Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование нейропротекторных свойств фуллеренов С60 на модели болезни Альцгеймера у крыс

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование нейропротекторных свойств фуллеренов С60 на модели болезни Альцгеймера у крыс"

005043307

На правах рукописи

Макарова Екатерина Григорьевна

ИССЛЕДОВАНИЕ НЕЙРОПРОТЕКТОРНЫХ СВОЙСТВ ФУЛЛЕРЕНОВ С60 НА МОДЕЛИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА

У КРЫС

03.03.01 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 '/ МАЙ 2012

Пущино-2012

О с

005043307

Работа выполнена в лаборатории системной организации нейронов им. О.С. Виноградовой Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук и Путинском Государственном естественно-научном институте, г. Пущино.

Научный руководитель: кандидат медицинских наук,

Подольский Игорь Яковлевич

Научный консультант доктор биологических наук,

Гордон Рита Яковлевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Полетаева Инга Игоревна (в.н.с. кафедры ВНД биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, г. Москва)

кандидат биологических наук, Гудков Сергей Владимирович (с.н.с. лаборатории изотопных исследований ИТЭБ РАН, г.Пущино)

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии Российской академии наук, Москва.

Защита состоится «31?» М& 9 2012 г. в I*? на заседании

совета Д 002.093.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН в ИТЭБ РАН, г. Пущино.

Автореферат диссертации разослан « 2 & » 2012 г.

Ученый секретарь ///?//>

диссертационного совета, ЛанинаН.Ф.

к.ф.-м.н. '

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Болезнь Альцгеймера (БА) - наиболее распространенное нейродегенеративное заболевание людей пожилого и старческого возраста, которое характеризуется прогрессивным нарушением памяти и деменцией. Одним из ключевых факторов в патогенезе БА являются бета-амилоидные пептиды (Aß) 39-43, которые образуются в результате последовательного внутримембранного амилоидогенного протеолиза белка предшественника бета-амилоида Р" и у- секретазами. В норме тоже образуются эти пептидные фрагменты, однако при патологии их концентрация сильно возрастает, они начинают полимеризоваться и приобретают токсические свойства. Нейротоксическое действие растворимых олигомеров Aß и их фибрилл приводит к гибели синапсов и нейронов в гиппокампе и неокортексе (Haass and Selkoe, 2007; Selkoe, 2008; Citron, 2010).

Существенный вклад в патогенез ранних стадий БА вносит окислительный стресс, индуцированный Aß (Kaminsky et al., 2010; Степаничев и Гуляева, 2010; Nunomura et al., 2001), основной мишенью которого являются компоненты белкового синтеза (мРНК, рибосомы, тРНК и хроматин) (Shan et al., 2007; Ding et al., 2007).

Одним из ранних симптомов БА является прогрессирующее нарушение оперативной и эпизодической памяти, в том числе пространственной памяти (Burgess et al., 2001; Lindeboom and Weinstein, 2004). На моделях БА широко применяется изучение пространственной памяти в водном лабиринте Морриса с использованием разнообразных протоколов обучения (Morris, 2001; Chen et al. 2000; D'Hooge and De Deyn, 2001; Bast et al., 2009; Подольский и Щеглов, 2004; Podolski et al., 2007).

Ни одна из современных экспериментальных моделей БА не является универсальной. Введение в центральную нервную систему (в желудочки мозга, непосредственно в гиппокамп или в кору) агрегированного бета-амилоидного пептида или его токсического фрагмента Др25-з5 позволяет исследовать непосредственно его действие на морфофункциональное состояние нейронов и когнитивные процессы (Selkoe, 2008; Stepanichev et al., 2000). Исследование ранних нейротоксических эффектов центрального введения Aß играет важную роль в понимании патогенеза БА и представляет большой интерес для изучения антиамилоидного действия лекарственных средств (Fiala, 2007; Haass and Selkoe, 2007; Makarova et al., 2011; Podolski et al., 2010; Nie et al., 2010).

Лечение БА - наиболее сложная проблема психиатрии и неврологии. Несмотря на интенсивные исследования многих ведущих лабораторий мира лекарства, тормозящие развитие или вызывающие долговременные ремиссии БА отсутствуют. Новым направлением в разработке лекарств для лечения БА являются фуллерены С60. Международные фармацевтические компании, С Sixty and Merck Co., начали разработку на основе фуллеренов антиоксидантов и лекарств для терапии болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных заболеваний (Small times magazine, 2007). Одними из наиболее перспективных являются подходы, нацеленные на создание антиамилоидных лекарственных

веществ, предупреждающих образование и агрегацию Ар (Citron, 2010; Scherzer-Attali et al., 2010). Однако фуллеренам не уделялось внимание в этих исследованиях.

Фуллерены С6о - углеродные наночастицы с уникальными физико-химическими и биологическими свойствами. Одним из основных биологических свойств Сбо является способность присоединять реактивные формы кислорода и вести себя как «губка свободных радикалов» (Krusic et al., 1991; Piotrovsky and Kiselev, 2006; Andrievsky et al., 2009; АН et al., 2008). В ряде работ показано, что фуллерены накапливаются в печени, селезенке и других органах экспериментальных животных (Yamago et al, 1995; Bullard-Dillard et al, 1996; Kubota et al, 2011). Фуллерены могут выводиться из организма (Yamago et al, 1995; Gharbi et al., 2005). Фуллерены действуют на разнообразные клеточные и молекулярные мишени (Piotrovsky and Kiselev, 2006; Dugan et al., 1997; Huang et al., 2000).

Флуоресцентный анализ in vitro показал, что производное фуллерена эффективно снижает агрегацию Армо. Авторы объяснили такой эффект связыванием фуллереном центрального гидрофобного мотива Ар KLVFF (Kim and Lee, 2003). Недавно методом высокоразрешающей электронной микроскопии было показано, что фуллерены С6о способны предотвращать агрегацию и разрушать Af^s и АрМ2 фибриллы (Подлубная и др., 2006; Podolski et al., 2007; Бобылев и др., 2010; Bobylev et al., 2011). Эти данные позволили нам предположить, что Ар пептиды представляют собой одну из мишеней для фуллерена (Podolski et al., 2010). Однако не было известно, будут ли фуллерены защищать нейроны от токсического действия Ар in vivo.

Таким образом, многие принципиальные вопросы остаются открытыми. Действие фуллеренов Сбо на экспериментальных моделях БА in vivo не были изучены. Особый интерес представляет исследование действия фуллеренов на амилоидогенез, нейродегенерацию, синтез белка в нейронах и состояние пространственной памяти на ранних стадиях действия Ар.

Цели и задачи исследования

Целью работы являлось исследование способности водорастворимого фуллерена С6о предупреждать нейротоксичность бета-амилоида in vivo.

Задачи исследования:

1. Исследовать влияние предварительного введения C6oHyFn на пространственную память при случайном положении цели в водном лабиринте Морриса, морфологическое состояние пирамидных нейронов поля CAI гиппокампа и синтез белка в этих нейронах, нарушенные на ранней стадии после интравентрикулярного введения агрегированного АР25-35 у крыс.

2. Исследовать влияние предварительной инкубации переживающих срезов гиппокампа в среде, содержащей CwHyFn, на морфологическое состояние пирамидных нейронов поля CAI гиппокампа, нарушенное ИНКубаЦИеЙ С А[?25-35-

3. Исследовать влияние предварительного введения C6oHyFn на морфологическое состояние пирамидных нейронов поля CAI гиппокампа и

синтез белка в этих нейронах, нарушенные на ранней стадии после интрагиппокампальной микроинъекции Ар25-з5.

4. Исследовать влияние предварительного введения C60HyFn на пространственное обучение и память, нарушенные в результате интрагиппокампальной микроинъекции Армг-

Научная новизна

Впервые обнаружено, что предварительное введение водорастворимого фуллерена С6о в гиппокамп предупреждает сильные нарушения пространственной памяти, развитие нейродегенерации, образование депозитов Ар и нарушение синтеза белка пирамидных нейронов гиппокампа, вызванные интрагиппокампальной микроинъекцией агрегированного Ар.

Показана разная динамика нарушения синтеза белка, морфологических изменений, образования депозитов А(3 в пирамидных нейронах поля CAI гиппокампа и нарушения пространственной памяти после интравентрикулярной и интрагиппокампальной микроинъекций агрегированного Ар. Продемонстрировано, что интрагиппокампальное введение АР приводит к более раннему развитию выраженных нейродегенеративных и когнитивных нарушений, чем интравентрикулярное введение.

Научно-практическая значимость работы

Полученные результаты показали, что С60 гидратированный фуллерен (C6oHyFn) предупреждает нарушение пространственной памяти, развитие нейродегенерации и нарушение синтеза белка пирамидных нейронов гиппокампа, вызванные интрагиппокампальной микроинъекцией Ар. Эти результаты подтверждают заключение нашей группы, что водорастворимые фуллерены Сбо представляют чрезвычайный интерес для разработки эффективной профилактики и терапии БА.

Показано преимущество интрагиппокампальной микроинъекции Ар для исследования ранних цитологических нарушений в гиппокампе и нарушения когнитивных функций по сравнению с интравентрикулярным введением.

Обнаружено, что нарушение синтеза белка пирамидных нейронов гиппокампа, вызванное интрагиппокампальной микроинъекцией Ар, происходит гораздо раньше проявления других нейротоксических свойств Ар и, по-видимому, связано с развитием окислительного стресса.

Материалы диссертационной работы вошли в учебный видеофильм «Нейрон и Память», ред. Ф.А. Филиппов, A.M. Черноризов. Министерство образования и науки России, Тюмень-Москва, 2009. http://www.eurasion.ru/

Апробация диссертации

Основные положения диссертации доложены на 7-ом и 8-ом Международных симпозиумах «Фуллерены и Атомные кластеры» (Санкт-Петербург, 2005, 2007), конференциях по программе Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» (Москва, 2006, 2007, 2010).

Международном симпозиуме «Гиппокамп и память» (Пущино, 2006), Всероссийской конференции с международным участием «Гиппокамп и память: норма и патология (Пущино, 2009), 37-ом Neuroscience Meeting, (Сан-Диего, Калифорния, 2007), б-ом Международном Форуме FENS Forum of European Neuroscience (Женева, Швейцария, 2008), III и VII Международных и Междисциплинарных Конгрессах «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Украина, 2007, 2011), Всеукраинской конференции «Актуальные проблемы современной биохимии и клеточной биологии» (Днепропетровск, 2008), Международном форуме «Rusnanotech» (Москва, 2010), 9-ой Международной конференции AD/PD «Alzheimer's and Parkinson's Diseases: Advances, Concepts and New Challenges» (Прага, Чехия, 2009), 1-ой Международной научной школе «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах» (Москва, 2009), 10-ой международной Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2006).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 26 печатных работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на ÜZ страницах, иллюстрирована рисунками и _L_ таблицами. Список литературы включает £7_fисточников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объесты и методы исследований

Животные

Исследование выполнено на 204 взрослых (3 месяца) и 25 старых (20 месяцев) самцах крыс Вистар, выращенных в питомнике Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН и содержащихся в стандартных условиях при свободном доступе к пище и воде, с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕС).

Вещества и способы введения

Ар25-35, Aß|-42 или Aß35_25 (Sigma, USA) растворяли в стерильной воде в концентрации 1,6 нмоль/мкл, 0,4 нмоль/мкл и 1,6 нмоль/мкл соответственно и инкубировали в течение 24 часов при температуре 37°С. Формирование фибриллярных агрегатов подтверждали визуально методом электронной микроскопии (х50000) в лаборатории «Структуры и функций мышечных белков». Высоко стабильный водный коллоидный раствор фуллерена CüoHyFn был получен в Институте физиологически активных соединений по методу Г.В. Андриевского в концентрации 0,46 нмоль/мкл. В соответствии с эти методом

фуллерен был перенесен из органического растворителя в водную фазу при помощи обработки ультразвуком без использования солюбилизаторов и стабилизаторов. Растворы С6оНуРп, в зависимости от концентрации, содержат как единичные молекулы СбоНуРп, так и их лабильные кластеры размером 3-72 нм. Ультрафиолетовый спектр препарата приведен на рисунке 1. Препарат сохраняет стабильность в течение нескольких лет (Апёпеуэку е! а1., 1995).

В качестве контроля использовали 0,9%-ый раствор №С1 и нетоксичный пептид Арз5.25.

МО5 2т

1,5

0,5

Рисунок 1. Ультрафиолетовый спектр СбоНуРп - типичный спектр фуллерена Обо в воде (коллоидные растворы) (Апсігіеубку е( а1., 2002).

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 >.,нм

Операции осуществляли в стереотаксическом аппарате в стерильных условиях под комбинированным наркозом. Вещества вводили однократно билатерально по следующим координатам: поле CAI дорзального гиппокампа, АР = -4 мм; L = ± 3 мм; Н = 3 мм или боковые желудочки мозга, АР = -0,8 мм; L = ±1,5 мм; Н = 3 мм (Paxinos and Watson, 1982). C6oHyFn вводили за два часа до введения АР в тех же концентрациях. Для гистологических исследований декапитация проводилась на 14-ый, 30-ый или 45-ый день после интравентрикулярного введения и на 2-ой, 7-ой и 14-ый день после интрагиппокампального введения. Локализация мест инъекций веществ осуществлялась на 40 мкм парафиновых срезах гиппокампа, окрашенных крезиловым фиолетовым.

Изучение пространственной памяти начинали на 14-ый, 30-ый или 45-ый день после интравентрикулярного введения и на 14-ый день после интрагиппокампального введения.

Переживающие срезы

Эксперименты выполнены на гиппокампальных срезах толщиной 300 мкм от 18 животных. Введение веществ в перфузионную среду осуществлялось в следующих экспериментах: (1) Контроль, в перфузионную среду вещества не вводились, п=6; (2) А(]25-з5 в концентрации 2 х Ю М (Chen et al., 2000), n=6; (3) C6oHyFn в концентрации 10"7 M до введения АР25-35» п—6. Длительность перфузии каждого вещества составляла 20 минут.

Приготовление образцов ткани

После декапитации часть мозга фиксировали в фиксаторе Карнуа (этанол - хлороформ - уксусная кислота 6:3:1 соответственно), другую часть мозга фиксировали в 4% параформальдегиде на PBS, рН 7,4 и заключали в парафин.

Фронтальные срезы толщиной 7 мкм использовали для световой и флуоресцентной микроскопии. Все морфологические исследования проводились на пирамидных клетках поля CAI дорзального гиппокампа, поскольку они составляют основную массу нейронов поля CAI (Monje et al., 2000).

Исследование состояния рРНК

Для исследования состояния рРНК в цитоплазме нейронов был использован метод окрашивания акридиновым оранжевым (АО) (Fluka Chemia AG, Buchs, Switzerland) в условиях оптимального взаимодействия красителя с РНК. После депарафинирования и регидратации срезы промывали в цитратно-фосфатном буфере в течение 4 минут, окрашивали АО в концентрации 3 х 10'4 М в цитратно-фосфатном буфере, pH 4,2 в течение 10 минут по методике, описанной ранее (Gordon et al., 1997). Измерения проводились на микроспектрофлуориметре ДМФ-2 (Пущино, Россия) (Карнаухов, 2001). Флуоресценция измерялась только в цитоплазме с помощью зондов диаметром 6,5 мкм и объектива х85. Измерения и обработка данных проводились с использованием программного обеспечения Microfluor (Пущино, Россия).

Для анализа цитоплазмы использовался коэффициент К„=(/640)/(/530), представляющий собой отношение интенсивностей красной и зеленой флуоресценции при окрашивании АО. Мономеры АО образуют комплексы с двунитевыми участками РНК, которые флуоресцируют в области 530 нм (/530), а димеры АО связываются с однотяжевыми участками РНК и флуоресцируют в области 640 нм (7640). Ранее было показано, что К^ отражает состояние рРНК в рибосомах и коррелирует с долей активно функционирующих рибосом (полирибосом) по отношению к неактивным моносомам, что позволяет оценить интенсивность белкового синтеза. (Gordon et al., 1997). Измерения проводили в отдельной клетке, исследовали по 100 пирамидных клеток поля CAI гиппокампа каждой крысы.

Световая микроскопия и иммуногистохимия

Дегенерацию нейронов выявляли окрашиванием срезов 0,25% крезиловым фиолетовым (Fluka, USA) (по Нисслю). Иммуногистохимическое исследование было выполнено по стандартной процедуре (Gong et al., 2005; Nie et al., 2010). Срезы инкубировали с первичными кроличьими поликлональные антителами: анти - Aßi.« (1:1000, Sigma, USA) при температуре +4° в течение 15 часов. Затем срезы инкубировали с вторичными козьими биотинилироваными анти-кроличьими антителами (1:800, Sigma, USA) в течение 1,5 часов при температуре +37° и стрептавидин/пероксидазным комплексом (1:800, Sigma, USA) в течение 1,5 часов при температуре +37°. Иммуногистохимическую реакцию визуализировали 0,06% раствором 3,3'-диаминобензидина (Sigma, USA). В качестве негативного контроля первичные антитела заменяли буфером.

Для количественного анализа проводили подсчет морфологически интактных пирамидных клеток поля CAI гиппокампа для срезов, окрашенных крезиловым фиолетовым и пирамидных клеток поля CAI, содержащих в цитоплазме депозиты Aßi.42, для иммуногистохимии. Критерием отбора являлись морфологически интактные нейроны поля CAI со следующими

характеристиками: равномерно окрашенная цитоплазма и нуклеоплазма, четкая плазматическая и ядерная мембраны, хорошо определяемое ядрышко. Подсчет нейронов выполняли с использованием микрофотографий (25-30 от каждого животного) полученных с помощью цифровой камеры, соединенной с микроскопом Axio Imager Mloptical (Zeiss, Germany) (объектив x40) и программного обеспечения Image J 1.44 (USA) на площади 200x50 мкм (0,01 мм2).

Исследование пространственной памяти в водном лабиринте Морриса

Водный лабиринт Морриса представлял собой круглый бассейн диаметром 140 см, высотой 50 см, заполненный на 30 см непрозрачной водой (t=21±l°C). В тесте на пространственное обучение с одной пробы внелабиринтными ориентирами служили две лампы по 40 Вт, расположенные в противоположных концах комнаты. В нашей модификации метода бассейн был разделен на 8 виртуальных секторов и кольца Т (зона тигмотаксиса - от греч. thigma — прикосновение и taxis — расположение - виртуальная зона в районе бортиков бассейна), С, В, А, что позволяло более детально анализировать траекторию движения животного. Остальные детали методики были такими же, как в стандартном тесте Морриса (Morris, 1984).

Установка состояла из водного бассейна, персонального компьютера, видеокамеры, установленной над бассейном и подключенной к компьютеру, и оригинальной программы A.A. Деева, которая фиксировала крысу и строила траекторию движения в каждой пробе. Табличные результаты анализа включали длину пройденного пути, среднюю скорость движения, время решения задачи, а также время пребывания в каждом секторе и кольце.

Крысу помещали в воду вблизи стенки бассейна в один из восьми виртуальных секторов. Пространственное обучение тестировалось с использованием двух протоколов обучения.

Вероятностная задача

Пространственное обучение тестировалось с помощью нового когнитивного теста (Подольский и Щеглов 2004; Щеглов и др., 2003; Podolski et al., 2007; Mugantseva and Podolski, 2009). Животные должны были запомнить пространство в виде кольца, в котором локализация цели изменялась псевдослучайным образом. Каждый сеанс навигационного обучения состоял из 4 проб. Продолжительность пробы была 120 с. Через 60 с крысу удаляли с платформы и через 2-3 с помещали в воду. Каждый последующий сеанс повторялся через 24 часа после предыдущего. Через 24 ч после последнего сеанса обучения проводили тест на сохранение пространственной информации. Тест на сохранение информации состоял в следующем: платформу убирали из бассейна и регистрировали траекторию движения крысы в течение 60 с. Тест на сохранение считался положительным, если время пребывания животного в заданном пространстве, статистически значимо превышало случайное значение времени в заданном кольце (Steele and Morris, 1999; Bast et al., 2009).

Тест на пространственное обучение с одной пробы

Стилом и Моррисом был разработан тест на оперативную пространственную память Delayed Matching-to-Place (DMP): в первой пробе

каждого сеанса положение платформы изменялось случайным образом и не изменялось в последующих пробах. Интервал между сеансами составлял 24 часа. Длительность пробы была равна двум минутам. Каждый сеанс навигационного обучения состоял из 4 проб. На платформе крыса находилась 30 секунд. Поскольку во второй пробе теста DMP время решения задачи сокращалось в несколько раз, авторы теста сделали заключение о том, что пространственное обучение происходит с первой пробы (Steele and Morris, 1999). На трансгенных моделях болезни Альцгеймера было показано нарушение оперативной памяти в этом тесте (Chen et al., 2000).

Мы модифицировали протокол DMP: увеличили длительность пробы с двух до пяти минут и ввели семи дневные перерывы между сеансами обучения. При двух минутной длительности пробы, крысы часто не могли находить платформу в первой пробе, и экспериментатор направлял их к платформе. По нашему мнению представляется очень существенным изучить поиск платформы без участия экспериментатора. Введение перерывов с нашей точки зрения позволяет параллельно изучать эпизодическую и пространственную память.

Продолжительность обучения составляла пять сеансов. Положение платформы в первой пробе третьего, четвертого и пятого сеансов менялось случайным образом, так же как в тесте DMP. Интервал между пробами составлял 10 минут. Через 1,5 и 48 ч после второго, третьего, четвертого и пятого сеансов проверяли сохранение пространственной информации по методике, описанной ранее.

Эксперименты по изучению пространственного обучения с одной пробы начинались через 14 дней после интрагиппокампального введения на пяти группах животных: (1) введение 0,9% NaCl (первый контроль); (2) введение нетоксичного Aß35.25 (второй контроль); (3) введение C6oHyFn; (4) введение AßM2; (5) введение C60HyFn за 2 часа до введения введение AßM2-

В качестве стандартного критерия обучения использовали время решения задачи (латентный период) и проводили описание траектории движения крысы в каждом сеансе.

Статистический анализ

Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Достоверность различий средних значений оценивалась по t-критерию Стыодента. Изменения считались статистически значимыми при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияния предварительного введения C60HyFn на пространственную память при случайном положении цели в водном лабиринте Морриса, морфологическое состояние пирамидных нейронов поля CAI гиппокампа и синтез белка в этих нейронах у взрослых и старых крыс на ранней стадии после интравентрикулярного введения Арг5_з5.

Согласно литературным данным введение Aß в латеральные желудочки мозга вызывало гибель нейронов в поле CAI, окислительный стресс и нарушение пространственной памяти (Nitta et al., 1994; Delobette et al., 1997; Stepanichev et al., 2004; Степаничев и др., 2004; Степаничев и Гуляева, 2010).

В тестах с использованием стандартного протокола Морриса во многих случаях не были выявлены нарушения пространственной памяти при центральном введении Aß и на трансгенных моделях БА (Chen et al., 2000; Harkany et al., 1998, Morris, 2001). Поэтому первая задача, которую мы поставили, было применение модели пространственной памяти при случайном положении цели, разработанной в нашей группе (Подольский и Щеглов 2004; Щеглов и др., 2003; Podolski et al., 2007; Mugantseva and Podolski, 2009).

1.1. Влияния предварительного введения C6oHyFn на пространственную память при случайном положении цели в водном лабиринте Морриса у взрослых и старых крыс на ранней стадии действия Aß25.35.

Для исследования ранних токсических свойств бета-амилоида животным в боковые желудочки мозга вводили Aß2s-35 в концентрации 22,5 нмоль/ 15 мкл. В контроле вводили 0,9% NaCl.

Исследование пространственной памяти проводили в водном лабиринте Мориса в новом когнитивном тесте при случайном положении цели на следующих группах животных: взрослые крысы Вистар через 14 дней (контроль, п = 8; введение Ар25-35, п = 10), взрослые крысы Вистар через 30 дней (контроль, п = 10; введение Aß25-35, группа необучившихся крыс, п = 16; введение Aß25-35, группа обучившихся крыс, п = 13), старые крысы Вистар через 45 дней (контроль, п = 7; введение Aß25-3s. группа необучившихся крыс, п = 9; введение Aß25.35, группа обучившихся крыс, п = 6).

В новом когнитивном тесте применялся протокол обучения, в котором местоположение платформы менялось псевдослучайным образом в каждой пробе, при этом платформа всегда располагалась на равном расстоянии от стенок бассейна. Поэтому животному необходимо было запомнить пространство в виде кольца и расстояние от бортиков.

В контроле все группы животных обучились в новом когнитивном тесте. В тесте на сохранение памяти происходило сохранение пространственной информации. Крысы Вистар через 14 дней после интравентрикулярного введения Aß25.35 достоверно обучились только в четвертом сеансе, во втором и третьем сеансах обучались гораздо медленнее контроля (рис. 2, А). В тесте на сохранение памяти нарушений не происходило (рис. 2, Б).

Через 30 дней после интравентрикулярного введения Aß25.35 наблюдались индивидуальные различия при обучении крыс Вистар в четвертом сеансе: 55% крыс Вистар обучились, а у 45% животных никаких нарушений не происходило (рис. 2, А). При этом в тесте на сохранение нарушения не наблюдались (рис. 2, Б).

Старые крысы Вистар (20 месяцев) обучались в пяти сеансах, длительность пробы составляла 60 с. Через 45 дней после интравентрикулярного введения Aß25.35 у старых крыс Вистар также наблюдались индивидуальные различия: у 60 % животных наблюдались грубые нарушения пространственной памяти, достоверные различия с контролем в третьем, четвертом и пятом сеансах (р < 0,05), а у 40% никаких нарушений не происходило (рис. 2, А). Однако нарушение сохранения информации

происходило, и у обучившихся и у необучившихся крыс (достоверные различия с контролем, р < 0,05) (рис. 2, Б).

А

— 0,9% NaCI

-о- А(325-35' обучившиеся крысы

■О— АР25-35" необучившиеся крысы

О 40

1 2 3 , 14 дней

J

взрослые крысы

старые крысы

взрослые крысы

45 дней старые крысы

Рисунок 2. А. Кривые обучение крыс Вистар в новом когнитивном тесте при случайном положении цели через разные сроки после интравентрикулярного введения веществ. *— значимые различия между контролем (введение 0,9% №С1) и опытом (введение АР25-35), Р < 0,05. Б. Сохранение пространственной информации в тесте без платформы. *- значимые различия между контролем (введение 0,9% №С1) и опытом (введение АР25-35), р < 0,05. Пунктирной линией отмечено случайное значение времени в заданном кольце.

14 дней, 30 дней и 45 дней обозначают время начало поведенческих опытов после интравентрикулярного введения АР25-35 или 0,9% ЫаС1 (контроль).

Применение теста на пространственную память при случайном положении цели не показало однозначных результатов и не позволило получить ясные результаты по влияние действия фуллеренов на нарушения, вызванные Ар.

1.2. Влияния предварительного введения C6oHyFn на морфологическое состояние пирамидных нейронов поля CAI гиппокампа и синтез белка в этих нейронах у взрослых и старых крыс на ранней стадии после интравентрикулярного введения Ар25.з5

Морфологические и гистохимические исследования проводились через 14, 30 и 45 дней на тех же группах животных после интравентрикулярного введения АР в той же концентрации, что и в предыдущем разделе.

Основную часть гиппокампальных CAI нейронов составляют пирамидные клетки (Monje et al., 2000). Показано, что пирамидные клетки поля CAI гиппокампа являются наиболее чувствительными к действию А(325-з5 (Stepanichev et al., 2000; Nie et al., 2010).

В контроле в нейронах, окрашенных крезиловым фиолетовым, выявлялась равномерно окрашенная цитоплазма и нуклеоплазма, четкая плазматическая и ядерная мембраны, хорошо определяемое ядрышко (рис. 3, А, Б).

А. ■ ' 7 . ш 50 мкм Б

В* * ■ Г ' * .» 50 мкм г . • * " ' f¿ мкм

Рисунок 3. Микрофотографии гиппокампа (поле CAI), окрашенного крезиловым фиолетовым, А, Б - контроль (интактная крыса), В, Г - через 30 дней после микроинъекции Ар25-з5 (22,5 нмоль/ 15 мкл) в латеральные желудочки мозга.

Через 14 и 30 дней после введения А(325-з5 морфологическая структура большинства пирамидных нейронов, окрашенных крезиловым фиолетовым, не отличалась от контроля на протяжении всего поля CAI, редко встречались темные и дегенеративные клетки у всех групп животных (рис. 3, В, Г). Это согласуется с литературными данными, в которых показано, что существенная гибель нейронов гиппокампа возникает примерно через три месяца после введения АР25.35 в латеральные желудочки мозга (Степаничев и др., 2004; Stepanichev et al., 2004) и сохраняется по меньшей мере в течении шести месяцев после инъекции (Stepanichev et al., 2000). Количественный анализ не

ВЫЯВИЛ ОТЛИЧИЙ ЧИСЛа МОрфОЛОГИЧеСКИ ИНТаКТНЫХ КЛеТОК ПОСЛе ВВедеНИЯ Ар25-35

от контроля (0,9% NaCl). У старых животных через 45 дней после введения АР25-35 происходило значительное снижение числа морфологически интактных клеток на 37% по сравнению с контролем (р < 0,05), в результате появления в основной массе клеток поля CAI нейродегенеративных признаков: разбухших клеток с выраженной вакуолизацией цитоплазмы.

Однако при окрашивании АО через 14 и 30 дней после введения Ap2s-3s, было выявлено значительное снижение значения Ка, в пирамидных нейронах у всех животных (рис. 4). Ранее было показано, что Ка является индикатором

интенсивности белкового синтеза и коррелирует с долей транслирующих полирибосом (Gordon et al., 1997). Введение 0,9% NaCl не вызывало изменений Ка, его значение не отличалось от интактного контроля.

Рисунок 4. Изменение величины коэффициента

^пср^е^кошроль (где конгроль

- интакгное животное), коррелирующего с изменением интенсивности белкового синтеза в пирамидных нейронах поля CAI гиппокампа после билатеральной микроинъекции Afo.35 в боковые желудочки мозга (22,5 нмоль/ 15 мкл). *- значимые различия между контролем (введение 0,9% NaCl) и экспериментом (введение АР25-35), р < 0,05. Исследования проводились на 100 клетках от каждого животного (п=9, в каждой группе животных, где п -количество животных).

Таким образом, после интравентрикулярного введения Ар25-з5 снижение белоксинтезирующей активности наблюдалось, и у взрослых и старых крыс Вистар. При этом у старых крыс происходило снижение количества морфологических интактных клеток в поле CAI. Нарушение пространственной памяти было обнаружено только у 60% старых крыс Вистар (20 месяцев).

В наших предварительных исследованиях было показано, что однократная интравентрикулярная микроинъекция C6oHyFn предупреждала нарушение пространственной памяти (Podolski et al., 2007), снижение синтеза белка (Makarova et al., 2009) у отдельных животных. Такой результат мог быть связан с тем, что интравентрикулярное введение Ар не вызывало постоянных нарушений памяти и морфологических изменений и в этом смысле было неподходящей моделью БА для исследования действия фуллерена.

2. Влияния предварительной инкубации переживающих срезов гиппокампа в среде, содержащей C6oHyFn, на морфологическое состояние пирамидных нейронов поля CAI гиппокампа, нарушенное инкубацией с

Ар2Ы5.

Интравентрикулярная инъекция АР25-35 не привела к однозначным результатам. Чтобы исследовать прямое действие АР25-35 и действие предварительной инкубации с C60HyFn, предшествующее инкубации с Ар25_з5 на пирамидные нейроны поля CAI, была использована модель переживающих срезов гиппокампа.

При инкубации переживающих срезов в среде Кребса-Рингера (контроль) не происходило гибели клеток (рис. 5, А, Б). Инкубация переживающих срезов в среде, содержащей Ар25_з5, уже через 20 минут приводила к выраженной дегенерации пирамидных клеток поля CAI (рис. 5, В, Г), количество

12

■ 0,9% NaCl аА(325-35

ш

i14 дней 30 дней^| ^45 дней)

Y Y

взрослые крысы старые крысы

морфологически интактных клеток снижалось на 73% (р < 0,05) (рис. 6). Предварительная инкубация переживающих срезов в среде с C60HyFn предупреждала развитие нарушений (рис. 5, Д, Е), число пирамидных нейронов поля CAI сохранялось на уровне контроля (рис. 6).

Рисунок 5. Микрофотографии пирамидных нейронов дорзального гнппокампа (поле CAI), окрашенного крезиловым фиолетовым, после инкубации в течение 20 минут в контроле (А, Б) и в среде с АР25-35 (2x10"7 М) (В, Г), и предварительной инкубацией с Cf,oHyFn (10"? М) с последующим добавлением в среду AP2J-35 (Д, В).

■ 0,9% NaCI □ Ар25-35

UCeoHyFn* А|3 25-35

Рисунок 6. Количественный подсчет числа морфологически интактных клеток дорзального гиппокампа крыс (поле CAI) в контроле (п=6), после инкубации с АР25.35 (2x10"7 М) (п=6) и после предварительной инкубации с CsoHyFn (10"7 М) с последующим добавлением в среду АР25.35 (п=6). *- значимые различия между контролем (введение 0,9% NaCI) и экспериментом (введение АР25-35), р < 0,05.

3. Влияния предварительного введения QoHyFn на морфологическое состояние пирамидных нейронов поля CAI гиппокампа и синтез белка в этих нейронах у взрослых крыс на ранней стадии после интрагиппокампальной микроинъекции Ар25-35- I

Предварительная инкубация переживающих срезов в среде с C60HyFn предупреждала нейродегенерацию клеток поля CAI. Для исследования влияния предварительного введения CüoHyFn на синтез белка и морфологическое состояние пирамидных нейронов поля CAI гиппокампа in vivo, осуществляли микроинъекцию АР25-35 (1,6 нмоль/ 1 мкл) и QoHyFn (0,46 нмоль/ 1 мкл), предшествующую микроинъекции АР25-35 в поле CAI дорзального гиппокампа j и проводили морфологическое исследование пирамидных нейронов поля CAI гиппокампа на 2, 7 и 14 день.

На 2-ой день после введения АР2505- во всех пирамидных нейронах поля CAI наблюдалось значительное снижение величины Ка (55% от значения в контроле) в морфологически интактных клетках (р < 0,05). Аналогичное явление имело место и на 14-й день после интравентрикулярного введения. Подчеркнем, что CíoHyFn, предшествующий введению АР25.35, не вызывал изменений величины Ка (рис. 7). Ранее было показано, что Ка является индикатором интенсивности белкового синтеза и коррелирует с долей транслирующих полирибосом (Gordon et al., 1997). Методом электронной микроскопии после интравентрикулярной инъекции Ар (Gordon et al., 2012), а также на культуре нейронов показано (Shan et al., 2007), что преобладание тяжелых полирибосом является причиной снижения белоксинтезирующей активности в исследуемых клетках.

Количественный анализ не выявил отличий числа морфологически интактных клеток на 2-ой день после введения АР25-35 или C60HyFn, предшествующий введению Ар25-з5 от контроля (0,9% NaCl) (рис. 8).

Рисунок 7. Значение коэффициента КажЯри«МуКаШНір№) (где котроль . I

интакгное животное) коррелирующего с j изменением интенсивности белкового синтеза в пирамидных нейронах поля CAI гиппокампа в контроле (п=6, где п -количество животных), после интрагиппокампальной микроинъекции АР25.35 (1,6 нмоль/ 1 мкл) (п=6) и после микроинъекции CaiHyFn (0,46 нмоль/ 1 МКЛ, предшествующей введению Ар25-35 (п=6). *— значимые различия между контролем (введение 0,9% NaCl) и 1 экспериментом (введение АР25-35), р < 0,05. Исследования проводились на 100 клетках от каждого животного.

На ранних стадиях развития БА больший вклад в повреждение нейронов вносит окислительный стресс (Nunomura et al.; 2001; Ding et al., 2007; Shan et al., 2007; Su et al., 2008). Белковый синтез является одним из ранних клеточных процессов, наиболее уязвимых к окислительным повреждениям при БА (Ding et

14

■ 0,9% NaCl

□ АР25.35

C6oHyFn»A(3 25.35

2 день 14 день

а1. , 2007; вЬап е! а!., 2007). Показано, что окислительный стресс индуцирует повышенной уровень экспрессии р- и у- секретаз, как следствие образование эндогенного А(3 и сильную нейродегенерацию (Топ£ е1 а1., 2005; Тата§по е1 а1., 2005, 2008; ви е1 а1., 2008). Основываясь на этих данных, мы предполагаем, что причиной снижения синтеза белка на первые дни после инъекции Ар является окислительный стресс. Отсутствие изменений в белковом синтезе в случае инъекции СбоНуРп, предшествующей Ар, можно объяснить его антиоксидантным действием.

40

35

к

5 30

о

о"

25

о

20

о

h- 0 15

у

s 1 10

■ 0,9% NaCI

О A¡3.

■ C6oHyFn«Ap25.35

25-35

2 день

14 день

Рисунок 8. Количественный подсчет числа морфологически интактных клеток дорзального гиппокампа крыс (поле CAI) в контроле (п=6), после интрагиппокампальной микроинъекции AP2J-33 (1,6 нмоль/ 1 мкл) (п=6) и после предварительной микроиньекции Cf,oHyFn (0,46 нмоль/ 1 мкл), предшествующей введению АР25-35- *- значимые различия между контролем (введение 0,9% NaCI) и экспериментом (введение АР25-35), Р < 0.05.

Через 14 дней после введения в гиппокамп АР25-35 на протяжении всего поля CAI наблюдались многочисленные расплывчатые, нечеткие, а также полностью разрушенные клетки, значительное набухание и вакуолизация цитоплазмы, что является морфологическими признаками некроза (рис. 9, В, Г), в отличие от контроля (рис. 9, А, Б). Количественный анализ показал значительное снижение на 78% числа морфологически интактных нейронов после однократной интрагиппокампальной микроинъекции АР25.35 по сравнению с контролем (р < 0,05) (рис. 8). Микроинъекция C60HyFn, предшествующая введению Ар, предупреждала массовую нейродегенерацию пирамидных клеток поля CAI (рис. 9, Д, Е), число морфологически интактных нейронов было на уровне контроля (рис. 8). Величина Ка составила 148% от контроля, р < 0,05 (рис. 7). Значительное увеличение Ка в некротических клетках поля CAI через 14 дней после введения АР25-35 является результатом деградации рРНК, а не увеличения белкового синтеза. Окрашивание АО в этом случае было неспецифическим, отражая степень деструкции рибосом, и как следствие повышение доступности рРНК к АО. При интрагиппокампальном введении C60HyFn, предшествующем введению АР, величина Ка оставалась на уровне контроля (рис. 7).

Иммуногистохимическое исследование выявило присутствие диффузных депозитов Ар в цитоплазме всех пирамидных нейронов поля CAI на 14 день. В контроле депозиты Ар отсутствовали (рис. 10). Накопление Ар в нейронах может происходить, как в результате проникновения экзогенного Ар,

вследствие повреждения клеточной мембраны, так и в результате формирования эндогенного А(3 (КієшєШієу Ы а!., 2007; №е & а!., 2010). Однако в данной работе в цитоплазме нейронов накапливается, по-видимому, эндогенный А(3, поскольку животным был введен А25-35, а в цитоплазме депозиты Ар идентифицировались антителами к АРмг-

Рисунок 9. Микрофотографии поля СА1 крысы, окрашенного крезнловым фиолетовым после введения в гиппокамп А, Б - контроль; В, Г - АР25-35 (1,6 нмоль/ 1 мкл); Д, Е - CcoHyFn (0,46 нмоль/ 1 мкл) с дальнейшим введением АРг5-з5-

После введения C60HyFn, предшествующего введению АР25-35. не наблюдалось нарушений в большей части пирамидных клеток (рис. 9, Г, Д, Е), иммуноокрашивание наблюдалось только в 17% клеток по сравнению с введением АР25.35 (рис. 10). После введения 0,9% раствора NaCl или C60HyFn не наблюдалось отличий от контрольного уровня.

АР приводит к развитию окислительного стресса на ранних стадиях БА (Nunomura et al. , 2001; Ding et al., 2007; Shan et al., 2007; Su et al., 2008). Ha поздних стадиях накопление депозитов Ар приводит к выраженной нейродегенерации (Su et. al., 2008). Методом трансмиссионной электронной микроскопии впервые была показана способность C60HyFn предотвращать формирование фибрилл Ар и разрушать сформированные фибриллы in vitro (Подлубная и др., 2006; Podolski et al, 2007; Бобылев и др., 2010; Bobylev et al., 2011). Отсутствие выраженной нейродегенерации и отложений Ар,

16

наблюдаемое в случае предварительной инъекции СбоНуРп, по-видимому, связано с антиамилоидным действием водорастворимых фуллеренов.

40 35

(N

! 30

О

о"

^25

О

ш

ё 20

0

Ш

и 15

О) т

1 10

0-L

OAß2S-35

■ C60HyFn+Aß25.35

Рисунок 10. Количественный подсчет числа нейронов дорзального гиппокампа крыс (поле CAI), содержащих в цитоплазме депозиты AP|.42. В контроле депозиты отсутствуют (п=6), после интрагиппокампальной микроинъекции АР25-35 (1,6 нмоль/ 1 мкл) (п=6) и после предварительной микроинъекции C6oHyFn (0,46 нмоль/ 1 мкл), предшествующей введению АР25.35. *-значимые различия между введением CüoHyFn, предшествующем введению АР25-35 и введением АР25-35, Р < 0,05.

Антиамилоидное действие in vitro и in vivo оказывают химически немодифицированные фуллерены, поэтому мы предполагаем, что фуллереновый каркас обладает сильным антиамилоидным действием.

4. Влияние предварительного введения C60HyFn на пространственное обучение и память у взрослых крыс на ранней стадии после интрагиппокампальной микроинъекции Aßt.42.

Мы модифицировали протокол Delayed Matching-to-Place (DMP) (Steele and Morris, 1999), позволяющий исследовать оперативное пространственное обучение с одной пробы. Была увеличена длительность пробы с двух до пяти минут и введены семидневные перерывы между сеансами обучения. При двух минутной длительности пробы, крысы часто не могли находить платформу в первой пробе, и экспериментатор направлял их к платформе. Мы считаем существенным изучение поиска платформы без помощи экспериментатора. Введение перерывов по нашему мнению позволяет параллельно изучать эпизодическую и пространственную память.

Продолжительность обучения составляла пять сеансов. Положение платформы в первой пробе третьего, четвертого и пятого сеансов менялось случайным образом, так же как в тесте DMP. Через 1,5 и 48 ч после второго, третьего, четвертого и пятого сеансов проверяли сохранение пространственной информации (подробности см. в методике).

В группе с интрагиппокампальным введением физиологического раствора в первой пробе первого сеанса крысы находили платформу в среднем за 180 с. Во второй пробе время решения задачи уменьшилось в 9 раз и незначительно снизилось при дальнейшем повторении проб первого и второго сеансов (рис. 11, А, рис. 12, А). Таким образом, после введения физиологического раствора наблюдалось пространственное обучение с одной пробы. В первых пробах третьего, четвертого и пятого сеансов, в которых

положение платформы менялось случайным образом, крысы быстро находили платформу, почти за такое же время как во второй пробе первого сеанса (рис. 11, А, рис. 12, А). Исследование сохранения пространственной информации в тесте без платформы показало, что после каждого сеанса обучения информация сохранялась как в оперативной (1,5 ч) так и в долговременной (48 ч) памяти (рис. 12, Б).

После введения нетоксического пептида АРз5.25 крысы достоверно обучились только ко второй пробе второго сеанса. В первых пробах третьего, четвертого и пятого сеансов крысы быстро находили платформу, положение которой не было заранее известно (рис. 12, А). Таким образом, различия между контролем с введением физиологического раствора и нетоксического Ар15_25 были не существенны. Также как и в предыдущей группе оперативная и долговременная пространственная информация сохранялись после каждого сеанса обучения (рис. 12, Б).

Результаты наших опытов совпадают с результатами группы Р. Морриса о том, что пространственное обучение может быть очень быстрым, после одной пробы. Более того, в наших опытах в заданном кольце бассейна крысы находили скрытую цель, вероятность локализации которой составляла 0,125 в течение нескольких секунд. В группе после интрагиппокампального введения А(Зм2 в первой пробе первого сеанса крысы находили платформу в среднем за 220 с, гораздо медленнее чем в контроле. В первом и втором сеансах обучение происходило значительно хуже, чем контроля (р < 0,05) (рис. 12, А, В). На рис. 11, Б показан пример траектории движения крысы после интрагиппокампального введения ЛРм2-' животное долгое время не находило платформу, у него был резко выражен тигмотаксис, особенно в первой и второй пробах. Тем ни менее, при последующих пробах происходило обучение, но в несколько раз хуже, чем в контроле (рис. 11, А, Б, рис. 12, А, В). Обучение с одной пробы было нарушено только в четвертом сеансе (рис. 11, А, рис. 12, В). Сохранение оперативной памяти было нарушено в третьем и пятом сеансах, а долговременной пространственной информации во всех сеансах (рис. 12, Г). Таким образом, через 14, 21, 30 и 45 дней после однократного интрагиппокампального введения АРмг У всех крыс наблюдалось более медленное пространственное обучение, чем в контроле. Сохранение долговременной информации после каждого сеанса было нарушено.

Интересно, что в контроле в первых пробах третьего, четвертого и пятого сеансов, в которых положение платформы было случайным, крысы быстро решали задачу в течение 20 - 40 с (рис. 11, А, рис. 12, А). Это позволяет сделать заключение, что крысы помнили повторения сеансов, несмотря на длительные временные интервалы между ними. Способность крыс запоминать информацию о повторении сеансов обучения, мы рассматриваем как характеристику эпизодической памяти. После введения АР1.42 крысы решали задачу за 120-160 с, то есть в несколько раз медленнее, чем в последней пробе предыдущего сеанса по сравнению с контролем (рис. 11, А, Б, рис. 12, А, В). Этот результат показывает, что интрагиппокампальное введение АРмг нарушает эпизодическую память. Интересно, что в отличие от эпизодической памяти, обучение с одной пробы было нарушено только в одном (четвертом) сеансе.

А Б В

Рисунок 11. Примеры формирования пространственной памяти в водном лабиринте Морриса. Показана траектория движения крысы и время решения задачи. А - в контроле (введение 0,9% №С1); Б - после введения в гиппокамп Арм2 (1,6 нмоль/ 1 мкл); В - после введения в гиппокамп СбоНуЕп (0,46 нмоль/1мкл) с дальнейшим введением АР1-42.

| 200 • 1 *

| 160 • II

3 120 - V

| 80 ■ о

І 40

iii iv

*

i

^"фчьад

в

iii iv

I *

\ ц*

V т 1 *

123-45678123412341234 пробы 012345678123412341234 пробы

" АР 35-25

-СбоНуРп + АРМ2

1 час 48 часов 1 час 48 часов 1 час 48 часов 1 час 48 часов ■ 0.9 %ЫаС1 0*035-25

1 час 48 часов 1 час 48 часов 1 час 48 часов 1 час 48 часов ■ СИН уРп +ЛРМ2 □ А(5,_,2

Рисунок 12. А, В, Обучение крыс Вистар в пяти сеансах по четыре пробы в стандартном водном лабиринте Морриса. А, Б - ЫаС1, п=7, Арз5_25, п=9; В, Г - СбоНуРп + Арі^г, п=13, АРм2, п=12. В 1 и 2 сеансах положение платформы одинаковое. В последующих сеансах положение платформы меняется. *- разница между соответствующими пробами после введения ЫаС1 и АР35.25 (р < 0,05) (А); *- значимые различия между соответствующими пробами после введения СбоНуРп + АР и АРиг (Р < 0,05) (Б).

Б, Г. Сохранение пространственной информации через 1,5 (кратковременная память) и 48 (долговременная память) часов после обучения. Пунктирной линией отмечено случайное значение времени в заданном кольце. *- значимые различия между соответствующими пробами после введения СбоНуРп + Армг и Армг (р < 0,05) (Г).

Ранее впервые было показано, что введение аддукта фулдерена С60 с поливинилпирралидоном (С60/ПВП) в гиппокамп предупреждало нарушение пространственной памяти, вызванное блокадой синтеза белка (Podolski et al., 2002, 2004). Позднее было показано, что карбоксифуллерен С63(С(СООН)2)з, действуя как антиоксидант, улучшал пространственную память у старых мышей (Quick et al., 2008). В нашей группе были получены предварительные данные о том, что микроинъекция C6oHyFn в желудочки мозга крыс улучшала пространственную память, нарушенную интравентрикулярным введением Ар (Podolski et al., 2007).

В данной работе показано, что после однократной интрагиппокампальной микроинъекции C60HyFn (0,46 нмоль/ 1 мкл), предшествующей интрагиппокампалыюму введению АРмг, у всех крыс не нарушалось пространственное обучение, обучение с одной пробы и эпизодическая память через 14, 21, 30 и 45 дней (рис. 11, В, рис. 12, В). В эти же сроки не нарушались оперативная и долговременная память (рис. 12, Г).

Таким образом мы обнаружили, что предварительное введение C6oHyFn предупреждало нарушение пространственной и эпизодической памяти, вызванное интрагиппокампапьным введением АРиг-

Следовательно, C6oHyFn оказывает сильное нейропротекторное действие. Механизмы этого эффекта требуют дальнейшего изучения. До настоящего времени нейропротектоное действие водорастоворимых фуллеренов объяснялось их анитиоксидантной активностью (Dugan et al., 1997; Quick et al., 2008). Наши данные in vitro с помощью электронной микроскопии показали, что фуллерены С6о предупреждают образование и разрушают сформированные фибриллы Ар (Подлубная и др., 2006; Podolski et al., 2007; Бобылев и др., 2010; Bobylev et al., 2011). Недавно мы показали, что интрагиппокампальное введение C60HyFn предупреждает нарушение синтеза белка, накопление амилоида и развитие нейродегенерации в пирамидных нейронах поля СА1 гиппокампа крыс (Makarova et al., 2012). Эти результаты подтверждают наше предыдущее предположение о том, что водорастворимые фуллерены оказывают антиоксидантное и антиамилоидное действие (Podolski et al., 2007; Подольский и др., 2010; Подольский и. Подлубная, 2010).

Пирамидные клетки поля СА1 гиппокампа являются наиболее чувствительными к действию АР25.35 (Stepanichev et al., 2000; Nie et al., 2010). Мы предполагаем, что защищая пирамидные клетки поля СА1 гиппокампа от нейротоксического действия АР, однократное введение C6oHyFn предупреждает нарушение пространственной и эпизодической памяти в течении длительного времени (более полутора месяцев).

На основании этих данных мы выдвигаем предположение, что водорастворимые фуллерены С6о представляют чрезвычайный интерес для разработки профилактики и терапии БА.

выводы

1. На ранней стадии (14, 30 и 45 дней) после однократной интравентрикулярной микроинъекции АР25-35 нарушение пространственной памяти при случайном положении цели в водном лабиринте Морриса наблюдалось не более чем у 50% животных. При этом происходило нарушение синтеза белка в морфологически интактных пирамидных клетках поля СА1 гиппокампа. Изучение действия фуллерена на этой модели не давало однозначных результатов.

2. Инкубация переживающих срезов в среде, содержащей АР25.35, приводила к выраженной дегенерации пирамидных клеток поля СА1. Предварительная инкубация переживающих срезов в среде с гидратированным фуллереном Сбо (СбоНуРп) предупреждала развитие нейродегенерации.

3. Предварительная однократная интрагиппокампальная микроинъекция C6oHyFn в невысокой концентрации (0,46 нмоль/ 1мкл) предупреждала нарушение синтеза белка, образование депозитов АР и массовую нейродегенерацию клеток в поле СА1 гиппокампа, вызванные интрагиппокампальным введением АР25-35 на 2, 7 и 14 дни.

4. Предварительная однократная интрагиппокампальная микроинъекция C6oHyFn предупреждала нарушение пространственной памяти, обучения с одной пробы и эпизодической памяти, вызванные интрагиппокампальным введением APi-42* Этот эффект сохранялся в течение полутора месяцев.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи:

1. Podolski I.Ya., Podlubnaya Z.A., Kosenko E.A., Mugantseva E.A., Makarova E.G., Marsagishvili L.G., Shpagina M.D.,. Kaminsky Yu.G., Andrievsky G.V., Klochkov V.K. Fullerene effects on amyloid р-peptide fibrillization in vitro and performance of the cognitive task. Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 2007, Vol. 7, № 4-5, p. 1479-1485.

2. Makarova E.G., Gordon R.Ya., Podolski I.Ya. Fullerene C60 prevents neurotoxicity induced by intrahippocampal microinjection of amyloid-p peptide. Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 2012, Vol. 12, № 1, p. 119-126.

3. Гордон Р.Я., Макарова Е.Г., Подольский И.Я., Рогачевский В.В., Кордонец O.JI. Нарушение белкового синтеза - раннее проявление действия амилоида-Р в нейронах. Нейрохимия, 2012, том 29, № 2, С. 139-149.

Тезисы:

1. Podolski I.Ya., Kosenko Е.А., Mugantseva E.A., Makarova E.G., Kaminsky Yu.G., Andrievsky G.V., Klochkov V.K. and Derevyanchenko L.I.. Hydrated C6o fullerenes and an animal model of Alzhemer's disease. 7th Biennial International Workshop «Fullerenes and Atomic Clusters», St. Petersburg, Russia, 2005, p. 241.

2. Макарова Е.Г.. Муганцева E.A., Косенко E.A., Марсагишвили Л.Г., Подлубная З.А., Подольский И Я. «Бета-амилоидная модель болезни

Альцгеймера у крыс», X Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наукаХХ1 века», Пущино, 2006, С. 151.

3. Mugantseva Е.А., Makarova E.G., Deev A.A., Shcheglov I.V., Lebedinsky A.A. and Podolski I.Ya. «Spatial memory of rats performing a probabilistic cognitive task», International Symposium «Hippocapus and memory», Pushchino, 2006, p. 90.

4. Подольский И. Я., Муганцева Е.А., Макарова Е.Г., Казанович Я.Б., Жунина В.В., Лежнева Н.Э., Ройтберг Е.Г. Исследование действия фуллеренов на когнитивные процессы на модели нейротоксичности, вызванной бета-амилоидом. Разработка компьютерных тестов на решение пространственных задач для диагностики слабых когнитивных расстройств. Тезисы конференции «Фундаментальные науки - медицине», Москва, 2006, С. 23-24.

5. Муганцева Е.А., Макарова Е.Г., Подольский И.Я. Анализ острой нейротоксичности, вызванной бета-амилоидным пептидом у крыс. Третий Международный Междисциплинарный Конгресс «Нейронаука для медицины и психологии», Судак, Крым, Украина, 2007, С. 164-165.

6. Макарова Е.Г., Кордонец О.Л., Муганцева Е.А., Марсагишвили Л.Г., Шпагина М.Д., Подлубная З.А., Годухин О.В., Подольский И.Я. Влияние С60 фуллерена на экспериментальных моделях болезни Альцгеймера in vitro и in vivo. Третий Международный Междисциплинарный Конгресс «Нейронаука для медицины и психологии», Судак, Крым, Украина, 2007, С. 149-150.

7. Podolski I.Ya., Podlubnaya Z.A., Mugantseva E.A., Makarova E.G., Marsagishvili L.G., Shpagina M.D., Kordonets O.L., Godukhin O.V.,Andrievsky G.V., and Klochkov V.K. Effects of hydrated C«> fullerene on animal models of Alzheimer's disease. 8th Biennial International Workshop «Fullerenes and Atomic Clusters» IWFAC, St. Petersburg, Russia 2007, p. 172.

8. Podolski I.Ya., Podlubnaya Z.A., Mugantseva E.A, Makarova E.G., Kordonets O.L., Marsagishvili L.G., Shpagina M.D., Kosenko E.A., Godukhin O.V. Impairment of cognitive processes induced AP peptides and C6o fullerenes. Neuroscience Meeting, San Diego, 884.23/K21. 2007. http://www.abstractsonline.com.

9. Подольский И.Я., Макарова Е.Г., Муганцева E.A., Кордонец О.Л., Годухин О.В., Гордон Р.Я, Казанович Я.Б., Ильясов Ф.Э., Жунина В.В., Khirug L. Механизмы нарушения когнитивных процессов на моделях болезни Альцгеймера и фуллерены. Тезисы конференции «Фундаментальные науки -медицине», Москва, 2007, С. 22-23.

10. Mugantseva Е.А., Makarova E.G., Pavlik V.D. and Podolski I.Ya. Impairment of cognitive processes and spatial synchronization of the electric activity of the frontal cortex and the hippocampus on an animal model of Alzheimer's disease in rats. Forum Neuroscience, Geneva, Switzerland, 2008, vol.4,217.20.

11. Podolski I.Ya., Podlubnaya Z.A., Mugantseva E.A., Makarova E.G., Kordonets O.L., Marsagishvili L.G., Godukhin O.V., Shpagina M.D. Fullerenes and creation of drugs for therapy of Alzheimer's disease. The second International Conference on NanoBioTechnologies, St. Petersburg, Russia, 2008, p.171.

12. Подольский И .Я., Годухин О.В., Гордон Р.Я., Кордонец O.JI., Макарова Е.Г., Марсагишвили Л.Г., Подлубная З.А. Фуллерены Сбо и болезнь Альцгеймера. Всеукраинская конференция «Актуальные проблемы современной биохимии и клеточной биологии», Днепропетровск, Украина, 2008, С. 20.

13. Makarova Е„ Muganceva К., Kordonets О., Gordon R., Podolski I. Effect of aqueous solutions of C6o fullerene on the impairment of protein synthesis spatial memory induced by p-amyloid peptide. «Alzheimer's and Parkinson's Diseases: Advances, Concepts and New Challenges», Prague, Czech Republic, 2009, p. 831.

14. Макарова Е.Г., Муганцева E.A., Гордон Р.Я., Подольский И.Я. Влияние фуллеренов С6о на синтез белка в гиппокампе и пространственную память на модели болезни Альцгеймера. 1-ая Международная научная школа «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах», Московская область, Ступинский район, 2009, С. 282.

15. Макарова Е.Г.. Гордон Р.Я., Подольский И.Я. Фуллерен Сбо нормализует нарушения синтеза белка в гиппокампе и пространственную память, вызванные амилоид - Р пептидом. Всероссийская конференция с международным участием «Гиппокамп и память: норма и патология», Пущино, Россия, 2009, С. 103-104.

16. Makarova E.G.. Gordon R.Ya., Kordonets O.L., Godukhin O.V., Podolsky I.Ya. Possible neuroprotective properties of fullerenes C6o- Nanotechnology international forum «Rusnanotech», Moskow, 2010. http://www.rusnanoforum.ru.

17. Подольский И.Я., Подлубная 3.A., Гордон Р.Я, Макарова Е.Г., Муганцева Е.А., Кордонец O.JL, Бобылева (Марсагишвили) Л.Г., Гехт А.Б., Пиотровский Л.Б., Мишулина О.А., Эйдлин А.А. Фуллерены Сб0 для разработки антиамилоидной терапии болезни Альцгеймера. Тезисы конференции «Фундаментальные науки - медицине», Москва, 2010, С. 164-165.

18. Подольский И.Я., Гордон Р.Я., Макарова Е.Г. Фуллерены для разработки терапии болезни Альцгеймера. Седьмой Международный Междисциплинарный Конгресс «Нейронаука для медицины и психологии», Судак, Крым, Украина, 2011, С. 339.

Работа выполнена при поддержке гранта Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» 2010, 2011; гранта Министерства образования и науки РФ 2009-2010 (грант № 2.1.1./3876); Государственного контракта № П1052.

Подписано в печать:

23.04.2012

Заказ № 7256 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Макарова, Екатерина Григорьевна, Пущино

61 12-3/915

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

НАУКИ

ИНСТИТУТ ТЕОРЕТИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОФИЗИКИ

РАН

На правах рукописи

МАКАРОВА ЕКАТЕРИНА ГРИГОРЬЕВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ НЕЙРОПРОТЕКТОРНЫХ СВОЙСТВ ФУЛЛЕРЕНОВ С60 НА МОДЕЛИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА У КРЫС

03.03.01 - физиология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук, И .Я. Подольский.

ПУЩИНО-2012

Оглавление

Список сокращений.......................................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................................6

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................................9

ГЛАВА 1. БОЛЕЗНЬ АЛЬЦГЕЙМЕРА...........................................................................9

1.1. Амилоидозы - конформационые болезни.............................................................9

1.2. Болезнь Альцгеймера: эпидемиология и социальная значимость.....................9

1.3. Генетическая и спорадическая формы Б А.........................................................10

1.4. Клинические признаки. Факторы риска. Диагностика.....................................11

1.5. Гистопатологические признаки и повреждение структур мозга. Нарушение памяти............................................................................................................................13

1.6. Маркеры болезни Альцгеймера...........................................................................15

1.6.1. Бета-амилоидные пептиды...........................................................................15

1.6.2. Тау и нейрофибриллярные узелки. Нарушение внутриклеточного транспорта.................................................................................................................20

1.6.3. Окислительный стресс. Нарушение синтеза белка.....................................21

1.6.4. Воспалительные процессы. Роль астроцитов и микроглии.......................22

1.6.5. Нарушение автофагии....................................................................................22

1.6.5. Дисфункция синапсов. Клеточная гибель...................................................23

1.7. Гипотезы................................................................................................................24

1.8. Модели БА: достоинства и недостатки...............................................................25

1.8.1. Трансгеные животные....................................................................................26

1.8.2. Введение агрегированного бета-амилоида..................................................26

1.8.3. Бульбэктомированные животные.................................................................28

1.9. Исследование пространственной памяти в водном лабиринте Морриса на

моделях Б А...................................................................................................................28

1.10.Терапия Б А...........................................................................................................30

ГЛАВА 2. ФУЛЛЕРЕНЫ Сб0 КАК ВОЗМОЖНЫЕ НЕЙРОПРОТЕКТОРЫ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ Б А............................................................................32

2.1. Физико-химические свойства С60........................................................................33

2.2. Биологическая активность фуллеренов..............................................................34

2.2.1. О вероятных механизмах проникновения в клетку и распределения в организме......................................................................................................................36

2.2.2. О токсичности фуллеренов...............................................................................37

2.3. Гидратированный фуллерен................................................................................38

2.4. Эффекты фуллеренов на моделях БА in vitro.....................................................39

КРАТКОЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................................40

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ..........................................................................42

II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ...........................................................................43

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.........................................................................43

3.1. Животные...............................................................................................................43

3.2. Вещества и способ введения................................................................................43

3.3. Переживающие срезы...........................................................................................45

3.4. Приготовление образцов ткани...........................................................................45

3.5. Исследование состояния рРНК............................................................................46

3.6. Световая микроскопия и иммуногистохимия....................................................47

3.7. Исследование пространственной памяти в водном лабиринте Морриса........48

3.7.1. Водный лабиринт и установка для видеорегистрации...................................48

3.7.2. Вероятностная задача........................................................................................49

3.7.3. Тест на пространственное обучение с одной пробы......................................50

3.8. Статистический анализ.........................................................................................51

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ..............................................................51

4.1. Влияние предварительного введения C60HyFn на пространственную память

при случайном положении цели в водном лабиринте Морриса и синтез белка пирамидных нейронов поля CAI гиппокампа, нарушенные на ранней стадии после интравентрикулярного введения агрегированного Ар25.35 У взрослых и старых крыс..................................................................................................................51

4.1.1. Влияние предварительного введения C60HyFn на пространственную память при случайном положении цели в водном лабиринте Морриса у взрослых и старых крыс на ранней стадии действия А|325-35.......................................................52

4.1.2. Влияние предварительного введения C60HyFn на морфологическое состояние пирамидных нейронов поля CAI гиппокампа и синтез белка в этих нейронах у взрослых и старых крыс на ранней стадии после интравентрикулярного введения АР25-35....................................................................58

4.2. Влияние предварительной инкубации переживающих срезов гиппокампа в среде, содержащей C6oHyFn, на морфологическое состояние пирамидных нейронов поля CAI гиппокампа, нарушенное инкубацией с AJ325_35......................64

4.3. Влияние предварительного введения C60HyFn на морфологическое состояние пирамидных нейронов поля CAI гиппокампа и синтез белка в этих нейронах у

взрослых крыс на ранней стадии после интрагиппокампальной микроинъекции

Ар25-35.............................................................................................................................66

4.4. Влияние предварительного введения СбоНуРп на пространственное обучение

и память у взрослых крыс на ранней стадии после интрагиппокампальной

микроинъекции Ар}_42........................................ ...........................................................73

ВЫВОДЫ..........................................................................................................................82

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................................................83

ФИНАНСОВАЯ ПОДДЕРЖКА РАБОТЫ..................................................................111

БЛАГОДАРНОСТИ.......................................................................................................112

Список сокращений

БА болезнь Альцгеймера

Aß бета-амилоидный пептид

АРР предшественник амилоидного бета-петида (Amyloid

Precursor Protein)

PSI, PS2 пресенилины 1, 2 (presenilin 1, presenilin 2)

АО акридиновый оранжевый

BJIM водный лабиринт Морриса

C60HyFn гидратированный фуллерен Сбо

С60/ПВП аддукт фуллерена С60 с поливинилпирралидоном

кДа килодальтон

НМДА ионотропный рецептор глутамата, селективно

связывающий ГЧ-метил-Б-аспартат (NMDA)

мкм микрометр

нм нанометр

к длина волны

ВВЕДЕНИЕ

Болезнь Альцгеймера (БА) - наиболее распространенное нейродегенеративное заболевание людей пожилого и старческого возраста, которое характеризуется прогрессивным нарушением памяти и деменцией. Одним из ключевых факторов в патогенезе Б А являются бета-амилоидные пептиды (Aß) 3943, которые образуются в результате последовательного внутримембранного амилоидогенного протеолиза белка предшественника бета-амилоида ß- и у-секаретазами. В норме тоже образуются эти пептидные фрагменты, однако при патологии их концентрация сильно возрастает, они начинают полимеризоваться и приобретают токсические свойства. Нейротоксическое действие растворимых олигомеров Aß и их фибрилл приводит к гибели синапсов и нейронов в гиппокампе и неокортексе (Haass and Selkoe, 2007; Selkoe, 2008; Citron, 2010).

Существенный вклад в патогенез ранних стадий БА вносит окислительный стресс, индуцированный Aß (Kaminsky et al., 2010; Степаничев и Гуляева H.B, 2010; Nunomura et al., 2001), основной мишенью которого являются компоненты белкового синтеза (мРНК, рибосомы, тРНК и хроматин) (Shan et al., 2007; Ding et al., 2007). Снижение белкового синтеза наблюдается в областях мозга, регулирующих когнитивные функции (гиппокамп и фронтальная кора) (Ding et al., 2005).

Одним из ранних симптомов БА является прогрессирующие нарушение оперативной и эпизодической памяти, в том числе пространственной памяти (Burgess et al., 2001; Lindeboom and Weinstein, 2004). При исследовании нарушений памяти на моделях БА во многих случаях наблюдаются мягкие нарушения памяти, что не соответствует клиническим данным. На моделях БА широко применяется изучение пространственной памяти в водном лабиринте Морриса с использованием разнообразных протоколов обучения (Morris, 2001; Chen et al. 2000; D'Hooge and De Deyn, 2001; Bast et al., 2009; Подольский и Щеглов, 2004; Podoiski et al., 2007).

Ни одна из современных экспериментальных моделей БА не является универсальной. Введение в центральную нервную систему (в желудочки мозга или непосредственно в гиппокамп или кору) агрегированного бета-амилоидного пептида или его токсического фрагмента Aß25_35 позволяет исследовать

непосредственно его действие на морфофункциональное состояние нейронов и когнитивные процессы (Selkoe, 2008; Stepanichev et al., 2000). Исследование ранних нейротоксических эффектов центрального введения агрегированного Af3 играет важную роль в понимании патогенеза заболевания и представляет большой интерес с точки зрения поиска и изучения антиамилоидного действия лекарственных средств (Fiala, 2007; Haass and Selkoe, 2007; Makarova et al., 2012; Podolski et al., 2010; Nie etal.,2010).

Лечение БА сложная проблема психиатрии и неврологии, поскольку, несмотря на интенсивные исследования многих ведущих лабораторий мира, лекарства тормозящие развитие или вызывающие долговременные ремиссии БА отсутствуют. Применяемые в клинике препараты (ингибиторы холинэстеразы, антагонисты НМДА (ионотропный рецептор глутамата, селективно связывающий Ы-метил-О-аспартат) рецепторов, определенные нейропептиды) временно улучшают память и интеллект больных, но они не вызывают длительной ремиссии при БА, заболевание прогрессирует и приводит к гибели больных в состоянии глубокой деменции. Новым направлением в разработке лекарств для лечения БА являются фуллерены С60. Международные фармацевтические компании С. Sixty and Merck Со. начали разработку на основе фуллеренов антиоксидантов и лекарств для терапии болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных заболеваний (Small times magazine, 2007). Одними из наиболее перспективных являются подходы, нацеленные на создание антиамилоидных лекарственных веществ, предупреждающих образование и агрегацию Ар (Citron, 2010; Scherzer-Attali et al., 2010), однако фуллеренам не уделялось внимание в этих исследованиях.

Фуллерены Сб0 - углеродные наночастицы с уникальными физико-химическими и биологическими свойствами. Одним из основных биологических свойств С60 является способность присоединять реактивные формы кислорода и вести себя как «губка свободных радикалов» (Krusic et al., 1991; Piotrovsky and Kiselev, 2006; Andrievsky et al., 2009; Ali et al., 2008).

Фуллерены накапливаются в печени, селезенке и других органах экспериментальных животных (Yamago et al, 1995; Bullard-Dillard et al, 1996; Kubota et al, 2011). Фуллерены и их производные могут удаляться из организма (Yamago et al, 1995; Gharbi et al., 2005). Молекулы фуллерена с низким уровнем

агрегации, такие как гидратированный фуллерен C60HyFn и Сб0/ПВП (аддукт фуллерена С60 с поливинилпорролидоном) не токсичны (Piotrovslcy and Kiselev, 2006; Andrievsky et al., 2005). C60HyFn удаляет гидроксил радикалы и защищает ДНК от окислительного повреждения, вызванного ионизирующей радиацией in vitro (Andrievsky et al., 2009).

Фуллерены действуют на разнообразные клеточные и молекулярные мишени (Piotrovsky and Kiselev, 2006; Dugan et al., 1997; Huang et al., 2000). Карбоксифуллерены предупреждали апоптоз, индуцированный A(3i.42 (Dugan et al., 1997). Фуллеренол блокировал индуцированное Ар25-з5 увеличение свободного цитозольного кальция в культуре клеток (Huang et al., 2000). In vitro флуоресцентный анализ показал, что фуллерены эффективно снижают агрегацию Api_40. Авторы объяснили такой эффект связыванием фуллереном центрального гидрофобного мотива Ар KLVFF (Kim and Lee, 2003). Недавно, используя метод высокоразрешающей электронной микроскопии, мы показали, что С6о фуллерены способны предотвращать агрегацию и разрушать Ар25-з5 и Ар^ фибриллы (Podolski et al., 2007; Bobylev et al., 2011). Эти данные позволяют нам предположить, что Ар пептиды представляют собой одну из мишеней для фуллерена (Podolski et al., 2010). Однако, неизвестно будут ли фуллерены защищать нейроны от токсического действия Ар in vivo.

Таким образом, ряд принципиальных вопросов остается открытым. Действие фуллеренов С60 на экспериментальных моделях БА in vivo не были изучены. Особый интерес представляет исследование фуллеренов на амилоидогенез, нейродегенерацию, синтез белка в нейронах и состояние пространственной памяти на ранних стадиях действия Ар.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. БОЛЕЗНЬ АЛЬЦГЕЙМЕРА

1.1. Амилоидозы - конформационые болезни

Более 20 клинических синдромов описаны как амилоидные заболевания.

Патологически, эти болезни характеризуются отложением в различных тканях нерастворимых фибриллярных белков, образующихся в результате наследственного или приобретенного нарушения сворачивания белков. К церебральным амилоидозам относятся амилоидные ангиопатии, характеризующиеся отложением амилоидного белка в стенках мелких мозговых сосудов (Thal et al., 2008), губчатые энцефалопатии, вызванные прионными белками, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, диабет второго типа, наследственная амилоидная полинейропатия, системные амилоидозы и др. (Selkoe, 2003).

Морфологическая характеристика амилоида

Амилоид является сложным веществом - гликопротеидом, в котором глобулярные и фибриллярные белки очень прочно связаны с мукополисахаридами, а также с теми тканевыми элементами, в которые амилоид выпадает. Для каждого клинического синдрома характерен свой доминирующий белок. Все белки обладают характерной ненативной бета-складчатой конформацией и спонтанно агрегируются в длинные фибриллы (диаметром 6-13 нм и длиной 100 нм - 1,6 мкм). Амилоид характеризуется сродством к Конго красному и флуоресцентным красителям тиофлавин Т и S, окрашивание обусловлено наличием в составе амилоида упорядоченных фибрилл, которые способны связывать и прочно удерживать на себе краску (Groenning, 2009).

1.2. Болезнь Альцгеймера: эпидемиология и социальная значимость

Болезнь Альцгеймера (или сенильная деменция альцгеймеровского типа) -

первичное нейродегенеративное заболевание людей пожилого и старческого возраста, проявляющееся прогрессирующим снижением когнитивных процессов и развитием деменции (слабоумия). Заболевание впервые было описано в 1906 году немецким психиатром Алоисом Альцгеймером.

Социально-экономическое давление заболеваний связанных с развитием слабоумия огромно. По всему миру насчитывается свыше 25 млн. больных с диагнозом болезнь Альцгеймера, каждый год число больных возрастает на 4,6 млн. Ежегодные расходы на содержание и уход за ними превышают 200 млрд. долларов. На долю этого заболевания приходится около 50-60% всех случаев деменции. Упомянутые обстоятельства привели к формированию взгляда на БА как на «эпидемию XXI века» и признанию деменций, объединяемых в настоящее время под названием БА, одной из главных проблем, стоящих перед медициной (Winblad and Wimo 2007).

1.3. Генетическая и спорадическая формы БА

К настоящему времени проверено более 400 генов - кандидатов, которые

участвуют в процессах окислительного стресса, апоптоза, воспалении, формировании бета-амилоидных бляшек, нейрофибриллярных сплетений, метаболизме бета-амилоида и других процессов, связанных с патогенезом БА. Большую часть аутосомно-доминантно наследуемых случаев БА (50-80%) связывают с мутациями в трех генах: белка-предшественника бета-амилоида (АРР), пресенилина 1 (PS1) и пресенилина 2 (PS2), которые приводят к развитию болезни с ранним началом, до 65 лет. Все они действуют на метаболизм и стабильность бета-амилоида (Григоренко и Рогаев, 2007, Waring and Rosenberg, 2008). Все мутации, приводящие к БА, представлены в базах данных, которые регулярно обновляются. В настоящее время известно о более 190 таких мутаций, большая часть которых приходится на ген PS1 (158), в АРР найдена только 21 мутация, в PS2 - около 11 (The Alzheimer Research Forum).

Мутация аминокислот гена АРР, локализованного на 21 хромосоме, а также трисомия по 21-й хромосоме, приводят к усиленному расщеплению АРР ß-секретазой и усиливают агрегацию Aß. Мутации в гене PS1, локализованного на 14-й хромосоме, и, PS2, локализованного на 1-й хромосоме, приводят к увеличению уровня амилоидогенной формы Aß (фрагмента Aß42) (Григоренко и Рогаев, 2007).

Наибольшее распространение имеют спорадические формы БА. Эти формы болезни наблюдается в 90 % случаев, и их причины остаются невыясненными. В

настоящее время проводятся многочисленные исследования, направленные на выяснение роли вирусной инфекции и токсичных веществ в развитии этого заболевания. У родственников большинства больных не отмечается предрасположенности к заболеванию, однако гены могут обуславливать степень риска заболевания.

Самый известный генетический фактор риска — наследуемая аллель е4 гена аполипротеина Е (АРОЕ), который значитель�