Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и экспрессия в клетках E. coli гена ДНК-полимеразы термофильной бактерии Thermus aquaticus

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и экспрессия в клетках E. coli гена ДНК-полимеразы термофильной бактерии Thermus aquaticus"

рга овсероссийский научный центр .....молекулярной диагностики и лечения

На правах рукописи

УДК 575.114.4

ВАЛЯЕВ Александр Григорьевич

КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ В КЛЕТКАХ Е.соН ГЕНА ДНК—ПОЛИМЕРАЗЫ ТЕРМОФИЛЬНОЙ

БАКТЕРИИ ТЬсгтив ачиаНсиБ

03.00.04 — Биохимия

Авторефер ат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва —1993

Работа выполнена в отделе молекулярной биологии Всероссийского научного центра молекулярной диагностики и лечения.

Научный руководитель—кандидат биологических наук Л. И. Патрушев.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук С. В. Машко;

кандидат биологических наук А. И, Глухов.

Ведущее учреждение — Институт молекулярной генетики РАН.

Защита диссертации состоится 1993 г.

часов на заседании Специализированного Ученого Совета Д 074.51.01 при Всероссийском научном центре молекулярной диагностики и лечения по адресу: 113149, Москва, Симферопольский бульвар, д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНЦМДЛ.

Автореферат разослан </\Ъ ^ 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета

кандидат биологических наУк^ Отраднова

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

Термостабильная ДНК-полимераза, выделенная из штамма Thermus aquaticus (Taq-полимераза), в настоящее время широко используется для специфической амплификации выбранных участков ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Способность Taq-полимеразы длительное время сохранять активность В режиме 75-95*С и синтезировать ДНК при этих температурах дает возможность автоматизировать ПЦР. Использование высокоспецифических праймеров и оптимальных условий ПЦР позволяет получить целевой продукт с минимальными неспецифическими заменами нуклеотидов. Кроме того, высокая термостабильность Taq-полимеразы дает возможность успешно использовать ее при секвенировании участков ДНК по методу Сэнгера, т.к. во время секвенирования при повышенных температурах происходит .разрушение вторичной структуры участков ДНК, не прочитываемых ДНК-полимеразами в обычных условиях. Повсеместное применение метода ПИР в молекулярной биологии и генетике, а также для ДНК-диагностики инфекционных и наследственных заболеваний и идентификации личности с помощью генетических отпечатков пальцев, требует использования высококачественного фермента - Taq-полимерэзы - ключевого фермента ПЦР. В то же время получение высокоочищенных препаратов Taq-полимерээы из природных штаммов Т.aquaticus связано с трудностями при выращивании этих термофильных бактерий и низким содержанием в них фермента ( < 0,03% клеточного белка), а также с большими потерями фермента в процессе его очистки.

Получение .эффективной экспрессии рекомбинантного гена Taq-полимеразы в клетках Е.col i несомненно облегчило бы очистку этого фермента и снизило бы себестоимость его препаратов.

В этой связи представляет практический интерес создание на основе E.coli штамма-продуцента Taq-полимеразы с целью крупномасштабной биотехнологической наработки этого широко используемого фермента для удовлетворения потребностей лабораторий и диагностических центров нашей страны в

- 4 -

высококачественных препаратах Taq-полимеразы,

ЦЕЛЬ РАБОТЫ. В работе были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Клонировать ген термостабильной ДНК-полимераэы Thermus aquaticus.

2. Сконструировать плазмиду, обеспечивающую накопление Taq-полимеразы в клетках E.coli.

3. Разработать метод очистки рекомбинантной Taq-поли-меразы, экспрессирующейся в клетках E.coli.

4. Изучить основные свойства рекомбинантной Taq-поли-меразы.

5. Изучить возможность использования рекомбинантной Taq-полимеразы для ПИР и ДНК-диагностики.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ

Клонирован ген Taq-пoлимepaзы ТЬегшиэ aquat^cus УТ-1. На основе Е.соП С 600 создан термоиндуцибельный штамм-продуцент Taq-пoлимepaзы.

В ходе выполнения диссертационной работы был разработан эффективный универсальный метод оптимизации экспрессии рекомбинантных генов в гетерологичном генетическом окружении.

Предложенные методы индукции и очистки рекомбинантной Taq-пoлимepaзы позволяют получать высокоочищенные препараты фермента, пригодные для использования в ПЧР и секвенирова-нии по методу Сэнгера, с удельной активностью около 200000 ед/мг.

Препараты рекомбинантной Таа-полимеразы в настоящее время широко используются для Ш1Р, секвенирования ДНК и ДНК-диагностики в таких институтах, как Институт общей генетики РАН, Институт молекулярной генетики, ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Научном центре молекулярной диагностики и лечения (ВНШИДЛ), а также в ряде других институтов и за рубежом.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация изложена на

страницах машинописного текста, включая рисунков и таблиц. Работа состоит иэ введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей условия проведения экспериментов, полученных результатов и их обсуждения, а также выводов и списка используемой литературы ( источников),

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были доложены на Втором Всесоюзном Симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" (Самарканд, 1991 г.) и на У конференции Российской Федерации "Новые направления биотехнологии" (Пущино-на-Оке, 1992 г.).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ШТАММЫ И ПЛАЗМИДЫ. Штаммы E.coli С 600 и 0T-I4 получены из музея ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов (г.Москва).

Фазмида pSL5 получена в лаборатории Н.К.Янковского. Векторная плазмида pUCI9 получена из НПО "Фермент" (г.Вильнюс), экспрессионный вектор pPR-TGATG-I предоставлен С.В.Машко (ВНИИгенетика).

ФЕРМЕНТЫ НУКЛЕИНОВОГО ОБМЕНА. Рестриктазы Kpnl, Hindi 11, Xhol, Pstl, SalGI, SacI, BamHI, а также Taq-поли-мераза, полинуклеотидкиназа, фрагмент Кленова ДНК-полимера-зы I E.coli, ДНК-лигаза Т4 и другие получены из НПО "Фер-иент'Чг.Вильнюс) и использованы в соответствии с рекомендациями изготовителя.

ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ, БАКТЕРИАЛЬНОЙ И ФАГОВОЙ ДНК. Выделение плазмидной ДНК осуществляли стандартным щелочным методом. Векторные плазмиды дополнительно очищали центрифугированием в градиенте плотности CsCl в присутствии бромистого этидия. ДНК штамма Thermus aquaticus YTI очищали с использованием протеиназы К и фенольной депротеинизации.

КОНСТРУИРОВАНИЕ БИБЛИОТЕКИ ГЕНОМНОЙ ДНК Т.aquati cus. Библиотеку геномной ДНК конструировали по методу, предло-

женному Янковским и др. (1989). Хромосомную ДНК штамма Thermus aquaticus, обработанную рестриктазой SalGI, лигиро-вали с ДНК фазмиды pSL5, обработанной этой же рестриктазой с последующим дефосфорилированием.

ВЫРАЩИВАНИЕ БАКТЕРИОФАГОВ осуществляли по методу Maniatis Т.(1982) с модификациями, предложенными Г.М.Долга-новым.

ТРАНСФОРМАЦИЮ БАКТЕРИЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК осуществляли по стандартному методу, предложенному Hanahan D.(I988).

СКРИНИНГ БИБЛИОТЕКИ ГЕНОМНОЙ ДНК Т.aquaticus осуществляли при помощи гибридизации {Maniatis, 1982)с зондами мечеными [/"jdntp.

ПОЛИМЕРАЗНУЮ ЦЕПНУЮ РЕАКЦИЮ проводили по методикам Saiki R.K. (1988). Амплифицированный фрагмент обрабатывали рестриктазами SacI и Kpnl, очищали переосаждением этанолом и лигировали с вектором pPR-TGATG-I, обработанным этими же рестриктазами и дефосфорилированным.

ИНДУКЦИЯ СИНТЕЗА РЕКОМБИНАНТНОЙ Taq-ПОЛИМЕРАЗЫ. Клетки E.coU pVG-AI выращивали при 28° С до оптической плотности 0,5 - 0,7 при 600 нм. Температуру в колбах повышали до 4^С и продолжали инкубацию при этой температуре еще 3-5 часов, после этого клетки собирали центрифугированием и замораживали .

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ Taq-ПОЛИМЕРАЗЫ в клеточных ли-затах и очищенных препаратах проводили по методике, предложенной Frances С.Lawyer (1989).

ОЧИСТКА РЕКОМБИНАНТНОЙ Taq-ПОЛИМЕРАЗЫ. За основу метода очистки Taq-полимеразы взяты методики, предложенные EngeIke et.al. (1990).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТИ РЕКОМБИНАНТНОЙ Taq-ПОЛИМЕРАЗЫ проводили в 600 мкл реакционной смеси для определения активности фермента, содержащей 45 единиц Taq-полимера-

о

зы, прогревая смесь в течение 2 часов при 95 С, отбирая через определенные промежутки времени пробы по 20 мкл, определяя в них оставшуюся активность фермента.

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ДНК проводили в агарозных гелях с использованием Трис-ацетатного буфера по методам Maniatis Т., et. al. (1982).

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ осуществляли в полиакрнламидном геле по U.Laemmli (1970).

СИНТЕЗ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ проводили на автоматическом синтезаторе (Applied Biosystems) с применением фосфорами-дитного метода с использованием N-изопроксиацетилированных мономеров (за исключением Т). После короткой стадии деблокирования (концентрированный аммиак, 20°С, 45 минут) продукты были очищены препаративным гель-электрофорезом в денатурирующих условиях и обессолены на колонке Силасорб CI8.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНА Taq-ПОЛИМЕРАЗЫ

В соответствии с опубликованными данными, ген Taq-no-лимеразы не содержит рестрикционного сайта Sal GI, по этой причине данная крупнощепящая рестриктаза была использована для гидролиза геномной ДНК Thermus aquaticus при конструировании библиотеки генов в фазмиде pSL5. Были синтезированы три олигонуклеотидных зонда TPZ-I, TPZ-2, TPZ-3, комплементарные консервативным участкам гена (рис.1). Мы полагали, что использование этих зондов позволит избежать затруднений, связанных с их гибридизацией с геномной ДНК Т.aquaticus, которые могли бы возникнуть вследствие возможных штаммо-специфических различий в первичных структурах известного из литературы и клонируемого генов.

Для более эффективного включения метки в зонд TPZ-I, синтезировали комплементарный ему ХЗ-членный олигонуклео-

- в -

тидный праймер со следующей нуклеотидной последовательностью: 5*-ACGGGGATGTTCT-3'. В результате отжига зонда с праймером образовывались выступающие 5-концы. Радиоактивную метку (все четыре [«t- 32р] <щтр вводили достройкой цепей с помощью фрагмента Кленова, ДНК-полимеразы1 E.coli. Меченый зонд TPZ-1, предварительно денатурированный, гибридизовали с ДНК репликами фаговых бляшек, снятымина нитроцеллюлозные фильтры Нуbond N с чашек, имеющих около 10*бляшек на чашху. В результате скрининга были получены четкие гибридизацион-ные сигналы с зондом TPZ-I с частотой около 0,2-0,3 %. Дополнительный анализ ДНК, выделенной из фаговых частиц бляшек, уже давших положительный ответ при гибридизации с помощью зондов TPZ-2 и TPZ-3 как методом дот-гибридизации, так,и гибридизацией по Саузерну после обработки рестрикта-зами Bgl И, Kpnl, Hind III, Pst I, Bam HI показал, что все полученные клоны содержали один и тот же ген Taq-полимера-зы, первичная структура которого по построенной рестрикци-онной карте не отличалась от опубликованной (рис.1). Для конструирования бактериального штамма продуцента Taq-поли-мераэы была использована одна из рекомбинантных фазмид, содержащих ген Taq-полимеразы.

Рис.1. "Рестрикционная карта клонированного гена

ДНК-полимеразы Т.адиаисиэ 'ТРг-1, ТРг-2, ТРг-3 -олигонуклеотидные зонды, использованные для клонирования гена и построения его рестрикционной карты

5-е

. ' ГР2-Э

2. КОНСТРУИРОВАНИЕ ПЛАЗМИДЫ, СОДЕРЖАЩЕЙ КОРОТКИЙ ФРАГМЕНТ ДНК С ГЕНОМ Taq-ПОЛИМЕРАЗЫ

В лизатах рекомбинантных фаговых частиц, содержащих клонированный ген, нам не удалось обнаружить активность Taq-полимерэзы, что соответствовало данным литературы. Этот результат мог указывать на то, что собственные регуляторные элементы гена Taq-полимеразы неэффективно используются бе-лок-синтезирующей системой E.coli, и, возможно, неактивны в этой системе вообще. С одной стороны, это могло быть следствием нарушения распознавания белковыми факторами E.coli соответствующих нуклеотидных последовательностей гена Taq-полимеразы, а с другой стороны - следствием затруднения взаимодействия факторов с регуляторными последовательностями при 3? С, а также физической недоступности последних в случае включения гена в состав протяженного, приблизительно 20 тысяч пар нуклеотидов (т.п.м.), клонированного фрагмента ДНК.

Для проверки этих предположений мы субклонировали Bglll фрагмент ДНК длиной около 8,5 т.п.н., который содержал полноразмерный ген Taq-полимеразы, в плазмиде pUCI9 в двух возможных ориентациях по BamHI сайту ее полилинкера. Полученная плазмида была обозначена рРА-I (рис.2). При этом субклонированный фрагмент помимо гена Taq-полимеразы длиной около 2,5 т.н.п. содержал, фланкирующие его последовательности геномной ДНК, причем один из Bgl II сайтов был расположен на расстоянии НО п.н. от инициаторного ATG- кодона структурной части гена. В этой фланкирующей последовательности отсутствовал промотор гена Taq-полимеразы и имелся природный сайт Шайна-Дальгарно за 4 п.н. перед ATG-кодоном. Оказалось, что рекомбинантные плазмиды рРА-I (рис.2), содержащие вышеупомянутый Bgl II фрагмент ДНК, даже в прямой ориентации по отношению к 1ас-промотору pUCI9 в условиях дерепрессии 1ас-промотора под действием изопропил-1-тио--D-галактопиранозида (IPTG) не обеспечивают стабильной эффективной экспрессии гена Taq-полимеразы, которую оценивали по уровню ферментативной активности в содержащих рекомби-Нантную плазмиду клетках E.coli С600.

лЛ/^Ч

/ \ йатН1

1 >«0« } лига>А • ,

Bgl.lL ' ЬэЧ 6-1.61 1 ' I-р5Ь в

КрпХ В«"нУв,1Х

«в»'

\SosI.KphI сх».№ им-Т0АТО-1) Лига»!

К»п1

Рис.2. Схема конструирования плаэмид рРА-1; рТО-ТА; рТА-23.

Л1^и СиБ857-промотор и ген термочувствительного реп-рессора; са^ген хлорамфениколацетилтрансфераэы;

БГНпоследовательность Шайно-Дельгарно; Ар*-ген устойчивости к ампициллину; и-терминатор транскрипции

Полученные данные можно объяснить низкой эффективностью использования регуляторных элементов Taq-полимеразы аппаратом белкового синтеза E.coli. Поэтому было решено поместить ген Taq-полимеразы под контроль гомологичных регу-ляторных элементов в другой экспрессионный вектор.

3. КОНСТРУИРОВАНИЕ ПЛАЗМИДЫ рТА-23, ЭФФЕКТИВНО ЭКС-ПРЕССИРУЮЩЕЙ ГЕН Taq-ПОЛИМЕРАЗЫ В КЛЕТКАХ E.coli

Для конструирования плазмиды, эффективно экспрессирую-щей ген Taq-полимеразы в клетках E.coli, мы использовали экспрессионный вектор pPR-TGATG-I, полученный в лаборатории С.В.Машко. В этом векторе структурная часть экспрессируемо-го гена соединяется через уникальный сайт рестрикции Sacl с кодоном инициации трансляции АТС (рис.2). В результате образуется гибридный оперон, транскрибируемый с Л-Рц-промото-ра, в котором клонируемый ген является дистальным цистроном этого оперона по терминологии авторов - "оверлаппона". Эффективно экспрессируемый гибридный цистрон ero'-cat'-trpE расположен проксимально промотору Р».. 3 -конец этого цист-рона является областью реинициации трансляции и содержит последовательность Шайна-Дальгарно гена trpE E.coli, а также кодоны терминации и инициации трансляции, которые перекрываются друг с другом (TGATG). В этой последовательности з' -концевой остаток G является первым нуклеотидом уникального сайта рестрикции Sacl (GAGClfc). Во время синтеза белка, направляемого этим вектором, образуется короткий гибридный пептид Cro-Cat-TrpE длиной около 120 аминокислот, и после терминации его трансляции происходит немедленная реинициа-ция синтеза белка клонированного гена. Поскольку активность промотора F^D векторе pPR-TGATG-I контролируется темпера-турно-чувствительныи репрессором í.CIts857, находящимся в этом же векторе, индукция экспрессии клонированного гена происходит при повышении температуры до 42 С. Дальнейшие этапы конструирования плазмиды, экспрессирующей ген Taq-no-лимеразы в клетках E.coli, схематически представлены на рис.2.

На первом этапе с помощью ПИР мы амплифицировали фраг-

мент ДНК гена Taq-полимеразы длиной в 674 п.н., кодирующий Н-концевую часть фрагмента, который содержал инициаторный кодон ATG. В качестве матрицы в этом случае использовали вышеописанную плазмиду pPAI. 5' -концевой праймер-1 CACGAGCTCGGGGATGCTCCCCCTCTTTGACGCCAAG-з' ) содержал искусственный сайт рестрикции SacI (подчеркнут), позволяющий клонировать амплифицированный фрагмент ДНК по тому же сайту рестрикции экспрессионного вектора pPR-TGATG-I. При введении искусственного SacI сайта, для сохранения открытой рамки считывания, возникла необходимость произвести замену -AGC- на -AGG в кодоне второй после инициирующего кодона аминокислоты, а также ввести дополнительный третий кодон (-TGG-).

5 В качестве встречного 3-концевого праймера-2 использовали" 25-членный олигонуклеотид: 5'-CAGCCGGTCGACGTTCTTGAGGA GG-3 . По окончании амплификации, очищенный с помощью электрофореза в агарозном геле продукт амплификации длиной около öoo н.п. (рис.3) расщепляли рестриктазами SacI и Kpnl, а. затем клонировали в дефосфорилированный вектор pPR-TGATG-I, предварительно линеаризированный теми же рест-риктазами. i 2. s

Рис.3. Амплификация 5-концевого фрагмента гена Taq-полимеразы на матрице рРА-1

1. Амплификат после обработки рестриктазами Sac I и Kpn I

2. Полноразмерный амплификат

3. Маркер молекулярных весов. ДНК фага А , обработанная рестриктазами HinD III и EcoR 1

Правильность структуры полученных плазмид pNO-TA проверяли обработкой рестриктазами SacI, Kpnl; а также SacI и Kpnl одновременно. Отобранные таким образом плаз-миды содержали 5 -конец гена Taq-полимеразы в одной рамке считывания с ATG-кодоном экспрессионного вектора полностью под контролем регуляторных элементов E.coli и ко-лифага Я.

На втором этапе конструирования в вектор pNO-TA вводили Крп1-фрагмент ДНК плазмиды pPAI, который содержал недостающую З'-концевую часть природного гена Taq-полимеразы (рис.2). Для этого вектор pNO-TA расщепляли рестрикта-зой Kpnl, дефосфорилировали и лигировали с выделенным Крп1-фрагментом плазмиды pPAI. Продуктами лигирования трансформировали клетки E.coli С600 и отбирали трансформанты, плазмиды которых содержали клонируемый фрагмент ДНК в нужной ориентации. Полученная таким образом плазми-да рТА-23 содержала ген Taq-полимеразы, отличающийся от природного наличием на 5 -конце нового сайта рестрикции SacI, а также дополнительного кодона, что приводило к незначительному изменению последовательности аминокислот в N-концевой части полипептидной цепи Taq-полимеразы.

4. ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА Taq-ПОЛИМЕРАЗЫ В СОСТАВЕ ПЛАЗМИДЫ рТА-23 В КЛЕТКАХ E.coli.

Клетки E.coli СбО'О трансформировали плазмидой рТА-23 и выращивали на богатой среде в присутствии ампициллина. Полученный в итоге бактериальный штамм E.coli PVG-AI по морфологическим признакам и особенностям культивирования не отличался от E.coli С600 за исключением способности к росту в присутствии 100 мкг/мл ампициллина. Для изучения экспрессии гена Taq-полимеразы в клетках полученного штагаа E.coli,клетки выращивали до ранней лог-фазы на богатой среде при 28°С, культуру разделяли на две части, одну из которых продолжали инкубировать при той же температуре, а другую прогревали до 42? С и инкубировали в течение нескольких

о

часов при этой температуре. Инкубация клеток при 42 С тео-

ретически должна сопровождаться инактивацией температу-рочувствительного репрессора АСИз857 и дерепрессией генов, находящихся под контролем Р*-промотора плазмиды рТА-23. По окончании инкубации бактериальные клетки собирали центрифугированием, лизировали и в лизатах определяли активность Тац-полимеразы (рис.4).

►»Лц^МЛТР. 100-

Рис.4. Экспрессия рекомбинантной Taq-полимеразы во время выращивания клеток E.coli PVG-AI при разных температурах. В качестве контроля использовали экстракты клеток E.coli С600, несущих исходную плаз-миду pPR-TGATG-I, в которых активность Taq-полимеразы не была обнаружена

При этом оказалось, что даже в клетках, инкубируемых при 28* С (пермиссивная температура) присутствует значительное количество ДНК-полимеразной активности, устойчивой к длительному прогреванию при 75°С, что является характерным свойством термостабильной Taq-полимеразы. В тон случае, если клетки инкубировали при непермиссивной температуре, происходило приблизительно 100-кратное возрастание внутриклеточной активности термостабильной ДНК-полимеразы. При этом уже неочищенный, прогретый при 75°С экстракт клеток PVG-AI «э индуцированной культуры обладал способностью направлять ПНР при использовании плазмидной ДНК в качестве матрицы (данныз не пргдставлены). Сопоставление белковых экстрактов клеток E.coli после термоиндукшш с помощью электрофореза в колпакриламидном геле не обнаружило появле-

50.

28° Темпь»Ату»* ин*у»лцми

ния сверхэкспрессирующегося полипептида Taq-полимеразы, что отчасти объясняется его возможной маскировкой белками теплового шока. В то же время, расчеты, проведенные на основании удельной активности Taq-полимеразы в очищенных препаратах, показали, что рекомбинантная Taq-полимераза составляет в бактериальных клетках E.coli PVG-AI после индукции до 1-2 % от суммарного белка.

На основании полученных данных мы сделали вывод, что в клетках E.coli PVG-AI при непермиссивной температуре происходит достаточно эффективная экспрессия гена Taq-полимера-зы, находящегося в составе рекоыбинантнсЙ плаэмиды рТА-23. Для окончательного подтверждения этого вывода мы выделил» рекомбинантный белок в чистом виде и изучили некоторые его свойства.

5. ОЧИСТКА И СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНОЙ Taq-ПОЛШЕРАЗЫ, ЭКСПРЕССИРУШЕЙСЯ В КЛЕТКАХ E.coli PVG-AI

При'разработке метода очистки полученной нами рекомби-нантной Taq-полимеразы мы взяли -за основу методику, предложенную Д.Р.Энгельке с соавт. (1990). После индукции синтеза Taq-полимеразы бактериальные клетки собирали центрифугированием, лизировали лизоцимом в присутствии неионных детергентов с последующим прогреванием в течение I часа при 75° С. В этих условиях происходила инактивация большинства термолабильных белков бактерии-хозяина, которые вместе с большей частью хромосомной ДНК выпадали в осадок. Эти белки и нуклеиновые кислоты удаляли низкоскоростным центрифугированием, а супернатант, содержащий Taq-полимеразу, фракционировали полимином Р, На этой стадии очистки происходит освобождение от большинства нуклеиновых кислот, содержащихся в экстракте, а также ряда белков E.coli. Злюент с полимина Р наносили.на колонку с ДЭАЭ-сефацелем и Taq-полимеразу элюировали линейным градиентом KCl. При этом Taq-полимераза элюировалась достаточно узким пиком приблизительно при 0,2 М KCl(рис.5А).

Рис.5. Хроматографическая очистка рекомбинантной Taq-полимеразы.

А - Хроматография на ДЭАЗ-сефацеле Б - Хроматография нв катионообменнике Bio-Rex 70

Фракции, содержащие активность Taq-полимеразы, объединяли, наносили на колонку с катионообменником Bio-Rex 70 и проводили ступенчатое элюирование 0,6 М KCl (рис. 5Б). На этой стадии очистки происходило концентрирование Taq-поли-меразы и ее дальнейшая очистка от следов полимина и нуклеиновых кислот, а также большинства примесных белков, не отделившихся от Taq-полимеразы на предыдущих стадиях очистки. Анализ чистоты конечного препарата Taq-полимеразы с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии доде-цилсуль$ата показал, что рекомбинантный фермент, в соответствии с данными литературы, представлен одной полипептидной цепью с молекулярной массой приблизительно 90 КДа (рис.6). Потери в процессе выделения рекомбинантной Taq-no-лимеразы составляют 20-30 % от ферментативной активности в исходном прогретом экстракте индуцированных клеток E.coll PVG-AI, а удельная активность конечных препаратов Taq-поли-меразы составляет 180 - 200 тысяч единиц на I мг белка.

йм

1 а

- 94

- 47

- 43

- ЪО

-

-

Рис.6. Электрофорез очищенной рекомбинантной Тач-полимеразы

1. Taq-пoлимepaзa

2. Маркерные белки. Цифра справа указывает их молекулярные массы (КДД)

Определение термостабильности рекомбинантной Тач~полимеразы показало, что время ее полужизни в очищенном состоянии около 60 мин. (рис.7).

Актиамоо» То^ поытьРАЗЬ(( %)

&рвмя (инн.)

Рис.7. Определение термостабильности рекомбинантной Тач-полимеразы

Более того, фермент сохранял свою активность на протя- ' жении, по крайней мере, 60 стандартных циклов ГО1Р и демонстрировал большую эффективность в осуществлении этой реакции. Оптимумы одно- и двухвалентных катионов в П11Р, как правило, соответствовали таковым природного фермента. Ре-комбинантная Taq-пoлимepaзa обладала значительной про-цессивностью и была в состоянии амплифицировать участки ДНК длиной не менее 5,5 т.п.н. (рис.8).

д.

N.N»31 2. э ^

Рис.8. Результаты полимеразной цепной реакции участков

ДНК фага Я , осуществленной рекомбинантной Taq-пoлимe-

разой.

Амплифицированы следующие участки ДНК (нуклеотиды):

1. 7131 - 7630

2. 7131 - 8401

3. 7131 - 10399

4. 7131 - 12825

При хранении при минус 20°С в течение одного года препараты очищенного фермента утрачивали не более 40% своей первоначальной активности. Полученный рекомбинантный фермент проявил высокую эффективность и при секвенировании про7яз?й»ых участков Д1К по методу Сэнгера (А.Б.Полтараус, пгрсойе.лькоэ сообщение). Вышеперечисленные свойства полу-чеккого нами рзкомбиначтного фермента указывают на то, что он обладает всеми свойствами природного фермента, а следо-

вательно, высокоочищенные препараты Taq-полимеразы стали доступны для решения всех обсуждавшихся выше прикладных задач.

В работе Ф.Лойера с соавт. (1989) впервые была описана плаэмида pLSGI, экспрессирующая термостабильную ДНК-полиме-разу Thermus aquaticus YTI. Недостатком данной плазмиды является то, что клонированный ген Taq-полимеразы содержит собственную, чужеродную для E.coli регуляторную последовательность Шайна-Дальгарно, а также значительный фрагмент нетранслируемой последовательности нуклеотидов перед этой последовательностью непосредственно после блока промотор-оператор 1ас-оперона E.coli. Наличие чужеродных для клетки-хозяина регуляторных последовательной делает экспрессию рекомбинантного гена Taq-полимеразы в этой системе малоэффективной. Вторым недостатком плазмиды pLSGI является необходимость использования для индукции экспрессии клонированного гена дорогостоящего индуктора IPTG.

В другой известной рекомбинантной плазмиде, сконструированной на основе коммерческого вектора pTTQI8, кодирующая часть гена Taq-полимеразы также, как и в нашем случае в плазмиде рТА-23, находится полностью под контролем регуляторных элементов E.coli. Однако, и в этой рекомбинантной плазмиде ген Taq-полимеразы индуцируется IPTG. Кроме того, способ конструирования плазмиды, предложенный авторами этой работы, включал в себя малоэффективный процесс амплификации посредством ПНР целого гена Taq-полимеразы длиной около 2,5 т.п.н. с использованием геномной ДНК Т.aquaticus в качестве матрицы. В этом случае выход продуктивных клонов должен быть неизбежно низким и вследствие включения ошибочных нуклеотидов в продукт ПИР.

В проведенном нами исследовании разработан универсальный метод конструирования рекомбинантных плазмид, экспрессия клонируемых генов в которых полностью контролируется регуляторными элементами клетки-хозяина. В процессе конструирования плазмиды рТА-23 мы амплифицировали с помощь» ГО1Р лишь короткий 5 -концевой фрагмент гена Taq-полимеразы, что уменьшило вероятность включения в амплификат ошибочных нуклеотидов. При этом, искусственно введенный в 5 -концевой праймер сайт рестрикции позволил клонировать этот фрагмент

- 20 -

ДНК в одной рамке считывания с инициаторным АТв-кодовом эк-спрессионного вектора. Недостающую же большую часть гена мы получили из предварительно клонированного природного гена Тач-полимеразы, которую объединяли с недостающей 5 -концевой его частью, находящейся в составе экспрессионного вектора. Значительным преимуществом нашего рекомбинантного штамма перед аналогичными штаммами, описанными в литературе, является термоиндуцибельность гена Тад-полимеразы, так как это весьма существенно снижает стоимость рекомбинантного фермента.

Разработанный нами метод очистки рекомбинантной Тад-полимеразы дает возможность получать до 0,5 миллиона единиц высокоочищенного фермента из двух литров бактериальной культуры. Длительное прогревание экстрактов при 75°С на одной из первых стадий очистки позволяет сразу же освободиться от большинства белков клетки-хозяина. В итоге конечный препарат рекомбинантной Тад-полимеразы получается полностью свободным от нуклеазных и других нежелательных белковых примесей.

Таким образом, в результате проведенной работы нам удалось получить высокопродуктивный бактериальный штамм-продуцент рекомбинантной Тад-полимеразы, пригодной для использования в ПНР и секвенирования ДНК по методу Сэн-гера. Выделенные нами препараты фермента получили высокую оценку специалистов у нас в стране и за рубежом. Это открывает широкую возможность производства в России общедоступных тест-систем для НИР-диагностики наследственных и инфекционных заболеваний по сравнительно низким ценам.

ВЫВОДЫ

1. С помощью фазмкдного вектора рБЬ5 клонирован ген термостабильной ДНК- полимеразы ТЬегтиэ адиаМсиБ УТ1 в составе фрагмента геноиноЗ ДНК длиной около 20 т.п.н.

2. Не удалось обнаружить эффектиную экспрессию гена Тач-полимеразы в составе фазмидного вектора рБЬб под контролем собственных регуляторных элементов.

3. Разработан двухстадийный метод оптимизации экспрессии чужеродных генов в гетерологичном генетическом окружении, заключающийся в амплифицировании короткого 5 -концевого фрагмента гена с потенциальным введением подходящих сайтов рестрикции и дальнейшим клонированием этого фрагмента в экспрессионном векторе в необходимой рамке считывания. После этого по уникальному сайту рестрикции вводится большой недостающий фрагмент природного гена.

4. Сконструирована плазмида, несущая полноразмерный ген Taq-пoлимepaзы, экспрессирующийся под контролем регуля-торных элементов Е.соН в одной рамке считывания с АТС-ко-доном вектора.

5. Получен высокопродуктивный штамм-продуцент Taq-пo-лимеразы Е.соН РУС-А1, несущий стабильно наследуемую плаз-

• миду рТА-23.

6. Разработан метод очистки рекомбинантного фермента, позволяющий получать на конечной стадии выделения препарат 95% чистоты.

7. По своим основным параметрам (термостабильность, процессивность, оптимумы одно- и двухвалентных катионов в ПЦР и т.д.) рекомбинантный фермент не отличается от природного. Однако, рекомбинантный фермент обладает более высоким качеством и надежностью как минимум вследствие более высокой степени очистки.

• 8. Препараты рекомбинантной Taq-пoлимepaзы успешно апробированы в ПИР, как для экспериментальных исследований, так и ДНК-диагностики, а также при секвенировании ДНК по методу Сэнгера.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Валяев А.Г., Головченко П.А., Виноградов C.B., Патрушев Л. И. "Клонирование генов термостабилыых ДНК-полимераэ из природах штаммов Ihermus thermotilus И ïhermua aquaticua ". В сборнике "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии", Самарканд, 1991, стр.40. .. • ■

2. Валяев А.Г., Головченко П.А., Сологуб В.К., Крамаров В.М., Патрушев Л. И. "Получение моноклоналъшх антител к термоотабилъ^-. ной ДНК-полимеразе. Thermu.s tharmofllus В сборнике "Новые направления биотехнологии", Пущино-на-Оке, 1992, стр.132.

3- Патрушев Л.И., Валяев А.Г., Виноградов C.B., Головченко П.А., Чикиндас М.Л,, Киселев В.И., "EshericMa ooli Pvs -23: бак— териалышй штамм-продуцент термостабильной ДНК-полимеразн ïhermua aquaticua". В сборнике "Новые направления биотехнологии", Цущи-но-нз-Око, 1992, стр.126.

4. Патрушев Л.И., Валяев А.Г., Головченко П.А., Виноградов C.B., Чикиндас М.Л., Киселев В.И. " Клонирование гена термоста-билъной ДНК-полимерази Thernun aquaticua упи его экспрессия в клетках Esherichia coli ". "Молекулярная биология", 1993, т.27 (в печати).

Под.шслмо о печать ¿S. Of. 199Зт.____Зак. jfyé Тир./Ûâ

МАЛОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ «ПЕТИТ»