Влияние красного пигмента дрожжей, продукта полимеризации аминоимидазол риботида, на амилоиды in vivo и in vitro

Михайлова, Екатерина Вячеславовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние красного пигмента дрожжей, продукта полимеризации аминоимидазол риботида, на амилоиды in vivo и in vitro
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Влияние красного пигмента дрожжей, продукта полимеризации аминоимидазол риботида, на амилоиды in vivo и in vitro"

На правах рукописи

Михайлова Екатерина Вячеславовна

ВЛИЯНИЕ КРАСНОГО ПИГМЕНТА ДРОЖЖЕЙ, ПРОДУКТА ПОЛИМЕРИЗАЦИИ АМИНОИМИДАЗОЛ РИБОТИДА, НА АМИЛОИДЫ IN

VIVO И IN VITRO

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат ^ ^ MAP

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005014892

Санкт-Петербург 2012

005014892

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт цитологии Российской академии наук

Научный руководитель: доктор биологических наук

Сойдла Тыну Рихович Институт цитологии РАН

Официальные оппоненты: Журавлева Галина Анатольевна,

доктор биологических наук, профессор Биолого-почвенный факультет Санкт-Петербургского государственного университета

Маргулис Борис Александрович,

доктор биологических наук Институт цитологии РАН, ведущий научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук

Защита диссертации состоится «23» марта 2012 года в 12 часов на заседании Диссертационного совета Д002.230.01 на базе Института цитологии РАН по адресу:

194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий проспект, д.4 e-mail: cellbio@mail.cytspb.rssi.ru Сайт: http://www.cytspb.rssi.ru Факс: 8(812)297-35-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан «22» февраля 2012 года.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Е.В. Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Существует ряд заболеваний человека и животных, диагностическим признаком которых является отложение в тканях амилоидов - фибриллярных образований, обогащенных p-структурами. Морфологически амилоиды представляют собой линейные неразветвленные фибриллы длиной до нескольких микрометров и диаметром 10-20 нм, состоящие из отдельных протофиламентов. Для амилоидов характерны общие биохимические свойства: амилоидные фибриллы устойчивы к действию высокой температуры, денатурирующих агентов и к некоторым протеазам (химотрипсину и протеиназе К), а их способность специфически связывать некоторые низкомолекулярные соединения (Конго красный и тиофлавин Т) широко используется для наблюдений за динамикой образования амилоидов в системе in vitro и в тканях млекопитающих (Herczenik, Gebbink, 2008).

При некоторых заболеваниях, например, болезнях Альцгеймера, Гентингтона, Паркинсона, говорят о корреляции между образованием амилоидов и развитием дегенеративных изменений некоторых типов клеток головного мозга, приводящим к нарушениям когнитивных функций и функций нервно-мышечной системы. Более того, в ряде случаев белок в амилоидной форме, передаваясь между особями одного вида и даже между видами, является непосредственной причиной возникновения тяжелых заболеваний центральной нервной системы у человека и животных. Эти амилоиды, представляющие собой инфекционные агенты белковой природы, получили название прионов (Wickner et al, 2008).

В качестве модельной системы для изучения амилоидозов и прионных болезней млекопитающих широко используются штаммы Saccharomyces cerevisiae, работа с которыми позволяет применять большой набор методов молекулярной биологии и биохимии (Xue et al., 2010). У этого вида найдено несколько собственных белков, способных к прионизации, среди которых одним из наиболее изученных является [/'5/+]-фактор - прионная форма белка Sup35. Переход большей части этого белка в амилоидные агрегаты приводит к увеличению прочитывания нонсенс кодонов, что легко отследить по изменению фенотипа. Клетки, в которых прионное состояние Sup35 самовоспроизводится и не воспроизводится, названы [PS7*] и [ртГ] соответственно (Chernoff, 2004).

В настоящее время эффективных терапевтических подходов к лечению заболеваний, связанных с амилоидами, не разработано (Charveriat et al., 2009), поэтому изучение молекулярного механизма амилоидогенеза, а также поиск новых факторов, способных влиять на образование амилоидов и предотвращать цитотоксическое действие как уже сформированных амилоидных фибрилл, так и промежуточных продуктов амилоидогенеза - «олигомеров», кажутся оправданными и необходимыми.

полимера, образующегося в клетках дрожжей S. cerevisiae при некоторых мутациях в пути биосинтеза аденина и придающего колониям дрожжевых клеток характерный красный цвет, поэтому этот полимер получил название «красный пигмент» (Smiraov et al., 1967).

Мы предположили, что наличие в клетке этого производного имидазола либо напрямую, либо опосредованно, за счет усиления активности защитных систем клетки, может приводить к уменьшению количества прионов и других амилоидов, делая красный пигмент дрожжей-сахаромицетов перспективной основой для создания противоамилоидных препаратов.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение влияния красного пигмента, продукта полимеризации аминоимидазол риботида, на образование амилоидных фибрилл в клетках Saccharomyces cerevisiae и in vitro.

Задачи исследования:

1. Получение и анализ изогенных штаммов S. cerevisiae, отличающихся накоплением красного пигмента.

2. Сравнение количества агрегированных белков в лизатах, выделенных из полученных штаммов.

3. Выявление и анализ у полученных штаммов изменений количества [PS1*] фактора - амилоидной формы белка 5ир35.

4. Оценка общего количества амилоидных структур в полученных штаммах, по интенсивности флуоресценции красителя тиофлавина Т.

5. Идентификация белков, агрегация которых зависит от наличия в клетках штамма красного пигмента.

6. Выявление и анализ действия красного пигмента, полученного из клеток S. cerevisiae, на амилоидизацию инсулина и лизоцима in vitro.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Образование в клетках дрожжей красного пигмента снижает количество агрегированных белков и амилоидов в клетках дрожжей.

2. Присутствие в клетках дрожжей красного пигмента приводит к снижению количества [Р5/+]-фактора.

3. Идентифицированы 48 белков, присутствие которых во фракции агрегированных белков зависит от наличия красного пигмента в клетке. К этим пигмент-зависимым белкам относятся шапероны, а также белки, вовлеченные в метаболизм глюкозы, в стрессовый ответ и в процессы трансляции и протеолиза.

4. Присутствие в системе in vitro красного пигмента приводит к торможению роста амилоидов инсулина.

5. Предложен механизм действия красного пигмента in vivo, который состоит в связывании красного пигмента с амилоидными фибриллами, что приводит к снижению доступности этих участков для факторов, участвующих в амилоидогенезе.

Научная новизна полученных результатов

Предложен метод сравнительной количественной оценки содержания амилоидов в клетках с использованием красителя тиофлавина Т.

Впервые показано, что продукт полимеризации аминоимидазол риботида - красный пигмент - вызывает уменьшение количества [РЗУ^-фактора в клетках дрожжей.

Впервые показано, что красный пигмент снижает скорость роста амилоидов инсулина in vitro.

Теоретическое и практическое значение работы.

В работе показано наличие большого количества белков, которые связаны с амилоидами только при отсутствии в клетках красного пигмента. Идентификация этих белков позволила разделить их на 4 основных группы в соответствии с выполняемыми функциями: шапероны, ферменты метаболизма глюкозы, белки, участвующие в клеточном ответе на окислительный стресс, и белки, участвующие в процессах трансляции и протеолиза. Эти данные вносят вклад в понимание механизмов, связанных с деградацией амилоидных структур и с образованием сложных комплексов с растворимыми белками прионами и амилоидами в дрожжевой клетке.

Данные, свидетельствующие о влиянии красного пигмента на образование амилоидных фибрилл в системе in vitro и in vivo, могут служить основой для дальнейших исследований возможности применения полимера аминоимидазол риботида или его производных для лечения заболеваний, связанных с образованием амилоидов. В частности, наши данные о снижении количества приона [PSY4] в клетках в присутствии красного пигмента позволяют предлагать дальнейшее изучение возможностей применения этого соединения для лечения прионных инфекций.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на школе-конференции "Bioinformatics and systems biology" (Новосибирск, 2010), на V российском симпозиуме "Белки и пептиды" (Петрозаводск, 2011), на VI Петербургской встрече лауреатов Нобелевской премии «Наука и общество: Физиология и медицина XXI века» (Петербург, 2011).

Финансовая поддержка работы

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта российского фонда фундаментальных исследований (проект 09-04-00750а).

Работа выполнена с использованием научного оборудования ЦКП "Аналитический центр нано- и биотехнологий ГОУ СПбГПУ".

Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 работ: статьи в рецензируемых журналах - 4, статьи в сборниках научных работ - 1, тезисы докладов - 3.

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, глав «Материалы и методы», «Результаты и обсуждения», выводов, списка цитируемой литературы и трех приложений. Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, содержит 26 рисунков и 8 таблиц.

Материалы и методы исследований Штаммы. Основные штаммы дрожжей Басскаготусея сеге\>1х1ае, использованные в работе, указаны в таблице 1.

Таблица 1.

Название штамма Генотип и плазмотип Источник

LL20 МАТ а 1еи2 his3 JI.H. Миронова и Г.А. Журавлева, кафедра генетики СПбГУ

74-D694 сокр.: 74-D MATa adel-14 ura3 his3 trpl leu 2 [PSI\,cAPJN+] JI.H. Миронова и Г.А. Журавлева

74-D694/Gul сокр.: 74-D/Gu MATa adel-14 ura3 his3 trpl leu 2 \psi pin] JI.H. Миронова и Г.А. Журавлева

ОТ56 MATa adel-14 ura3 his3 trpl leu 2 [PSfsUons Pitt] JI.H. Миронова и Г.А. Журавлева

АН/В сокр.: В MATa adel-14 ura3 his3 lys9 karl [psi~pin] A.C. Борхсениус, кафедра генетики СПбГУ

GT26 MATa aro7-l cysl-72 his4-166 leu2-l lys2-187 met8-l trp5-48 ura3-l \PSfPIbt] Ю.О. Чернов, Технологический институт штата Джорджия, Атланта, США

GT27 MATa aro7-l cysl-72 his4-166 leu2-l lys2-187 met8-l trp5-48 ura3-l [psT piii] Ю.О. Чернов

168tester coKp.:168t MAT a his5 [PSI'] Т.С. Карпова, Национальный институт рака, Бетесда, США

YTK79 сокр.: YTK MA Та игаЗ 1еи2 his3 îrpl lys2 Т.С. Карпова

К5-13 сокр.: К-13 MATa his5 karl-l[PSt] Б.Ф.Яровой, ПИЯФ, Санкт-Петербург

К5-5А сокр.: К-5 MAT a his4 ade2 karl-1 [pif] Б.Ф. Яровой

Методы. Цитодукцию проводили в соответствии с работой (Zakharov, Yarovoy, 1977) с некоторыми изменениями: зиготы, а затем их первые почки изолировали с помощью микроманипулятора, выращивали на полной питательной среде YEPD в течение 2-3 дней, после чего тестировали на соответствующих селективных средах.

Лизаты клеток сравниваемых штаммов получали механическим разрушением клеток и центрифугированием при 100 g в течение 5 мин. Для получения фракции осадочных белков, обогащенной амилоидами и другими агрегатами, лизаты выравнивали по количеству белка и центрифугировали при 1000 g в течение 30 мин. Полученные осадки проводили через ряд дополнительных обработок. Для разделения белков в агарозном геле осадки однократно обрабатывали PB S (150 мМ NaHCl, 25 мМ Na2HP04-NaH2P04> рН 7,4). Перед разделением методом SDS-PAGE осадки обрабатывали 8М мочевиной, затем дважды PBS и три раза 2 %-ным раствором SDS в PBS при 37 °С, чтобы избавиться от неприоновых белковых агрегатов и удалить слабо ассоциированные белки из агрегатов прионов (Kryndushkin et al., 2003).

Экстракцию белков из осадков выполняли в буферном растворе (0,15 M Tris-HCl, рН 6,8, 2 % SDS, 50 мМ DTT) в течение 15 мин при 37 °С. Для разрушения агрегатов пробы 10 мин выдерживали при 100 °С и центрифугировали при 1000 g в течение 5 мин.

Для разделения агрегированных белков использовали электрофорез в горизонтальной системе в агарозном геле, содержащем 0,1 % SDS (SFR agarose, Amresco, США) в условиях, указанных в работе (Bagriantsev et al., 2006). При работе с белками использовали метод электрофореза в денатурирующих полиакриламидных гелях (SDS-PAGE) (Laemmli, 1970). Двумерное электрофоретическое разделение белков включало 2 стадии: изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) с последующим разделением в SDS-PAG. ИЭФ выполняли в 18 см Immobiline™ DryStrip геле, рН 3—10, с использованием системы Ettan IPGphor II IEF (GE Helthcare, Великобритания). Образцы растворяли в 350 мкл стандартного ИЭФ буфера (8 M мочевина, 2 % CHAPS, 2

% ИЭФ буфер, рН 3—10, 1,2 % DeStreak реагент). Последующее разделение по молекулярному весу осуществляли в 15%-ном SDS-PAG.

Для определения белков, присутствие которых в осадочной фракции зависит от наличия в клетках красного пигмента, использовали масс-спектрометрию. Идентификацию белков осуществляли при помощи программы Mascot (www.matrixscience.com). Поиск по «пептидному фингерпринту» проводили в базе данных NCBI среди белков всех организмов.

Измерение интенсивности флуоресценции (ИФ) тиофлавина Т измеряли при длинах волн возбуждения и эмиссии 435 и 486 нм соответственно, на флуоресцентном спектрофотометре Сагу Eclipse (Varian Inc., США).

Для выделения из клеток и очистки от примесей красного пигмента использовали схему, предложенную Смирновым (Smirnov et al., 1967). Для получения амилоидных фибрилл in vitro выбрали белки инсулин и лизоцим.

Получение фибрилл инсулина осуществляли следующим образом: раствор бычьего инсулина (Sigma, США) с концентрацией 2 мг/мл в буфере, содержащем 20 % СН3СООН и 100 мМ NaCl (рН 2.0), выдерживали в течение 24 ч при температуре 37 °С и постоянном перемешивании. Получение фибрилл лизоцима осуществляли, как описано в работе (Pepys et al., 1993). Когда оценивали влияние красного пигмента на формирование фибрилл, в растворы добавляли красный пигмент (0,06 мг/мл). Полученные амилоидные фибриллы центрифугировали при 1000 g в течение 10 мин и дважды отмывали PBS для удаления свободного красного пигмента.

Для анализа морфологии получаемых амилоидных фибрилл использовали трансмиссионную электронную микроскопию. Препараты изучали при помощи электронного микроскопа LIBRA-120 (Carl Zeiss, Германия).

Для оценки и анализа полученных данных применяли стандартные методы статистики в пакете STATISTICA 6.

Результаты и их обсуждение Раздел 1. Влияние красного пигмента на количество амилоидов в дрожжевых клетках.

Первой задачей для оценки возможного действия красного пигмента стало качественное сравнение агрегированных белков в изогенных штаммах, отличающихся цветом колоний. Для этого мы использовали метод разделения агрегатов в 1,8%-ном агарозном геле (Kryndushkin et al., 2003).

Мы получили выборку красных штаммов, у которых накопление красного пигмента подавлялось индукцией дополнительных мутаций, и, наоборот, штаммов белого цвета, в которых индуцировали мутации в генах ADE1 или ADE2, приводящие к накоплению красного пигмента. Кроме того, изменение цвета колоний достигали физиологическим воздействием - рост на среде с избытком аденина (YEPD-ADE) приводит к блокированию образования красного пигмента.

Результаты сравнения осадочных фракций полученных пар приведены на рис. 1.

& 5? 3 Я § 1 | :| | Ё р С ^ ^ Шпш

— а и х о б о < < > > > ьг.

Рис. 1. Электрофореграммы осадочных белков красных и белых изогенных штаммов в 1,8%-ном агарозном геле.

а, б, в: соседние дорожки представляют белые и красные дериваты штаммов; дорожки 5 (а), 3 (б и е) - штаммы, выращенные на среде с избытком аденина (УЕРВ-АБЕ).

Во всех случаях, в каждой изогенной паре белый штамм (дорожки а 1, 3, 5; б 1, 3, 5; в 1, 3, 4) содержит фракцию белков с молекулярной массой больше 450 кДа, которая у штаммов, накапливающих красный пигмент, значительно редуцирована (дорожки а 2, 4; б 2, 4; в 2, 5). Выращивание штамма на среде УЕРБ-АОЕ приводит к восстановлению фракции осадочных белков до уровня белых штаммов. На основании полученных данных можно предположить, что во всех штаммах содержится достаточное количество белков, способных переходить в агрегированное состояние, однако наличие красного пигмента подавляет этот переход.

Следующая задача состояла в том, чтобы определить, влияет ли присутствие красного пигмента не на общее количество белковых агрегатов клетки, а именно на амилоиды. Для этого мы оценили уровень прионизированного белка 8ир35 - [Р5/+]-фактора в полученных изогенных штаммах, отличающихся цветом колоний.

На рис. 2 а представлены данные, полученные для штамма К-13. Видно, что пятно материала, реагирующего на антитела к Бир35 (дорожка 2), больше выражено в случае исходного белого штамма.

3 ко

о +

k I ~ .

Т ш ± 4

ф а <£> «

и < й. й

« n w Û

i ^ М.кДа

-660 -450

± (Л

со

£ т

ÉL

со

Г"—t

(Л

со

Y— С

VD ±

Сп"

о <

со

^ М.кДа

I^JIMbl^j -г. L.....осадки .....| -«-не

■■V'V- : -

■ . V -«-45

Рис.2. Блот-гибридизация с антителами к белку Sup35.

Cl - осадочные белки, выделенные из клеток: 1 - ade2 мутанта штамма К5-13 красного цвета; 2 - ade2 мутанта штамма К5-13, выращенного на среде YEPD-ADE; 3 - [PS/] штамма К5-13 белого цвета; 4 - {psi'] штамма 74-D красного цвета, использованного в качестве отрицательного контроля. Разделение белков проводили в ] ,5 %-ном агарозном геле.

б - лизаты клеток: 1 - ade2 мутанта штамма К5-13 красного цвета; 2 - ade2 мутанта штамма К5-13, выращенного на среде YEPD-ADE, а также осадочные белки, содержащиеся в штаммах: 3 - ade2 мутанта штамма К5-13 красного цвета; 4 - ade2 мутанта штамма К5-13, выращенного на среде YEPD-ADE. Разделение белков проводили в 15 %-ном SDS-PAG.

Чтобы убедиться, что наблюдаемые различия не связаны с разницей в уровне экспрессии белка 8ир35 в красных и белых штаммах, мы разделили лизаты и осадочные фракции, агрегаты в которых предварительно разрушили, в 15%-ном БОЗ-РАО, и провели блот-гибридизацию с антителами к белку 8ир35. На рис. 2 б видно, что синтез 8ир35 у красного штамма К-13 (дорожка 1) и штамма, выросшего на среде УЕРО-АБЕ (дорожка 2), одинаков. В то же время количество 8ир35 во фракции осадочных белков, больше в белом штамме (дорожка 3), чем в красном (дорожка 4).

Полученные данные свидетельствуют о том, что, несмотря на одинаковый уровень экспрессии белка Бир35 в красных и белых изогенных

штаммах, при отсутствии красного пигмента количество агрегированного и, скорее всего, прионизированного, 8ир35 возрастает.

Для подтверждения того, что различия, наблюдаемые на электрофореграммах, действительно соответствуют разному количеству амилоидных агрегатов, а также для более достоверной оценки различий между красными и белыми штаммами был использован метод оценки количества амилоидов с помощью красителя тиофлавина Т.

Мы сравнили показатель интенсивности флуоресценции (ИФ) тиофлавина Т при добавлении его к осадочным фракциям белых/красных изогенных пар. Результаты, полученные при анализе трех штаммов и их производных, представлены на рис. 3.

Рис. 3. Значения интенсивности флуоресценции (ИФ) тиофлавина Т, связанного с амилоидами осадочной фракции изогенных штаммов, различающихся по содержанию приона [РЗ/4'] и по накоплению красного пигмента. Вертикальными отрезками представлены 95%-ные доверительные интервалы.

а: исходный красный К-5[/м/~], полученный из него белый мутант К-5Лу1(/ш~] и К-5/АОЕ[/ш] - исходный штамм К-5, в котором накопление красного пигмента блокировалось при росте на среде УЕРБ-АБЕ;

б: мутант красного цвета 168(М[/М7"], исходный белый штамм 1681[/»/'], а также 1681/г1МХ)Е(/«7~] - 1681/г1, в котором накопление красного пигмента блокировалось при росте на среде с десятикратным избытком аденина;

в: мутант красного цвета ОТ26/г1[Р£/+], исходный белый штамм СТ26[Р,5'/] и СТ26/г1/АВЕ[Р£/+] —штамм ОТ26/г1, в котором накопление красного пигмента блокировалось при росте на среде с десятикратным избытком аденина.

При анализе данных видно, что когда штамм перестает накапливать красный пигмент (либо при появлении дополнительной мутации в генах биосинтеза аденина, либо при выращивании на среде с десятикратным содержанием аденина), значения ИФ тиофлавина Т возрастают. Когда в исходно белом штамме появляются мутации ас1е1 или ас]е2, приводящие к накоплению красного пигмента, наблюдается понижение ИФ.

Для дальнейшего анализа зависимости количества амилоидов в дрожжевых клетках от них красного пигмента мы увеличили выборку изогенных красных/белых пар.

В табл. 2 приведены значения интенсивности флуоресценции тиофлавина Т при связывании с фракцией осадочных белков, выделенных из 9 изогенных красных/белых пар. В отдельной графе указаны мутации исходных штаммов и дополнительные мутации, приведшие к прекращению накопления красного пигмента.

Таблица 2

ИФ фракции осадочных белков изогенных пар штаммов, отличающихся _накоплением красного пигмента__

№ пары Цвет культуры Штамм Генотип по аденину Плазмо-тип ИФ Отношение бел./кр.

1 Кр Бел К5-5 К5-5М ас/е2 ас1е2ас1е5,7 [рлг] 285 496 1,7

2 Кр Бел АН/В АН/ВАу1 а(1е1 ас1е1ас1е6 [ртп [¿»П 246 446 1,8

3 Кр Бел 74-Б/Ои 74-Б/Ои/ш1 а<1е1 ас1е1ас}е6 м [р51_] 228 321 1,4

4 Розов Бел 74-Бтлг 74-0\у/\у1 ас1е1 ас1е1ас1е6 [таг] 348 788 2,3

5 ке Бел К-13/г1 К-13 ас!е2 [р5г] [гаг] 322 2265 7,0

6 Ке Бел К-13/гЭ К-13 ас1е2 [р5г] [/'57'] 212 2266 10,7

7 Ке Бел вТ26/г1 вТ26 ас!е1 [р5г] [р5г] 420 1517 3,6

8 Ке Бел 168^1 1681 ас{е1 \рзГ] \рзГ] 364 1617 4,4

9 Ке Бел УТК/г1 УТК ас1е1 (?) (?) 182 1996 11,0

Примечания. Подчеркнут цвет полученного мутантного штамма. В названии штамма: г - мутант красного цвета (кр), \у - мутант белого цвета (бел). Двусторонний критерий знаков для 9 пар на 1%-ном уровне: границы 1 и 8. Различия между красными и белыми клетками достоверны при р<0,01.

Данные табл. 2 говорят о том, что при получении из красного или розового штамма белого мутанта, в котором благодаря дополнительной мутации красный пигмент не накапливается (пары 1-4), значение ИФ значительно увеличивается. И, наоборот, если из белого штамма получить красный за счет мутации в гене ADEI или ADE2 (пары 5-9), это приводит к понижению величины ИФ.

Выращивая красные штаммы на среде с высоким содержанием аденина, мы также можем повысить показатели интенсивности их флуоресценции. Об этом свидетельствует табл. 3, в которой приводятся данные сравнений интенсивности флуоресценции тиофлавина Т для 9 независимых пар.

Таблица 3

Влияние десятикратного увеличения количества аденина (ADE) в среде на ИФ осадочных белков у штаммов красного цвета

№ пары Штаммы и их генотип по аденину 10-кратная добавка Цвет культуры ИФ Отношение бел/кр

1 К5-5 ade2 ADE Кр Бел 284 2663 9,35

2 АН/В adel ADE Кр Бел 246 8369 3,39

3 74-D/Gu adel ADE Кр Бел 227 1740 7,65

4 74-Dw adel ADE Розов Бел 347 1206 3,47

5 K-13/rl ade2 ADE Кр Бел 322 2460 7,64

6 K-13/r3 ade2 ADE Кр Бел 212 2468 11,60

7 GT26/rl adel ADE Кр Бел 419 1668 3,97

8 168t/rl adel ADE Кр Бел 364 1804 4,96

9 YTK/rl adel ADE Кр Бел 181 435 2,40

Примечание. Двусторонний критерий знаков для 9 пар на 1 %-ном уровне: границы 1 и 8. Различия между красными (Кр) и белыми (Бел) клетками статистически значимы (р<0,01).

Важно подчеркнуть, что высокая концентрация аденина в среде приводит к значительному увеличению ИФ осадочных белков только в штаммах, в генотипе которых есть мутации, блокирующие биосинтез аденина. Если же

штаммы прототрофны по аденину (т.е. не несут мутации в генах, контролирующих путь биосинтеза аденина), то показатели интенсивности флуоресценции не зависят от количества аденина в среде.

Таким образом, количество амилоидов в осадочной фракции зависит от присутствия красного пигмента в клетках. В каждой изогенной паре белый штамм содержит амилоидную фракцию белков, которая у красного штамма значительно редуцирована. Мы задались вопросом, будет ли эта амилоидная фракция цитоплазматически наследуемой, т.е., передастся ли повышенный уровень интенсивности флуоресценции белых штаммов при цитодукции.

В таблицах 4 и 5 представлены данные по ИФ тиофлавина Т, связанного с осадочными белками цитодуктантов, получивших цитоплазму от красного (кр) или белого штамма-донора.

Таблица 4

Сравнение ИФ цитодуктантов, полученных в различных скрещиваниях штаммов-доноров [PS/^]

A:(l) GT26/iï[ASY"] кр х AH/BQwf] кр А: (2) GT26[P.sr] белый х АН/В [/и Г] кр

иф иф

[/W] розовые цитодуктанты 100 % [РБГ] розовые цитодуктанты 158 %

Штамм-донор GT26/rl кр 100% Штамм -донор ОТ26 белый 617 %

Б:(1) K-13/r3[PS7+]Kp х AH/B&wf] кр Б:(2) К-13 [Р5/] белый х AH/B[jkwi] кр

иф иф

[PSf] розовые цитодуктанты 100% [Р£Г] розовые цитодуктанты 132 %

Штамм-донор K-13/r3 кр 100% Штамм-донор К-13 белый 749 %

А: Различия между ИФ цитодуктантов, полученных в скрещиваниях двух типов, статистически значимы,/? <0,01.

Б: Различия между ИФ цитодуктантов, полученных в скрещиваниях двух типов, статистически значимы, р < 0,05.

Таблица 5

Сравнение ИФ цитодуктантов, полученных в различных скрещиваниях штаммов-доноров [psi rho+]

А: (1) К-5[р«"][?-/го+] кр х 14-D[psi][rho°] белый А: (2) К-! х 74-Df 5/wl [рз Г][г/го+] кр psf][rho°] белый

иф иф

[psi }[rho+] белые цитодуктаны 100 % [ртГ][/7го+] белые цитодуктаны 156 %

Штамм-донор К-5 кр. 100 % Штамм донор К-5/\у1 белый 187 %

Б:(1) 168t/rl [psf][rho+] кр х K-5/wl \jis[]{rho0} белый Б:(2) 1681 К-5/ш1 белый х psf][rho°] белый

ИФ ИФ

[р$Г][гйо+] белые цитодуктаны 100 % [р5Г][г/го+] белые цитодуктанты 137 %

Штамм-донор 168t/rl кр 100 % Штамм-донор 1681 белый 449 %

А: Различия между ИФ цитодуктантов, полученных в скрещиваниях двух типов, статистически значимы, р < 0,01.

Б: Различия между ИФ цитодуктантов, полученных в скрещиваниях двух типов, статистически значимы,р < 0,05.

В таблице 4 представлены данные, полученные на цитодуктантах, в которые перешел прион fPS/+]. В двух независимых скрещиваниях (А и Б) роль штамма-реципиента выполнял красный [/ш~] штамм АН/В, несущий супрессируемую нонсенс-мутацию в rem ADE1. В качестве штаммов-доноров, содержащих [Р5/+]-фактор, были выбраны штаммы красного цвета, несущие несупрессируемые нонсенс-мутации в генах ADE1 (GT26 кр) и А DE2 (К5-13 кр), которые приводили к накоплению красного пигмента. Среди потомков скрещивания отбирали по ядерным маркерам штамма-реципиента и по супрессии нонсенс-мутации в гене ADE1 [PS/4"] гаплоидные гетерокариотические клоны. Средние значения ИФ для 6 цитодуктантов, получивших цитоплазму от белых штаммов-доноров, превышают ИФ для цитодуктантов, получивших цитоплазму от красных штаммов-доноров.

Чтобы оценить количество передаваемого цитодукцией амилоидного материала у белых |/ш"] штаммов, мы провели скрещивания, в которых донорный и реципиентный штаммы отличались по наличию [rho] фактора. Штаммы-реципиенты не содержали митохондриальной ДНК и не накапливали красный пигмент. В этих экспериментах отбирали [rho+] цитодуктанты. Данные, полученные в результате двух независимых скрещиваний (А и Б), представлены в табл. 5.

Можно видеть, что средние значения ИФ цитодуктантов, получивших [rho+] цитоплазму от штамма-донора красного цвета, значительно ниже

средних значений ИФ цитодуктантов, получивших цитоплазму от изогенного штамма-донора белого цвета.

Таким образом, количество материала, окрашиваемого тиофлавином Т, является цитоплазматически наследуемым признаком и может передаваться белыми штаммами в отсутствие [Р57+]-фактора. Это является дополнительным доказательством того, что наличие красного пигмента влияет на уровень именно прионовых агрегатов, уменьшая их количество в клетках.

Одним из возможных объяснений подобного эффекта является связывание красного пигмента с амилоидными фибриллами, препятствующее либо их росту, либо образованию агрегатов с другими белками, что приводит к снижению количества амилоидных агрегатов в клетке. Для того, чтобы определить механизм действия пигмента, мы провели опыты в системе in vitro.

На рис. 4 представлены флуоресцентные спектры тиофлавина Т, связанного с амилоидами инсулина, сформировавшимися без красного пигмента (рис. 4, кривая 1) и в его присутствии (рис. 4, кривая 2). Видно, что добавление красного пигмента в раствор при образовании амилоидов приводит к значительному понижению интенсивности флуоресценции тиофлавина Т.

X, НМ

Рис. 4. Спектры флуоресценции тиофлавина Т, связанного с амилоидами инсулина, полученными в обычных условиях (1), а также с фибриллами инсулина, полученными в присутствии красного пигмента (2). Вставка: абсорбционный спектр тиофлавина Т, связанного с амилоидами инсулина (3), а также с амилоидами инсулина, полученными в присутствии красного пигмента (4). ИФ - интенсивность флуоресценции.

Для амилоидов лизоцима наблюдались аналогичные закономерности.

Столь значительное снижение ИФ тиофлавина Т при связывании с амилоидными фибриллами, сформировавшимися в присутствии красного пигмента, может объясняться как минимум двумя причинами. С одной стороны, красный пигмент может препятствовать связыванию тиофлавина Т с амилоидной фибриллой. С другой стороны, красный пигмент может

непосредственно снижать количество или физический размер амилоидов в растворе.

Для прояснения этого вопроса был проведен следующий эксперимент. Измеряли интенсивность флуоресценции тиофлавина Т, связанного с амилоидами, (а) сформированными в обычных условиях; (б) сформированными в обычных условиях, после чего к ним добавили красный пигмент; (в) сформированными в растворе с добавлением красного пигмента.

«12 о

О 8

4 -

Рис. 5. Нормализованные значения ИФ тиофлавина Т, связанного с амилоидами инсулина, сформированными в обычных условиях (1), сформированными в обычных условиях, после чего к ним добавили красный пигмент (2), сформированными в присутствии красного пигмента (3). Вертикальными полосами представлены 95% доверительные интервалы.

Можно видеть, что образование амилоидных фибрилл в присутствии красного пигмента и добавление пигмента к уже сформированным амилоидам, приводят к примерно одному результату - значительному падению интенсивности флуоресценции тиофлавина Т. Необходимо подчеркнуть, что падение интенсивности флуоресценции до минимального уровня происходило очень быстро (в течение трех-пяти минут), а затем уже не менялось. Это означает, что, по крайней мере, в случае амилоидных фибрилл инсулина и лизоцима, красный пигмент не способен вызвать их деструкцию.

Гипотеза о том, что красный пигмент не блокирует образование фибрилл, подтверждается и данными трансмиссионной электронной микроскопии. При формировании амилоидов в присутствии красного пигмента в препаратах инсулина и лизоцима наблюдали фибриллярные структуры, характерные для амилоидов. Однако для инсулина отмечали различия в средней длине фибрилл (рис. 6) - 700±100 нм для фибрилл, сформированных в обычных условиях и 300±50 нм для фибрилл, сформированных в присутствии красного пигмента.

Рис. 6. Электронные микрофотографии амилоидов инсулина, полученных в обычных условиях (а), а также в присутствии красного пигмента (б). Увел.: 16000х. Масштаб: 500 нм.

В случае лизоцима наблюдалась только разница в плотности расположения фибрилл на подложке (рис. 7)

Рис. 7. Электронные микрофотографии амилоидов лизоцима, полученных в обычных условиях (а), а также в присутствии красного пигмента (б). Увел.: 8000*. Масштаб: 500 нм.

Таким образом, для объяснения столь значимых различий между флуоресценцией тиофлавина Т, связанного с амилоидами, сформированными без красного пигмента и в его присутствии мы предполагаем, что красный пигмент взаимодействует с фибриллами, конкурируя с тиофлавином Т за сайты связывания. Возможно, что аналогичным образом красный пигмент может действовать и в клетках дрожжей, препятствуя образованию комплекса амилоидов с другими белками клетки и тем самым опосредованно снижая количество амилоидов. Для подтверждения нашей гипотезы необходимо было определить, какие белки оказываются в составе агрегатов и попадают в

осадочную фракцию, если в клетках не происходит накопления красного пигмента.

Раздел.2 Анализ пигмент-зависимых белков S. cerevisiae.

Для решения этой задачи мы использовали подход, в основе которого -сравнение белкового состава осадочных фракций, выделенных из клеток изогснных штаммов, отличающихся по цвету колоний (красных и белых). Двумерный электрофорез с последующей масс-спектроскопией позволили идентифицировать белки, нахождение которых в осадочной фракции зависело от присутствия в клетке красного пигмента.

При сравнении трех пар изогенных штаммов, отличающихся накоплением красного пигмента, было идентифицировано 48 белков, которые мы относим к категории пигмент-зависимых осадочных белков. Один из идентифицированных нами белков — Sodl — способен амилоидизироваться в клетках млекопитающих (Munch et al., 2011). Возможно, что и в дрожжах этот белок может вести себя аналогичным образом.

Остальные пигмент-зависимые белки относятся к 4 основным функциональным классам. Более половины идентифицированных белков — шапероны и ферменты метаболизма глюкозы. Стоит также отметить белки, участвующие в клеточном ответе на окислительный стресс, и белки, участвующие в процессах трансляции и протеолиза. Это совпадает с данными о функциональных группах прион-зависимых белков, полученными в ряде лабораторий (Nevzglyadova et al., 2009). Представляет интерес и группа белков, участвующих в трансляции - их роль не кажется тривиальной и требует уточнения.

Мы составили таблицу взаимодействий между идентифицированными белками. Группы белков, способные взаимодействовать с тем или иным прионом, соотнесены с классификацией, основанной на функции идентифицированных белков в клетке (табл. 6). Для краткости выделенные нами группы обозначены по имени приона, или другого, характерного для группы, белка. Из 48 идентифицированных белков 9 способны непосредственно взаимодействовать с прионами.

Таблица 6

Взаимодействия между группами белков_

Группа взаимодействия: Функциональная группа: SUP35: RNQ1: NEW1: ADH1: Нет взаимодействия с остальными группами

Шапероны ико-шапероны Hsc82 (132000) Ssal (269000) Hsp26 (19300) Eno2 (2610) Cdc48 (78400) СргЗ (1960)

Ssa2 Hsn78 (2990)

(364000)

Белки Acol Adhl АИ4

метаболизма (96700) (?) (22200)

глюкозы и Eno2 Enol

цикла Кребса (2610) (76700)

Pgkl Gpml

(314000) (172000)

Tpil Hxk2

(207000) (114 000)

Fbal Tdhl

(1020000) (120000)

Tdh3

(169000)

Белки Efbl Tef2

трансляции (?) (450)

Ascl Tufl

(333000) (58 500)

Белки, Sodl

связанные со (519 000)

стрессом Mcrl

(1920)

Tmal9

(27800)

Zeol

(?)

Gvp36

(7720)

Другие белки Porl Aco2

(?) (4670)

Psal Shml

(97100) (17700)

Примечания. Таблица создана на основе базы данных: Saccharomyces Genome Database (http://www.veastgenome.org/), 20.02.2011. Группировка белков основана на способности идентифицированных в настоящей работе белков взаимодействовать с белками известных прионов. В скобках указано число молекул на клетку. Подчеркнуты белки, присутствующие в количестве меньшем, чем 50000 молекул на клетку.

Вопросительный знак означает отсутствие данных по количеству белка в базе данных.

Состав пигмент-зависимых белков в целом близок к составу агрегатов, формируемых амилоидоподобным полиглутаминовым доменом, и к спектру белков, вовлекаемых в агресомы - белковые агрегаты, формируемые для очищения клеток от поврежденных белков (Wang et al., 2008). Эта близость явно не случайна, так как в нашем списке присутствует один из ключевых белков дрожжевых агресом - Cdc48 (окислительный стресс и протеолиз также связаны с функцией агресом). Дальнейший анализ этих белков может подтвердить возможность их прямого или опосредованного влияния на образование амилоидных агрегатов в дрожжевой клетке.

Принимая во внимание снижение количества амилоидов у красных штаммов по сравнению с белыми, мы предлагаем следующую гипотезу для объяснения перекрывания спектров пигмент-зависимых белков с белками агресом. Пигмент-зависимые белки входят в число амилоид-зависимых белков. Связь с амилоидами заставляет их переходить в агрегированное состояние и попадать в осадочную фракцию, в частности, в состав агресом. Накопление красного пигмента затрудняет связывание идентифицированных белков с амилоидами, так как он занимает необходимые для этого сайты. Поэтому уровень этих белков в осадочной фракции зависит от накопления красного пигмента и для красных клеток оказывается сниженным по сравнению с белыми.

Тот факт, что мы выявили среди пигмент-зависимых белков несколько шаперонов, позволяет выдвинуть гипотезу о механизме влияния красного пигмента на прионы дрожжевых клеток. Мы предполагаем, что в клетках дрожжей к снижению количества белков в амилоидной форме приводит способность красного пигмента связываться с амилоидами, в результате нарушая связи прионовых полимеров с шаперонами, ответственными за разделение фибрилл на небольшие части, что обеспечивает размножение прионов.

Таким образом, основной вывод, который можно сделать на основании нашей работы, состоит в том, что красный пигмент дрожжей снижает количество амилоидных агрегатов в клетке, связываясь с фибриллами и не допуская их взаимодействия с другими белками клетки.

Дальнейшим развитием работы должно стать расширение круга патогенных белков, на которые способен влиять красный пигмент, определение структуры красного пигмента, а также проверка экзогенного противоамилоидного действия этого соединения на культурах животных клеток и организмах.

Выводы

1. Количество агрегатов, содержащих белки в амилоидной форме, значительно снижено в дрожжевых клетках, накапливающих красный пигмент - продукт полимеризации аминоимидазол риботида.

2. Присутствие красного пигмента в клетках дрожжей приводит к снижению в них количества [Р81+]-фактора - прионной формы белка Sup35.

3. Разработан метод, позволяющий дать количественную сравнительную оценку количества амилоидов в штаммах Saccharomyces cerevisiae

4. В опытах in vitro показано, что красный пигмент не вызывает деструкцию амилоидов, а связывается с амилоидными фибриллами. При образовании амилоидов в присутствии красного пигмента наблюдается торможение роста амилоидных фибрилл инсулина.

5. Идентифицированы 48 белков, присутствие которых во фракции агрегированных белков зависит от наличия красного пигмента в клетке. К этим пигмент-зависимым белкам относятся, в первую очередь, шапероны, белки, вовлеченные в метаболизм глюкозы, белки, вовлеченные в стрессовый ответ, в процесс трансляции и протеолиз.

6. Предложен механизм действия красного пигмента in vivo, который состоит в связывании красного пигмента с амилоидными фибриллами, что приводит к снижению доступности этих участков для факторов, участвующих в амилоидогенезе. Эта гипотеза подтверждается тем, что пигмент-зависимые белки, идентифицированные нами, относятся к тем же функциональным классам, что и белки, входящие, по оценкам разных лабораторий, в прионовые агрегаты.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Невзглядова О.В., Кузнецова И.М., Артемов А.В., Михайлова Е.В., Туроверов К.К., Сойдла Т.Р. Сравнительная оценка содержания амилоида и прионов в клетках дрожжей // Цитология. 2008. 50(1): 40—48. English translation: Nevzglyadova О. V., Kuznetsova I. M., Artemov A. V., Mikhailova E. V., Turoverov К. K., Soidla T. R. Comparative assay of amyloid and prion contents in yeast cells // Cell and Tissue Biology. 2008. 2(1): 71-80.

2. Невзглядова O.B., Артемов A.B., Митгенберг А.Г., Михайлова Е.В., Кузнецова И.М., Туроверов К.К., Сойдла Т.Р. Влияние красного пигмента на амилоидизацию белков у дрожжей // Цитология. 2010. 52(1): 80—93. English translation: Nevzglyadova O.V., Artemov A.V., Mittenberg A.G., Mikhailova E.V., Kuznetsova I.M., Turoverov K.K., Soidla T.R. The effect of red pigment on amyloidization of yeast proteins. Cell and Tissue Biology. 2010. 4(2): 152—166.

3. Nevzglyadova O.V., Artemov A.V., Mittenberg A.G., Mikhailova E.V., Kuznetsova 1.М., Turoverov K.K., Soidla T.R. Yeast protein aggregates, containing chaperones and glucose metabolism enzymes. In: Handbook of

Molecular Chaperones: Roles, Structures and Mechanisms (P. Durante and L. Colucci, Eds). Nova Science Publishers, Hauppauge, NY, USA. 2010. P.241-270.

4. Mikhailova E.V., Nevzglyadova O.V., Artyomov A.V., Soidla T.R. Prion-associated proteins in yeast: comparative analysis of yeast strains, distinguised by their prion content // Proceedings of the young scientists school "Bioinformatics and systems biology". Новосибирск. 2010.

5. Nevzglyadova O.V., Kuznetsova I.M., Mikhailova E.V., Artamonova Т.О., Artemov A.V., Mittenberg, A.G., Kostyleva, E.I., Turoverov, K.K., Khodorkovskii, M.A., Soidla, T.R. The effect of red pigment on amyloidization of yeast proteins // Yeast. 2011. 28 (7): 505—526.

6. Михайлова E.B., Артемов А. В., Снигиревская E.C., Артамонова Т.О., Ходорковский М. А., Сойдла Т. Р., Невзглядова О.В. Влияние красного пигмента Saccharomyces cerevisiae на образование инсулиновых фибрилл in vitro// Цитология. 2011. 53(10): 808—814. English translation: Mikhailova, E.V., Artemov, A.V., Snigirevskaya, E.S., Artamonova, Т.О., Khodorkovskii, M. A., Soidla, T.R., Nevzglyadova, O.V. The effect of red pigment on insulin fibril formation in vitro // Cell and Tissue Biology. 2011. 5(6): 580-585.

7. Михайлова E.B., Артемов A.B., Сойдла T.P., Невзглядова О.В. Влияние красного пигмента на амилоидизацию дрожжевых белков //Тез. V российского симпозиума "Белки и пептиды". - Петрозаводск. 2011.

8. Сойдла Т.Р., Невзглядова О.В., Михайлова Е. в., Артемов А.В., Миттенберг А.Г., Костылева Е. И., Кузнецова И.М., Туроверов К.К., Артамонова Т.О., Ходорковский М. А. Прион-зависимые белки и влияние красного пигмента дрожжей на амилоиды in vivo и in vitro. В сборнике: Санкт-Петербургский научный форум «Наука и общество: Физиология и медицина XXI века». VI Петербургская встреча лауреатов Нобелевской премии. 2011.

Список цитируемой литературы Bagriantsev S.N., Kushnirov V.V., Liebman S.W. Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis // Methods Enzymol.2006. 412: 33—48.

Charveriat M., Reboul M., Wang Q., le Picoli C., Lenuzza N., Montagnac A., Nhiri N., Jacquet E., Gueritte F., Lallemand J-Y., Deslys J-P., Mouthon F. New inhibitors of prion replication that target the amyloid precursor // J. Gen. Virology. 2009. 90: 1294-1301.

Chernoff Y.O. Replication vehicles of protein-based inheritance // Trends Biotechnol.2004. 22(11): 549-552.

Herczenik E., Gebbink M.F.B.G. Molecular and cellular aspects of protein misfolding and disease // FASEB J. 2008. 22: 2115-2133.

Kryndushkin D.S., Alexandrov I.M., Ter-Avanesyan M.D., Kushnirov V.V. Yeast [PSI+] protein aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hspl04 II J. Biol. Chem. 2003. 278: 49636-49643.

Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. 227(5259): 680-685.

Munch C., O'Brien J., Bertolotti A. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011. 108: 3548-3553.

Nevzglyadova O.V., Artemov A.V., Mittenberg A.G., Solovyov K.V., Kostyleva E.I., Mikhailova E.V., Kuznetsova I.M., Turoverov K.K., Soidla T.R. Prion-associated proteins in yeast: comparative analysis of isogenic [PSf] and [psi] strains // Yeast. 2009. 26(11): 611-631.

Pepys M.B., Hawkins P.N., Booth D.R., Vigushin D.M., Tennent G.A., Soutar A.K., Totty N., Nguyen O., Blake C.C.F., Terry C.J., Feest T.G., Zalin T.G., Hsuan J.J. Human lysozyme gene mutations cause hereditaiy systemic amyloidosis // Nature. 1993. 362: 553-556.

Smirnov M.N., Smirnov V.N., Budowsky E.I, Inge-Vechtomov S.G., Serebrjakov N.G. Red pigment of adenine-deficient yeast Saccharomyces cerevisiae II Biochem. Biophys. Res. Com. 1967.27:299-304.

Summers D., Cyr D. Use of yeast as a system to study amyloid toxicity // Methods. 2011. 53: 226231.

Wang Y, Meriin A.B., Zaarur N., Romanova N.V., Chernoff Y.O., Costello C.E., Sherman M.Y. Abnormal proteins can form aggresome in yeast: aggresome-targeting signals and components of the machinery //FASEB J. 2008. 23:451-463.

Wickner R., Shewmaker F., Kryndushkin D., Edskes H. Protein inheritance (prions) based on parallel in-register beta-sheet amyloid structures // Bioessays. 2008.10: 955 -964.

Xue W., Hellewell A., Hewitt E, Radford S. Fibril fragmentation in amyloid assembly and cytotoxicity. When size matters // Prion. 2010.4(1): 20-25.

Zakharov I.A., Yarovoy B. Cytoduction as a new tool in studying the cytoplasmic heredity in yeast // Mol. Cell Biochem. 1977.14: 15-18.

Подписано в печать 22.02.2012. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 8852Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в типографии Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: (812) 550-40-14 Тел./факс: (812) 297-57-76

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Михайлова, Екатерина Вячеславовна, Санкт-Петербург

61 12-3/831

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии Российской академии наук

На правах рукописи

МИХАЙЛОВА Екатерина Вячеславовна

ВЛИЯНИЕ КРАСНОГО ПИГМЕНТА ДРОЖЖЕЙ, ПРОДУКТА ПОЛИМЕРИЗАЦИИ АМИНОИМИДАЗОЛ РИБОТИДА, НА АМИЛОИДЫ

IN VIVO И IN VITRO 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук Сойдла Т.Р.

Санкт-Петербург 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений 4 стр

Введение 5 стр.

Глава 1 .Обзор литературы

1.1. Амилоидные агрегаты эукариотических организмов

1.2. Цитотоксичность амилоидных агрегатов

1.3. Дрожжи как модель для изучения амилоидов 1.3.1. Особенности образования и передачи прионов в клетках Saccharomyces cerevisiae

1.4. Противоамилоидная терапия Глава 2. Материалы и методы

2.1. Среды для культивирования микроорганизмов

2.2. Использованные штаммы и плазмиды

2.3. Генетические методы

2.4. Получение фракции осадочных белков из дрожжевых клеток

2.5. Электрофоретическое разделение белков

2.6. Выявление [P^ST4"]-фактора в осадочной фракции

2.7. Получение MALDI масс-спектров

2.8. Измерение интенсивности флуоресценции тиофлавина Т 2. 9. Получение и анализ красного пигмента

2.10. Получение амилоидных фибрилл in vitro

2.11. Трансмиссионная электронная микроскопия

2.12. Методы статистической обработки Глава 3. Результаты и их обсуждение

3.1. Влияние красного пигмента на количество амилоидов в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae

3.1.1. Уменьшение количества белковых агрегатов в 55 стр

10 стр.

18 стр.

24 стр.

30 стр.

40 стр.

45 стр.

46 стр.

47 стр.

48 стр.

49 стр.

51 стр.

52 стр.

53 стр.

55 стр

55 стр.

клетках при накоплении красного пигмента

3.1 ^.Сравнительная оценка количества амилоидов в 63 стр. клетках дрожжей

3.1.3. Влияние присутствия красного пигмента на 75 стр. количество амилоидов в клетках дрожжей

3.1.4. Передача материала, характеризующегося высокими 85 стр. наследуемыми значениями ИФ, при цитодукции

3.2. Влияние красного пигмента на амилоиды in vitro 89 стр.

3.2.1. Получение чистого препарата красного пигмента 89 стр.

3.2.2. Влияние красного пигмента на формирование 90 стр. амилоидов in vitro.

3.3. Анализ пигмент-зависимых белков клеток Saccharomyces 99 стр. cerevisiae

Выводы 106 стр.

Библиографический список 107 стр.

Приложение 1 136 стр.

Приложение 2 139 стр.

Приложение 3 140 стр.

Приложение 4 141стр.

Приложение 5 142 стр.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

В работе использована стандартная трехбуквенная номенклатура для обозначения генотипов и фенотипов дрожжей (Захаров и др., 1976)

Применялись также следующие обозначения: АИР - аминоимидазол риботид;

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография;

ИФ - интенсивность флуоресценции;

ОИФ - относительная интенсивность флуоресценции;

ТФУ - трифторуксусная кислота;

УФ - ультрафиолетовое излучение;

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота;

ЭФ - электрофорез;

CHAPS - 3-[(3-Холамидопропил)-диметиламмонио]-1-пропансульфонат;

DTT - дитиотреитол;

GuHCl - гуанидин гидрохлорид;

HPR - пероксидаза хрена;

MALDI - матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация;

PBS - натрий-фосфатный буфер;

PMSF - фенилметилсульфонилфторид;

PVDF - поливинилиденфторид;

SDS - лаурилсульфат натрия;

SDS-PAG - денатурирующий полиакриламидный гель;

SDS-PAGE - электрофорез в полиакриамидном геле в денатурирующих условиях;

Tris - трис-(оксиметил)-аминометана (HOCH2)3CNH2;

YEPD - полная среда (дрожжевой экстракт, пептон, глюкоза);

YEPD-ADE - полная среда, содержащая аденин в повышенной концентрации

YEPE - полная среда с добавлением этанола вместо глюкозы;

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Существует ряд заболеваний человека и животных, к числу которых относятся, например, многочисленные губчатые энцефалопатии, болезни Альцгеймера, Гентингтона, Паркинсона, диабет II типа и др., диагностическим признаком которых является отложение в тканях амилоидов - нерастворимых фибриллярных образований, обогащенных |3-структурами (Herczenik, Gebbink, 2008; Uversky et al., 2008). Морфологически амилоиды представляют собой линейные неразветвленные фибриллы длиной до нескольких микрометров и диаметром 10-20 нм, состоящие из отдельных протофиламентов. Для амилоидов характерны общие биохимические свойства: амилоидные фибриллы устойчивы к действию высокой температуры, денатурирующих агентов и к некоторым протеазам (химотрипсину и протеиназе К), а их способность специфически связывать некоторые низкомолекулярные соединения (Конго красный и тиофлавин Т) широко используется для наблюдений за динамикой образования амилоидов в системе in vitro и в тканях млекопитающих (Herczenik, Gebbink, 2008).

При некоторых заболеваниях, например, нейродегенеративных, говорят о корреляции между образованием амилоидов и развитием дегенеративных изменений некоторых типов клеток головного мозга, приводящим к нарушениям когнитивных функций и функций нервно-мышечной системы. Более того, в ряде случаев белок в амилоидной форме, передаваясь между особями одного вида и даже между видами, является непосредственной причиной возникновения тяжелых заболеваний центральной нервной системы у человека и животных. Эти амилоиды, представляющие собой инфекционные агенты белковой природы, получили название прионов (Wickner et al., 2008).

В настоящее время проводятся интенсивные исследования, направленные на изучение особенностей отдельных заболеваний и на поиски путей предотвращения появления в клетках амилоидных агрегатов. Помимо создания новых фармакологических препаратов разрабатываются

принципиально новые подходы, связанные, например, с генной терапией (Lindquist and Kelly, 2011), для оценки эффективности которых используют различные модели амилоидных заболеваний, в частности, полученные на основе почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Summers and Cyr, 2011).

Изученность большинства метаболитных путей, наличие гомологов многих белков высших эукариот, возможность использования широкого спектра методов молекулярной биологии делают эти микроорганизмы незаменимыми для изучения молекулярных механизмов формирования амилоидных структур и идентификации их взаимодействий с другими белками клетки. Кроме того, дрожжи позволяют проводить быстрый скрининг большого количества соединений, что является актуальной задачей на первых этапах поиска противоамилоидных препаратов.

Так как лекарства, применяемые в настоящее время в клинической практике, имеют ограниченный эффект, в лучшем случае задерживая развитие заболеваний, поиск новых противоприоновых и противоамилоидных соединений кажется оправданным и даже необходимым (Bezprozvanny, 2009).

Перспективной группой веществ, препятствующих образованию амилоидных фибрилл, являются производные имидазола. Одно подобное соединение - 5-фосфат-рибозил-аминоимидазол (АИР) лежит в основе полимера, образующегося в клетках дрожжей S. cerevisiae при некоторых мутациях в пути биосинтеза аденина и придающего колониям дрожжевых клеток характерный красный цвет, благодаря чему этот полимер получил название «красный пигмент» (Smirnov et al., 1967).

Задачи исследования:

1. Получение и анализ изогенных штаммов S. cerevisiae, отличающихся накоплением красного пигмента.

2. Сравнение количества агрегированных белков в лизатах, выделенных из полученных штаммов.

3. Выявление и анализ у полученных штаммов изменений количества [PS7*] фактора - амилоидной формы белка »Sup35.

5. Идентификация белков, агрегация которых зависит от наличия в клетках штамма красного пигмента.

Основные положения, выносимые на защиту:

2. Присутствие в клетках дрожжей красного пигмента приводит к снижению количества [Р57+]-фактора.

4. Присутствие в системе in vitro красного пигмента приводит к торможению роста амилоидов инсулина.

Научная новизна полученных результатов

Впервые показано, что продукт полимеризации аминоимидазол риботида - красный пигмент - вызывает уменьшение количества [PS/"]-фактора в клетках дрожжей.

Впервые показано, что красный пигмент снижает скорость роста амилоидов инсулина in vitro.

Теоретическое и практическое значение работы.

аминоимидазол риботида или его производных для лечения заболеваний, связанных с образованием амилоидов. В частности, наши данные о снижении количества приона [Рб!/*] в клетках в присутствии красного пигмента позволяют предлагать дальнейшее изучение возможностей применения этого соединения для лечения прионных инфекций.

Финансовая поддержка работы

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Амилоидные агрегаты эукариотических организмов

Формирование трехмерной структуры белков - "фолдинг" - является одним из важнейших биологических процессов. Различные энергетически выгодные формы укладки полипептидных цепей, стабилизируемые множеством электростатических и гидрофобных взаимодействий, образуют уникальную компактную пространственную структуру белка (Туроверов и др., 2005; Lindquist and Kelly, 2011). Фолдинг, концентрация белков, взаимодействия между субъединицами и локализация белков в клетке регулируются сложной системой внутриклеточных механизмов (Balch et al., 2008).

Нарушения в работе этой системы - изменение концентрации белков, некорректный фолдинг в результате мутаций или отсутствие некоторых субъединиц при образовании белка приводят к появлению функционально неактивных молекул, для большинства которых характерно экспонирование неструктурированных областей или областей, обогащенные гидрофобными аминокислотными остатками на поверхности белковой глобулы. Если конформация подобных молекул стабильна, а скорость их деградации или рефолдинга недостаточно высока, то в системах с высокой концентрацией белков как in vitro, например, при биотехнологических процессах, так и в клетках, эти белки с нарушенной конформацией могут объединяться, образуя агрегаты.

У человека и других животных формирование цитоплазматических и ядерных включений, состоящих из неправильно уложенных белков, а также образование на более поздних стадиях крупных фибриллярных отложений, обогащенных ß-структурами - амилоидов, являются диагностическими маркерами целого ряда серьезных заболеваний различной симптоматики и этиологии.

К подобным заболеваниям относят, прежде всего, амилоидозы, которые развиваются и как самостоятельные заболевания (первичный амилоидоз, болезнь Альцгеймера, бета-2-микроглобулиновый амилоидоз), и в качестве сопутствующих патологий при различных нарушениях (вторичные амилоидозы, отложения амилоидов при множественной миеломе и диабете II типа), а также многие нейродегенеративные заболевания, часто связанные с возрастом - болезнь Паркинсона, Гентингтона и др.

Отдельной группой болезней, при которых в некоторых случаях наблюдается образование амилоидных агрегатов в мозговой ткани, являются прионные заболевания - вертячка (scrapie) овец, бычья и кошачья губчатые энцефалопатии, болезни Крейцфельда-Якоба, Герстмана-Штраусслера-Шейнкера, семейная фатальная бессонница и куру, для которых характерно одновременное существование инфекционной, наследуемой и спорадической форм (Шкудина и Тер-Аванесян, 2006).

В основе этих заболеваний лежат нарушения метаболизма белка, названного прионом - PrP (prion protein), который в клетке может находиться в двух изоформах: функциональной РгРс и амилоидной PrPsc, богатой ß-структурами (Cohen and Prusiner, 1998; Detlev, 2003; Prusiner and Hsiao, 1994; Wickner et al., 2008). Этот белок, являющийся продуктом гена PRNP, высоко консервативен у млекопитающих и экспрессируется в большом количестве тканей, в частности, в нейронах. Его функция неизвестна, хотя локализация этого белка на поверхности нейронов позволяет предположить, что он участвует в трансмембранной передаче сигналов и клеточной адгезии (Collinge et al., 1994). Принципиальное отличие прионных болезней от других заболеваний, связанных с амилоидными отложениями, состоит в том, что растворимая изоформа РгРс может переходить в амилоидную форму PrPsc как de novo, так и при контакте с PrPsc в случае попадения последней в клетку из окружающей среды (обратный переход возможен только в денатурирующих условиях). В этом случае PrPsc служит своего рода «затравкой», которая

способствует дальнейшей конверсии изоформ, то есть представляет собой инфекционную частицу белковой природы (Cohen and Prusiner, 1998).

Других белков, образующих патогенные амилоидные структуры у высших организмов, не так много - около 20 (Rochet et al., 2000). Большинство из них не содержат в аминокислотной последовательности гомологичных специфичных участков, которые можно напрямую связать с образованием амилоидов как в системе in vitro, так и в клетках.

Например, системные формы амилоидозов вызываются фибриллярными отложениями пяти разных белков: (1) легких цепей иммуноглобулинов или их фрагментов (первичные амилоидозы, миеломная болезнь, болезнь Вальденстрема, B-клеточные злокачественные лимфомы); (2) острофазового альфа-глобулина SAA, близкого по своим свойствам к С-реактивному белку (вторичный амилоидоз, хронические воспалительные и ревматические заболевания); (3) бета 2-микроглобулина (амилоидоз, развивающийся при хронической почечной недостаточности вследствие резкого снижения выведения этого белка почками и непроницаемости для него диализных мембран); (4) транспортного белка транстиретина (амилоидоз почек, вызываемый мутантной формой при семейных наследственных и нормальной формой при старческих заболеваниях); (5) полипептида амилина (сахарный диабет II типа) (Захарова и др., 2002).

Исключение составляет группа белков - гентингтин, андрогенный рецептор, ряд белков семейства атаксинов - амилоидные отложения которых связаны с нейродегенеративными заболеваниями, такими как, например, болезнь Гентингтона или спиноцеребеллярные (мозжечковые) атаксии. Эти белки содержат характерную полипептидную последовательность -протяженный полиглутаминовый участок, поэтому болезни, вызываемые ими, также называют полиглутаминовыми (Ross et al., 2003; Shao et al., 2007). Для белков с полиглутаминовыми повторами показана четкая зависимость между длиной полиглутаминового участка и степенью агрегации (Paulson, 2000;

Zoghbi and Orr, 2000), а затем с помощью методов электронной и атомно-снловой микроскопии подтверждено, что полиглутаминовые участки действительно представляют собой амилоидогенные пос�

Информация о работе

Михайлова, Екатерина Вячеславовна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2012
ВАК 03.03.04

Диссертация

Влияние красного пигмента дрожжей, продукта полимеризации аминоимидазол риботида, на амилоиды in vivo и in vitro - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы