Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Модификация термостабильных ДНК-полимераз для повышения эффективности синтеза ДНК

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Игнатов, Константин Борисович

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Принципы пространственной организации и механизма действия полимеразного домена ДНК-полимераз

2.1.1. Типы ДНК-полимераз

2.1.2. Принципы пространственной организации полимеразного домена

2.1.3. Механизм ферментативного синтеза ДНК. Субдомены «ладонь» и «пальцы»

2.1.4. Субдомен «большой палец»

2.2. ДНК-полимеразы, используемые в генной инженерии и области их применения

2.2.1. ДНК-полимеразы из мезофильных организмов

2.2.1.1. ДНК-полимераза IЕ. coli, Фрагмент Кленова и ДНК-полгшераза фага Т4.

2.2.1.2. РНК-зависимые ДНК-полимеразы

2.2.1.3. Секвенирование ДНК по методу Сенгера. ДНК-полимераза фага Т7 и ее модификации

2.2.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

2.2.3. Термостабильные ДНК-полимеразы

2.2.3.1. ДНК-полимераза I Thermus aquaticus (Тaq-полимераза) и ее модификации

2.2.3.2. ДНК-полимераза I Thermus thermophilus (Tth-полимераза)

2.2.3.3. Термостабильные ДНК-полимеразы с 3'-5' экзонуклеазной активностью (Vent- и Pfu- полимеразы)

2.2.3.4. Ферментативные смеси для ПЦР-амплификации длинных последовательностей ДНК

Введение Диссертация по биологии, на тему "Модификация термостабильных ДНК-полимераз для повышения эффективности синтеза ДНК"

4.2. Влияние некомплементарных нуклеотидов в структуре праймера на способность Tth, Taq и Klentaq ДНК-полимераз элонгировать цепь ДНК 72

4.2.1. Специфичность амплификации ДНК Taq и Tth ДНК-полимеразами 72

4.2.2. Способность Klentaq, Taq и Tth ДНК-полимераз элонгировать цепь ДНК при наличии в З'-концевой области праймера некомплементарного нуклеотида 75

4.2.3. Испопользование Tth полимеразы для амплификации ДНК с праймерами, содержащими некомплементарные нуклеотоды 81

4.2.4. Смеси полимераз, содержащие Tth полимеразу и их испопользование 84

4.3. Связь субдомена "большой палец" Taq и Tth полимераз со спсобностью этих ферментов синтезировать последовательности ДНК большой длины 89

4.3.1. Конструирование гибридных полимераз Ttaq и Teco 89

4.3.2. Полимеразная активность ферментов при различных значениях температуры и концентрации Mg2+ 94

4.3.3. Способность Taq, Tth и Ttaq полимераз амплифицировать фрагменты ДНК различной длины в ПЦР 96

4.3.4. Способность полимераз осуществлять синтез цепи ДНК после

3'-некомплементарного нуклеотида 98

4.4. Модификация Klentaq ДНК полимеразы для повышения эффективности синтеза ДНК 101

4.4.1. Анализ замещений аминокислотных остатков при создании

Ttaq полимеразы 101

4.4.2. Влияние замещения Ser543 на Asn в большом фрагменте Taq полимеразы (Klentaq) на эффективность синтеза ДНК 103

4.4.3. Сравнение способности Klentaq и KlentaqN ДНК-полимераз элонгировать цепь ДНК при наличии некомплементарного нуклеотида на 3'-конце 105

4.4.4. Влияние структуры матрицы на эффективность синтеза ДНК Klentaq и KlentaqN ДНК-полимеразами 108

4.5. Заключение 112

5. Выводы 115

6. Список использованной литературы 117

1. Введение

Логично предположить, что одной из первых ферментативных активностей, появившихся в процессе возникновения жизни, была полимеразная активность, присущая полинуклеотид-полимеразам. Действительно, важнейшим этапом жизнедеятельности живого организма является передача заключающейся в ДНК (или РНК) генетической информации потомству. Этой цели служит процесс репликации, в ходе которого происходит точное копирование цепей ДНК. В процессе репликации принимают участие многочисленные белки, среди которых главную роль играют ДНК-полимеразы. Их основной функцией является матрично-зависимый синтез ДНК путем последовательного включения четырех сИЧТР в дочернюю цепь по принципу комплеметарности Уотсона-Крика.

ДНК-полимеразы - ферменты, ковалентно присоединяющие дезоксинуклеозидтрифосфаты (сШТР) в форме дезоксинуклеозидмонофосфатов (сЙЯМР) к растущей цепи ДНК за счет образования фосфодиэфирной связи между 3'-гидроксилом затравочного и 5'-фосфатной группой полимеризуемого нуклеотидов. Всем ДНК-полимеразам (как прокариотическим, так и эукариотическим) присущ ряд общих свойств, как то:

1. Включение в элонгируемую цепь ДНК остатка сЮТР, комплементарно соответствующему нуклеотиду матрицы, с одновременным гидролизом альфа-бета фосфодиэфирной связи в присутствии кофакторов (ионов двухвалентных металлов).

2. Требование затравки, для инициации матричнозависимого синтеза ДНК, -комплементарного матрице олигонуклеотида ДНК или РНК, так называемого праймера, со свободной гидроксильной группой на 3' конце.

3. Все ферменты катализируют полимеразную реакцию в направлении 5'-3' растущей дочерней цепи.

Суммарная реакция, катализируемая ДНК-полимеразой: (dNMP)n + dNTP = (dNMP)„+i +PPi

Доказательство этой химической схемы и выделение первой ДНК-полимеразы - ДНК-полимеразы 1 из E.coli принадлежит Корнбергу с сотрудниками [1]. Открытие ДНК-полимераз легло в основу теории биосинтеза ДНК. Значение этих работ было по достоинству оценено научным сообществом. За открытие ДНК-полимераз Артуру Корнбергу была присуждена Нобелвская премия.

Изучение полимераз продолжается уже более сорока лет. Неослабевающий интерес к этим ферментам связан не только с тем, что они вовлечены в важнейшие биологические процессы, но и с их широким использованием в генной инженерии и молекулярной биологии. Среди важнейших областей применения полимераз можно упомянуть секвенирование ДНК по методу Сенгера [2] и полимеразную цепную реакцию (ПЦР) [3]. Большое значение для этих целей имеют полимеразы, выделенные из термофильных организмов [4], особенно, Taq ДНК-полимераза из Thermus aquaticus YT-1 и Tth ДНК-полимераза из Thermus thermophilus НВ-8. Несмотря на высокую гомологию (идентичность аминокислотных последовательностей 87% ), Taq и Tth ДНК-полимеразы различаются некоторыми практически важным свойствами. К ним можно отнести способность Tth полимеразы синтезировать более длинные последовательности ДНК и использовать РНК в качестве матрицы, а также способность Taq полимеразы осуществлять ПЦР с большей специфичностью.

В настоящей диссертационной работе представлении результаты исследования различий в свойствах Тая и ТШ ДНК-полимераз и их причин. Полученные данные позволили более рационально подайти к использоваию этих ферментов для решения прикладных задач и создали предпосылки для направленной корекции свойств этих полимераз. В результате была создана ДНК-полимераза способная высокоспецифично и эффективно осуществлять синтез ДНК на «сложных» матрицах в ходе секвенирования ДНК по методу Сенгера и ПЦР.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Игнатов, Константин Борисович

5. Выводы

1. Показано, что Tth ДНК-полимераза осуществляет амплификацию ДНК в процессе ПЦР с меньшей специфичностью, чем Taq ДНК-полимераза. Исследованы причины этого явления.

2. Обнаружено свойство Tth ДНК-полимеразы с равной эффективностью использовать в ПЦР праймеры как не содержащие, так и содержащие некомплементарные матрице нуклеотиды. Показано, что смеси ДНК-полимераз, содержащие Tth ДНК-полимеразу, также обладают способностью использовать праймеры с некомплементарными матрице нуклеотидами.

3. Продемонстрирована эффективность использования Tth ДНК-полимеразы и содержащих ее смесей полимераз при поиске и анализе гомологичных последовательностей ДНК с помощью ПЦР.

4. Путем создания гибридных ферментов подтвержден высокий консерватизм структурно-функциональной организации полимеразного домена ДНК-полимераз, относящихся к А семейству.

5. Установлено, что различия в консервативным участке субдомена "большой палец" Taq и Tth ДНК-полимераз определяют различную способность этих ферментов амплифицировать протяженные последовательности ДНК.

6. Показано, что замещение Ser543 на Asn в большом фрагменте Taq ДНК-полимеразы (Klentaq) многократно повышает эффективность синтеза ДНК на протяженных матрицах и позволяет использовать модифицированный фермент для амплификации и секвенирования ДНК со сложной структурой.

4.5. Заключение

В представленной работе проведено сравнение способностей Taq и Tth ДНК-полимераз осуществлять специфичную амплификацию ДНК и синтезировать протяженные последовательности ДНК в ходе ПЦР, а также исследованы причины наблюдаемых различий.

Было показано, что Tth полимераза осуществляет ПЦР-амплификацию ДНК с меньшей специфичностью, чем Taq полимераза. Причиной этого является свойство Tth полимеразы «не замечать» наличие некомплементарных пар оснований в дуплексе ДНК и, как следствие, неспособность дискриминировать неспецифически праймированные участки ДНК. Выявленные особенности Tth полимеразы ограничивают ее применение, когда требуется высокая специфичность ПЦР, но позволяют использовать этот фермент для амплификации ДНК с праймерами, не полностью комплементарными матрице, например при поиске и анализе гомологичных последовательностей ДНК методом ПЦР.

Было показано, что добавление Tth полимеразы в очень малых количествах (тысячные доли от общей полимеразной активности) к препаратам других полимераз придает последним способность эффективно использовать праймеры, содержащие некомплементарные матрице нуклеотиды. Этот факт расширяет возможности применения различных полимераз и их смесей.

Созданные в процессе работы функционально-активные гибридные Ttaq и Teco ДНК-полимеразы подтверждают данные структурных исследований, говорящие о высокой гомологии на уровне вторичной и третичной структур ДНКполимераз одного семейства. Это позволяет комбинировать части различных полимераз, создавая ферменты с новыми свойствами, и изучать структурно-функциональные особенности ДНК-полимераз путем создания гибридных белковых молекул.

Сравнение способности Taq и Tth ДНК-полимераз амплифицировать протяженные последовательности ДНК показало, что для амплификации фрагмента ДНК фага X длиной 5695 п.о. Taq полимеразы требуется в шесть раз больше, чем Tth полимеразы. Путем создания гибридной Ttaq полимеразы, содержащей аминокислотные последовательности Taq и Tth было показано, что разная эффективность синтеза протяженных последовательностей ДНК связана с различиями в консервативной области субдомена "большой палец" этих ферментов.

Сопоставление различий в аминокислотной последовательности субдомена "большой палец" Taq и Tth полимераз с данными [13] рентгено-структурного анализа Taq полимеразы в комплексе с ДНК выявило, что из всех различающихся аминокислотных остатков лишь Ser543 Taq полимеразы принимает непосредственное участие во взаимодействии с ДНК. Этому Ser в Tth полимеразе соответствует Asn545. Было показано, что замещение Ser543 на Asn в большом фрагменте Taq полимеразы (Klentaq) многократно (в шесть раз) повышает эффективность синтеза ДНК на протяженных матрицах. Эти факты указывают, что именно наличие Asn545 (вместо Ser) в субдомене "большой палец" позволяет Tth полимеразе более эффективно синтезировать длинные последовательности ДНК.

Изучение свойств мутантной Юегйац полимеразы, содержащей замену Б543К (К1еп1аяМ полимераза), показало, что внесенная мутация позволяет модифициованному ферменту преодолевать «трудные» участки ДНК, предотвращая преждевременную терминацию синтеза. Низкая чувствительность модифицированной полимеразы к структуре матрицы позволяет использовать Юег^ацЫ полимеразу для ПЦР-амплификации и секвенирования ДНК со сложной структурой.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Игнатов, Константин Борисович, Москва

1. Корнберг А.// Кн. Синтез ДНК. М.: 'Мир' (1977)

2. Sanger F., Nicklen S., and Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sei. USA V.74 (1977), P. 5463-5467

3. Mullis K.B. and Faloona F.A. Specific synthesis of DNA in vitro a Polymerase-Catalysed Chain Reaction. // Methods in Enzymol. V.155 (1987), P.335-349

4. Saiki R.K.,.Gelfand D.H, Stoffel S., Scharf S.J., Higuchi R., Horn G.T., Mullis K.B., and Erlich H.A Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase // Science V.239 (1988), P. 487-491

5. Wang Teresa S.-F. Eukariotyc DNA-polymerases // Annu. Rew. Biochem. V.60 (1991), P. 513-552

6. Cann I., and Ishino Y. Archaeal DNA replication: identifying the pieces to solve a puzzle // Genetics V.152 (1999), P.1249-1267

7. Woese C.R., Kandier О. and Wheelis M.L. Towards a natural system of organisms: proposal for the domains archaea, bacteria, and eukarya // Proc. Natl. Acad. Sei. USA V.87 (1990), P. 4576-4579

8. Delarue M., Poch O., Tordo N., Moras D., and Argos P. An attempt to unify the structure of polymerases II Protein Eng. V.3 (1990), P.461-467

9. Joyce C.M., and Steitz T.A. Function and structure relationships in DNA polymerases // Annu. Rew. Biochem. V.63 (1994), P. 777-822

10. Михайлов B.C. ДНК-полимеразы эукариот // Мол. Биология Т.ЗЗ (1999), С. 567-580

11. Ollis D.L., Brick P., Hamlin R., Xuong N.G., and Steitz T.A, Structure of large fragment of Escherichia coli DNA polymerase I complexed with dTMP // Nature V.313 (1985), P.362-766

12. Beese L.S., Debyshire V., and Steitz T.A. Structure of DNA polymerase I Klenow fragment bound to duplex DNA // Science V.260 (1993), P. 352-355

13. Eom S.H., Wang J., and Steitz T.A. Structure of Taq polymerase with DNA at the polymerase active site // Nature Y.382 (1996), P. 278-281

14. Kiefer J.R., Mao C., Braman J.C., and Beese L.S. Visualizing DNA replication in a catalytically active Bacillus DNA polymerase crystal // Nature V.391 (1998), P. 304307

15. Doublie S., Tabor S., Long A.M., Richardson C.C., and Ellenberger T. Crystal structure of a bacteriophage T7 DNA replication complex at 2.2A resolution //

16. Nature V.391 (1998), P. 251- 258

17. Modrich P., and Richardson C.C. Bacteriophage T7 DNA replication in vitro. A protein of Escherichia coli required for bacteriophage T7 DNA polymerase activity // J. Biol. Chem. V.250 (1975), P.5508-5514

18. Wang J., Sattar A., Wang C.C., Karam J.D., Königsberg W.H., and Steitz T.A. Ciystal structure of a pol a replication DNA polymerase from bacteriophage RB69

19. Cell V.89 (1997), P. 1087-1089

20. Hopfner K.-P., Eichinger A., Engh R.A., Laue F., Ankenbauer W., Huber R., and Angerer B. Ciystal structure of a thermostable type B DNA polymerase from Thermococcus gorgonarius II Biochemistry V.96 (1999), P. 3600-3605

21. Rodriguez A.C., Park H.W., Mao C., and Beese L.S. Crystal structure of a pol alpha family DNA ptymerase from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus sp. 9 degrees N-7 // J. Mol. Biol. V.299 (2000), P.447-462

22. Steitz T.A. DNA polymerases: structural diversity and common mechanisms // J. Biol. Chem. V.274 (1999), P. 17395-17398

23. Huang Y.P., and Ito J. DNA polymerase C of the thermophilic bacterium Thermus aquaticus: classification and phylogenetic analysis of the family C DNA polymerases

24. J. Mol. Evol. V.48 (1999), P.756-769

25. Sawaya M.R., Pelletier H., Kumar A., Wilson S.H., and Kraut T. Crystal structure of rat DNA polymerase ß: Evidence for a common polymerase mechanism // Science V264 (1994), P. 1930-1935

26. Steitz T.A., Smerdon S.J., Jager J., and Joyce C.M. A unified polymerase mechanism for nonhomologous DNA and RNA polymerases // Science V.266 (1994), P. 2022-2025

27. Holm L., and Sander C. DNA polymerase beta belongs to an ancient nucleotidyltransferase superfamily //Trends Biochem. Sei. V.20 (1995), P. 345-347

28. Brautigam C.A., and Steitz T.A. Structural and functional insights provided by crystal structures of DNA polymerases and their substrate complexes // Curr. Opin. Struct. Biol. V.8 (1998), P. 54-63

29. Ishino Y., Komori K., Cann I., and Koga Y. A novel DNA plymerase family found in Archaea // J. Bacteriol. V.180 (1998), P. 2232-2236

30. Kohlstaedt L.A., Wang J., Friedman J.M., Rice P.A., and Steitz T.A. Ciystal structure at 3.5A of HIV -1 reverse transcriptase complexed with an inhibitor //

31. Science V.256 (1992), P. 1781-1790

32. Tabor S., and Richardson C.C. A single residue in DNA polymerases of the E.coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides // Biochemistry V.92 (1995), P. 6339-6343

33. Bedford E., Tabor S., and Richardson C.C. The thioredoxin binding domain of bacteriophage T7 DNA polymerase confers processivity on Escherichia coli DNA polymerase I // Proc. Natl. Acad. Sei. USA V.94 (1997), P. 479-484

34. Huang H., Chopra R., Verdine G.L., and Harrison S.C. Structure of a covalently trapped catalytic complex of HIV-1 reverse transcriptase: Implications for drug resistance // Science V.282 (1998), P. 1669-1675

35. Steitz T.A. DNA- and RNA-dependent DNA polymerases. // Curr. Opin. Struct. Biol. Y.3 (1993), P. 31-38

36. Pelletier H., Sawaya M.R., Kumar A., Wilson S.H., and Kraut T. Structure of ternary complexes of rat DNA polymerase ß, a DNA template-primer, and ddCTP //

37. Science V264 (1994), P. 1981-1983

38. Sawaya M.R., Prasad R., Wilson S.H., Kraut Т., and Pelletier H. Crystal structures of human DNA polymerase p complexed with gapped and nicked DNA : Evidence for an induced fit mechanism // Biochemistry V.36 (1997), P. 11205-11212

39. Краевский A.A. Химические реакции, катализируемые ДНК-полимеразами

40. Биоорган, химия Т.26 (2000), С. 4-11

41. Краевский А.А., Куханова М.К. //Итоги науки и техники. Серия молекулярная биология/ под ред. Киселева Л.Л. М.: ВИНИТИ, Т.22 (1986), С. 5-164

42. Steitz Т.А. and Steitz J.A. A ganeral two-metal-ion mechanism for catalytic RNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA V.90 (1993), P. 6468-6502

43. Komori K., and Ishino Y. Functional interdependence of DNA polymerizing and 3'-5' exonucleolytic activities in Pyrococcus furiosus DNA polymerase I // Protein Eng. V.13 (2000), P. 41-47

44. Joyce C.M Choosing the right sugar: How polymerases select a nucleotide substrate // Proc. Natl. Acad. Sci. USA V.94 (1997), P. 1619-1622

45. Doudlie S., Sawaya M.R., and Ellenberger T. An open and closed case for all polymerases. // Structure V.7 (1999), P. 31-35

46. Barnes W.M. The fidelity of Taq polymerase catalyzing PCR is improved by an N-terminal deletion // Gene V.l 12 (1992), P. 29-35

47. Barnes W.M. PCR amplification of up to 35kb DNA with high fidelity and high yield from X bacteriophage templates // Proc. Natl. Acad. Sci. USA V.91 (1994), P. 2216-2220

48. Blanco L., Bemad A., Blasco M.A., and Salas M. A general structure for DNA-dependent DNA polymerases // Gene V.100 (1991), P. 27-28.

49. Shamoo Y., and Steitz T.A. Building a replisome from interacting pieces: sliding clamp complexed to a peptide from DNA polymerase and polymerase editing complex // Cell V.99 (1999), P. 155-166

50. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. // Кн. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир (1984)

51. Klenow Н., and Henningsen I. Selective elimination of the exonuclease activity of the deoxyribonucleic acid polymerase from Escherichia coli В by limited proteolysis

52. Proc. Natl. Acad. Sci. USA V.65 (1970), P. 168-175

53. Goodman H.M., and MacDonald R. J. Cloning of hormone genes from a mixture of cDNA molecules // Methods Enzymol. V.68 (1979), P. 75-90

54. Cordell В., Swanstrom R., Goodman H.M., and Bishop J.M. tRNATrp as primer for RNA-directed DNA polymerase: structural determinants of function // J. Biol. Chem. V.254 (1979), P. 1866-1874

55. Verma I.M. Studies on reverse transcriptase of RNA tumor viruses III. Properties of purified Moloney murine leukemia virus DNA polymerase and associated RNase H. // J. Virol. V.15 (1975), P. 843-854

56. Myers J.C., Spiegelman S., and Kacian D.L. Synthesis of full-length DNA copies of avian myeloblastosis virus RNA in high yields // Proc Natl Acad Sei USA V.74 (1977), P. 2840-2843

57. Roth M.J., Tanese N., and Goff S.P. Purification and characterization of murine retroviral reverse transcriptase expressed in Escherichia coli // J. Biol. Chem. V.260 (1985), p.9326-9335

58. Maxam A.M., and Gilbert W. A new method for sequencing DNA // Proc Natl Acad Sei USA V.74 (1977), P. 560-564

59. Tabor S., and Richardson C.C. DNA sequence analysis with a modified bacteriophage T7 DNA polymerase // Proc. Natl. Acad. Sei. USA V.84 (1987), P. 4767-4771

60. Tabor S., and Richardson C.C. Selective oxidation of the exonuclease domain of bacteriophage T7 DNA polymerase // J. Biol. Chem. V.262 (1987), P. 15330-15333

61. Tabor S., and Richardson C.C. Selective inactivation of the exonuclease activity of bacteriophage T7 DNA polymerase by in vitro mutagenesis // J. Biol. Chem. V.264 (1989), P. 6447-6458

62. Innis M.A., Myambo K.B., Gelfand D.H., and Brow M.A.D. DNA sequencing with Thermus aquatic us DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA Y.85 (1988), P. 9436-9440

63. Chien A., Edgar D.B., and Trela J.M. Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophil Thermus aquaticus. II J.Bacteriol V.45 (1976), P. 1550-1557

64. Kaledin A.S., Sljusarenko A.G. and Gorodetskii S.I. Isolation and properties of DNA polymerase from the extremely thermophilic bacterium Thermus aquaticus YT1 //Biochimiya V.45 (1980), P. 644-651

65. Lawyer F.C., Stoffel S., Saiki R.K., Myambo K., Drummond R., and Gelfand D.H. Isolation, characterization and expression in E.coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus. II J. Biol. Chem. V.264 (1989), P. 6427-6437

66. Park Y., Choi H., Lee D.S., and Kim Y. Improvement of the 3'-5' exonuclease activity of Taq DNA polymerase by protein engineering in the active site // Mol. Cells V.7 (1997), P.419-424

67. Bedinger P., Munn M., and Alberts B.M. Sequence-specific pausing during in vitro DNA replication on double-stranded DNA templates // J. Biol. Chem. V.264 (1989), P. 16880-16886

68. Mytelka D.S., and Chamberlin M.J. Analysis and suppression of DNA polymerase pauses associated with a trinucleotide consensus // Nucleic Acids Res. V.24 (1996), P. 2774-2781

69. Varadaraj K., and Skinner D.M. Dénaturants or cosolvents improve the specificity of PCR amplification of a G + C-rich DNA using genetically engineered DNA polymerases // Gene V.140 (1994), P. 1-5

70. Henke W., Herdel K., Jung K., Schnorr D., and Loening, S.A. Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences // Nucleic Acids Res. V.25 (1997), P. 3957-3958

71. Huang M.M., Arnheim N., and Goodman M.F. Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: implications for single nucleotide discrimination in PCR. //

72. Nucleic Acids Res. V.20 (1992), P. 4567-4573

73. Wu D.Y., Ugozzoli L., Pal B.K., and Wallace R.B. Allele-specific enzymatic amplification of beta-globin genomic DNA for diagnosis of sickle cell anemia // Proc. Natl. Acad. Sci. USA V.86 (1989), P. 2757-2760

74. Nichols W.C., Liepnieks J.J., McKusick V.A., and Benson M.D. Direct sequencing of the gene for Maryland/German familial amyloidotic polyneuropathy type II and genotyping by allele-specific enzymatic amplification // Genomics V.5 (1989), P. 535540

75. Sokolov B.P. Primer extension technique for the detection of single nucleotide in genomic DNA //Nucleic Acids Res. V.18 (1990), P. 3671

76. Tindali K.R., and Kunkel T.A. Fidelity of DNA synthesis by the Thermus aquaticus DNA polymerase. // Biochemistry V.27 (1988), P. 6008-6013

77. Eckert K.A., Kunkel T.A. High fidelity DNA synthesis by the Thermus aquaticus DNA polymerase // Nucleic Acids Res. V.18 (1990), P. 3739-3744

78. Villbrandt В., Sobek H., Frey В., and Schomburg D. Domain exchange: chimeras of thermus aquaticus DNA polymerase, escherichia coli DNA polymerase I and thermotoga neapolitana DNA polymerase // Protein Eng. V.13 (2000), P. 645-654

79. Ruttknann C., Cotoras M., Zaldivar J., and Vicuna R. DNA polymerases from the extremely thermophilic bacterium Thermus thermophilus HB-8 H Eur. J. Biochem. V.149 (1985), P. 41-46

80. Carballeira N., Nazabal M., Brito J., and Garcia O. Purification of a thermostable DNA polymerase from Thermus thermophilus HB8, useful in the polymerase chain reaction // Biotechniques V.9 (1990), P. 276-281

81. Lawyer F.C., Stoffel S., and Gelfand D.H. Recombinant expression vectors and purification methods for Thermus thermophilus DNA polymerase // U.S. Patent 9007639. / PCT. 1991. P. 7-13.

82. Ohler L.D., and Rose E. A. Optimization of long-distance PCR using a transposon-based model system. // PCR Methods Appl. V.2 (1992), P. 51-59

83. Глухов А.И., Трофимова M.E., Гордеев C.A., Гребенникова Т.В., Виноградов С.В., Киселев В.И., Крамаров В.М. // Молекуляр. биология. Т.25. (1991), С. 16021610.

84. Tse W.T., and Forget B.G. Reverse transcription and direct amplification of cellular RNA transcripts by Taq polymerase // Gene V.88 (1990), P. 293-296

85. Klimczak L.J., Grummt F., and Burger K.J. Purification and characterization of a DNA polymerase from the archaebacterium Methanobacterim thermoautotrophicus. // Biochemistry. V.25 (1986), P. 4850-4855

86. Hamal A., Forterre P., and Flie C. Purification and characterization of a DNA polymerase from the archaebacterium Thermoplasma acidophilum // Eur. J. Biochem. V.190 (1990), P. 517-521

87. Lundberg K.S., Shoemaker D.D., Adams M.W., Short J.M., Sorge J.A., and Mathur E.J. High-fidelity amplification using a thermostable DNA polymerase isolated from Pyrococcus furiosus // Gene V. 108 (1991), P. 1-6

88. Klimczak L.J., Grummt F., and Burger K.J. Purification and characterization of DNA polymerase from the archaebacterium Sulfolobus acidocaldarius // Nucleic Acids Res. V.13 (1985), P. 5269-5282

89. Elie Ch., de Recondo A.M. and Forterre P. Thermostable DNA polymerase from the archaebacterium Sulfolobus acidocaldarius. Purification, characterization and immunologocal properties. 11 Eur.J.Biochem. V.178 (1989), P. 619-625

90. Rossi M., Rella R., Pensa M., Bartolucci S., de Rosa M., Gambacorta A., Raia C.A. and dell'Aversano Orobona N. Structure and properties of a thermophilic and thermostable DNA polymerase from Sulfolobus solfataicus. II Microbiol. V.7 (1983), P. 337-341

91. Mattila P., Korpela J., Tenkanen T., and Pitkanen K. Fidelity of DNA synthesis by the Thermococcus litoralis DNA polymerase~an extremely heat stable enzyme with proofreading activity //Nucleic Acids Res. V.19 (1991), P. 4967-4973

92. Uemori T., Ishino Y., Toh H., Asada K., and Kato I. Organization and nucleotide sequence of the DNA polymerase gene from the archaeon Pyrococcus furiosus //

93. Nucleic Acids Res. V.21 (1993), P. 259-265

94. Perler F.B., Comb D.G., Jack W.E., Moran L.S., Qiang B., Kucera R.B., Benner J., Slatko B.E., Nwankwo D.O., Hempstead S.K. Intervening sequences in an Archaea DNA polymerase gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA V.89 (1992), P. 5577-5581

95. Hodges R.A., Perler F.B., Noren C.J., and Jack W.E. Protein splicing removes intervening sequences in an archaea DNA polymerase. // Nucleic Acids Res. V.20 (1992), P. 6153-6157

96. Cariello N.F., Swenberg J.A., and Skopek T.R. Fidelity of Thermococcus litoralis DNA polymerase (Vent) in PCR determined by denaturing gradient gel electrophoresis //Nucleic Acids Res. V.19 (1991), P. 4193-4198

97. Cheng S., Fockler C., Barnes W.M., and Higuchi R. Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA V.91 (1994), P. 5695-5699

98. Queen C. A vector that uses phage signals for efficient synthesis of proteins in E.colill J. Mol. Appl. Genet. V.2 (1983), P. 1-10.

99. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins assembly of 6the head of bacteriophage T4. // Nature, V.227 (1970), P. 680-685.

100. Joyce C.M., Kelley W.S., Grindley N.D.F. Nucleotide sequence of the Escherichia coli polA gene and primary structure of DNA polymerase I // J. Biol. Chem. V.257 (1982), P. 1958-1964.

101. Bashirova A.A., Markelov M.L., Shlykova T.Y., Levshenkova, E.V., Alibaeva, R.A. and Frolova E.I. The human RIL gene: mapping to human chromosome 5q31.1, genomic organization and alternative transcripts // Gene V.210 (1998), P. 239-245.

102. Zaraisky A.G., Lukyanov S.A., Vasiliev O.L., Smirnov Y. V., Belyavsky A.V., Kazanskaya O.V. A novel homeobox gene expressed in the anterior neural plate of thtXenopus embryo // Dev. biol. V.152 (1992), P. 373-383.

103. Kh. PCR Protocols / Eds M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky. N.Y.: Acad. Press, Inc. (1990).

104. Reymond I., Sergeant A., Tappaz M. Molecular cloning and sequence analysis of the cDNA encoding rat liver cysteine sulfonate decarboxylase (CSD) // Biochim. Biophys. Acta. V.1307 (1996), P. 152-156.

105. Wilks A.F., Kurban R.R., Hovens C.M., Ralph S.J. The application of the polymerase chain reaction to cloning members of the protein tyrosine kinase family

106. Gene (1989) V.85 (1989), P. 67-74.

107. Skinner T.L., Kerns R.T., Bender P.K. Three different calmodulin-encoding cDNAs isolated by a modified 5'-RACE using degenerate oligodeoxyribonucleotides

108. GeneV.151 (1994), P. 247-251.

109. Maier J., Witter K., Gutlich M., Ziegler I., Werner T., Ninnemann H. Homology cloning of GTP-cyclohydrolase I from various unrelated eukaryotes by reverse-transcription polymerase chain reaction using a general set of degenerate primers

110. Biochim. Biophys. Res. Commun. V.212 (1995), P. 705-711.

111. Joshi C.P.,Kumar S., Nguyen H.T. Application of modified differential display technique for cloning and sequencing of the 3' region from three putative members of wheat HSP70 gene family // Plant. Mol. Biol. V.30 (1996), P. 641-646.

112. Robertson N.L., French R., Gray S.M. Use of group-specific primers and the polymerase chain reaction for the detection and identification of Iuteoviruses // J. Gen. Virol. V.72 (1991), P. 1473-1477.

113. Kaltenboeck B., Kousoulas K.G., Storz J. Detection and strain differentiation of Chlamydia psittaci mediated by a two-step polymerase chain reaction //J. Clin. Microbiol. V.29. (1991), P. 1969-1975.

114. Telenius H., Carter N.P., Bebb C.E., Nordenskjold M., Ponder B.A., Tunnacliffe A. Degenerate oiigonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer // Genomics. V.13 (1992), P. 718-725.

115. Sakallah S.A., Lanning R.W., Cooper D.L. DNA fingerprinting of crude bacterial lysates using degenerate RAPD primers // PCR Methods Appl. V.4 (1995), P. 265-268.

116. Lebedev Yu.B., Belonovitch O.S., Zybrova N.V., KM P.P., Kurdyukov S.G., Vinogradova T.V., Hunsmann G., and Sverdlov E.D. Differences in HERV-K LTR insertions in orthologous loci of humans and great apes // Gene V.247 (2000), P. 265277.

117. Blasco M.A., Lazaro J.M., Blanco L. and Salas M. Phi 29 DNA polymerase active site. The conserved amino acid motif "Kx3NSxYG" is involved in template-primer binding and dNTP selection // J. Biol. Chem. V.268 (1993), P. 16763-16770.

118. Rees W.A., Yager T.D., Korte J. and von Hippel P.H. Betaine can eliminate the base pair composition dependence of DNA melting // Biochemistry V.32 (1993), P. 137-144.