > а... л д д.. (фракция 2). После центрифугирования осадок, содержащий нуклеиновые шелоты, отбрасывали, а к супернатаяту добавляли сульфат аммония до 55 % концентрации, после чего суспензию центрифугировали. Полученный осадок растворяли в 25 мМ трис-HCI буфере, pH 7.5, ;одержащем 0.1 М KCl, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ ß-меркаптоэтанола, 5% гли-

церина и диализовали против этого же буфера (фракция 3).

Для дальнейшей очистки фермента применяли хроматографию нг колонках. Фракцию 3 наносили на колонку (2.5*8 см) с ДНК-агарозой Колонку промывали буфером и фермент элюировали линейны!^ градиентом концентрации КС1 (от 0.1 до 1 М) (рис. 4). Фракции обладающие ДНК-полимеразной активностью, объединяли и диализовал! (фракция 4). ДНК-агароза обладала высоким сродством к ДНК-полимеразе и низкой неспецифической сорбцией, поэтому хроматографш на колонке с ДНК-агарозой обеспечивала очистку от основной массь балластного белка, значительно концентрировала фермент и давал; возможность для последующей очистки использовать небольшие объем! сорбентов.

Таблица 3. Очистка ДНК-полимеразы из бактерии ТЬсггаиз ациа^сиз.

Суммарная Удельная Выход,

№ Стадия очистки активность, ед. активность, ед/мг белка /о

1 Грубый экстракт 10800 6.9 100

2 Супернатант после осаждедения поли-

этиленимином 11450 19.2 106

3 Осаждение суль-

фатом аммония 8420 8 78

4 Хроматография на

ДНК-агарозе 7020 1000 65

5 Хроматография на

ДЭАЭ-целлюлозе 4430 2200 41

6 Хроматография на

голубой сефарозе 3240 6750 30

Фракцию 4 наносили на колонку (1.5*12 см) с ДЭАЭ-целлюлозо: промывали буфером и затем фермент элюировали линейным градиенте концентрации КС1 (от 30 мМ до 0.4 М) (рис. 5). Фракции, имеюнц ДНК-полимеразную активность, объединяли (фракция 5) и наносили I колонку с голубой сефарозой (1.2*9 см). Колонку промывали буфером фермент элюировали линейным градиентом концентрации КС1 (от 50 м до 0.6 М) (рис. 6). Фракции, обладающие ДНК-полимеразн< активностью, диализовали против 20 мМ трис-НС1 буфера, содержаще 50% глицерина (фракция 6). Очистка на ДЭАЭ-целлюлозе и голуб|

ксш

(Л

аз

-».2

......... ^Т/ТГЛГ^Г'.ТГ.- ^ГГГт г"-Г"ГП >.0 -*»>.0

оУ 40 СО С 5

Рис. 4. Очистка ДНК-полимеразы Тая на колонке с ДНК-агарозой.

А--,

Рис. 5. Очистка ДНК-полимеразы Тая на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой

'О ¿О

Рис. 6. Очистка ДНК-полимеразы Тая иа колонке с голубой сефарозок.

1 - ДНК-полимеразная активность, (имп/м1ш*1(Г'1),

2 - поглощение при 280 нм, (^280^ >

3 - концентрация КС1, (М).

.4

- ? , кДа

- 95

. 66

б-^й'' - Из

шш

к

%

45

- 36

' 29

г 'г

>

- 20.1 - 14.2

в:

Рис. 7. Анализ ДНК-полимеразы Taq методом электрофореза в денатурирующих условиях. А - препарат ДНК-полимеразы Тад, Б - белки-маркеры, В - белки-маркеры.

сефарозе обеспечивала отделение фермента от белков, имеющих сродство к ДНК-агарозе, в частности, от термостабильных эндонуклеаз. Нуклеазные примеси элюировались при более высокой ионной силе, чем ДНК-полимераза. Результаты по очистке ДНК-полимеразы Тад представлены в табл. 3 и на рис.7. Полученные препараты фермента имели удельную активность 5000-14000 ед/мг белка . Они могут быть использованы в циклической полимеразной реакции и ряде других методов молекулярной биологии и генетики.

Разработанный нами способ выделения дает возможность масштабировать процесс с незначительными качественными и количественными изменениями его показателей. Кроме того, нами было показано, что, используя аналогичную схему очистки, можно выделить и другие термостабильные ДНК-полимеразы. Так, нами до' гомогенного состояния была очищена ДНК-полимераза 1 из бактерии Вас. 51еагоШегторЫ1и8 по схеме: фракционирование полиэтиленимином, хроматография на ДНК-агарозе и последующая очистка на фосфоцеллюлозе.

Температурный оптимум активности ДНК-полимеразы Taq составлял 75°С, оптимальная величина рН - 9.0. Активность фермента повышалась при введении ионов К+ и Mg2+ , причем оптимальные концентрации этих ионов составили - 50 мМ и 5 мМ, соответственно ( в качестве субстрата использовали активированную ДНК). Молекулярная масса ДНК-полимеразы Taq была определена с помощью электрофореза и составила 85 кДа.

Эффективность взаимодействия ол игону кл сот идов-п размеров различно/! длины с ДНК-полимсразои Taq была исследована на матрице poly(dT) с праймерами oligo(dA)n (п=2-14) (эта часть работы была выполнена совместно с д.х.н. Лаврик О.И., ИБХ, Новосибирск). Были подобраны оптимальные условия реакции полимеризации и рассчитаны величины Км и Умакс для набора праймеров d(pA)n ( п=2,4,6,8,10,12,14 ). Полученные данные представлены в таблице 4. Как видно из этой таблицы, увеличение длины праймера приводит к уменьшению величины Км. Зависимость -lgKM и IgVMaKC от числа звеньев в праймере имеет линейный характер с точкой перегиба при п=10. При увеличении длины праймера на одно нуклеотидное звено происходит возрастание его сродства в среднем в 3.3 раза. Это соответствует изменению свободной энергии • Гиббсд бС, равному -0.79 ккал/моль. Это изменение больше, чем в случае описанных рапсе ДНК-полимераз, в частности, ДНК-полимсраз термофильных архебактерий. Характер взаимодействия праймера и матрицы, по-видимому, меняется вне молекулы фермента, что и отражается в изменении зависимости логарифмов Км и Умакс от числа звеньев в праймере. На основании этих данных можно предположить, что только 10 нуклео-тидных звеньев праймера находится в пределах активного центра молекулы фермента.

Таблица 4. Величины Км и относительных максимальных скоростей V превращения затравок для ДНК-полимеразы Taq.

Олигонуклеотид Км, mkM V, %

d(pA)2 160 5.4

d (рА) 4 16 12.3

d(pA>6 1.8 17.8

d(pA)8 0.145 68.7

d(pA)10 0.011S 100

d(pA)12 0.0057 31.5

d(pA)14 0.0034 24.1

выводы

1. Изучены термофильные нуклеазы из миделия гриба Spicaria violacea штамм ВКПМ F-273.

Выделены две термостабнльные нуклеазы из экстракта мицелия. Определены некоторые физнко - химические свойства и субстратная специфичность нуклеаз. Нуклеаза 1 очищена до гомогенного состояния и показано, что ее молекулярная масса составляет 75 кДа.

Установлено, что экстракт мицелия гриба Spicaria violacea, кроме нуклеаз, содержит ряд других термофильных ферментов. При хроматографии на голубой сефарозе получены две фракции, обладающие фосфатазной и неспецифической фосфодиэстеразной активностью.

2. Предложен промышленный способ получения 2'-дезоксирибо-нуклеозид-5'-монофосфатов с помощью гидролиза ДНК термофильными нуклеазами из гриба Spicaria violacea.

3. Разработана новая эффективная методика выделения ДНК-полимеразы Taq из бактерии Thermus aquaticus штамм YT1. Способ получения фермента характеризуется простотой, хорошей воспроизводимостью и стабильным выходом. При очистке используются сравнительно небольшие количества сорбентов. Полученный препарат фермента имеет высокую удельную активность, не содержит примеси термостабильных эндонуклеаз и может быть использован в циклической полимеразной реакции. Молекулярная масса фермента составляет 85 кДа. Данная методика используется для промышленного получения ДНК-полимеразы Taq на Омутнинском химическом заводе.

4. Показано, что на основе методических приемов, которые были разработаны для получения ДНК-полимеразы Taq, могут быть выделены другие термостабильные ДНК-полимеразы. В частности, был получен гомогенный препарат ДНК-полимеразы 1 из бактерии Bacillus stearothermophilus.

5. Исследованы свойства ДНК-полимеразы Taq при использовании в качестве субстрата poly (dT) "oligo (dA) n и активированной ДНК. Подобраны оптимальные условия реакции полимеризации, катализируемой ДНК-полимеразой Taq, для poly(dT) матрицы. Найдены величины Км и Умакс для праймеров oligo(dA)n (п=2-14). Показано, что величины -lgKM и lgVMaKC линейно возрастают с увеличением длины праймера до п=10. При увеличении длины праймера на одно нуклеотидное звено (в интервале п=2-10) происходило возрастание его сродства в 3.3 раза. Линейное возрастание -lgKM говорит в пользу существенного вклада в сродство единственного универсального контакта для праймеров различной длины, скорее всего З'-концевого нуклеотида.

Сделано предположение о том, что оптимальный размер праймера равен 10 нуклеотплякм ззспъям.

По материалам опубликованы работы:

1. " За:т"" А. И., Исаев A.C. Быстрый и - экономичный способ. выделения

Тп^-ДЫС-полимерагы из г;гстрсмаяько-тсрмсф11."ьяой бактерии Thcrmus aqualicus // Пракл. биохимия и михробко.-.. 1994. т.30. вул.4-5. с.561-565.

2. Згыка А. И., < !сасн А. С., Ллнрик О. Vi. Зфф^кти is; ¡ость . дсйствия олишнуклеотидов-праймераи различной длины с ДНК-по-лпу.ерагой л;. Thomms aqaaücus // Приел. блохам:;:; л мпклаблол.

I АЛ Г •"> 1 г* О <"ч t <*•, Г<

iVVO. t.öi. raz. c./OI-auJ.

3. Заика А. И. Быстрый и эффективный способ выделения ДНК - лоли-...ерааа: термофильной бактерии Bacillus stearothermophilus // АО "20СТ0К". - 0"*утнинск1 Киоовско;; обл., 199-1.- 3 е., пл., бтт&тето.

II назван,- Рус,- Деп. в ВИНИТИ 04. 02. 94. № 327-004.

4. Заика А. И., Тяглов Б. В. Выделение нуклеаз из гриба Spicaria violacea. // Биотехнология. 1995. т.И. н.12.

Автор приносит глубокую благодарность д.х.н. Лаврик О.И. и к.б.н. Исаеву A.C. за ценные советы и помощь в работе.