Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Секреция кислой фосфатазы Saccharomyces cerevisiae при экпрессии различных структурах генов и в условиях иммобилизации клеток

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Секреция кислой фосфатазы Saccharomyces cerevisiae при экпрессии различных структурах генов и в условиях иммобилизации клеток"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи

Биологический факультет

БЕЛОУСОВА Лилия Викторовна

УДК 577.21 :582.282.232

СЕКРЕЦИЯ КИСЛОЙ ФОСФАТАЗЫ БассИаготусез сеге-с'тае ПРИ ЭКСПРЕССИИ РАЗЛИЧНЫХ СТРУКТУРНЫХ ГЕНОВ И В УСЛОВИЯХ ИММОБИЛИЗАЦИИ КЛЕТОК

03.00.07 — Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1990

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Нучные руководители:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Н. С. Егоров; кандидат биологических наук, доцент С. Н. Егоров.

доктор биологических наук А. М. Безбородое; доктор биологических наук М. А. Несмеянова.

Ведущап организация:

Институт микробиологии АН БССР. '

Защита состоится « . 5 ■ » • , 1990 года в

¿Зг. ^часов на заседании специализированного совета K053.05.ll при Московском Государственном университете по адресу: 119899, ГСП, Москва, Ленинские горы, Биологический факультет МГУ. ¿^¿'А

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан « » 1990 года:

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат биологических наук

И. А. Кондратьева

ОЬШЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуалыгостъ проблемы, в .настоящее время Оольшой интерес ¡(¡следователей вызывает секреция* белков клетками шкроорганизмов. Одним из наиболее популярных обьектоз для )зуче»ия секреции является дрожжи, простевшие зукариоты, процесс ¡екреции у которых имеет иного сходных черт с аналогичным фоцессои как у клеток прокариот, так и у клеток высших |укариот. Секретируемые белки выполняет множество биологических >ункциП, важнейшей из которых являь.ся обеспечение клеток [итвтельиыми веществами.Поскольку секреция -один И8 наиболее ложных процессов, осуществляемых клеткой,многие оо стороны 1йтаптся пок^ не изученными, несмотря на интенсивное [сследование э+ой проблемы.

Разработка методов генетической инженерии позволила юушествнть а клетках микроорганизмов экспрессию гетерологичных еиоа. Секреция гетерологичных белков в среду культивирования читается удачный технологическим решением при их производстве, ^то подчеркивает важность изучения закономерностей секреции и ^пользование полученной информации для повышения эффективности роцесса секреции гетерологичных практически ценных продуктов.

Потребностями развития микробиологической промышленности иктуется необходимость активного изучения возможности рименення иммобилизованных ферментов и иммобилизованных клеток ИК) для получения различных веществ. Новой и интересной властью применения ИК является получение с их помощью екрвтируеиых белковых, продуктов. . ИК представляют и научный нтерес, так как позволяют изучать жизнедеятельность икроорганизмов в особых условиях. В частности, в некоторнх лучаях ИК могут использоваться в качестве модельной системы еделяиихся клеток. ' ■■ » .

Цель и задачи исслсаошшия. Целью данной работы являлось зучение секреции белков клетками микроорганизмов на примере екреции кислой ; фосфатазы (КФ) клотками ЗассНаютусел тега¡ае. В атом сложном процессе нас интересовали два спекта: сопряженность секреции с деленном клеток ¡1 возможность заемного влияния различных секретируемых белков при совместной зкрецци. В связи с этим были поставлены следующие задачи: аяснить закономерности секреции КФ при экспрессии различных груктуриых генов: - изучить возможность секреции КФ 5Делящимися клетками дрожжей на модели.ИК; - ;оздать изогенные анин дрожжей с целью выявления возможного взаимного влия"ля наличных секретируемых белков при их секреции.

Научная новизна. Впервые проведена иммобилизация дроажовых неток с целью получения секретируеиого белка. Показано, чго !етки 5ассЛс«т'шае, иммобилизованные включением в крисго/ь )Ливинилового спирта (ПВС), секретируют КФ.

Созданы изогенные линии дрожжей с различными сочетаниям! активных и неактивных аллелей генов, кодирующих свкретируомы« белки КФ. глюкоамилазу (ГА), инвертвзу (И). Покеванв возможное« взаимного влияния различных секретируемых белков.

Практически ценность. Показано, что использование ИК в проточной •системе ведет к значительному увеличению выхода саботируемого белка. Иммобилизация является аффективны* способом повышения иекреториой активности клеток при введении в них гена секретируемого белка (Кф) в составе киогокопиЛиоЯ плазииды. Стабильность репликативных плазмид у нымоОилизованнУХ клеток может быть основой при создании производств, использующих генно-инженерные продуценты. что, фактически, является альтернативой традиционному подходу, связанному со сложный конструированиям високостибильиых векторных систем.

Обнаружении взаимного влияния различных секретируемых белков позволит учитывать этот фактор при создании штаммов продуцентов практически важных соединений.

Апробации работы. Результаты работы докладывались на ? съезде Всесоюзного Микробиологического общества

(Алма-Ата, 1935), Зи 4 Всесоюзных конференциях "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Кобулети,19В6: Ташкент,19ВВ), 6 Всесосзн ч ' сиипознуие по инженерное знзимолоти (Вильнюс,1988), 1 конференции "Проблемы и перспективы биотехнологии" (Братислава,1989). Работа проала апрсбацню на кафедре микробиологии биологического факультета ИГУ и»!. U. В. Ломоносова,

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ и 1 авторское свидетельство.

Обьем работы и структура диссертации. Материал диссертации изложен на //Г страницах машинописного текота, состоит из введения, g глав, заключении, выводов и сансг.а литературы, включающего //3 нанменов&нив. Диссертация содержит таблиц, проиллюстрирована <23 рисунками и ff фотографиями.

МАТКРИЛЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЦДОВЛНИЯ В работе использовали следующие штаммы микроорганизмов: Saich.cereviiiue - S-288C (дикий тип)(Венков, ИЦБ АН НРБ), АН 216 {ah!u2hh3pho3plw5){Скрябин К.Г..ИМНАН СССР). СКЗ

(Крамер,Нью-Йорк),H 248 ( «1leullyOadelur.. 1) (Беневоленский C.B.,ВНИИГенетика), штаммы, созданные в процессе работы, "Писаны ниже; Escherichia coli - HB 101 , С, 600, ТС 1, Hir3000YA149:HirP01 (Всесоюзная коллекция микроорганизмов) Условия культивирования.Дрожжевые штаммы культивировали при 30°С на ротационной качалке на следующих средах (состав в 1-/л):Ы1 (дрожжевой зкстракт-5, пептои-10, глюкоза-20). N2 (cm.N1, вместо глгкозы■ глицерин-3, втанол-1,5), НЗ (KH2PO4-I, UgS04-0,Ë, HaCl -Ü, 1, CaCh-0,1, (ННОгБО.-З,5, глюкоза-20,

К Н РН & ян РН

Рис.1. Схега конструирования пдавчвд рУМ.1- р\Ш4.

Л- цитирование, ЭФ- эдектрофорететвское разделение фрагментов, сайты рестриктаз : В- ВавН1, П- Е1пйШ, р- Рз«, Е- ЕсоЯ1.

С Я

«VJ ^ч

pYtC'bß(4ft )

¿fw у

H

PH

/Jjfl/АА» .....g WM"

рМ^г

H. ЭФ

рн t»

(' цмл s сем) ''ч

■píW )

1 J

>111.111 .I...I,! |>. ^

^ a />

( ffl )

^-I Г* " ' "' .

ЭФ

-ПГ~

HP* HP

PHO.

'¿Mi' Mtî\R

jcSZ

Си

Рис,2. Схеш конструирования илааывд рКМ-ркиз.

Ä- актирование, Э0~ здьктрофоретвческое разделение фрагментов, сайты рестрпктаа t В-Вшгл1, H-Hindiu, Р- Petl, R- EcoRI.

коиплвкс витаминов по Буркхолдеру-1мл), N4 (cm.N3, вместо глвкоаы- сахароза-40), Nb (пептои-20, глгкова-20, сукцинатный буфер рНЬ,0. 0,0211), N6 (cM.Nb, вместе пептона- дрожжевой акстракт-20), НУ (глюкоза 20, КНдО-0.2, сукцинатный буфер рН5,0-0,02Ы), Н8 (си.НУ, вместо глюкоаи-сахароаа-40)> Штаммы ЕсоЙ Овыравивалн па средах LB и U9 ( Маниатис н др.,1984),

Использованные плазмиды: рАР20 (Крамер, Нью-Йорк), CV13(P1103PH0b) (Эльдаров.ИИБ АН СССР), pRBbS (Шекмаи,Беркли), pUH 12,pBR329, pUC19,pYe(CKN3)41 (все получены от M.А.Нейстата, ВШШГенетика), плазмиды, сконструированные в ходе работы, описаны ниже (рис.1,2).

Клетки трансформировали плазмидной ДНК с применением

хлористого кальция (Маниатис и др.,1984).

Трансформации дрожжевых клеток осуществляли по методу с использованием ацетата лития, описанному в (Гловер,1989).

Выделение плазмидной ДНК . из Е-соЧ и электрофорез ДНК проводили как описано в (51аниатис и др.,1984).

Конструирование дрожжевых штаммов оеуиеитвляли ' в соответствии с описанием (Гловер,1989).

Концентрацию глюкозы определяли с диннтросалицилозой кислотой (HI Пег, 19Ь9).

Определение белка проводили с использованием красителя Куыасси G 2bU (Bradford,1976),

Ортофосфат определяли по (Panusz et,al.,1970).

Активность КФ определяли с использованием пара-нитрофенилфосфвта-(Torriani,1960).

Клетки дрожжей иммобилизовали "включением в криогель ПВС (Рогожин C.B. и др.,1989).

За .основу полного факторного эксперимента была взята методика, описанная Максимовым (1980).

Никроскопировалй в сканирующем электронном микроскопе "HITACHI-40ЬА" разрешающей способностью 70Ä.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБС^ЖАШШВ Конструирование алазыид. В процессе работы били сконструированы плазмиды, содержащие структурные гены КФ (РНОЗ п РН05).Схемы конструирования представлены на рис.1,2.

Срагшсвие ссхрецни КФ при экспрессии хромосомных п □лазмолиш копий г ci: on. Поскольку КФ представлена в основном продуктами генов РНОЗ - и РН05, считали необходимым разделить их секрецию. Суиествует два возможных подхода для решения этой аадачя: использование штаммов, мутантных по определенны* структурным генам КФ, или трансформация штамма, мутантиого по всем структурным генам КФ, плазмидаыи, содержащими отдельные гены. Остановились на втором подходе. Чтобы уСедиться в том, что результаты, полученные на клетках трансформантов, можно распространять на клеткк дикого типа, на первом этапе раЗо-гц

наследовали секрецию КФ при экспрессии сцепленных генов РНОЗ к PHOS в составе хромосомы и репликатнвной плаамнды. В качестве штимма с хромосомными копиями генов РНОЗ л PHOS использовали Б-286С.Для исследования экспрессии фосфатазных генов £ составе плазмид использовали специально сконструированный реиипиенгиый датами CRL4 { и Ieu2lüi3uro3pho3pho5), трансформированный плазмидами CV13(PH03PH05)(содержит сцепленные Гены РНОЗ и PHOS), pVU2(содержит РНОЗ), рУ1Жсодержит РЙОЬ) и рННЗ(ци!ггромерная плазмида, содержащая ген РНОЬ).

Активность КФ в культуральной жидкости определяли при выращивании клеток на полной среде в отсутствии и в присутствии ортофосфата (начальная концентрация в среде-IGmU). Результаты опытов с использованием штаммов S-288C и CRL4/CV13(PH03PH0S) свидетельствует о том, что их секреция имеет сходный характер. На рис.3,4 представлены результаты определения секреторной активности клеток (активность,ед/109клоток), трансформированных плазмидами pVU2 и pVM4. Цненин исследователей о конститутивном характере секреции продукта гена РНОЗ расходятся. Наши данные (рис.З) показывает, что секреция КФ клетками, трансформированными плаямидой, содержащей ген РНОЗ, имеет место как в присутствии,так и в отсутствии в среде фосфата, причем характер секреции сходен при обоих условиях роста. Следовательно, неорганический фосфор не индуцирует непосредственно экспрессию гена РНОЗ.

Из литературных данных известно,. что конститутивная и репрессибеяькая формы КФ обладает различной стабильность». Длл формантов, секратированных клетками, содержащими плазмиды с генами РНОЗ и РН05 по отдельности, мы обнаружили, что продукт гена РН05 за 1Ь ч при 3U°C инактивируется полностью, тогда как продукт гена РНОЗ в тех же условиях сохраняет 1UU7. активности. С учетом этого факта, сравнение кривых секреции А кривых росте., показывает, что секреция продуктов обоих генов прекращается с выходом клеток на стационарную фазу роста.Означает ли это, что секреция КФ осуществляется лишь делящимися клетками? Для решения вопроса о существовании облигатной сопряженности процессов секреции и делении клеток решили исследовать секрецию в системе неделящихся клеток, которой является снстеми ИК.

Секрешш КФ нмыобилизоыишыми слетками. При выбс,в способа иммобилизации ыы считали, что для изучения секреции необходимым условием является сохранение неповрежденной клеточкой стенки. Иммобилизация химическими способами сопряжена с обработкой клеток реагентами,которые могут влиять на клеточную стенку. 'Позтому было принято решение иммобилизовать клетки включением в гель. Использовали криогели,методика получения которых рааработаиа в ЙНЭОС АН СССР им.А.Н.Несмеянова.

Для иммобилизации дрожжевых клеток в нашей работе опробованы

Активнооть КФ, 8д/1Ср клеток

Количество клеток/мл

5 4

3 2

I

О

17 22 26 31 36 41 .46 50 55 60 65

Время,чао

Рис.3, Секреция КФ метками снь V рУМ2. Активность КФ(ад/ю9 клеток . Количество клеток/мл

4-Ю8

11 3-Ю8 2-Ю8

. х- т

8

17 22 26 31 36 41 46 50 55 60 6?

Время,час

Ряс.4. Секреция КФ клэткаыи снь 4/ р1/вд-.

Количество клеток:1(1)(+4«),2(0)(-Фн) Активность К4:3(*)(+Фн),4(о)("-4_н).

Рис,б. Поверхность отклика активное те КФ & среде на измзненве концентрации ИЬС в цдотноотв ишосв-шауеиой суспензия клеток.

кои цме.%

Рис.6. Поверхность отклика секреторноА актиьноста клеток на взкенекие концентрации цве в плотности выноОн-иаэуеыой суспензии клехск.

три (.аэличиых системы для образования ' крногелкй: ПАЛГ, сиднкагель, ПВС. Лля дальиеявих исследований выбран гель,получаемые крноструктурцрованичм IIВС.

Подобран» услония иммобилизации для секреции ИК КФ. Наиболее целесообразный признано замораживание раствора ПВС с ' клетками при » течение 6 минут.

Постановка полного факторного эксперимента с тремя уровнями двух факторов - концентрации ПВС и плотности иммобилизуемой суспензии клеток-, имела целью выяснить влияние этих факторов на »ффнкгивность секреция КФ ИК и вымывание клеток из геля в процессе культивирования. На рис.Ь,6 представлены полерхности отклика' активности КФ а среде культивирования и секреторной активности • клеток. • По результатам полного факторного эксперимента сделан вывод о том, что оптимальной для секреции КФ следует - считать иммобилизации суспчкзии ' дрожжевых клеток с концентрацией l.lbxlü" клеток/мл в ЬХ иыЯ хрио ЛВС.

О состолини клеток и структуре геля при разных условии* замораживания и различной концентрации ИБС судили по наблюдениям л сканирующий электронный микроскои.На структуру геля влияет концентрация ПВС; различна в структуре гелей, замороженных прв равных, условиях, не обнаружили. Обрашеет, на себя внимание отсутствие почкующихся клеток (фото).Способность ИК к размножению сохраняется по крайней мере в течение двух недель культивирования. В ИК активно протекают метаболические процессы, о чей свидетельствуют, а частности, результаты эксперимента по утилизации глюкозы свободными клетками (CK) н ИК (табл.1)

.Таблица I.

Определение глюкозы в среде (Kl) культивирования (г/10* клеток)

Врчик,час

U

1

3

среда с фосфатом 7,14 6,7Ь

СК среда без фосфата 7.14 6.64

среда с фосфитом 7,14 6,1Ь

ИК среда без фосфата 7.14 6,02

6,64 6,4) Ь,60 Ь. 10

Ь, 46 5,33 2,10 1,00

4,26 4,17 0,67 0.65

Добавление, а среду культивирования ортофосфата ведет, к репрессии секреции КФ как СК. так н НК (в течение 1 часа после добавления активность КФ в среде культивирования СК снижается о 2,8 раза, а в среде культивирования ИК- а 2,4 раза). Это, сс-видимоиу. свидетельствует о сохранении в ИК регуляции «кспрвсиа генов КФ на уровне транскрипции.

.Сравнивали секрецию КФ при культивировании СК к ИК на различных йитгтеЛьных средах (N3-118). Наибольная секреторная кктир'до^ть как СК." гак и ИК, наблюдалась на среде N5.

Секреторная активность ПК на данной среде составляет более 80% от уровня активности CK.

Использование лабораторной проточной установки позволило значительно увеличить выход секретируемого фермента (рис.7). Если активность КФ, декретированной за все время инкубации определенным количеством (109 клеток) CK, принять за 100%, то для ИК данная величина составляет 2Ь7. , а для ИК в проточной системе-34и%(а данном опыте использовали среду N7).Дли некоторых сихретнрусиых Ферментов дрожжей показано явление ауторегуллиии; подавление секреции фермента, если его концентрации в среде достигает определенного значения. ¿озможио, что синтез и/или секреция КФ 'также подвержены ауторегулнции. Увеличение выхода' фермента при использовании проточной системы, . в таком случае, может являться следотниеы удаления секретируемого формеита из среды культивироьанин. • '

При сравнении экспрессии гена РН05 в составе реяликитивной (pYU4)u цеитромкрноп (рНКЗ) плазмид выход КФ был значительно выше длч клеток, трансформированных репликативноя плазмидой. Однако, секреторная активность популяции таких клеток быстро снижается вследствие потери плазмид в митозах. Определение мистической стабильности использованных нами плаамид показало, что нри выращивании клеток,трансформированных центромерными плазнидами (pNR2,.pNK3), на полной среде после 10 клеточных генераций плазмиды сохраняется ь 85-90% клеток, а длн клеток, трансформированных репликативными (pVU2,pVU4 и CV13CРНОЗРНОЬ)) ■иланмидами, данная величина . составляет 35-60%. Одним И8 возможных путей стабилизации реплнкатнвнык плаамид яв чотся иммобилизация клеток трансформантов. Сравнение секреции CK и ИК после трансформации репликативной плазмидой (CV13(PH03PH05)) показало значительное увеличение секреторной активности ИК на различных исследованных средах: на среде ИЗ- в 1,9 раза, HS- /в 3,3 раза, Кб- в 6,5 раза. Этот эффект отчасти связан с тем, что клетки в иммобилизованном состоянии не делятся и, следовательно, доля несущих плазмиду клеток не снижается с течением времени, как это происходит для CK с увеличением, числа клеточных генераций. . Возможно, играет роль и другой фактор. Интересно сравнить для CK и ЯК отношение секреторной активности клеток, трансформированных репликативной плазмидой (в расчете лишь на плазмидосодержацие клетки) к секреторной активности клеток с хромосомной экспрессией структурных генов КФ. Для CK данная величина составляет 1,1 -1,4, для ИК- 1,7- 2,2. Следовательно, эффективность экспрессии амплифицированных структурных генов КФ и/или ; секреции их продуктов при иммобилизации клеток повышается. Причины этого не ясны. Одно из возможных предположений заключается в том, что с прекращением деления клеток при их иммобилизации свяааны изменения в метаболизме.

шшй»

дам»

гУ^^ ■. ¿У / ' -

"вй '• <й> ' ю» ''v ' i /

¡Ж--- % • ;

I

¿¿^Ш ¿ЗДЯОД к- ;

4отэ I. Дрохлиьие клетки, ИиЮ<ЯииЗОЬаШЦ.& включением и криогвль [ВС.

■■■Я

Активность АЧ, едДСб клеток

Активность КФ, ед/103 клзток

4 га

Р и

3

«

?. ■

I (—1 Я

Г 1

.ЕЯ 1 1

3 10 ~ 40 ~50 оЗ О

Врем, час

Рис.7. Сравнение секреции СК(°),ЙХ(«>) и ИХ в протоке (•).

Сульркий ьдаод аа время кульшзяров&нид: О-СУ., 0-Ж. 8-й.< проточней систеле': кульг<£виреввния.

способствующие такому повыяению. Итак, иммобилизация нвлиется аффективным способом .' повышения секреторной активности клеток, трансформированных репликативными илвзмидами,'

В:инмоАСйстпие различны* сегрегируемых белков у лрожясй. По современным.представлениям, для различных белков, еекретируемых В культуральную среду, существует единый путь транспорта. Поэтому можно предположить, что на каких-то втапих возможно их > взаимодействие. Для решения вопроса о существовании и характере такого взаимодействия для различных сек.ретируеиых белков был применен I ейетический подход. Работа проводилась совместно с лабораторией оптимизации ъкспрессии генов ВИИИГенетйка.

Мы предприняли попытку иыио.иить, звьи<:ктлн уровень секреции КФ от секр«ции других гомологичных белкоа, внпример, инвертазы (И) и глюкоамилнни (ГА). Уровни спкрьиии' данных волков различными лр ,81'.'кым<1 штииччии часто . существенно отличаются. Нортону ДАН кумячеитненног.о сравнения секреторной активности необходимо было получить иногенные линии с различными еллслышми сочетаниями генов, кодирующих зги белки.

йэогеикые щтьммы, и которых активные и неактивны« аллели генов, кодируююих. ГА (Ь'ГА2) и )1 (ЬУСХ), нредс.чввлеиы в различных комбинациях, получена в результате пяти бак кроссов с одиии и тем же исходным родительским штаьщои. После пятого* Оэк кросса Изогенность сегрегантоа составляла 977.. Из подученного таким образом небора культур отобрали для проведении исследований штампы одного типа спаривания, с одинаковыми ауксотрофностями (а 1т2 ш1е2 (1шЗ ) н распределили их по группам, соответствующим различным генотипам. В экспериментах использовали по пять штаммов из каждой группы, отобранных случайным образом.

В первой серии экспериментов использовали .питательнуг Среду, на которой секретируются все три белка. Этому требование удовлетворяет среда N2. . Штаммы выращивали на среде Н1 дс стационарной фазы роста; затем переносили на средуN2 (начальны! титр составлял 5x10' клеток/нл). Определение ферментативных активностей проводили в культурвльноа жидкости, отобранной чере! 1 час и черцз 3 часа после начало инкубации клеток на среде N2. Результаты сравнения секреции КФ для различных групп ытаимо] представлены в табл.2. Приводятся значения разности велнчш активности КФ, полученных при двух определениях.' .

Данные по секреторной активности штаммов внутри каадс; группы представлены в порядке возрастания. Сравнение' секреторио: активности по КФ между втаммами групп I а 2, отличающимися о наличию 5ТА2 , покааадо отсутствие статистически достоверны отличия.То же самое можно отметить и для отаммов групп 3 и 4 также различающихся лишь по способности секретировать ГА. Таки образец, нохио сделать вывод о той, что секреция ГА не оказывав

Таблица 2.

Секреция КФ различными штаммами но среде N2

Генотип Дактивностк КФ, ед/10* клеток

1 sucxsta2 0,011 0,012 0,013 0,013 0,014

2 OUOXSTA2 0,012 0,012 0,013 0,013 0,013

3 SUCXsta2 0,020 0,022 0,024 0.024 0.025

4 SUCXSTA2 0,020 0,024 0,024 0,025 0,026

зтатветичеокн достоверного влияния на секрецию КФ, Чтобы выяснить влияние секреткруемоа К на секрецию КФ, необходимо сравнить другие группы штаммов: 1 и 3, 2 в 4. Уровни секреторной активности для обеих пар сравниваемых групп различаются ,в два {>ааа- в ртаммах, секретируюаих И, высе.Следовательно, секреция Я оказывает стимулируокее влияние на секрецию КФ.

Дли втаимов, ' не секретируюаих ГА (группы 1 а 3), провели сравнение секреция КФ в условиях репрессии синтеза И: на среде Н1. Результаты представлены.в табл. 3.

Таблица 3.

Секреция КФ различными штампами на среде Н1

H

группы Генотип Дактивностц КФ, од/10» клеток

1 8ucxsta2 0,058 0,063 0,065 8,070 0,078 3 SUCXsta2 0,054 0,068 0,070 0,074 0,075

Из таблицы видно, что уровень секреторной активности по КФ

¡в вависят от наличия активного аллеля гена, кодирующего И.

Следовательно, различия в уровнях секреции КФ связаны не с 'екогипаки, а с фактом экспрессии структурного гена И.

Для объяснения обнаруженной взаимосвязи секреции И в КФ •рвбуются дальнейвие исследования. lia основании нмеюянхея данных юва 150XU0 лпыь коцстаТировать ее наличие.

выводы

1. Экспрессия гена РНОЗ не подвержена индукции фосфатом.

2. Непочкуюаяеся клетки Sacch-cereviiiax, вмаобяливо^анные ^

в криогаль ВВС, секретирувт КФ, при этом синтез фермента подвержен регуляции фосфатом, реалиауюаеяся на уровне транскрипции.

3. Уровень секрецнн-НК в проточное системе культивирования

повыиается, что может указывать и« участие иеханксма .обратной регуляции в секреции КФ.

4. Иммобилизация включением в криогель ЛВС является эффективным способом повышения л стабилизации секреции КФ культурой."несущей амплифицированиый структурный геи РНОЬ.

5. На эффективность секреции КФ мохет влиять секреция других секретнруемых белков.

' ~ *

Слисок опубликованных по т.еие работ

1. Егоров С.Н.«Семенова И, И. .Вадоусоаа Л.В..Егоров 1LC. применение иммобилизованных клеток для получения секретируемоб хислой фосфатазы дрожжей, 7 сьн-л Всесоюзного Микробиологического обшаству.Тезисы докл.. Алма-Ата, 1905, том 2, стр. 47,

2. Лозинский В.И. .Райиерман Е.С. .Рогожин C.B. ,1'авриленко (бвлоусова)Л.В..Семенова H.H.,Егоров С,h. Иммобилизация клеток Sacctiuroniycn cnrvhiae. . продуцента кислой фосфатаоы, в

криоголк поливинилового спирта. 3 Всесоюзная конференция "Биосинтеа ферментов микроорганизмами"«Тевись докл., КоОулети, 1966, стр.20.

3. Велоусова Л.В.,Егоров С.Н. Секреция кислой фосфатааы иммобилизованными клетками Secchmvmyiti txrevislae.

6 Всесоюзный симпозиум по инженерноя рнзимологии. Тезисы докл. , Вильнюс, 1988, ч.11, стр.ЬВ.

4. Белоусова Л,В..Егоров С.Н. Секреция кислой фосфатазы клетками дрожжей при экспрессии хромосомных и плаэмидных генов. 4 . . Всесоюзная конференция "Биосинтез ферментов микроорганизмами".Тезисы докл., Ташкент,- 1908, сгр.37.

5. Рогохии С.В..Егоров С.Н..Лозинский В.И..Гавридэнко Л.В., Вайнерман Е.С..Семенова И.К. Способ получения препарата хислой фосфатазы ив дрожжей Saccluuvmycei ccrevisiae. Авторское свидетельство (СССР) 1505972. 1989. . ,

6. Велоусова Л.В.,Лозинский В.И.,Вайнерман Е.С., Рогожин С.В.,Егоров С.Н..Егоров Н.С. Секреция кислой фосфатазы Клетками Saxkaromyces cerevisiae при иммобиливация включением в хриогели поливинилового спирта."Ферменты микроорганизмов" Москва,НПО •Цедбиоэксномика",1983,2, стр.224-232.

7. Велоусова Л.В.,Егороь С.Н. Использование криогелей для иммобилизации ' клеток с целью получения секреткруемого продукта. I конференция "проблемы и перспективы биотехнологии".Тезисы докл., Братислава, 1989, стр,102.