Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярный механизм цинк-зависимой димеризации бета-амилоида при болезни Альцгеймера

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярный механизм цинк-зависимой димеризации бета-амилоида при болезни Альцгеймера"

На правах рукописи

КУЛИКОВА АЛЕКСАНДРА АЛЕКСАНДРОВНА

МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МЕХАНИЗМ ЦИНК-ЗАВИСИМОИ ДИМЕРИЗАЦИИ БЕТА-АМИЛОИДА ПРИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА

03.01.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2015

2 7 МАЯ 2015

005569273

005569273

Работа выполнена в лаборатории конформационного полиморфизма белков в норме и патологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардга Российской академии наук

Научный руководитель: Заведующий лабораторией конформационного

полиморфизма белков в норме и патологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардга Российской академии наук, доктор биологических наук, профессор, академик Российской академии наук Макаров Александр Александрович

Заведующий отделом биохимии животной клетки Научно-исследовательского института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, доктор биологических наук, профессор Муронец Владимир Пзраилевич

Научный сотрудник лаборатории генетического моделирования нейродегенеративных процессов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологически активных веществ Российской академии наук, кандидат биологических наук К ухарским Михаил Сергеевич

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук

Защита диссертации состоится «18» июня 2015 г. в 11-00 на заседании Диссертационного совета Д 002.235.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д.32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д.32.

Автореферат разослан «/¿л 2015 г.

Крицын

Официальные оппоненты:

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Изменение структуры белков, приводящее к их патологической агрегации, лежит в основе развития ряда нейродегенеративных заболеваний — протеинопатий. Особое место среди протеинопатий занимает болезнь Альцгеймера (БА) — наиболее распространенная причина деменции пожилых людей. БА диагностируется примерно у 11% лиц старше 65 лет и у 32% - старше 85 лет. Увеличение продолжительности жизни в ближайшем будущем делает БА одной из основных проблем, с которой столкнутся системы здравоохранения развитых стран. В 2010 г. во всем мире насчитывалось 36 млн. человек с диагнозом БА, а к 2050 г. их число может составить 115 млн.

Степень разработанности темы исследования. БА характеризуется наличием амилоидных бляшек в межклеточном пространстве и внутриклеточных нейрофибриллярных клубков в головном мозге пациентов. Основным компонентом амилоидных бляшек является бета-амилоид (Ар) - пептид, состоящий из 36-43 аминокислотных остатков. Согласно «амилоидной гипотезе» возникновения БА (Hardy and Selkoe, 2002), ключевым событием, запускающим патогенный каскад заболевания, является процесс агрегации Ар в нейротоксичные димеры и олигомеры, а затем - в амилоидные бляшки. На сегодняшний день детальный молекулярный механизм агрегации Ар остается неизвестным. Важную роль в этом процессе играют ионы цинка. Первые шестнадцать аминокислотных остатков Ар формируют его металлсвязываюгций домен- Ар(1-16). Наличие мутаций и посттрансляционных модификаций в Ар(1-16) оказывает влияние на процесс агрегации Ар и, таким образом, на развитие БА.

В настоящее время не существует эффективных лекарственных средств, способных остановить течение заболевания. В связи с этим ведется активный поиск новых лекарственных мишеней. Выявление молекулярных основ патогенной агрегации Ар, а именно, взаимодействия металлсвязывающего домена АР(1-16) и его природных изоформ с ионами цинка, представляет большой интерес в свете направленного поиска терапевтических мишеней и борьбы с БА. Цели и задачи. Целью настоящей работы являлось определение молекулярного механизма цинк-зависимой димеризации металлсвязывающего домена АР(1-16) и его модификащш при БА. В задачи работы входило:

1. Установление аминокислотных остатков, хелатирующих в мономерном комплексе Ар(1-16) человека с цинком.

2. Определение сайта цинк-зависимой димеризации Ар(1-16) человека.

3. Исследование влияния трех замен в Ар<1-16) крысы на его взаимодействие с ионами цинка.

4. Исследование влияния модификаций Ар(1-16) человека, ассоциированных с патогенезом БА — фосфорилирования остатка Ser8 АР(1-16) и «английской» His6Arg мутации-на его взаимодействие с ионами цинка.

5. Сравнение цитотоксического действия полноразмерного Ар, АР(1-42), и АР(1-42), содержащего

изомеризованный остаток Asp7, на нейрональные клетки человека. Научная новизна исследования. Впервые было систематически исследовано взаимодействие ионов цинка с Ар(1-16) человека и влияние ассоциированных с развитием БА мутации и посттрансляционной модификации АР(1-16) на процесс его цинк-зависимой димеризации. На основе полученных данных был установлен механизм цинк-зависимой димеризации Ар(1-16) человека и его патогенных форм. Выявленные в ходе работы различия в структурной организации цинк-связывающих сайтов Ар(1-16) человека и крысы позволили объяснить тот факт, что при старении у крыс не образуются амилоидные бляшки, которые являются основным гистопатологическим признаком БА. Установлено, что изомеризация Asp7 Ар приводит к значительному усилению его токсического действия на нейрональные клетки человека NSC-hTERT.

Теоретическая и практическая значимость работы. В ходе диссертационной работы, в рамках развития «амилоидной гипотезы» возникновения БА, был установлен молекулярный механизм цинк-зависимой димеризации АР(1-16) и его модифицированных форм. Полученные данные указывают на важное значение взаимодействия ионов цинка с металлсвязывающим доменом Ар(1-16) в процессе развития БА. Результаты работы свидетельствуют о том, что фрагмент 11-14 Ар, через который осуществляется димеризация Ар(1-16) человека, представляет собой терапевтическую мишень, блокирование которой будет замедлять прогрессию БА. Методология н методы исследования. В работе были использованы современные биофизические методы анализа структуры молекул и их взаимодействий: изотермическая калориметрия титрования, спектроскопия ЯМР, оптический биосенсор, работающий на эффекте поверхностного плазмонного резонанса, масс-спектрометрия с ионизацией распылением в электрическом поле, гибридный квантово-механический/молекулярно-механический метод. Для измерения параметров клеток был использован метод проточной цитометрии. Положения, выносимые на защиту.

1. Установлено, что в мономерном комплексе металлсвязывающего домена 1-16 Ар человека с Zn2+ фрагмент 6-14 формирует минимальный цинк-связывающий центр, в котором ион цинка координируется остатками His6, Glull, Hisl3 и Hisl4, а участок 11-14 представляет собой первичный сайт узнавания Zn2+. Этот же участок является сайтом цинк-зависимой димеризации Ар( 1-16).

2. Обнаружено, что АР(1-16) крысы образует цинк-индуцированные димеры, структурная организация которых отличается от димеров АР(1-16) человека. В димерах Ар(1-16) крысы

координируется остатками His6 и His 14 двух субъединиц, взаимное расположение которых препятствует формированию амилоидных фибрилл.

3. Показано, что исключение остатка His6 из координационной среды Zn2+ вследствие патогенных модификаций в A(J(1-16) человека, таких как фосфорилирование остатка Ser8 и «английская» наследственная His6Arg мутация, усиливает его цинк-зависимую димеризацию.

4. Обнаружено, что изомеризация Asp7 приводит к значительному усилению токсического действия полноразмерного АР(1-42) на нейрональные стволовые клетки человека NSC-hTERT. Нейротоксический эффект этой модификации обусловлен индукцией апоптоза.

5. Установлен молекулярный механизм цинк-зависимой димеризации металлсвязьгеающего домена Ар человека и его модифицированных патогенных форм. Показано, что димеризация всех исследованных форм Ар(1-16) человека осуществляется через фрагмент 11-14. Полученные результаты свидетельствуют о том, что фрагмент 11-14 р-амилоида представляет потенциальную лекарственную мишень, блокирование которой будет препятствовать его патогенной димеризации и развитию БА.

Степень достоверности и апробация результатов. Основные результаты работы были представлены на девяти международных и на одной российской конференциях. Материалы диссертационной работы отражены в девяти статьях, из них семь статей — в зарубежных профильных рецензируемых журналах, две статьи — в отечественном профильном рецензируемом журнале.

Личное участие автора в получении научных результатов. Основные результаты диссертационной работы получены автором или при ее непосредственном участии. Структура н объем работы. Диссертация изложена на 114 страницах текста и включает в себя 11 таблиц и 45 рисунков. Работа содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и их обсуждение, выводы, список сокращений и условных обозначений, приложение и список литературы. Список литературы включает 264 наименования.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Ар — бета-амилоид;

АР(1-16) - металлсвязывающий домен Ар, включающий остатки от 1 до 16; АР(1-42) — Ар, включающий аминокислотные остатки от 1 до 42; AP(1-16)H6R- АР(1-16) человека, содержащий замену His6 на Arg; HEPES - 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-l-yl]ethanesulfonic acid; isoAp(l-42) - АР(1-42), включающий изомеризованный остаток Asp7; рАр - Ар человека, фосфоршшрованный по остатку Ser8; PIPES - 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid; pSer — фосфорилированный остаток Ser; гAP( 1 -16) - AP( 1 -16) крысы; БА — болезнь Альцгеймера;

Бис-трис-2-[бис(гидроксиэтил)амино]-2(гидроксиметил)-1,3-пропандиол;

БППР- биосенсор, работающий на эффекте поверхностного плазменного резонанса;

ИКТ — изотермическая калориметрия титрования;

КМ/ММ - квантовая механика/молекулярная механика;

м.д. — миллионные доли;

ПТМ — посттрансляционные модификации;

РЕ - резонансные единицы;

Трис - 2-Амино-2-(гидроксиметил)-1,3-пропандиол гидрохлорид;

ЭС-МС - масс-спектрометрия с ионизацией распылением в электрическом поле;

ЯМР — ядерный магнитный резонанс.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Введение

Во введении кратко обозначена проблема БА, описаны молекулярные основы патогенеза этого заболевания, сформулированы основные цели и задачи исследования, обоснована его актуальность и практическая значимость.

1. Обзор литературы

В данном разделе рассмотрен класс нейродегенеративных заболеваний, протеинопатий, к которым относится БА. Представлены основные этапы развития этих заболеваний, подробно описан процесс образования амилоидных фибрилл и активируемые защитные механизмы клеток. Изложены базовые молекулярные процессы развития БА. Детально рассмотрено ключевое событие в инициировании БА - процесс патологической агрегации Ар и место ионов цинка в этом процессе. Особое внимание уделено роли мутаций и посттрансляционных модификаций (ПТМ) металлсвязывающего домена Ар в развитии ранних и поздних форм БА.

2. Материалы и методы исследований

В данном разделе подробно описаны объекты исследования (синтетические пептиды Ар, его фрагменты и модифицированные формы), использованные в работе реактивы, линия нейрональных стволовых клеток человека NSC-hTERT. Детально описаны методы исследования: изотермическая калориметрия титрования, ИКТ; оптический биосенсор, работающий на эффекте поверхностного плазмонного резонанса, БППР (эксперименты проводились в ФГБНУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича» в сотрудничестве с Ивановым А.С. и Мезенцевым Ю.В.); масс-спектрометрия с ионизацией распылением в электрическом поле, ЭС-МС (эксперименты проводились в ФГБНУ Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН в сотрудничестве с Индейкиной М.И. и Поповым И.А.); гибридный квангово-механический/молекулярно-механический, КМ/ММ, метод (расчеты проводились совместно с Головиным А.В., сотрудником Факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В. Ломоносова); спектроскопия ядерного магнитного резонанса, ЯМР (эксперименты проводились на Факультете фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова в сотрудничестве с Полыпаковым В.И. и Истрате А.Н.), метод проточной цитометрии.

3. Результаты н их обсуждение

3.1. Определение минимального цинк-связывающего сайта в металлсвязывающем домене

Ар человека

Ранее с помощью метода ЯМР были установлены 3D структуры металлсвязывающего домена Ар - АР(1-16) — в свободной форме и в комплексе с Zn2+ (Zirah et al., 2006). Было показано, что в комплексе Zn\Ap(l-16) ион цинка координируется тремя остатками гистидина, His6, Hisl3 и Hisl4, посредством их N8i, Ne2 и N8| атомов, соответственно, и остатком Glull посредством OS атома Эта структура была получена для Ар{1-16) с ацетилированным N-концом и амвдированным С-концом, не агрегирующего в присутствии ионов цинка в физиологических условиях. В то же время существовало несколько альтернативных моделей взаимодействия иона цинка и Ар(1-16) с неацетилированным N-концом. Участие трех остатков гистидина в координации ионов цинка не вызывало разногласий, на роль же четвертого хелатора цинка вместо остатка Glull был предложен остаток Aspl (Danielsson et al., 2007). Также была предложена модель пентакоординащш иона цинка остатками Aspl, His6, Glull, Hisl3 и Hisl4 (Gaggelli et al., 2008). Однако, в отличие от модели Zirah и колл., пространственная структура ни одной из альтернативных моделей комплекса не была установлена. В диссертационной работе для выявления минимального цинк-связывающего сайта АР(1-16) необходимо было однозначно определить аминокислотные остатки, участвующие в координации Zn2+.

Время, мин 10 20

г а-'

<1

ттрг^

ТШТТГ^

АР(1-16)

Ар(6-14)

АрСб-13)

[2п2+]/[фрагментАр]

Рисунок 1. Кривые титрования Ар(1-16) (фиолетовый), Ар(6-14) (зеленый) и Ар(6-13) (оранжевый) ионами цинка (верхняя панель), полученные методом ИКТ, и изотермы связывания, рассчитанные из этих кривых титрования (нижняя панель). Измерения проводились при 25°С в 50 мМ Трис буфере, рН 7,3.

Для решения этой задачи с помощью ИКТ была охарактеризована термодинамика связывания гп2+ с Ар(1-16), его фрагментами и мутантами. Типичные кривые титрования пептидов Ар(1-16), АР(6-14) и АР(6-13) ионами цинка и соответствующие им изотермы связывания приведены на рисунке 1. Термодинамические параметры связывания '¿п2' с фрагментами и мутантами АР(1-16), рассчитанные из изотерм связывания, представлены в таблице 1. Исходя из полученных данных, можно заключить, что ацетилирование М-конца практически не влияет на связывание 2п2+ с АР(1-16). Процесс титрования фрагмента Ар(1-5) ионами цинка не сопровождался выделением теплоты, т.е. Ы-концевая часть Ар не связывает ионы цинка. Сокращение АР(1-16) на пять аминокислот с Ы-конца и на две аминокислоты с С-конца (Ар(1-16)—>Ар(6-14)) приводит к пятикратному возрастанию его сродства к Это может

объясняться тем, что в отсутствие ионов цинка боковая цепь остатка Нкб образует водородную связь с карбоксильной группой остатка Азр1 или МиЗ в АР( 1-16). Дальнейшее удаление одного из концевых гистидинов фрагмента Ар(6-14)

Таблица 1. Термодинамические параметры связывания гп2+с АР(1-16), его фрагментами и мутантами, полученные с помощью ИКТ при 25°С в 50 мМ Трис буфере, рН 7,3

Пептид Лд, М^хЮ"4 АН ккал хМ"1 ТАЗ," ккалхМ"1

Ар(1-16) 1,1 1,80 -4,0 1,8

АР(1-16)откр* 1,1 3,90 -5,4 0,9

Ар(6-14) 1,0 8,60 -9,2 -2,5

Ар(6-13) 0,6 0,34 -8,1 -3,3

Ар(7-14) 0,9 0,17 -7,9 -3,5

АР(11-14) 0,5 0,2Т" -2,6 2,1

АР(1-5) связывание не детектировалось

АР(1-16)Е11А 1,0 0,54 -6,9 -1,8

Ар(1-16)Н611 0,5 0,24 °> -5,6 -1,0

N - стехиометрия взаимодействия 7,гГ:пептид; 61 Ка - константа ассоциации, стандартное отклонение не превышало 20%; е> АН - изменение энтальпии системы, стандартное отклонение не превышало 10%; г> АБ - изменение энтропии системы, вследствие димеризации пептида, размерность Ка выражена в М"2; * - пептид не несет защиту на >)-конце

приводит к значительному снижению константы ассоциации Ка. Эти данные указывают на то, что все хелатирующие Zn2+ аминокислотные остатки входят в состав фрагмента 6-14 Aß. Аминокислотные остатки Ар(1-16), расположенные между Asp7 и ТугЮ, не участвуют в связывании Zn2+, поскольку их удаление (Aß(7-14)—>Aß(l 1-14)) лишь немного изменяет сродство пептида к цинку. Замены Glull на Ala и His6 на Arg в Aß(l-16) приводят к сильному понижению сродства к Zn2+. Полученные данные свидетельствуют о том, что His6, Glul 1 и Hisl4 необходимы для координации Zn2+.

Связывание Zn2+ с Aß(l-16), его фрагментами и мутантами является энтальпийно выгодным процессом (табл. 1). Стехиометрия связывания Zn2+ с фрагментами Aß(6-13) и Aß(ll-14) близка к 0,5, что говорит о формировании димеров через посредство Zn2+. Высокая положительная энтропия связывания Zn2+ с фрагментом Aß(ll-14) обусловлена формированием гидрофобных контактов между двумя пептидными субъединицами в процессе димеризации, что также согласуется с данными ЯМР

В связи с тем. что в присутствии ионов цинка фрагмент Aß( 11-14) димеризуется, определение термодинамических параметров образования мономерного комплекса Aß( 11-14) с Zn2+ не представляется возможным. Для выявления роли этого фрагмента в механизме узнавания Zn2+ были проведены КМ/ММ расчеты стабильности мономерных комплексов фрагментов Aß(ll-14), Aß(6-14) и Aß(l-16) с Zn2+. Установлено, что Aß(6-14) и Aß(l-16), хелатирующие Zn2+ посредством остатков His6, Glull, Hisl3 и Hisl4, сохраняли стабильную тетраэдрическую координацию иона цинка в течение восьми пс наблюдения системы. Исходя из результатов моделирования, можно заключить, что на начальной стадии взаимодействия Zn2+ узнается и захватывается фрагментом Aß(ll-14), а в роли четвертого хелатора временно выступает молекула

воды (рис. 2А). Такая структура

0 Таким образом, с помощью

метода ИКТ было показано, что

Рисунок 2. Схема узнавания 2п1+ фрагментом Ар(6-14), фрагмент АР(6-14) образует полученная с помощью метода КМ/ММ с использованием

1IVV1T 1V1U1M/4 V W H1V1 V^U IVITlf 1ТД1Т1 V liVilVJW^ULIUiUlVm ^ w

.............._ „ rDnuAPc/rDiim í„____________ „ минимальныи цинк-связывающии

программного пакета GROMACS/CPMD (пояснения в

С N

о

существует до тех пор. пока имидазольное кольцо остатка Нкб не приблизится к Zn2+ и не заменит молекулу воды в координационной сфере цинка, что приведет к завершению формирования

комплекса (рис. 2Б).

тексте).

сайт Aß(l-16), в котором ион цинка координируется остатками His6,

Glul 1, Hisl3 и Hisl4. Три из четырех аминокислотных остатков фрагмента Aß(l 1-14) участвуют в связывании Zn2+. Эти данные позволяют рассматривать фрагмент Aß(l 1-14) как первичный сайт узнавания иона цинка

3.2. Определение сайта димеризации металлсвязываюшег о домена Aß

I

В присутствии ионов цинка Aß(l-16) преимущественно существует в мономерной форме, ; хотя в растворе также образуются его димеры. Данные, характеризующие участок Aß( 11-14) как первичный сайт узнавания Zn2+, позволили предположить, что этот же участок может быть вовлечен в процесс цинк-индуцируемой димеризации Aß(l-16). Для определения интерфейса цинк-индуцированной димеризации Aß(l-16) были охарактеризованы взаимодействия иммобилизованного Aß(l-16) с Aß(l-16) и его фрагментами с использованием БППР. Над поверхностью сенсорного чипа, на котором был иммобилизован Aß(l-16), пропускали растворы фрагментов Aß (рис. 3, табл. 2). В отсутствии Zn2+ не было зарегистрировано резонансных сигналов. Добавление Zn2+ в буфер приводило к формированию комплексов между иммобилизованным Aß(l-16) и следующими пептидами: Aß(l-16) (рис. ЗА), Aß(ll-14) (рис. ЗБ), \ Aß(6-14) и Aß(7-14) (табл. 2). Полученные результаты свидетельствуют о том, что все пептиды с высоким сродством к Zn содержат аминокислотную последовательность "EVHH14 - фрагмент Aß(l 1-14) (табл. 2). Следовательно, этот регион является фрагментом, необходимым для

образования цинк-связанных комплексов Aß(l-16). !

I

Для определения стехиометрии комплексов Aß(l-16) с Aß(ll-14) и с Zn2+, а также комплексов Aß(ll-14) с Zn2+ был использован метод ЭС-МС. В отсутствии Zn2+ комплексы Aß(l-16) с Aß(ll-14) зарегистрированы не были. В присутствии Zn2+ в масс-спектре смеси Aß(l-16)/Aß(l 1-14) был зарегистрирован изотопный паттерн трехзарядного нековалентного комплекса Aß(l-16)-ZnAß(l 1-14) со стехиометрией 1:1:1 (рис. 4А, m/z 873,7). Другие олигомеры в эксперименте ЭС-МС не наблюдались. В тех же экспериментальных условиях был зарегистрирован гомодимерный комплекс Zn-(Aß(ll-14))2 со стехиометрией 1:2, что соответствует данным ИКТ (рис. 4Б).

о ю

s

и

150 100 50 0

30 20 10 0

--^20*мМ А

_15 цМ

10 рМ

2цМ ---

0 им

с- 250 иМ Б

200 |jM

- - 150 цМ

100 мМ

50 JjM -

ОцМ

100 200 300 Время, сек

400

Рисунок 3. Сенсограммы взаимодействий АР(1-16) (А) и Ар(11-14) (Б) с иммобилизованным АР(1-16) при 25°С в 10 мМ НЕРЕБ буфере, в присутствии 100 мкМ У.пСЬ, рН 6,8. РЕ - резонансные единицы.

Таблица 2. Кинетические и термодинамические параметры взаимодействия иммобилизованного на поверхности чипа Аре 1-16) и фрагментов Ар при 25°С в 10 мМ НЕРЕБ буфере в присутствии 100 мкМ гпС1г, рН 6,8

Фрагмент Ар у/' к "> V Ö)

в буфере с х10 M"'c"'xl02 МхЮ8 М-'хЮ"6

Aß(l-16) 1,4±0,5 0,3±0,1 40±20 2,0±1,0

АР(6-14) 9,0±2,0 0,9±0,2 100±40 1.0±0,4

Ар(1-5) связывание не детектировалось

Ар(7-14) 9,3±0,7 4,8±0,4 19±3 5,2±0,8

Ар(6-13) связывание не детектировалось

АР(11-14) 2,9±0,2 1,0±0,3 30±10 3,0±1,0

значения констант скоростей ассоциации (к0„) и диссоциации (к0/г) были получены при обработке сенсограмм с помощью программы В1Аеуа1иа1юп 4 1;

значения равновесных констант ассоциации (К„) и диссоциации (К,/) рассчитаны из

V

--------"" г

соотношения: Ка=(Кл) -к0^к„ц.

Полученные данные позволяют заключить, что фрагмент АР(11-14) играет ключевую роль в процессе цинк-зависимой димеризации Ар(1-16), а две взаимодействующие субъединицы АР(1-16) соединяются через посредство гп2+.

Фрагмент Ар(11-14) содержит три потенциальных хелатора Ъг}* — остатки С1и11, ШэП, Н1з14, т.е. при формировании димера в координации могут принимать участие шесть

аминокислотных остатков. Поскольку в биологических системах координационное число цинка равно четырем, некоторые из этих остатков не будут связывать ЪгГ*. Как было показано выше в

[EVHH+H1* 562.27

[2EVHH+Znf* 593.23

[EVHH+Zn-H]" 624.19

550 560 570 580

Рисунок 4. А - фрагмент масс-спектра изотопного паттерна трехзарядного нековалентного комплекса AP(l-16)Zn-Ap(l 1-14) полученный для смеси 10 мМ Ар(1-16):100 мМ Aß(11-14). Б-фрагмент масс-спектра в диапазоне 550-640 m/z, полученный для 10 мМ Aß(ll-14). Сигналы, соответствующие m/z 562,27, 593,23 и 642,19, относятся к однозарядному иону АР(11-14), 1 'EVHH14, его двухзарядному димерному комплексу с ионом цинка и однозарядному аддукту того же пептида, соответственно. Измерения проводились в 50% метаноле, в присутствии 300 мкМ Zn(CH,COO)2. pH 6.3.

экспериментах БП1 IP. остаток His 14 необходим для образования комплекса Ap(l-16)-Zn-Ap(6-14). На основании этих данных с применением КМ/ММ метода были построены модели димера Zn-(AP(11-14))2. В первой модели Zn2+ координировался остатками Glull и Hisl4 двух молекул, во второй - остатками His 13 и His 14. Полученные результаты позволили заключить, что Zn2+ предпочтительно ' хелатируется остатками Glull и Hisl4 двух молекул (рис. 5). Эти данные были подтверждены экспериментально с помощью ИКТ. Установлено, что пептид j АР(11-14)H13R связывает ион цинка с такими же стехиометрией и сродством, как и пептид АР(11-14), т.о. в димере остаток Hisl3 не принимает участия в хелатировании Zn2+.

i

Ионы цинка обеспечивают межмолекулярное взаимодействие пептидов Ар и их последующую олигомеризацию через домен 1-16. В диссертационной работе выявлен участок Ар(11-14), который играет ключевую роль в процессе цинк-зависимой димеризации АР(1-16) и, следовательно, в димеризации полноразмерной молекулы Ар. Этот участок представляет собой потенциальную лекарственную мишень, блокирование которой будет предотвращать патогенную олигомеризацию Ар.

|

3.3. Влияние модификаций металлсвязывающего домена Ар на его взаимодействие с ионами

цинка

Наличие модификаций в металлсвязывающем домене АР(1-16) оказывает существенное влияние на агрегационные и токсические свойства полноразмерной молекулы Ар. Мутации в Ар(1-16) приводят к развитию ранних форм БА, а ПТМ Ар(1-16) играют важную роль в развитии наиболее распространенных поздних форм заболевания. В противоположность этому, природный полиморфизм Ар приводит к тому, что у крыс и мышей, содержащих замены в последовательности АР(1-16), при старении не образуются амилоидные бляшки. В диссертационной работе было проанализировано влияние полиморфизма АР(1-16) на его взаимодействие с Zn2+ для установления молекулярного механизма цинк-индуцированной димеризации Ар при БА.

Рисунок 5. Модель димера 7гг(Ар(11-14))г, в которой ион цинка (обозначен оранжевым) координируется 01и11 и Ни 14 двух субъединиц (обозначены зеленым и желтым), полученная с помощью метода КМ/ММ с использованием программного пакета ОЯОМАСЗ/СРМО.

3.3.1 Механизм цинк-зависимой димеризации металлсвязывающего домена Ар крысы

В отличие от других млекопитающих, в головном мозге крыс и мышей при старении не образуются амилоидные бляшки, которые являются основным гистопатологическим признаком БА. Этот феномен может объясняться наличием трех аминокислотных замен в металлсвязывающем домене Ар крысы (гАр(1-16)), отличающих его от Ар человека (Arg5—>Gly, Try]0—>Phe и Hisl3—>Arg). Ранее были установлены пространственные структуры фрагментов Ар крысы, содержащих металлсвязывающий домен, и идентифицированы возможные хелаторы Zn2+ (Gaggelli et al., 2008: Huang et al„ 2004). Однако, эти данные были получены в нефизиологических условиях (органическом растворителе или мицеллах), что затрудняло достоверное сравнение этих структур со структурой комплекса АР(1-16) человека с Zn2+, полученной в водном растворе при физиологическом значении рН (Zirah et al., 2006).

Для определения молекулярного механизма устойчивости крыс к патогенной агрегации Ар с помощью ИКТ были выявлены аминокислотные остатки гАр(1-16). участвующие в координации Zn2+ и, в сотрудничестве с коллегами (стр. 7), была получена структура комплекса гАр(1-16) с Zn2+ в водном растворе при физиологическом значении рН. Анализ данных ЯМР — изменений химических сдвигов гАР(1-16), наблюдаемых при связывании Zn2+, - позволил выделить остатки His6 и Hisl4. участвующие в координации этого иона. Однако, вследствие высокой подвижности гАР(1-16) в растворе, цинк-индуцированные химические сдвиги относительно малы и их анализ не

дает возможности точно установить, участвуют ли другие остатки в связывании Zn2+. Для точного определения остатков гАР(1-16), координирующих иона цинка, с помощью метода ИКТ были получены термодинамические параметры связывания Zn2+ с гАР(1-16) и его мутантами, содержащими замену потенциального хелатора Zn2+ на остаток апанина. Полученные изотермы связывания показаны на рисунке 6, а термодинамические параметры и стехиометрия связывания Zn2+ с пептидом гАР(1-16) и его мутантами приведены в таблице 3.

Стехиометрия связывания Zn2+ со всеми мутантами, кроме гАР(1-16)ЕЗА и

[гп2+1/[ фрагмент Ар крысы]

Рисунок 6. Изотермы связывания ионов цинка с гАР(1-16) (черный) и его мутантами гАр(1-16)Б1А (оранжевый), гАР(1-16)ЕЗА (голубой), гАр(1-16)Н6А (зеленый), гАР(1-16)07А (синий), гАр(1-16)Е11А (красный), гАР(1-16)Н14А (фиолетовый), полученные методом ИКТ при 25°С в 50 мМ Трис буфере, рН 7,3.

Таблица 3. Термодинамические параметры связывания ионов цинка с гАр(1-16) и его мутантами, полученные с помощью ИКТ при 25°С в 50 мМ Трис буфере, рН 7,3

Пептид №> К.,"1 IVr'xlO"4 АН," ккалхМ"1 TAS, ккалхМ"1

гАР(1-16) 0,6 1,53* -4,8 0,9

rAP(l-16)DlA 0,7 0,98* -3,5 1,9

гАр(1-16)ЕЗА 1,2 0,71 -1,8 3,6

тАр(1-16)Н6А связывание не детектировалось

rAp(l-16)D7A 0,7 1,01* -2,9 2,6

тАР(1-16)Е11А 1 1,44 -1,4 4,3

гАр(1-16)Н14А связывание не детектировалось

стехиометрия взаимодействия гп2+:пептид; ® стандартное отклонение не превышало 20%; в> стандартное отклонение не превышало 10%;'' вследствие димеризации пептида, размерность Ка выражена в М"2

rAP(l-16)El 1А, составляет примерно 1:2, что говорит об образовании димеров пептида, связанных через посредство одного Zn2+ (табл. 3). Замены остатков Aspl, Glu3, Asp7 и Glull на Ala существенно не влияют на сродство Zn2+ к гАр(1-16), т.е. эти остатки не участвуют в координации Zn2+. В противоположность этому, процесс титрования цинком мутантов АР(1-16)Н6А и АР(1-16)Н14А не сопровождался поглощением или выделением теплоты, что говорит о том, что остатки His6 и His 14 участвуют в хелатировании Zn2+. Таким образом, данные ИКТ позволили установить, что при взаимодействии с Zn2+ гАр(1-16) образует димеры, в которых один ион цинка координируется остатками His6 и Hisl4 двух молекул гАР(1-16).

Информация, полученная с помощью ИКТ, и ограничения, установленные в результате анализа спектров ЯМР, были использованы для расчета структуры комплекса гАр(1-16) с цинком. Основываясь на полученных с помощью ЯМР структурных данных, можно заключить, что противоположно направленная ориентация С-концевых участков гАР(1-16) крысы затрудняет дальнейшее образование упорядоченных амилоидных фибрилл. В противоположность этому в цинк-связанном димере АР(1-16) человека С-концы пептидов находятся в выгодной для олигомеризации ориентации. Итак, комбинация методов ИКТ и ЯМР позволила выявить существенные различия в структурной организации цинк-связывающих сайтов Ар человека и крысы. Эти различия помогают объяснить тот факт, что при старении в головном мозге крыс и мышей не образуются амилоидные бляшки, которые являются основным гистопатологическим признаком БА.

3.3.2. Влияние фосфорилирования остатка серина в положении восемь металлсвязывающего домена Ар человека на его взаимодействие с ионами цинка

Недавно в сенильных бляшках головного мозга трансгенных мышей и пациентов, страдавших БА, была обнаружена новая ПТМ Ар - фосфорилирование остатка Ser8 (Kumar et al., 2011). Такая модификация ускоряет процесс образования токсичных агрегатов Ар. Механизм образования агрегатов фосфорилированным по остатку Ser8 Ар (рАр) оставался неизвестным. Поскольку Ser8 расположен в минимальном цинк-связывающем сайте Ар - фрагменте 6-14, то агрегационные свойства рАр могут быть также связаны с изменением характера взаимодействия пептида с ионами цинка. В данной работе для определения влияния фосфорилирования по остатку Ser8 на связывание Ар с ионами цинка было проанализировано взаимодействие Zn2+ с металлсвязывающим доменом рАр - рАР( 1-16).

Двухфазная форма изотермы связывания рАр(1-16) с ионами цинка в экспериментах ИКТ

говорит о наличии более чем одного сайта связывания Zn2+ (рис. 7). Действительно, эта изотерма

может быть описана с помощью модели двух независимых сайтов связывания (табл. 4, рис. 7).

Термодинамические параметры связывания

Время, мин Zn2' с обоими сайтами указывают на то, что

оба процесса являются только энтропийно

выгодными (табл. 4). Этот факт существенным

образом отличает связывание Zn2+ пептидом

рАр(1-16) от АР(1-16) и свидетельствует о

значительном уменьшении площади

гидрофобных поверхностей, экспонируемых в

раствор, при формировании комплекса Zn2+ с

фосфорилированной формой, что, в свою

очередь, говорит о более компактной

структуре этого комплекса. Стехиометрия

связывания Zn2+ с высокоаффинным сайтом

рАР(1-16) близка к 1, в то время как

стехиометрия связывания Zn2+ с

низкоаффинным сайтом равна 0,5 (табл. 4), что

указывает на образование димера. Таким

Рисунок 7. Кривая титрования рАР(1-16) образом, образуется комплекс из двух молекул

ионами цинка (верхняя панель), полученная рАр(1_16) и трсх ионов цш1ка где один ион методом ИКТ, и изотерма связывания (нижняя

панель), рассчитанная из кривой титрования, цинка взаимодействует с двумя молекулами

Измерения проводились при 25°С в 20 мМ пептида а даа других иона цинка связываются PIPES буфере в присутствии 160 мМ NaCl, рН

7 3 в двух других аналогичных сайтах. На масс-

I 0.50

А

2 4 6

[Zn2+l/[pAP( 1-16)1

спектрах, полученных с помощью ЭС-МС, также наблюдается днмер рАР( 1-16) с тремя ионами цинка, в то время как в отсутствии ионов цинка димеры рА(5( 1-16) не были обнаружены.

Для локализации сайтов связывания ионов цинка с рАР(1-16) в экспериментах ИКТ был использован набор его фрагментов и мутантов, содержащих замену потенциального хелатора Zn2+ на остаток аланина. Параметры связывания Zn2+ с пептидами рАр(1-16) с защищенным и не защищенным N-концом практически совпадают, что говорит о том, что N-конец не задействован в связывании Zn2+ (табл. 4). Тот факт, что фрагмент Ар(11-14) служит интерфейсом цинк-зависимой димеризации АР(1-16), позволил сделать предположение о том, что этот же сайт участвует в димеризации рАр(1-16). Действительно, сокращение рАр(1-16) на шесть аминокислотных остатков с С-конца (рАР( 1-16)—>рАР( 1-10)) приводит к исчезновению сайта связывания Zn2+ со стехиометрией 0,5. а фрагмент Ар(11-16). напротив, формирует димеры при титровании Zn2+. Потенциальными хелаторами Zn2+ в N-концевой части рАР(1-16) являются остатки Aspl, Glu3, His6. Asp7 и pSer8. Данные ИКТ показывают, что при замене остатков Aspl, Glu3 и Asp7 на Ala термодинамические параметры связывания Zn2+ меняются незначительно, следовательно, эти остатки не принимают участия в его координации. В то же время, процесс титрования фрагментов рАр(1-10)Н6А и рАР(7-9) ионами Zn2+ не сопровождался выделением тепла. Эти данные показывают, что His6 и pSer8 необходимы для координации Zn2+ и что фрагмент рАр(6-8) формирует второй цинк-связывающий сайт рАр( 1-16).

Таблица 4. Термодинамические параметры связывания ионов цинка с фрагментами и мутантами рАр(1-16), полученные с помощью ИКТ при 25°С в 20 мМ PIPES буфере в присутствии 160 мМ NaCl, рН 7,3

Пептид К "> M-'xlO"4 лн,"> ккалхМ"1 TAS, ккалхМ"1

рАР(1-16) 1,2 4,08 1 7,2

0,5 0,14 * 13 17,2

рАР(1-16)откр* 1,2 3,3 1 7,1

0,5 0,4* 15 19,5

рАР(1-10) 1,2 0,16 5,3 9,7

АР(11-16) 0,5 3,11* -0,4 6,6

pAp(l-10)DlA 1 0,12 5,7 9,8

рАР(1-10)ЕЗА 1 0,16 5,9 10,1

рАр(1-10)Н6А связывания нет

pAP(l-10)D7A 1,3 0,2 4.4 8,6

рАР(7-9) связывания нет

а> стехиометрия взаимодействия 7п2+:пептид; б> стандартное отклонение не превьплало 20%; в> стандартное отклонение не превышало 10%;г> вследствие димеризации пептида, размерность К„ выражена в М""; * - пептид не несет защиту на Ы-конце

Сайты координации Хп2* во фрагментах рАР(1-10) и АР(11-16) были подтверждены с помощью ЯМР. Эксперименты по титрованию рАр(1-10) раствором цинка показали, что увеличение концентрации цинка влияет на химические сдвиги сигналов боковых цепей только

16

А

Н6Н&2 D7HN

Мб HN | S8HN ||

___ п_п„ ¥ п.Ж Пп11

-U ц --'И Ц»Ц U « «41

двух остатков - His6 и Ser8 (рис. 8А). Имидазольное кольцо His6 и фосфатная группа Ser8 предоставляют три из четырех координационных связей для Zn2+. В роли четвертого хелатора может выступать карбонильная группа основной цепи остатков His6 или Asp7. Изменения химических сдвигов амидных протонов His6 и Asp7 указывают на участие карбонильных атомов кислорода в координации Zn2+. Эксперименты по титрованию фрагмента Ар( 11-16) раствором цинка позволили установить, что остатки Glull и His 14 координируют Zn2+. поскольку цинк-индуцируемое изменение химических сдвигов для этих двух остатков наиболее значительно (рис. 8Б). Наблюдаемые изменения резонансов остатка Vall2 отражают конформационные изменения при связывании с Zn2+. В экспериментах по методу Джоба для фрагментов рАр(1-10) и Ар(11-16) установлено, что стехиометрия взаимодействия пептид-цинк составила 1:1 и 2:1, соответственно, что согласуется с данными ИКТ. Полученные данные подтверждают, что в результате взаимодействия с Zn2+ образуется димер. в котором фрагмент "EVHHQK16 взаимодействует с ионом металла.

Для моделирования цинк-связывающего сайта f'HDpS8 был применен КМ/ММ подход и построены модели двух способов координации цинка в этом сайте. В первом случае (рис. 9А) фосфатная группа предоставляет два кислорода для координации цинка, в роли третьего хелатора выступает NS атом боковой цепи остатка His6, а четвертым является карбонильный кислород основной цепи остатка Asp7. Во втором случае (рис. 9Б) все участники координации остаются теми же, за исключением карбонильного кислорода остатка Asp7, который заменен на карбонильный кислород основной цепи остатка His6. Квантовые расчёты показали, что энергия системы для двух исследованных способов координации близка. Представляется весьма вероятным

Индивидуальные сигналы

Рисунок 8. Химические сдвиги (Д5) сигналов 0,5 мМ рАр(ЫО) (А) и 0,5 мМ АР(11-16) (В), обусловленные присутствием десятикратного

избытка Zn2+.

Рисунок 9. Способы координации Zn2+ (зеленая сфера) остатками pSer8, Asp7 и His6 рАР(1-16), полученные с помощью КМ/ММ оптимизации геометрии с использованием программного пакета GROMACS/CPMD (пояснения в тексте).

существование двух указанных форм в растворе, что согласуется с данными ЯМР

Итак, фосфорилирование остатка Ser8 приводит к значительным информационным изменениям в металл-связывающем домене Ар и образованию нового сайта связывания иона цинка - 6HDpS8, в котором ион цинка координируется имидазольным кольцом остатка His6, фосфатной группой остатка Ser8 и карбонильной группой основной цепи остатков His6 или Asp7. В пептиде рАр(1-16) фрагмент "EVHH14 формирует интерфейс димеризации, в котором ион цинка координируется остатками Glull и Hisl4 двух пептидных субъединиц, также как и в немодифицированной форме АР(1-16). Фосфорилированный Ар обнаруживается в нейронах трансгенных мышей уже на ранних стадиях БА, а позднее детектируется и в амилоидных бляшках (Kumar et al„ 2013). Полученные в рамках диссертационной работы результаты, указывающие на смещение равновесия в сторону образования димеров при фосфорилировании Ser8 Ар. помогают ; объяснить тот факт, что рАр детектируется в нейронах в основном в форме димеров и олигомеров, j в то время как Ар обнаруживается в мономерной форме.

3.3.3. Влияние мутации остатка гистидина в положении шесть металлсвязывающего домена Ар человека на его взаимодействие с ионами цинка

В металлсвязьгаающем домене Ар выявлен целый ряд мутаций, приводящих к развитию

ранней формы БА. Наибольший интерес представляет «английская» наследственная мутация Ар - j

замена остатка His6 на Arg (Janssen et al., 2003),

поскольку она непосредственно затрагивает остаток (

His6, входящий в состав минимального цинк-

связывающего сайта Ар (остатки 6-14). Наличие этой

мутации приводит к повышению нейротоксичности

соответствующих олигомеров Ар (Ono et al., 2011) и !

увеличению скорости сборки амилоидных фибрилл

(Hon et al., 2007). Однако, влияние ионов цинка на

процесс агрегации Ар, содержащего такую замену, не

изучалось ранее. В рамках диссертационной работы

охарактеризовано взаимодействие ионов цинка с АР(1- j

16), включающим мутацию H6R (Ap(l-16)H6R). j

Способность Ap(l-16)H6R образовывать

олигомеры в присутствии ионов цинка была проверена

с помощью БППР. Для этого осуществлялась

изотерма связывания, рассчитанная из регистрация взаимодействия между растворённым и кривой титрования (нижняя панель).

Измерения проводились при 25°С в 50 иммобилизованным на оптическом чипе пептидом

мМ Трис буфере, рН 7,3. Ap(l-16)H6R в присутствии и отсутствии ионов цинка.

Время, мин

[Zn2+J/[AP(1-16)H6R]

Рисунок 10. Кривая титрования АР(1-16)H6R ионами цинка (верхняя панель), полученная методом ИКТ, и

Установлено, что для образования олигомеров Aß(l-16)H6R необходимы ионы цинка.

Стехиометрия связывания Zn2+ с Aß(l-16)H6R, установленная методом ИКТ (рис. 10), свидетельствует о формировании комплекса, где две молекулы пептида взаимодействуют с одним ионом цинка, в то время как Aß(l-16) в тех же условиях образует мономерный комплекс (табл. 1). Этот процесс может быть описан следующей системой уравнений, где Р обозначает пептид Aß(l-16)H6R:

Zn + P«Zn-P (1)

te.

P + Zn-PWP-Zn-P (2)

Константа ассоциации суммарного процесса составляет Ka=KixK¿= 0,24* 104 М'2. Процесс связывания Aß(l-16)H6R с Zn2+ - энтальпийно выгодный. Отрицательное значение энтропийного компонента может объясняться сокращением гидрофильной поверхности при димеризации. Термодинамические параметры связывания Aß(l-16)H6R с защищенной и с открытой N-концевой аминогруппой не отличаются, что говорит о неучастии N-конца Aß(l-16)H6R в хелатировашш Zn2+.

Образование димеров Zn(Aß(l-16)H6R)2 в растворе бьшо подтверждено в экспериментах ЯМР. В спектрах ЯРМ наблюдалось типичное для исследованных изоформ Aß(l-16) уширение сигналов при добавлении Zn2+. Однако, в отличие от других описанных изоформ, взаимодействие Aß(l-16)H6R с Zn2+ приводит к появлению дополнительного набора резонансных сигналов. Например, появляется новый сигнал для протона метальной группы остатка Val 12, который принадлежит димеру Zn(Aß(l-16)H6R)2. В экспериментах по методу Джоба наблюдение изменения интенсивности сигнала остатка Vall2 на 0,23 м.д. позволило установить стехиометрию взаимодействия пептид-цинк, равную 2:1, а наблюдение изменения химических сдвигов Hei остатков Hisl3 и Hisl4 говорит о формировании комплекса со стехиометрией 1:1. Таким образом, в растворе в присутствии Zn2+ в равновесии существуют мономерная и димерная формы Aß(l-16)H6R. Повышение концентрации пептида Aß(l-16)H6R приводит к увеличению интенсивности сигналов, принадлежащих димерной форме.

Изменения химических сдвигов в ЯМР спектрах при титровании ионами цинка было использовано для определения сайтов связывания металла в комплексах Zn2+ с Aß(l-16)H6R В связывание иона цинка фрагментом Aß(l-16)H6R в мономерном комплексе вовлечены остатки Glull, Hisl3 и Hisl4. Однако, в отличие от Aß(l-16) дикого типа, в формировании этого комплекса не участвует остаток His6, вследствие его замены на остаток Arg. Наиболее вероятными хелаторами цинка в комплексе Zn(Aß( l-16)H6R)i являются остатки Glull и Hisl4 двух взаимодействующих пептидных цепей, как и в димере Aß(l-16) дикого типа.

Итак, можно заключить, что замена остатка His6 на Arg в молекуле Aß(l-16) способствует

его цинк-зависимой димеризации, а, следовательно, и димеризации полноразмерной молекулы Aß.

19

Эти данные помогают объяснить механизм патогенного влияния «английской» мутации: склонность к димеризации AP(1-16)H6R может приводить к усилению олигомеризации Ар и, соответственно, к ускорению развития БА.

3.3.4. Влияние изомеризации остатка аспарагиновой кислоты в положении семь Ар человека на его нейротоксические свойства

Самой распространенной ПТМ Ар, выделенной из амилоидных бляшек, является изомеризация остатка Asp7 (Roher et al., 1993). Изомеризация Asp7 вносит существенный вклад в нейродегенеративные процессы, сопровождающие БА (Shimizu et al., 2000). Ранее, в работах нашей лаборатории было установлено, что изомеризация Asp7 усиливает цинк-зависимую димеризацию Ар(1-16) (Tsvetkov et al., 2008) и что внутривенное введение АР(1-42), содержащего изомеризованный Asp7 (isoAP(l-42)), существенно ускоряет процесс образования амилоидных í бляшек у трансгенных мышей, тогда как введение Ар( 1-42) не влияет на этот процесс (Kozin et al., 2013). Для определения нейротоксических свойств isoAp(l-42) в диссертационной работе было ¡ проведено сравнение токсического действия isoAP(l-42) и АР(1-42) на нейрональные клетки человека NSC-hTERT.

Установлено, что как АР(1-42), так и isoAP(l-42) индуцируют гибель нейрональных клеток NSC-hTERT и разрушение образованной ими нейронной сети, причем токсический эффект isoAp(l-42) выражен сильнее. Для выявления различий в нейротоксических свойствах АР(1-42) и isoAp(l-42) было исследовано влияние различных концентраций данных пептидов на ano птоз и некроз нейрональных клеток человека через 48 ч инкубации (рис. 11). Доля гибнущих клеток

относительно контрольной популяции в присутствии 10 и 15мкМ isoAP(l-42) возрастает на 37% и 61%, соответственно. В присутствии 10 и 15мкМ Ар(1-42) доля гибнущих клеток возрастает лишь на 11% и 32%, соответственно. В случае isoAP(l-42) гибель клеток в 75% случаев обусловлена индукцией

апоптоза, в то время как для АР(1-42) только половина клеток гибнет по пути апоптоза, а остальная часть

[Пептид], мкМ

[Пептид], мкМ

Рисунок 11. Влияние различных концентраций пептидов Ар(1-42) (квадраты) и воАр(1-42) (круги) на долю апоптических (А) и гибнущих (Б) клеток в популяции нейрональных клеток человека ИЗС-МТЖТ после инкубирования в течение 48 ч. Доля апоптических и гибнущих клеток выражена в процентах от общего числа клеток в каждом варианте. К гибнущим клеткам относили клетки, находящиеся в апоптозе и некрозе.

клеток гибнет по пути некроза (рис. 11). Таким образом, токсическое действие ¡5оА[5( 1 -42) на нейрональные клетки не только более эффективно, но и более специфично, чем действие АР(1-42).

Далее, было оценено состояние митохондрий и уровень внутриклеточного глутатиона в клетках с неповрежденной цитоплазматической мембраной, обработанных 10 мкМ пептидов (рис. 12). Апоптотический эффект обоих пептидов ассоциирован с понижением митохондриального потенциала клеток, что свидетельствует о запуске апоптоза по митохондриальному пути (рис. 12А). Действие пептидов на нейрональные клетки приводит к понижению уровня внутриклеточного глутатиона (рис. 12Б), являющегося основным регулятором редокс статуса клеток и активным участником их антиоксидантной защитной системы. Истощение внутриклеточного глутатиона также является одной из причин гибели клеток.

Рисунок 12. Влияние АР(1-42) и 15оАР(1-42) на падение митохондриального мембранного потенциала (А) и уровень внутриклеточного глутатиона (Б) в клетках ЫЗС-ЬТЕЯТ после 48 ч инкубации с 10 мкМ пептидов.

Нейротоксическое действие Ар(1-42) может быть обусловлено нарушением целостности мембран клеток вследствие образования фибрилл или запуском сигнальных каскадов вследствие связывания пептида с определенными рецепторами или компонентами клеточной мембраны. В наших экспериментальных условиях гибель нейрональных клеток человека под действием ьоАр(1-42) происходила не за счет нарушения целостности мембраны, а за счет индукции апоптоза (рис. 11А). При этом 15оАр(1-42) оказывает значительно большее токсическое действие на нейрональные клетки человека, чем АР(1-42). Можно предположить, что ¿зоАР( 1-42) индуцирует гибель клеток посредством связывания со специфическими компонентами на их поверхности, в частности, ацетилхолиновыми рецепторами (Рагп е1 а1., 2010). Согласно данным, полученным в настоящей работе, механизм развития патологического процесса БА может включать непосредственное нейротоксическое действие воАР(1-42) на клетки человека.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Молекулярный механизм цинк-зависимой димеризации металлсвязывающего домена Ар человека и его патогенных модификаций

В растворе в присутствии ионов цинка устанавливается равновесие между мономерным и димерным комплексами металлсвязывающего домена Ар с Zn смещенное в сторону ■ мономерной формы. В диссертационной работе было показано, что при образовании мономерного комплекса с АР(1-16) ион цинка распознается и захватывается участком 11-14 Ар, а затем боковая цепь остатка His6 приближается к координационной сфере цинка и замыкает ее, что приводит к < завершению формирования комплекса (рис. 13А). Далее, было установлено, что этот же участок 11-14 формирует интерфейс димеризации АР(1-16). Таким образом, можно было предположить, что «выключение» остатка His6 из хелатирования Zn2+ в мономерном комплексе будет приводить j к смещению равновесия в сторону образования димеров АР(1-16). Действительно, в работе показано, что в случае «английской» наследственной мутации Ар такое «выключение» происходит в результате замены остатка His6 на Arg. В фосфорилированном по остатку Ser8 Ар(1-16) остаток His6 задействован в формировании нового цинк-связывающего центра вместе с pSer8 и теряет возможность замкнуть координационную сферу Zn2+ Это приводит к тому, что сферу замыкает участок 11-14 другой молекулы Ар(1-16), в результате чего образуются димеры (рис. 13Б). Склонность к димеризации нейротоксичной формы АР(1-42), содержащей изомеризованный остаток Asp7, также может быть связана с удалением остатка His6 от координационной сферы цинка в результате удлинения основной белковой цепи на СНг-группу.

Природная форма АР

W"

И Г Hii'

■ dull

Выключение His6 Ар в результате: • фосфорилирования по Ser8

Рисунок 13. Схема образования мономерного комплекса Zn2+ с Ар(1-16) (А) и цинк-индуцируемой димеризации Ар(1-16) (Б) в результате «выключения» Швб. Пептиды обозначены синим, ионы цинка - оранжевым, аминокислотные остатки, связанные с ионом цинка - зеленым, «выключение» Н¡$6 обозначено красным (пояснения в тексте).

22

Начальный этап формирования амилоидных фибрилл из полноразмерных молекул Ар включает процесс взаимодействия их металлсвязывающих доменов, за которым следует сближение и агрегация гидрофобных участков Ар(17-42) (Miller et al„ 2010). Исходя из этого, описанный механизм цинк-зависимой димеризации АР(1-16) и его патогенных форм справедлив и для полноразмерных молекул Ар. Таким образом, в результате анализа взаимодействия Zn2+ с АР(1-16) человека и с его модифицированными формами в работе был установлен молекулярный механизм цинк-зависимой димеризации Ар - начального этапа его олигомеризации. Полученные данные подчеркивают важное значение взаимодействия Zn2+ с металлсвязывающим доменом Ар как молекулярного процесса, лежащего в основе развития БА.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что в мономерном комплексе металлсвязывающего домена 1-16 р-амилоида человека (Ар(1-16)) с Zn2+ фрагмент 6-14 формирует минимальный цинк-связывающий центр, в котором ион цинка координируется остатками His6, dull, Hisl3 и Hisl4, а участок 11-14 представляет собой первичный сайт узнавания Zn2+. Этот же участок является сайтом цинк-зависимой димеризации Ар(1-16).

2. Обнаружено, что Ар(1-16) крысы образует цинк-индуцированные димеры, структурная организация которых отличается от димеров Ар(1-16) человека. В димерах АР(1-16) крысы Zn2+ координируется остатками His6 и Hisl4 двух субьединиц, взаимное расположение которых препятствует формированию амилоидных фибрилл.

3. Показано, что исключение остатка His6 из координационной среды Zn2+ вследствие патогенных модификаций в АР(1-16) человека, таких как фосфорилирование остатка Ser8 и «английская» наследственная His6Arg мутация, усиливает его цинк-зависимую димеризацию.

4. Обнаружено, что изомеризация Asp7 приводит к значительному усилению токсического действия полноразмерного Ар(1-42) на нейрональные стволовые клетки человека NSC-hTERT. Нейротоксический эффект этой модификации обусловлен индукцией апоптоза.

5. Установлен молекулярный механизм цинк-зависимой димеризации металлсвязывающего домена АР человека и его модифицированных патогенных форм. Показано, что димеризация всех исследованных форм АР(1-16) человека осуществляется через фрагмент 11-14. Полученные результаты свидетельствуют о том, что фрагмент 11-14 р-амилоида представляет потенциальную лекарственную мишень, блокирование которой будет препятствовать его патогенной димеризации и развитию БА.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Tsvetkov Р. О., Kulikova A. A., Golovin А. V., Tkachev Y. V., Archakov A. I., Kozin S. A., Makarov A. A. Minimal Zn(2+) binding site of amyloid-p // Biophysical Journal. - 2010. - T. 99, № 10. - C. L84-L86.

2. Kozin S. A., Mezentsev Y. V., Kulikova A. A., Indeykina M. I., Golovin A. V., Ivanov A. S., Tsvetkov P. O., Makarov A. A. Zinc-induced dimerization ofthe amyloid-p metal-binding domain 1-16 is mediated by residues 11-14 // Molecular BioSystems.-2011.-T. 7,№4.-C. 1053-1055.

3. Шелковникова Т. А., Куликова А. А., Цветков Ф. О., Peters О., Бачурин С. О., Бухман В. Л., Нинкина Н. Н. Протеинопатии — формы нейродегенеративных заболеваний, в основе которых лежит патологическая агрегация белков // Молекулярная биология. - 2012. - Т. 46, № 3. - С. 402415.

4. Istrate A. N., Tsvetkov Р. О., Mantsyzov А. В., Kulikova A. A., Kozin S. A., Makarov А. А., Polshakov V. I. NMR solution structure of rat AP(1-16): toward understanding the mechanism of rats' resistance to Alzheimer's disease //Biophysical Journal.-2012.-T. 102,№ l.-C. 136-143.

5. Mitkevich V. A., Petrushanko I. Y., Yegorov Y. E., Simonenko О. V., Vishnyakova K. S., Kulikova A. A., Tsvetkov P. O., Makarov A. A., Kozin S. A. Isomerization of Asp7 leads to increased toxic effect of amyloid-p42 on human neuronal cells // Cell Death & Disease. - 2013. - T. 4. - C. e939.

6. Kulikova A. A., Tsvetkov P. O., Indeykina M. I., Popov I. A., Zhokhov S. S., Golovin A. V., Polshakov V. I., Kozin S. A., Nudler E., Makarov A. A Phosphorylation of Ser8 promotes zinc-induced dimerization of the amyloid-p metal-binding domain // Molecular BioSystems. - 2014. - T. 10, № 10. -C. 2590-2596.

7. Kozin S. A., Kulikova A. A., Istrate A. N., Tsvetkov P. O., Zhokhov S. S., Mezentsev Y. V., Kechko

0. I., Ivanov A. S., Polshakov V. I., Makarov A. A. The English (H6R) familial Alzheimer's disease mutation facilitates zinc-induced dimerization of the amyloid-p metal-binding domain // Metallomics. -2015. № 7. — C. 422—425.

8. Suprun E. V., Zaryanov N. V., Radko S. P., Kulikova A. A., Kozin S. A., Makarov A. A., Archakov A. I., Shumyantseva V. V. Tyrosine Based Electrochemical Analysis of Amyloid-p Fragment (1-16) Binding to Metal(II) Ions // Electrochimica Acta. - 2015. http://dx.doi.org/10.1016/j.electacta.2015.01.066.

9. Куликова А. А., Макаров А. А., Козин С. А. Роль ионов цинка и структурного полиморфизма р-амилоида в инициации болезни Альцгеймера // Молекулярная биология. - 2015. - Т. 49, № 2. - С. 249-263.

Тезисы конференций

1. Куликова А. А., Цветков Ф. О., Головин А. В., Ткачев Я. В., Арчаков А. И., Козин С. А., Макаров А. А. Минимальный цинк-связывающий сайт бета-амилоида // Тезисы докладов и стендовых сообщений XXIII зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 7-10 февраля 2011. - 2011. - С. 6.

2. Куликова А. А. Роль структурных детерминант р-амилоида в молекулярном механизме болезни Альцгеймера // Тезисы докладов XIX Международной научной конференция студентов аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2012», Москва, 9-13 апреля 2012.-2012. - С. 51.

24

3. Куликова А. А., Цветков Ф. О., Козин С. А., Макаров А. А. Роль участка 11-14 металл-связывающего домена бета-амилоида в патогенезе болезни Альцгеймера // Сборник тезисов XVI Международной Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 16-21 апреля 2012.-2012.-С. 122.

4. Istrate А. N.. Tsvetkov Р. О., Mantsyzov А. В., Kulikova A. A., Kozin S. A., Makarov А. А., Polshakov V. I. Solution structure of rat Ap(l-16) and the mechanism of rats' resístanse to Alzheimer's disease // The proceedings of XXVth International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems, Lyon, France, 19-24 August, 2012. - 2012. - C. 230.

5. Kulikova A. A., Tsvetkov P. O., Kozin S. A., Makarov A. A. Minimal Zn(2+) binding site of amyloid-P and the role of residues 11-14 in the process of zinc-induced dimerization of its metal-binding domain // Proceedings of the XVIIth Conference of the International Society for Biological Calorimetry, Leipzig, Germany, 3-6 June, 2012. - 2012. - C. 1432.

6. Kulikova A. A., Istrate A. N. NMR solution structure of rat p-amyloid metal-binding domain: new insights into the mechanisms of rats' resistance to Alzheimer's disease // FEBS Journal 38th FEBS Congress, St. Peterburg, 6- 11 July, 2013. -2013.-T. 280(S1). -C. 418.

7. Istrate A. N.. Zhokhov S. A„ Kulikova A. A., Tsvetkov P. O., Kozin S. A., Makarov A. A., Polshakov V. I. NMR solution structure of the English mutant of the p-amyloid peptide metal binding domain Ap(l-16)H6R and its impact on Ap oligomerization // The proceedings of International Conference EUROMAR-2014,29 June - 3 July, 2014, Zurich, Swetserland. - 2014. - C. 280.

8. Kulikova A. A., Kozin S. A., Makarov A. A., Tsvetkov P. O. Phosphorylation of Ser8 promotes zinc-induced dimerization of amyloid-p metal-binding domain // FEBS Journal FEBS EMBO 2014 Conference, Paris, France, 30 August - 4 September, 2014. -2014.-T. 281(S1). -C. 246-247.

9. Kozin S. A., Tsvetkov P. O., Kulikova A. A., Indeikina M. I., Mezentsev Y. V., Istrate A. N., Popov I. A., Ivanov A. S., Polshakov V. I., Makarov A. A. Zinc-induced dimers of chemically modified Ap are possible aggregation seeds II Alzheimer's & Dementia: The Journal of the Alzheimer's Association. Alzheimer's Association International Conference, Denmark, Copenhagen, 12 - 16 July, 2014. - 2014. -T. 10,№4.-C. 793.

10. Kozin S. A., Kulikova A. A., Petrushanko I.Y., Polshakov V. I., Makarov A. A. The metal-binding domain 1-16 of Abeta comprising isomerized aspartate 7 is the minimal aggregation seed // Neurodegenerative Diseases 12й1 International Conference on Alzheimer's and Parkinson's diseases and Related Neurological Disorders, France, Nice, 18-22 March, 2015. - 2015. - T. 15. - C. 359.

Патент

Козин С. А., Петрушанко И. Ю., Симоненко О. В., Митькевич В. А., Куликова А. А., Егоров Е. Е., Вишнякова X. С., Цветков Ф. О., Макаров А. А. Патент № 2544957 на изобретение «Способ создания клеточных моделей болезни Альцгеймера». Опубликовано: 20.03.2015 Бюл. № 8.

Подписано в печать 24.04.2015 г. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 100 Экз. Заказ № 5705-4-15 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39