Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эффекты гиперэкспрессии гена белка-предшественника амилоида в нервных клетках дрозофилы и поиск антиамилоидогенных соединений

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Эффекты гиперэкспрессии гена белка-предшественника амилоида в нервных клетках дрозофилы и поиск антиамилоидогенных соединений"

На правах рукописи

РОДИН Дмитрий Игоревич

Эффекты гиперэкспрессии гена белка-предшественника амилоида в нервных клетках дрозофилы и поиск антиамилоидогенных соединений

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2015

005558281

Санкт-Петербург 2014

005558281

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Петербургский институт ядерной физики им. Б. П. Константинова» Национального исследовательского центра «Курчатовский институт», г. Гатчина.

Научный руководитель: доктор биологических наук

Саранцева Светлана Владимировна, заместитель директора, заведующая лабораторией экспериментальной и прикладной генетики ФГБУ «ПИЯФ» НИЦ «Курчатовский институт», г. Гатчина.

Официальные оппоненты: доктор медицинских-наук

Чухловин Алексей Борисович, профессор кафедры клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова» Минздрава РФ, г. Санкт-Петербург,

кандидат биологических наук Никитина Екатерина Александровна, старший научный сотрудник, заместитель заведующего лабораторией нейрогенетики Института физиологии им. И. П. Павлова РАН, г. Санкт-Петербург.

Ведущее учреждение: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук.

Защита состоится 2015 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 212.232.12 на базе Санкт-Петербургского государственного университета по адресу: 199034, г. Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9, Санкт-Петербургский государственный университет, биологический факультет, кафедра генетики и биотехнологии, аудитория 1. С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан « Ученый секретарь

диссертационного совета Д 212.232.12 доктор биологических наук

а/

/7

Л. А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Белок-предшественник амилоида (АРР) -крупный трансмембранный белок, в большом количестве обнаруживаемый в синапсах нейронов. Белок принимает участие в развитии различных заболеваний, среди которых можно выделить синдром Дауна, амилоидную ангиопатию и болезнь Альцгеймера. На сегодняшний день функции АРР неясны. Однако было показано, что он участвует в разнообразных процессах, включающих клеточную адгезию, клеточную сигнализацию, формирование структуры и функции нейронов [Breen et al., 1991; Neve et al., 2007; Stante et al., 2009].

Основным механизмом протеолиза АРР является его расщепление тремя протеазами, получившими название а-, 0- и у-секретазы. Процессинг АРР осуществляется по так называемому амилоидогенному (при участии р- и у-секретазы) и неамилоидогенному пути (при участии а- и у-секретазы). Основным отличием является то, что в случае амилоидогенного пути происходит образование небольшого по размерам амилоид-бета-пептида (АР). В свою очередь нарушение метаболизма Ар приводит к его агрегированию и образованию так называемых сенильных бляшек - одного из главных маркеров широко распространенного старческого нейродегенеративного заболевания - болезни Альцгеймера (БА).

БА - одна из значимых медицинских проблем современного мира, характеризующаяся тяжелой и разнообразной симптоматикой, включающей амнезию, зрительно-пространственные и временные нарушения, алексию, аграфию. Дальнейшее прогрессирование заболевания ведет к общему физическому истощению и в конечном итоге к летальному исходу. В аутоптате мозга пациентов обычно обнаруживаются классические маркеры БА — деградация тканей мозга и наличие нейрофибриллярных клубков, основным компонентом которых является гиперфософрилированный белок тау, и амилоидных бляшек, состоящих в основном из агрегированного Ар.

На сегодняшний день не существует эффективного способа лечения БА. За годы исследований заболевания было протестировано и отвергнуто множество препаратов. В большей степени это связано с отсутствием глубинного понимания механизмов, ведущих к развитию патологии. Тем не менее, с каждым годом число тестируемых препаратов растет. Наиболее перспективными являются соединения, обладающие антиамилоидогенной активностью, т. е. способные восстанавливать гомеостаз Ар.

Согласно гипотезе амилоидного каскада токсичные растворимые формы Ар запускают каскад патологических процессов, приводящих в итоге к дисфункции нейронов, нарушению синаптической передачи и когнитивным изменениям. Несмотря на наличие множества данных, бесспорно подтверждающих правомерность амилоидной гипотезы, более пристальное изучение вопроса последних лет показало, что не только вызываемый Ар каскад патологических изменений, но и ряд других не связанных или опосредованно связанных с Ар параллельных процессов может вести к манифестации клинической симптоматики заболевания. Среди этих процессов можно выделить патологические изменения цитоскелета нейрона, нарушение антиоксидантной

системы, нарушение апоптоза, изменение клеточного метаболизма и др. [Brion, 1998; Peers et al, 2007; Kumar-Singh, 2008; Kroner, 2009; Su et al., 2008, Bermejo-Pareja etal., 2010].

Кроме того, не до конца ясна функция полноразмерного белка АРР и других его фрагментов в развитии нейродегенерации. Долгое время АРР рассматривался исключительно как источник Aß. В то же время ряд исследований показывает, что нарушение нормальной функции АРР может также приводить к развитию разнообразных патологий нервной системы [Rovelet-Lecrux etal., 2005]. Определение роли АРР в развитии патологических процессов, наблюдаемых при БА, — ключевой момент для понимания базисных молекулярных механизмов, ведущих к развитию заболевания, что крайне важно для разработки эффективных методов лечения.

Цель и задачи исследования. Основная цель диссертационной работы — исследовать эффекты гиперэкспрессии гена АРР в нервной системе Drosophila melanogaster и охарактеризовать, как содержание трансгенных особей Drosophila на среде с дрожжами Saccharomyces cerevisiae, мутантными по гену ADE2 и продуцирующими красный пигмент, влияет на нейродегенерацию и амилоидогенез. В работе поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать морфологические дефекты развития особей Dr. melanogaster с гиперэкспрессией в нервных клетках гена АРР, АРР с мутацией Swedish, а также с образованием Aß42.

2. Используя трансгенные линии Dr. melanogaster, изучить влияние экспрессии АРР, АРР с мутацией Swedish, последовательностей, кодирующих укороченные формы АРР, а также образования Aß42 на транскрипционную активность генов пресинаптических белков.

3. Определить влияние содержания особей Drosophila с экспрессией последовательности, кодирующей пептид Aß42, на среде с дрожжами Sac. cerevisiae, продуцирующими красный пигмент, на уровень растворимого и агрегированного Aß42 в мозге мух.

4. Исследовать влияние содержания трансгенных Dr. melanogaster на среде с дрожжами Sac. cerevisiae, продуцирующими красный пигмент, на продолжительность жизни и поведение мух.

Научная новизна. В работе продемонстрировано влияние гиперэкспрессии гена АРР на развитие Dr. melanogaster. Показано, что нарушение экспрессии АРР может независимо от Aß приводить к морфологическим аномалиям развития мух. Кроме того, оценено влияние как АРР и его форм, так и Aß42 на транскрипционные изменения генов пресинаптических белков синаптотагмина и нейронального синаптобревина в мозге Dr. melanogaster. Впервые in vivo продемонстрировано позитивное влияние потребления дрожжей-продуцентов красного пигмента на содержание растворимой и нерастворимой фракции Aß42, а также на когнитивные функции Drosophila с экспрессией последовательности, кодирующей пептид Aß42.

Теоретическое и практическое значение работы. Изучение патогенетических основ развития БА - критически необходимое условие для создания полноценной многофакторной теории возникновения заболевания. Исследование роли основных участников патогенеза БА и анализ первичных транскрипционных и эпигенетических изменений важны не только с научной точки зрения, но и имеют значительный практический смысл, так как понимание механизмов, вызывающих начальные нейродегенеративные изменения -ключевое условие как для разработки новых методов диагностирования, так и для поиска новых эффективных терапевтических препаратов для лечения БА.

Основные положения, выносимые на защиту:

• Нарушение нормальных функций белка АРР ведет к активации иммунного ответа и соответствующей воспалительной реакции, вызывая тем самым патоморфологические дефекты развития и функционирования организмов.

• Нарушение метаболизма АРР независимо от Ар42 влияет на синаптическую плотность в мозге за счет негативной регуляции экспрессии генов синаптических белков. Определенный вклад в регуляцию транскрипции вносят эпигенетические факторы.

• Содержание трансгенных линий дрозофилы на среде с мутантными дрожжами Sac. cerevisiae, производящими красный пигмент, позитивно влияет на когнитивные функции и существенно снижает уровень Ар42в мозге.

Апробация работы. Результаты, предложенные к защите, были представлены на следующих отечественных и международных конференциях: V Международной научной конференции для студентов и аспирантов «Молодежь и прогресс биологии» (Львов, 2009); VII Международной научной конференции для студентов и аспирантов «Молодежь и прогресс биологии» (Львов, 2011); Европейской конференции по генетике человека (Готенбург, 2010); IX Курчатовской молодежной научной школе (Москва, 2011); Всероссийской конференции с международным участием «Эмбриональное развитие, морфогенез и эволюция» (Санкт-Петербург, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 4 статьи опубликованы в журналах, включенных в список ВАК, 1 статья - в научном сборнике и 4 статьи - в материалах российских и международных конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты и обсуждение, 25 рисунков, 5 таблиц, заключение, выводы и список литературы, содержащий 161 источник. Работа изложена на 104 страницах.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Материалы и методы исследования

Были использованы следующие линии Dr. melanogaster: UAS-APP (содержит ген АРР человека); UAS-APP-Swedish (содержит ген АРР с мутацией Swedish)-, UAS-APP ANT (содержит укороченную форму гена АРР695, в которой последовательность сигнального пептида соединена напрямую с последовательностью, кодирующей АР, трансмембранным доменом и цитоплазма-тическом хвостом); UAS-APPACT (содержит укороченную форму гена АРР695, в которой удалена большая часть цитоплазматического конца, за исключением короткого мембранного якоря); UAS-APP.Abeta42 (содержит последовательность, кодирующую АР42); UAS-BACE (содержит ген бета-секретазы человека); UAS-PSEN1 (содержит ген пресенилина 1 человека); UAS-PSEN1.M146V (содержит ген пресенилина 1 человека с мутацией, приводящей к одноаминокислотному замещению M146V); UAS-PSEN1.P267S (содержит ген пресенилина 1 человека с мутацией, приводящей к одноаминокислотному замещению P267S); UAS-GFP (содержит последовательность, кодирующую белок GFP).

Экспрессия данных генов была проведена в системе GAL4-UAS при помощи активатора транскрипции elav-Gal4, запускающего транскрипцию в нервных клетках.

Линии получены из коллекции Drosophila Bloomington Stock Center. Мухи содержались на стандартной дрожжевой среде при температуре 25 °С при 12-часовом световом дне.

В работе использованы следующие методы: световая микроскопия конфокальная микроскопия, ПЦР в реальном времени, вестерн-блоттинг приготовление препаратов целых голов и парафиновых срезов мозга Drosophila иммуногистохимические методы, методы анализа когнитивного состояния мух.

2. Результаты и обсуждение

2.1. Аномалии развития Drosophila с гиперэкспрессей гена АРР и с образованием Ар

Исследования полноразмерного АРР показали его значимость разнообразных процессах, в том числе и в развитии нейродегенерации. Наприме| было показано, что дупликация гена АРР приводит к раннему развитию БА аутосомно-доминантным типом наследования и церебральной амилоидно ангиопатии [Rovelet-Lecrux et al., 2005]. Для более полного понимания функци белка АРР мы экспрессировали ген АРР человека и его мутантную форму АРР Swedish, приводящую к семейной форме заболевания, в нервных клетка Dr. melanogaster. Кроме того, мы провели совместную экспрессию этих генов геном p-секретазы человека ВАСЕ. Так как у Drosophila есть все необходимы компоненты, ответственные за активность у-секретазы, совместная экспресси АРР и ВАСЕ приводила к образованию Ар и последующему его отложению.

Мы обнаружили, что как экспрессия АРР, так и образование Ар приводили высокой летальности организмов на стадии куколки (рис. 1).

Генотип исследуемых мух

Рис. 1. Выживаемость куколок в зависимости от генотипа (%): 1 - е/ау, 2 - е1а\;ВАСЕУАРР-5Ж, 3 - е1ау;ВАСЕ/АРР, 4 - е1а\;АРР-5Ж 5 - е!аг;АРР

Экспрессия ЛРР и АРР-Я^ в нервных клетках Ого.чорИНа как отдельно, так и совместно с ВАСЕ вызывала появление большого количества морфологических аномалий у взрослых мух, которые проявлялись в виде меланизации и некроза тканей в области хоботка, патологических изменений самого хоботка, недоразвитых крыльев и раздутых абдоменов, заполненных гемолимфой, что говорит об активном воспалительном процессе (рис. 2, 3).

Рис. 2. Морфологические аномалии у мух с гиперэкспрессией АРР: А - гиперэкспрессия АРР вызывает сильную деформацию и некроз хоботка, недоразвитие крыльев и раздутие абдомена; Б - мухи генотипа е!а\ не обнаруживают морфологических аномалий. 1 - крылья, 2 - абдомен, 3 - хоботок

Верх

Низ

Рис. 3. Деформация хоботка у мух с гиперэкспрессией АРР: А - мухи генотипа elav не обнаруживают морфологических изменений хоботка; В - гиперэкспрессия АРР вызывает сильную деформацию хоботка. 1 — основание хоботка,

2 - верхняя губа,

3 - нижнечелюстные щупики,

4 - нижняя губа, 5 - лабеллумы с псевдотрахеями

У мух с аномальной морфологией наблюдалось появление асимметрии в строении основания хоботка и его увеличение на 20-30 % по сравнению с контролем. Кроме того, в отличие от контрольной линии у исследуемых мух наблюдалось также 20-30 %-ное утолщение верхней и нижней губы. Нижнечелюстные щупики также были заметно увеличены. При приблизительно одинаковой длине их ширина была на 30-50 % больше, чем у контрольной линии. Лабеллумы с псевдотрахеями были явно деформированы, что, по всей видимости, и приводило к невозможности потребления пищи.

Мы исследовали частоту встречаемости морфозов у взрослых мух различных генотипов, выращенных как на стандартной дрожжевой среде, так и на более питательной среде, содержащей мелассу. Среда с мелассой (далее в тексте м) была использована в эксперименте для оценки влияния калорийности на частоту возникновения аномальных морфологических изменений. Результаты эксперимента представлены на рис. 4.

Рис. 4. Частота встречаемости морфозов (%):

1 - elav;APP,

2 - elav;АРР + м,

3 - elav;APP-Sw,

4 - elav;APP-Sw + м,

5 - elav;BA СЕ/АРР,

6 - elav;BACE/APP + м,

7 - elav; ВАС E/A PP-Sw,

8 - elav; В А С E/A PP-Sw +

Генотип исследуемых мух

Как видно из приведенных выше графиков, частота проявления морфозов зависела от генотипа исследуемых мух. Наиболее часто морфозы встречались в линии с гиперэкспрессией АРР. Мы наблюдали снижение их количества как у мух с гиперэкспрессией APP-Sw, так и с гипреэкспрессией АРР и ВАСЕ. А для линии с одновременной гиперэкспрессией APP-Sw и ВАСЕ они были минимальны. Повышение питательности среды не оказало влияния на частоту возникновения морфологических аномалий.

Мы полагаем, что уменьшение количества морфозов при одновременной экспрессии АРР и ВАСЕ объясняется падением уровня белка АРР в нервных клетках Drosophila. Падение же количества морфозов при экспрессии гена АРР с мутацией Swedish, возможно, объясняется ускорением процессинга АРР.

Необходимо отметить, что экспрессия только последовательности, кодирующей Aß42 в мозге трансгенных особей Drosophila, не приводила к описанным выше дефектам развития. Изучение трансгенных линий мух, несущих ген другого крупного трансмембранного белка человека PSEN-1 или ген ВАСЕ также не выявило морфологических отклонений в развитии Drosophila.

• Полученные нами результаты показывают, что именно экспрессия АРР в нервных клетках Drosophila приводит к наблюдаемым патологическим дефектам развития, что указывает на участие АРР в процессах развития и морфогенеза. Кроме того, меланизация тканей и наполнение абдомена гемолимфой указывает на то, что гиперэкспрессия АРР в мозге мух приводит к активации иммунного ответа организма.

2.2. Транскрипционные изменения генов sytl и n-syb в мозге взрослых мух при гиперэкспрессии АРР и образовании Aß

Результаты многочисленных исследований показывают, что самым ранним проявлением БА является прогрессирующее падение синаптической плотности, сопровождаемое значительным снижением содержания основных пресинаптических белков в мозге больных БА [Davidsson et al., 1998; Masliah and Terry, 1993]. Степень подобного падения коррелирует с тяжестью деменции и состоянием пациента.

В то же время изменение уровня белков, принимающих непосредственное участие в синаптической передаче и формировании синапсов, может идти разнонаправленно либо вообще не меняться. Так, Sze с соавт. показали, что уровни белков синапсин-1 и SNAP не менялись ни у пациентов с выраженной когнитивной дисфункцией, ни у пациентов с начальной стадией когнитивных изменений. В то же время уровень синаптотагмина значительно падал в областях, ответственных за формирование и консолидацию памяти - гиппокампе и энторинальной области коры головного мозга, а падение уровня синаптобревина наблюдалось независимо от исследуемого отдела [Sze et al., 2000].

Анализ транскриптов на чипах Affymetrix HuFL, проведенный на аутоптатах мозга больных спорадической формой БА (средний возраст 82,7 года), показал снижение уровня транскриптов мРНК для основных классов синаптических белков [Yao et al., 2003]. Параллельно с этим исследованием было показано значительное снижение уровня экспрессии гена syt [Mufson et al., 2002] и генов

VAMP1 и VAMP2, кодирующих две изоформы белка синаптобревина человека в мозге больных БА [Bossers et al., 2009]. Следует заметить, что в этих экспериментах отсутствовали результаты для ранних стадий БА. Возможно, именно это обстоятельство не позволило отличить первичный эффект нарушения синаптогенеза от других эффектов нейропатологического процесса.

Drosophila содержит гомологи синаптических белков человека. Например, у Drosophila было выделено 7 различных изоформ белка syt, из которых только sytl обнаруживается в большом количестве в синапсах. Также было выделено 2 изоформы белка syb. Изоформа n-syb обнаруживается преимущественно в нейронах.

Ранее Sarantseva с соавт. показали существенное падение уровня белков sytl и n-syb при гиперэкспресии АРР, APP-Sw и при совместной их экспрессии с ВАСЕ в антеннальных долях и в грибовидном теле мозга Drosophila - структурах, отвечающих за формирование памяти и поведения, начиная с первых дней жизни животных. Подобные изменения плотности пресинаптических белков вызывали достоверное ухудшение памяти и способности к обучению, что было показано с помощью теста Тулли и Квина [Sarantseva et al., 2009]. Оставалось, однако, неясным, какой механизм определяет снижение уровня синаптических белков в мозге трансгенных особей Drosophila.

Мы оценили изменение транскрипции генов синаптических белков sytl и п-syb как при образовании Ар, так и при экспрессии полноразмерного АРР и различных его форм. Это позволило нам разделить патологический эффект, оказываемый Ар от эффекта, оказываемого непосредственно АРР или его формами. Необходимо отметить, что в линиях с экспрессией генов, кодирующих укороченные формы АРР, не происходит образования Ар (из-за отсутствия бета-секретазы), но образуются С-концевые фрагменты АРР.

Мы экспрессировали АРР, его мутантную форму APP-Swedish, приводящую к семейной форме заболевания, его укороченные формы, а также ген ВАСЕ в нервных клетках Dr. melanogaster. Уровень мРНК генов sytl, n-syb анализировали у 2- и 30-дневных мух следующих генотипов: elav (в качестве контроля), elav;APP, elav;APP-Swedish, elav;APPACT, elav;APPANT, elav;APP/BACE и elav;BACE;APP-Swedish. Полученные данные были нормированы относительно контрольной линии с экспрессией гена elav.

Мы наблюдали падение уровня мРНК гена sytl, нормированного на соответствующие показатели для референсных генов RP-49 и GAPDH2, на 2-й и на 30-й день (рис. 5).

Мы также наблюдали падение уровня мРНК гена n-syb (рис. 6).

Рис. 5. Относительный уровень мРНК гена ху11: - е/ау, 2 - е1сю;АРР, 3 - е1ау;АРР-8м>есИзИ, 4 - е1ау;АРРАСТ, 5 - е!ау;АРРАМТ, 6 - е!ау;АРР/ВАСЕ, 7 - е!ау;ВАСЕ;АРР-8м!. * - статистически достоверное отличие р < 0,05; ** — статистически достоверное отличие р < 0,001

Рис. 6. Относительный уровень мРНК гена п-эуЬ: - е1ау, 2 - е1м;АРР, 3 - е1ау;АРР-8м>есНяИ, 4 - е/ау;АРРАСТ, 5 - е1ау;АРРАЫТ, 6 — е1ау;АРР/ВАСЕ, 1 - е1ау;ВАСЕ;АРР-8м>. * - статистически достоверное отличие р < 0,05; ** - статистически достоверное отличиер < 0,001

Мы также исследовали изменение уровня мРНК гена /и« Ого.чоркИа при гиперэкспрессии АРР, его форм и образовании Ар (рис. 7). Мы показали отсутствие статистически значимого падения уровня м-РНК гена ряп у 2-дневных мух и увеличение уровня экспрессии у 30-дневных, что демонстрирует избирательный негативный эффект АРР и Ар на экспрессию генов ¡уII и п-яуЬ.

Рис. 7. Относительный уровень мРНК генаpsn:

1 - elav, 2 - е lav; АРР, 3 - elav;АРР -Swedish, 4 - elav; АРР ACT, 5 - elav; АРР ANT, 6 - elav;APP/BACE, 7 - elav; BACE;APP-Sw. * - статистически достоверное отличиеp < 0,05; ** - статистически достоверное отличие р < 0,001

Любопытно, что экспрессия другого гена трансмембранного белка человека пресенилина 1 (PSEN-1) и его мутантных форм в мозге мух не вызывала падение транскрипционной активности исследуемых генов синаптических белков (данные ■ не показаны).

Таким образом, мы установили, что гиперэкспрессиия АРР изменяет уровень мРНК sytl и n-syb. Полученные данные указывают на его существенное падение уже на 2-й день жизни мух во всех исследованных трансгенных линиях с экспрессией как АРР и его форм, так и в линиях с образованием Ар (совместная экспрессия АРР и ВАСЬГ). Подобная картина сохранялась и на 30-й день для sytl, j за исключением линий с экспрессией укороченных форм АРР ACT и APPANT. Интересно, что на 30-й день уровень мРНК n-syb снижался только в линиях с экспрессией полноразмерного АРР {АРР и APP-Sw). Как было отмечено ранее, трансгенные линии Drosophila позволяют разделить эффекты АРР и Ар. Мы полагаем, что наблюдаемое снижение уровня мРНК sytl и n-syb обусловлено экспрессией именно гена АРР и независимо от секреции Ар. Хотя наши эксперименты были проведены на трансгенных организмах, в литературе

представлены данные о том, что дупликации гена АРР может приводить к развитию Б A [Rovelet-Lecrux et al., 2006].

Можно предположить, что важную роль в изменении уровня экспрессии пресинаптических генов может играть С-концевой фрагмент белка АРР - AICD -небольшой пептид размером в 6-kDa, отщепляющийся в результате действия гамма-секретазы. Показано, что AICD может проникать в ядро, связываться с различными внутриклеточными адапторными белками, влияя через них на многие клеточные процессы, в частности генную экспрессию, синаптическую пластичность и память [Kim et al., 2003; Muller et al., 2007; Cao, Sudhof, 2001; Gao, Pimplikar, 2001]. С другой стороны, не только фрагменты АРР, но и он сам может участвовать в регуляции транскрипции. Так гиперэкспрессия АРР в нейронах уменьшала уровень мРНК белков, участвующих в обороте холестерина (SREBP, HMGCR, cholesterol 24-hydroxylase) [Pierrot et al., 2013].

Таким образом, нарушения процессов транскрипции генов синаптических белков могут лежать в основе изменения синаптической плотности, наблюдаемой при БА, и являются одним из ранних признаков заболевания. Изменение экспрессии гена АРР или мутации в нем могут приводить к уменьшению уровня мРНК синаптических белков и вызывать синаптическую патологию при БА.

2.2.1. Метилирование ДНК как один из факторов, регулирующих активность генов синаптических белков в трансгенных особях Drosopliila

Одной из причин изменения транскрипционной активности генов может быть изменение статуса метилирования промоторной области исследуемых генов. Эпигенетическая регуляция активности генома путем метилирования остатков цитозина - широко распространенное в природе явление, наблюдаемое у многих представителей эукариот. Долгое время считалось, что у Drosophila метилирование ДНК либо отсутствует полностью, либо не играет существенной роли в регуляции активности генов. В основном это объяснялось отсутствием у Drosophila гомологов канонических метилтрансфераз человека. Кроме того, не было показано наличие 5-метилцитозина в геноме Drosophila [Kunert et al., 2003; Gowher et al., 2000]. Однако последние исследования показали, что геном Drosophila содержит ген МТ-2, который кодирует белок, обладающий метилтрансферазной активностью [Kunert et al., 2003]. Более сложный анализ ' ДНК позволил также обнаружить метилированный цитозин в ДНК, полученный на разных этапах развития Drosophila, в том числе и на стадии имаго, где он обнаруживается в концентрации 1 метилированный цитозин на 1 000 - 2 000 неметилированных [Gowher et al., 2000]. Таким образом, несмотря на не столь масштабный уровень метилирования генома Drosophila по сравнению с млекопитающими, данная эпигенетическая регуляция может влиять на транскрипционную активность генов.

Мы предположили, что именно изменение статуса метилирования генома Drosophila при гиперэкспрессии АРР и образовании АР ответственно за угнетение транскрипционной активности исследуемых генов.

Мы оценили изменение статуса метилирования промоторных областей исследуемых генов. Статус метилирования гена sytl на 2-й и 30-й день представлены в табл. 1.

Таблица 1

Статус метилирования гена хуМ

Генотип Кол-во дней, % метилирования

1-2 дня 30 дней

elav (контроль) 100 ±3 100 ±2

elav.APP 119 ± 5* 118 ±3*

elav; APP-Swedish 116±2* 119 ±5*

elav;APPACT 109 ±4 118 ±9

elav;APPANT 114 ± 3* 106 ±2

elav;BACE/APP 105 ±3 108 ±3

elav;BA CE;APP-Sw 110 ± 4 101 ±4

* - статистически достоверное отличие р < 0,05.

Из таблицы 1 видно, что статус метилирования промоторной области гена sytl на 2-й день после вылупления имеет тенденцию к росту во всех исследуемых линиях со статистически значимыми изменениями в линиях с экспрессией АРР, APP-Swedish и APPANT, что коррелирует с данными по экспрессии этого гена. Подобная тенденция сохраняется и на 30-й день жизни мух.

Несмотря на полученный в эксперименте незначительный рост уровня метилирования промоторной области гена n-syb, мы не наблюдали статистически значимых изменения ни на 2-й, ни на 30-й день.

2.3. Изучение влияния содержания взрослых особей Dr. melanogaster с экспрессией последовательности, кодирующей пептид Aß42, на среде с дрожжами-продуцентами красного пигмента на амилоидогенез и нейродегенеративные процессы в мозге мух

Согласно наиболее популярной сегодня «амилоидной гипотезе» [Hardy, Higgins, 1992], нарушение синаптических функций в мозге, лежащее в основе потери памяти при БА, является результатом действия растворимых олигомеров Aß [Ferreira, Klein, 2011]. Несмотря на описание других механизмов, возможно перекрывающихся с образованием Aß, основные стратегии разработки терапии для БА в последние годы были сконцентрированы на поиске соединений, снижающих уровень Aß [Giacobini, Becker, 2007]. Следовательно, терапия при БА должна восстанавливать в мозге гомеостаз Aß, который может быть нарушен в результате изменений в образовании и клиренсе Aß [Hardy, Higgins, 1992; Hardy, 2002; Hardy, 2006].

Мы оценили влияние содержания взрослых особей Dr. melanogaster с экспрессией последовательности, кодирующей пептид Aß42, на среде с дрожжами-продуцентами красного пигмента на амилоидогенез и нейродегенеративные процессы в мозге мух.

Известно, что мутации в генах ADE-1 и (или) ADE-2 приводят к накоплению в цитоплазме клеток дрожжей Sac. cerevisiae 5'-аминоимидазолрибозида, который после полимеризации и присоединения некоторых аминокислот образует красный пигмент, в результате колонии мутантных дрожжей приобретают характерную красную окраску. Было обнаружено, что дрожжи красного штамма имеют значительно сниженный уровень общего амилоида по сравнению с «белыми» дрожжами. Интересно, что штамм дрожжей, изогенный красному штамму, несущий дополнительную мутацию в-гене ADE6, блокирующую синтез аденина на ранней стадии и не образующий в результате этого красный пигмент, имел значительно более высокий уровень общего амилоида. Это позволяет сделать вывод об антиамилоидных свойствах красного пигмента. Было также показано, что добавление красного пигмента к разрушенным клеткам «белого» штамма снижало уровень общего амилоида, из чего можно сделать вывод об эффективности красного пигмента in vitro. В другом опыте антиамилоидный эффект красного пигмента был показан на фибриллах инсулина. В определенных условиях мономеры инсулина способны агрегировать и образовывать фибриллы. Осветленный дрожжевой лизат, содержащий красный пигмент, добавляли к фибриллам инсулина. Эффект анализировали путем определения уровня флуоресценции тиофлавина Т, способного связываться с амилоидизированными белками. Было выявлено значительное снижение уровня флуоресценции в пробах с добавленным красным пигментом по сравнению с пробами, в которые был добавлен лизат, полученный из изогенного «белого» штамма [Nevzglyadova et al., 2011, Михайлова и др., 2011]. Кроме того, добавление чистого экзогенного красного пигмента к трансформированным дрожжам, в которых происходит образование АР, существенно снижало содержание Ар в лизатах, что было показано как с помощью анализа уровня флуоресценции тиофлавина Т, так и с помощью вестерн-блоттинга [данные готовятся к публикации].

Приведенные выше данные, а также тот факт, что дрожжи служат природным кормом для плодовой мушки, стали основой эксперимента по оценке влияния потребления штамма-продуцента красного пигмента дрозофилой на амилоидизацию.

Трансгенные Dr. melanogaster с экспрессией последовательности человеческого Ар42 в нервных клетках - широко используемая модель для изучения патогенеза Ар in vivo. Было показано, что экспрессия Ар в нейронах мозга приводила к прогрессирующей с возрастом нейродегенерации, нарушениям локомоторных функций и преждевременной гибели мух. Так как дрожжи служат природным кормом для плодовой мушки, для проведения эксперимента было достаточно содержать трансгенных мух на среде с «красным» и «белым» изогенным штаммом дрожжей. По истечении необходимого для опыта времени содержавшиеся на разных штаммах особи Drosophila сравнивались по проявлению перечисленных выше черт патогенеза.

Было оценено влияние потребления красного штамма дрожжей на содержание Ар в мозге имаго трансгенных особей Drosophila с экспрессией последовательности, кодирующей Ар42.

С помощью иммуногистохимии и конфокальной микроскопии было подтверждено отложение Л(342 в мозге трансгенных мух. Пример опыта представлен на рис. 8.

Как видно из рисунка, Ар42 детектировался только в особях йго$орЫ1а с экспрессией последовательности, кодирующей Ар42. В контрольной линии сигнал отсутствовал.

А

В

Г

Рис. 8. Детекция отложения Ар в мозге мух: А - е1ам;Лр42 («белые» дрожжи); Б - е1м;Ар42 («красные» дрожжи);

В - контроль е1ау («белые» дрожжи); Г — контроль е!аг («красные» дрожжи)

Для количественной оценки содержания Ар42 методом вестерн-блота было проведено измерение его уровня в мозге мух, потреблявших в пищу как «красные», так и «белые», не продуцирующие красный пигмент дрожжи. Относительное содержание Ар42 было нормировано на а-ШЬиНп. Пример эксперимента приведен на рис. 9.

а-ШЬ

Растворимый АЗ

а-шЬ

Нерастворимый Ар

ЧЙк

Рис. 9. Пример вестерн-блота по определению уровня Ар42:

1 — контроль е1ау («красные» дрожжи),

2 - контроль е/ау («белые» дрожжи),

3 - е1а\;Ар41 («красные» дрожжи),

4 — е1а\;Ар4} («белые» дрожжи)

В мухах, потреблявших в пищу «красные» и «белые» дрожжи, относительное содержание растворимой фракции Ар42 составило 0,095 ± 0,04 и 0,31 ±0,04 соответственно. Подобные результаты были получены и для нерастворимой фракции. В этом случае содержание нерастворимой фракции Ар42 при содержании мух на среде с «красными» дрожжами составило 0,16 ±0,06, с «белыми»-0,60 ± 0,13 (рис. 10).

0.8т

А

< 0.6-

Рис. 10. Относительный уровень А|342 в мозге мух, содержавшихся на «красных» и «белых» дрожжах: А - растворимая фракция А(342; Б - нерастворимая фракция А|342: 1 - е1ау;АР42 («красные» дрожжи), 2 - е1ау;Ар42 («белые» дрожжи)

Чтобы удостовериться, что наблюдаемый нами эффект не является следствием общего угнетения транскрипционной активности в результате потребления пигментобразующих дрожжей и (или) негативной регуляции системы САЬ4-11А5, мы провели схожий эксперимент на трансгенных особях ОгоБорЫ1а с экспрессией гена белка СРР. В эксперименте использовались мухи, полученные в результате скрещивания линии е1т-САЬ4 и линии Было

показано, что уровень вИР в мозге 20-дневных мух, потреблявших в пищу «красные» дрожжи, не отличался от такового в мухах, развивавшихся на «белом» штамме (рис. 11). Относительное содержание ОБР было нормировано на а-ШЬиНп.

О

0.6-

3 0.4-

0.2

-ЗЕ

ТиЬ

Рис. 11. Уровень вРР в мозге трансгенных особей ОгоБорИИа в зависимости от штамма дрожжей, на которых они развивались: А - относительное содержание ОРР в мозге Огозор1пИа\ Б - пример вестерн-блота: 1 - е1ау;(}РР («красные» дрожжи), 2 - e/av,•GF^, («белые» дрожжи)

Таким образом, мы показали достоверное снижение уровня А(342 в мозге мух, потреблявших в пищу дрожжи-продуценты красного пигмента. Согласно работам УегЬигу с соавт., в агрегировании олигомеров Ар и стабилизации агрегатов существенную роль играют белки-шапероны. Например, одним из участников патологического процесса является белок кластерин, обнаруживаемый в существенном количестве в амилоидных бляшках. Этот белок-шаперон, связываясь с АР, усиливает аггрегационный потенциал пептида. Любопытно, что подобный негативный эффект кластерина наблюдается только при аномально высоком образовании Ар. Нарушение связи кластерина с Ар замедляет дальнейшее отложение амилоида. Возможно, наблюдаемый нами позитивный эффект содержания трансгенных мух на «красных дрожжах» объясняется именно нарушением связи кластерина с Ар за счет конкурентного связывания красного пигмента с АР, что было описано ранее в работе №у2§1уа<1оуа с соавт.

На следующем этапе мы оценили нейропротекторный эффект кормления трансгенных мух штаммом-продуцентом красного пигмента.

Нейродегенерация, вызываемая Ар42, проявляется в виде хаотично расположенных вакуолей округлой формы в нейропиле и в районе клеток Кеньона. Оценка уровня нейродегенерации проводилась на 30-й день жизни трансгенных особей (рис. 12).

А Б

Рис. 12. Эффект содержания трансгенных особей ОгозоркПа на среде с красным штаммом дрожжей на нейродегенерацию: А - уровень нейродегенерации; Б - срезы мозга: 1 - контроль е1ач («белые» дрожжи), 2 - контроль е/оу («красные» дрожжи), 3 -е1а\;Ар42 («белые» дрожжи), 4 - е1ау;Ар42 («красные» дрожжи). Стрелками указаны места вакуолизации

Нейродегенерация - нормальный процесс старения мозга, что объясняет наличие вакуолей в мозге мух контрольных линий.

Из приведенных выше данных видно, что потребление трансгенными особями «красных» дрожжей эффективно снижало нейродегенеративные

процессы, вызываемые экспрессией последовательности, кодирующей Ар42, в мозге мух.

Оценка выживаемости проводилась на трансгенных мухах, в мозге которых происходит образование Ар42. Исследуемые мухи употребляли в пищу как «белые», так и «красные» дрожжи (рис. 13).

Рис. 13. Эффект потребления красных дрожжей трансгенными особями ОгояоркИа на выживаемость: 1 -е1ау;Ар42 («белые» дрожжи), 2 -е1ау;Ар42 («красные» дрожжи)

Как видно из рис. 13, потребление красного штамма дрожжей не оказывало влияния на продолжительность жизни исследуемых трансгенных особей ОгоБорЬИа.

Оценка локомоторной активности была проведена для взрослых мух, в клетках мозга которых образовывался Ар42. Линию трансгенных особей йгозорИИа содержали на среде или с «белыми», или с «красными» дрожжами. В качестве контроля были использованы мухи генотипа е/от>/+. Полученные данные приведены в табл. 2.

Таблица 2

Локомоторная активность мух различных генотипов на 10-й и 20-й день после вылупления

Генотип «Белые» дрожжи «Красные» дрожжи

10 дней, % 20 дней, % 10 дней, % 20 дней, %

е/оу ('контроль,) 78,8 ±2,8 56,5 ± 4,2 81,4 ±2,7 60,2 ± 5,3

е/ау; А/}42 41,2 ± 3,1 1,3 ±0,1 82,5 ± 2,2* 5,5 ± 1,4*

* - процентное количество мух, обладающих нормальной локомоторной активностью, % (согласно методу измерения локомоторной активности плодовых мушек); статистически достоверное отличие р < 0,05.

Как видно из табл. 2, трансгенные животные с экспрессией последовательности, кодирующей Ар42, демонстрировали по сравнению с контролем значительное падение локомоторной активности уже на 10-й день жизни. В то же время наблюдаемое падение было частично компенсировано у мух, потреблявших «красные» дрожжи в пищу. Особенно ярко улучшение локомоторной активности проявлялось на 10-й день. Статистически значимого изменения локомоторной активности мух контрольной линии, потреблявших «красные» дрожжи, обнаружено не было.

Для анализа влияния когнитивного состояния исследуемых мух были оценены их память и способность к обучению на 10-й и 20-й день жизни. Полученные результаты приведены в табл. 3.

Таблица 3

Память и способность к обучению трансгенных мух с экспрессией Ар42, содержавшихся на «красных» или «белых» дрожжах

Генотип Штамм дрожжей Возраст животных

10 дней 20 дней

индекс обучаемости, % индекс памяти, % индекс обучаемости, % индекс памяти, %

. elav (контроль) «белые» дрожжи 44,5 ± 3,6 55,1 ±4,2 37,7 ± 2,6 25,8 ± 1,1

«красные» дрожжи 53,1 ±5,3 61,1 ±3,7 25,7 ± 3,3 32,6 ±2,6

elav;Ap42 «белые» дрожжи 14,5 ±2,1 13,2 ±2,3 3,6 ± 1,2 2,4 ± 0,8

«красные» дрожжи 28,3 ± 3,2* 24,7 ±2,1* 25,1 ±5,4* 22,1 ±4,6*

* - статистически достоверное отличие р < 0,05.

«Красные» дрожжи не привели к статистически значимым изменениям индекса обучаемости и памяти у мух контрольной линии elav/+ ни на 10-й, ни на 20-й день жизни. Иная картина наблюдалась у мух с экспрессией последовательности, кодирующей Ар42. Был обнаружен значительный рост обоих индексов у трансгенных мух, потреблявших «красные» дрожжи.

Как видно из приведенных данных, эффект от содержания трансгенных мух на красном штамме дрожжей возрастал по мере старения мух. Наблюдаемое улучшение когнитивных функций трансгенных мух согласуется со значительным падением уровня АР в мозге и снижением нейродегенерации. Максимальный эффект наблюдался на 20-й день жизни трансгенных мух.

Принимая во внимание антиамилоидогенные свойства красного пигмента, показанные как in vivo на дрожжах, так и in vitro на инсулиновых и амилоидных фибриллах, мы пришли к выводу, что именно красный пигмент ответственен за падение уровня Ар42 в мозге Drosophila, а также за сопровождающее его улучшение когнитивного состояния трансгенных мух. Мы полагаем, что красный пигмент - интересное соединение, требующее более пристального изучения в

контексте его способности подавлять образование или агрегацию АР и деградацию когнитивных функций.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На текущий момент очевидно, что простого ответа на вопрос о причинах возникновения БА не существует. Многофакторность заболевания требует понимания роли всех участников нейродегенеративных процессов. На сегодняшний день изучение таких белков, как АРР, Р5Е1Ч-1, АРОЕ и др. и анализ их функций - одно из важных направлений в исследовании БА. Для этих целей широко используются разнообразные трансгенные линии Бго$орЫ1а. Относительная простота манипуляции с геномом ОгояорЫа, короткий жизненный цикл, небольшие размеры и стоимость содержания позволяет в короткие сроки оценить влияние интересующих объектов исследования на биохимические процессы, происходящие в организме. Используя разнообразные трансгенные линии Иго$орЫ1а, мы показали важную роль АРР в онтогенезе мух, в активации воспалительного ответа, а также в развитии нейродегенерации. С помощью йгозорМа мы продемонстрировали антиамилоидогенный эффект содержания мух на среде с дрожжами-продуцентами красного пигмента. Мы также показали, что трансгенные мухи, содержавшиеся на среде с «красными» дрожжами, имели более высокие когнитивные показатели, что объясняется падением уровня нейродегенерации мозга. Полученные данные представляют интерес для разработки нового метода лекарственной терапии БА.

ВЫВОДЫ

1. Экспрессия гена АРР человека в нервных клетках Ог. те1апо%а.51ег приводит к увеличению гибели куколок и морфологическим дефектам имаго дрозофилы, что говорит о влиянии АРР как на жизнеспособность особей, так и на процессы развития и морфогенеза.

2. Уровень мРНК генов пресинаптических белков синаптотагмина-1 и нейронального синаптобревина снижается при экспрессии АРР и его форм уже на ранних этапах жизни имаго Ог. melanogaster, что предполагает участие АРР или его фрагментов в регуляции транскрипции определенных генов.

3. Наблюдаемые морфологические аномалии обусловлены именно гиперэкспрессией АРР, а не образованием Ар.

4. При содержании мух на среде с мутантными по гену АОЕ-2 дрожжами происходит подавление процесса нейродегенерации, улучшаются локомоторные функции, обучаемость и память трансгенных особей Иг. melanogasler, воспроизводящих основные признаки болезни Альцгеймера, а также снижается содержание как растворимой, так и нерастворимой фракций Ар42 в мозге трансгенных мух. Полученные данные представляют интерес при разработке новых методов антиамилоидогенной терапии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Sarantseva S., Timoshenko S„ Bolshakova О., KarasevaE., Rodin D., Schwarzman A., Vitek M. Apolipoprotein E-Mimetics Inhibit Neurodegeneration and Restore Cognitive Functions in a Transgenic Drosophila Model of Alzheimer's Disease // PLoS ONE. 2009. V. 4. No. 12. P. e8191.

2. Саранцева С. В., Родин Д. И., Шварцман А. Л. Экспрессия гена АРР человека в нервных клетках Drosophila melanogaster вызывает снижение уровня мРНК синаптотагмина //ДАН. 2012. Т. 442. № 2. С. 279-281.

3 .Родин Д. И., Шварцман А. Л., Саранцева С. В. Современные подходы к терапии при болезни Альцгеймера: от амилоида к поиску новых мишеней // Ученые записки СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова. 2014. Т. XXI. № 1. С. 14-16.

4. Rodin D., Bolshakova О., Kislik G., Sarantseva S. Morphological Abnormalities in Drosophila with Overexpression of Human APP Gene // Open Journal of Animal Sciences. 2013. V. 3. No. 4B. P. 49-52.

Публикации в других изданиях

1. Саранцева С. В., Большакова О. И., КузовковаЕ. Ф„ Родин Д. И., Тимошенко С. И. Моделирование нейродегенеративных заболеваний человека на трансгенных животных // Сб. «Бреслеровские чтения II: молекулярная генетика, биофизика и медицина сегодня». СПб, 2007. С. 224-235.

2. Rodin D., Karaseva Е., Kislik G. Neuropathological Processes Associated with Alzheimer's Disease, Their Modeling and Therapy Approaches in Drosophila melanogaster II Youth and Progress of Biology. Lviv, 2009. P. 285-286.

3. Rodin D., Kislik G„ Vitek M, Sarantseva S. Overexpression of Human Amyloid Precursor Protein Causes Neurodegeneration and Impairment of Cognitive Functions in Transgenic Drosophila melanogaster II European Conference of Human Genetics. Gothenburg, 2010. P. 216.

4. Родин Д. И., Саранцева С. В. Моделирование и коррекция нейропатологических процессов при болезни Альцгеймера в Drosophila melanogaster IIIX Курчатовская молодежная научная школа. Москва, 2011. С. 125.

5. Tkachenko N.. Rodin D., Sarantseva S. Analysis of Synaptic Genes Expression in the Brain of Transgenic Drosophila with Overexpression of Human APP and Human SNCA Genes // 23 European Drosophila Research Conference. Barcelona, 2013. P. 184.

Отпечатано в типографии ФГБУ «ПИЯФ» НИЦ «Курчатовский институт»

188300, Гатчина Ленинградской обл., Орлова роща Зак. 324, тир. 100, уч.-изд. л. 1; 20.11.2014 г.