Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка и применение экспериментальных и промышленных иммуноферментных тест-систем для лабораторной диагностики вирусных инфекций

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка и применение экспериментальных и промышленных иммуноферментных тест-систем для лабораторной диагностики вирусных инфекций"

1 г *

й , . акада®1я медицинских наук

^ институт* полиомиелита к вирусных энцефалитов

На прэвах рукописи УДК 616.98:578.833.26-07

иванов александр петрович

разработка и применение экспериментальных

и промышленных шотюфврментных тест-систш дяя лабораторной диагностики вирусных инфекций

03.00.06 - вирусология

Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских кзук а форме научного доклада

/

и*

Москва - 1994 г.

Работа выполнена в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов Российской Академии медицинских наук.

Научный консультант - доктор медицинских наук, профессор Б.А. Ткачзнко

Официальные онпоненты: доктор медицинских наук, профессор

Л,Б. Элъберт

доктор биологических наук, профессор К.Л. Шахакика доктор медицинских наук К.Н. Мальцева

Ведущее учреждение: Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля кеди-цинских биологических препаратов ;шеии Л.А.Тарасевичэ МЗ РФ.

Защита диссертации состоится Ч" шмх 1994 года в ¿{0 часов на заседании Специализированного Ученого совета Д.001,27.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов Российской АМН. (142782, .Московская о6л., п/о Институт полиомиелита ).

С диссертацией (научным докладом) можно ознакомиться в библиотеке Института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН

Научный доклад разослан алМ, 1Э54 года.

Ученый секретарь Специализированного совета

кандидат биологических наук О.А.Медведаина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Среди неизотопных методов иммуноана-лиза наиболее широкое распространение в различных областях биологии получил иммуноферментный метод (ИФМ). 1АШ отличается от принципиально аналогичного радиоиммунологического анализа (РИА) только по характеру метки для антител или антигенов. Использование неизотопной метки (фермента) значительно упростило приготовление и применение меченых антител и антигенов (биозондов). Кроме того, ИФМ более доступен для широкого круга исследователей, поскольку не требует сложного и дорогостоящего радиометрического оборудования, благодаря оптической (или визуальной) регистрации результата. Совершенствование способов детекции вирусных антигенов и антител - одна из основных методических проблем вирусологии, поэтому очевидные преимущества ИФМ как высокочувствительного метода иммуноанализа явились веским основанием адаптировать его для практики вирусологических исследований. Кроме того, к началу данной работы четко обозначилась необходимость качественно нового уровня исследований, позволяющего расширить спектр природных материалов как объектов исследований (недоступных для традиционных тестов) и проводить более широкие и детальные обследования эндемичных территорий. Высокую значимость представляло использование ИФМ для лабораторной диагностики особоопасных инфекций, вызываемых высокопатогенными вирусами семейств Агепау!-г1йае и Випуау1г1с1ае. Использование нового методического подхода могло обеспечить решение не только чисто практических задач (собственно лабораторная диагностика вирусных инфекций - определение антигенов в различных вируссодержащих материалах и противовирусных антител), но и задач фундаментальных - выяснение особенностей циркуляции и распространения ряда вирусов-возбудителей

инфекций человека в изучаемых популяциях на определенных территориях.

Однако практика показала, что эффективное использование ИЗ в лабораторной диагностике конкретных вирусных инфекций требуе оптимизации метода с учетом специфики исследуемого вируса и xs рактера исследований. К началу данной работы в еще не столь ос ширной литературе с информацией по применению ИФМ в вирусологи вопросы разработки оптимальных параметров метода освещалис очень скупо, либо вообще не были представлены (Voller et al. 1976). Исследователю предлагался принцип метода, а проблемы адв птацни и оптимизации ИФМ применительно к конкретным вирусам ре шались в основном эмпирически и нередко неудовлетворительно, чч рождало определенный скептицизм в отношении ИФМ. Преодоление ря да трудностей при решении проблем стандартизации и систематизг ции ИФМ открывает возможность создания эффективной методическс основы для решения широкого круга актуальных исследовательски задач. Разработка и успешная апробация нового лабораторного ме тода предполагает логическое завершение - конструирование и вне дрение в исследовательскую практику коммерческих диагностически тест-систем.

Цель и задачи исследований. Целью исследований является эг спериментальное обоснование эффективности ИФМ как универсально{ системы детекции вирусных антигенов и противовирусных антител. Достижение этой цели предусматривает решение следующих задач:

1) конструирование экспериментальных иммуноферментных тест систем и их применение для лабораторной диагностики вирусных ш фекций,

2) разработка и оптимизация различных вариантов ИФМ для от ределения вирусных антигенов и противовирусных антител,

-53) разработка технологии промышленного изготовления коммерческих гашуноферментных тест-систем.

Научная новизна работы. Впервые в вирусологической практике разработан комплекс вариантов ИФМ для лабораторной диагностики инфекций, вызываемых вирусами семейств Агепау1г1(1ае : высокопатогенные вирусы Ласса, Мачупо, Хунин, а также вирусы лимфоцитар-ного хориоменингита (ЛХМ), Амапари, Такарибе, Тамиами, и Випуа-у1г1с1ае: вирус Крымской - Конго геморрагической лихорадки (КГЛ-Конго) и хантавирусы - возбудители геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС). Разработка и применение ИФМ для определения вирусных антигенов и антител к ним подняли исследования на новый уровень и создали основы нетрадиционных подходов к изучению этих патогенов. Благодаря высокой чувствительности и специфичности метода стала возможной прямая регистрация малых количеств вирусного антигена в грубых суспензиях органов диких и лабораторных животных, что позволило создать систему ИФМ-скрининга

/

и проводить широкие эпизоотологические исследования. Использование ИФМ помогло значительно повысить эффективность специфической диагностики инфекций, вызываемых вышеуказанными вирусами, и получить новые данные, имеющие приоритетное значение в изучении этих инфекций в нашей стране и за рубежом. Установлена таксономическая принадлежность хантавирусов к семейству Випуа?1г1(1ае; уточнены границы ареала хантавирусов на территории бывшего СССР; определен видовой состав мелких млекопитающих - носителей хантавирусов в природе (в странах бывшего СССР, в Бельгии, Нидерландах, Западной Германии, Чехии, Словакии, Швеции); доказана антигенная вариабельность хантавирусов; выяснены вопросы формирования гуморального иммунитета при ГЛПС; получены данные об этиологической роли вируса ЛХМ в нейропатологии человека; получены

приоритетные данные о распространении ряда патогенных вирусов н территории Гвинейской Республики (вирусы гепатитов А и В, КГЛ Конго, Ласса, Чикунгунья); выявлены случаи контаминации лабора торных животных питомников РАМН хантавирусами и вирусом ЛХМ Практическая значимость и внедрение результатов исследова кий в практику. На основе полученных данных разработаны техноло гии экспериментального изготовления иммуноферментных тест-систе для лабораторной диагностики вирусов КГЛ-Конго и ЛХМ и промыш ленного производства коммерческой иммуноферментной тест-систем "ХАНТАГНОСТ" для определения антигенов хантавирусов - возбудите лей ГЛПС. Широкое практическое применение ИФМ для определена инфицированное™ мелких млекопитающих хантавирусами открыло воз можность оценки степени активности природных очагов (мониторин га) и своевременного проведения соответствующих противозпидеми ческих мероприятий. Применение ИФМ для определения антител к ви русу ЛХМ и хантавирусам в сыворотках крови больных ладей значи тельно повысило эффективность клинической диагностики. Результг ты обследования в ИФМ материалов от лабораторных животных из пк томников свидетельствуют о возможности эффективного использовг ния разработанных нами иммуноферментных тест-систем для контро1 контаминации вирусом ЛХМ и хантавирусами лабораторных животных проведения соответствующих мероприятий, направленных на предок ращение распространения инфекций в питомниках.

Разработаны и утверждены следующие нормативно-техничесю документы:

I. Инструкция по изготовлению, контролю и применению диагност! кума лимфоцитарного хориоменингита, иммуноглобулинового перокс! дазного сухого (протокол N I заседания КВС МЗ СССР от 9. 01 1983 г.).

-72. Инструкция по изготовлению, контролю и применению диагности-кума геморрагической лихорадки с почечным синдромом, иммуногло-булинового пероксидазного сухого (протокол N I заседания КВС МЗ СССР от 9. 02. 1983 г.).

3. Инструкция по изготовлению, контролю и применению диагности-кума Крымской-Конго геморрагической лихорадки, иммуноглобулино-вого пероксидазного сухого (протокол N I заседания КВС МЗ СССР от 9. 02. 1983 г.).

4. Временная фармакопейная статья на тест-систему иммунофермент-ную для определения антигена вируса ГЛПС (ВФС 42-297 ВС-91, утверждена МЗ СССР от 2. 07. 1991 г.).

5. Экспериментально-производственный регламент N 325-91 на тест-систему иммуноферментную для определения антигена вируса ГЛПС (согласовано с ГИСК им. Л. А. Тарасевича от 17. 06. 1991 г.).

6. Инструкция по применению иммуноферментной тест-системы "ХАН-ТАГНОСТ" для определения антигена вируса ГЛПС (утверждена Госкомитетом санзпиднадзора при Президенте Российской федерации от 26. 03. 1992 г.).

Иммуноферментная тест-система для определения антигена вируса ГЛПС защищена авторским свидетельством: "Диагностикум геморрагической лихорадки с почечным синдромом для детекции антигенов всех известных серотипов этого вируса прямым иммунофермент-ным методом", свидетельство N 1639245 от 1.12.1990 г.

Товарный знак "ХАНТАГНОСТ" зарегистрирован в Государственном реестре товарных знаков СССР, свидетельство N 91221 от 8.10.1990 г.

Опубликованы следующие практические рекомендации: I. Применение твердофазных иммуносорбентных методов (энзимного и радиоиммунологического анализа) для лабораторной диагностики

аренавирусных инфекций, КГЛ-Конго и ГЛПС. Методические рекомен дации. МЗ РСФСР, М., 1982 г.

2. Методы лабораторной диагностики ГЛПС. Методические рекоменда ции. МЗ РСФСР, М., 1982 г.

Основные результаты, изложенные в диссертации, получены соавторстве с сотрудниками ИПВЭ РАМН: Е. А. Ткаченко, Г. В. Ре запкиным, Т. К. Дзагуровой, В. Н. Башкирцевым, М. А. Донцом, Е П. Деконенко, А. Г. Анджапаридзе, 0. Е. Ивановой, М. Б. Короле вым, а также М. М. Шейнбергасом (НИИ эпидемиологии, микробиоло гии и гигиены, г. Вильнюс) и Г. М. Воронковой (Институт эпидеми ологии и микробиологии, г. Хабаровск).

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на ко нференции молодых специалистов по медицинской вирусологии (Инс титут полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР, Москва 1981), 19 и 20 итоговых сессиях Института полиомиелита и вирус ных энцефалитов АМН СССР, Москва, 1981, 1985), пленуме Всесоюэ ной проблемной комиссии "Арбовирусы" (Таллинн, 1984), II Всесс юзной конференции по природной очаговости болезней (Тюмень 1984), 10 и II международных конгрессах по тропической медицин и малярии (Манила, 1980, Калгари, 1984), 5 международном конг рессе по вирусологии (Страсбург, 1981), рабочем совещании экспе ртов ВОЗ (Москва, 1985), 29 международном коллоквиуме по ханта вкусам (Антверпен, 1987), международном симпозиуме по ГЛПС (Ленинград, 1991), 3 международном симпозиуме по арбовирусам хантавирусам в странах Средиземноморья (Кортина д'Аыпеццс 1992), 2 международной конференции по ГЛПС (Пекин, 1992).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Разработка и применение экспериментальных ИФМ тест-систем для лабораторной диагностики вирусных инфекций.

Твердофазный иммуноферментный метод (гетерогенный - с разделением компонентов), предложенный в 1971 г. Van Weeman и Schu-urs и Engvall и Perlmann, основан на принципе меченых антител (специфических, антивидовых) или антигенов, где в качестве метки используется определенный фермент. Твердой фазой, то есть поверхностью, на которой последовательно происходит взаимодействие компонентов иммунологической реакции, является поверхность материалов, способных сорбировать белки: полистирол, поливинилхло-рид, полшзропилен, полиакриламид, агароза, целлюлоза и др., в виде лунок микротитрационных панелей, пробирок, бус, шариков, гранул, пленок и т.д. В данной работе в качестве метки использовали наиболее доступный фермент - пероксидазу хрена, а в качестве твердой фазы - полистирольные или поливинилхлорвдные микроти-трационные панели на 96 лунок (иммунопанели). Исследования проводили в рамках следующих вариантов ИФМ: I) прямой вариант для определения антигенов, 2) блок прямого варианта для определения антител, 3) непрямой вариант для определения антигенов или антител с сенсибилизацией твердой фазы специфическими антителами, 4) непрямой вариант для определения антител с сорбцией стандартного антигена на твердую фазу. Все технические детали, касавдиеся материалов и методов данной работы, изложены в приложении к диссертации.

Экспериментальные (лабораторные) шшуноферментные тест-

системы были разработаны для следующих вирусов: Амапари, Ласса ЛХМ, Мачупо, Такарибе, Тамиами, Хунин (аренавирусы); хантавиру сы, КГЛ-Конго (буниавирусы); гепатит А (пикорнавирус); гепатит (гепаднавирус); клещевого энцефалита - КЭ (флавивирус); Чикунгу нья (тогавирус). Пероксидазные диагностикумы (включая специфике ские пероксидазные коныогаты) к данным арена- и буниавирусаы бы ли приготовлены впервые в вирусологической практике. Пероксидаз ные диагностикумы к вирусам гепатитов А и В, КЭ и вирусу Чикун гунья были разработаны и применялись ранее другими авторами, од нако сероэпидемиологические исследования в Гвинейской Респуб лике с использованием этих тест-систем (за исключением КЭ) был проведены нами впервые. Разработка той или иной тест-систем преследовала конкретную цель и была связана с определенными нал равлениями исследований (сероэпидемиологическими, эпизоотологи чесними и др.). В задачи данной работа не входил анализ (напрн мер, эпидемиологический) полученных данных, поэтому представлен ные ниже результаты отражают только ее основную цель - экспери ментальное обоснование эффективности ИФМ для вирусологически исследований.

1.1. Аренавирусы.

Необходимость создания эффективных диагностических систе для идентификации патогенных аренавирусов диктовалась высокс контагиозностыо и летальностью инфекций, вызываемых вирусами Лг сса, Мачупо, Хунин в случае их завоза из-за границы. Особеш остро этот вопрос стоял в преддверии Олимпийских Игр в Моей 1980 г., когда ожидался большой приток иностранных граждан. Пс этому разработка комплекса вариантов ИФМ для определения антиге нов аренавирусов и антител к ним имела самостоятельную высокз значимость.

На завершающем этапе лабораторных испытаний различных вариантов ИФМ изучение антигенных взаимосвязей 7 аренавирусов в непрямом ИФМ продемонстрировало эффективность этого варианта как универсальной и чувствительной системы определения антигенов и антител. В параллельных с непрямым РИА опытах были получены результаты, указывающие на более выраженное антигенное родство вирусов Ласса, ЛХМ и Тамиами с вирусами комплекса Такарибе, а также между вирусами Ласса и ЛХМ (табл. I), что дополнило данные РСК и МФА (Casals et al.t 1975, Wulff et al., 1978). Другим подтверждением эффективности метода была ретроспективная серологическая диагностика случаев лабораторного заражения вирусом Мачу-по. При обследовании сывороток крови сотрудников Института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН, переболевших боливийской геморрагической лихорадкой в 1972 г., в непрямом ИФМ выявлены антитела к вирусу Мачупо (в титрах до 1:320) по истечении 8 лет от момента заболевания. Параллельное обследование этих сывороток в РСК и МФА дало отрицательные результаты.

Следующий элемент диагностической системы на основе ИФМ -прямая детекция малых количеств вирусного антигена в различных антигенсодержащих материалах (кровь больных людей, секционный материал, кровь и суспензии органов диких и лабораторных животных, культуры клеток, инфицированных аренавирусами). Этот подход получил экспериментальное подтверждение в опытах по изучению динамики накопления антигенов аренавирусов в 1фови, органах инфицированных лабораторных животных и культуре клеток. На модели вируса ЛХМ в прямом и непрямом ИФМ показано, что вирусспецифи-ческий антиген определяется в крови, мозгу, печени инфицированных новорожденных белых мышей (нбм) уже на вторые сутки после заражения животного (для РСК это 4-5 сутки). В культуральной

Таблица I.

Антигенные взаимосвязи аренавирусов по данньш непрямого ИФМ

Антиген Метод Титры антител (обратные величины)

Амапари Хунин Мачупо Такарибе Тамиами ЛХМ Ласса

РСК * 256 32 32 64 16 0 4

Амапари МФА ** 64 128 64 64 128 < 4 4

ИФМ 16000 8000 16000 8000 8 < 8 < 8

РСК 64 128 32 64 0 0 0

Хунин МФА 32 128 128 64 128 < 4 8

ИФМ 4000 64000 16000 16000 8 < 8 < 8

РСК 128 64 64 128 4 2 4

Мачупо МФА 32 64 256 64 64 < 4 4

ИФМ 8000 32000 32000 8000 16 < 8 16

РСК 64 64 16 256 0 0 0

Такарибе МФА 64 128 128 128 128 < 4 4

ИФМ 4000 16000 8000 16000 < 8 < 8 < 8

РСК 4 0 0 2 128 0 0

Тамиада МФА 8 4 8 32 128 < 4 < 4

ИФМ 128 32 32 128 32000 < 8 < 8

РСК I 0 0 0 0 256 16

ЛХМ МФА 4 < 4 < 4 32 8 256 16

ИФМ 128 512 1024 1024 32 128000 512

РСК 4 2 I 0 4 8 256

Ласса МФА < 4 < 4 < 4 < 4 4 16 128

ИФМ 32 < 8 16 < 8 < 8 4000 4000

* - данные Casals et al., 1975

## - данные Wulíí et al., 1978

жидкости инфицированной культуры клеток Vero антиген вируса ЛХМ выявляли в ИФМ уже через 48 часов после заражения клеток. В РСК в течение всего срока наблюдения (б суток) антиген выявить не удалось. Показано также, что минимальное количество вируса, при

котором в ШМ начинает выявляться антиген, составляет примерно 3 lg БОЕ/мл (один из способов выражения чувствительности метода). Для РСК это 5 - 6 lg БОЕ/мл.

Представленные результаты легли в основу системы скрининга диких и лабораторных животных при проведении эпизоотологических исследований, в частности, при изучении циркуляции и распространения вируса ЛХМ в природе и в питомниках лабораторных животных (контроль контаминации). Следует отметить, что к началу этих исследований (1983 г.) природные очаги вируса ЛХМ, по крайней мере, на территории бывшего СССР были практически не изучены (Львов и др., 1989), а систематический контроль на контаминацию лабораторных животных вирусом ЛХМ не проводился. В результате обследования в прямом И®« 10 % суспензий мозга более 2 тысяч мелких млекопитающих 10 видов, отловленных в 18 районах Краснодарского края, антиген вируса ЛХМ обнаружен у домовой мыши (2,1 -7, в среднем 4,6 %), обыкновенной полевки (0,14 - 1,3, в среднем 0,72 %), лесной мыши (2 - 4,2, в среднем 3,1 %), желтогорлой мыши (0,7 %). Следует отметить, что обнаружение антигена вируса ЛХМ у других видов грызунов (кроме домовой мыши и сирийских хомячков) неоднократно подтверждался фактами изоляции этого вируса, например, от серой крысы, лесной мыши и др. (Иванидзе, 1990).

Необходимость контроля контаминации лабораторных животных вирусом ЛХМ обусловлена вероятностью их хронического инфицирования, в результате чего они могут быть источниками инфицирования лабораторного персонала и нарушать чистоту экспериментов. Согласно рекомендациям ВОЗ вирус ЛХМ включен в список инфекционных агентов, на присутствие которых должны обследоваться колонии грызунов, используемые для биомедицинских исследований. Особенностью естественной инфекции грызунов вирусом ЛХМ (in utero или

при рождении) является то, что у животного не происходит выработки антител (антитела вырабатываются, если инфицирование произошло в более позднем периоде жизни, вирус при этом не выделяется). Поэтому определние антигена вируса ЛХМ в суспензиях органов грызунов с использованием такого чувствительного теста, как ИФМ, представляется адекватным контролем контаминации (наряду с определением антител). Применение вирусологических методов (выделение вируса) при массовом обследовании животных практически невозможно.

С 1987 г. контролю подвергали линейных и нелинейных лабораторных мышей и крыс трех питомников лабораторных животных Российской АМН: "Центральный", "Столбовая", "Белый мох", а также мышей и крыс Коллекционного фонда НИЛ биомоделей РАМН, находящихся в конвенциональных и СПФ-условиях разведения и содержания. Детекцию антигена вируса ЛХМ проводили в 10 Ж суспензиях органов (головной мозг, селезенка, печень), прямым ИФМ. Всего обледовано 1755 проб от 524 животных. Параллельно ИФМ эти пробы обследовали в реакции непрямой гемагглютинации (РИГА, С.Я. Гай-дамович и Г.А. Клисенко, Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского). Антиген вируса ЛХМ в низких титрах выявлен только в ИФМ у 3-х мышей линии BALB/c и у нелинейной крысы.

Следующий раздел эпизоотологических исследований с применением системы ИФМ-скрининга касался изучения циркуляции вируса Ласса'на территории Гвинейской Республики (ГР), которые проводились с 1983 г. Органы мелких млекопитающих доставляли из Научно-исследовательской микробиологической и вирусологической лаборатории (КИМВЛ) МЗ СССР (г. Киндаа, ГР) и исследовали (10 % суспензии головного мозга и печени) в непрямом ИФМ на наличие антигена вируса Ласса. На этом этапе из 153 обследованных животных у 3

Mastomys natalensls (иногососковая крыса - основной природный хозяин вируса Ласса) выявлен антиген вируса Ласса, который также в непрямом ИФМ был дифференцирован от антигена вируса ЛХМ. На следующем этапе (1987 - 1988 г.г.) уже на базе НИМВЛ в прямом ИФМ обследовано 874 суспензии печени животных 16 видов отряда Rodentla и I вида Insectívora (Mastomys natalensls - 48 %, Цуо-mys daltoni - 23 %, Mus musculus - 7 % и 22 % - другие виды), отловленные на территории префектуры Киндиа (Нижняя Гвинея), которая граничит со Съерра-Леоне, где зарегистрированы природные очаги вируса Ласса (Monath et al., 1974). Пероксидазшй диагнос-тикум (пероксидазный конъюгат) для определения антигена вируса Ласса в прямом ИФМ был приготовлен на базе НИМВЛ на основе анти-Ласса сыворотки морской свинки, полученной в БелНИИЭМ, г. Минск. Выявлено 4 положительных образца (все от Mastomys natalensls, отловленных в окрестностях г. Киндиа). Положительные образцы были также обследованы в прямом ИФМ на наличие антигена вируса ЛХМ с отрицательными результатами. Полученные данные свидетельствуют о существовании природных очагов вируса Ласса в Гвинее, по крайней мере, на территории префектуры Киндиа. Достоверные сведения о манифестациях лихорадки Ласса среди населения этой префектуры, как и в целом по Гвинее, отсутствуют. Собственные серологические исследования проводились в ограниченном объеме - в непрямом ИФМ обследовано 12 сывороток жителей префектуры Киндиа (здоровые доноры), у одного из них обнаружены антитела к вирусу Ласса. По данным Henderson et al. (1972) при обследовании сывороток миссионеров-европейцев из Телекоро (Лесная Гвинея, граничащая с Либерией) в реакции нейтрализации обнаружены антитела к вирусу Ласса ST 4-х из 17 обследованных. У 3-х серопозитивных лиц в I9&5-I968 годах отмечались лихорадочные заболевания, схожие по симптома-

тике (но в более мягкой форме) с лихорадкой Лаоса; у четвертого (ребенка) подобных симптомов в анамнезе не было. В работе Luka-shevich et al. (1992) представлены данные массового обследования сывороток населения Гвинеи (здоровых доноров) на наличие антител к вирусу Ласса в непрямом ИФМ: всего по стране количество серо-позитивных лиц составило 23,6 %, по префектуре Киндиа - 34,5 %.

Следующий этап работы был посвящен изучению этиологической роли вируса ЛХМ в нейропатологии человека.

В структуре нейроинфекций заболевания, вызываемые вирусом ЛХМ, составляют около 10 % (Johnson, 1982). Вирус ЛХМ, впервые выделенный от больного асептическим менингитом, вначале считался этиологическим агентом только небактериальных менингитов, что v, отразилось на его названии. Однако вскоре выяснилось, что вирус ЛХМ вызывает значительно больший круг заболеваний, чем предполагалось ранее, включая бессимптомные и гриппоподобные состояния, менингиты, арахноидиты, энцефалиты, в том числе с хронически» течением.- (Леви, 1964; Lehmann-Grube, 1971),

Для выяснения этиологической роли вируса ЛХМ в патологи нервной системы проводили обследование сывороток крови (а так» спинномозговой жидкости - СМЖ, которая в качестве объекта серо логического исследования привлекает в последнее время большо внимание исследователей) больных с использованием непрямого И® (в ряде случаев - параллельно в РСК и непрямом МФА). Применял систему определения специфического IgG. С 1978 г. на базе клини ческого отделения Института полиомиелита и вирусных энцефалите Российской АМН (клиническая инфекционная больница N I г. Москвы обследовано 425 больных с различными синдромами нейроинфекций сходными заболеваниями (табл. 2). Основными группами заболеванн с предполагаемым участием вируса ЛХМ были серозные менингита

Таблица 2

Результаты определения антител к вирусу ЛХМ в непрямом ИФМ у больных с различными синдромами нейроинфекций и сходными

заболеваниями.

Формы заболеваний Всего больных В том числе с антителами к вирусу ЛХМ

I. Менингиты 1) Серозные менингиты 2) Бактериальные менингиты 3) Менингит, вызванный вирусом варицелла/зостер 4) Туберкулезный менингит 157 24 10 9 13 (8,7 %)

II. Энцефалиты и сходные заболевания 1) Энцефалиты 2) Церебральные арахноидиты 3) Энцефалопатии воспалительного характера 4) Объемные процессы головного мозга (абсцессы, опухоли) 68 35 14 II 8 (11,7 %) I (2,8 %)

III. Лихорадочные заболевания различной этиологии 33 I (3,3 %)

IV. Заболевания нервной системы различной природа 52 -

V. Боковой амиотрофический склероз (БАС) 12 3 (25 %)

Всего 425 26 (6,1 %)

энцефалиты и энцефалитоподобные заболевания, церебральные арахноидиты, лихорадочные заболевания неясной этиологии. Одновременно были обследованы составляющие контрольную грушу больные с

другими неврологическими заболеваниями (поражениями периферической нервной системы, сосудистыми заболеваниями головного мозга и т.д.). У большинства больных было проведено исследование сывороток крови и СМХ в динамике - первое исследование при поступлении, затем через 10-15 дней и перед выпиской. Всего обследовано 1041 проба крови и СМХ. Антитела к вирусу ЛХМ в диагностически значимых титрах обнаружены в сыворотках у 26 больных, из них у 8 антитела найдены и в СМХ. Титры антител по данным непрямого ИФМ в крови колебались от 1:8 до 1:1024, в СМХ - от 1:4 до 1:128. Нарастание титров антител наблюдалось до 3 - 4 недели заболевания, затем наступала их стабилизация и в части случаев - снижение. У больных менингитами титры антител были в целом выше, чем у больных энцефалитами. Корреляция между уровнем титров антител и тяжестью заболевания не обнаружена. У одной больной арахноидитом отмечено наличие антител только в СМЖ при отсутствии их в сыворотке крови.

Следующий раздел исследований касался вопроса этиологической роли вируса ЛХМ в пренатальной нейропатологии человека - в развитии тератогенных процессов плода : гидроцефалии, микроцефалии и т.д. (М.М. Шейнбергас, 1979). В непрямом ИФМ (и параллельно в МФА) проведено обследование 16 детей с врожденной инфекцией вирусом ЛХМ (клинический диагноз: гидроцефалия, хориоретинит, микроцефалия). Сыворотки детей обследовали параллельно с сыворотками матерей, перенесших инфекцию вирусом ЛХМ в гриппоподобной, инаппарантной или субклинической формах во второй половине беременности. Материалы для исследований получены от М.М. Шейнберга-са (НИИ эпидемиологии, микробиологии и гигиены, г. Вильнюс). В непрямом ИФМ наличие антител (1§й) к вирусу ЛХМ подтверждено во всех 16 случаях (мать-ребенок). В МФА титры антител у детей и

матерей варьировали от 1:2 до 1:512, в непрямом ИФМ - от 1:8 до 1:4096 (средне-арифметическая величина титра в МФА 1:47,8, в ИФМ - 1:952,2). Сроки взятия крови варьировали у детей от момента рождения (пупочная вена) до 8 лет, у матерей - от 2 месяцев до 8 лет от начала болезни.

Возможность определения вирусного антигена (на примере вируса ЛХМ) в крови экспериментально зараженных животных посредством ИФМ позволила применить этот метод и для определения вирусного антигена в крови больных людей. На присутствие антигена вируса ЛХМ в прямом ИФМ (параллельно в прямом РИА) обследовано более 200 сывороток крови больных с различными неврологическими диагнозами: серозный менингит, менингоэнцефалит, энцефалопатия, а также с хроническими заболеваниями ЦНС и другими неврологическими синдромами (клиническая инфекционная больница Л I г. Москвы). Сроки взятия крови варьировали от 5 - 6 дней до нескольких месяцев от начала заболевания. Предварительно все сыворотки были обследованы в непрямом ИШ на наличие антител к вирусу ЛХМ. Антиген вируса ЛХМ в титрах 1:2 - 1:16 был обнаружен в крови 3-х больных (из них 2 больных с клиническим диагнозом боковой амиот-рофтческий склероз - БАС, и один больной с клиническим диагнозом серозный менингит) и в секционном материале (мозг, печень, почки) больного, погибшего от БАС. В одном случае у больного К-ча с

У

клиническим диагнозом БАС положительными на наличие антигена вируса ЛХМ оказались образцы крови, взятые через 8 и II месяцев от начала заболевания. В другом случае (больной Х-н, диагноз БАС) положительным был образец крови, взятый через 5 лет от начала заболевания. Положительный на наличие антигена вируса ЛХМ секционный материал (диагноз БАС) был взят через 6 лет от начала заболевания. У больного с диагнозом серозный менингит положитель-

-голыми были образцу крови, взятые на 16 и 21 день от начала заболевания. Антитела к вирусу ЛХМ в сыворотках этих больных не обнаружены. С положительными образцами крови было проведено вирусологическое исследование - внутримозговое заражение нбм и определение антигена и вируса в инфицированной мозговой ткани (в ИФМ, РИА, РСК, МФА и методом бляшек). Вирус ЛХМ удалось выделить из образца крови, взятого у больного К-ча (диагноз БАС) через II месяцев от начала заболевания. В анамнезе этого больного указано, что в середине 60-х годов он по характеру своей работы в течение некоторого времени проводил эксперименты с различными видами мелких лабораторных животных (мыши, хомячки). При электрон-номикроскопическом изучении (М.Б. Королев, ИПВЭ РАМН) показано, что популяция выделенного штамма вируса ЛХМ характеризуется в среднем меньшим размером частиц и в то же время большей степенью морфологической гетерогенности по сравнению с лабораторным штаммом СА-1371. к выделенному штамму (Канта-220) был приготовлен высокоактивный иммунный асцит (титр в РСК 1:256), который серологически (в ИФМ, РСК) не отличался от ИАЖ к штамму СА-1371. Всего обследовано 12 больных с диагнозом БАС, из них, как указывалось, антиген вируса ЛХМ обнаружен в крови у 2-х больных (из одного образца выделен вирус ЛХМ) и в секционном материале погибшего. Антитела к вирусу ЛХМ в непрямом ИФМ обнаружены у других 3-х больных с диагнозом БАС (табл. 3).

Представленные в этом разделе результаты являются, по существу, инициальными в решении столь большой и сложной проблемы, как этиологическая роль вируса ЛХМ в нейропатологии человека (в частности, в этиологии БАС), и не претендуют на окончательные выводы. Однако предложенный и достаточно апробированный методический подход (ИФМ), несомненно, может быть полезен в дальнейших

хашшц а <3

Результаты обследования больных боковым амиотрофическим склерозом (БАС) по данным ИШ

Больные БАС Пол Возраст (года) Форма БАС Исследуемый материал Сроки обследования от начала заболевания Титры антигена и антител в ИФМ

антиген антитела

I. К-ч М 55 Бульбарная Сыворотка 8 мес,4 II мес. 13 мес. 1:8 1:4 0 ООО

2. З-ч Ж 36 Шейно-грудная Сыворотка 4 года 0 1:128

3. М-н ж 46 Шейно-грудная Мозг* . Печень Почки 6 лет 1:2 1:4 1:2 _

4. Р-н м 60 Бульбарная Сыворотка 12 мес. 0 0

5. С-в м 55 Бульбарная Сыворотка 14 мес. 0 0

6. Х-н м 32 Пояснично-крестцовая Сыворотка 5 лет 1:16 0

7. Ш-х м 24 Пояснично-крестцовая Сыворотка 6 лет 0 0

8. В-к м 37 Шейно-грудная Сыворотка 18 мес. 0 0

9. С-в м 57 Шейно-грудная Сыворотка 3 года 0 0

10. Р-ч м 61 Шейно-грудная Сыворотка 18 мес. 0 0

II. И-в м 21 Бульбарная Сыворотка 2 мес. 0 1:8

12. С-в м 43 Шейно-грудная Сыворотка 5 мес. 0 1:16

* - секционный материал

** - выделен вирус ЛХМ (штамм Канта 220)

-22-

исрледованиях по данной проблеме.

1.2. Буниавируеы.

Вирус КГЛ-Конго был первым представителем буниавирусов, на котором отрабатывались варианты ИФМ для определения антигенов и антител. Основные параметры ИФМ тест-систем для лабораторной диагностики КГЛ-Конго были аналогичны таковым для аренавирусов, что подтвердило правильность подходов к конструированию перокси-дазных диагностикумов.

Для определения антигена вируса КГЛ-Конго в природных образцах использовали прямой вариант ИФМ. При обследовании 10 % суспензий мозга 10 видов мелких млекопитающих, отловленных в 5 районах Краснодарского края, антиген вируса КГЛ-Конго был обнаружен у обыкновенной полевки (3,6 %), лесной шши (4,5 %), полевой мыши (9,5 %), домовой мыши (1,5 55). На присутствие антигена вируса КГЛ-Конго были обследованы суспензии иксодовых и гамазо-вых клещей, собранные в тех же районах. Вирусспецифический антиген обнаружен только у клещей БегтасегЛог та^1па1из. Аналогичные исследования, проведенные с суспензиями органов 10 видов мелких млекопитающих, доставленных из Гвинейской Республики, не дали положительных результатов. Однако скрининг в непрямом ИФМ 548 сывороток жителей различных префектур (практически здоровое население) позволил обнаружить антитела к вирусу КГЛ-Конго у 8,8 % обследованных лиц. Наличие природных очагов вируса КГЛ-Конгс на территории Гвинеи доказано фактами изоляции вируса из иксодовых клещей (Во1го, 1981).

Следующий раздел исследований был посвящен изучению циркуляции и распространения хантавирусов на территории бывшего СССЗ и ряда стран.

До 1980 г. практически единственным методом определени.

антигенов хантавирусов был непрямой МФА. Образцами для исследований служили криостатные срезы легочной ткани мелких млекопитающих (Lee, 1982). Достаточно высокая чувствительность МФА, однако, нивелировалась сложностью приготовления и микроскопии криос-татных срезов и интерпретации результатов. Детальное изучение циркуляции и распространения хантавирусов на территории бывшего СССР и ряда стран требовало более надежного и эффективного методического подхода. Новый методический подход должен был обеспечить, во-первых, масштабность исследований (обширные территории бывшего СССР, в большинстве регионов которого эпизоотологичекие исследования в рамках данной проблемы не проводились), во-вторых, высокую чувствительность, специфичность и объективность определения вирусспецифического антигена в органах диких животных. Опыт применеия прямого варианта ИФМ для детекции антигенов аренавирусов и предствителя семейства буниавирусов (вирус КГЛ-Конго) позволил адаптировать этот вариант ИФМ и для детекции антигенов хантавирусов .в суспензиях органов (прежде всего в легочной ткани) диких мелких млекопитающих.

К началу широкомасштабных исследований по изучению циркуляции и распространения хантавирусов на территории бывшего СССР (I98X г.) единственным источником высокоактивных специфических антител для приготовления пероксидазного диагностикума служили сыворотки реконвалесцентов ГЛПС с высоким уровнем антител к хантавирусному серотипу Пумала. Выли установлены оптимальные сроки взятия сыворотки - не менее 6 месяцев от начала заболевания, и минимальный титр антител к этому вирусу - 1:16000 -1:32000 в непрямом МФА. Вследствие одностороннего характера серологической связи между хантавирусами серотипа Пумала с одной стороны и серотипов Хантан и Сеул с другой стороны (факт, уста-

новленный на инициальных стадиях исследований, ТкасЬэпко et а1., 1982), иммуноглобулин класса С, выделенный из сыворотки рекоква-лесцента после инфекции, ассоциированной с хантавируеным сероти-пом Пумала, связывает антигены всех известных на сегодняшний день хантавирусных серотипов. В то же время выделенный из сыворотки реконвалесцента после инфекции, ассоциированной с серотяпом Хантан, реагирует только с гомологичным антигеном и с антигеном серотипа Сеул. Таким образом, диагностикум (специфический для сенсибилизации твердой фазы и специфический перок-сидазный конъюгат), приготовленный на основе к хантавирусно-му серотипу Пумала, является универсальной системой детекции антигенов, по крайней мере, 5 хантавирусов: Хантан, Сеул, Пумала, Проспект Хилл и Лики. Прямые опыты по сравнению пероксидаз-ных диагностикумов, приготовленных на основе к вирусам Пумала и Хантан, для детекции культуральных референс-антигенов 5 перечисленных хантавирусов, подтвердили универсальность "Пумала--диагностикума". Универсальность этого даагностикума позволила получить адекватные результаты при обследовании материалов от животных, собранных на территориях бывшего СССР, где циркулируют несколько хантавирусных серотипов.

С помощью иммуноферментной тест-системы для определения антигенов хантавирусов в суспензиях органов диких млекопитающих стало возможным провести масштабные зпизоотологические исследования и получить приоритетные данные о циркуляции и распространении хантавирусов на территории бывшего СССР и ряда стран (видовой состав мелких млекопитающих-носителей хантавирусов в природе, географическое распространение хантавирусов, новые, ранее неизвестные природные очаги ГЛПС и т.д.). ИФМ был ключевым методом при установлении таксономического статуса хантавирусов как

представителей семейства Bunyaviridae (Donets et al., 1982).

Начиная с 1981 г. , в прямом ИФМ на присутствие антигенов хантавирусов обследовано около 300000 мелких млекопитащих (10 -20 % грубые суспензии легочной ткани) 63 видов, 14 семейств, отловленных на 70 административных территориях и, практически, всех ландшафтных зонах бывшего СССР. Антигены хантавирусов обнаружены у 46 видов, принадлежащих к 6 семействам (Muridae, Crice-tidae, Sciuriüae, GliriOae, Talpidae, Soricidae) отрядов Roden-tia и Insectívora, двум семействам (Leporidae и Ochotonlúae) отряда Lagomorpha, семейству Canidae отряда Carnívora и семейству Suiüae отряда Artiodactyla. Следует отметать, что к началу данных исследований экспериментально была установлена возможность инфицирования хантавирусами только двух видов грызунов: полевой мыши и рыжей полевки. В европейской части бывшего СССР антигены хантавирусов обнаружены у 32 видов млекопитающих, в регионах Сибири - у 6 видов, в Казахстане - у 3 видов, на Даль-ном Востоке - у 18 видов. Антигены хантавирусов также были обнаружены у 13 видов птиц, отловленных на Дальном Востоке.

На наличие антигенов хантавирусов обследованы легочные суспензии мелких млекопитащих, отловленных в Бельгии, Нидерландах и Западной Германии (более 2000 образцов), бывшей Чехословакии (3000 образцов), Швеции (4000 образцов). Гвинейской Республике (1100 образцов), Монголии (200 образцов). Антигены хантавирусов были выявлены у 5 видов животных в Бельгии, 2 видов в Нидерландах, 3 видов в Западной Германии, 3 видов в бывшей Чехословакии, одного вида в Швеции. Наибольшая частота обнаружения хантавирусных антигенов установлена среди рыжих полевок в Бельгии, Нидерландах и Западной Германии (15,8 %, 12,5 % и 12,2 % соответственно), в бывшей Чехословакии - среди обыкновенных

полевок (7,6 %), в Швеции - только у рыжих полевок (5,5 %), С отрицательными результатами были обследованы 18 видов мелких млекопитащих из Гвинеи и 6 видов из Монголии.

ИФМ также применялся для контроля при выделении штаммов хантавирусов (всего выделено 60 штаммов: из легочной ткани 8 видов грызунов и одного вида птиц, из крови больных ГЛПС и из секционного материала). Для этого часть инокулята сначала исследовали в ИФМ на присутствие антигенов хантавирусов, в случае положительного ответа другую часть инокулята использовали для заражения культуры клеток. Такой подход позволил избежать многочисленных "слепых" инокуляций, хотя имели место случаи выделения вируса из антигенотрицательных образцов.

Использование ИЯМ для определим антигенов хантавирусов в крови больных ГЛПС не дало четких результатов. При обследовании 800 образцов крови, взятых в различные сроки от начала заболевания (от 2 дней до I года), антигены хантавирусов были обнаружень в 8 % образцов. Определить какие-либо закономерности в динамике циркуляции антигена в крови, в величинах титров и частоты обнаружения антигена в зависимости от времени с начала заболевания ; тяжести клинического течения болезни не удалось. Поэтому опреде ление антигенов хантавирусов в крови больных ГЛПС с помощью ИЗ для ранней диагностики данного заболевания признано неэффектиЕ ным.

Применение ШМ для определения антигенов хантавирусов секционном материале (ретроспективная диагностика) продемонстрз ровало более четкие результаты. Антигены хантавирусов были обн; ружены в органах (10 % суспензии легких, печени, селезенк почек, сердца, головного мозга, лимфоузлов, надпочечников) 7 8 погибших с клиническим диагнозом ГЛПС и одного из 5 с подозр

нием на ГЛПС.

Хантавирусы, как и вирус ЛХМ, включены в список инфекционных агентов, на присутствие которых должны обследоваться колонии грызунов, используемые для биомедицинских исследований (материалы совещания Рабочей группы ВОЗ по ГЛПС, 1982 г.). В прямом ИФМ на присутствие антигенов хантавирусов обследованы 10 % суспензии легких от 524 животных, которые параллельно тестировали на наличие антигена вируса ЛХМ (раздел IЛ.)•В результате скрининга антитены хантавирусов обнаружены у одной мыши яшвш C57BI/6 и 4-х мышей линии ВАЬВ/с.

Следухщий раздел исследований касался применения ИФМ в серологической диагностике ГЛПС.

Проблема ранней серологической диагностики ГЛПС (в течение первых дней болезни) связана прежде всего с методом определения специфического глобулина класса М (IgM). Наличие специфического IgM в сыворотке пациента является четким признаком свежей инфекции. Кроме того, несомненный интерес представляло изучение динамики антителообразования (антитела классов М и G) в течение болезни. Для этих целей разработаны два подхода: непрямой вариант ИФМ с сенсибилизацией твердой фазы специфическим глобулином и непрямой ИФМ с сорбцией на твердую фазу частично очищенного антигена хантавируса. Использование перокеидазных коныогатов против IgM и IgG человека дало возможность селективной детекции специфических антител этих классов.

Изучение динамики формирования IgM и IgG антител проводили с сенсибилизацией твердой фазы высокоактивными (титр в МФА 1:320000) моноклональными антителами к вирусу Хантан (штамм 76-118) в виде иммунного асцита (панель моноклональных антител предоставлена д-ром J. McCormick, CDC, Atlanta). Стандартным

антигеном служил лизат инфицированного вирусом Хантан (штамм 76-118) монослоя клеток Vero Е6, в качестве контроля - лизат неивфицированных клеток этой культуры (каждое разведение исследуемой сыворотки тестировали параллельно со специфическим и контрольным антигеном). Сыворотки больных ГЛПС доставлялись из регионов Дальнего Востока. Сроки взятия сывороток - от 2 дней до 2 лет от начала болезни. Всего обследовано 369 сывороток (186 парных, 72 тройных н 161 одиночных) от 253 больных ГЛПС. В данном варианте ИФМ специфические антитела класса М в исследуемых сыворотках определялись на второй день болезни . (титры 1:128 -1:16000), достигая максимальных титров (до 1:64000) к 1-3 неделям болезни. С 4 недели до 3 месяцев наблюдалось резкое падение титров IgM; в течение следующих месяцев до конца I года Igtó в низких титрах регистрировался примерно в 30 % сывороток. К концу 2 года от начала заболевания специфические Igjá не выявлялись (рис.1). Параллельное обследование этих сывороток на присутствие специфического IgM в МФА показало низкую эффективность этого метода - IgM в невысоких титрах (до 1:16) регистрировался в течение только первой недели болезни.

Дополнительным контролем специфичности при определении IgM в ИФМ был тест на присутствие в исследуемых сыворотках ревматоидного фактора (РФ) - высокоавидных аутоантител класса М к IgG, могущих давать ложноположительные результаты. РФ определяли в непрямом ИФМ по схеме Knez et al. (1976) с собственными модификациями. Наличие РФ (или неспецифического IgM) в титрах не выше 1:256 в части исследуемых сывороток, однако, не оказывало влияния на результаты определения специфического IgM - четкая серо-конверсия при высоких значениях титров специфического IgM подтверждает это. Также очевидно, что присутствие IgG в исследуемых

СРЕДНЕПгОМЕГРЙЧЕСКЛЯ ТИТРА АНТИТЕЛ ( 1о£ 14

ДНИ ОТ НАЧАЛА ЗАБОЛЕВАНИЯ — - ИФМ : ~- МФА ;

ГОДА

РИС. 1. ДИНАМИКА ФОРМИРОВАНИЯ 1ЙМ АНТИТЕЛ У БОЛЬНЫХ ГЛПС

СРЁДНЕГЕОивТРИЧЕСКАЯ ТИТРА АНТИТЕЛ ( 1о£ 2 )

- - ИФМ ; —*— - МФА ;

РИС. 2. ДИНАМИКА ФОРМИРОВАНИЯ АНТИТЕЛ У БОЛЬНЫХ ГЛПС

сыворотках не оказывало конкурентного влияния при определении в ИФМ. Вероятно, что в МФА детекция осложняется именно конкуренцией

Специфический в ИФМ определялся в титрах 1:32 - 1:2048 в течение первой недели болезни, достигая плато (1:2048 -1:16000) к концу первого месяца от начала заболевания. С 1,5 месяцев наблюдалось некоторое снижение уровня титров (максимальное значение 1:4096). Далее (до 2 лет) среднегеометрические титров составляли 10 - II 1оц2. Аналогичная картина получена в МФА, но при более низких титрах на плато (рис.2).

Другой вариант ИФМ предусматривает сорбцию частично очищенного стандартного антигена непосредственно на твердую фазу (в первом варианте происходит иммунологическая очистка антигена из лизата инфищрованных клеток при его взаимодействии со специфическим глобулином, сорбированным на твердой фазе). Данный вариант обладает рядом преимуществ: отсутствует необходимость в приготовлении высокоактивного специфического глобулина для сенсибилизации твердой фазы, более простой сэндвич (трехкомпонентный), возможность комбинировать антигены различных хантавирусов (поливалентный антиген) для детекции антител широкого спектра типо-специфичности, что особенно важно при проведении сероэпидемиоло-гических исследований.

Таким образом, представленные варианты непрямого ИФМ могут эффективно использоваться как для ранней серологической диагностики ГЛПС, так и для массовых сероэпидемиологических исследований. Применение блока ИФМ для ранней серологической диагностики ГЛПС неэффективно - антитела выявлялись, начиная только с I месяца от начала заболевания. Скорее всего, это связано с низкой аффинностью ранних антител, в результате чего высокоаффинные

антитела специфического пероксидазного конъюгата легко связываются со стандартным антигеном. Однако блок ИФМ может быть использован (как его аналог - блок РИА) в серозпидемиологических исследованиях (изучение иммунной структуры и т.д.).

1.3. Птсорна- и гепаднавирусы.

ИФМ использовали в серологических исследованиях по определению маркеров вирусов гапатитов А и В в сыворотках крови населения Гвинейской Республики. Подобные исследования в Гвинее ранее не проводились, поэтому соответсвуодая информация отсутствовала .

Сыворотки собирали от практически здорового городского и сельского населения 4-х префектур Гвинеи. Возраст обследованных лиц - от 10 месяцев до 85 лет ; лица в возрасте до 15 лет отнесены в группу "дети", в возрасте 16 лет и старше - в группу "взрослые".

Определение антител к вирусу гепатита А - анти-БГА. Обследовано 812 проб сывороток. Анти-ВГА определяли с помощью блока ИФМ. Анти-ВГА пероксидазный конъюгат готовили на базе НИМВЛ на основе IgG, выделенного из сыворотки реконвалесцента (сыворотка предоставлена Ю.Ю. Кусовым, ИПВЭ РАМН). В качестве стандартного антигена ВГА использовали 10 % суспензию печени экспериментально инфицированной яванской макаки (Анджапаридзе и др., 1985). Частота обнаружения анти-БГА в сыворотках населения Гвинеи составила 67 % (табл. 4). Частота обнаружения анти-ВГА у детей (77 + 4 %) достоверно выше (р < 0,05), чем у взрослых (65 ± 2 %). Наиболее часто (до 84 %) анти-ВГА определялись в возрастных группах до 31 года. Частота обнаружения анти-ВГА у жителей города (75 %) выше, чем у жителей сельской местности (40 %). Эта закономерность отмечена как для детей, так и для взрослых. Опре-

Таблвда 4

Результаты определения ан-ш-ВГА в сыворотках населения ГР

Возрастная группа (года) Обследовано Положительных Процент

< 1 1 0 0

1 - 5 4 3 75 ± 25*

6 - 10 39 32 82 ± 6

11 - 15 50 37 74 ±6

16 - 20 82 69 84 ± 4

21 - 30 242 180 74 ± 3

31 - 40 189 107 57 t 4

41 - 50 101 62 61 ± 5

51 - 60 27 11 41 ■± 10

61 - 70 16 3 19 ± 10

> 70 17 3 18 ± 10

Нет данных 44 33 75 ±т

И т о г о 812 540 67 ± 2

* - Средняя ошибка процента Б

СРЕДНЕГЕОМЕТРИЧЕСКАЯ ТИТРА 2)

10 -Т-

ВОЗРАСТНЫЕ ГРУППЫ ( годы )

РИС. 3. УРОВНИ ТИТРОВ АНТИ-ВГА В СЫВОРОТКАХ НАСЕЛЕНИЯ ГР В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ВОЗРАСТА

деление титров анти-ВГА подтвердило раннее приобретение анти-ВГА с последующим спадом: титры анти-ВГА (7,9 + 0,35 log2) выше (р < 0,05), чем у взрослых (6,2 + 0,26 log2, рис. 3). Титры анти-ВГА в сыворотках городского населения (6,9 + 0,28 log2) выше (р < 0,05), чем в сыворотках сельского населения (6,3 + 0,45 log2). При сравнении титров анти-ВГА у детского и взрослого населения в городской и сельской местности наблюдалась отмеченная выше закономерность: уровень титров анти-ВГА у детей как в городе, так и на селе (8,2 + 0,41 и 7,1 + 0,6 log2 соответственно) выше (р < 0,05), чем у взрослых в соответствующих группах (6,3 + 0,29 и 5,7 + 0,54 log2). При этом уровень титров анти-ВГА у городских детей выше (р < 0,05), чем у сельских, в то время как уровни анти-ВГА у взрослых, проживающих в городе и на селе, достоверно не различаются (р > 0,05).

Определение поверхностного антигена вируса гепатита В (HBs Ag). Обследовано II99 проб сывороток. HBs Ag определяли в прямом ИФМ. Специфический пероксвдазный коньюгат готовили на базе НШВЛ из IgG, выделенного из коммерческой анти-HBs Ag сыворотки осла. Частота обнаружения HBs Ag в сыворотках населения Гвинеи составила 16 % (табл. 5). При этом у детей HBs Ag определялся в 18 + 4 %, у взрослых - 15 + I %. Достоверного различия частоты обнаружения HBs Ag у детей и взрослых не установлено (р > 0,05), однако наиболее высокий процент HBs Ag-носительства наблюдали в возрастных группах до 41 года (р < 0,05). Достоверных различий частоты HBs Ag-носительства между грушами городского и сельского населения (сравниваемые группы мальчики-девочки, мужчины-женщины) не обнаружено (р > 0,05).

Результаты определения анти-ВГА и HBs Ag в сыворотках крови населения Гвинеи близки к результатам, полученным при исследова-

Таблица 5

Результаты определения HBsAg в сыворотках населения ГР

Возрастная группа (годы) Обследовано Положительных Процент

< 1 1 0 0

1 - 5 4 2 50 ± 29*

6 - 10 39 8 20 ± 6

11 -15 46 6 13 ± 5

16 - 20 89 22 25 ± 5

21 - 30 544 96 18 - 2

31 - 40 275 39 14 - 2

41 - 50 124 9 7 ± 2

51 - 60 34 0 0

61 - 70 16 0 0

> 70 16 1 6 ± 6

Нет данных 12 3 25 ± 13

И т о г 0 1199 186 16 ± 1

* - Средняя ошибка процента S

нии сывороток населения пограничных с Гвинеей стран Западной Африки. Для гепатита А это высокая частота обнаружения анти-НГА и высокие титры анти-ВГА у детей (Paulin, 1982; Prince, 1985). Частота выявления HBs Ag (по данным РИА ч РПГА) составляет в Сенегале 14 - 17 % (Pranet, 1982), в Мали - 17,1 % (Maupas, 1982).

Полученные данные позволяют сделать вывод: результаты определения анти-ЕГА и HBs Ag в сыворотках крови населения Гвинейской Республики с помощью 7Ш характерны для стран Западной Африки и отражают некоторые особенности эпидемиологических процессов при гепатитах А и В в Африке (Gebreselassîe, 1983).

1,4. Флавивирусы.

Разработка к применение ИФМ тест-систем для лабораторной

диагностики клещевого энцефалита (КЭ) открыла новые возможности в изучении »той актуальной проблемы. При обследовании природных очагов КЭ система ИФМ-скрининга позволила определять'вирусспеци-фический антиген в суспензиях органов млекопитающих и иксодовых клещей. Так, при скрининге б видов мелких млекопитающих, отловленных в Краснодарском крае, антиген вируса КЭ в 10 % суспензиях мозга обнаружен у обыкновенной полевки, лесной мыши и полевой мыши. Вирусспецифический антиген выявлен также в суспензиях клещей Dermacentor maxgimtus и Ixodes ricinus.

Высокая эффективность ИФМ была продемонстрирована в серологической диагностике КЭ. При обследовании парных сывороток крови больных КЭ в непрямом ИФМ была отмечена значительно более четкая динамика сероконверсии (4-х кратное нарастание титров специфических IgG антител) и в более ранние сроки, чем при использовании традиционных тестов - РТГА и РСК. Диагностическое значение этот метод имел уже на второй неделе от начала заболевания.

Большое практическое значение представляло изучение тех изменений гуморального иммунитета, которые наблюдаются после вакцинации против КЭ. Обследование сывороток крови людей, вакцинированных против КЭ, показало, что в ИФМ антитела выявлялись во. всех обследованных случаях уже после однократного введения вакцины, тогда как в РТГА это оказалось возможным только в 31 % случаев.

1.5. Тогавирусы.

Данный представитель тогавирусов - вирус Чикунгунья. Изучению иммунной прослойки населения Гвинейской Республики по отношению к этому вирусу были посвящены исследования, представленные ниже. Подобные исследования в Гвинее ранее не проводились, поэтому полученная информация также носит приоритетный ха-

рактер.

Для работы использовали непрямой ИФМ и блок ИФМ. Перокси-дазные диагностикумы (включая специфический пероксидазный коныо-гат) были приготовлены на базе НИВЛ из ИАЖ белых мышей (титр в РСК 1:320) к штамму АУ-5767 вируса Чикунгунья, выделенного из пула иксодовых клещей АтЫуотта vaгiegatum (Во1го е1; Ьотопозэоу, 1984). В качестве стандартного антигена использовали 10 % суспензии мозга нбм, инфицированных штаммом АУ-5767. Непрямой вариант ИФМ проводили с сенсибилизацией твердой фазы иммунным асцитом к вирусу Чикунгунья. Специфический в исследуемых сыворотках определяли с помощью пероксидазного конъюгата против человека. Блок прямого ИФМ использовали для верификации положительных образцов.

Всего обследовано 1093 сыворотки практически здорового населения (мужчины и женщины) в возрасте от I года до 90 лет, собранные в 9 префектурах Гвинеи. Общее количество серопозитивных лиц по всем обследованным префектурам составило 51,7 % (табл. 6). Отмечено достоверное различие (р < 0,05) в проценте серопозитивных лиц между возрастными группами до 20 лет (45 + 3 %) и 21 - более 70 лет (56 +2 %). Процент серопозитывных лиц среди мужчин и женщин практически одинаков. Серологическая прослойка в различных префектурах оказалась неодинаковой. Так, в префектуре Кундара (Средняя Гвинея) она составила 65,9 %, в префектуре Киндиа (Нижняя Гвинея) - 43,9 %, в префектурах Куруса, Канкан и Сигири (Верхняя Гвинея) - суммарно 82,6 %. Рост процента серопозитивных лиц с возрастом говорит о постоянных (в течение жизни) контактах населения с вирусом, то есть об эндемичности данной инфекции на территории Гвинеи. Неравномерность серологической прослойки по различным префектурам страны - результат взаимодей-

Таблица 6

Результаты определения антител к вирусу Чикунгунья в сыворотках населения ГР

Возрастная группа (года) Обследовано Положительных Процент

I - 10 65 26 40,0

II - 20 178 83 46,6

21 - 30 226 104 46,0

31 - 40 248 137 55,2

41 - 50 138 82 59,4

51 - 60 60 40 66,7

61 - 70 38 27 71,0

> 70 24 19 79,2

Нет информации 116 47 40,5

Всего 1093 565 51,7

ствия сложного комплекса факторов (климатических, географических, биологических и т.д.), который требует дальнейшего изучения. Не исключено, что в данных вариантах ЙФМ выявлялись антитела и к наиболее антигенно близкому к вирусу Чикунгунья другому альфавирусу - представителю комплекса вируса Семлики - вирусу О'Ньонг-Ньонг (Львов и др., 1989). Согласно опубликованным данным серологическая прослойка по отношению к вирусу Чикунгунья в ряде стран Африки (Сенегал, ЦАР, Уганда, Камерун) может достигать 82 % по данным РТГА (International Catalogue of Arboviruses, 1985).

Заключение.

Очевидно, что представленные результаты могли быть получены

только посредством такого чувствительного и продуктивного метода иммуноанализз, как ИФМ. Вместе с тем эти результаты являются не просто доказательством эффективности метода, но прежде всего имеют самостоятельную и признанную научную ценность и приоритетность.

Система ИФМ скрининга природных образцов поставила эпизо-отологические исследования на совершенно новый уровень, придав им строгую объективность и масштабность. На ее основе были разработаны принципы мониторинга эндемичных территорий и разведки природных очагов вирусных инфекций. Наиболее полное развитие этот подход получил при изучении циркуляции и распространения хантавирусов на территории бывшего СССР и за его пределами.

Результаты работ, выполненных в Гвинейской Республике, продемонстрировали также мобильность и гибкость метода и возможность проведения с его помощью достаточно сложных и информативных исследований практически в экспедиционных условиях.

II. Оптимизация ИФМ.

Как уже отмечалось, превращение принципа ИФМ в работоспособный и эффективный инструмент регистрации вирусных антигенов и противовирусных антител требовало оптимизации и стандартизации метода. Для этого необходимы были экспериментальный анализ всех этапов теста и функциональная оценка его компонентов. Обсуждение этих вопросов вынесено во второй раздел диссертации, что не противоречит замыслу работы, но подчеркивает их подчиненность основной цели - экспериментальной оценке эффективности ИФМ и разработке надежных тест-систем.

Определение основных параметров ИФМ обеспечило создание не только экспериментальных диагностических систем, но и конструи-

рование коммерческих даагностикумов. Базисным вариантом, на основе которого разрабатывались условия оптимизации ИФМ, был прямой вариант для определения антигенов.

2.1. Прямой вариант для определим антигенов.

Для прямого варианта необходим специфический (антивирусный) иммуноглобулин класса б (1^), который используют для сенсибилизации твердой фазы и для связывания с ферментом (приготовление пероксидэзного коныогата). Источниками служили: гипериммун-кые сыворотки лабораторных животных, иммунные асцитные жидкости (ИАЖ) белых мышей, сыворотки реконвалесцентов. Основополагающим

моментом разработки прямого варианта ИФМ было определение четких

/

критериев качества иммунных препартов как источников специфического 1§С. К началу данной работы в литературе не было представлено исчерпывающей информации по этому вопросу. Авторы либо вообще не касались его, либо ограничивались общими фразами ("высокоактивная сыворотка", например, у МагМеэеп ег а1., 1978). Для иммунных препаратов были определены следующие критерии. Специфическая активность (титры антител) иммунных сывороток и ИАЖ должна быть не ниже 1:128 в реакции связывания комплемента (РСК), 1:32 в реакции диффузионной преципитации в геле агара (РДПА), 1:16000 в непрямом методе иммунофлуоресценции (МФА). полу-

чении е из иммунных препартов с более низкими титрами специфических антител, были непригодны ни для сенсибилизации твердой фазы, ни для приготовления пероксидазных коныогатов : в том и другом случае отмечалось резкое падение чувствительности и специфичности ИФМ (ложноположительные результаты, высокий неспецифический фон в контролях и т.д.). Этот критерий, оправдавший себя при разработке ИФМ для лабораторной диагностики различных вирусных инфекций, лег в основу стандарта и значительно упростил подход к

созданию высокоактивных пероксидазных диагностикумов, а также объяснил причины неудач ряда авторов при разработке ИФМ: низкая специфическая активность сырья - источника IgG.

Чем выше специфическая активность (титра антител) иммунных препаратов, тем выше чувствительность и специфичность пероксидазных диагностикуиов, приготовленных из такого сырья. Использование иммунных сывороток (ИАЖ) с титрами специфических антител 1:128 - 1:256 по РСК и сывороток реконвалесцентов после ГЛПС с титрами 1:32000 - 1:64000 по непрямому МФА обеспечивало чувствительность пероксидазных диагностикумов не ниже 10 нанограмм (нг) вирусспецифического белка на I мл.

Для выделения IgG из иммунных препаратов апробированы 3 метода: гель-фильтрация на колонках с Sephadex G-200, Sephacryl S-200 - S-300, ионообменная хроматография на колонке с DEAE-Sephadex А-50, аффинная хроматография на колонке с Protein A Se-pharose CL-4B. Сравнительная оценка этих методов показала преимущество аффинной хроматографии как наиболее тонкого (обеспечивает высокую чистоту препарата IgG) и достаточно простого в исполнении метода. Однако показано также, что степень чистоты препарата IgG не оказывает столь выраженного влияния на качество пероксидазного диагностикума: пероксидазный диагностикум, полученный с использованием аффинной хроматографии, превышал чувствительность диагностикумов, полученных с использованием двух других методов, не более чем в 2 раза.

Конъюгацию специфических IgG с пероксидазой хрена проводили по методу Nakane и Kawaoi (1974) в модификации Mathiesen et al. (1978) с собственными модификациями. В основе данного метода лежит окисление углеводных групп пероксидазы перийодатом натрия до альдегидных, которые затем связываются с аминогруппами IgG. Ис-

пользовали пероксидазу хрена только 6-го типа (содержащую оптимальное количество углеводных групп) со степенью чистоты (RZ) не ниже 3.0 в основном импортную ("Slgnia", "Boehringer Mannheim", "Serva"). Для работы пригодны фракции конъюгата с RZ (выражает в данном случае соотношение количества пероксидазы и IgG в конъю-гате) от 0,45 до 0,6.

Постановку прямого ИФМ начинали с определения оптимальной концентрации IgG для сенсибилизации твердой фазы и рабочего разведения конъюгата. Эти параметры подбирали шахматным титрованием глобулина и конъюгата в присутствии постоянной дозы стандартного вирусного антигена. Концентрация IgG для сенсибилизации твердой фазы зависит от его специфической активности; в данной работе оптимальные концентрации IgG определены в 3 - 20 микрограмм (мкг) на мл. Рабочее разведение конъюгата также зависит от его специфической активности; в работе использовали конъюгата с рабочими титрами 1:320 - 1:5120 (в среднем 100 нг/мл пероксидазы и 400 нг/мл общего белка). Концентрация IgG для сенсибилизации твердой фазы и рабочее разведение конъюгата - основные параметры ИФМ. Неточное их определение приводит к снижению чувствительности и специфичности метода, особенно это касается конъюгата. При разработке основных параметров ИФМ для учета результатов реакции необходим фотометр типа Titertek Multiscan. Визуальный учет допустим при уже отработанных условиях проведения теста.

Для определения антигенов прямым ИФМ наиболее адекватным контролем признан контроль в виде нормального IgG (выделенный из зыворотки того же вида животного-донора специфического глобулина, но не содержащей антител к исследуемому вирусу), которым се-зсибилизировали лунки имиунопанели параллельно специфическому [gG. Таким образом, оценивали, как исследуемый антиген взаимо-

дейсхвует со специфическим и нормальным глобулинами. Степень этого взаимодействия выражали показателем Р/И - отношение оптической плотности лунок, сенсибилизированных специфическим (Р) к оптической плотности лунок, сенсибилизированных нормальным (Ы). Дальнейшая задача заключалась в выборе метода определения статистически достоверной разницы мевду значениями Р и N и установлении критерия положительного результата. Это, в свою очередь, зависит от качества иммунопанели. Качество (пригодность иммунопанели для ИФМ) определяется двумя основными параметрами: сорбционной емкостью (количество бежа - глобулина на лунку) и уровнем стабильности сорбции по отдельным лункам панели (выражается степенью разброса результатов по лункам). При работе с II типами отечественных и импортных полистирольных и поливинилхло-ридных иммунопанелей показано, что использование панелей с емкостью 0,2 - 0,25 мкг глобулина на лунку обеспечивает высокую чувствительность ИФМ. При проверке иммунопанелей с различной сорбцибнной емкостью (0,1 - 0,2 мкг и 0,2 - 0,25 мкг на лунку) показано, что изменение концентрации для сенсибилизации твердой фазы от 1,5 до 100 мкг/мл не увеличивает чувствительность ИФМ. Концентрация З^С (для любых паней) больше 20 мкг/мл нецелесообразна .

По уровню разброса результатов по лункам (высчитывался коэффициент вариации V) панели разделены на 3 категории: I) V - до 10 %, 2) V - 10 - 20 % и 3) V - более 20 %. Для ИФМ пригодны панели I и 2 категорий, панели 3 категории требуют многократных повторов (5-6) исследуемого образца антигена. Предложены статистические методы определения достоверной разницы между значениями Р и N и установлены критерии положительного результата дяя различных категорий иммунопанелей. Для первой категории панелей

положительный результат соответствует Т/И > 1,6. Для второй категории результат считали положительным при Р/Ы > 2,1. Тот и другой критерий рассчитан на однократный анализ антигена. Последний критерий (Р/Н > 2,1) соответствует распространенному критерию (Уо1кеп, 1974), и применялся в данной работе, поскольку в основном использовались панели 2 категории. Жесткий критерий Р/Ы >2,1 оправдан также при обследовании тысяч образцов (грубых суспензий органов диких животных при массовых эпизоотологических исследованиях), поскольку практически полностью исключает ложно-положительные результаты, возможные при обследовании сложных белковых смесей, которые представляют собой 10 - 20 % суспензии органов животных.

Изучение влияния рН буфера, в котором растворяли глобулин для сенсибилизации твердой фазы показало, что для панелей с высокой сорбционной емкостью (до 0,25 мкг белка на лунку) изменение рН от 7,2 (фосфатно-солевой буфер) до 9,6 (карбонатный буфер) мало влияло на чувствительность ИФМ. Для панелей со средней и низкой сорбционной емкостью (от 0,2 до 0,1 мкг белка на лунку) использование буфера с рН 9,6 повышало оптическую плотность опытных образцов на 20 - 50 %, и увеличивало титр исследуемого антигена на I - 2 разведения.

Чувствительность прямого варианта ИФМ для определения антигенов превышает чувствительность РСК в 128 - 256 раз, и в среднем составляет 10 нг/мл вирусспецифического белка.

В таблице 7 суммированы основные принципы оптимизации прямого варианта ИФМ.

Таблица 7

Оптимизация прямого варианта ИФМ для определения вирусных

антигенов

Источник специфических антител и их титр гипериммунная поликлональная сыворотка, сыворотка реконвалесцента, моноклональ-ная сыворотка - РСК > 1:128, МФА > 1:16000, РДПА > 1:32

Метод выделения аффинная хроматография (Protein A Sep-harose), ионообменная хроматография (DEAE-Sephadex А-50), гель-фильтрация (Sephadex G-200j Sephacryl S-200-300)

Метод конъюгации с пероксидазой хрена (тип 6, яг = 3,0) Nakane-Kawaoi, оптимальное соотношение пероксидаза / IgG (403 нм / 280 нм) = = 0,45 - 0,6

Твердая фаза Сенсибилизация твердой фазы иммунопанели из полистирола и поливи-нилхлорида - сорбционная емкость 0,20,25 мкг на лунку, уровень разбоса результатов по лункам (V) до 10-20 % до 20 мкг/мл IgG в буфере с pH 7,2-9,6

Рабочее разведение конъюгата подбирается шахматным титрованием, в . среднем 100 нг/мл пероксидазы и 400 кг/мл общего белка конъюгата

Контроль специфичности системы сенсибилизация твердой фазы нормальным IgG параллельно специфическому IgG -антиген оценивается по уровню связывания со специфическим и нормальным IgG (соотношение F/N)

Интерпретация результата положительный при P/N > 1,6 (для панелей с V до 10 %) и > 2,1 (для панелей с V до 20 % )

Чувствительность системы не ниже 10 нг/мл вирусспецифического бежа

2.2. Блок прямого варианта ИФМ для определения антител. В этом варианте использовали все компоненты прямого ИФМ,

исследуемый антиген заменяли стандартным антигеном. Специфические антитела, содержащиеся в исследуемой сыворотке, блокирувэт соеданение конъгогата со стандартным антигеном. Иммунопанель сенсибилизировали специфическим IgG, который затем связывали с гомологичным (стандартным) антигеном, к последнему и определяли антитела в исследуемой сыворотке. Дозу стандартного антигена подбирали шахматным титрованием с известной сывороткой в блоке ИФМ; его оптимальная доза составляет 4-8 антигенных единиц. Неточный выбор дозы стандартного антигена приводит к снижению чувствительности анализа (в случае передозировки антигена) или к ложноположителькым результатам (в случае уменьшения дозы антигена). Инициальное разведение исследуемой сыворотки - 1:16. Остальные этапы анализа - добавление специфического пероксидазного коныогата, субстрата, учет реакции - аналогично прямому методу. Контроли: сенсибилизация нормальным IgG для контроля системы и F/N, нормальная сыворотка (ИАЖ) или буфер. Исследуемая сыворотка считается положительной, если в результате ее инкубации со стандартным антигеном оптическая плотность лунок, содержащих стандартный антиген, снижается на 50 и более процентов по сравнению с оптической плотностью антигенсодержащих лунок, инкубированных с нормальной сывороткой или буфером ( Yolken, 1974). Чувствительность блока прямого ИФМ для определения антител относительно невысока, и превосходит чувствительность РСК в 32 раза - это обусловлено тем, что антитела исследуемой сыворотки конкурируют с высокоаффинным IgG пероксидазного конъюгата за связь с эпитопами стандартного антигена.

2.3. Непрямой вариант ИФМ для определения антигенов и специфических антител классов М и G с сенсибилизацией твердой фазы специфическим глобулином.

Для определения антигенов иммунопанель сенсибилизировали специфическим IgG, вносили и инкубировали исследуемый антиген, затем добавляли гомологичную исследуемому антигену стандартную сыворотку (ИАЖ) в дозе, подобранной шахматным титрованием с гомологичным антигеном. Оптимальная доза стандартной сыворотки составляет 16 - 32 единицы. Далее вносили антивидовой (против IgG животного - донора стандартной сыворотки) пероксидазный конъю-гат. Этот конъюгат должен быть не против IgG вида животного, от которого получен глобулин для сенсибилизации. В работе использовали коммерческие анти-IgG пероксидазные кокыогаты, либо конъю-гаты готовили по вышеуказанному методу (аналогично специфическим коныогатом), используя IgG, полученные из антивидовых сывороток с титром в РДПА не ниже 1:32. Остальные этапы анализа - аналогично прямому ИФМ. Контролем служили нормальные сыворотки (ИАЖ), которые вносили параллельно стандартным в таких же разведениях. Результат считается положительным, если оптическая плотность содержимого опытных лунок (со стандартной сывороткой) превосходит оптическую плотность содержимого контрольных лунок (с нормальной сывороткой) в 2,1 и более раз. Чувствительность непрямого варианта для определения антигенов в среднем превышает чувствительность РСК в 256 - 512 раз.

Для определения антител в лунки сенсибилизированной специфическим IgG панели вносили гомологичный (стандартный) антиген в дозе, подобранной шахматным титрованием с гомологичной сывороткой (4 - 32 единицы). Данным методом определяли специфические IgM и IgG антитела, поэтому использовали анти-IgM или анти-IgG пероксидазные конъюгаты. Остальные этапы анализа ~ аналогично другим вариантам. Контролем служил нормальный антиген (того же происхождения, что и стандартный). Результат считали положитель-

ным, если оптическая плотность содержимого опытных лунок (со стандартным антигеном) превосходила оптическую плотность содержимого контрольных лунок (с нормальным антигеном) в 2,1 и более раз. Следует отметить, что диапазон доз стандартной сыворотки для определения антигенов узок (16 - 32 единицы), а диапазон доз стандартного антигена при определении антител достаточно широк (4 - 32 единицы). Стартовое разведение исследуемой сыворотки допустимо с 1:16. Чувствительность непрямого варианта для определения антител превосходит чувствительность РСК в 512 - 2048 раз, и в среднем составляет примерно 10 нг/мл

2.4. Непрямой вариант ИФМ для определения специфических антител классов ИиСс сорбцией стандартного антигена на твердую фазу.

Этот вариант требует достаточно тонкой очистки стандартного антигена. Предложен следующий способ частичной очистки стандартного антигена (на модели хантавирусов) с использованием гель-фильтрации. Инфицированные клетки Уего-Б6 (через 2 недели после заражения при наличии 100 % светящихся клеток в МФА, инфекционный титр вируса не менее 6 БОЕ/мл) отмывали и суспендировали в фосфатном буфере, разрушали однократным замораживанием и оттаиванием, а затем - ультразвуком (22 кгц). Полученный лизат обрабатывали I % тритоном х-100 и подвергали гель-фильтрации на колонке с БерЬаго8е 4В. Антигенную активность полученных фракций проверяли в прямом ИФМ. Фракции с минимальным содержанием белка, но с максимальной антигенной активностью использовали как стандартный антиген. Дозу стандартного антигена (в мкг/мл белка) подбирали шахматным титрованием со стандартной сывороткой в непрямом ИФМ. В среднем это 10 - 20 мкг/мл. Аналогичным способом готовили нормальный антиген из неикфицированных клеток Уего-Е6.

Чувствительность данного варианта определена в I нг/мл- 100 пикограмм (пг)/мл Ig, и превосходит чувствительность непряного МФА в 8 - 16 раз. Стартовое разведение исследуемых сывороток -не ниже 1:64.

Заключение.

Предложенные в данном разделе подхода к оптимизации различных вариантов ИФМ обеспечивают высокую чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов анализа. Определение четких критериев качества иммунных препаратов (источников специфических IgG) является приоритетным и регламентирует высокий стандарт пероксидазных диагностикумов, что особенно важно при использовании в качестве источника антител поликлональных сывороток, которые (в отличие от моноклональных сывороток) гораздо труднее поддаются стандартизации.

III. Разработка и внедрение в производство коммерческих

иммуноферментных тест-систем.

Положительный опыт применения лабораторных иммуноферментных тест-систем (например, для определения антигенов хантавирусов в эпизоотологических исследованиях) позволил перейти к заключительному этапу - созданию полных диагностических наборов, пригодных для использования как в специализированных вирусологических лабораториях, так и в учреждениях практического здравоохранения (центрах санэпиднадзора, противочумных станциях и т.д.). Объективная потребность в таких наборах существует. Основная проблема перевода лабораторной технологии изготовления пероксидазных диагностикумов в промышленную - сохранение высокой специфической активности препаратов, а также конструирование простой и надеж-

ной системы для широкого круга пользователей.

3.1. Иммуноферментная тест-система для определения

антигенов хантавирусов - ХАНТАГНОСТ.

ХАНТАГНОСТ (товарный знак, диагностикум защищен авторским свидетельством) рассчитан прежде всего для определения антигенов большинства известных хантавирусов в грубых суспензиях органов диких животных (мониторинг эндемичных территорий, разведка природных очагов ГЛПС и т.д.). Тест-система обеспечивает быстрый скрининг (в течение 24 часов) сотен образцов. Учет результатов проводится фотометрически, либо визуально. Чувствительность - не ниже 10 кг/мл вирусспецифического белка. ХАНТАГНОСТ представляет собой полный диагностический набор для прямого варианта ¡ИМ (12-ти компонентный), состоящий из специфических компонентов (специфический и нормальный IgG для сенсибилизации иммунопанели, пер-оксидазный специфический коныогат, контрольный антиген) и неспецифических - концентраты буферов, ферментный субстрат, иммунопа-нель и т.д.). Один комплект рассчитан на обследование 47 образцов.

Принцип конструирования данной тест-системы (как и ее лабораторной модели) основан на использовании сыворотки реконвалес-цента (не ранее 6 месяцев от начала заболевания) с высокими титрами- (не менее 1:16000 - I: 32000 в непрямом МФА) антител к хантавирусному серотипу Пумала. Такая сыворотка служит источником специфического IgG, который используется для сенсибилизации иммунопанели и для приготовления пероксидазного конъюгата (во избежание неспецифических реакций IgG для сенсибилизации твердой фазы и IgG для пероксидазного конъюгата выделяют из сывороток разных реконвалесцентов). Использование IgG к серотипу Пумала обеспечивает универсальность тест-системы - возможность выявлять

антагены большинства известных хантавирусных серотипов (см. раздел 1.2.). Следует отметить, что сыворотки людей как источник специфических антител используются и за рубежои для приготовления коммерческих пероксидазных диагностикумов. Например, крупнейший производитель диагностических препаратов фирма Qrganon TeKnlka (Нидерланды) выпускает такой диагностикум душ определения антигена вируса иммунодефицита человека. На сегодняшний день сыворотки реконвалесцентов - наиболее доступный источник полноценных (высокоаффинных) антител.к серотипу Пумала. Пока еще не удалось получить высокоактивные препараты иммунных сывороток животных и моноклональных антител к данному хантавирусу, пригодные для изготовления чувствительных пероксидазных диагностикумов (Nlklasson, 1991).

Из трех апробированных методов выделения IgG (раздел 2.1) аффинная хроматография на колонке с Protein A Sepharose CL-4B признана наиболее эффективной (высокая чистота получаемого препарата IgG), технологичной и экономичной. Технологический цикл изготовления тест-системы предусматривает выделение IgG из 5 мл сыворотки на мини-колонке с Protein A Sepharose CL-4B объемом 2 мл (такая колонка рассчитана на минимум 50 выделений). Количество IgG, выделенного из 5 мл сыворотки реконвалесцента, достаточно для анализа не менее 10000 образцов. Аналогичным образом готовят препарат нормального IgG для контрольной сенсибилизации твердой фазы (контроль специфичности), источником которого служат сыворотки доноров, не содержащие антитела к хантавирусам. Такой подход обеспечивает практически 100 % специфичность тест-системы и значительно упрощает учет и интерпретацию результата, поскольку каждый исследуемый антигенный образец оценивается по 'степени его связывания со специфическим и нормальным IgG.

Пероксидазный конъигат готовят по методике, описанной в в разделе 2.1. Данный метод обеспечивает высокую стандартность и большой выход конъюгата. Так, при конъюгации 5 мг пероксидазы с I мл IgG (10 мг/мл) подучают 3-6 мл конъюгата (средний рабочий титр 1:1280 - 1:2560), достаточного для обследования минимум 30000 образцов.

Контрольный антиген представляет собой инактивированный формалином лизат клеток Vero Е6, инфицированных штаммом CG-1820 серотипа Пумала.

Специфические компоненты тест-системы выпускают в лиофильно высушенном виде. Выпуск пероксидазного конъюгата предусмотрен такяе и в жидком виде - в присутствии 50 % глицерина. Такая форма выпуска обеспечивает его большую стабильность в условиях хранения при + 4 0 С. Срок годности тест-системы определен в I год в условиях хранения пр + 4 0 С.

Таким образом, технологический цикл изготовления тест-системы предусматривает следующие этапы: получение препаратов специфического и нормального IgG, приготовление пероксидазного конъюгата, приготовление контрольного антигена, приготовление неспецифических компонентов, компановка тест-системы (рис. 4). Детальное описание технологического цикла изготовления, стандартизации и контроля тест-системы представлено в "Экспериментально-производственном регламенте" (приложение).

С апреля 1992 г. экспериментально-производственным предприятием Института полиомиелита и вирусных энцефалитов Российской АМН выпущено 14 коммерческих серий (всего 1600 комплектов) тест-системы. Потребители (более 30 организаций) - центры санэпиднад-зора, противочумные станции, вирусологические лаборатории НИИ.

РИС. 4. СХЕМА ТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ЦИКЛА ИЗГОТОВЛЕНИЯ ХАНТАГНОСТ

-533.2. Перспективные иммуноферментные тест-системы: для определения антител классов М и G к хантавирусам и для определения антигена вируса ЛХМ.

йммуноферментная тест-система для определения антител классов М и G непрямым ИФМ к хантавирусам (предположительное название ХАНТАТЕСТ) предназначена для ранней серологической диагностики ГЛПС (определение IgM антител в сыворотках больных) и для сероэпидемиологических исследований (определение IgG антител в сыворотках доноров). Тест-система основана на использовании частично очищенного антигена хантавируса, сорбированного на твердую фазу без сенсибилизации специфическим глобулином (раздел 2.4.). Источник антигена - лизат инфицированных хантавирусом клеток Vero Еб, инактивированный формалином. Метод очистки антигена -гель-фильтрация на колонке большого объема (до 300 ил) с Sepha-rose 4В (6В) для получения препаративного количества антигена. Аналогичным способом готовится нормальный антиген (из лизата не-инфицированных клеток Vero Еб) для параллельной сорбции на твердую фазу. Таким образом, каждое разведение исследуемой сыворотки оценивается по степени связывания со специфическим и нормальным антигеном. Предусмотрено использование поливалентного антигена -смеси антигенов минимум двух хантавирусных ееротипов (Пумала и Хантан) для определения антител различной типоспецифичности. Для селективной детекции специфических антител классов М и G используют пероксидазные конъюгаты против IgM и IgG человека. Тест-система также может использоваться для определения антител к хантавирусу в сыворотках животных, для этого необходимы только пероксидазные конъюгаты против иммуноглобулинов соответствующих видов животных. Тест-система комплектуется референс-сывороткой и всеми необходимыми неспецифическими компонентами для ИФМ. Чувст-

вительность тест-системы - не ниже I нг/мл 1§. Стартовое разведение исследуемых сывороток - 1:64 - 1:256,

Иммуноферментная тест-система для определения антигена вируса ЛХМ основана, как и ХАНТАГНОСТ, на прямом варианте ИФМ. Тест-система предназначена для определения антигена вируса ЛХМ в грубых суспензиях органов лабораторных животных (грызунов) как метод контроля на контаминацию этим вирусом, а также для эпизо-отологических исследований. Источником специфического З^ служат гипериммунные сыворотки лабораторных животных и ИАЖ. Технологии изготовления и параметры тест-системы полностью соответствуют ХАНТАГНОСТ. Многолетнее интенсивное использование лабораторной модели тест-системы показали ее высокую эффективность. Инструкция по изготовлению и контролю и инструкция по применению тест-системы утверждены, а сам диагностикум рекомендован к внедрениг в медицинскую практику (протокол Л I заседания КВС МЗ СССР с« 9.09.1983 г.).

Таким образом, технология изготовления промышленных ИФ> тест-систем опирается на разработанные четкие критерии и принципы при конструировании их лабораторных моделей. Успешная коммерциализация диагностической системы (например, ХАНТАГНОСТа) сви детельствует о ее эффективности и надежности.

Общее заключение по работе.

Комплексный анализ такой сложной системы, как ИФМ, показа реальную возможность адаптации метода для лабораторной диагнос тики вирусных инфекций. Разработка и целенаправленное использо вание ИФМ тест-систем в различных направлениях исследований про демонстрировали эффективность метода. Результаты этих исследова ний приоритетны как в плане новизны, так и в плане методическог

подхода, обоснованность которого подтверждена обширным экспериментальным материалом. Оптимизация и детальная разработка параметров теста обеспечила также перевод лабораторной технологии изготовления ИФМ тест-систем в промышленную. Предложенные четкие критерии и стандарты при конструировании ИФМ тест-систем позволяют адаптировать метод для лабораторной диагностики различных вирусных инфекций.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны условия оптимизации различных вариантов ИФМ для определения вирусных антигенов и противовирусных антител. Детальный анализ всех этапов ИФМ, а также функциональная оценка компонентов метода (твердая фаза, иммунные препараты, антигены и т.д.) позволили определить стандарты пероксидазных диагностикумов и на этой основе конструировать ИФМ тест-ситемы для лабораторной диагностики различных вирусных инфекций.

2. Экспериментально продемонстрированы преимущества ИФМ. К ним относятся: высокие чувствительность и специфичность, объективный учет и однозначность интерпретации результатов, возможность проведения массовых анализов в короткий период времени, возможность обследования широкого спектра антигенных образцов различной природы.

3. Впервые в исследовательской практике предложены экспериментальные модели И®! тест-систем для лабораторной диагностики инфекций, вызываемых вирусами - представителями семейств Агепау±г1йае и Випуау1г1<1ае.

4. Создана система ИФМ скрининга природных образцов для определения вирусспецифических антигенов. На ее основе разработаны и внедрены в практику принципы систематического

мониторинга эндемичных территорий и разведки природных очагов вирусных инфекций.

5. Анализ представительного экспериментального материала по результатам применения ИФМ в конкретных исследованиях с вирусами семейств Arenaviridae, Bunyaviridae, Flaviviridae, Hepadnaviridae, Picornavirldae и Togaviridae показал высокую эффективность метода. С помощью ИФМ получены приоритетные данные, касающиеся различных аспектов изучения вирусов перечисленных семейств, которые играют важную роль в инфекционной патологии человека.

6. На основе положительного опыта применения экспериментальных ИФМ тест-систем предложены подхода к конструировали! коммерческих диагностикумов. Разработана и утверздена нормативно-техническая документация для промышленного производства универсальной тест-системы для определения антигенов хантавирусов (ХАНТАГНОСТ, система защищена авторски» свидетельством и товарным знаком). Освоен промышленный вшу си тест-системы ХАНТАГНОСТ.

7. Предложены перспективные коммерческие ИФМ тест-системы: для определения антител классов М и G к хантавирусам и для определения антигена вируса ЛХМ.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

По теме диссертации опубликовано 75 работ. Представленные 33 работы наиболее полно отражают содержание диссертации. I. Tkachenko Е.А., RezapRln G.V., Ivanov А.P., Dsagurova Т.К., Drozdov S.G. Further development oi laboratory technique for the detection oi arenaviruses. - In Abstr. 10 th Intern. Congr. Trop. Med. Malaria, Manila, 1980, p. 49.

-572. Tkachenko E.A., Ivanov A.P., Rezapkin G.V., Donets M.A., Dzagurova Т.К., Drozdov S.G. Immunosorbent assays for rapid diagnosis of viral haemorrhagic fevers. - In Abstr. 5th Intern. Congr. Virol., Strasbourg, 1981, p. 203.

3. Ivanov A.P., Bashkirtsev V.N., and Tkachenko E.A. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of arenaviruses. - Arch. Virol., 1981, v. 67, p. 71-74.

4. Tkachenko E.A., Ivanov A.P., Dzagurova Т.К., Donets M.A., Rezapkin G.V., Leshchinskaya S.V., Zagidulin U.M., Ivanova A.A., Stadukhin O.V., Mustafin N.M., Savinova T.I. Irmiunosorbent assays for diagiosis of HFRS. - The Lancet, 1981, August 1, p. 257-258.

5. Иванов А.П., Башкирцев B.H., Ткаченко E.A. Разработка и применение иммуноферментативного метода для диагностики аренавирусных инфекций. - Вопр. вирусол., 1981, Ji 2, с. 200-203.

6. Резапкин Г.В., Ткаченко S.A., Иванов А.П., Башкирцев В.Н., Дзагурова Т.К. Определение аренавирусных антигенов и антител методом твердофазного радиоиммунологического анализа. - Вопр. вирусол., 1981, Л 4, с. 459-463.

7. Ткаченко Е.А., Донец М.А., Дзагурова Т.К., Иванов А.П., Резапкин Г.В., Лещинская Е.В., Иванова A.A., Стадухин О.В., Мустафин Н.М., Степаненко А.Г., Савинова Т.И. Усовершенствование лабораторной диагностики ГЛПС. - Вопр. вирусол., 1981, 36 5, с. 618-621.

8. Donets М.А., Rezapkin G.V., Ivanov А.P., and Tkachenko E.A. Immunosorbent assays for diagnosis of CCHF. - Am. J. Trop. Med. Hyg., 1982, 31 (1), p. 156-162.

9. Tkachenko E.A., Donets M.A., Rezapkin G.V., Dzagurova Т.К., Ivanov A.P., Leshchinskaya E.V., Reshetnikov I., Drozdov S.G.,

Slonova R.A., Somov G.P. Serotypes of HFRS virus in east european and far eastern U.S.S.R. - The Lancet, 1982, April 10, p. 863.

10. Ткаченко E.A., Дзагурова Т.К., Иванов А.П., Резапкин Г.В., Башкирцев В.Н., Деконенко Е.П., Королев М.Б. Усовершенствование лабораторных методов диагностики аренавирусных инфекций. - Вопр. вирусол., 1983, Л 2, о. 2II-2I5.

11. Рыльцева Е.В., Ткаченко Е.А., Донец М.А., Иванов А.П., Дзагурова Т.К., Мустафин Н.М., Степаненко А.Г. Некоторые характеристики эпизоотического процесса у мелких млекопитающих в природных очагах ГЛПС, отловленных в окрестностях Уфа. - Мед. паразитология и паразитар болезни, IS83, J6 3, с. 15- 18. '

12. Van der Groen G., Tkachenko E.A., Ivanov A.P., Verhagen R. Haemorrhagic fever with renal syndrome related virus in indigenous wild rodents in Belgium. - The Lancet, 1983, July 9, p. 110-111. .

13. Tkachenko E.A., Ivanov A.P., Donets M.A., Miasnikov Y.A., Ryltseva E.V., Gaponova L.K., Bashkirtsev V.N., Gkulova N.M., Drozdov S.G. Potential reservoir and vectors oi HFRS in the U.S.S.R. - Ann. Soc. beige Med. trop., 1983, 63, p. 267-269.

14. Ivanov A.P., Resapkin G.V., Dzagurova Т.К., Tkachenko E.A, Indirect solid-phase immunosorbent assays for detection oi arenavirus antigens and antibodies. - Acta virol., 1984, 28, p. 240-245.

15. Tkachenko E.A., Butenko A.M., beshchinskaya E.V., Boiro I., Ivanov A.P., Dzagurova Т.К., Sochinski. SerQloglca] investigation of population from the People's Revolutionary Republic of Guinea for antibodies to viral haemorrhagic fevers. - In Abstr. 11 th Intern. Congr. Trop. Med. Malaria, Calgary

-591984, p. 222.

16. Ткаченко E.A., Деконенко Е.П., Иванов А.П., Королев М.Б., Резапкин Г.В. Результаты серологического обследования больных боковым амиотрофическим склерозом. - Бопр. вирусол., 1984, & 2, с. I9I-I95.

17. Тинкер Ю.А., Дранов И.Ю., Иванов А.П., Резапкин Г.В., Башкирцев В.Н., Брудный Р.А., Ткаченко Е.А. Изучение природной очаговости КГЛ, КЭ, ЛХМ на территории Краснодарского и Ставропольского краев. - "Особо опасные инфекции на Кавказе", тез. докл., Ставрополь, 1984, с. 73.

18. Dekonenko Е.Р., Ivanov А.Р., Andreeva L.S., and Tkachenko Е.А. Appearance of antibodies to two viruses in cerebrospinal fluid of patients with aseptic meningitis. - Acta Neurol. Scand., 1985, 71, p. 146-149.

19. Башкирцев В.Н., Иванов А.П., Деконенко Е.П., Ливанова Г.П., Воробьева М.С., Ладыженская И.П. йммуноферментный метод в диагностике клещевого энцефалита. Вопр. вирусол., 1986, J6 I, с. 96 - 100.

20. Danes L., Tkachenko Е.А., Ivanov А.Р., Lim D., Rezapkin G.V., Dzagurova Т.К. HPRS in Czechoslovakia: detection ol antigen in small terrestrial mammals and specific serum antibodies in man. - J. Hyg. Epidemiol. Microbiol. Inmnuol., 1986, 30, p. 79-85.

21. Verhagen R., van der Groen G., Ivanov A.P., van Rompaey J., Leirs H., Verheyen W. Occurrence and distribution oi hantavirus in wild living mammals in Belgium. - Acta virol., 1986, 31, p. 43-52.

22. Деконенко Е.П., Ткаченко Е.А., Уманский К.Г., Иванов А.П., Резапкин Г.В., Дзагурова Т.К., Куприянова Л.В., Рудометов Ю.П.

Частота и особенности нейроинфекций, вызываемых вирусом лимфоцитарного хориоменингита. - Журн. невропатологии и психиатрии им. Корсакова., 1986, т. 136 (2), с. I7I-I75.

23. Иванов А.П., Ткаченко Е.А., ван дер Грун Г., Бутенко A.M., Константинов O.K. Непрямой иммуноферментный метод для лабораторной диагностики геморрагических лихорадок Ласса и Эбола. - Бопр. вирусол.,1986, Л 2, с. 186-190.

24. Резапкин Г.В., Иванов А.П., Ткаченко Е.А., ван дер Грун Г. Оценка результатов прямого твердофазного ИФМ для определения антигенов. - Вопр. вирусол., 1986, № 5, с. 573-577.

25. Ткаченко Е.А., Рыльцева Е.В., Мясников Ю.А., Иванов А.П., Резапкин Г.В., Татьянченко Л.А., Пашков А.Я. Изучение циркуляции вируса ГЛПС среди мелких млекопитающих на территории СССР. -Вопр. вирусол., 1987, й 6, с. 709-716.

26. Ivanov А.P., labzin V.V., Ivanova O.E., Tkacheiiko E.A. Investigations on Hantaan virus in the Republic оi Guinea. - Ir Abstr, 29th Intern. Colloquium "Hantaviruses", Antwerpen, 1987.

27. Ivanov A.P., Ivanova O.E., Posdnyakov S.V. HBsAg carriers ii the Republic of Guinea. - Ann. Soc. beige Med. trop., 1987, 67, p. 301.

28. Ivanov A.P., Tkachenko E.A., Petrov V.A., Pashkov A.J. Dzagurova., Vladimirova T.P., Voronkova G.M., van der Groen G Enzyme immuno assay for the detection of virus specific IgG am IgM antibody in patients with HFRS. - Arch. Virol., 1988, 100 p. 1-7.

29. Tkachenko E.A., Ivanov A.P., Rezapkin G.V., Drozdov S.G Immunosorbent methods for the detection of HFRS antigens an antibodies. In "Manual of HFRS", WHO Coll. Center for Virus Ref Research, Korea University (Seoul), 1989, p. 88-93.

-6130. Иванов A.n., Иванова O.E., Поздняков С.В., Анджапаридзе А.Г., Кусов Ю.Ю., Донец М.А. Результаты серологических исследований по определению маркеров гепатитов А и В в сыворотках крови населения Гвинейской Республики. - Вопр. вирусол., 1990, А 5, с. 382-384.

31. Иванов А.П., Ткаченко Е.А., Резапкин Г.В., Гасанова Т.А., Башкирцев В.Н., Дзагурова Т.К., Дроздов С.Г. Диагностикум геморрагической лихорадки с почечным синдромом для детекции всех известных серотипов этого вируса прямым иммуноферментным методом. Авторское свидетельство № 1639245, 1990.

32. Niklasson В., Tkachenko Е.А., Ivanov А.Р., van der Groen G., Wiger D., Andersen H.K., LeDuc D., Kjelsson Т., Nystrom K. HFRS: evaluation of ELISA for detection ol Puumala-virus-speciiic IgG and 101. - Res. Virol., 1990, 141, p. 637-648.

33. Ivanov A.P., Ivanova O.E., Lomonosov N.N., Pozdnyakov S.V., Konstantinov O.K., Mamadou Alpha Bah. Serological investigations on Chikungunya virus in the RepuMic ol Guinea. - Ann. Soc. beige Med. trop., 1992, 72, p. 73-74.