Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и очистка термостабильной Tth ДНК-полимеразы, изучение свойств и ее использование в методах детекции молекул РНК

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Выделение и очистка термостабильной Tth ДНК-полимеразы, изучение свойств и ее использование в методах детекции молекул РНК"

г;, - *

1 6 О Щ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М. В. ЛОМОНОСОВА.

Р Г Б ОД

• с щ?" т На правах рукописи

j ü UiiS b-J-J

УДК 577.213.32 + 578.825.13

ГРЕБЕННИКОВА Татьяна Владимировна.

ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ ТЙ1 ДНК-ПОЛИМЕР АЗЫ, ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ И ЕЁ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В МЕТОДАХ ДЕТЕКЦИИ МОЛЕКУЛ РНК.

03.00.04. - Биологическая химия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

Москва - 1995

Работа выполнена в отделе молекулярной биологии Всероссийского научного центра молекулярной диагностики и лечения.

Научные руководители: доктор биологических наук, В. И. Киселёв кандидат биологических наук, А. И. Глухов

Официальные оппоненты: доктор химических наук, С. Н. Кочетков кандидат биологических наук, С. Л. Кальнов

Ведущая организация: Медико-генетический научный центр

РАМН.

Защита состоится октября 1995 г.. в на заседании

Специализированного совета Д.053.05.32. при Московском Государственном Университете по адресу: 117219, Москва, Воробьевы горы, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан сентября 1995 г.

Учёный секретарь

Специализированного совета Д.053.05.32, кандидат биологических наук

М. В. Иванов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Одной из важных проблем молекулярной биологии является детекция малых количеств исследуемых ДНК и РНК. Стандартные методы детекции нуклеиновых "кислот либо очень-трудоёмки, либо требуют большого количества ДНК и РНК. Открытие метода полимеразной "цепной реакции (ПЦР) дало в руки исследователей самый чувствительный метод анализа нуклеиновых кислот. Использование термостабильных ДНК-полимераз привело к возможности автоматизировать метод ПЦР. (Sairi R. К. 1986, Krawets S. A. et al. 1989). С помощью данного метода, даже из нескольких молекул ДНК можно получить необходимое количество копий её специфического фрагмента. Кроме этого, было показано, что некоторые термостабильные ДНК-полимеразы обладают обратнотранскриптазной (ОТ) активностью (Tse W. Т., Forget В. G. 1990). Это свойство позволяет использовать данные ферменты для непосредственной детекции молекул РНК методом совмещённой обратнотранскриптазной и полимеразной реакции (ОТ/ПЦР) (Myers W. Th., Gelfand D. H. 1991), что позволило решить ряд проблем, связанных с негативным влиянием вторичной структуры РНК на эффективность синтеза кДНК. Одной из первых была изучена Taq ДНК-полимераза, выделенная из термофильной бактерии Thermus aquaticus (Saiki R. К. et al. 1988). В настоящее время ведётся поиск новых природных источников термостабильных ДНК-полимераз, обладающих рядом преимуществ по сравнению с Taq ДНК-полимеразой, например, более высокой

термостабилыюстью, способностью амплифицировать участки ДНК большей протяжённости. Проблемы детекции РНК-вирусов, изучения экспрессии генов определили поиск термостабильных ДНК-полимераз, обладающих сильно выраженной ОТ-активпостью. Анализ в клиническом материале мРНК CD-4 рецептора, через который происходит инфицирование клеток вирусом иммунодефицита человека, вызывающего СПИД, а также мРНК гена множественной лекарственной устойчивости (MDR-1) имеет большое значение с научной и медицинской точки зрения.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы была отработка метода выделения и очистки термпстабильной Tth ДНК-полпмеразы из штамма термофильной бактерии Thermus thermophilics КТП и использование полученного гомогенного препарата для подбора оптимальных условии полимеразной и обратнотранскриптазной реакции.

В задачи иследования входило:

1. Отработать процедуру выделения и очистки Tth ДНК полимеразы из штамма Т. Thermophilus КТП.

2. Исследовать оптимальные условия проведения ПЦР с Tt ДНК-полимеразой на модельной системе с использованием качестве матрицы ДНК фага А. и влияние ряда параметро (концентрации АТР и пирофосфата) на способность фермент осуществлять полимеразную реакцию.

3. Исследовать оптимальные условия проведения совмещённо ОТ/ПЦР на матрице РНК интерлейкина 2а (IL-2a), синтезирование путем транскрипции in vitro и на матрице мРНК CD-4 рецепторов составе суммарной клеточной РНК.

4. Исследовать влияние двухвалентных катионов:

Cd2+ и Мп2+ на ОТ и ПЦР стадии совмещённой ОТ/ПЦР реакции.

5. Исследовать влияние неорганической пирофосфатазы н способность фермента осуществлять совмещённую ОТ/ПЦР реакции

6. На основании проведённой оптимизации условий реакци использовать ОТ/ПЦР для детекции высокоструктуированной 16, рибосомной (рРНК) из В. Subtilis, мРНК CD-4 рецепторов в состав суммарной клеточной РНК, а также разработать метод прямог определения экспрессии гена множественной лекарственно устойчивости (MDR-1).

Научная новизна работы. Впервые выделена и очищена д гомогенного состояния нативная Tth ДНК-полимераза из штамма 1 thermophilus КТП. Этот фермент (М. в. 92 кДа), по физике химическим свойствам отличается от Taq ДНК-полимеразы (Glukho et. al. 1990) и от рекомбинантной Tth ДНК-полимеразы, описанной статье (Myers W. Th., Gelfand D. H. 1991). Отработан мето выделения фермента, позволяющий получить фермент гомогенностью 90%. Впервые показана возможность использовани данного фермента в ОТ/ПЦР реакции. Подобраны оптимальны условия проведения ПЦР и ОТ/ПЦР реакций с использованием Tt ДНК-полимеразы. На основании проведённых исследовани продемонстрирована возможность синтеза и амплификации больши фрагментов кДНК на матрице рРНК из В. Subtilis. Впервые бы предложен метод прямого определения экспресии гена MDR-1 использованием одного фермента.

Практическая значимость работы. Выполненная работа имее важное научное и практическое значение. Возможност амплифицировать непосредственно рибосомные РНК важна, т. i структура рибосомных РНК является важнейшим таксономически признаком. Возможность детекции мРНК CD-4 рецепторов поможе в исследовании популяции CD-4 позитивных клеток периферическо

крови, т. к. данные рецепторы связаны с проникновением вируса иммунодефицита в клетку человека. Прямое определение экспресии гена MDR-1 позволит быстро и эффективно следить за эффективностью хемиотерапии и составлять индивидуальные схемы лечения опухолевых больных. Высокая степень чуствителыгости и специфичности ПЦР и ОТ/ПЦР с использованием Tth ДНК-полимеразы позволит широко использовать её в детекции, -количественном анализе и клонировании клеточных и вирусных РНК.

Апробация работы. Научные результаты, представленные в диссертации были доложены на Втором Всесоюзном Симпозиуме "Теоретические и прикладные проблемы молекулярной биологии" (Самарканд, 1991), на Биотехнологической АТВ'92 конференции (Milan, 1992) и на семинаре отдела молекулярной биологии ВНЦМДЛ (Москва, 1994).

Публикация работы. Результаты исследования изложены в Г) публикациях.

Объём работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на стр машинописного текста и включает табл. и рис. Библиография включает 182

наименования, из них 172 иностранные работы.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Материалы и методы.

Фермент Tth ДНК-полимеразу выделяли из штамма-продуцента термофильной бактерии Thermus thermophilus КТП. Штамм-продуцент получен в отделе молекулярной биологии ВНЦМДЛ селективным методом (Крамаров В. М. и др.). Процедура выделения состояла из следующих стадий: разрушение клеток ультразвуком, обработка полимином П, осаждение белков сульфатом аммония и двух последовательных хроматографии: на колонке с фосфоцеллюлозой и FPLC-хроматографии на колонке с ионообменником Mono QTM HR 5/5.

Культивирование штамма термофильной бактерии Т. thermophilus КТП проводили в среде, содержащей 30 г/л агара, 2 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л триптона. После рассева культуры на чашки Петри, их инкубировали в термостате в течение 18-24 часов при температуре 70°С. Выросшие колонии переносили в

пробирки объёмом 15 мл, в каждую пробирку добавляли 5 мл средг того же состава (исключая агар) и инкубировали 16 часов при 70°С Оптическая плотность бактериальной суспензии, выращенной выше указанных условиях была равна 1.01 при длине волны 600 нь Культуру, выращенную в пробирках, вносили в колбы объёмом 85 мл, содержащие 100 мл среды вышеуказанного состава. Инкубацш проводили в режиме качания при температуре 70°С в течение часов. Биомассу собирали центрифугированием при 5000g взвешивали и хранили замороженной. Из 100 мл бактериально] суспензии получали 0.55 - 0.6 г биомассы.

Разрушение клеток ультразвуком. 20 г биомассы Thermu thermophilus КТП ресуспендировали в 40 мл буфера А, содержащег 50 мМ Трис-HCL рН 8.0, 1 мМ ЭДТА, 5мМ р-меркаптоэтанола, 0.2«; Твин-20. Суспензию обрабатывали ультразвуком: время озвучивани: 12 мин, режим озвучивания по ЗОсек с интервалами 30 сек. npi постоянном охлаждении. Полученную суспензию центрифугировал! при 100000 g в течение 2 часов при 4°С.

Обработку полимином П проводили с целью осаждения ДНК полимеразы и нуклеиновых кислот. К прозрачному супернатант; добавляли 10% полимин П (в/о) до экспериментально установлений! оптимальной концентрации. Суспензию центрифугировали н центрифуге "Beckman" с использованием ротора IA20 при 1800 об/мин в течение 20 мин при 20°С. Супернатант отбрасывали.

Осадок промывали в буфере А, разведённом в 2 раза (1/ конечного объема после добавления полимина П). Суспензш центрифугировали в вышеуказанном режиме, растворяли в 40 мл 0. M KCL и гомогенизировали при охлаждении. Суспензию оставлял на ночь при 4°С при постоянном перемешивании и дале центрифугировали в вышеуказанном режиме.

Обработку сульфатом аммония проводили, добавляя его д конечной концентрации 75%. Осадок собирали центрифугированием выше указанных условиях и ресуспендировали его в 15 мл 20 мЬ калий-фосфатного буфера рН 7.4, содержащем 1 мМ ЭДТА, 80 м! KCL.

Суспензию диализовали против буфера Б, содержащего 20 мЪ КН2РО4 рН 7.5, 0.5 мМ р-меркаптоэтанола, 5% глицерина, 0.25',

Твин-20, 80 мМ KCL в течение суток при 4°С. Зате! центрифугировали при 19000 g в течение 15 мин. при 4°С с целы осаждения нерастворившихся частиц. Супернатант сохраняли, осадок промывали буфером Б и вновь центрифугировал»

Супернатанты объединяли и измеряли ДНК-полимеразную активность и концентрацию белка.

Хроматография на фосфоцеллюлозе. 20 мл супернатанта наносили на колонку с фосфоцеллюлозой (объём 15.7 см^), предварительно уравновешенную буфером Б. Колонку промывали 2.5 объёмами буфера Б и олюйровали белки линейным градиентом 0.08 -0.4 М KCL (10 объёмами) при скорости олюцпи 20 мл/чГ В собпранных фракциях измеряли ДНК-полимеразную активность н концентрацию белка. Фракции, содержащие ДНК-полимеразу объединяли и диализовали против буфера С, содержащего 10 мМ Tpne-HCL pH 7.5 и 1 мМ |>-меркапто:)тапола.

FPLC-хроматография. Объединённую фракцию после фосфоцеллюлозы наносили на FPLC-колонку с ионообменником Mono Qlw HPi 5/5 ('Thnrmncia") объёмом 1 см^. Колонку промывали 5 объёмами буфера С и проводили элшцшо линейным градиентом 0 -0.5 М NaCL (20 объёмами). После проведения хроматографии измеряли ДНК-полимеразную активность и концентрацию белка. Фракции с ДНК-полимеразной активностью объединяли. Полученный фермент проверяли на экзонуклеазную активность и диализовали против буфера В, содержащего 10 мМ КН2РО4 pH 7.0, 100 мМ NaCL, 1 мМ ДТТ, 0.5 мМ ЭДТА, 50% глицерина. Фермент хранили при -20°С.

Трансформацию клеток Е. Coli проводили методом, описанным в литературе (Hanuhan and Moselson, 1983) с некоторыми модификациями. Компетентные клетки Е. Coli (IIBIUI, JM109) были трансформированы плазмндоЛ pGem-2, содержащий клонированный участок гена пнтерленкина 2а (IL-2a) размером 450 н. п. гюд контролем SPG промотора. Затем лидировали клетки щелочью и проводили очистку равновесным центрифугированием в градиенте хлористого цезия с бромистым этидием (Maniatis, 1984)

Транскрипция гена IL-2ct in vitro. Для получения РНК IL-2a был использован метод транскрипции in vitro (Kolosov М. I. et al., 1992). В качестве матрицы для транскрипции перользовали плазмпду pGEM-2, содержа1цую участок гена интерлейкина II a (IL-2a) с SP(i промотором (участок в 450 н. п.).

Выделение суммарноп РНК из культуры клеток. Суммарную РНК из культуры клеток выделяли описанным ранее методом (Cliomczynski P. and Sacchi N., 1987).

Гомогенность_прена р ала_РНК о 11 р< • д ел; ] .■ ш мо то д <> м

электрофореза в агарозном геле.

Активность Tth ДНК-полимеразы определяли по включению [32p]dCTP в "активированную" ДНК спермы лосося полученную по

методу (Cantoni G. L. and Davies D. K., 1966). За одну единиц; активности ДНК-полимеразы принимали включение 10 нмоль dNTP в кислотонерастворимую фракцию за 30 мин при 70°С.

Гомогенность препарата Tth ДНК-полимеразы определял! методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле присутствии SDS, по методу (Laemmli,1970). Концентрацию белка в пробах определяли по методу Лоури.

Экзонуклеазную активность ТитДНК-полимеразы рассчитывал] по степени деградации [Зн]-ДНК.

Перенос ДНК из геля на мембранные фильтры осуществлял! диффузным методом.

Гибридизационный анализ ДНК с ДНК-зондами, меченым! [32P]dNTP , проводили методом, описанном ( Maniatis, 1984)

Подбор праймеров для ПНР и ОТ/ПНР осуществляли i использованием компьютерной программы "Microgenia" фирм! "Beckman" и программу "Праймер", составленную в отдел молекулярной биологии ВНЦМДЛ. Праймеры были синтезированш на автоматическом ДНК-синтезаторе "Applied biosystem 380А" очищены электрофорезом в полиакриламидном геле или методо! FPLC

Полимеразную цепную реакцию проводили в инкубационно: смеси, конечным объёмом 50мкл, содержащей 67 мМ Трис-HCL pi 8.8 при 25°С, 16.6 мМ (NH4)2S04( 1.5 - 5.2 мМ MgCL,2, 0.02 - 0.9 мЪ каждого dNTPs, 0.1 -1мкМ каждого праймера, 2 - 8 нг ДНК фага X, - 4 ед. Tth ДНК-полимеразы. На образцы наслаивали 50 мк. минерального масла для предотвращения испарения жидкости.

ОТ-анализ. Смесь (12 мкл), содержащая 67 мМ Трис-HCL рН 8. (при 25°С), 16.6 мМ (NH4)2S04, 16 пмоль праймера RT54, 108 копи

РНК IL-2a инкубировали 5 мин при 70°С. Реакцию начинал добавлением 8 мкл смеси, содержащей 2.5 мМ MnCL2, 500 mkJ

каждого dNTPs, [H3]dTTP (80.3 Ки/ммоль) и 5 ед. Tth или Taq ДНК полимеразы. Через определенные промежутки времени реакцш останавливали добавлением раствора, содержащего 10% пирофосфа натрия и 0.5 М EDTA. Количество включенного нуклеотида считал по проценту включения метки в кислотонерастворимую фракцию.

Совмещённая ОТ/ПЦР. Стандартная инкубационная смесь дл ОТ, конечным объемом 20 мкл содержала 67 мМ Трис-HCL рН 7.(] 9.0 (при 25°С), 16.6 мМ (NH4)2S04, 0.5-3 мМ MnCL2 ( либо другог двухвалентного иона), 200 мкМ каждого dNTPs, 16 пмоль праймер для обратной транскрипции, матрицу, 5 ед. Tth ДНК-полимеразь При синтезе кДНК на матрице рРНК, для контроля, в качеств

ревертирующего фермента добавляли ревертазу AMV-RT. На поверхность наслаивали 75 мкл минерального масла и инкубировали 15 мин при 70°С в случае анализа РНК IL-2a и мРНК CD-4 рецепторов, 3 мин при 43°С и 15 мин при 7()°С в случае мРНК MDR-1 гена и 30 мин при 65°С в случае анализа рРНК. После проведения ОТ-реакцип, в пробирку под масло добавляли-80 мкл ПЦР-смеси, содержащей 67 мМ Трис-HCL рН 8.8 (при 25<'С), 1G.G мМ (NH^SC^, 0.01 с,ге Твпн-20, 1.5 мМ MgCL2 (либо MnCL2), 0.75-4.5 мМ EGTA, 200 мкМ каждого dNTPs, по 1G пмоль прапмеров. Затем образцы, конечным объемом 100 мкл амплифицировали на температурном циклере "rerkin-Elnier Cetus Instrument DNA Thermal Cycler".

Анализ продуктов ПНР и ОТ/ПЦР проводили по методу (Lor-ninw>. 19G7).

Результаты исследования и их обсуждение.

Для разрушения бактериальных клеток использовали обработку ультразвуком. По окончании озвучивания и доведении объёма полученного гомогената до 170 мл, удельная активность ДНК-полимеразы равнялась 48.57ед. акт./мг белка.

Подбор оптимальной kohii^irrpaции полимина П.

Предварительной процедуро1"1 явился подбор условии наиболее полного осаждения Tth ДПК-полимеразы иолпмнном П. Результаты данного опыта представлены в таблице 1. Видно, что концентрация полпмина П равная 0.35',с, для осаждения ДПК-полимеразы и нуклеиновых кислот является оптимальной.

Таблица 1 Подбор оптимальной концентрации полпмина II.

1 № количество % включения количество

пробы полиминаП% в кислотонер. фракцию белка мг/мл

1 0.05 3.3 4.2

2 0.10 2.9 2.8

3 0.15 2.9 2.9

4 0.20 2.1 2.8

5 2.25 2.0 1.9

G 0.30 2.0 2.1

7 0.35 1.2 1.0

8 0.40 1.9 0.9

9 0.45 3.6 1.0

10 0.50 3.7 1.1

Хроматография на фосфоаеллюлозе. На рисунке 1 приведены результаты фракционирования белков н; колонке с фосфоцеллюлозой ( профиль элюции по белку - а, I распределение активности ДНК-полимеразы по фракциям - б' Собирали 21 фракцию. Как видно из графика распределение активности, ДНК-полимераза элюируется с колонки при 0.14 - 0.15 Л

на колонке с фосфоцеллюлозой: а - профиль элюции белков с колонки_

б - распределение активности ДНК-полимеразы по фракциям_____

Интересно отметить, что Taq ДНК-полимераза элюируется с колонк: при 0.22 М KCL (Каледин и др., 1980). После объединения фракции элюированных с фосфоцеллюлозы, получали фермент, с ДНК полимеразной активностью, равной 2191.6 ед./мг

Хроматография на Mono Q HR 55. На рисунке 2 приведены результаты фракционирования белко методом FPLC на Mono Q™ HR 5/5. Как видно из рисунка, крива элюции имеет 8 пиков, ДНК-полимеразная активность был обнаружена в пиках 6 и 7 (рис. 2 б). Фермент элюировался с колоше при 0.265 М NaCL.

На рисунке 3 представлены результаты онределени гомогенности выделенного фермента. Как видно из рисунка, бы выделен .гомогенный белок, с молекулярной массой 92 кДа. Данны

фермент был использован в опытах по оптимизации условий проведения ПЦР и ОТ/ПЦР.

NaCL

ед акт

тгртязу

3000

2000

2 4 6 6 10 1214 "16 18 20

Рисунок 2. FPLC-Хроматография белков объединённой фракции белков,

полученной после хроматографии па колонке с фосфоцеллюлозой, на колонке с Mono Q™ 5/5. а - профиль элюции белков -—-—

б. - распределение активности ДНК-лолнмеразы по фракциям____

1 2

Ъашё ~94

*т

67

43

- 30

Рисунок 3. Анализ гомогенности препарата фермента Tth ДНК-полимеразы методом SDS-электрофореза в 10% полиакриламидном геле. 1-5 ед. Tth ДНК-полимеразы, 2 - стандарты молекулярной массы белков (Pharmacia).

Результаты выделения Tth ДНК-полимеразы суммированы в таблице 2.

Таблица 2. Стадии очистки Tth ДНК-полимеразы.

Стадия очистки Суммарная акт-ть, ед. Кол-во белка ,мг Удельн. активн, ед./мг Степень очистки

Суспензия клеток обработанная ультразвуком 57800 1190 48.57 -

Фракционирование полимином П и сульфатом аммония 13289 194 68.5 1.4

Хроматография на фосфоцеллюлозе 6575 2.91 2259.4 46.5

FPLC хроматография на Mono Q. 6000 0.3 20000 411.8

Подбор оптимальных условий ПЦР с ТШ ДНК-полимеразой осуществляли на модельной системе, используя в качестве матриць ДНК фага Я. Использованные нами праймеры представлены 1 таблице 3.

Таблица 3. Праймеры, используемые для ПЦР.

npaiiMep последовательность участок на Х-ДНК

Lamp 1 GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG 7131-7155

Lamp 2 GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC 7606-7630

Lamp 3 TTCCCAGCCACACGCTGCATGACAT 8377-8401

Lamp 4 CTGCATCAGCACATCATCTTCAGGC 10375-10399

Lamp 5 CCTCCTTCGTGAAGACAAACTCACC 12801-12825

Lamp 6 TCGATCACACTCAGCAACTGCGTGG 15563-15587

Lamp 7 TCAGATGACTCACACCGGTATCCCC 19106-19130

В данной работе мы исследовали влияние различны: концентрации в инкубационной смеси при постоянно!

концентрации каждого сШТР, равной 0.2 мМ. При этом, на основани! статистических экспериментов мы обнаружили, что оптимально значение

для данной ПЦР-системы равно 1.8' Согласно литературным данным (За1И К К., 1989), в инкубационно смеси, при концентрации равной 1.5 мМ и обще

концентрации сШТРб, равной 0.8 мМ, концентрация не связанного сШТРз 1^2+

составляет 0.8 мМ. В связи с этим, необходимо пр увеличении концентрации сШТРз, увеличивать концентрацию в инкубационной смеси. Мы нашли, что при постоянном соотношени Ь^+ДШТРз,

равном 1.87, увеличение концентрации каждого сШТР 11

до 0.9 мМ наблюдается снижение выхода ПЦР-продукта за счёт неспецифического синтеза ДНК. Ингибирование ПЦР-системы наблюдается также при уменьшении концентрации dNTP 0.05 мМ и ниже (данные не приведены). Следовательно, эффективность ПЦР-амплификации зависит, с одной стороны, от концентрации комплекса [Mg-dNTPs], влияющего на активность ДНК-полимеразы.-С другой стороны, в инкубационной смеси должно быть достаточно свободного иона вероятно, для стабилизации структур матрицы и

праймера, для эффективного образования комплекса [праймор -f матрица].

Оптимальное значение ионной силы (I) для данной ПЦР-системы соответствует 0.08 (линия 3). При увеличении I до 0.2 наблюдалось полное ингибирование выхода специфического ПЦР-продукта. Таким образом, 'при подборе условий ПЦР необходимо учитывать вклад компонентов смеси

dNTPs и другие солевые добавки) в

ионную силу раствора.

Оптимальное значение рН для данной ПЦР системы с использованием Tth ДНК-полимеразы, равно 8.8. При значении рН равном 7.5 наблюдалось заметное снижение выхода ПЦР-продукта, а при значении рН, равном 7.0 - практически полное ингибирование.

Оптимальное количество Tth ДНК-полимеразы соответствует 22.5 ед. активности фермента на 50 мкл. В случае добавления большего количества фермента наблюдается появление неспсцифического фона ДНК в виде "шмера" (данные не приведены).

Использование для ПЦР избытка ДНК-матрицы может также привести 1С искажению вида специфического фрагмента ДНК в агарозном геле. Оптимальная концентрация каждого н:з пары ираймеров для ПЦР с Tth ДНК-полимеразои, определённая для данной системы, составляет 0.3 мкМ, что соответствует молярному соотношению праймер/матрица, равному 5x10^.

В работе мы исследовали влияние различных концентраций АТР и PPj на эффективность ПЦР. Согласно литературным данным.

интенсивность синтеза ДНК, осуществляемого ДНК-полимеразой и, повышается при добавлении пирофосфата в реакционную среду (Doublrclay О. P. ct al., 1983), (Abbott J., 1985). Это может происходить за счёт участия пирофосфата в механизме коррекции синтеза ДНК, при удалении ошибочно включённого нуклеотпда в З'-положении праймера за счет пирофосфоролиза (Doublrday О. P. et al., 1883). С другой стороны, PPj, как продукт реакции полимеризации, может оказывать ингибирующее действие на синтез ДНК. Кроме того, известно, что активность многих ДНК-полимераз а стимулируется АТР. АТР увеличивает сродство ДНК-полимеразы к ДНК (Lawton К.

е1 а1., 1984), повышает стабильность комплекса [фермент +ДНК] стимулирует полимеризацию, процессивность и другие параметрь синтеза ДНК (Ргеуага Р., 1984), (Б1оеп Е. Т., 1984).

Рисунок 5. Влияние различных концентраций пирофосфата (а) и АТР (б) г выход ПЦР-продукта (указан стрелкой). Проводили 20 циклов ПЦ! В качестве матрицы использовали 2 нг ДНК фага Я. 1=0.С Представлены фотографии 1.2% агарозного геля, содержащя бромистый этидий. а) реакционные смеси содержали различнь концентрации РР; (мМ): 1 - контроль (отсутствие PPj), 2 - 0.03, 3 0.06, 4 - 0.125, 5 - 0.25, 6 - 0.5. б) реакционные смеси содержа! различные концентрации АТР (мМ): 1. - контроль (отсутствие АТГ 2 - 0.015, 3 - 0.03, 4 - 0.06, 5 - 0.125, 6 - 0.25, 7 - 0.5, 8 - 1.0 На рисунке 5, а представлены результаты влияния различны концентраций PPj на эффективность выхода ПЦР-продукта. Видн что присутствие РР} в реакционной среде, в концентрации от 0.03 ; 0.125 мМ (линии 2, 3 и 4) не приводят к увеличению выхо; специфического ПЦР-продукта по сравнению с контролем (линия ] Ингибируюхцее действие РР; на эффективность ПЦР-амплификацг наблюдалось при его концентрации, равной 0.25 мМ (линия 5). Пр концентрации PPj выше 0.25 мМ наблюдалось практически полн< ингибирование выхода ПЦР-продукта (линия 6). Нужно отметит что ингибирование пирофосфатом синтеза ДНК показано для цело ряда ДНК-полимераз (Berg Р., 1963). Аналогичный эффе] наблюдали при добавлении АТР в реакционную среду (рисунок 5, i Заметное ингибирование выхода специфического ПЦР-продук наблюдалось при концентрации АТР, равной 1 мМ (линия 8). Скор всего, АТР и пирофосфат ингибируют ПЦР-амплификаци конкурируя с dNTPs за место связывания на ферменте.

На основании проведённых нами исследований по оптимизации условий ПЦР с ТШ ДНК-полимеразой, были амплифицированы специфические участки ДНК, размером от 500 до 12000 п. н. (рисунок С). При этом, реакционная смесь для ПЦР содержала: 67 мМ Трис-НСЬ рП 8.8 при 25°С, 16.6 мМ (N114)2504, 0.01% Твин-20 1.5мМ МеСЬг, 0.2 мМ каждого еЗМТРз, 0.3 мкМ.каждого праймера, 1-2 нг ДНК фага X, 2.5 ед. Т1Ь ДНК-полимеразы. Температурный режим циклов ПЦР был следующий: 1 мин. - 94°С, 1 мин. - 56°С, 2.5 мин -72°С (для последнего цикла - 7 мин)

1 2 3 4 6 5 7

21760 5129 3550

1 9 04 1 5 48 1375

947 831

ии*

11999

8457 5695 | 3269

12 71

500

Рисунок 6. ПЦР-амплификация с использованием Tth ДНК-полимеразы специфических фрагментов ДНК фага X различной длины. В качестве маркеров использовали ДНК А. /' ЕсоШ и Hind III. 1=0.08. Проводили 20 циклов ПЦР. Представлены фотографии 1.2% , агарозного геля, содержащего бромистый этидий.

Таким образом, нативная Tth ДНК-полимераза может эффективно синтезировать фрагменты ДНК достаточно больших размеров. Следующим этапом работы явилось изучение возможности использования Tth ДНК-полимеразы в совмещённой ОТ/ПЦР реакции.

Подбор оптимальных условий для проведения ОТ/ПЦР реакции (прежде всего для ОТ-стадии) проводили на матрице РНК, синтезированной путём транскрипции in vitro участка гена IL-2a и на природной мРНК CD-4 рецепторов.

Для характеристики ОТ-активности была получена зависимость количества включенного [H^jdTTP в кислотонерастворимую фракцию от времени инкубации для Taq ДНК-полимеразы и Tth ДНК-полимеразы (рисунок 7). В реакции обратной транскрипции использовали праймер RT54. Как видно из рисунка 7, начальная скорость ОТ-реакции, а так же максимальное количество [H3]dTTP,

включенного в кислотонерастворимую фракцию у Tt.li ДНР полимеразы выше, чем у Тая ДНК-полимеразы. В данной систел использовали Мп2+ в качестве двухвалентного катиона. Как видг из рисунка 7, после 10-и минутной инкубации кривая включеш: метки в кислотонерастворимую фракцию выходит на насыщение.

Нужно отметить, что при концентрации ТЬЬ ДНК-полимеразы единиц на пробу обеспечивается достаточно высокий уровень ОТ активности, что даёт возможность и обратную транскрипцию, и ЛЦ реакцию (ОТ/ПЦР) проводить в одной пробирке без повторно: добавления фермента.

Таблица 4. Праймеры, используемые в совмещённой ОТ/ПЦР реакции.

РНК В. ЗиЫШэ

пр. 291 ААСОАССТОАТССАОССОСАССТС 1514-1539

пр. 289 АОАСТТТаАТССТСССТСАС 14-34

кДНК 1Ь-2сс

ЛТ54 АСТССТООАТТТАСАОАТОАТТТГО-ААТСО 54-84

пр.355 САААТТСТАСААТООТТОСТСТСТС-АТСАС 335-325

кДНКМБ11-1

мот ' ТАСАСТССААТТООТССТСС 776-795

МБиг ОТТАССТТССААССАССТОТ 1049-1068

МБИЗ АССТСАСАСТССААОААСАО 1091-1111

кДНК СБ-4

АШ САССОАААСАААОТОСТССТОООС-ААА 145-174

АИ2 аОТСАОССТСАОССТСТаССССТОА-АйСАС 472-501

АИЗ (БЫА РгоЬе) ОАСССАООАААСТТСССССТО 336-357

В данной работе мы исследовали влияние рН на эффективное!1! ОТ/ПЦР. Максимальный выход специфического ОТ/ПЦР-продукт; наблюдается при рН 8.8. При рН ниже 8.0 наблюдается снижешк эффективности ОТ/ПЦР при работе с РНК 1Ь-2а и практически полное ингибирование ОТ/ПЦР при использовании в качестве матрицы' суммарной клеточной РНК, содержащей мРНК СО-рецепторов.. Интересно отметить, что значение оптимального рН дл; системы с искуственной РНК совпадает со значением рН полученном в опыте с природной РНК. Вероятнее всего - э'п оптимальное значение рН для проведения ревертазной реакции с

Tth ДНК-полимеразой. Необходимо отметить, что оптимальное

Рисунок 6. Обратная транскрипция с использованием Tth ДНК-полимеразы и Taq ДНК-полимеразы ("Cetus"). Смесь для ОТ-реакции конечным объемом 20 мкл содержала 67 мМ Трис-HCL рН 8.8 (при 25°С), 16.6 мМ (NH4)2S04, 16 пмоль праймера RT54, 2.5 мМ МпСЬг, 500

мкМ каждого dNTPs, [H3jdTTP (80.3 Gi/ммоль), 10s копий РНК IL-2« л 5 ед. Ttli ДНРС-полпмеразы, Представлен график включения |H^jdTTP в кпслотонерастворимую фракцию в зависимое'! и от времени ОТ-реакции.

В данной работе мы подобрали оптимальное соотношение Me~+/dNTP.s для четырех двухвалентных ионов - Mg2+, Cd2+, Cu2 + и Мп2+ для ОТ/ПЦР па матрице синтетической РНК IL-2a. Tth ДНК-иолпмераза синтезирует к ДНК более эффективно в присутствии Мп2+, а не Mg2+. Это согласуется с литературными данными о том, что при использовании рекомбинантной Tth ДНК-полимеразы (Myers Т. W., liJ(Jl), ион Мп2+ более эффективен в ОТ-реакции, чем Mg2+. .При использовании Mg2+ в качестве двухвалентного иона, максимальная эффективность ОТ/ПЦР наблюдается при соотношении Mg2+/dNTPs равном 3.75. В данной системе, при использовании Си или Cd^^B качестве

двухвалентного катиона, необходимо использовать молярное соотношение Me'^/dNTPs от 1.88 до 2.5, тогда как при использовании Мп2+ - только 1.25-1.88. Использование ионов Со2+ в совмещенной ОТ/ПЦР не эффективно.

При проведении ОТ/ПЦР на матрице суммарной клеточно РНК, содержащей мРНК CD-4 рецепторов, использование ино Cd2+, Cu2+ и Со2+ вместо Мп2+на ОТ-стадии ОТ/ПЦР оказалос не эффективным. Возможно, что в случае использования 1м1 концентрации Си2+, или Cd2+ или Со2+ не достаточно дл дестабилизации сложной вторичной структуры мРНК CD-рецепторов (косвенным подтверждением этого предположени является оптимальная концентрация Cu2+, Cd2+, определённая дл системы искуственной РНК lL-2a). Однако,не исключено, что пр повышении концентрации двухвалентных катионов, може наблюдаться гидролиз РНК ионами двухвалентных металлов (Browr 1974) и их гидроокисями, присутствующими в среде инкубации. Зт особенно важно для природных РНК. Оптимальная концентраци концентрации Мп2+ для данной ОТ/ПЦР-системы составила 1 ыЬ что соответствует молярному соотношению Mn2+/dNTPs 1.25.

Интересно отметить, что при проведении ПЦР-стадии ОТ/ПЦ1 соотношение Mg2+/dNTPs равное 1.87 является оптимальным ка для данной ПЦР-системы, так и для ПЦР-системы, где в качеств матрицы использовали ДНК фага X. При использовании на стади ПЦР ионов Мп2+происходит понижение эффективности ОТ/ПЦ] Кроме того, Мп2+ может оказывать негативное влияние на точност синтеза ДНК (Вескшап R. А., 1985). Таким образол предпочтительнее использовать в ОТ-стадии и Mg2+ в ПЦБ

стадии ОТ/ПЦР реакции.

Подобрав оптимальные условия проведения ОТ/ПЦР реакцш мы исследовали чуствительность ОТ/ПЦР системы с использование Tth ДНК-полимеразы.

На рисунке 8 представлена чувствительность метода ОТ/ПЦ на матрице синтетической РНК IL-2a. Как видно из рисунка, выхо продукта ОТ/ПЦР наблюдался при использовании

103 копий РН:

IL-2a в качестве матрицы (линия 5). Необходимо отметить, что пр использовании рекомбинантной Tth ДНК-полимеразы, преде чувствительности был 10^ копий искуственной РНК (Myers Т. W Gelfand D. Н., 1991). Интересно отметить, что специфический продук мы получали в том случае, когда реакционная смесь для ОТ-реакци была разбавлена реакционной смесыо для ПЦР не менее, чем в 5 ра Для дополнительного доказательства того, что специфически продукт - это амплифициро'ванная кДНК, синтезированная и матрице РНК IL-2a , " проба с РНК была предварительи проинкубирована с РНКазой А, специфического продукта ОТ/ПЦ

при этом не на. :,алось (линия 6). Это подтверждает отсутствие примесей ДНК в РНК-матрице.

1 2 3 4 6 6 7

Рисунок 8. Совмещенная ОТ/ПЦР с использованием ТШ ДНК-полимеразы на матрице РНК 1Ь-2а. ОТ-стадию проводили, используя праймер НТ54. Амплификацию проводили с использованием пары праймеров КТ54/355, Стрелкой указвано положение специфического продукта ОТ/ПЦР размером в 301 п. н. при различных концентрациях РНК 1Ь-2а: 2 - 10^ копий, 3 - 10' копий, 4 - 105 копий, 5 - 10^ копий. В качестве маркеров молекулярного веса использовали рВК322, обработанную А1и1. Представлена фотография 1.5% агарозного геля оокрашенного бромистым этидием.

На рисунке 9 представлена чувствительность метода ОТ/ПЦР на матрице суммарной клеточной РНК, содержащей мРНК СБ-4 рецепторов. Как видно из рисунка, 20 нг суммарной РНК, выделенной из клеточной линии Н9, после проведения ОТ/ПЦР с ТШ ДНК-полимеразой дают видимую полосу в агарозном геле (линия 1). Эффективность ОТ/ПЦР с использованием нативной ТИт ДНК-полимеразы и гТШ ДНК-полимеразы примерно одинакова (линии 6 и 8 соответственно). Однако, необходимо подчеркнуть, что сравнение проводилось лишь при концентрации матрицы (суммарной РНК, выделенной из клеточной линии Н9) равной 400 нг. Возможно, различия в чувствительности реакции с данными ферментами могут возникнуть при использовании более низких концентраций суммарной РНК. Это может быть предметом дальнейших исследований. При использовании в качестве матрицы ДНК, выделенной из тимоцитов, специфического продукта не наблюдалось (линияП). В качестве контроля на специфичность синтеза кДНК ОТ-стадия была проведена с праймером, комплементарным к кДНК, а' не к РНК (линии 8 и 10 для ТШ и гТ1Ь соответственно). Отсутствие специфического продукта показывает, что в нашей системе данный

специфический продукт является результатом амплификаци именно к ДНК, полученной с РНК-матрицы.

1 2 3 4 Б 6 7 8 9 10 11 12

356—4

- 910

- 6 55 + 1 -52 1

-40 3

1-28 1

Рисунок 9. Совмещенная ОТ/ПЦР на матрице мРНК СБ-4 рецепторе ОТ/ПЦР проводили, используя ТЧЬ ДНК-полимеразу (линии 2-гИЬ ДНК-полимеразу фирмы "Се1из" (линии 9, 10) .В качест матрицы использовали мРНК СО-4 рецепторов (линии 2-10) суммарную ДНК из тимоцитов (линия 11). Синтез кДЕ проводили, используя лраймер АП2 (линии 2-7) и праймер А] (линии 8,10), амплификацию кДНК - с использованием па{ праймеров АЙ2/АШ. Пробы содержали различное количест мРНК СИ-4 рецепторов: 1 - 0.02 мкг, 2 - 0.025 мкг, 3 - 0.05 мкг, . 0.1 мкг, 5 - 0.2 мкг, 6, 8, 9, 10 - 0.4 мкг. Проба 11 - 0.1 м суммарной ДНК из тимоцитов. В качестве маркеров использова рВИ322, обработанную А1и1 (линия 12) и Тад1 (линия Представлены фотографии агарозных гелей, окрашешн бромистым этидием. Стрелкой указан продукт ОТ/ПЦР размер 356 п. н.

В данной работе было изучено влияние термостабильи неорганической пирофосфатазы на эффективность ОТ/ПЦР. I рисунка 10, а видно, что добавление 0.20 и 0.25 ед. неорганическ пирофосфатазы в реакционную смесь (линии 2, 3 соответственн увеличивает эффективность ОТ/ПЦР по сравнению с контрол! (линия 1). Данный эффект можно объяснить тем, что пирофосфата удаляет РР| из сферы реакции и, тем самым, увеличивает скорос полимеразной реакции. Это согласуется с полученными на] данными о том, что РР{ оказывает ингибирующее действие эффективность ПЦР (см. стр. 13). Поскольку пирофосфат являет продуктов как полимеразной, так и обратнотранскриптазн реакции, можно предположить, что он оказывает ингибируюш действие на ОТ-стадию реакции. Причём пнгибирующий эффект Р

оказывается сильнее при проведении большего числа циклов ПЦР. Поэтому при добавление неорганической пирофосфатазы в инкубационную смесь ОТ/ПЦР эффект её действия более выражен. Гибридизация с меченым 32Р ДНК-зондом демонстрирует специфичность полученного продукта (рисунок 10, б) ОТ/ПЦР реакции, - - .

а 1 2 3 4 6

6Э

356

Рисунок 10. Влияние неорганической пирофосфатазы на совмещенную ОТ/ПЦР с использованием Tth ДНК-полимеразы и на матрице мРНК CD-4 рецепторов. Синтез кДНК проводили, используя праймер AR2, амплификацию кДНК - с использованием пары праймеров

AR2/AR1. Представлены фотография 1.5% агарозного геля, окрашенного бромистым этидием. Стрелкой указан продукт ОТ/ПЦР размером 356 п. н. а) Пробы содержали различное количество неорганической пирофосфатазы: 1 - контроль (без пирофосфатазы, 2 - 0.20 ед., 3 - 0.25 ед. В качестве маркеров использовали pBR322/ A!ul. б) Гибридизация продуктов ОТ/ПЦР (см. гель а) по Саузерну с меченым 32Р зондом AR3.

' (Радиоавтография мембранного фильтра) Итогом проведения оптимизации условий ОТ/ПЦР явились: синтез и амплификация высокоструктуированной рибосомной РНК (рРНК) и определение экспрессии гена множественной лекарственной устойчивости (MDR-1).

На рисунке 11 представлены результаты ОТ/ПЦР реакции на матрице 16S рибосомной РНК из В. subtilis.. Видно, что

обратнотранскриптазная активность Tth ДНК-полимеразы (линия 1) сравнима с активностью мезофильной ревертазы AMV-RT (линия 3). В результате ОТ/ПЦР были синтезированы два фрагмента: 1506 п. н. и 800 п. н., являющиеся результатом наличия двух мест посадки праймера 291 на матрице 16S рРНК. При использовании AMV-RT, наблюдаютя две дополнительные полосы, меньшей молекулярной массы, чем специфические фрагменты (линия 3). При использовании термостабильного фермента неспецифических полос практически не "

наблюдается, что может являться результатом того, что ОТ-стади проводится при повышенной температуре. При этом, боле эффективно дестабилизируется сложная вторичная структура качестве контроля, рРНК была предварительно обработан РНКазойА (линии 2 и 4). Инкубация с РНК проводилась в течение 1 мин. (линия 4) и в течение 60 мин. (линия 2). Результаты контрол показывают, что данные фрагменты синтезированы с рРНР матрицы, а не с геномной ДНК. Необходимо отметить, что пр амплификации кДНК 16Б рРНК , в отличие от предыдущи экспериментов, был использован - трёхтемпературный профит ПЦР:1мин. - 95°С, 1 мин. - 55°С, 2.5 мин. - 72°С ( для первого цикл 7 мин, для последнего - 10 мин.) , , ч . .

10,000 • 1,000

1506800-

-1,000

-300

Рисунок 11. Совмещенная ОТ/ПЦР на матрице 16Б рибосомной РНК из зиЫШз. ОТ/ПЦР проводили, используя Т1Ь ДНК-полимера (линии 1, 2, 4) и АМУ-РГГ (линия 3). Синтез кДНК проводил • используя праймер 291, амплификацию кДНК - с использоватк пары праймеров 291/289. Контроль: РНК, обработанная РН-азой в течение 60 мин. (линия 2) и 10 мин. (линия 4) Представле1 фотография 1.4% агарозного геля, окрашенного бромисть этидием. Стрелкой указаны продукты ОТ/ПЦР размером 1506 п. и 800 п. н.

В данной работе нами предложен быстрый и эффективнь метод определения экспрессии 1УГОК-1 гена, кодирующего .' гликопротеин, оказывающий влияние на лекарственна устойчивость раковых клеток человека.

На рисунке 12 представлены результаты ОТ/П1 амплификации суммарной клеточной РНК, выделенной человеческой клеточной линии БКУЬВ, содержащей мРНК МБИ-Специфические олигонуклеотидные праймеры были подобра! таким образом, что праймеры, комплементарные РНК имё. различные места посадки на матрице, а праймер, комплементарш кДНК - одно место посадки. Таким образом, мы получили специфических фрагмента: 282 п. н. (линия 1) и 335 п. н. (линия

12345 6 7 8 М

— 910 |

— 655+6591

— 521

— 4^03

— 2 81

Рисунок 12. ОТ/ПЦР реакция на матрице мРНК ШЭ11-1 гена в составе суммарной клеточной РНК. В качестве матрицы использовали суммарную клеточную РНК клеточной линии БКУЬВ, (литт 1-4, 7, 8) и суммарную клеточную РНК МТ-4 (линии 2, 4). ОТ-стадию проводили с использованием праймеров: ЛГОШ (линия 2, 4), ЛГО112 (линии 1, 5, 7), ЛГОНЗ (линии 3, 6, 8). ПЦР-стадию проводили с парами праймеров МХШ/МОШ (линии1, 2, 5, 7), МБИЗ/МОШ (линии 3, 4, 6, 8). В качестве контроля от ДНК-контаминаций, смесь ОТ-реакции инкубировали при 4°С, а затем амплифицнровали (линии 7, 8). Представлена фотография 1.5% агарозного геля, окрашенного бромистым этидием. Стрелками указаны специфические продукты: 282 п. н. (линия 1) и 335 п. н. (линия 3).

Наличие в геномной ДНК интронной области в 540 п. н. между участками связывания праймеров, исключает получение специфических продуктов данной величины с геномной ДНК, в области гена МОГ{-1. Для контроля мы провели реакцию, используя в качестве матрицы суммарную клеточную РНК, выделенную из клеточной линии МТ-4, не содержащую мРНК МОЛ-1 гена. Как видно из рисунка 4, появление специфического продукта не наблюдалось (линии 5, С). Отсутствие специфического фрагмента после инкубации смеси для ОТ-реакции при 4°С и последующего проведения ПЦР-стадии (линии 7 и 8) демонстрирует нам тот факт, что с данными праймерами в ОТ/ПЦР не происходит амплификации геномной ДНК, которая может частично присутствовать в образце РНК. Результаты проведенных экспериментов показывают, что продукт ОТ/ПЦР образовался в результате синтеза кДНК на матрице РНК и последующей амплификации кДНК, и что Т1И ДНК-полимераза амплифицирует мРНК МБР1-1 с довольно высокой чуствительностью и специфичностью в данных условиях. Для проведения ревертазной реакции, мы использовали результаты оптимизации, описанные ранее. Для проведения совмещенной

ОТ/ПЦР реакции с мРНК MDR-1 был использова трёхтемпературный профиль ПЦР (30 сек. - 95°С (последний цикл мин.), 1 мин. - 43°С, 1.5 мин. - 72°С (для первого - 10 мин, дл последнего - 7 мин.)). Такое изменение связано, прежде всего, с сравнительно низкой температурой отжига выбранных праймеро (43°С), тогда как элонгацию цепи ДНК необходимо проводить пр 72°С. Описанный нами метод позволяет быстро и эффективн анализировать наличие мРНК MDR-1 гена в клеточном материале.

Таким образом, термостабильная Tth ДНК-полимераз позволяет проводить совмещенную ОТ/ПЦР реакцию на различны матрицах РНК. Эта реакция отличается высокой чуствительностью специфичностью, при этом, Tth ДНК-полимераза более эффективн осуществляет ревертазную реакцию, чем Taq ДНК-полимераза. Вс это позволяет надеятся на использование данного термостабильног фермента в молекулярной биологии и медицине.

ВЫВОДЫ.

1. Отработана методика получения гомогенного препарата нативно Tth ДНК-полимеразы из штамма Т. Thermophilus КТР.

2. Показана возможность использования нативной Tth ДНР полимеразы в полимеразной цепной реакции. Исследован эффективность катализа ПЦР в зависимости от соотношени компонентов реакционной смеси. Подобраны оптимальные услови амплификации участков ДНК высокой протяжённости.

3. Показана возможность использования нативной Tth ДНЬ полимеразы осуществлять совмещённую реакцию обратно транскрипции и амплификации (ОТ/ПЦР) на матрицах РНК присутствии ионов Мп2+. Исследовано влияние двухвалентны катионов на ОТ/ПЦР.

4. Установлено, что АТР и РР; оказывают ингибирующее действие г

способность Tth ДНК-полимеразы катализировать полимеразну реакцию. При этом показано, что неорганическая пирофосфатао оказывает стимулирующее действие на ОТ/ПЦР.

5. Разработаны эффективные тест-системы детекции рибосомной 16

РНК из В. subtilis и мРНК CD-4 рецепторного белка, а так же I гликопротеина, играющего ключевую роль в процесса множественной лекарственной устойчивости клеток.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Глухов А. И., Трофимова М. Е., Гордеев С. А., Гребенникова Т. В.,

Виноградов С. В., Киселёв В. И., Крамаров В. М. Амплификация последовательностей ДНК фага X методом полимеразной цепной

реакции с использованием термостабильной Tth , ДНК-полимеразы. Молекулярная биология. 1991, Т. 26, с. 1602-1609.

2. Трофимова М. Е., Гребенникова Т. В., Гордеев С. А., Глухов А. И.,

Грабовецкпй В. В. Оптимизация условий проведения полимеразной цепной реакции с Tth ДНК-полимеразой: Второй Всесоюзный Симпозиум " Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии", Тезисы докладов, с. 194, Самарканд.

1991.

3. Glukhov A. I., Grebennikova Т. V., and Kiselev V. I. Use of Thermostable Tth DNA Polymerase in RNA detection by coupled RT/PCR reactions. ATB'92 conference, Milan. November 24-27,

1992.

4. Глухов А. И., Гребенникова Т. В., Киселёв В. И., Северин Е. С. Использование термостабилыюй ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus КТП в совмещённой реакции обратной транскрипции и амплификации для детекции мРНК CD-4 рецепторов. Молекулярная биология, (в печати), 1995.

5. Гребенникова Т. В., Глухов А. И., Чистякова JI. Г., Киселёв В. И.,

Северин Е. С. Использование термостабильной ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus КТП в совмещённой реакции обратной транскрипции и амплификации для детекции РНК интерлейкина 2и. и определение окспресии гена множественной лекарственной устойчивости. Молекулярная биология, (в печати), 1995.