Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полигалактуроназа дрожжей SACCHAROMYCES PASTORIANUS: образование и свойства

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Полигалактуроназа дрожжей SACCHAROMYCES PASTORIANUS: образование и свойства"

АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ Институт микробиологии

од

i Г. ;'!*!() ;■!. I I» '-¡-к ¡.V

На правах рукописи УДК 579.22+577.152.3

Рябая Наталья Евгеньевна

ПОЛИГАЛАКТУРОНАЗА ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES PASTORIANUS: ОБРАЗОВАНИЕ И СВОЙСТВА (специальность 03.00.07. микробиология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск, 1994

Работа выполнена в Институте микробиологии АНЕ

академик АН Беларуси, профессор А.Г.Лобанок доктор биологических наук Н.И.Астапович

}

доктор биологических наук, профессор С.П.Коваленко доктор биологических наук, профессор В.М.Мажуль

кафедрч микробиологии Белгосуниверситета

1)0

Зашита состоится "Гг " ■¿¿¿¿'/^и? 1994 г. в ¿¿__ часов на заседании специализированного совета (К 008.09.01) по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте микробиологии Академии наук Беларуси (220733. г-Минск, Академгородок, ул.Жодинская,2)

С диссертацией* можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН Беларуси

Автореферат разослан " 1ЯЯ4 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат апологических наук

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение -

С^, ■ Н.В.Образцова

ОБШЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЕОТЬ) актуальность провлемм. в настоящее Еремя изучение регуляции образования и секреции ферментов у микроорганизмов вызывает большой интерес. Одним из наименее изученных объектов являются дрожжи. Последние, как продуценты экзогидролаз, исследователями

не принимались во внимание многие годи иэ-эа невысокого уровня белков, секретируемых в окружающую сроду. Использование дрожжей при изучении секреторного процесса интенсифицировало работы, направленные на поиск культур, активно накапливающих внеклеточные ферменты. Обнаружены активные продуценты,—кс»ланчз__ (Biely, 1930), глюканаз (Olivero et al., 1Э85), протеинаэ (Ogrydziali et. al., 1982), амилаз (Mot, Verachert, 1P85; Dowbonick et al., 1990), нуклеаз (Петков и др., 1991).

Значительный прогресс в понимании молекулярных механизмов зекреции, достигнуты'.! к настоящему моменту, во многом явился следствием использования дрожжей рода Saccharomyces в качестве модельной системы. ВыяЕлени многие существ нные элементы секреторного процесса, определена последовательность стадии, изучен механизм экспорта белков, роль клеточной стенки в этом процессе Schekman, 1982; Циоменко и др., 1987: Burgoyne, 1988: Hirnk. ,991). Однако, вопросы, связанные с исследованием фнзиолого->иохимических особенностей образования и секреции внеклеточных арментов-Х-Дрождей, остаются малоизученными.

Анализ литературных данных о роли различных факторов среды i образовании экзогидролаз и путях повышения продуцпрукчпои поеобности дрожжей свидетельствует об vk противоречивом хдгпк-ере, указывает на многообразие механизмов регуляции г"-посинт»зч неклеточных ферментов.

Влиян'иа на образование формантов таких ¡рак-торов ¡сак уело- . вил культивирования, пред-'цента, состав питательной среды и, особенно, наличие в паи легкометаболизируекых источников углеро-' да, отличается не только у различных видов, но и даже штаммов микроорганизмов. Поэтому знание физиологических особенностей микроорганизмов мозгет позволить не только направленно регулировать продукцию ферментов, но и получать препараты с определенными свойствами.

Цель настоящей работы - отбор высокоактивного продуцента полигалактуроназы среди дрожжей, исследование особенностей образования внеклеточной полигалактурсназы и характеристика ее основных физико-химических свойств.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- исследование способности различных дрожжей образовывать полигалактуровазу и отбор активного продуцента;

- изучен :в физиолого-бнохга-шческих особенностей дро.хг.ей, образующих полигалактуронаэу;

- исследование состава и свойств полигалактуроназы.

UÛXHHÛ3—НОЕНГ'ВД. В результате проведенных исследований v

изучены особенности -'образования полигалактуроназы вйсс'паго^усее paf.torianuQ на различных источниках углеродного питания. Ьыявле-'но, что в условиях ограниченной аэрации при высоких концентрациях глюкозы в среде культивирования и::еет насто повышение продукции полигалактуроназы дрожжами. Впервые обнаружено траизиентное снижение ферментатигнои активности в культуральной жидкости после. добавления глюкозы в растущую на этаноле культуру дрожжей Е убловиях • аэрации. Установлено, что снижение активности поли-галактурон&зы в аэрируемом среде не связано с протеолиэои, не 2

сопровождается энергетическими затратами и не обусловлено контактом с клеточног поверхностью дрожжей. Обосновано предположение, что ингибированив связано с Низкомолекулярным метаболитом дрожжей - этилацетатом, обнаруживаемым в среде культивирования. Впервые показано, что полигалактуроназа йаееп. pastorlenug секретируется в виде высокомолекулярного комплекса, содержащего 79% углеводов. Доказана роль пол»сахаридного компонента в повышении стабильности фермента.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Отобран новым продуцент полигалактуроназы - дрожжи Saccharomyces pastorianus ВКМ У-50£'. Отличительной особенностью Saoch. раеъог larrus является сравнительно высокий уровень,.полигалактуроназной активности, отсутствие активностй других экэог'идролаэ - целлюлаэы, кислой протеи-назы, пектинэстеразы, пектинтрансэлиминазы, что обусловило перспективность культуры для получения ферментного препарата с определенными свойствами. Подобраны среды и условия культивирования, обеспечивающие максимальное накопление фермента в культуральной жидкости. Разработана схема выделения и очистки полигалактуроназы. Относительно высокая__^термостабильность и устойчивость в. зоне кислих значении рН позволяют полагать, что полигалактуроназа Sacch. paetorianus перспективна при создании мультиэнзимных композиций для обработки низкометоксилироЕанного сырья.

Апробация ряботи: основные положения рБ соты докладывались яа XVIII конференции молодых ученых Института ©ис.«импи и (ипт-по-тогии микроорганизмов АН СССР (Пущино, 1687), на IV Республиканской конференции молодых ученых "Биология, культивирование и еио-гехнология микроорганизмов" (Т:.-;гент, 1989). на Ееес-сю:=чси

5

конференции "Методы получения, анализа и применения ферментов'^ (Юрмала, 1990).

Публикации •■ По материалам диссертации опубликовано 5 работ«;

структура и объем_диссертации; Диссертационная работа

состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части <5 глав), выводов и списка литературы. Работа изложена на 121 страницах машинописного текста, иллюстрирована 27 рисунками и 22 таблицами. Список литературы содержит 207 наименовании.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы и метопы исследований

С целью отбора дрожжей, образующих полигалактуроназы исследованы музейные культуры, относящиеся к роду Saccharomyces, а такхе родам Brettariomycee. Candida, Cryptococcus. Debaryomyces, Fabiepora, Hansenula, Kluyveromycee, Pichia, Torulopsie, Trichosporon, Saccharomycopsis.

Реэультгты проведенного отбора показали, что из 126 проверенных культур рода Üaccharomyces - 30 продуцируют ферменты, вызывающие снижение вязкости раствора пектовой кислоты.

Для дальнейших исследования отобраны дрожжи Sacch. pasto-ч

rianus BUM У-509. Ь/льтивирование дрожжей осуществляли ш, миологической качалке (180-200 о^/мин) в г.олбох Эрленмейера объемо: 2S0 к.., содержащих 50 мл оре„ы. При подборе опт) мальвой .питательной средм за основу взята минеральная среда Ридер ir/л) Глюксза - 20,0, дрожжевой автолизат - 5,0. (HH<)2S04 - 3,0 rißSCM •- 0,7, NaCl - 0,5, КНгК>4 - 1,0, КгНР04 - 0,1 (среда 1).

Б некоторых экспериментах • в состав среды включал! сеЬкловичныи пектин - 5,0 r/л (среда 2 ).

Накопление биомассы дрожжей определяли измерением -оптической плотности суспензии при 600 вм ¿'Вечер, Xyf-6mv&a, 1363), В супернатанте дрожжей после отделения бдамаесы определяли активность Ферментов, содержание Сахаров, белка, ©шрта.

Бесклеточные экстракты получали путем заморашвения дрожжевых клеток в жидком .азоте и механического разрушения.

В опытах о отмытыми клетками дрожжи через 24 ч роста отделяли от среды культивирования, отмывали дистияяиррвавной водой и помещали в 0,2 М ацетатный б/З^Р или питательную среду,

Полигалактуроназную активность *ПГ) определяли вискрзк-метрически метопом Лифшиц (JS67) в модификаций Тюриной (1977). В качестве субстрата использовали 1,0% раствор пектина или пекто-вой кислоты. За единицу активности принимали такое количество фермента, которое гидролизует 1 мг субстрата в минуту при 30° и рН 5,0 со снижением вязкости раствора субстрата на 20%.

При описании процессов роста дрожжей и биосинтеза поли-галактуроназы удельную скорость роста iJ*.) и удельную скорость синтеза ( £ ) вычисляли по формулам: JU.= ax-dt-1,х-1:

dE-dt-1-х-1; где dx - прирост биомассы (мг/мл) за определенный промежуток времени dt; х - биомасса (мг/мл), dE - прирост активности (ед/мл) за промежуток времени dt (Terui, 197Й).

Белок определяли по методу Брэдфорда (Bradford, 1976) и спектрофотометрически (Кочетов, 1980).

Идентификацию и количественное определение этилового спирта л этилацетата производили на газовом хрома-, ографе лРОМ-5 (Богдановская и др., 1982).

Количество Сахаров определяли no Miller (1959 ) и антроновым. методом (Методы биохимии углеводов, 1966). Определение углеводных компонентов гликопротеинов проводили по метод!' Mshe ( 1949 ) г Аналитический диск-электрофорез проводили в 7 и 7,5* поли-акриламидном геле при рН 8,3 (l'avis, 1964). электрофорез в ПААГ с ДДС-Na проводили согласно методике Laemmli (1970).

Ионообменную хроматографию проводили на колонке с диамино-гексилсилохромом С-80 (2x15), уравновешенной 0,04 M универсальной буферной смесью (рН 6,0). Элюиию проводили линейным градиентом концентрации NaCl (0-0,8 M) в том же буфере. Активную фракцию, которая элюировалась 0,15 M раствором, наносили на колонку с Sephadex G-100 11,5x80,0), уравновешенную 0,04 M универсальным буфером рН 6,0 и этим же буфером проводили элюирование фермента. Очищенную таким образом до электрофоретически гомогенного состояния полигалактуроназу использовали в дальнейшей работе.

молекулярную массу ПГ определяли, сравнивая подвижность фермента при гель-фильтрации на Toyopearl HW-55 и электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии ДДС-Na с подвижностью белков известной молекулярной массы, ч

Константу Михаэлиса и максимальную скорость . реакци.'. находили, используя систему координат Лаинуивера-Берка.

Определение рН-оптимума действия фермента проводили при 30° в 0,01 M универсальном буфере в интервале значений рН от 2.0 до 9,0. Температурный оптимум действия полигалактуроназы устанавливали при рН 4,0 в интервале температур от 20° до 55°.

Терн'остабильность фермента изучали, предварительно прогревав растьор фермента при соответствующих температуре« в течение 1ч, с- последующим определением активности при 30°. Изучение рН-6

стабильности проводили, выдерживая растворы фермента 18 ч в равном объеме буфера с соо /ветствующим значением рн при 4°.

Приведенный в работе цифровой материал является результатом не менее чем 3-х кратной повторности опытов и измерений. Статистическую обработку результатов проводили ■ по общепринятой методике (Рокицкий, 1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Влияние условий культивирования на образование . полигалактуронаэц Sacch. рает.огзагшя В результате проведенных, исследовании ьыла подобрана оптимальная для образования полигалактуроназы Sacch. pastorianue питательная среда следующего состава (%): (НН4 )2'50-i-ú,5; MgSO*-0,05; NaCl-0,05; KaHPO-í-O.Ol; <№U )zHf0.*-0.5! сахароэа-Э,0; свекловичный пектин-0,5; дрожжевой экстракт-0,5. Культивирование целесообразно проводить при 28-30°С в 250 мл колбах Эрленмейера, содержащих 100 мл среды с начальным рН 5,0 Наибольшую продукцию фермента обеспечивают в качестве инокулята клетки дрожжей (3,0%), находчщиеся в экспоненциальной фазе развития.

Полигалактуроназа продуцируется в среду культивирования при выращивании дрожжей на средах с углеводами, органическими кислотами, спиртами. Увеличение внеклеточной активности ПГ отмечено ipvi использовании сред со смешанными источниками углеродного гитания. Так, если к среде с сахарозой, фруктозой, галактозо»-. добавить 0,5% свекловичного пектина активность ПГ в среде сультивирования возрастает в 1.66, 2.1 и 3.2 раза соответственно ;рис.1). Однако, очищенный СЕекловичный пектин, пектовая кисло-'а, полипектат натрия и яблочный пектин не еыгыеэют ■'.^'•'лнчснп'т

гч

I

полигала(стуроказной активности - Вероятно, стимулирующий эффект с неочищенного свекловичного пектина можно объяснить содержащимися 1

• 400

300"

ZOO

100'

.0

1 2 3 4 ее

Рис. 1 Влиявие источника углеродного питания на накопление полигалактурогазы (1 - ПГ, вд/мл) в сред© культивирования 1 - галактоза; 2 - глюкоза; 3 - мальтоза; 4 - сахароза; 5 -Фруктоза; 6 - свекловичный пектин;

СЭ - углеводы ЁШеЭ - то же + свекловичный пектин

в нём примесями. Примечательно, что в культуральной жидкости v

Sacch. pastorianue^ йеэависимо от используемых пектиновых веществ, Обнаруживается тсиичо эндополигалактуроназная актив' ность. Таким образом, специфический субстрат не является необходимым условием образования фермента. Это дает основание отнести синтез полигалактуроназы у Sacch. pastorianus к конститутивному.

Отличительной особенностью дрожжей Sacch. pastor-ianus является образование внеклеточной полигалактуроназы при высоких концентрациях глюкозы в питательной среде в условиях ограниченной аэрации культуры (рис.2).

е

2

Рис. 2 Влияние различных концентраций глюкозы (2 - %) на накопление полигалактуроназы (1 - ПГ, ед/мл) в среде культивирования Sacch. pastor iarvus ¡M i - культивирование без дополнительной аэрации ШШ ~ культивирование на биологической качалке

Установлено, что при культивировании ЗассЬ. раз^гхаггиз уровень клеточносвязанного фермента меняется незначительно и не превышает 4,0% от уровня суммарной активности полигалактуроназы. В период наиболее активной продукции полигалактуроназы нгблюда-ется некоторое увеличение доли клеточносвязанного 'Фермента. Однако, сравнение величины активности фермента секретпрованного в культуральную жидкость и связанного с клеткой говорит в пользу того, что полигалактуроназа ъаесЬ. рав!:ог1апив является преимущественно внеклеточным ферментом. По-видимому, клеточносвпэаним1 фермент - это лишь промежуточный этап в секреторном процессе.

эяектрофоретическое исследование белков, секретируемых^ растущими клетками Sacch. pastorianue, показало, что внеклеточ-

24 48 72 96 Ч

Рис. 3 Электрофореграммы и энзимограмма белков, секретируемых Sacch. pastorianua в динамике роста

ная ПГ обнаруживается чер&з 24 ч роста (рис.3). Причем, в первые 48 ч культивирования это единственный белок, секретируемыи дрожжами. Характерная особенность культуры - низкий уровень белка в среде культивирования (5-10 мкг/мл).

Исследование Атетики образования внеклеточного фермента Sacch. pastorianue показало, что максимальные удельные скорости 0 роста iJKj и синтеза полигалактуроназы (£) разобшены во времени. Накопление внеклеточного фермента происходит преимущественно в ностэкспоненииальной фазе развития культуры. На рис.4 представлено графическое изображение удельных скоростей роста и синтеза полигалактуроназы дрожжами. На исследованных средах удельная скорость роста дрожжей Sacch. paatorianus меняется незначительно: otJKwx=0,26 ч-1 на среде с сахарозой до J4m»>t=0,24 ч-1 на

. среде с этанолом. Однако, в первом случае достигается к а ч

10

12 24 36 <16 60 72 3

Рис. 4 Рост Sacch. pastoriarms и образование полигалактуроназы при

культивировании нз сахарозе (X), этаноле (II). сахарозе с добавлением свекловичного пектина (III)

1 - удельная скорость роста.

2 - удельная скорость синтеза,

ед'МГ'Ч-1

3 - время культивирования, ч

13 34 36 48 ¿0

18

12

культивирования, а во втором-г. 15 ч. На всех средах максимум, удельной скорости роста еномассы i jv- ) предшествует максимальной дифференциальной скорости синтеза полмгалактуроазы l £ ). Эффепг наиболее. выражен на среде с этанолом, где ju- тлж достигается к 15 ч, а £ ишх-к 63 ч культивирования. На среде с сахарозой, а также на среде с сахарозой и свекловичным пектином, кривые скорости роста и синтеза ПГ имеют несколько пиков, что, вероятно, объясняется поэтапным усвоением источников углеродного питания.

Особенности рруруляпии образования и секррпми

полигалактуррназы.. у Sacctu. pastorianyis глнкопои и другими

лагкоупвояемыми источниками углерода

Дрожжи Saccti. pastor ianuB активно образуют полигалактуро-

назу на среде с глюкозой в качестве единственного источника

углерода. иднако, внесение глюкозы. в среду с сахарозой и

свекловичным пектином или среду с этанолом, в одних условиях

приводит к подавлению продукции полигалактуроназы, в других - к

стимулированию. Эффект зависит от концентрации сахара (рис.5) и

от времени его внесенчя в питательную среду (рис.6). \

При добавлении'- в начальную точку роста глюкоза стимулируе.' накопление полигалактуроназг lрис.6). Добавление глюкозы в растущею культуру Saccti. pastarianuo влечет за собой снижение уровня ПГ активности в культуральнои жидкости по сравнению с контролем. Подавляющее действие глюкозы неспецифично, диалогичный эффект оказывают арабиноза, галактоза, лактоза, мальтоза, добавленные в количестве 2и мг/мл к основной среде в разные периоды культивирования. Продуцирующая способность дрожжей может

снижаться при этом на 30-70%.

■12

Снижение активности внеклеточной полигалахтуроназы у ЗзесЬ. раз-Ьог!апиз при добавлении глюкозы, по-видимому, не связано с ье

Рис. 5 Изменение активности ПГ при внесении различных концентраций глюкозы в питательную среду с сахарозой и свекловичным пектином (К)

1 - ПГ, % 2 - глюкоза, %

непосредственным действием на фермент, так как глюкоза не является специфическим ингибитором полигалактуроназы. Глюкоза в количестве 20 мг/мл, добавленная в момент посева, потребляется дрожжами к 24 ч, а внесенная к 4й ч культуре не обнаруживается в среде культивирования через 6-9 ч (рис.6).

Добавление глюкозы к отмытым клеткам ЗассЬ. разъсггапис в ацетатном буфере позволило установить, что она не оказывает существенного влияния на секрецию фермента.

Более детальное исследование изменений, наблюдаемых после добавления глюкозы (2,0%) в растущую на среде с этанолом 48 ч культуру ЗассЬ. раеЪогЧапиз позволило установить, что глюкоза в начальный период вызывает как резкое повышение скорости роста

160

120

Рис. 6 Влияние времени внесения глюксс-я (2,0%) иа накопление аолигалактуроназа (1 - ПГ, ед/ил) блосЬ. раа<;ог1с1тдз 1 - контроль

2-5 - то где + 2,0% гл.оцозы Стряпка;-:« ¡за графике отмечено:

V- время снзссдапл глюкоси; па оси абсцисс - время потребпепия

глюкозы

дрожией, так и увеличение дифференциальной скорости•синтеза внеклеточной полигалактуронази - на этаноле £= 5,3 ед^мг-1.*-»-1, после внесения глюкозы £= 12,5 ед-мг-Лч-1 (рис.7). После потребления сахара (через 9-12 ч) накопление фермента в среде прекращается. В это время отмечено снижение уже имеющейся активности внеклеточной ПГ. С падением полигалактурйназной активности уровень внеклеточного белка в культуральной жидкости не снижается, также как и не изменяется спектр белков, секретируемых вассй. рае1;ог1впие. • ,

'Определение содержания АТФ в клетках дрожжей при культивировании на этаноле и после добавления к растущей культуре З&ссЬ.

Н '

раз<;ог1апиз глюкозы показало, что снижение активности ПГ в-культуральнон жидкос-ш, также как и ее последующее восстановле-

Рис. 7 Динамика активности полигалактуроназы (1 - ед/мл), дифференциальном скорости синтеза фермента (2 - ед«мг-1•ч-1) и спектра внеклетсчных белков (А) после внесения глюкозы (О) к 48 ч культуре ЗассЪ. разгог-Хапиз на среде с этанолом (К)

3 - время после внесения глюкозы, ч

4 - глюкоза, мг/мл

ние. не связано с энергетическими затратами клетки (рпс.З).

• Использование полупроницаемых мембран показало у. -что, уснижение активности ПГ происходит и без контакта феррздга: ■<?• клеЗтачнои поверхностью дрожжей. Эти дангые дают. с>он<5 йьн^-предположить возможную связь инактивации с действией^^зкфмолекулярных метаболитов, появляющихся в культуральнси^зуадцр.рти БассЬ. раггогХапиз.

Исследования, проведенные нами с использованием методов газожидкостной хроматографии показали, что изменение активности

2 6.0

о ta ia 24 з

Рис.8 Изменение активности полигалактуроназы (1) в культуральной жидкости и содержания ATO i2) в клетках дрожжей после добавления глюкоза

Ki - активность ПГ (ед/мл) в среде с этанолом (Контроль) Oí - то же после добавления глюкозы (2,OS) Кг - содержание АТФ,' мМ/мт (Контроль) Ог - то же после добавления глюкозы (2,0%) 3 - время после внесения глюкозы, ч

внеклеточной полигалактуроназы Sacch. pastorianu3 коррелирует с появлением и исчезновением в культуральной жидкости этилацета-та. содержание которого достигает максимума в момент наиьолее ■резкого снижения активности фермента 1рис.9). В опытах in vitro добавление этилацетата к раствору фермента также вызывает снижение его активности. После воздействия этилацетата via ПГ происходит .изменение кинетических параметров фермента. На основании данных зависимости 1/V от ■1/S можно предполагать, что в данном случае, возможно, происходит неконкурентное ингибиоование этил-

ацетатом активности ПГ. Величина Км при увеличении концентрат■■• 16

А Б

Рис. 9 Внеклеточные метаболиты (А) и полигалактуроназная активность (Б) и культуральной жидкости Ьассп. рааСоПапиа после внесения глюкозы в среду с этанолом

этилацетата не изменяется, тогда как У то.:-, снижается от '¿.,0 до 1,5. После потребления этилацетата дрожжами наблюдается частичная реактивация фермента, Ушах при этом возрастает до 1,86.

Приведенные результаты изучения влияния глюкозы и других легкоусвояемых источников углерода на образование и секрецию полигалактуроназы дрожжами свидетельствуют о множественности эффектов, вызываемых ими. Так, добавление глюкозы в момент

посева стимулирует пост культуры и последующее накопление поли-галактуроназы. В то'же время, внесение глюкозы и других легко-

1/V

Рис.10 Активность полигалактуооназы tíacch. pastorianus в зависимости от концентрации субстрата после добавления глюкозы К - контроль

I - в момент снижения активности R - в мокзнт реактивации

усвояемых источников углерода в различные фазы роста дрожжей подавляет накопление фермента в культуральной жидкости. Совокупность полученных нами результатов в сопоставлении с известными литературными данными позволяет судить о наличии у дрожжей Saccn. pastorianu3 контроля активности внеклеточной ПГ, связанного с воздействием низкомолекулярного метаболита. Можно

V

предположить, что/резкое падение ферментативной активности выэ-

И

вано обратимым изменением молекулы фермента под влиянием этил-ацетата, который появляется в среде культивирования дрожжей при метаболизме углеводов.

Выделение и свойства полигалактуррназы йаесЪ. г,ая+-.пг-1 апид

Полигалактуронаэа из культуральной жидкости Засс'п. г1агтз очищена по схеме приведенной в табл.1.

Таблица 1

Очистка полигалактуронаэы ЗассЬ. раэгогАапив

-1-;-1-г——--—Г—->

Стадии очистки | Удельная | Очистку Общая ¡Выход, | активность ПГ,| | активность ПГ • ]

| *103, (ед/'мг)| (раз) | (ед) | (%)

Концентрирование КЖ 3,3

Фракционирование 3,5 (Ш-ОгвСи

Гель-фильтрация 3,5 на БерИзаех в-25

Хроматография на ди- 4,8

аминогексилсилохроме С-80

Гель-фильтрация на 8,0 верЬааех С-100

1,0 3.9

1.06 1,4

1,06 1,4

1,6 0.24

2,4 0,2

100.0 35,9

35,9

6,2

5,1

Молекулярная масса очищенной таким образом ПГ по результатам гель-фильтрации и электрофореза составляет соответственно -42 и 43 кД. Так как гель-фильтрация проводилась в нативных

19

■условиях, а электрофорез - в денатурирующих, полу"енные результаты указывают на то, что молекула фермента не имеет субъединичной структуры. Нами установлено. что ПГ Sacch. pastortanue поедставляет собой гликопротеин, углеводная часть которого составляет 3,2%.

В то же время, при использовании для очистки спирто-осажденвого ферментного препарата гель-фильтрации на Toyopearl НН-55. выделяется элёктрофоретически гомогенная высокомолекулярная фоакция с активностью ПГ. ¡Молекулярная масса ее по данным гель-фильтрации выше 200 кД, содержание углеводов 79% (табл.2). Электрофоретическая подвижность очищенной таким образом ЯГ не отличается от электрофоретической подвижности фермента, очищенного методом ионообменной хроматографии.

Таблица 2

Т1олигапактуроназы Sacch. pastorianus

о

---1-.-:-1-1-:-

Схема | Молекулярная масса Углеводный | ПГ.

очистки --г--1--( компонент. % I ед/мг белка

| гель-фильтрация | ЭФ | j

-_i__ .i._:_i_—i_

3. 216 КД 43 кД 79 1070

•2 42 кй ■ 43 КД 3.2 8000

Можно полагать, при ионообменной хроматографии, также как и при электрофорез® высокомолекулярной фракции спиртоосажденного препарата, происходит отрыв углеводного компонента от белковой части молекулы, t^Hi, этом активность полигалактуроназы Sacch. pastorianus возраетсат почти в 6 ваз - от 1070 ед до 8000 ед.

' 20. ..

Секреция полигалактуроназы дрожжами в составе высокомолекулярного комплекса с "глеводами обнаружена нами впервые.

Проведено сравнительное изучение ряда физико-химических и каталитических свойств ПГ Sacch. pa3torianus. очищенной различными методами. При изучении рН-оптимума действия установлено, что в обоих случаях ПГ проявляет наибольшую активность nt.i рН 4,0-5,0. Фермент наиболее активен при температуре 50°. Уменьшение или увеличение температуры на 10° приводит к снижению гидролизуюшей способности на 40 и 30?; соответственно. ПГ Sacch. » pastorianus проявляет высокую стабильность в интервале рН 5.07,0, в щелочных условиях фермент инактивируется за это время на 70-80%. ПГ Sacch. pastortanus стабильна при температуре 0-35°: повышение температуры до 40 и 45=' ведет к потере 25 и /5% активности. Фермент с низким содержанием углеводов сохраняет лищь 80% активности по сравнению с ПГ с высоким содержанием углеводов.

Для определения типа действия очищенной ПГ Sacch. pa3to-rianus на субстрат (зкзо- или эндо- типа) изучалось снижение вязкости 1,0% раствора пектовой кислота в процессе фермента^ тивной реакции и изменение пои этом количества Сахаров' с" редуцирующими группами. Снижение вязкости раствора пектбвои кислоты на 47.0% под действием ПГ Sacch.u. paaÈ&iisrais сопровождается гидролизом 5,7% глииозидных .. связей-.^ из чего следует, что фермент действует по эндо-г тицу,^..

Определена изоэлектрическая точка,^ДОД-^АПактураНазы Sacch. pastorianu3 - pi равная 5.4. Знздев)1^>.Кп:'^0ятйВЛяет 6.25 Ю-1 мг/мл . Vm«ix=0 .18 мг/мл мин.

Для изучения специфичности действия полигалактуроназн была

использована полигаЛактуронсвая кислота, а также набор пектинов

с различной степенью этерификации. Фермент способен деполимери-ч

зовать все испытанные субстраты, проявляя наибольшую специфичность к полигалактуроновой кислоте.

Легкость выделения и очистки внеклеточной полигалактуроназы Sacch. pastorianus, широкая субстратная специфичность фермента, стабильность при низких значениях рН и температуре до 50°, позволяют рассматривать ПГ как перспективный фермент для использования в составе мультиэнзимных композиций.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ 11 ВЫВОДЫ

1. Исследовано образование внеклеточной полигалактуроназы у 126 музейных культур дрожжей рода Saccharomvcea и 54 представи-

V

телей родов Candida, Brettanomyces, Cryptococcus, t'ebaryomyces, Fabospora, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Torulopsis, Trisho-sporon, Saccharomycopsis. По уровню продукции фермента отобраны дрожжи Sacch. pastorianus Y-509. Особенностью штамма является конститутивный синтез полигалактуроназы и отсутствие активности сопутствующих экзогидролаз iцеллюлазы, кислой протеиназы, пектинэстеразы, пектинтранеэлиминаэы>, что позволяет рекомендовать его не только как весьма удобную модель для изучения механизмов регуляции образования и секреции внеклеточных ферментов, но и как продуцент для получения ферментного препарата с определенными свойствами.

2. Установлено, что полнгалактуроназа воссп. оаагопапие является. секретсрныу белком - по У6Ь этого Фермента выделяется из клетки в окоужахявую среду. В течение 48 ч Роста дрожжей это единственный обнаруживаемый внеклеточный балок. Наиболее еысо-коиу уровню саксетируекой полигалактуроназы предшествует максимум активности нлеточноссязакного фермента. Показано, чтс независимо от используемого источника углесопа, процессы роста дроажеи и образования внегаеточной полигалактуроназы смешены времени - максимальная скорость синтеза Фермента наблюдается в постзкспонениигльной Фазе развития культуры.

3. изучено влияние глюкозы на продукцию внеклеточной полигалактуроназы в различных Условиях роста дрожжей. Обнаружена зависимость эффекта глюкозы от сазы роста ЗассИ. раз^папиэ и от интенсивности аэрации среды. Установлено, что добавление глюкозы в цемент посева стимулирует образование фермента, особенно в первые 24 ч. Внесение сахара в процессе культивирования подавляет продукцию полигалактуроназы. Эффект неспепифичен и вызывается другими легко?/свояемыми источниками Углерода. Установлено, что при ограниченней аэрации увеличение концентрации глюкозы ло 60% стимулирует накопление Фермента, тогда как при интенсивной аэргшш такая же концентрация сахара подавляет продукцию полигалактуроназы.

4. Экспериментально обосновано предположение о том, что эффект глюкозы зависит от физиологического состояния кулътутэы. Полученные данные дают основание предположить, что наблюдаемые эффекты глюкозы связаны, главным обоазом. с накоплением в среде

внеклеточных продуктов метаболизма, в частности, зтилаи^тата.

вызывающего транзненТное снижение активности полигалактуроназы. «/

ó. Впервые показано, что полигалактуроназа Sacch. pastorianus выделяется в среду в виде высокомолекулярного комплекса. включак!шего_79% углеводов. С использованием методов ионообменной хроматографии получен очищенный фермент с содержанием углеводов до 3,2%. Установлено, что углеводный компонент не влияет на характер действия шеомзвта и его субстратную специфичность. Предполагается. что полисахарилвыи компонент секретируемого клетками дрожжей комплекса обуславливает стабильность фермента в процессе экспорта.

S. Полигалактуроназа ¿acch. pastorlanus характеризуется

широкой субстратной специфичностью. Скорость гидролиза пектина

______________ ___ ____

находится в обратной зависимости от степени его этерификаиии. Показано, что Фермент действует по эндо-типу ГКФ 3.2.1.15). не имеет субъединичнои структуры. Молекулярная масса полигалактуро-назы составляет 43 кД, изозлектрическая точка равна pl=5.4, Кш=б.25-10-1 мг/мл, Vmax=0.1B мг/мл мин. оптимальная температура для действия полигалактуроназы - 45-50°. PH - 4.0-5.0. стабильность в широком интервале рН и температуры свидетельствуют о возможности использования полигалактуроназы Sacch. paotoriatvus в составе мультиэнзимних композиций при обработке ннзкометокснлиоованнсго растительного сырья.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕНВ ДИССЕРТАЦИИ

с

1. Рабая Н.Я., Ражкова З.А.. Астаповi4 H.I. Умовы утварэння пол1метылгалактураназы дражджам1 Saccharomyces rastoriamis // Becul АН БССР.- 1988.- N1.- С.87-91.

2. Н.Й. Рябая. Полигалактуроназа дрожжей Saccharomycea paetorianuB //Теэ.докл.Респ.конф.мол.ученых "Биология культивирования и биотехнология микроорганизмов" (г. Ташкент, 24-26 мг»я 1989г. 1 Ташкент,- 1989.- С.56.

3. Астапович H.H., Рябая H.H., Лебедев В.В., Датуиаш-вили В.Н. Полигалактуроназы дрожжей - биосинтез, свойства и применение // Биотехнология микробных ферментов . - Мн.: Наука и техника, 1989.- С.34-64.

4. Рябая Н.Е., Астапович H.H. Выделение и свойства полигалактуроназы дрожжей Saccharomyces paatorianua //Теэ. докл., Всес.конф. "Методы получения, анализа и применения ферментов" (г. Юрмала, 10-14 декабря 1990г.)- Рига.- 1990,- с.95.

5. Астапович H.H.. Рябай Н.Е., лобанок A.F. Влияние глюкозы и других источников углерода на накопление' полигалактуроназы дрожжами Saccharomyces paatorianua // Прикл. бИОХИМ.И микробиол.- 1990.- Т.28, ВЫП.6.- С.743-747.

i

Подписано в печать 12.05;94. Формат 60x8^,1/16. Бумага типографская 211 .Печать офсетная.

Усл.печ.л. 1,5 1,39

Тираж 100 Зак.б4 Бесплатно.

Отпечатано ка роталрингв ЦНБ AHPÍ5 . 220601, Мипск, ул. Сурганова, 15.