Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние гидратированного фуллерена C60 в широком диапазоне концентраций на биологические тест-системы

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние гидратированного фуллерена C60 в широком диапазоне концентраций на биологические тест-системы"

На правах рукописи

00505906/

Яблонская Ольга Игоревна

ВЛИЯНИЕ ГИДРАТИРОВАННОГО ФУЛЛЕРЕНА С60 В ШИРОКОМ ДИАПАЗОНЕ КОНЦЕНТРАЦИЙ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ

03.01.02 — Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 р МАЙ ¿013

МОСКВА 2013

/ о

А

005059067

Работа выполнена на кафедре биоорганической химии Биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский Государственный Университет имени

М. В. Ломоносова.

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории физико-химических основ регуляции биологических систем ИБХФ РАН

Воейков Владимир Леонидович

Пальмина Надежда Павловна

Доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник кафедры эмбриологии Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова

Доронин Юрий Константинович

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук, г. Пущино

Зашита диссертации состоится «29» мая 2013 г. в 12.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.039.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук по адресу: 119334, Москва, ул. Косыгина, д.4. л -

¿У

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института химической физики им. H.H. Семенова Российской академии наук.

Автореферат разослан 19 апреля 2013 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 002.039.01 кандидат химических наук

i^c^^^C, МазалеЧкая Л.И.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы: Фуллерены (С6о, С70 и т.д.) являются аллотропной формой углерода [Сидоров и др., 2005]. Наиболее стабильный изомер С6о проявляет свойства ненасыщенного полиалкена и обладает структурой усеченного икосаэдра Сейчас во всем мире уделяется самое пристальное внимание перспективам применения фуллеренов в физике, в химии, в области нанобиотехнологий и медицины.

Фуллерен практически не растворим в воде (его растворимость <10"9мг/л) [Ruoff et al., 1993; Heymann, 1996]. В 1995 году без использования каких-либо солюбилизаторов и специальной химической модификации была получена устойчивая композиция фуллерена и воды, получившая название гидратированного фуллерена С6о (HyFn). Эта композиция соответствует всем характеристикам истинного раствора, и концентрация С6о в нем достигает 2,0 мг/мл и более [Andrievsky et al., 1995].

Гидратированный фуллерен HyFn - это молекула С60-фуллерена, окруженная оболочкой молекул воды и образующая истинные водные растворы. Исследования биологической активности HyFn и его химически модифицированных аналогов показали, что они обладают антивирусным, антиамилоидным, антиаллергическим, противоопухолевым, гепатопротекторным, антиатеросклеротическим действием, стимулируют иммунитет и препятствуют возрастным изменениям в организмах [Andrievsky et al, 2005; Bakry et al, 2007; Baati et al, 2012]. При этом HyFn не проявляет признаков токсичности даже в высоких дозах.

С одной стороны, HyFn можно рассматривать как сильный акцептор электронов, антиоксидант, с другой - как активатор для кислорода, т.е. прооксидант. Учитывая, что молекула С60 проявляет слабую химическую активность, а в составе HyFn она заключена в водную оболочку, можно предположить, что весь спектр действия HyFn можно объяснить свойствами ВОДНЫХ оболочек, формирующихся вокруг молекул СбО-

Поскольку HyFn положительно влияет на многие биологические процессы in vivo, представляется важным исследовать действие этого соединения с использованием широкого спектра модельных биологических систем.

Цель данной работы заключалась в изучении влияния НуРп в широком диапазоне концентраций (1 х Ю-6 М - 1 х 10"23 М), на различные биологические объекты: ферменты, неразбавленную кровь человека и трансформированные фибробласты китайского хомячка.

Основными задачами исследования являлись:

1. Изучить влияние НуРп в широком диапазоне концентраций на активность бактериальной люциферазы, щелочной фосфатазы и пероксидазы в условиях продолжительного хранения и при термической инактивации. Изучить сроки и условия хранения растворов НуРп в низких концентрациях.

2. Изучить влияние НуРп в широком диапазоне концентраций на люцигенин-зависимую хемилюминесценцию (ЛЦ-ХЛ) неразбавленной крови человека. Сравнить это влияние на кровь здоровых доноров и пациентов с ХОБЛ.

3. Изучить влияние НуРп в сверхнизкой концентрации на трансформированные фибробласты китайского хомячка. Оценить влияние препарата на скорость роста культуры клеток и на скорость старения.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. НуРп оказывает стабилизирующее действие на ферменты, предохраняя их от термической и окислительной инактивации.

2. НуРп в определенных концентрациях усиливает интенсивность ЛЦ-ХЛ неразбавленной крови человека, причем этот эффект не обнаружен на крови пациентов с ХОБЛ. Добавление НуРп снижает дисперсию показателей хемилюминесценции крови в группах пациентов с разной тяжестью течения заболевания, поэтому может служить диагностическим методом.

3. НуРп подавляет пролиферацию трансформированных клеток, а также ускоряет их гибель.

4. НуРп оказывает все вышеперечисленные эффекты на биологические объекты в малых и сверхмалых концентрациях. Это указывает на то, что его про- и антиоксидантная активность опосредована воздействием на водную среду этих объектов.

Научная новизна исследования:

Впервые изучено защитное влияние НуРп в широком диапазоне концентраций (10"7 М - 10'23 М) на бактериальную люциферазу, щелочную

4

фосфатазу и пероксидазу в условиях термической и окислительной денатурации. НуРп в сверхмалых концентрациях модулирует эффект окислителей, восстановителей и антиоксидантов (окисление, Ре2+, глицин) на ферменты. Определены сроки и условия хранения НуРп.

Впервые изучено стабилизирующее влияние НуРп в низких и сверхнизких концентрациях (10"6 М, 10"7 М, 10'17 М, 10"19 М) на ЛЦ-ХЛ неразбавленной крови человека в течение нескольких суток. Показано, что НуРп в этих концентрациях снижает интенсивность ЛЦ-ХЛ крови пациентов с ХОБЛ. Влияние НуРп на кровь пациентов с ХОБЛ зависит от степени тяжести заболевания.

Впервые было изучено воздействие НуРп на скорость роста культуры трансформированных фибробластов китайского хомячка. Показано снижение скорости пролиферации культуры клеток, усиление гибели культуры и снижение эффективности образования колоний клетками в присутствии НуРп.

Впервые обнаружено, что НуРп в концентрациях 10"6М, 10'7 М, 10"9 М, 10"17 М и 10'19 М оказывает наиболее выраженное неспецифическое влияние на разные биологические объекты. В частности, он стабилизирует активность изученных ферментов, способствует длительному сохранению активности; стабилизирует интенсивность ЛЦ-ХЛ неразбавленной крови человека и ускоряет гибель культуры трансформированных клеток.

Теоретическая и практическая значимость исследования: Работа вносит определенный вклад в понимание характера воздействия НуРп на разные биологические объекты в диапазоне малых и сверхмалых доз, что даст возможность установить механизм и принцип его действия с учетом низкой химической активности собственно С6о-

Лабораторные исследования других авторов показали, что НуРп обладает терапевтическими свойствами, оказывая антибактериальное, гепатопротекторное, противовирусное, нейропротекторное и другие эффекты. Предполагается, что это влияние НуРп связано с его способностью модулировать свободно-радикальные процессы в живых системах, которые играют важную роль в регуляции жизнедеятельности. Обнаруженное в настоящей работе стабилизирующее влияние НуРп в сверхмалых дозах на ферменты представляет практический интерес для его использования в качестве консервирующего агента. Противоположный отклик

крови здоровых доноров и больных ХОБЛ на введение в кровь HyFn позволяет рассмотреть возможность использования его для диагностических и терапевтических целей. Результаты данного исследования могут быть использованы в курсах лекций по биофизике и клеточной биологии.

Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ кафедры биоорганической химии Биологического факультета МГУ имени М.ВЛомоносова (тема НИР: «Изучение динамических процессов в биохимических и клеточных системах», № Госрегистрации 01.2001.17.408).

Вклад автора: Личный вклад диссертанта состоит в разработке и проведении биофизических экспериментов, обработке и анализе полученных данных, формулировании положений и выводов, в подготовке тезисов конференций и статей к опубликованию. Все изложенные в диссертации новые результаты получены автором лично или при его непосредственном участии. Апробация работы: Материалы диссертации доложены на IV Международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» (2008 г., ИБХФ РАН, Москва), VIII Международной конференции «Биоантиоксидант» (2010 г., ИБХФ РАН, Москва), Международной конференции «Ломоносов-2010» (2010 г., МГУ имени М.ВЛомоносова), III Евразийском- конгрессе по медицинской физике (2010 г., МГУ имени М.ВЛомоносова, Москва), IX Международной крымской конференции «Космос и Биосфера» (2011 г., Алушта, Крым, Украина), X Международном симпозиуме "Биологические механизмы старения" (2012 г., Харьков, Украина), VI Международном конгрессе "Low and Superlow Fields and Radiations in Biology and Medicine" (2012 г., Санкт-Петербург), the 17th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence (ISBC 2012) (2012 г., Guelph, Ontario, Canada) (ISBC 2012), XVI международном научном конгрессе «Наука. Информация. Сознание» (2012 г., Санкт-Петербург).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 19 печатных работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах, входящих в Перечень ВАК, 1 статья в рецензируемом зарубежном журнале, 2 статьи в сборниках трудов международных конференций, 12 тезисов докладов, представленных на российских и международных конференциях.

б

Структура и объем диссертации: Диссертационная работа изложена на 130 страницах печатного текста, содержит 39 рисунков и включает разделы «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Выводы», «Литература». Библиографический список включает 204 ссылки на научные публикации, в том числе 76 источников на русском языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во «Введении» обоснована актуальность темы, сформулирована цель и основные задачи работы, охарактеризована научная новизна полученных результатов.

Вторая глава содержит обзор литературы по теме данного исследования. В нем описана структура и свойства фуллерена С6о и HyFn. Описаны процессы генерации АФК, даны характеристики ферментов, неразбавленной крови человека и клеточных моделей. Изложены доступные в литературе представления о действии биологически активных веществ в сверхмалых дозах, свойства структурированных вод и их роль в свободно-радикальных процессах, протекающих в водных системах.

Третья глава посвящена описанию оборудования, реактивов и методики экспериментов. В Разделе 3.1. описаны источники использованных реактивов и их характеристики.

В Разделе 3.2. описаны методики опытов с ферментами: бактериальной люциферазой Vibrio fischeri, щелочной фосфатазой E.coli и пероксидазой Ar morada rusticana. Растворы HyFn готовили из исходного раствора HyFn с концентрацией 2x1o-4 М путем последовательных разведений. Порцию исходного раствора разбавляли в 200 раз в буфере, воде или физиологическом растворе для получения lxlO"6 М раствора HyFn. Раствор интенсивно встряхивали и оставляли на 30 минут в темноте. Далее 300 мкл раствора добавляли в 2700 мкл воды или буфера

для получения 1хЮ'7М раствора HyFn. Для получения HyFn в концентрации 1x10"' М готовили сотенное разведение lxlO"7 М раствора. Растворы интенсивно встряхивали и оставляли на 30 минут в темноте. Эту процедуру повторяли для получения каждого разведения раствора HyFn.

Оценку уровня каталитической активности люциферазы проводили методом измерения интенсивности хемилюминесценции в реакционной смеси. XJI-излучение люциферазы регистрировали работающими в режиме счета одиночных фотонов

люминометрами - «Биотоке 7 А», «Биотоке 7», «Биотоке-7С» (AHO «Инженерный центр-экология», Россия). Реакционные смеси содержали 5х10~4 мг/мл фермента, FMN, NADH и деканаль. Смеси встряхивали и помещали в измерительную камеру счетчика фотонов.

Каталитическую активность щелочной фосфатазы и пероксидазы измеряли фотометрическим методом при помощи спектрофотометра Specord Analytik Jena (Германия). Использовали кварцевые и стеклянные кюветы. В опытах со щелочной фосфатазой кюветы содержали фермент, буфер pH 7,8 с HyFn, соли магния и цинка. Реакцию инициировали добавлением 4-нитрофенилфосфата (субстрата) непосредственно перед измерением оптической плотности при длине волны 410 нм. В опытах с пероксидазой реакционная смесь содержала 0,067 М фосфатный буфер (pH 6,5) с HyFn, 2,2 мг/мл пероксидазы, пероксид водорода и 2,2'-азино-ди[3-этил]-бензтиазолинсульфоновая кислота АБТС (субстрат). Каталитическую активность контролировали при длине волны 405 нм.

Описана методика опытов по изучению влияния HyFn на цельную неразбавленную кровь человека. Использовали кровь здоровых доноров и пациентов с ХОБЛ. К крови добавляли HyFn и люцигенин, и далее измеряли ЛЦ-ХЛ при помощи люминометра «Биотоке 7А».

Описана методика культивирования трансформированных фибробластов китайского хомячка линии Bll-dii FAF28. Клетки сеяли в стеклянные флаконы в опытах по изучению скорости роста культуры и в пластиковые чашки Петри в опытах по изучению эффективности образования колоний.

В Четвертой главе приводятся результаты исследования.

В разделе 4.1 дана характеристика водного раствора фуллерена. Получен спектр поглощения раствора HyFn. Установлено, что по спектральным характеристикам полученный нами препарат фуллерена полностью совпадает с описанными в литературе [Andrievsky et al., 2002].

180000 8 160000

0

® 140000

г?

с 120000

1

| 100000

2

£ 80000 4)

5 60000 40000 2000С

I I Л- 1 I

! "г~"

"Н......

,Г.........*.........*

12 3 4

I рм [и;.[ пбрггщов

Рис.1. Влияние длительной инкубации Рис.2. Изменение активности люциферазы при комнатной температуре в щелочной фосфатазы после присутствии НуРп в различных нагревания до 80°С в течение 5 мин. концентрациях на ее активность. На графике 1 - контроль без нагревания; 2 -приведены средние значения из 12 опытов. НуРп добавлен после нагревания, Приведены значения стандартных конц НуРп 10"17 М; 3- НуРп добавлен отклонений. до нагревания, конц НуРп 10"17 М; 4

- термоинактивированный контроль без добавления НуРп.

В разделе 4.2. приведены результаты экспериментов по изучению влияния НуРп в различных концентрациях на активность люциферазы. На рисунке 1 видно, что в первые и вторые сутки наблюдений НуРп не влияет на скорость ферментативной реакции. Однако уже на третьи и четвертые сутки эксперимента в тех образцах, к которым добавили НуРп в концентрациях от 10"15 М доЮ'23 М, наблюдали небольшое повышение активности фермента относительно контроля без НуРп. На пятый день измерений активность фермента в образцах, к которым добавили НуРп в концентрациях 10~13 М, 10"15 М, 10"17 М, на 44% превышает таковую в контроле, а с добавлением НуРп в концентрациях 10"19 М, 10'21 М, 1(Г23 М активность люциферазы практически в два раза превышает контрольную. Различия достоверны, р<0.01. В подразделе 4.2.2 приведены данные о стабилизирующем влиянии НуРп на люциферазу при термической инактивации. Установлено усиление стабилизирующего эффекта НуРп на активность фермента в глициновом буфере (подраздел 4.2.3). В подразделе 4.2.4 приведены данные о том, что в присутствии 1 мкМ Ре(П) активность люциферазы снижается, а при добавлении НуРп в концентрации 10"15 М к реакционной среде, содержащей 1 мкМ Ре(П), активность люциферазы снижается еще сильнее. В подразделе 4.2.5

показана стабилизация фермента при перемешивании на микробиологической качалке в присутствии НуРп.

В разделе 4.3 приведены данные со щелочной фосфатазой. В серии экспериментов проверяли возможность стабилизации НуРп щелочной фосфатазы при ее термической инактивации при 80°С (подраздел 4.3.1). На рисунке 2 видно, что после нагревания фермента его активность заметно снижается (столбик 4). Внесение НуРп в раствор фермента до нагревания препятствовало термоинактивации (столбик 3). Концентрация НуРп составила 10'17 М. В отличие от результатов с люциферазой, в этом опыте наиболее яркий результат получен в образцах с термоинактивированным ферментом, к которому добавили НуРп после того, как образцы охладили до комнатной температуры (столбик 2). Здесь скорость наработки продуктов гидролиза субстрата превышала скорость в термоинактивированном контроле, что свидетельствует о реактивации щелочной фосфатазы.

В подразделе 4.3.2 приведены данные о сроках и условиях хранения НуРп на примере тест-системы со щелочной фосфатазой. Показано, что НуРп сохраняет свои свойства в течение 25 суток при хранении при комнатной температуре и в холодильнике в темноте, но при освещении свойства утрачиваются на 15 сутки.

В подразделе 4.3.3 показаны результаты, указывающие на стабилизирующее влияние НуРп при продолжительном хранении щелочной фосфатазы в течение 5 суток при комнатной температуре. Обнаружено, что добавление НуРп в концентрациях 10'" М и 10'17 М приводит к снижению вариабельности данных, значения стандартного отклонения снизились в несколько раз по сравнению с контролем.

В разделе 4.4 приведены результаты с пероксидазой. На рисунке 3 показано, что нагревание до 70 °С привело к термической инактивации пероксидазы. Добавление НуРп в концентрации 10"15 М до нагревания приводило к существенной стабилизации фермента НуРп, добавленный после нагревания, не оказал защитного эффекта. Аналогичные результаты получены с люциферазой.

■ К без НуЯп. без Т « Р п 10(-15) М. без Т абезн^п, т«7ос

■ Hyf п 10(-15) М добавлен после нагревания доТ«=70С □ Н^п 101-15) М добавлен до нагревания до Т=70 С

К 10* 10-' 10* 10"" 10"и 10" 10"17 1аи Концентрация НуЯп (х2,5), М

НуРп

на Рис. 4. Влияние НуРп в концентрациях

Рис. 3. Влияние

термоинактивированную пероксидазу. от 2,5 х1(Гб до 2,5 х 10"23 М на ЛЦ-ХЛ Приведены результаты 15 измерений, цельной крови одного здорового Приведены стандартные отклонения. донора. Данные нормализовали

относительно интенсивности

хемилюминесценции в отсутствии НуРп, принятой за 100%.

Получены данные о стабилизирующем влиянии перемешивания на активность пероксидазы в присутствии НуРп.

В разделе 4.5 представлены результаты с неразбавленной кровью человека. В подразделе 3.5.1 изложены данные о влиянии НуРп на кровь здоровых доноров. Показано, что НуРп в сверхнизких концентрациях стимулирует ЛЦ-ХЛ неразбавленной крови (рис. 4). Наибольшее влияние на интенсивность ЛЦ-ХЛ неразбавленной крови оказывает НуРп в концентрациях 2,5x10"6 М, 2,5x10"7 М, 2,5хЮ"17 М и 2,5х10'19 М. На рис. 4 приведены значения ЛЦ-ХЛ крови одного донора, взятой с интервалом около 2 месяцев. На вторые сутки ХЛ начинает усиливаться в присутствии НуРп в тех концентрациях, при которых на первые сутки усиления ХЛ не наблюдали (2,5х1(Г9 М, 2,5x10"" М, 2,5хЮ"13 М и 2,5хЮ"15 М). В опыте, результаты которого представлены на рис. 5, в два образца крови одного здорового донора одновременно добавили физиологический раствор в контроль НуРп в физ.растворе до концентрации 10"19 М в опытный образец, затем добавили люцигенин, и измеряли ЛЦ-ХЛ. Видно, что в образце, содержащем НуРп, и в контроле в течение нескольких часов усиливается свечение. В образце с НуРп максимальное значение ЛЦ-ХЛ за сутки в несколько раз превышает значение в контроле. Такая реакция цельной крови индивидуальна, и соотношения

интенсивности ХЛ в присутствии НуРп в различных концентрациях неодинаковы у разных доноров в разных условиях.

■ Здоровые доноры Пациенты с ХОБЛ

I!' ГI

Ю-7 Ю-9 10-11 10-13 Ю-15 10_17 Ю-19 Концентрация НуРп (*2,5), М

Рис. 5. Изменение ЛЦ-ХЛ цельной крови человека в течение суток. ЛЦ-ХЛ более интенсивна в присутствии НуРп, чем в контроле. Максимальное свечение наблюдается через 6 часов после начала измерения.

Рис. 6. Сравнение влияния НуРп в различных концентрациях на интенсивность ЛЦ-ХЛ крови здоровых доноров и пациентов с хроническим течением ХОБЛ. Данные приведены на основании исследования крови 8 здоровых доноров и 7 пациентов с ХОБЛ. * - различия статистически достоверны.

В подразделе 4.5.2 приведены результаты исследования влияния НуРп на кровь пациентов с ХОБЛ. Обнаружено, что добавление НуРп в различных концентрациях по-разному влияет на ЛЦ-ХЛ крови здоровых доноров и кровь пациентов с ХОБЛ. На рис. 6 показано, что в присутствии НуРп в концентрациях 2,5^10"6 М, 2,5x10"7 М, 2,5х10"17 М и 2,5хЮ"19 М ЛЦ-ХЛ усиливается в крови здоровых доноров. Однако в крови пациентов с ХОБЛ таких изменений не наблюдается.

Полученные данные свидетельствуют о различиях в механизмах выработки и гашения АФК и других свободных радикалов в крови здоровых людей и пациентов с ХОБЛ. Характер влияния НуРп на кровь пациентов с ХОБЛ большей частью зависел от тяжести симптомов заболевания. Для этого опыта использовали кровь пациентов вне фазы обострения с не тяжелым течением заболевания до прохождения курса терапии.

Рис.7. Влияние НуРп на ЛЦ-ХЛ Рис.8. Плотность культуры клеток в неразбавленной крови пациента К. с ХОБЛ. присутствии 10"19 М НуРп на 4-е Приведены характерные результаты одного сут кулЬтивирования. Различия

измерения. 1 - До лечения Гипоксеном , -

,, „ _ . между столбцами статистически

НуРп не добавляли, 2 — до лечения

Гипоксеном®, конц. НуРп составила 1019 М, значимы (р<0,01).

3 - после лечения Гипоксеном®, НуРп не

добавляли, 4 - после лечения Гипоксеном®,

конц. НуРп составила 10'6 М, 5 - после

лечения Гипоксеном®, конц. НуРп составила

Помимо стандартной терапии, пациенты получали препарат Гипоксен® -антиоксидант и антигипоксант. Гипоксен® - акцептор электронов; он шунтирует митохондриальную цепь переноса электронов и повышает эффективность тканевого дыхания. Гипоксен® способен устранять радикалы и препятствовать окислению. Пациентов поделили на три группы — пациенты с хроническим течением ХОБЛ (вне обострения) до применения Гипоксена®, пациенты с хроническим ХОБЛ после лечения Гипоксеном®, и группа пациентов с обострением ХОБЛ, не получавших Гипоксен®. Раствор НуРп добавляли в образцы крови пациентов из всех групп. Добавление НуРп к образцам крови пациентов с ХОБЛ до и после лечения Гипоксеном® оказало влияние на интенсивность ЛЦ-ХЛ (рис. 7). Интересно, что НуРп в низких (2,5x10"6 М) и особенно сверхнизких (2,5хЮ"19 М) концентрациях заметно снизил ЛЦ-ХЛ в образцах крови группы пациентов, принимавших Гипоксен®. Это усилило контраст между группами пациентов до и после лечения. Интересно, что лечение Гипоксеном® снижало ЛЦ-ХЛ крови; снижение интенсивности ЛЦ-ХЛ происходило также при добавлении

НуРп в кровь пациентов, не принимавших Гипоксен®. Эти данные согласуются с результатами опыта, результаты которого приведены на рис. 6. На рис. 7 приведены результаты, полученные в эксперименте с кровью одного пациента.

В разделе 4.6 приведены данные опытов с трансформированными фибробластами китайского хомячка. В подразделе 4.6.1 представлены данные опытов по изучению влияния автоклавирования на свойства НуРп в сверхмалых концентрациях. Для этого в качестве биологической тест-системы использовали цельную кровь здорового донора. Нами было показано ранее, что неразбавленная кровь, как тест-система, весьма чувствительна к добавлению НуРп. Мы обнаружили, что ЛЦ-ХЛ крови возрастает в одинаковой степени в ответ на внесение в нее НуРп в сверхмалых концентрациях независимо от того, подвергали автоклавированию или нет запасной раствор НуРп (10"7), из которого путем последовательных разведений готовили НуРп в концентрации 10"17 М. Таким образом, автоклавирование запасного раствора не влияет на биологическую активность НуРп в сверхмалых концентрациях.

В подразделе 4.6.2 показаны результаты эксперимента по определению цитотоксических или митогенных свойств НуРп. НуРп добавляли через 1,5 часа после посева до концентрации 10"19 М. На рис. 8 показано, что 10"19 М НуРп угнетает пролиферативную активность изучаемых клеток. Это выражалось в том, что через 4-5 сутки после посева плотность клеток в опытных флаконах была достоверно ниже (р<0,01), чем в контроле. Однако оставалось неясным, не влияет ли НуРп в концентрации 10"19 М также на эффективность прикрепления клеток к ростовой поверхности. Получены данные, из которых с очевидностью следует, что, независимо от того, вводится ли НуРп сразу при посеве или через 1,5 часа после него, он одинаково подавляет размножение клеток.

Добавление

■контроль

Добавление HyFn 10(-19) М на 7-е суг (Опыт) Добавление -

HyFn или воды — Контроль, к которомудобавил и воду на 16-е сут(кв)

Контроль, к которому добавили HyFn на 16-е сут(КФ)

■■«■• Опыные флаконы, к которым добавили HyFn повторно на 16-е сут (ОФ}

10 15 20 25 30

Время после пересева, сут.

Рис.9. Влияние HyFn—в конечной концентрации 10' М на кинетику "стационарного старения" культуры клеток китайского хомячка: Контроль; Опыт -образцы, к которым добавили HyFn; КВ - контроль, к которому повторно добавили воду; КФ - контроль, к которому добавили HyFn; ОФ - опытные флаконы, к которым повторно добавили HyFn. Стрелки - добавление воды или HyFn.

В подразделе 4.6.3 приведены результаты исследования влияния HyFn на кинетику роста трансформированных фибробластов китайского хомячка и их последующей гибели в стационарной фазе роста. Добавление водного раствора HyFn для получения конечной концентрации 10'19 М к клеткам, уже находящимся в стационарной фазе роста, вызвало быструю (в течение 24 ч) гибель части клеточной популяции. Показано ускорение процесса "стационарного старения" клеточной культуры (рис. 9). Полученный результат также свидетельствует об угнетающем действии HyFn в сверхмалой концентрации на трансформированные клетки. В этом опыте клетки сеяли в стеклянные флаконы. После достижения насыщающей плотности на 7 сутки к клеткам в первый раз добавили HyFn для получения конечной концентрации 10"19 М, что привело к резкому (на 20 %) снижению плотности клеточной культуры в опытных флаконах. В последующие несколько суток в опытных флаконах процесс гибели клеток происходил быстрее, чем в контрольных флаконах. Когда на 16-е сутки к части опытных и контрольных

флаконов добавили НуРп для получения конечной концентрации 10"19 М повторно, мы обнаружили, что в тех флаконах, к которым ранее не добавляли НуРп (КФ), произошло резкое снижение плотности культуры, подобное тому, которое мы наблюдали при первом добавлении НуРп. Во флаконах, к которым добавили НуРп повторно (ОФ), также произошло снижение плотности культуры клеток настолько же, как и после первого добавления (около 20 %). В тех флаконах, к которым повторно добавили воду (КВ), значительного изменения плотности клеточной культуры не обнаружено.

Подраздел 4.6.4 содержит данные об исследовании влияния НуРп на эффективность образования колоний. Это важный параметр, показывающий сколько посеянных клеток образовали колонии. На рис. 10 показано, что в контрольных чашках Петри, к которым была добавлена вода, 64% посеянных клеток образовали колонии. Однако в опытных чашках Петри, к которым добавили НуРп, только 31% клеток образовали колонии. Это указывает на то, что НуРп в концентрации 10"19 М создает неблагоприятные условия для культивирования трансформированных клеток, угнетает их рост и возможно, препятствует прикреплению. При подсчете учитывались только колонии, состоящие из 16 и более клеток.

Подраздел 4.6.5 содержит данные об исследовании влияния НуРп на средневзвешенный номер класса колоний. Все колонии поделили на классы в зависимости от размеров. Колонии, содержащие от 1 до 15 клеток, отнесли к первому классу, 16-31 клетку - ко второму и т.д. Обнаружено, что в присутствии НуРп в концентрации 10"19 М средневзвешенный номер класса меньше, чем в контроле, что указывает на подавление пролиферативной способности клеток.

На рисунке 11 проиллюстрированы результаты, приведенные в подразделе 4.6.6 - процентная доля каждого номера класса в общем числе клеток в контрольной и опытной группах чашек Петри. Видно, что в опытных чашках Петри, к которым добавили НуРп, большую часть составляют маленькие колонии, содержащие 1-15 клеток и 16-31 клетку, а колоний, содержащих больше 96 клеток, не обнаружено совсем. При этом в контрольных чашках Петри представлены все номера классов. Это также подтверждает все полученные ранее данные о том, что НуРп подавляет рост и размножение трансформированных клеток.

й Ночтрслв П Опыт

1Э 11 12 13 14 15 16 17

Рис.10. Влияние 10" М НуРп на Рис.11. Гистограммы распределения колоний

эффективность образования по размерам.

колоний фибробластами

китайского хомячка (размер

колоний 16 и более клеток).

Приведены стандартные ошибки

среднего. Различия статистически

значимы (р < 0,01).

В Пятой главе приведено обсуждение результатов.

Практически во всех случаях инактивация белка связана с его окислением или термической денатурацией. Из обзора литературы следует, что НуРп оказывает структурирующее влияние на среду и регулирует содержание в ней свободных радикалов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что НуРп в низких и сверхнизких концентрациях оказывает выраженное стабилизирующее действие на люциферазу, щелочную фосфатазу и пероксидазу. Так как указанные ферменты относятся к различным группам энзимов, это позволяет предположить подобное неспецифическое воздействие фуллерена и на более широкий спектр ферментов. Это влияние проявляется двояко. Во-первых, : он оказывает наибольшее стабилизирующее действие на ферменты при добавлении НуРп в концентрации 10" 15 - 10"21 М к люциферазе и 10"13 - 10"15 М к пероксидазе до их термическом инактивации. С другой стороны, НуРп, добавленный к щелочной фосфатазе в концентрации 10"17 М после термической инактивации, восстанавливает ее активность. НуРп в концентрации 10"17 М, добавленный к щелочной фосфатазе до нагревания, также приводит к частичному сохранению активности. Такое действие НуРп можно объяснить как его структурирующим воздействием на водную среду,

так и, возможно, антиоксидантной (электрон-донорной) активностью, сформированных под его влиянием водных кластеров, что меняет условия реакции и характер взаимодействия белка с субстратом и кофакторами. Подробные механизмы этого влияния сейчас активно исследуются во всем мире.

При перемешивании реакционной смеси сообщается дополнительная энергия, улучшается доступ кислорода и происходит упорядочивание или разупорядочивание структуры среды, что может негативно сказываться на активности ферментов. Возможно, поэтому НуРп более явно проявляет свои структурирующие и окислительно-восстановительные качества при перемешивании. Показано, что НуРп заметно стабилизирует люциферазу и пероксидазу при перемешивании на микробиологической качалке при комнатной температуре. Вероятнее всего НуРп в малых и сверхмалых дозах способен стабилизировать ферменты благодаря структурирующему воздействию на водную среду.

Цельная кровь человека - это саморегулирующаяся гетерогенная система. Она способна генерировать и устранять АФК благодаря активной работе прооксидантных и антиоксидантных механизмов. Даже отделенная от организма, кровь достаточно продолжительное время может сохранять эти свойства. Эти свойства так или иначе связаны со свойствами белков, также подверженных денатурации, как и изучаемые нами ферменты. Кровь человека служит источником фотонов в видимой области спектра благодаря непрерывной генерации АФК аэробными клетками крови при восстановлении ими кислорода, поступающего от эритроцитов [Воейков, 2003]. Интенсивность излучения является тонким индикатором состояния крови. Нами показано, что добавление НуРп в сверхмалых концентрациях к цельной крови здоровых доноров приводит к возрастанию интенсивности хемилюминесценции. Наибольшее влияние на кровь оказывают НуРп в концентрациях 2,5x10"6, 2,5хЮ'7, 2,5х10"17 и 2,5х10~19 М. Это влияние сохраняется и усиливается в течение нескольких суток. В тех пробирках, в которые добавили НуРп в концентрациях 2,5х10"9, 2,5х10"п, 2,5x10'" и 2,5хЮ'15 М сразу после добавления НуРп не было отмечено усиления ХЛ. Оно возникает после выдерживания этих образцов в течение суток в холодильнике. Интересно, что в крови пациентов с ХОБЛ обнаружено противоположное влияние. НуРп в

сверхмалых дозах (10"17 М, 10"19 М) понижал интенсивность ЛЦ-ХЛ по сравнению с контролем. Характер влияния HyFn на ХЛ крови пациентов с ХОБЛ зависит от состояния пациентов и степени тяжести заболевания. Также мы разделили пациентов на 3 группы: пациенты с обострением ХОБЛ, получающие Гипоксен®, пациенты с вялотекущим ХОБЛ до лечения препаратом Гипоксен® и группа пациентов, прошедших лечение Гипоксеном®. Гипоксен® - это антиоксидант и антигипоксант, который снижает ЛЦ-ХЛ цельной крови. Кровь пациентов из трех групп удалось разделить на основании интенсивности ЛЦ-ХЛ. Различие между группами усилилось при добавлении HyFn в концентрациях 2,5хЮ"6 М и 2,5x10" М, и образцы можно было разделить на группы с большей уверенностью. Мы предполагаем, что добавление HyFn может стать новым диагностическим методом определения характеристик состояния пациента.

Известно, что динамика процессов с участием АФК, определяемая отношением интенсивности их генерации прооксидантными системами к скорости их устранения антиоксидантами, оказывает существенное влияние на рост, дифференцировку, старение живых клеток, их гибель за счет апоптоза [Sauer Н. et al., 2000]. В экспериментах с трансформированными фибробластами китайского хомячка в ростовой среде концентрация HyFn составила 10"19 М. Клетки уже находились в стационарной стадии роста, и HyFn вызвал быструю гибель существенной части популяции. Мы обнаружили, что в присутствии HyFn снижается пролиферативная способность клеточной культуры и эффективность образования колоний. Ингибирующее влияние растворов HyFn в сверхмалых дозах на пролиферацию и выживаемость клеток in vitro показано впервые. Более того, как уже отмечалось, многие исследования доказывают, что HyFn не проявляет токсичности даже в очень высоких дозах. Однако, если учесть, что в настоящей работе использовали трансформированные клетки, которые, как выясняется, более чувствительны к повышенной интенсивности процессов с участием АФК, чем нормальные дифференцированные клетки [Sauer et al., 2000], можно предположить, что HyFn в сверхнизких концентрациях цитотоксичен в первую очередь для трансформированных клеток. В дальнейшем представляет интерес изучить действие HyFn в более широком диапазоне концентраций не только на трансформированные, но и на нормальные клетки в культуре.

В данной работе особый акцент сделан на изучение сверхмалых доз биологически активного вещества - HyFn. Была показана нелинейная зависимость «доза - эффект» в опытах со всеми изученными ферментами и диапазоне концентраций от 10'7М до 10'23 М. В опытах с неразбавленной кровью наибольший стабилизирующий эффект обнаружен при конечной концентрации HyFn 2,5хЮ"6 и 2,5x10'" М. В промежуточных значениях эффект не столь выражен или отсутствует. Интересно, что при одних и тех же концентрациях для различных объектов, возможен как ингибирующий, так и стабилизирующий эффекты. Это явление можно объяснить с позиции изменения структурных свойств водной среды. Структура воды и водных растворов — основной объект воздействия веществ в сверхмалых концентрациях и слабых полей. Некоторые исследователи [Lo et al., 2009; Pollack, 2013] полагают, что вода— это гетерогенная субстанция, содержащая как квази-жидкокристаллические, так и неупорядоченные области. Растворение веществ в даже исчезающее малых концентрациях приводит к образованию «следов» или «дефектов», способных надолго сохраняться в этой гетерогенной системе. Другие специалисты [Бульенков, 1999] основной мишенью влияния биологически активных веществ в сверхмалых концентрациях считают водно-белковые взаимодействия, изменения которых сказываются на структуре белков и их активности. По мнению третьих [Вакс и др., 1994; Воейков, 2000], при воздействии на биологические объекты биологически активных веществ в сверхмалых дозах в воде возникают АФК, которые смещают энергетическое равновесие в системе и определяют свойства сверхмалых доз.

Было обнаружено, что в водных системах, которые представляют собой сильно и сверхсильно разбавленные растворы разнообразных биологически активных веществ, присутствуют наноассоциаты, размеры которых варьируют от долей микрон [Ямсков и др., 1999, Ryzhkina et al., 2009] до нескольких микрон [Lo et al., 2009]. Появились убедительные факты, свидетельствующие, что именно водные наноассоциаты, представляющие собой динамически активные структуры, обусловливают действие биологически активных веществ в малых и сверхмалых дозах [Belov et al., 2011]. Существующие гипотезы служат дополнением друг другу. Однако механизм формирования наноассоциатов пока неясен и для его

выяснения требуется, по-видимому, глубокий пересмотр традиционных представлений о физико-химических свойствах водных систем.

Выводы:

1. Выявлено стабилизирующее действие НуРп в малых и сверхмалых дозах (Ю-7 М - Ю-23 М) на люциферазу, пероксидазу и щелочную фосфатазу, подвергавшихся нагреванию до 80°С.

2. НуРп в сверхмалых дозах модулирует эффект окислителей, восстановителей и антиоксидантов (окисление при хранении (02), Ре2+, глицин) на ферменты.

3. НуРп в малых и сверхмалых концентрациях усиливает ЛЦ-ХЛ в крови здоровых доноров. Этот эффект обнаружен у разных индивидуумов практически в одинаковых интервалах концентраций (1С)"6 М, 10"7 М, Ю-17 М, 10'19 М). Этот эффект усиливается в течение нескольких часов и суток.

4. НуРп в сверхмалых дозах (10'17 М, 10'19 М) снижает ЛЦ-ХЛ крови пациентов сХОБЛ.

5. НуРп в концентрации 10'19 М приводит к снижению пролиферативной активности суспензии трансформированных фибробластов китайского хомячка.

6. Добавление НуРп в концентрации 10'19 М к клеткам, уже находящимся в стационарной фазе, вызвало быструю (в течение 24 ч) гибель части клеточной популяции. Показано ускорение процесса "стационарного старения" (накопления «возрастных» изменений при замедлении скорости размножения клеточной культуры).

7. В присутствии НуБп в культуре образуется больше мелких колоний и снижается эффективность образования колоний.

Результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях;

1. Воейков В. JI., Виленская Н. Д., До Минь Ха, Малышенко С. И., Буравлева Е. В., Яблонская О.И., Тимофеев К. Н. Устойчиво неравновесное состояние бикарбонатных водных систем // Журнал физической химии. 2012. Т. 86. №9. С. 1518-1527.

2. Яблонская О.И., Рындина Т.С., Воейков B.JL, Хохлов А.Н. Парадоксальное влияние гидратированного СбО-фуллерена в сверхнизкой концентрации на жизнеспособность и старение культивируемых клеток китайского хомячка // Вестник Московского Университета. Серия 16. Биология. 2013. № 1. С. 10-16.

3. Рындина Т.С., Яблонская О.И., Воейков B.JL, Хохлов А.Н. Парадоксальные цитотоксические и геропромоторные свойства воды, модифицированной растворенным в ней СбО-фуллереном, выявленные в экспериментах на культивируемых клетках // Клиническая геронтология: научно-практический журнал. 2012. № 11-12. С. 23-28.

4. Yablonskaya O.I., Ryndina Т. S., Voeikov V. L., and Khokhlov A. N. Paradoxal effect of hydrated C6o fullerene in an ultralow concentration on the viability and aging of cultivated Chinese hamster cells // Moscow University Biological Sciences Bulletin. 2013. V. 68. № 2. P. 63-68.

5. Novikov K.N., Berdnikova N.G., Novikov A.K., Lyusina O.Y., Muhitova O.G., Yablonskaya O.I., Minh H.D., Voeikov V.L. Changes in chemiluminescence of whole blood of COPD patients treated with Hypoxen® and effects of C60 fullerenes on blood chemiluminescence // Med Sci Monit. 2012. V. 18. № 2. BR76-83.

6. Novikov K.N., Yablonskaya O.I., Berdnikova N.G., Novikov A.K., Bouravleva E.V., Voeikov V.L. Modulation of luminescence intensity of whole nondiluted human blood by hydrated fullerenes in ultra-low doses // Luminescence. 2012. V 27. № 2. P. 148-149. (17th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence - ISBC 2012).

7. Yablonskaya О. I., Voeikov V.L., Vilenskaya N.D., Malishenko S.I., Novikov K.N. Effects of hydrated fullerenes on the luminescence of bacterial luciferase, of whole blood and of bicarbonate water solutions // Luminescence. 2012. V 27. № 2. P. 175. (17th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence - ISBC 2012).

8. До Минь Ха, Виленская Н.Д., Малышенко С.И., Яблонская О.И., Воейков B.JI., Андриевский Г.В. Влияние гидратированных фуллеренов в сверхмалых дозах на щелочную фосфатазу и пероксидазу in vitro II IV Международный симпозиум «Механизмы действия сверхмалых доз»: Тезисы докладов. 28-29 октября 2008 г. М.: РУДН, 2008. С. 34-35.

9. Новиков К.Н., Бердникова Н.Г., Новиков А.К., Люзина О.Ю., Мухитова О.Г., Яблонская О.И., До Минь Ха, Воейков ВЛ. Оценка клинико-фармакологического действия Гипоксена® на больных с ХОБЛ по хемилюминесценции цельной крови в присутствии гидратированных С60 фуллеренов // Тезисы Международного научного Конгресса «Наука, информация, сознание». Санкт-Петербург, 29 июня-1 июля, 2011. С. 33-34.

10. Рындина Т.С., Яблонская О.И., Воейков B.JI., Хохлов А.Н. Парадоксальные цитотоксические _ и геропромоторные свойства воды, модифицированной растворенным в ней СбО-фуллереном, выявленные в экспериментах на культивируемых клетках // XVII Международная научно-практическая конференция "Пожилой больной. Качество жизни". 8-9 октября 2012 г. Москва.

11. Хохлов А.Н., Рындина Т.С., Яблонская О.И., Воейков В.Л. Обнаружение цитотоксических и геропромоторных свойств воды, модифицированной растворенным в ней СбО-фуллереном, в экспериментах на трансформированных культивируемых клетках // Третий съезд геронтологов и гериатров России. 24-26 октября 2012. Новосибирск, Россия.

12. Яблонская О.И., Воейков В.Л. Влияние гидратированных фуллеренов в сверхмалых дозах на стабильность ряда ферментов и на флуктуации их активности // «Биоантиоксидант»: Тезисы докладов VIII Международной конференции. Москва. 4-6 октября 2010 г. М.: РУДН, 2010. С. 534-536.

13. Яблонская О.И., Воейков В.Л. Влияние гидратированных фуллеренов на активность ферментов // Тез. конференции «Ломоносов-2010». 12-15 апреля 2010 г. МГУ, Москва. С. 165.

14. Яблонская О.И., Воейков В.Л. Влияние гидратированных фуллеренов С60 на активность ферментов // Сборник материалов. III Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии "Медицинская физика — 2010". 21-25 июня 2010 г. Москва. Т. 3. С. 311-313.

15. Яблонская О.И., Воейков В.Л. Влияние сверхнизких концентраций гидратированных фуллеренов на флуктуации активности ферментов // Материалы Международного научного Конгресса «Наука — информация -сознание» (Биоэлектрография). 3-4 июля, 2010 г. Санкт-Петербург. С. 279281.

16. Яблонская О.И., Новиков К.Н., Новиков А.К., Буравлева Е.В., Воейков В.Л. Модуляция дыхательной активности цельной крови человека гидратированными фуллеренами в сверхмалых дозах // Сборник материалов. IX Международная крымская конференция «Космос и биосфера». Алушта, Крым, Украина. 10-15 октября 2011. С. 15-18.

17. Khokhlov A.N., Ryndina T.S., Yablonskaya O.I., Voeikov V.L. A paradoxical effect of hydrated C60-fullerene at ultra-low concentration on the viability and "stationary phase aging" of cultured cells // Тезисы докладов. Малые дозы. Международная научная конференция. Гомель, Беларусь. 26-28 сентября 2012 г. С. 56.

18. Yablonskaya O.I., Ryndina T.S., Khokhlov A.N., Novikov K.N., Voeikov V.L. Effect of ultra-low concentrations of hydrated fullerene C«, on whole human blood and on cultured Chinese hamster cells. VI International Congress "Low and Superlow Fields and Radiations in Biology and Medicine" Saint-Petersburg, 02-06.07.2012. Sci proceedings of the Congress. P. 79.

19. Yablonskaya O.I., Ryndina T.S., Voeikov V.L., Khokhlov A.N. Effect of hydrated C60-fullerene at ultra-low concentration on the growth and «stationary phase aging» of cultured Chinese hamster cells // Тезисы докладов. X Международный симпозиум «Биологические механизмы старения». 16-19 мая, 2012 г. Харьков, Украина. С. 35.

?

Подписано в печать: 17.04.2013 Тираж: 100 экз. Заказ №989 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект д.74 (495)790-47-77 www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Яблонская, Ольга Игоревна, Москва

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ

М. В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет Кафедра биоорганической химии

На правах рукописи

04201356915

Яблонская Ольга Игоревна

ВЛИЯНИЕ ГИДРАТИРОВАННОГО ФУЛЛЕРЕНА С60 В ШИРОКОМ ДИАПАЗОНЕ КОНЦЕНТРАЦИЙ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ

03.01.02 Биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

Проф., д.б.н. Воейков Владимир Леонидович

2013

Содержание

Содержание 2

Список сокращений 5

1. Введение

1.1. Актуальность работы 6

1.2 .Цель работы 9

1.3. Задачи исследования 9

1.4. Научная новизна исследования 10

1.5. Практическая значимость 11 1.6.Основные положения, выносимые на защиту 11 1.7. Публикации 12

2. Обзор литературы по теме

2.1.Строение и свойства фуллерена

2.1.1. Структура фуллерена 13

2.1.2. Получение фуллеренов 14

2.1.3. Химия фуллерена 15

2.2.Истинные растворы гидратированного фуллерена Сбо (HyFn)

2.2.1. Метод получения HyFn 17

2.2.2. Особенности свойств водной оболочки HyFn 19

2.2.3. Биологическая активность HyFn 2 3

2.3.Сверхнизкие концентрации биологически активных веществ. Практические наблюдения и теоретические механизмы действия 26

2.4. Ферменты

2.4.1. Бактериальная люцифераза 31

2.4.2. Пероксидаза 34

2.4.3. Щелочная фосфатаза 35

2.5.Свободно-радикальные процессы в неразбавленной крови человека

2.5.1. Понятие активных форм кислорода (АФК) 3 7

2.5.2. Роль АФК в физиологических процессах 38

2.5.3. Хемшпоминесценция как метод определения свободных радикалов 40

2.5.4. Люцигенин-зависимая ХЛ клеток и тканей 42

2.5.5. Роль АФК в патогенезе ХОБЛ 45

2.6.Клеточные модели как ключ к пониманию механизма

детерминации продолжительности жизни 46

2.7.Заключение: взаимосвязь НуБп и АФК при воздействии на

ферменты, цельную кровь и культуру клеток 48

Материалы и методы исследования

3.1.Реактивы 50

3.2.Методы 52 4. Результаты исследования

4.1. Характеристика водного раствора фуллерена 64

4.2.Люцифераза

4.2.1. Изучение влияния НуБп в различных концентрациях ня активность люциферазы 65

4.2.2. Изучение влияния растворов НуБп на активность люциферазы после однократного воздействия высокой температуры 69

4.2.3. Изучение ферментативной активности люциферазы в глициновом буфере 70

Л I

4.2.4. Изучение влияния Бе на активность люциферазы в присутствии НуБп 73

4.2.5. Изучение влияния перемешивания на ферментативную активность люциферазы в присутствии НуРп 74

4.3.Щелочная фосфатаза

4.3.1. Изучение влияния растворов НуБп на активность

щелочной фосфатазы после ее нагревания 75

4.3.2. Изучение влияния условий хранения на срок хранения

НуБп 77

4.3.3. Изучение влияния НуБп на активность щелочной фосфатазы при умеренной температуре 78

4.4.Пероксидаза

4.4.1. Влияние воздействия высокой температуры на активность пероксидазы в присутствии НуБп 81

4.4.2. Исследование влияния перемешивания на активность пероксидазы в присутствии НуРп 82

4.5.Неразбавленная кровь человека

4.5.1. Изучение влияния НуРп на кровь здоровых доноров 84

4.5.2. Исследование влияния НуРп на кровь пациентов с ХОБЛ 87

4.6.Клетки

4.6.1. Изучение влияния автоклавирования на свойства НуРп 90

4.6.2. Определение цитотоксических или митогенных свойств НуРп 91

4.6.3. Изучение влияния НуРп на кинетику роста клеток и их последующей гибели в стационарной фазе роста 93

4.6.4. Исследование влияние НуРп на эффективность образования колоний клеток 95

5. Обсуждение результатов 98

6. Выводы 106

7. Литература 107

Благодарности 131

Список сокращений

АФК - активные формы кислорода БАВ - биологически активное вещество ЗМ - зимозан ЛМ-люминол

ЛМ-ХЛ - люминол-зависимая хемилюминесценция ЛЦ - люцигенин

ЛЦ-ХЛ - люцигенин-зависимая хемилюминесценция

СМД - сверхмалая доза

СМК - сверхмалая концентрация

СОД - супероксиддисмутаза

ХЛ - хемилюминесценция

ХОБЛ - хроническая обструктивная болезнь легких ЭВС - электронно-возбужденное состояние

- (англ. Ехскшои^опе) пограничная область НуБп - (англ. Нуёга1есШи11егепе) гидратированный фуллерен

1. Введение

1.1 Актуальность работы

Фуллерены (Сбо, С70 и т.д.) являются одной из аллотропных форм углерода. Молекула фуллерена состоит из атомов углерода, при этом каждый атом образует связи с тремя соседними атомами [Сидоров и др., 2005]. Наиболее стабильный изомер Сбопроявляет свойства ненасыщенного полиалкена, содержит одинарные и двойные связи и имеет структуру усеченного икосаэдра.

Рис. 1. Компьютерная модель фуллерена Сбо-Исследователи, открывшие фуллерен Сбов 1985 году (H.W. Kroto, R E. Smally, R.F. Curl), уже в 1996 году были удостоены присуждения Нобелевской премии [Kroto et al., 1985]. В настоящее время во всем мире уделяется самое пристальное внимание перспективам применения фуллеренов в физике, в химии, в современных технологиях и, особенно, в области нанобиотехнологии и медицины.

Является общепринятым, что фуллерен практически не растворим в воде (его растворимость <10 9мг/л) [Ruoff et al., 1993;Heymann, 1996]. В 1995 году без использования каких-либо солюбилизаторов и специальной химической модификации была получена устойчивая композиция фуллерена и воды, получившая название гидратированного фуллерена Сбо (HyFn). Эта композиция соответствует всем характеристикам истинного раствора, и концентрация Сбов нем достигает 2,0 мг/мл и более [Andrievsky et al., 1995].

Подобные растворы являются высокостабильными и могут храниться годами без изменения своих свойств. Было выяснено, что HyFn является прочным молекулярно-коллоидным раствором, проявляющими донорно-акцепторные свойства [Ma and Bouchard, 2009]. В литературе они также обозначаются как Сб0*(Н2О)п.

Гидратированный фуллерен - это молекула Сбо-фуллерена, окруженная оболочкой молекул воды и образующая истинные водные растворы. HyFn обладает широким спектром биологического действия как in vivo и in vitro, не проявляя при этом признаков токсичности. Исследования биологической активности HyFn и его химически модифицированных аналогов показали, что они обладают антивирусным, антиамилоидным, антиаллергическим, противоопухолевым, гепатопротекторным,

антиатеросклеротическим действием, стимулируют иммунитет и противостоят накоплению возрастных патологий [Andrievsky et al, 2005; Bakry et al, 2007; Baati et al, 2012]. Считается, что терапевтический эффект шунгита и Марциальных вод Карелии объясняется именно за счет присутствия в них нативных фуллеренов в гидратированном состоянии [Раков, М.: Логос, 2009].

HyFn обладает своеобразными свойствами - с одной стороны, его можно рассматривать как сильный акцептор электронов, антиоксидант, с другой -как активатор кислорода, т.е. прооксидант. Учитывая, что молекула Сбо проявляет слабую химическую активность, а в составе HyFn она заключена в водную оболочку, можно предположить, что весь спектр действия HyFn можно объяснить особыми свойствами водных оболочек, формируемых вокруг молекул Сбо Появились также свидетельства того, что HyFn в сверхмалых концентрациях может влиять на биохимические процессы [Andrievsky et al, 2010] и свободно-радикальные реакции, протекающие in vitro. HyFn подавлял образование ОН*-радикалов, образующихся при радиолизе воды, причем в расчетной концентрации HyFn 10" М скорость

устранения ОН*-радикалов была в 20 ООО раз выше, чем при его концентрации 10"6 М [Andrievsky et al., 2009].

Поскольку HyFn положительно влияет на биологические процессы in vivo, представляло интерес более детальное его изучение на разнородных модельных биологических системах in vitro. В данной работе мы использовали ферменты, так как изменение их активности является удобным показателем наличия биологической активности HyFn. Использовали бактериальную люциферазу, щелочную фосфатазу и пероксидазу. Во всех рассмотренных ферментативных реакциях важную роль играет образование и поглощение активных форм кислорода (АФК) в ходе этих реакции. Поэтому их активность зависит от соотношения АФК и интенсивности свободно-радикальных процессов в реакционной среде. Мы предположили, что добавление HyFn, регулятора окислительно-восстановительных процессов, может повлиять на активность ферментов.

Поскольку фуллерены оказывают выраженное влияние на широкий спектр физиологических процессов в организме, представляло интерес исследовать их действие в широком диапазоне концентраций на окислительно-восстановительные процессы, протекающие в неразбавленной крови человека. Неразбавленная кровь - это сложная многокомпонентная система, способная сохранять свои физиологические свойства в течение длительного времени после изъятия из организма. Так как свойства крови во многом связаны с выделением и поглощением АФК в результате свободно-радикальных процессов [Voeikov et al., 2001], она оказалась незаменимой тест-системой для изучения свойств HyFn. Также изучили влияние HyFn в тех же концентрациях на кровь пациентов с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ). При ХОБЛ происходит усиление процессов воспаления в бронхолегочной системе и повреждение легочной ткани. При этом важную роль играет «окислительный стресс», к которому приводят высокий уровень АФК, либо несостоятельность собственных механизмов антиоксидантной защиты [Федосеев, 1998]. Таким образом, к настоящему

времени получены данные, позволяющие говорить о несомненно важной роли АФК в патогенезе ХОБЛ.

Также в настоящей работе мы исследовали влияние водного раствора Ну1Рп на рост и "стационарное старение" (накопление "возрастных" изменений клеток при замедлении скорости размножения в пределах одного пассажа и дальнейшем их пребывании в стационарной фазе роста) трансформированных культивируемых фибробластов китайского хомячка. Конечная расчетная концентрация НуБп в ростовой среде составляла 10"19 М. Скорость роста и старения изучали на модели стационарного старения [Прохоров и Хохлов, 1989]. Культура трансформированных клеток - это удобная тест-система для данного исследования, так как она чувствительна к изменению АФК и интенсивности свободно-радикальных процессов. АФК являются естественными биорегуляторами в нормальных физиологических условиях.

1.2 Цель работы

Исследовать влияние НуБп в широком диапазоне концентраций

-6 23

(1x10-° М - 1x10-" М) на различные биологические объекты: ферменты, неразбавленную кровь человека и трансформированные клетки китайского хомячка.

1.3 Задачи исследования

1. Изучить влияние НуБп в широком диапазоне концентраций на активность бактериальной люциферазы, щелочной фосфатазы и пероксидазы в условиях продолжительного хранения и при термической инактивации. Изучить сроки и условия хранения растворов НуРп в низких концентрациях.

2. Изучить влияние НуБп в широком диапазоне концентраций на люцигенин-зависимую хемилюминесценцию (ЛЦ-ХЛ) неразбавленной крови

человека. Сравнить это влияние на кровь здоровых доноров и пациентов с ХОБЛ.

3. Изучить влияние ПуБп в сверхнизкой концентрации на трансформированные клетки китайского хомячка. Оценить влияние на скорость роста культуры клеток и на скорость старения.

1.4 Научная новизна

Впервые изучено защитное влияние НуРп в широком диапазоне

7 23

концентрации (10" М - 10"" М) на бактериальную люциферазу, щелочную фосфатазу и пероксидазу в условиях термической и окислительной денатурации. НуБп в сверхмалых концентрациях модулирует эффект окислителей, восстановителей и антиоксидантов (окисление, Бе2+, глицин) на ферменты. Определены сроки и условия хранения НуБп.

Впервые изучено стабилизирующее влияние НуГп в низких и сверхнизких концентрациях (10"6 М, 10"7 М, 10"17 М, 10~19 М) на ЛЦ-ХЛ неразбавленной крови человека в течение нескольких суток. Показано, что НуБп в этих концентрациях снижает интенсивность ЛЦ-ХЛ крови пациентов с ХОБЛ. Влияние НуРп на кровь пациентов с ХОБЛ зависит от степени тяжести заболевания.

Впервые было изучено воздействие НуБп на скорость роста культуры трансформированных клеток китайского хомячка. Показано снижение скорости пролиферации культуры клеток, усиление гибели культуры и снижение эффективности образования колоний клетками в присутствии НуБп.

/Г п л

Впервые обнаружено, что НуБп в концентрациях 10"°М, Ю-' М, 10'" М, Ю-17 М и 10~19 М оказывает наиболее выраженное неспецифическое влияние на разные биологические объекты. В частности, он стабилизирует активность изученных ферментов, способствует длительному сохранению

активности; стабилизирует интенсивность ЛЦ-ХЛ неразбавленной крови человека и ускоряет гибель культуры трансформированных клеток.

1.5 Практическая значимость

Работа вносит определенный вклад в понимание характера воздействия НуРп на разные биологические объекты в диапазоне малых и сверхмалых доз, что даст возможность установить механизм и принцип его действия с учетом низкой химической активности собственно Сбо-

Лабораторные исследования других авторов показали, что НуРп обладает терапевтическими свойствами, оказывая антибактериальное, гепатопротекторное, противовирусное, нейропротекторное и другие эффекты. Предполагается, что это влияние НуРп связано с его способностью модулировать свободно-радикальные процессы в живых системах, которые играют важную роль в регуляции жизнедеятельности. Обнаруженное в настоящей работе стабилизирующее влияние НуРп в сверхмалых дозах на ферменты представляет практический интерес для его использования в качестве консервирующего агента. Противоположный отклик крови здоровых доноров и больных ХОБЛ на введение в кровь НуРп позволяет рассмотреть возможность использования его для диагностических и терапевтических целей. Результаты данного исследования могут быть использованы в курсах лекций по биофизике и клеточной биологии.

1.6 Основные положения, выносимые на защиту

1. НуРп оказывает стабилизирующее действие на ферменты, предохраняя их от термической и окислительной инактивации.

2. НуРп в определенных концентрациях усиливает интенсивность ЛЦ-ХЛ неразбавленной крови человека, причем этот эффект не обнаружен на крови пациентов с ХОБЛ. Добавление НуРп снижает дисперсию показателей хемилюминесценции крови в группах пациентов с разной

тяжестью течения заболевания, поэтому может служить диагностическим методом.

3. НуБп подавляет пролиферацию трансформированных клеток, а также ускоряет их гибель.

4. НуБп оказывает все вышеперечисленные эффекты на биологические объекты в малых и сверхмалых концентрациях. Это указывает на то, что его про- и антиоксидантная активность опосредована воздействием на водную среду этих объектов.

1.7 Публикации

По материалам диссертации опубликовано 19 печатных работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах, (1 из которых продублирована в переведенном на английский язык издании), входящих в Перечень ВАК, 1 статья в рецензируемом зарубежном журнале, 2 статьи в сборниках трудов международных конференций, 12 тезисов докладов, представленных на российских и международных конференциях.

2. Обзор литературы по теме 2.1. Строение и свойства фуллерена

2.1.1. Структура фуллерена

Фуллерены - это одна из аллотропных форм углерода. Молекула фуллерена состоит из атомов углерода, при этом каждый атом образует связи с тремя соседними атомами [Сидоров и Макеев, 2000]. Фуллерен Сбо, наиболее легко образующееся стабильное соединение среди известных фуллеренов, получил название «Бакминстерфуллерен», имеет форму усеченного икосаэдра и напоминает футбольный мяч [Сидоров, 2005; Kroto et al, 1985; Fowler and Manolopoulos, 1995].

Безводные фуллерены Сбо представляют собой твердое вещество или порошок черного цвета без запаха. Они легко растворяются в неполярных растворителях, таких как бензин и хлороформ. Такие растворы имеют красно-коричневую окраску [Юровская, 2000].

Молекулы фуллерена устойчивы к высоким температурам. Структура теряет свою упорядоченность только при 1100°С. При ~527°С с поверхности твердого вещества начинается испарение [Сидоров, 2000].

Согласно данным рентгеноструктурного анализа, диаметр молекулы Сбо ~ 7.2 А, длина связи (6,6) и (6,5) - 1,386 и 1,434, соответственно [Сидоров, 2005, Мастеров, 1997]. Все шестьдесят атомов в молекуле Сбо эквивалентны, что подтверждается наличием в спектре ЯМР С только одного сигнала при 720 amu (atomic mass units). Среднее расстояние С-С в Сбо (1,44 А) близко к расстоянию С-С в графите (1,42 A) [Fowler and Manolopoulos, 1995]. Кристаллическая решетка мягкая и может сжиматься [Раков, М.: «Логос», 2006].

л

В углеродном каркасе атомы С характеризуются sp -гибридизацией, причем каждый атом углерода связан с тремя ближайшими к нему атомами [Сидоров и др. М.:«Экзамен», 2005]. Каждый атом углерода участвует в

образовании р-связей и обладает валентностью 4. Предполагается, что р-связи могут быть частично делокализованы. Но так как в молекуле фуллерена есть и двойные и одинарные связи, его принято рассматривать как полиалкен [Кнорре и Мызина. М.: Высшая школа, 2000].

2.1.2. Получение фуллеренов

Фуллерены встречаются в природе. Они обнаружены в космосе в межзвездном пространстве, в составе метеоритов, в местах попадания молнии, в составе вулканической лавы и вулканических пород. Небольшое количество фуллере