Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Транспорт и утилизация сахаров и аминокислот у экстремально-термофильных анаэробных архебактерий

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Транспорт и утилизация сахаров и аминокислот у экстремально-термофильных анаэробных архебактерий"

РГ6 од

- А ДПР 1994.

Российская Академия Наук Институт микробиологии

На правах рукопяси УДЯ 579.в.017.7

УГОШО ИРИНА АРНОЛЬДОВНА

ТРАНСПОРТ й УТИЛИЗАЦИЯ САХАРОВ И АМИНОКИСЛОТ У ЭКСТРЕМАЛЬНО-ТЕРМОФИЛЬНЫХ АНАЭРОБНЫХ АРЩАКТЕРЙИ

Специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени-кандидата биологических паук

Москва - 1994

Работа выполнена в Институте микробиологии РАН

Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор

Плакунов В.К.

Официальные оппонента : доктор биологических наук Ивановский Р.Н.

кандидат биологических наук Вонч-Осмоловская I

Ведущая организация : кафедра биологии почв

факультета почвоведения МГУ, Москва.

пп

Защита состоится " 20 " апреля 1994 г. в 14 -часов на заседании специализированного совета Д.002.64.01.. в Институте микробиологии РАН по адресу : II7BII, г.Москва, Проспект 60-летия Октября, д.7, корпус 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии РАН.

Автореферат разослан '.^."..•А^Я^.У.^?rî994 г.

Ученый секретарь еттециали- ^ г^с <-<__ Л.Е.Никитин

аированного совета, к.б.н.

Актуальность проблемыé

Изучение экстремальных' термофшзв' Интересно с точки зрения решения таких фундаментальных проблем, как термостабилькость белков, нуклеиновых кислот и других Сиомолекул, а также с точки зрения потенциального использования в биотехнологии уникальных ферментов и метаболических процессов.

Экстремально-термофильные бактерии (в последнее время такяе именуемые "гипертермофильными") - это микроорганизмы, имеющие оптимум роста при температура вшив 80 °С и адаптированные к местообитаниям с экстремальной температурой, которые, как правило, связаны с зонами остаточной вулканической активности [Brook, 1936; stetter et al, 1990]. В настоящее время насчитывается около 50 видов таких бактерий, большинство из которых отнесены к архебактериям.

Среди известных, в настоящее время экстремально-термофильных анаэробных архебактерий, которые входят в состав микробных сообществ морских и нижних слоев континентальных гидротерм, особый интерес с ■точки зрения пищевых потребностей представляют серометаболизирупцие гетеротрофные архебактерии родов Thermococcua, Ругососсиа, Desulfurococcua, а такке Stapxylotherrmta martmi3 и штаммы ES-1 и ES-4. Представители данной группы экстремальных термофилов в качестве источника углерода и энергии используют Оэлково-пептидные субстраты - пептон, триптон, дрожжевой экстракт, казеин - и некоторые из них способны использовать полисахаридные субстраты - крахмал, пектин, гликоген, т.е. биополимеры [Stetter et al, 1990]. Водород не используется в качестве донора электронов данными организмами в отличие от Thermovrvteua tenas и Pyrobaculm lelandicim и не стимулирует рост в отличие от Pyrodictium abysal и Hyperthermie butyltcua. Представители рассматриваемой здесь группы микроорганизмов при росте . на высокомолекулярных субстратах -

полисахаридах и пептидах - синтезируют внеклеточные ферменты, в частности амилазы и протеиназы, способные расщеплять эти соединения ДО МОЮ- и олигомеров (Bra^ger et al, 1989; Klingeberg et al, 1991; Koch, et al, 1991]. При этом в среда культивирования обнаруживаются продукты сбраживания Сахаров (Hg, С02, ацетат) и аминокислот (Hg, COg, ацетат, изобутират.изовалэрат ) (Bonoh-Osmoiovskaya, stetter, 1991? Stetter, .1990J. Однако, moho- и диеахариды, а такяе аминокислоты либо не используются 'этими организмами в. качестве единственного источника углерода и энергии, либо обеспечивают очень слабый рост (2-4 клеточные генерации) [Бонч-Осмоловская и др., 1988; Piala, Stetter, 1986; Pledger, Багозз, 1991]. С другой стороны, попытки культивировать эти микроорганизмы на средах с пептидами определенной структуры до настоящего времени были неудачными. Поэтому весьма актуальным представляется более детальное изучение возможности утилизации этими бактериями не только полимерных, но и мовомерных субстратов.

Цель работа. Целью наших исследований было выяснение способности архебактерий родов 27гегаососсиз, Deaulfxxrocaccus и Руго соссиз использовать аминокислоты, моно- и диеахариды, что позволяет уточнить их роль в микробном сообществе гидротерм. Задачи исследов&шш.

1. Выяснить способность ряда представителей рассматриваемой физиологической группы архебактерий транспортировать в клетки аминокислоты, моно- и дисахарида.

2. Изучить транспортные системы экстремальных термофилов.

3. Изучить способность к утилизации Сахаров и аминокислот. Научная новизна в практическая значимость. Впервые показано, что архебактерии родов Ругососаиа, Thermoaocatia и De3ulfurococcua, которыз в лабораторных условиях не растут на средах, содержащих в

г

качестве единственного источника углерода и энергии простые сахара (моно- и дисахарида) или свободные аминокислоты» способна поглощать из среды и аккумулировать в клетках аминокислоты,, моно- и дисахариды. Величины скорости поглощения данных субстратов клетками изученных экстремально-термофильны* анаэробных архебактерий имеют тот же порядок, что и соответствующие показатели для термофильных анаэробных эубактерий. AnaeroceUm thermophlltm и Dlctyoglcmua turgláus, которые были использованы для сравнения Как бактерии, способные расти на средах с полисахаридами, или простыми сахарами в качестве единственного источника углерода и энергия. Изучены некоторые характеристики транспорта серина у D.amylolyt icu3. Показана возможность метаболического превращения моно- и дисахаридов клетками D.amylolyt leva. Выявлено, что условием утилизации Сахаров и аминокислот D.amylolyt(сиз является наличие относительно больших количеств пептона в среде. Выдвинуты гипотезы о роли пептона в утилизации аминокислот и Сахаров.

Апробация работ. Материалы диссертации доложены на совместном заседании лаборатории микробной биогвохимии, лаборатории микробных сообществ и лаборатории микробной трансформации минералов. Отдельные материалы были представлены на конкурсе НИР ШЛИ РАН. Публикации. По материалам диссертации опубликована I статья, и I статья сдана в печать.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на -/X. О страницах машинописного текста и ' состоит из разделов "Введение", "Обзор литературы", "Экспериментальная часть" (вкллчащего главы "Объекты и методы исследования", "Результаты и их обсуждение"), "Заключение","Выводы" и "Список литературы" (включающий 495 наименований). Диссертация содержит 25 рисунков и 12 таблиц.

эксжриштдоия часть, I. Объекты Е метода всрледовавиа.

Культуры. Из .коллекции лаборатории микробных сообществ Института микробиологии РАН; штаммы экстремально - термофильных облигатыо анаэробных гетеротрофных серометаболизирувдих архебактерий Deèulfurococcua amylolytlcua z-533 и z-603 [Бонч-Осмоловская и др.,1988], Thermoooccus etetterl к-3 (DSM 5262) и К-15 [Miroshnichenko et al., 1939], Thermoooccus litoralla1 z-1301 [СветличныЛ и др.,1987]; штаммы термофильных облигатно анаэробных гетеротрофных эубактерий Anaeroaellm thermopMlvoi z-1320 [Светличный и др.,1990], dlctyoglomua turgiäua z-Í310 [Светличный.и Др., 1988]. Из коллекции Deutsohe Saianlvmg für Mikroorganismen (Германия): штаммы экстремально - термофильных облигатно анаэробных гетеротрофных серометаболизирувдих архебактерий Thermococcua celer DSM 2470 [Zillig et al, 1933], Deaul^uroooccua mucosus DSM 2162 [Zillig et al, 1982], Pyrococcua fwrloaua DSM 3638 [Piala, stetter,19861. Перечисленные штаммы оыли любезно предоставлены нам сотрудниками лаборатории микробных сообществ Института микробиологии РАН Е.А.Бонч-Осмоловской, И.Л.Мирошниченко и В.А.Светличным.

Основой для приготовления питательных сред слукила среда следующего состава : минеральный фон по Пфеннигу [Pfennig, 1965], шрфолшшропансульфоновая кислота (UOPS, для эубактерий) - 1,05 г/л (5 мМ) или морфолинэтансульфоновая кислота (MES, для архебактерий) -0,976 г/л (5 мШ, NagS'SHgO - 0,6 г/л, резазурин - 0.001 г/л, раствора витаминов - 10 мл/л (Woiin et al.,19631, раствора микроэлементов - 10 мл/л [Pfennig, Lippert, 1966], сера (только для

1

Переименован из Caldoooooue litoralis после проведения ДНК-ДНК гибридизации со штаммом Thermoccoous litoralis (DSM 5473) (Светличный, персональное сообщение).

архебактерий) - 10 г/л. При выращивании морских кокков T.atetteri. T.lltoralls, P.furlosus я T.celer дополнительно вносили соответственно 2,5; 2,5; 3,0 и 4,0 s Nací. pH среды доводили до 6,4 - 6,5 (для T.atettert, T.lltoralta, D.nucosua, D.amylolytlcua), 5.86,0 (для T.celer) и 6,8-7,0 (для P.furlooua), 7,0-7,2 (для эуоактерий). Питательные среды готовили согласно правилам анаэробной техники [Жилина, Заварзин, 1978]. Газовой фазой служил N2. При исследовании транспортных процессов культивирование бактерий проводили в герметично закрывающихся стеклянных флаконах объемом 500 мл с 250 мл среды с добавлением дрожжевого экстракта (0,5 г/л), шптонэ или крахмала (3 г/л) - в случае архебактерий; крахмала, сахарозы или глюкозы (5 г/л) - в случае эуоактерий. При исследовании способности D.amylolytlcua утилизировать сахара и аминокислоты культивирование проводили во флаконах объемом 100 мл с 20 мл среда с добавлением в качестве источника углерода и энергии следующих субстратов : дрожжевого экстракта, пептона ("ХШАЛОЛ"), крахмала, моно- и дисахаридов, 20 аминокислот, дипептидов. Варьировали содержание субстратов в среде и их сочетание меиу собой. Посевной материал вносили в количестве 1%. Стандартизацию посевного материала проводили путем нескольких пересевов на среду того же состава. Бактерии выращивали в течение 20-20 ч при соответствующей каждому штамму оптимальной температуре роста, а именно: при 72° - D.turgldua и A.thermophllvm, при 76° - T.atetteri К-3, при 88° -D.cmjlolyttcua, О.тпжоаиэ, T.celer, T.lltoralta и T.atetteri К-15, при 98°С - Р./иг1озиз.

Подсчет клеток проводили с помощью люминесцентной микроскопии, окрашивая препараты акридиновым оранжевым. Все эксперименты проводили не менее, чем в трех повторностях. В таблицах и ка рисунках представлены типичные данные. Определение достоверности

различий при подсчете урожая клеток проводили по Стьвденту-Фишеру [Зайцев, 1973].

Для исследования транспортных процессов выросшие клетка отделяли от среды центрифугированием в течение 15 мин при 8000/е (архебактерии предварительно освобокдали от серы) и двакды промывал! солевым раствором , суспендировали в анаэробном буфере, содеркаще* только минеральные компоненты среды культивирования, 5 мЫ MES шв MOPS, резазурин и Na2s-9H2o (рН как в среде культивирования), Плотность клеточной суспензии доводили до плотности, соответствующе* по белку 0.1-0.3 мг/мл. Опыты по изучению транспортных процессо! проводили в строго анаэробных условиях во флаконах объемом 10 мл < 2-5 мл клеточной суспензия. Радиоактивный субстрат вводили д( конечной концентрации 4-5 мкЫ (для аминокислот) и 20-25 мкМ (дл Сахаров). Пробы объемом 0,3 мл отбирали, начиная с 20 с до 15-21 мин, фильтровала через мембранные фильтры "Whatman,Oïï" (диаметр по; 0,45 мкм, England) и двавды промывали солевым раствором Радиоактивность высушенных фильтров измеряли на жидкостно; сцинтилляционном счетчике "1216 Rackbeta"(1KB,Швеция). Поглощение 4 HPpOlo (4-Ш1трофенил -p-D-глюкошранозид) клетками D.amylolytlcu изучали по Sims et al [Sinis et al.,1984]. 4-NPpGlo ВВОДИЛИ, Д конечной концентрации I мм я отбирали пробы по 2 мл, которые сраз охлаждали на льду, затем центрифугировали при 8000 об/мин 10 мин. 1,5 мл супернатанта добавляли 1,5 Ш1 2 M Ма2Со3 (рН IQ.0). Абсорбци измеряли при А.=400 шг в кюветах с 1=1 см на спектрофотометре СФ-(СССР). В качестве контроля использовали аналогично обработаннь анаэробный буфер. Количество поступившего в клетки D.amylolytictia 4 KPpQlo вычисляли по формуле :

А400 Ю3 НМОЛЬ i = t _____

9,6 р.

где р - белок в клеточной суспензии (мг/мл). По результатам эксперимента стройли график зависимости поглощения клетками субстрата от времени инкубации.

Хроматографическое разделение продуктов инкубации клеточной суспензии D. ату lolyt loue с С ^-глюкозой- проводили методом восходящей бумажной хроматографии в 0,2 % уксусной кислоте на хроматографич&сКой бумаге ЭКТЕОЛА-целлюлоза'.

Кинетические параметры транспорта серина клетками D.amylolytlcua определяли путем измерения' за 20 с скорости транспорта L-[tf-14c]-серина в диапазона концентраций 0,1-15 мкМ при 60, 70 и 80°С. Значения К^и ?макс и юс овиСку рассчитывали методом нелинейной регрессии по способу Ньютона с коррекцией [Эберт, Эдерер,1988], реализованной на IBM PC/AT Глаголевым М.В. на языке Ouiok Basio, а также по методу Лайнуивера - Берка [Налети,1990].

Величину мембранного электрического потенциала (¿Ф) измеряли по распределению 14с-тетрафеншйюсфония (ТФФ+) и рассчитывали по •уравнению Нэрнста [Ahmed, Booth, 1931).

Содержание белка определяли по методу Лоури в модификации Гартри [Hartгее,1972]. Калибровочную кривую строили, используя раствор бычьего сывороточного альбумина.

2. Результаты а их обсуждение.

2.1 Поглог-экие акинокислот экстреЦйльно-гермсх^льшаи анаэробными

архебактеркяшя.

В качестве основных объектов исследования били выбраны представители нескольких родов экстремально- термофшьных анаэробных серометаболизирующих архебактерий, которые характеризуются гетеротрофным типом питания и используют, по литературным данным, в

качестве единственного источника углерода и энергии в среде только пептиды (T.celer, T.ateîîeri К-15, F.lltoralla, D.muc03u3) или пептиды и некоторые полисахариды (D.cmylolyttcua, T.stetterl К-3, P.fvrloaua), . т.е. биополимеры. Высказывалось предположение, что отсутствие роста или предельно слабый рост экстремально-термофильных анаэробных гетеротрофных археСактьрий на средах, в которых единственным источником углерода и энергии служат не пептиды или полисахариды, а аминокислоты или простые сахара, может быть св'язано с отсутствием у данных микроорганизмов' соответствующих транспортных систем (Zillig et al, 1990].

Все изученные экстремально-термофильные облигатно анаэробные гетеротрофные архебактерии при росте в оптимальных условиях (состав среды, температура, pH) оказались способными поглощать и аккумулировать в клетках аминокислоты из смеси 20 свободных 14С-аминокислот. Приведенные в таблице I величины начальной скорости поглощения (VQ) носят суммарный характер, поскольку в качестве тест-рэ актива использовалась смесь меченых аминокислот, а не индивидуальные соединения, как в последующих опытах. Существенных отличий мезду архебактериями и использованными для сравнения эубактериями по величинам V0 для аминокислот не обнаружено. Процесс накопления метки в клетках носит экспоненциальный характер в первые несколько минут с последующей стабилизацией на каком-то уровне или постепенным снижением уровня радиоактивности. Поглощаемые клетками аминокислоты вовлекаются в конструктивный метаболизм, поскольку при более длительной инкубации (3,5 ч) клеток D.omylolytlcua со смесью меченых аминокислот наблюдалось устойчивое включение метки в кислотонерастворимуо фракцию. Добавление дрожжевого экстракта оказывает незначительное благоприятное воздействие на этот процесс. Полученные данные свидетельствуют о потенциальной способности

Таблица 1 Поглощение Сахаров и аминокислот клетками экстремально-термофильных, бактерий.

Организм Источник углерода ■ Начальная скорость поглощения меченых субстратов,нмоль/(нин нг белка |

в среде глюкоза сахароза мальтоза анинокнслт ы

D. araylolyticus z-533 ( пептиды, полисахариды)* Пептон, дрожжевой экстракт 86 1 .5 1 .3 1,6 2.4

z-603 С пептиды, полисахарид ьО То яе 86 1 .4 1 .4 1.8 2.0

D. mucosus СпептидьО - 86 0.1 0.3' 0.3 0.9

T.stetteri К-3 Спептидь!, полисахариды} К-15 СпептидыЭ 76 86 0.5 Q.8 .0,3 2 f 2 0.9 0.7 2.3 3,3

T. Utoralis Z-1 301 С п'ептидыЭ - 86 0.6 0,3 2.1 2.1

T. celer СпептидыЗ - 86 0.9 3,3 4.3 2.8

P. f uriosus Спептиды.поли- сахаридьО 86 0.8 0, 8 0.3 0,1

A. t hermophi 1 ига Скрахмал.ноно-И дисахаридьО Глюкоза Сахароза Крахмал 72 3.0 2.7 0.6 1.5 4.1 1. 0 1 ,2 2.4 1 .2 0.8 1 .1 0,8

I). turgldus Спептиды,крахмал, мано- и дисзха-ридьО Глюкоза Сахароза Крахнал 72 4.2 1.5 0.7 0.9 7. 6 0, 4 3.3 1 .5 0.8 ' 0. 1 0.3 0,5

* Типичный источник углерод^ по данным литературы. Таблица 2. Поглощение аминокислот клетками О. ату1о1уИс1га.

ала вал г.пи сер - мет про лей тре

Vo 11.04 0,17 1,45 1.83 0.6 0'.2б 0.72 0.11

лнз гис арг тир трп фал асп глу

Vo 0.91 1 .69 0.6 0.51 0.72 . 0,13 0,6 0.13

V - начальная скорость поглощения, нноль^нич мг белка

° с концентрация меченого субстрата в шиубационноп смеск 3 hkITj.

экстремально-термофильных гетеротрофов использовать аминокислоты в качестве источника углерода.

В.апу1о1уИоиа, выбраный в качестве объекта для более подробных исследований,, поглощает и аккумулирует в клетках аминокислоты из смесей, составленных по группам (кислые, основные, ароматические, прочие) и индивидуальные аминокислоты (табл.2). Особенно высокая транспортная активность в отношении серина, аланина, глицина и гистидшш указывает, по-видимому, на"важную роль этих аминокислот в жизнедеятельности 1).олу1о1уг1сиа.

Таким образом, главные природные аминокислоты доступны клеткам 0.ату1о1уг1сиз в свободной форме.

Зависимость начальной скорости поглощения серина клетками 1).сту1о1уИсиз от его концентрации в среде описывается кривой насыщения (рис.1), характерной для ферментативной кинетики [Мусил и др.,1984]. При определении кинетических параметров- обнаружено две пара значений Км и умакс, что можно интерпретировать как наличие двух систем: с низким сродством к субстрату (Кц=70 мкМ и умакс=50 нмоль/мг мин) и с высоким сродством к субстрату (Ку=0,3 мкМ и 7макс~0,67 нмоль/мг мин).(табл.3). Полученные значения кинетических, параметров транспорта аминокислоты принципиально не отличаются; от соответствующих величин для большинства евтрофных бактерий [Котик, Яначек/ 1980]. Анализ кинетических кривых транспорта серина при разной температуре позволяет предположить, что при высокой температуре (>70°) функционирует преимущественно система с низким сродством к субстрату, в то время как система с высоким сродство« ингибируотся. 70°С - оптимальная температура для транспорта)! системы серина у О.ату1о1у(1сиз, что объясняется, по-видимому, функционированием обеих транспортных систем.

Транспортные системы экстремальных термофилов функционируют I

У.нмоль/мг мин

Э.мкМ

Рно.1 Зависимость начальной скорости транспорта серина (уо) от концентрация в среде (б,при разной температуре,

I - 80 °С 2 - 70°С 3 - 60°С

Таблица 3. Кинетические параметры транспортной системы сернна D.»BylolyiiciiS.

Паранетры Температура. °С

60 70 80

К* . нкМ м „1 нмоль накс'мин иг К^ . нк.П нмоль накс'мнн иг 3*1.2 'у * 0.7 0.8 ¿ 0,3 3.3 + 0.3 5 + 1,6 10 ± 1,2 0,5 + 0.2 3.3 ¿ 0.3 70 ± 15 50 ±5,3 0.3 ± 0,1 0,67 ± 0.1 ,..*. j

широком диапазоне температуры. Например, клетки T.ate.ttert к-15 спосоош поглощать аминокислоты в диапазоне температуры по крайней мере от 50°С до 90°С.

2.2 Поглощение ыоно- в дисахаридов экстремально - терыофалькышс анаэробными архебактершши.

Все изученные нами бактерии (и эу-, и архе-)- способны поглощать и аккумулировать в клетках моно- и дисахарида (табл.1). Архебак'терии T.atetterl к-3, D,cmylolyticua и D.mucosua, выращенные на среде с крахмалом в качестве источника углерода и энергии, также способны транспортировать все исследованные меченые соединения (т.е. глюкозу, мальтозу, сахарозу и аминокислоты), однако величины начальной скорости этих процессов существенно не отличаются от соответствующих данных, приведенных в табл.1 для среда с пептоном. Клетки эубактерий D.turgldua ж A.thermophllvm поглощают меченые глюкозу, сахарозу и мальтозу на средах с любым из исследованных углеводов, внесенным в качеотве источника углерода и энергии. (табл.1). Культура D.turglchia на среде с глюкозой характеризуется увеличенной лаг-фазой (1-2 суг), однако это не влияет на величину начальной скорости поглощения, исследованных меченых субстратов суспензией клеток . из экспоненциальной фазы роста (табл.1).

Интересно отметить, что у всех исследованных наш бактерий процесс поглощения Сахаров носит периодический характер, и после достижении максимума происходит снижение уровня радиоактивности клеток практически до уровня адсорбции или во всяком случае до уровня, не превышающего концентрацию метки в среде более чем в 2-3 раза - (рис.2). Показано, что поглощение глюкозы клетками B.amylolyttcual выросшими на среде с пептоном и на среде с пептоном и мальтозой., имеет периодический характер. На среде с крахмалом

нмоль/мг 1 г

I I I

мин

Рис.2 Поглощение Сахаров экстремально-термофильными архебактериями.

1 - глюкоза \D.amylolytlcu3)

2 - мальтоза (В.ату1оТ.цг1сиа)

3 - сахароза {Т. Игогси1а)

иИН

Рис.3 Изменение мембранного потенциала (ДФ) ¡меток о.аиуыуис!«

При ПОГЛОЩВШШ ГЛ2НОЗЫ.

1 - поглощэниэ 14С-глюкозы„ нмоль/мг белка

2 - А®, мВ (контроль)

3 - динамика ДШ при добавлении глюкозы

изменение внутриклеточной концентрации метки также носит периодический характер» но с более длинным "периодом". В целом, следует отметать, что поглощение моно- и дисахаридов у D.ccnylolytlcua носило периодический характер независимо от источника углерода в среде, однако, в отсутствие точных сведений о механизме транспорта Сахаров, не представляется возможным проводить какие-либо сравнения. Такой характер "транспортного процесса обычно свидетельствует о наличии транс-регуляции, т.е. управление субстратом или продуктами его метаболизма транспортом этого субстрата из среды. Механизмы'транс-регуляции могут быть различными. Например, у H.sallnartm был обнаружен необычный периодический характер динамшш поглощения ароматических аминокислот клетками, выращенными на сложной пептонной среде. Авторами было показано, что присутствие ароматической аминокислоты (в опыте использовали феннлаланин) преобразует плавную динамику изменения электрического потенциала в периодическую, сходную по характеру с динамикой поглощения самого меченого фешлалашша [Лобырева, Плакунов, 1992). С целью выяснения причин периодического характера поглощения Сахаров у исследованных нами экстремально-термофшышх бактерий была изучена возможность воздействия транспортируемого сахарида (на примере глюкозы) на величину и динамику мембранного потенциала. Присутствие глюкозы не влияет на плавную динамику изменения электрического потенциала (рис.3).

Факт обнарукения транспорта моно- и дисахаридов вполне закономерен для эубактерий D.tvrgixius и A.thermoptilliai, которые хорошо растут на средах, содержащих различные сахара, в том числ( глюкозу, мальтозу и сахарозу [Светличный, Светличная, 1988 Светличный и др.„1990].

Напротив, наличие способности транспортировать моно-

дисахарида у представителей изучаемо® группы экстремально-термофильных гетеротрофов входит в противоречие с широко известным фактом неспособности данных архебактерий расти на средах с сахарами в качестве единственного источника углерода и энергии.

Принципиальных отличий в скоростях поглощения меченых Сахаров между архе- и эубактериями не обнаружено.

2.3. бДвтаболнзы сймров у й.отуШуПсиз.

Поглощаемые клетками 0.ату1а1уХ1сиэ сахара подвергаются метаболическим превращениям.

При инкубации • клеток й.ащЮХуИаья с

4-1ШтрофбШ1л-р-Б-глюкопиранозидом, химическим аналогом дисахарида целлобиозы » в среде накапливается неметаболизируемое окрашенное соединение нитрофенол, что является дополнительным свидетельством в пользу наличия транспорта и внутриклеточного расщепления дисахаридов.

При инкубации клеток В.ату1о1уХ1саз с 14С-глюкозой в среде появляются и накапливаются соединения, отличные от глюкозы (табл.4). Образующиеся продукты метаболизма имеют сильно кислую, природу, поскольку при хроматографировании фильтрата на анионообменникэ в 0,2 % уксусной кислоте остаются практически на старте. В качестве продукта превращения глюкозы обнаружен также С02, который после окончания инкубации и подщелачивания инкубационной смеси в закрытом флаконе с помощью Иа^О^ переходит в раствор в виде бикарбонат-иона и приводит к резкому увеличению количества меченых соединений во фракции с глюкозой. С02 известен как один из продуктов сбраживания сложной органики экстремальными термофалами, в том числе й.(Щ)1о1уИсма.

Таблица 4. Содержанке продуктов превращения глюкозы Снмоль/'мг белхг при инкубация клеточной суспензии О. ату1о1уЛ.1еиз с 1 4

С-глюкозой.

время инкубации, мнн

1 15 25 35*

Н&В№Ы кислоЯ со2 0 н. о. 0.28 н. о. 0,82 н. о. 1.66 1 .5

* - после обработки суспензии N»-00,

2.4. Утяазацкя сахвров и шинокнслот и. а»у1о1уг1сия.

Рост В.ату1о1уг1сиз на среде, содержащей в качестве единственного источника углерода и энергии смесь из 20 природных аминокислот с конечной концентрацией I мМ для каждой аминокислоты, не зафиксирован.2 Увеличение содержания виташнов в 10, 50 и 100 раз не вызвало рост С.ату1о1у1(сиз на среде со 'смесью аминокислот. Слабый рост (около 3-Ю7 кл/мл) на среде, содержащей 0,1 мМ, 0,5 мМ или I мМ смесь аминокислот, наблюдался только в присутствии небольшого количества дрожяевого экстракта (0,1 г/л и 0,5 г/л). Численность д.ащХоХуНсиз, выросших на всех вариантах сред, не была пропорциональна содержанию аминокислот и не отличалась от численности бактерий в контрольном варианте на среде с одним дрожжевым экстрактом, т.е. рост обеспечивался за счет какого-то(каких-то) источника(ов) углерода и энергии из дрожжевого экстракта. В контрольных высевах В.ат.у1о1у11сиа на среды с разным содержанием пептона (0,3-3,0 г/л) рост бактерий был пропорционален содержанию пептона. Дрожжевой экстракт в количестве 0,1 т/1

2

Во всех экспериментах, касающихся выяснения возможности, роста

0.ату1о1уИсиз на среде с каким-либо субстратом,. окончательный вывод

делали только после проведения 2-3 пересевов на среду того же

состава.

стимулировал рост В.ату1о1уИсиэ на среде с пептоном. Это согласуется с данными Бонч-Осмоловской [Бонч-Осмоловская и др., 1988] .Указанные закономерности роста О.атуХоХуИсиз наблюдались и в присутствии, и в отсутствие сери. Таким образом, В.ату1о1уХ1спз, по-видимому, не способен использовать аминокислоты в качестве единственного источника углерода и энергии.

На средах, содержащих помимо смеси аминокислот пептон в небольших количествах (до 0,5 г/л; варианты 2д,За и 4а, табл.5), численность клеток практически не отличается от численности микроорганизмов, выросших на одном пептоне, в соответствуют« контрольных вариантах (2К,3К и 4К). При компенсации уменьшенного содержания пептона увеличением концентрации смеси аминетшслот (из рассчета, что 3 г/л пептона соответствует I мМ смеси аминокислот) численность 0.ату1о1уИсиа (варианты 20,30 и 4С) также соответствует численности в контрольных вариантах. Однако, при увеличении содержания пептона в среде й.шуХоХуНсиа начинает активно утилизировать аминокислоты» что проявляется в значительном превышении численности клеток •, выросяшх на среде с добавлением снеси аминокислот (варианты 5а и 6а)„ по сравнению с численностью 0.оту1о1уИсиз в контрольных вариантах 5К и 6К. При этом на среде с 1,5 г/л пептона и 0,5 мМ смесью аминокислот рост 0.сту1о1уИсиа был достоверно выше, чем на среде с 3 г/л пептона (варианты 6а и 7„,соотве тственно).

Л

Получешше результаты служат прямым доказательством способности Р.ату1о1уТ1сиз утилизировать аминокислоты. Однако степень утилизации аминокислот зависит от количества пептона в среде, - поскольку при увеличении концентрации смеси аминокислот в среде при постоянном количестве пептона численность, бактерий не увеличилась (варианты 5;3 и 50,таСл.8), а при увеличении количества пептона наблюдалось резкое

Таблица 9. Влияние аминокислот Во ростг Ь.*Йу1о1 на средах с пептоном

N Источник углерода н энергии в среде Численность бактерий, х 106 члунл 0 Источник; углерода н энергии в среде Численность бактерий, X 10 клупл

1 а 0,1 г/л др.экст. 0,5 мМ смесь анинокислот 70 1 ■ к 0,1 гул др. экст. 53

2 а 0,1 г/л др.экст. 0,1 г ал пептона 0,5 мМ смесь аминокислот 110 2к 0.1 гуя др.экст. 0,1 гуя пептона 130

26 0,1 гул др.экст. 0,1 гул пептона 0,97 нН смесь анинокислот 120

3 а 0,1 гул др.экст. 0,2 гул пептона 0,5 иМ сиесь аминокислот 170 Эк 0,1 гул др.экст. 0.2 гуя пептона 180-

36 0,1 гул др.экст. 0,2 гул пептона 0,94 нМ снесь аминокислот 130

^а 0,1 г^л др.экст. 0,5 гул пептона 0.5 иМ сн^сь аминокислот 200 4к 0.1 гул др.экст. 0,5 гул пептона 170

46 0.1 гул др.экст. 0.5 гул пептона 0,84 нМ сиесь анинокислот 210

5 а 0,1 гул др.зкст. 1.0 гул пептона 0,5 нМ сиесь аминокислот 300 5к 0,1 гул др.экст. 1,0 гул пептона ISO

36 0,1 гул др. эксг. 1,0 гул пептона 0,67 нМ снесь аминокислот 310

6 а 0,1 гул др.зкст. 1 ,5 гуя пептона 0,5 нМ снесь аминокислот ■ 450 6 к 0.1 гуя др.экст. 1.5 гул пептона 170

7 к 0.1 гул др.экст. 3.0 гул пептона 350

Различия опытного и контрольного вариантов достоверны с Р 0,95.

увеличение численности ' 0.<му1о1уИсца. (варианты 5а и 6д), но численность, микроорганизмов увеличилась именно благодаря присутствии аминокислот (сравнить 6а и 6К).

Показано, что в концентрации 0,5 Ш все 20 сеоОодных аминокислот, взятые по отдельности, в больней или меньшей степени стимулируют рост 0.шу1огуГ {сиз на среде с пептоном (рис.4, приведены данные по нескольким аминокислотам). Добавление к среде с пептоном аминокислот в концентрации 5 ыМ не приводило к заметному повышению численности кикрооргашзмов по сравнению с контролем, а в некоторых случаях (при добавлении 5 мМ серша) наблюдалось даже ингибирование роста й.ту1о\уИсиа. Исключение составили только некоторые аминокислоты (триптофан, валин, щюшп, аспарагин и метионин), добавление в среду которых в концентрации 5 мМ также стимулировало рост 0.ту1о1уИсиэ на среде с пептоном.

Показано, что при наличии в среда культивирования достаточного количества источника энергии Д.ту1о1уХ1сиа способен активно ' утилизировать сахара, что, как и в случае добавления аминокислот, приводит к увеличению численности бактерий, особенно при добавлении мальтозы й трегалозы (рис.5).

Выявив стимулирунций эффект мальтозы и аминокислот на рост О.атуШуИсиа на среде с пептоном и принимая во внимание тот факт, что при одновременном наличии в среде аминокислот и Сахаров бактерии часто используют аминокислоты в конструктивном метаболизме, а сахара используются, главным образом, в энергетическом метаболизме , мы пробовали культивировать 0.сщ1о1уХ1сиз на среде со смесью аминокислот и мальтозой. Однако рост 1).сщ1о1уХ1сьз на этой среде не наблюдался (не считая "фонового" роста за счет 0,1 г/л др.экстракта).

Мы такие пыталась выращивать 0.ату1о1уНсиа, добавляя в среду

N•10 к л/мл

1 2 3 4 5 6 7 8

варианты •

Рис.4 Влияние ешнокисло? на рост С.ашу1о1у^1оиз на среде с пептоном.

I - ОД г/л ДЭ 5 - вар 2 + аргинин

2-1,5 г/л пептона, 0,1 г/л ДЭ 6 - вар 2 + аланин

3 - вар 2 +■ 0,5 мМ смесь аминокислот 7 - вар 2 + серин

4 - вар 2 + фенилаланин 8 - вар 2 + аспарагин

а -С,5 мМ; б - 5 мМ (аминокислоты)

в

N -10 кл/мл

1 2.3 4 5 6

варианты

Рис.5 Влияние Сахаров на рост ь. »иу1о1у11си^ на среде с пептоном.

1-1,5 г/л пептона, 0,1 г/л ДЭ 4 - вар I + сахароза

2 - вар I + глюкоза 5 - вар I + трегалоза

3 - вар I + мальтоза 6 - вар I +3 г/л крахмала

а - 1,8 г/л; б- 3,6 г/л (углевода)

культивирования в качестве единственного источника углерода и энергии пептиды определенной структуры. Однако рост D.amylolyticua не был зафиксирован на среде, содержащей смесь нескольких дипептидов, а дипептид ь-лейцил-ь-тирозян в концентрации 0,5 мМ и 5 мМ не стимулировал рост D.cmylolytlcua на среде с пептоном.

Заключеше.

Предпринимавшиеся до сих пор попытки (в основном, неудачные), выявить соединения определенной структуры, которые могут служить единственным источником углерода и энергии для экстремально-термофильных анаэробных гетеротрофных серометаболизирущих архебактерий , характеризуются классическим подходом к решению этой проблемы, т.е. основаны на проверке способности обеспечивать рост микроорганизмов большого разнообразия соединений. При этом особенно йристальное внимание уделялось сахврам, аминокислотам и, в последнее время, пептидам, поскольку архебактерии указанной группы характеризуются способностью расти на средах с белково-пептидными субстратами и некоторыми полисахаридами с образованием соответствуодйх продуктов брожения. В настоящем исследовании впервые предпринята попытка охарактеризовать возможный спектр используемых субстратов через изучение способности данных архебактерий поглощать индивидуальные соединения из среды. Полученные данные о способности всех изученных представителей родов Themocoocua, Ругоаосоиа и Desulfurococcua транспортировать аминокислоты, моно- и дисахариды, а также способности D.cmylolytlcua метаболизировать моно- и дисахариды, позволили предположить, что указанные соединения могут играть существенную роль в кизнедеятельности архебактерий данной группы. Мы предположили, что экстремально-термофильные гетеротрофные архебактерии, по-видимому, помимо сбраживания пептидов могут

использовать moho- и дисахариды й качестве дополнительного -источника углерода и/или энергии.

Чтобы попытаться разрешить■противоречие, которое заключалось в том, что экстремально-термофильные гетеротрофные архебактерии "растут на пептвд-содержащнх и/шш полисахарзд-содержащих средах, способны поглощать меченые аминокислоты и сахара, но не способны расти на средах, содержащих в качестве единственного источника углерода и энергии свободные аминокислоты или сахара, была исследована возможность утилизации Сахаров и аминокислот D.amylolyt1сиз.

Показано, что D.amylolyti сиз не использует в качестве единственного источника углерода и энергии смесь из 20 природных аминокислот, взятых в концентрации от 0,1, 0,5 или I мМ. Дрожжевой экстракт даже в небольших количествах (0,1-0,5 г/л) может обеспечивать рост D.amylolytleus. Внесение основных витаминов в разной концентрации не обеспечивает способность D.amylolyticus использовать аминокислоты в качестве единственного источника углерода,« энергии. Однако при добавлении в среду культивирования кроме 20 аминокислот (по 0,5 Ш) пептона в количестве не менее 1-1,5 г/л наблюдается резкое усиление роста D.amylolyt1сиз за счет аминокислот, при этом степень вовлечения аминокислот в клеточный метаболизм зависит от количества пептона в среде. Аналогичные результаты получены и в отношении Сахаров,

Таким образом, нами показана возможность D.mylolytlcua утилизировать сахара и аминокислоты,, но при условии наличия в среде пептона, роль которого пока не ясна. Судя по последним научным публикациям s, подобная ситуация сложилась и в отношении изучения пищезых потребностей-Pyroooccua furlosua [Jarmasoh, 1993; Snowden et al, 1992J.

Все имеющиеся в литературе данные о физиолого -биохимических

свойствах архебактерий родов Ругососсиэ, Thermocoacna, Desulfvrococcua, StaptyjXothermia указывают прежде всего на то, что в пищевых цепях гидротэрм они являются первичными потребителями органического материала. Расщепляя биополимеры (белки, пептида и полисахариды) и сбраживая продукты их деградации с образованием Н2, С02 и недоокисленных органических веществ (ацетата, бутирата, изовалерата и других летучих яирных кислот), они поставляют в пищевую цепь субстраты для роста других членов гидротермального сообщества. С ,яругой стороны, при определенных условиях помимо биополимеров экстремально-термофильные анаэробные гетеротрофные архебактерии могут использовать для роста аминокислоты, моно- и дисахара, и> как показано для P.furiosus, пируват [Sohafer, Sohonheit, 1991]. Это возможно является важным свойством, обеспечивающим эффективную конкуренцию в экстремальных условиях и расширяет имеющиеся представления о метаболических возможностях данной физиолого-биохимической группы архебактерий.

Так в чем же все-таки причина отсутствия роста экстремально-термо<1ильных гетеротрофов на сахарах и аминокислотах ? Одно из объяснений, которое представляется нам достаточно вероятным, состоит в следующем. Пептон может содержать компонент(ы), необходимый для утилизации аминокислот и выполняющий роль либо "кометаболита", утилизация которого долина происходить одновременно с утилизацией аминокислот, либо регулятора (индуктора) аминокислотного метаболизма (возможно пептидной природы). Имеющиеся данные пока не позволяют отдать предпочтение какой-либо одной точке зрения.

ВавоОДг

Г.Многие эксгремально-термофьяьные анаэробные гетеротрофные врхебактерии родов Desulfuroco cctta, Ругососсиз и ТПегтососаиз способны к поглощению и утилизации аминокислот, моно- и дисахаридов.

2.Утилизация из среды, биополимеров, олигомеров и мономеров (белков, полисахаридов, пептидов, олигосахаридов, аминокислот и моносахаров) взаимосвязаны. Использование аминокислот, моно- и дисахаридов требует обязательного присутствия в среде пептидов.

3.Все изученные дипептиды не обеспечивают рост D.amylolytlcua в качестве единственного источника углерода и энергии и не стимулируют рост данного организма на среде с пептоном.

4.0бнарукена способность D.amylolytlcua транспортировать и

аккумулировать в клетках все природные аминокислоты. Кинетические

параметры транспортной системы серина у D.amylolyt(сиз имеют

величины, характерные для большинства евтрофных бактерий. Возможно

существование двух систем транспорта серина у D.amylolyticos,

характеризующихся высоким (К = 0,3 мкМ) и низким (К = 70 мкМ)

М М ■ ь

сродством к субстрату. При высокой температуре (выше 70 С)

функционирует преимущественно система с низким сродством' к

субстрату, а цри более низкой температуре - система с высоким

сродством к субстрату.

5.В острых опытах в суспензии клеток D.amylolytlcu3 обнаружено образование кислых и газообразных продуктов метаболизма 14С-глисозы, а также гидролитическое расщепление 4-нитрофенил-p-D-глвкопиранозида» химического аналога целлобиозы.

G.Полученные результаты расширяют представление о метаболических возможностях экстремально- термофильных анаэробных гетеротрофных архебактерий, способных утилизировать не только полимерные, но и мономерные субстраты, что свидетельствует об универсальности их роли в микробном сообществе гидротерм.

Список работ, опубликование ш ш дассертгщи.

1. И.А.Усенко, Л.0.Северина, В»К.Плакунов. Поглощение Сахаров и аминокислот экстремально-термофильными архе- я эубактериями. // Микробиология. Т. 62, Вш. 3. С. 437-446.

2. И.А.Усенко. Утилизация Сахаров и аминокислот экстремально -термофильной анаэробной архебактеривй Ееви1Гигоооооия ату1о1у1;1оив. // Микробиология. 1994. (в печати).