Исследование гена пресенилина 1 человека и его гомологов в модельных системах

Григоренко, Анастасия Петровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование гена пресенилина 1 человека и его гомологов в модельных системах
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование гена пресенилина 1 человека и его гомологов в модельных системах"

На правах рукописи

ГРИГОРЕНКО Анастасия Петровна

ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНА ПРЕСЕНИЛИНА 1 ЧЕЛОВЕКА И ЕГО ГОМОЛОГОВ В МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ

03.00.15-генетика

03.00.26 - молекулярная генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики мозга Научного Центра Психического здоровья РАМН и в отделе вирусной и клеточной молекулярной генетики Института Молекулярной Генетики РАН

Научные руководители доктор биологических наук, профессор

Рогаев Евгений Иванович

доктор биологических наук, профессор Тарантул Вячеслав Залманович

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор,

член-корреспондент РАН Корочкин Леонид Иванович

доктор биологических наук, профессор, Спицын Виктор Алексеевич

Ведущее учреждение Институт Общей Генетики

им. Н.И. Вавилова РАН

Защита состоится " 12 " сентября 2005 г. в (Ч часов на заседании Диссертационного Совета Д. 001.016.01 при ГУ МГНЦ РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ГУ Медико-генетического научного центра РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

Автореферат разослан 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

доктор биологических наук, профессор Курило Л.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Болезнь Альцгеймера (БА) - распространенное нейродегенеративное заболевание людей среднего и позднего возраста. Обнаружение генов ранних семейных форм БА позволило открыть новую область в исследовании молекулярно-генетических механизмов, лежащих в основе БА. Несмотря на значительное число исследований в данной области, патологические механизмы развития БА и, в частности, причины нейродегенеративного процесса, лежащие в основе заболевания, остаются до конца не выясненными. В этой связи, остается актуальным создание различных моделей БА in vivo и in vitro. Такие модели необходимы для изучения молекулярных основ заболевания, в частности, механизмов взаимодействия генов и регуляции экспрессии генов и белков, лежащие в основе патологии БА. Исследование генов БА важно также для понимания их роли в жизнедеятельности специализированных клеток (нейронов) и функций целого организма (пролиферации, дифференцировки, гисто- и органогенеза). Такие модельные системы чрезвычайно важны для тестирования и поиска лекарственных средств и препаратов, которые можно было бы использовать для терапии БА.

Исследование функций генов пресенилинов (PS), мутации в которых ответственны за большую часть семейных случаев БА, является приоритетным направлением исследований, важным для понимания молекулярных процессов, приводящих к БА. На сегодня известно около 150 мутаций в генах пресенилинов, вызывающих БА. Детальное изучение механизмов действия различных мутаций в генах PS и форм альтернативного сплайсинга генов PS в модельных системах позволит охарактеризовать особенности патогенеза, вызываемого мутантными формами белков PS.

За последнее время собраны данные, показывающие, что белки PS могут быть особыми аспартатными протеазами, участвующими в необычном внутримембранном расщеплении рецепторных белков типа 1. Одним из субстратов пресенилинов является белок предшественника амилоида АРР. Изменение соотношения продуктов протеолиза АРР в сторону труднорастворимого, фибриллогенного пептида А(342, предполагается, может быть основной причиной амилоидных отложений при БА,

запускающих каскад молекулярных процессов, ведущих к гибели нейронов в специфических отделах мозга. Неизвестным остается, каковы тонкие механизмы расщепления АРР белками пресенилинов, и как на эти механизмы влияют мутации в генах PS. Недавно стало ясно, что пресенилины функционируют в составе так называемого у-секретазного комплекса белков. Было установлено, что в состав у-секретазного комплекса, помимо пресенилинов, входят никастрин, АРН-1 и PEN-2. Важно изучить взаимодействия пресенилинов с белками у-секретазного комплекса для выяснения возможных механизмов регуляции протеолитической активности.

Таким образом, актуальной задачей является создание генных конструкций, несущих нормальные и мутантные формы пресенилинов и других компонентов у-секретазного комплекса для исследования экспрессии этих генов в клетках млекопитающих или беспозвоночных. Кроме того, важное направление исследований представляет поиск новых генов, имеющих структурное или функциональное сходство с пресенилинами. В этой связи, поиск и исследование отдаленных гомологов, внутримембранных аспартатных протеаз, работающих по сходным механизмам, позволили бы выделить общие закономерности функционирования внутримембранных протеаз в норме и патологии.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы было исследовать функции мутантных и нормальных форм генов пресенилинов в различных модельных системах. Был также проведен поиск возможных гомологов пресенилинов с последующей целью описания и первичного определения функций этих белков.

В соответствии с этими целями были поставлены следующие задачи:

1. Создать модельные системы in vitro и in vivo для изучения функций генов БА. Получить набор рекомбинантных ДНК конструкций, трансфицированных клеточных линий млекопитающих и трансгенных линий плодовых мушек D. melanogaster.

2. Изучить влияние нормальных и мутантных генов пресенилина 1 человека на пролиферацию и чувствительность к апоптотическим стимулам в культуре трансфицированных клеток феохромоцитомы крысы PC 12.

3. Определить и описать формы альтернативного сплайсинга гена пресенилина 1 человека.

4. Провести поиск возможных клеточных гомологов генов PS. Клонировать удаленные гомологи генов пресенилинов и провести анализ экспрессии в культуре клеток млекопитающих in vitro. Исследовать функции этих генов in vivo, на модели нокаутированных дрожжевых клеток, и при ингибировании генов у почвенных нематод C.elegans методом дцРНК интерференции.

Научная новизна

1. В настоящей работе создан набор плазмидных конструкций, использованных для получения трансфицированных клеточных линий млекопитающих и трансгенных линий D. melanogaster, которые представляют собой модельные системы in vitro и in vivo для изучения молекулярно-генетических механизмов Болезни Альцгеймера.

2. Впервые исследовано влияние мутаций C410Y и M146V в генах пресенилинов на пролиферацию и чувствительность к апоптотическим стимулам на модели трансфицированных клеточных культур феохромоцитомы крысы PC 12.

3. Выявлены и описаны различные формы альтернативного сплайсинга гена пресенилина 1 человека с делецией экзона 9.

4. Идентифицировано новое семейство генов-гомологов пресенилинов IMPAS (IMP). Впервые клонированы три изоформы гена hIMPI, определены некоторые структурно-функциональные особенности IMP1 гена человека и его гомологов в системах клеток млекопитающих, беспозвоночных и дрожжей. Получены как теоретические, так и экспериментальные данные свидетельствующие о том, что ЫМР!, как и пресенилин, является политопной аспартатной протеазой.

Теоретическая и практическая значимость

В данной работе был проведен структурно-функциональный анализ различных изоформ генов пресенилинов и их гомологов с использованием широкого круга методических подходов и разнообразных модельных систем, что позволило получить ряд важных данных в изучении природы аспартатных протеаз и их функций в жизнедеятельности организма, в норме и патологии. Полученных конструкции,

клеточные линий млекопитающих и трансгенные линии мух могут быть использованы как для дальнейшего исследования молекулярных механизмов БА, так и в качестве модельных для поиска и тестирования лекарственных препаратов при терапии БА.

Положения, выносимые на защиту

1. Гиперэкспрессия мутантных форм пресенилина 1 человека (hPSl) C410Y и M146V в культуре клеток феохромоцитомы крысы линии PC 12 приводит к повышенной чувствительности клеток к апоптотическим стимулам, угнетению их пролиферативной активности, а также проявляется в отрицательной селекции трансгена в поликлональных культурах. Мутации в гене ИР81, приводящие к БА, могут частично ингибировать процессинг полноразмерного белка ИР81.

2. Идентифицированы две новые формы альтернативного сплайсинга гена ИР81. Показано, что уровень экспрессии изоформы ИР81 с делецией экзона 9 в периферических клетках крови может варьировать у разных людей.

3. Идентифицированы новое семейство генов, кодирующих консервативные политопные трансмембранные белки эукариот (импасы/ IMPAS/IMP) и архей (мембразы/ Membгase), имеющих ряд важных сгруктурных сходств с пресснилинами эукариотических организмов, включая инвариантные аминокислотные остатки и домены, регулирующие эндопротеолиз.

4. Ген И1МР1 широко экспрессируется на уровне транскрипции в различных тканях и органах человека. В клеточных культурах белок ЫМР1 подвергается N гликозилированию и детектируется в клетке, как в виде мономера, так и в составе высокомолекулярного комплекса.

5. ЫМР1 является аспартатной мембранной протеазой, отвечающей за расщепление политопных белков, в частности, полноразмерной формы hPSl.

6. Гомолог генов IMPAS у дрожжей не является критическим фактором индукции UPR-сигнального клеточного ответа.

7. Се-тр-2 ген, ортологичный гену И1МР1 у человека, критически необходим для нормального морфогенеза червя, играя важную роль как в эмбриональном, так и в личиночном развитии, обеспечивая нормальное прохождение процессов линьки.

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на лабораторных семинарах и заседании Ученого Совета Института Молекулярной Генетики РАН (Москва, 2005), на межлабораторном семинаре ГУ Медико-генетического Научного Центра РАМН (Москва, 2005), на конференциях: "Болезнь Альцгеймера и старение: от нейробиологии к терапии", Москва, 1999; "8th International Conference on Alzheimer's Disease and Related Disorders", Stockholm, 2002; "Xlth World Congress of Psychiatric Genetics", Quebec, 2003

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 научных статей и 10 тезисов российских и зарубежных конференций.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 142 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", "Заключение", "Выводы", "Список литературы". Работа проиллюстрирована 29 рисунками и 18 таблицами. Список литературы содержит 233 источника, из них 6 ссылок на интернет сайты.

Благодарности

Автор выражает глубокую благодарность за переданный опыт и помощь в проведении экспериментальных исследований и обсуждении результатов к.б.н. Моляке Ю.К. и К.6.Н. Бобрышевой И.В., коллективам сотрудников лаборатории молекулярной генетики мозга НЦПЗ РАМН и Массачусетского Университета МШ., отдела вирусной и клеточной молекулярной генетики ИМГ РАМН. Особая благодарность научным руководителям д.б.н., проф. Рогаеву Е.И. и д.б.н., проф. Тарантулу В.З. за возможность работы над интересной темой, постоянную помощь в ходе исследований и при написании работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Программы биоинформатики

В работе были использованы различные биоинформационные программы по поиску, анализу и редактированию нуклеотидных и белковых последовательностей на серверах NCBI, TIGR, KEGG, ВСМ, Molbiol.ru, Weizmann Institute, Expasy, GeneBee и др.

Клонирование генов

Получение рекомбинантных конструкций проводили с помощью стандартного набора методов включающих эндонуклеазное расщепление ДНК, электрофоретическое разделение ДНК фрагментов, выделение фрагментов ДНК из агарозного геля, лигирование фрагментов ДНК, транформацию клеток Е. coli, отбор клонов, содержащих плазмидные конструкции, секвенирование полученных плазмидных конструкций. При клонировании использовали векторы pcDNA3, pcDNA4/myc-His В и pcDNA6/V5-HisA (Invitrogen), для экспрессии генов в клетках млекопитающих; pUAST - для экспрессии генов в трансгенных мухах; pQE30 - для наработки белка в E.coli (QIAGEN); L4440 - для продукции дцРНК в клетках E.coli линии НТ115.

Выделение РНК, получение кДНК, изучение экспрессии генов (ОТ-ПЦР)

Тотальную РНК выделяли из периферической венозной крови человека с использованием набора YellowSolve (Clonogen) или колонок Rneasy QIAGene (QIAGEN). мРНК получали из тотальной РНК с использованием набор Oligotex mRNA Mini Kit (QIAGEN). кДНК получали, используя мРНК или тотальную РНК и набор Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit (MBI Fermentas) с использованием гексануклеотидов и Олиго (дТ) праймеров. ПЦР проводили в реакционной смеси, объемом 20-30 мкл, содержащей следующие компоненты в конечных концентрациях:

200

мкМ дНТФ, 0,1 мкМ соответствующих праймеров (Синтол) и 2,5 ед. Pfii-полимеразы или 1 ед. Taq-полимеразы (Силекс М). Реакцию проводили на амплификаторе "Терцик" (ДНК-Технология). Параметры амплификации: денатурация 94°С - 5 мин., 25-30 циклов (денатурация 94°С - 40 сек., отжиг 57°С - 40 сек., синтез 72°С - 50 сек.), достройка концов 72°С -10 мин. В качестве матрицы использовали полученную кДНК из крови человека или коммерческую библиотеку кДНК из разных

тканей и органов человека (Clontech). Нуклеотидные последовательности альтернативных транскриптов генов PS1, Н1МР1 определяли с помощью секвенирования клонированных ОТ-ПЦР продуктов.

Исследования на модели клеток млекопитающих

Клетки РС12 феохромоцитомы крысы выращивали при 37°С и 5% СО2 на среде RPMI-1640 (ICN) с добавлением 15% эмбриональной телячьей сыворотки (ICN) и 80 мкг/мл гентамицина. Эмбриональные клетки почки человека НЕК293 культивировали на среде DMEM (GibcoBRL), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (GibcoBRL) и 100 ед. пенициллина/стрептомицина. Для индукции нейрональной дифференцировки под действием фактора роста нервов (NGF) клетки изучаемых линий и клонов рассевали на среду, содержащую 1% эмбриональной телячьей сыворотки и 100 нг/мл NGF, по 2 тыс. на лунку 96-луночной плашки и по 12,5 тыс. на лунку 24-луночной плашки. Каждые 3 дня в культуральную среду добавлялим свежий NGF до концентрации 100 нг/мл. Трансфекцию клеток млекопитающих проводили с электропорацией на приборе СУМ4 (ИМБ РАН) или с помощью набора LipofectAMINE PLUS (GibcoBRL).

Рост и гибель клеток определяли по изменению их числа, вычисляемого по показателям оптической плогности при добавлении МТТ (3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенил тетразолиум бромид) - витального реагента, имеющего тропность к митохондриям живых клеток.

Визуализацию апоптоза в клетках проводили при помощи окраски флуоресцентным красителем Hoechst 33258, связывающим ДНК. Подсчет клеток проводили на 3-4 стеклах в 5 случайных полях на каждом стекле при увеличении х400. Апоптотическими считали клетки с ядрами, окрашенными флуоресцентным красителем, сжатыми или демонстрирующими явную фрагментацию.

Вестерн-блоттинг

Осадок клеток лизировали в RIPA-буфере, содержащем соответствующие детергенты и ингибиторы протеаз. Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорда (Bredford, 1976) или по методу Лоури в модификации Петерсона (Peterson, 1977) и использовали для нанесения на гель. Электрофоретическое разделение проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1970) в 10-12% ПААГ гелях. После

электрофоретического разделения белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану Hybond ECL (Amersham) или мембрану PVDF ("Amersham Pharmacia Biotech"). Для детекции белков на блоте использовали первичные антитела к N-концевой части PS 1 (ак 1-92), антитела к 17 ак N-терминального участка белка ЫМР1, коммерческие антитела к эпитопам V5, с-тус, и соответствующие вторичные антитела. Визуализацию комплексов проводили с использованием набора ECL (Amersham).

Исследования на модели дрожжей Saccharomyces cerevisiae

В экспериментах использовали линии Saccharomyces cerevisia, полученные из центра Euroscarf (Германия). В работе были использованы стандартные методы культивирования дрожжей, получения диплоидных линий, индукции споруляции (Sherman, 2002,2003).

Исследования на модели почвенной нематоды Caenorhabditis elegans

В работе использовали бристольскую линию дикого типа N2 Caenorhabditis elegans. Культивирование червей Caenorhabditis elegans осуществлялось по стандартной методике (Brenner, 1974). Активность IMPAS гена ингибировали с помощью интерференции двуцепочечной РНК (дцРНКи, dsRNAi) путем микроиньекций двуцепочечной РНК (дцРНК) в полость тела червя (Rocheleau et al., 1997; Fire et al., 1998), или с использованием в качестве корма клеток Е. coli, продуцирующих дцРНК (Timmons and Fire, 1998). Фенотип анализировали на микроскопе с оптикой Номарского при увеличении х 1000-2000.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Создание набора плазмидных конструкций, трансгенных линий млекопитающих и мух Drosophila melanogaster.

В ходе работы был создан набор плазмидных конструкций (более 20), содержащих нормальные и мутантные формы гена PS1 человека и его гомолога hIMPI дня экспрессии в культурах клеток млекопитающих. Кроме того, получены конструкции, содержащие нормальные и мутантные формы гена PS1 человека в pUAST векторе для экспрессии в трансгенных линиях мух D. melanogaster. Данные конструкции были использованы для получения клеточных линий млекопитающих

(человека НЕК293, крысы PC 12, китайского хомячка СНО) и трансгенных линии D. melanogaster.

Исследование различных форм генов пресенилинов в модели трансфицированных клеточных культур

Исследование функций нормальных и мутантных гена hPSl (с мутациями, вызывающими БА - C410Y, M146V) на клеточную пролиферацию, было выполнено на трансгенных линиях клеток феохромоцитомы крысы PC 12. Эти клетки под действием фактора роста нервов (NGF) приобретают нейрональный фенотип и широко используются во всем мире в качестве нейрональной модели. Было показано, что в условиях трофического голодания, а именно, при 1% сыворотки, как недифференцированные, так и дифференцированные клеточные линии, трансформированные мутантной формой гена демонстрировали значительное

снижение скорости роста (Рис.1). Чем выше была экспрессия мутантного гена (определяемая по непроцессированной форме экзогенного белка PS1), тем меньшее число клеток детектировали на 6-й день культивирования в условиях нейрональной дифференцировки. При изучении изучении чувствительности трансгенных линий к апоптотическим стимулам, таким, как депривация по факторам роста, показано увеличение числа апоптотических клеток под действием мутаций, приводящих к БА, в пресенилине 1. В качестве контрольных были использованы нейронально-дифференцированные PC 12 клетки без депривации (Рис.2).

Помимо изучения влияния гена hPSl на пролиферацию и апоптоз, клеточные модели были также использованы для исследования влияния различных мутаций в hPSl на его же процессинг. Было показано, что экзогенный мутантный пресенилин, особенно с мутацией C410Y, процессировался с меньшей эффективностью. Это наблюдение подтвердилось в экспериментах с использованием транзиентной трансфекции на другом типе клеток, НЕК293. Наши исследования чувствительности клеток к апоптозу при экспресии мутантных форм hPSl согласуются с данными ряда авторов, полученными на других модельных системах (knock-in мыши, M146V - Guo et al., 1999b), для других мутаций в гене hPSl (L286V - Guo et al., 1999a), для других апоптотических стимулов (M146V, действию Р'-амилоида - Guo et al., 1999a), а также для мутаций в гене-гомологе hPS2 (Deng et al., 1996; Wolozin et al., 1996). Стабильные нейрональноподобные культуры PC 12 с негативным действием мутантных генов

пресенилинов могут быть использованы в дальнейшем как для изучения взаимодействия различных генов и белков в клетке, экспресии генов, так и для поиска синтетических соединений, потенциальных терапевтических средств БА.

Щ - РС12 иетрансфицированная культура

« - К-ро1у (рсОМЗ)

Д -€Ш-Р4(рсР81лсО

у -М2-Е4 (А), М1-Е5 (Б,В) (рсР81-С410У)

От-1-1-1-1-1-1-1-1-г-1-1-1-1

О 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13

дни культивирования

♦-1 1% сыворотки

оН-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1

0123456789 10 И 12

дни культивирования

Рис. 1. Динамика роста моноклональных клеточных культур PC 12, стабильно трансфицированных различными формами гена hPSl (МТТ-метод). А, Б -недифференцированные клетки; В - дифференцированные клетки.

Рис. 2. Влияние мутаций в гене НРБ1 на чувствительность к апоптотическим факторам (культивирование клеток в течение 48 часов на среде без сыворотки и NGF) нейроналыю-дифференцированных клеток РС12:1 -К-ро1у (трансфекция контрольным вектором pcDNA3), 2 - wt-poly (трансфекция плазмидой pcPSl-wt), 3 - M146V-poly (трансфекция плазмидой pcPSl-M146V), Контрольные варианты (стандартные условия культивирования) обозначены светло-серым цветом, варианты с депривацией - темно-серым. На гистограмме указаны стандартные отклонения.

Получение и анализ трансгенных линий Drosophila melanogaster

Конструкции с различными формами генов пресенилина и никастрина, были использованы для получения трансгенных линий D. melanogaster (в сотрудничестве с Шостак Н.Г. и Павловой Г.В. (ИМБ РАН, ИБГ РАН)). Трансгенные линии мух в дальнейшем были исследованы в Университете Торонто (Канада, PS линии) и в Университете Пенсильвании (США, N. Lukinova, M. Fortini, Net линии). При изучении влияния мутантных форм на структуру фасеток глаз трансгенных мух, фенотипических изменений выявлено не было. Действительно, в независимой работе группы М. Fortini (Университет Пенсильвании, США) на линиях, экспрессирующих мутантные гены пресенилина, было показано, что апоптоз в фасетках глаз можно вызвать только при 2-4-х кратном увеличении дозы генов в трансгенных мухах. При этом фенотип "неровного" глаза обнаруживается как при гиперэкспресии мутантных, так и нормальных форм пресенилина, что, по-видимому, свидетельствует о специфичном эффекте, обусловленном гиперэкспрессией, а не мутацией в гене PS. В нашей работе мы показали, что экспрессия одной копии трансгена (PS или Net) не нарушала основных функций при формировании структуры фасеток D melanogaster.

Изучение альтернативных транскриптов гена пресенилина 1 человека

Из лейкоцитов и тканей мозга человека были выделены два альтернативных транскрипта PSI: 1) содержащий сплайсинг экзона и 2) содержащий

сплайсинг экзона 9 и инсерцию четырех нуклеотидов GTAG на границе экзонов 10 и 11 (PSlA9tr). Показано, что уровень э к с п р е с№ймм о ж е т варьировать между различными людьми. Сплайсинг экзона 9 PS1 интересен тем, что 1) транслируемый белок не содержит одного из функционально-консервативных аспартатных остатков, который заменяется на аланин (D257A). Подобный белок должен быть не активен в отношении внутримембранного расщепление субстратов, что действительно было подтверждено в наших и др. работах в отношении Notch 1. Сплайсинг экзона 9 приводит также к нарушению эндопротеолиза белка. Весьма вероятным является, возможно, доминантно-негативный эффект сплайсированной формы на

функцию нормальной формы hPSl.

Рис. 3. Структурное сходство белков семейств: пресенилинов - hPSl, Я sapiens и импасов - ЫМР1, Я sapiens. Белые треугольники показывают расположение консервативных аспартатов и PAL - домена. Серые треугольники обозначают сайты основного процессинга пресенилина. Черный треугольник показывает область предполагаемого расщепления PS1 импасом. Стрелками обозначены мутации в пресенилине, которые использовали в работе при локализации сайта протеолиза. Сайты N-гликозилирования hlMPl отмечены звездочками, ЕКЕК - сигнал ЭР - локализации. Показаны консервативные области других импас-белков человека (hIMP2-hIMP5), а также область РА-домена в белках hIMP3-hIMP5.

Обнаружение новых семейств белков, имеющих сходство с пресснилинами

Были предприняты попытки выделить гомологи пресенилинов с использованием различных стратегий. Существование длинной петли между консервативными трансмембранными доменами VI и VII, широко варьирующая по длине, затрудняет выравнивание аминокислотных последовательностей и поиск удаленных гомологов. Было сделано предположение, что выявление наиболее древних или примитивных ортологов пресенилинов может помочь в поиске филогенетически удаленных семейств белков (если таковые существуют), имеющих участки сходные с теми или иными доменами пресенилинов. В данной работе был предпринят анализ с использованием коротких, наиболее консервативных участков пресенилинов для сравнения с базой данных EST простейших организмов. Была идентифицирована последовательность древнего архетипа пресенилинов у простейшего организма, слизевика Dictyostelium discoideum, имеющего короткий участок петли между аспартатами. Используя эту последовательность для дальнейшего поиска, у слизевика был найден новый белок, имеющий сходство с пресенилинами как по трансмембранной структуре, так и по гомологии в области консервативных сайтов. В область гомологии входили консервативные аспартаты и

концевой PAL-мотив. Дальнейший анализ показал, что выявлены гены, кодирующие новое супер-семейство белков, ранее не описанных в литературе. Продукт данных генов - политопные трансмембранные белки с неизвестной функцией.

Гомологичные гены были обнаружены во множестве организмов (у дрожжей, растений, беспозвоночных и позвоночных, архебактерий - мембразы). Мы назвали эти гены импасами (по предполагаемому участию белкового продукта в интрамембранном протеолизе) - IMPAS (IMP). У человека идентифицировано 5 импас-генов, кодирующих белки со сходной структурой. У всех IMPAS-белков консервативными оказались последовательности вокруг первого и второго аспартатных остатков и PAL- мотива в С-конце (Рис.3). Кроме того, было обнаружено, что пресенилины, импасы и мембразы имеют структурное сходство с другими известными аспартатными протеазами - бактериальными белками семейства препилиновых пептидаз типа 4 и префлагеллиновыми пептидазами архебактерий (Рис.4).

Рис. 4. (на следующей странице) Множественное выравнивание, показывающее сходство консервативных аспартатных и PxL- доменов в семействах белков: эукариот -пресенилинов (PSEN1,2 - Homo sapiens; SEL-12 , HOP-1 - Caenorhabditis elegans; Ar.-lPs -Arabidopsis thaliana AAF99776; Dict.-Ps - Dictyostelium discoideum EST C84790, транслированная частичная CDS); эукариот - импасов (ЫМР1-5 - Homo sapiens; Caen.-IMP1, Caen.-IMP2 - Caenorhabditis elegans CAB02277, CAA92975; S.cerv-IMP - Saccharomyces cerevisiae CAA81940; Ar.-IMP2 - Arabidopsis thaliana AAC34490 ; Dict.-IMP - Dictyostelium discoideum EST C89899, транслированная частичная CDS); архебактерий - мембраз (Arch.fulg. - Archaeoglobus fulgidus AAB89302; Th,volc- Thermoplasma volcanium NP_110537; Th.ac- Thermoplasma acidophilum CAC11210); бактерий - препилиновых пептид аз 4-го типа (Burk.ps. - Burkholderia pseudomallei; Pseud.aer. - Pseudomonas aeruginosa; Aerhyd. -Aeromonas hy drop hila; The r. mar. - Thermotoga maritima, Str.coel. - Streptomyces coelicolor). Выделение групп сходных аминокислог: (Blosum 62

scoring mathrix). Красным цветом отмечено 100% сходство аминокислот во всех семействах. Сходство аминокислот внутри отдельных семейств составляющее 50% и более (30% и более для архебактерий), общее для пресенилинов и других семейств отмечалось синим цветом; для импасов, архебактерий и бактерий - желтым; для архебактерий и бактерий - серым. Подчеркнуты аминокислоты сходные только внутри семейств. Стрелками отмечены аминокислотные замены мутантных конструкций, использованных в работе.

Эукарноты - пресенилины

• б SD

г» od

Архебактерни - мембразы

izek.falf. ik.tele.

ЕуаЭаЕ*— : 1*1 : ¡ишж : 22« : хы>2

вд.

Бактерии - препилиновые пептндазы типа 4

JMi.lqa.

■fcr.oMl.

Изучение экспрессии Н1МР1 гена в тканях и органах человека

В данной работе было проведено исследование наиболее древнего импас-гена человека - ЫМР1. Три изоформы 1МР1 гена из тканей мозга и крови человека были клонированы и секвенированы. Изоформы отличаются по сплайсингу участков, содержащих экзон 11 или его часть. Последовательность изоформы 1 гена И1МР1 как наиболее часто встречающаяся, использовалась при всех дальнейших анализах и сравнениях. ОТ-ПЦР анализ показал, что ЫМР1 ген экспрессируется во множестве органов и тканей человека, за исключением сердца и скелетных мышц, где его транскрипция существенно снижена (Рис.5).

Рис. 5. Изучение экспрессии гена И1МР1 в различных органах человека с помощью ОТ-ПЦР.

ОЗРВИ - контрольный ген; +Контроль1 , +Контроль2 -положительные контроли (смеси различных кДНК). -Контроль - отрицательный контроль.

Изучение экспрессии белка hIMP1 в клетках млекопитающих

С помощью Вестерн-гибридизации была охарактеризована экспрессия белка ЫМР1. Были использованы антитела к тус-эпитопу, который содержался в векторе для экспрессии, для детекции экзогенной экспрессии белка IMP1 в трансфицированных клеточных культурах, или антитела к N-концевому участку белка IMP1 для исследования эндогенной экспрессии собственного гена в клеточных культурах и тканях мозга. Было показано, что белок присутствует в клетке как в мономерной форме (42-50 кД), так и в составе высокомолекулярных комплексов (70100 кД и >100 кД) (Рис.6). hIMPI в клетках подвергается N-гликозилированию. Белок реагирует на обработку специфическими ферментами (EndoHf, PN Gase), убирающими гликозильные остатки.

НЕК293, транзиентная трансфекцня, Эндогенная экспрессия hIMPl-myc экзогенная экспрессия ЫМР1-тус

Рис. 6. Экспрессия белка HIMP1 (Вестеон-блоттинг).

Участие ЫМР1 в протеолитнческом расщеплении полноразмерного белка hPSl

Получены экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что белок ЫМР1 является аспартатной мембранной протеазой, отвечающей за расщеплении политопных белков. В модельной системе трансфицированных клеточных линий обнаружено участие HIMP1 в протеолитическом расщеплении полноразмерной формы hPSl (Рис.7). Мутации в критических аспартатных остатках ЫМР1 (D219A, D265A), а также в консервативном пролиновом остатке (P317L) ингибировали протеолиз полноразмерной формы hPSl. Напротив, искусственная БА-мутация (аналогичная замене в пресенилине, вызывающей БА) - G264A в ЫМР1 не приводила к какому-либо видимому изменению протеолиза в отношении полноразмерного белка hPSl (Рис.7). Сайт протеолиза был локализован в центре 10-го гидрофобного домена в районе 442-й аминокислоты hPSl (Рис.3).

Рис.7. Протеолитическое расщепление

полноразмерного белка hPSl дикого типа при котрансфекции hPSl с HIMP1 дикого типа (wt). В качестве контроля проводили котрансфекцию hPSl с плазмидой pcDNA4 (mock). Вестерн-гибридизация с антителами к N-концевой части hPSl. PS1 holo - полноразмерная форма белка. Стрелки указывают продукты протеолитического расщепления.

PS1 wt

В независимых исследованиях группы В. Martoglio недавно было показано, что SPP (синоним hIMP1) может расщеплять сигнальные пептиды внутри мембранного домена, что также свидетельствует о функциональном сходстве импасов и пресенилинов (Weihofen et al., 2002). В наших исследованиях было впервые показано, что субстратом интрамембранных протеаз может быть политопный мембранный белок.

IMPAS не является критическим фактором индукции UPR (Unfolded-Protein Response) в Saccharomyces cerevisiae

На модели нокаутированных дрожжей было исследовано, является ли импас критическим фактором индукции Unfolded-Protein Response. UPR - ответ эукариотических клеток на накопление "несвернувшихся" белков в

эндоплазматическом ретикулуме (ЭР). У млекопитающих основным клеточным рецептором накопления несвернувшихся белков в эндоплазматическом ретикулуме является белок IRE1. В ряде работ показано, что активация UPR начинается с протеолитического расщепления IRE1, которое в свою очередь зависит от пресенилина 1.

В клетках дрожжей активация UPR также зависит от IRE1. При индукции накопления несвернувшихся белков антибиотиком туникамицином, ингибирующим N-гликозилирование, клетки, нокаутированные по IRE1 гибнут. Пресенилин у дрожжей отсутствует, но есть IMPAS ген. Мы решили проверить, возможно ли участие IMPAS белка в протеолитического расщепления IRE1 - повлияет ли отсутствие гена, кодирующего IMPAS дрожжей на индукцию UPR - ответа. Для этого были заказаны клетки нокаутированные по генам IMPAS, Irel и клетки дикого типа.

В то время как линии с делецией Irel не росли на чашках, содержащих 1 мкг/мл туникамицина, линии нокаутированные по гену IMPAS ничем не отличались в росте от контрольных. Т.е. индукция UPR-ответа в линиях с делецией IMP AS гена проходила также как и в исходных линиях.

Ингибирование гена-ортолога hIMP1 у нематоды Caenorhabditis elegans (Ce-imp-2)

Модель почвенной нематоды Caenorhabditis elegans - одна из наиболее популярных моделей изучения генов функций in vivo. В процессе развития черви

последовательно проходит следующие этапы развития яйца (эмбриональное развитие), личиночных стадий и взрослой особи Личиночные стадии разделяются четырьмя линьками, при которых происходит сброс старой кутикулы

- в головной области - в средней части - в хвостовой области

эмбриональная гибель

Рис. 8. Фенотипы С elegans, наблюдаемые при инактивации Ce-imp-2 гена с помощью дцРНК интерференции

Для определения функций IMPAS генов и кодируемых ими белков в целом организме, проводили инактивацию ортолога hMPl гена в С elegans с помощью двуцепочечной РНК интерференции (дцРНКи, dsRNAi) и изучали полученные фенотипы) В качестве контроля использовали дцРНК гена GFP Двуцепочечную РНК вводили в организм червя с помощью микроиньекций в полость тела или проводили ингибирование Ce-imp-2 с использованием в качестве корма клеток Е coli, продуцирующих дцРНК данного гена. E соН линии НТ115 трансформировали плазмидой L4440, содержащей два Т7 промотора и вставку кДНК Ce-imp-2 для продукции двуцепочечной РНК При этом наблюдали гибель червей на поздней эмбриональной стадии, а также специфический фенотип нарушения процессов линьки был связан с невозможностью сброса старой кутикулы в голове и, реже, в хвостовой области или в средней части тела (Рис 8)

Таким образом, было показано, что ген Ce-imp-2 критически важен для нормального морфогенеза червя Ce-imp-2 играет важную роль как в эмбриональном развитии С elegans, так и в личиночном, обеспечивая нормальное прохождение процессов линьки

выводы

1. Сконструированы рекомбинантные плазмиды, содержащие нормальные и мутантные формы гена пресенилина 1 человека (hPSl) и его гомологов (IMPAS), способные экспрессироваться в клетках млекопитающих и дрозофилы. Получены клеточные линии млекопитающих (человека НЕК293, крысы РС12, китайского хомячка СНО) и трансгенные линии Drosophila melanogaster, трансфицированные этими рекомбинантными плазмидами, которые могут быть использованы для изучения молекулярно-генетических механизмов Болезни Альцгеймера (БА).

2. Показано, что гиперэкспрессия мутантных форм пресенилина 1 человека (hPSl) C410Y и M146V в культуре клеток феохромоцитомы крысы линии PC 12 приводит к повышенной чувствительности клеток к апоптотическим стимулам, угнетению их пролиферативной активности, а также проявляется в отрицательной селекции трансгена в поликлональных культурах. Мутации в гене hPSl, приводящие к БА, могут частично ингибировать процессинг полноразмерного белка hPSl.

3. В клетках мозга человека обнаружены две новые формы альтернативного сплайсинга гена hPSl. Разработан эффективный метод детекции транскриптов сплайсированной формы в лейкоцитах человека. Показано, что уровень экспрессии может варьировать в периферических клетках крови, взятой у различных людей.

4. Идентифицировано новое семейство генов, кодирующих консервативные политопные трансмембранные белки эукариот (импасы/ 1МРА8ЯМР) и архей (мембразы/ Membгase), которые имеют ряд важных структурных сходств с пресенилинами эукариотических организмов, включая инвариантные аминокислотные остатки и домены, регулирующие эндопротеолиз.

5. Клонированы и идентифицированы три альтернативные формы сплайсинга гена IMP1 человека. Показана экспрессия hIMP1 в различных тканях и органах человека на уровне транскрипции. В клеточных культурах, трансфицированных геном hIMP1, показано, что белок hIMP1 подвергается ^гликозилированию и детектируется в клетке, как в виде мономера, так и в составе высокомолекулярного комплекса.

6. Получены экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что hIMP1 является аспартатной мембранной протеазой, отвечающей за расщепление

политопных белков. В модельной системе трансфицированных клеточных линий показано участие ЫМР1 в протеолитическом расщеплении полноразмерной формы ЬР81. Определена критическая роль инвариантных аспартатов и С-концевого пролина ЫМР1 в протеолизе ЬР81.

7. На модели нокаутированных линий дрожжей Saccharomyces cerevisiae показано, что гомолог генов 1МРЛ8 у дрожжей не является критическим фактором индукции иРЯ-сигнального клеточного ответа.

8. На модели нематоды CaenorhabdШs elegans при инактивировании гена ортолога ЫМР1 - Ce-mp-2 методом дцРНК интерференции установлено, что этот ген необходим для нормального развития. Инактивация Ce-imp-2 приводила к эмбриональной гибели, а также гибели личинок на всех стадиях развития нематод за счет специфических нарушений процессов линьки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи:

1. Чернявская, Л. И., Григоренко, А. П., Бобрышева, И. В., Кальина, Н. Р., Гривенников, И. А., Тарантул, В. 3., Флисс, Г., Гуляева, Н. В., Рогаев, Е. И. Трансфекция мутантным геном пресенилина-1 человека увеличивает чувствительность клеток РС 12 к апоптозу. Нейрохимия, 1998, т. 15, стр.308-311.

2. Григоренко, А. П., Моляка Ю. К., Коровайцева, Г. И., Рогаев, Е. И. Обнаружение нового класса политопных белков с доменами, ассоциированными с возможной протеиназной активностью. Биохимия, 2002, т.67, стр.995-1005.

3. Бобрышева, И. В., Григоренко, А. П. , Новосадова, Е. В., Кальина, Н. Р., Арсеньева, Е. Л., Гривенников, И. А., Тарантул, В. 3., Рогаев, Е. И. Влияние изоформ пресенилина 1 человека на пролиферацию и выживаемость клеток феохромоцитомы крысы линии РС12. Биохимия, 2003, т.68, стр.750-758.

4. Гривенников, И. А., Бобрышева, И. В., Варшавер, Н. Б., Григоренко, А. П., Иноземцева, Л. С, Мануйлова, Е. С. Молекулярные механизмы дифференцировки, злокачественной трансформации и гибели соматических клеток млекопитающих ш

vitro. Проблемы и перспективы молекулярной генетики. М.: Наука, 2003, т.1, стр. 248290.

5. Moliaka, Y. К., Grigorenko, A., Madera, D., Rogaev, E. I. Impas I possesses endoproteolytic activity against multipass membrane protein substrate cleaving the presenilin 1 holoprotein. FEBS Lett., 2004, v. 557, pp.185-192.

6. Grigorenko, A. P., Moliaka, Y. K., Soto, M. C, Mello С. С. and Rogaev, E. I. The Caenorhabditis elegans IMPAS gene, imp-2, is essential for development and is functionally distinct from related presenilins. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, v. 101, pp. 14955-14960.

Тезисы конференций:

1. Bobrysheva, I. V., Chernyavskaya, L. I., Grigorenko, A. P., Kalyina, N. R., Grivennikov, I. A., Tarantul, V. Z., Fliss, H., Gulyaeva, N. V., and Rogaev, E. I. Transfection with mutant human presenilin-1 gene sensitized PC12 cells to apoptosis. Joint meeting of the 17th Biennial Meeting of the International Society for Neurochemistry (ISN) and the 13th General Meeting of the European Society for Neurochemistry (ESN), 1999, August 8-14, Berlin. J. Neurochem., 1999,73, Suppl., abstract 43.

2. Рогаев, Е. И., Григоренко, А. П., Моляка Ю. К., Щербатых, Т. В., Дворянчиков, Г. Обнаружение новых форм пресенилина 1: сплайсинг эволюционно консервативного домена в клетках мозга.- Материалы Второй Российской конференции "Болезнь Альцгеймера и старение: от нейробиологии к терапии", 1999, Октябрь 18-20, Москва, стр.125-126.

3. Григоренко, А. П., Бобрышева И. В., Андреева, Л. Е., Чернявская, Л. И., Кальина, Н. Р., Гуляева, Н. В., Гривенников, И. А., Кирьянов, С. А., Коровайцева, Г. И., Щербатых, Т. В., Тарантул, В. 3., Рогаев, Е. И. Получение и анализ стабильно трансформированных клеточных линий и трансгенных мышей, несущих различные мутантные формы гена пресенилина 1, ассоциированного с болезнью Альцгеймера у человека. Материалы Второй Российской конференции "Болезнь Альцгеймера и старение: от нейробиологии к терапии", 1999, Октябрь 18-20, Москва, стр.128-129.

4. Rogaev, E. I., Grigorenko, A., Ryazanskaya, N., Sherbatich, Т., Molyaka, Y., Korovaitseva, G. I ., and Dvoryanchikov G. Evolution and modulation of Alzheimer's

disease associated genes and families of related proteins. 6th Annual International Human Genome Meeting. Program and Abstract Book, 2001, April 19-22, abstract 101, p.28.

5. Grigorenko, A. P., Bobrysheva, I. V., Novosadova, E. V., Madera, D. A., Novack, M., Grivennikov, I. A., Tarantul, V. Z., and Rogaev, E. I. Effects of presenilins on survival and proliferation of PC 12 cells (to search for factors interacting with presenilin pathway). Proceedings of the 8th International Conference on Alzheimer's Disease and Related Disorders, 2002, July 20-25, Stockholm, abstract 1275, p.96.

6. Riazanskaia, N., Grigorenko A. P., Dvoriyanchikov, G., and Rogaev E. Evolution of genes for Alzheimer's disease. Proceedings of the 8th International Conference on Alzheimer's Disease and Related Disorders, 2002, July 20-25, Stockholm, abstract 1276, p.96.

7. Grigorenko A. P., Moliaka, Y., Novosadova, E., Madera, D., Dvoryanchikov, G., and Rogaev, E. Natural splicing of conserved domain critical for complex formation and function of Presenilin 1 protein is dynamically regulated. Proceedings of the 8th International Conference on Alzheimer's Disease and Related Disorders, 2002, July 20-25, Stockholm, abstract 1277, p.96.

8. Rogaev, E. I., and Grigorenko, A. Novel Families of Putative Proteases Related to Presenilins. The IPA European Regional Meeting, 2003, April 1-4, Geneva.

9. Grigorenko, A., Moliaka, Y., Riazanskaya, N., Madera, D., Stepanova, J., Korovaitseva, G., and Rogaev, E. Families of intra-membrane proteases related to presenilins. Xlth World Congress of Psychiatric Genetics, 2003, October 4-8, Quebec, Am. J. Med. Genet., v.l 12B, p. 150.

10. Rogaev, E. I., Moliaka, Y. K., and Grigorenko, A. Presenilin- Related Putative Intramembrane Aspartyl-Proteases. The 9th International Conference on Alzheimer's Disease and Related Disorders, 2004, July 17-22, Philadelphia, P4-272.

Отпечатано в копицентре « СТ ПРИНТ» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprint.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел: 939-33-38 Тираж 100 экз. Подписано в печать 27.06.2005 г.

15Ш 2005

I <**»«» «J»**-' V

' iiÔJW«** j

4i,w72§5

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Григоренко, Анастасия Петровна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.И

1.1.1. Клинические и гистопатологические признаки Болезни Альцгеймера.

1.1.2. Генетические факторы и гены Болезни Альцгеймера.

1.2. Функции генов пресенилинов.

1.2.1.1. Участие пресенилинов в протеолитическом расщеплении АРР.

1.2.1.2. Участие пресенилинов в протеолитическом расщеплении Notch.

1.2.1.3. Другие субстраты внутримембранного протеолиза пресенилина.

1.2.2. Обнаружение компонентов у-секретазного комплекса.

1.2.3. Участие пресенилинов в апоптозе.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Программы биоинформатики.

2.2. Векторы, использованные для клонирования.

2.3. Набор методов для получения рекомбинантных конструкций.

2.3.1. Эндонуклеазное расщепление ДНК.

2.3.2. Переосаждение ДНК.

2.3.3. Электрофоретическое разделение ДНК фрагментов.

2.3.4. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля.

2.3.5. Лигирование фрагментов ДНК.

2.3.6. Культивирование клеток Е. coli.

2.3.7. Транформация клеток Е. coli.

2.3.8. Отбор клонов, содержащих плазмидные конструкции.

2.3.9. Секвенирование.

2.4. Общие методы получения кДНК, геномных копий генов, изучения экспрессии генов (ОТ-ПЦР).

2.4.1. Выделение геномной ДНК из периферической венозной крови человека.

2.4.2. Выделение тотальной РНК из периферической венозной крови человека.

2.4.3. Выделение мРНК.

2.4.3. Получение кДНК.

2.4.4. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

2.5. Частные методы, использованные при клонировании, изучении экспрессии генов на уровне транскрипции.

2.5.1. Получение конструкции для наработки N-концевого фрагмента белка hPSl в клетках Е. coli.

2.5.2. Получение конструкций для экспрессии форм альтернативного сплайсинга hPSl в культурах клеток млекопитающих.

2.5.3. Изучение экспрессии форм альтернативного сплайсинга hPSl в клетках крови человека.

2.5.4. Исследование экспрессии IMP AS генов человека.

2.5.4.1. Анализ экспрессии hIMPI гена в различных тканях и органах человека

2.5.4.2. Исследование альтернативных транскриптов гена hIMPI.

2.5.4.3. Получение и клонирование полноразмерных копий альтернативных форм сплайсинга гена hIMPI.

2.5.4.4. Получение и клонирование мутантных форм гена hIMPI.

2.5.4.5. Клонирование делеционных и мутантных форм гена hPSl.

2.6. Набор методов для получения и исследования трансфицированных культур клеток млекопитающих.

2.6.1. Культивирование клеток млекопитающих.

2.6.2. Подготовка плазмидной ДНК для трансфекции культур клеток млекопитающих.

2.6.3. Трансфекция культур клеток PC 12 с помощью электропорации.

2.6.4. Трансфекция культур клеток НЕК293 с использованием набора LipofectAMINE PLUS.

2.6.5. Получение трансфицированных поликлональных культур клеток PC 12 и клонов индивидуального происхождения.

2.6.6. Выделение высокополимерной геномной ДНК клеточных культур.

2.6.7. Анализ стабильно-трансфицированных культур РС12 с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

2.6.8. Хранение полученных клеточных линий.

2.6.9. Изучение дифференцировки PC 12 клеток.

2.6.10. Анализ пролиферации клеток PC 12.

2.6.11. Изучение апоптоза в трансфицированных культурах клеток PC 12.

2.6.12. Выделение белковых гомогенатов из культур клеток РС12. Электрофорез белков в полиакриламидном геле. Вестерн-блоттинг.

2.6.13. Получение белковых лизатов культур клеток НЕК293. Электрофорез белков в полиакриламидном геле. Вестерн-блоттинг.

2.6.14. Получение антител, использованных в работе.

2.6.15. Изучение гликозилирования белков.

2.7. Материалы и методы исследования на модели дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

2.8. Материалы и методы исследования на модели нематоды Caenorhabditis elegans.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Создание набора плазмидных конструкций, трансфицированных культур клеток млекопитающих, трансгенных линий Drosophila melanogaster.

3.1.1. Создание набора плазмидных конструкций.

3.1.1.1. Плазмидные конструкции для экспрессии в культуре клеток млекопитающих.

3.1.1.2. Плазмидные конструкции для экспрессии генов в трансгенных Drosophila melanogaster.

3.1.1.3. Плазмидные конструкции для наработки белка в Escherichia coli.

3.1.1.4. Плазмидные конструкции для дцРНКи в Caenorhabditis elegans.

3.1.2. Создание набора стабильно трансфицированных культур клеток млекопитающих.

3.1.3. Получение и анализ трансгенных линий Drosophila melanogaster.

3.2.1. Исследование изоформ генов пресенилинов в модели трансфицированных клеточных культур.

3.2.2. Апоптоз и мутантные пресенилины в поликлональных клеточных культурах.

3.2.3. Мутации и высокий уровень непроцессированной формы hPSl замедляют пролиферативную активность и повышают чувствительность к апоптозу моноклональных РС12 культур.

3.3. Изучение альтернативных транскриптов гена PS1 человека.

3.4.1. Обнаружение новых семейств белков, имеющих сходство с пресенилинами.

3.4.2. PA-домен.

3.4.3. IMP AS- гены и IMPAS-белки человека.

3.4.4. Изучение экспрессии hIMPl гена в тканях и органах человека. Исследование альтернативных транскриптов гена ЫМР1.

3.4.5. Изучение экспрессии белка hIMPl в клетках млекопитающих.

3.4.6. Участие hIMPl в протеолитическом расщеплении полноразмерного белка hPSl.Ill

3.4.7. IMPAS не является критическим фактором индукции UPR (Unfolded-Protein Response) в Saccharomyces cerevisiae.

3.4.8. Ингибирование гена-ортолога hIMPl у нематоды Caenorhabditis elegans

Ce-imp-2).

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование гена пресенилина 1 человека и его гомологов в модельных системах"

Актуальность темы

Болезнь Альцгеймера (БА) - распространенное нейродегенеративное заболевание людей среднего и позднего возраста. Обнаружение генов ранних семейных форм БА позволило открыть новую область в исследовании молекулярно-генетических механизмов, лежащих в основе БА. Несмотря на значительное число исследований в данной области, патологические механизмы развития БА и, в частности, причины нейродегенеративного процесса, лежащие в основе заболевания, остаются до конца не выясненными. В этой связи, остается актуальным создание различных моделей Б A in vivo и in vitro. Такие модели необходимы для изучения молекулярных основ заболевания, в частности, механизмов взаимодействия генов и регуляции экспрессии генов и белков, лежащие в основе патологии БА. Исследование генов БА важно также для понимания их роли в жизнедеятельности специализированных клеток (нейронов) и функций целого организма (пролиферации, дифференцировки, гисто- и органогенеза). Такие модельные системы чрезвычайно важны для тестирования и поиска лекарственных средств и препаратов, которые можно было бы использовать для терапии БА.

Исследование функций генов пресенилинов (PS), мутации в которых ответственны за большую часть семейных случаев БА, является приоритетным направлением исследований, важным для понимания молекулярных процессов, приводящих к Б А. На сегодня известно около 150 мутаций в генах пресенилинов, вызывающих БА. Детальное изучение механизмов действия различных мутаций в генах PS и форм альтернативного сплайсинга генов PS в модельных системах позволит охарактеризовать особенности патогенеза, вызываемого мутантными формами белков PS.

За последнее время собраны данные, показывающие, что белки PS могут быть особыми аспартатными протеазами, участвующими во внутримембранном расщеплении рецепторных белков типа 1. Одним из субстратов пресенилинов является белок предшественника амилоида APP. Изменение соотношения продуктов протеолиза АРР в сторону труднорастворимого, фибриллогенного пептида Aß42, предполагается, может быть основной причиной амилоидных отложений при БА, запускающих каскад молекулярных процессов, ведущих к гибели нейронов в специфических отделах мозга. Неизвестным остается, каковы тонкие механизмы расщепления АРР белками пресенилинов, и как на эти механизмы влияют мутации в генах PS. Недавно стало ясно, что пресенилины функционируют в составе так называемого у-секретазного комплекса белков. Было установлено, что в состав у-секретазного комплекса, помимо пресенилинов, входят никастрин, АРН-1 и PEN-2. Важно изучить взаимодействия пресенилинов с белками у-секретазного комплекса для выяснения возможных механизмов регуляции протеолитической активности.

Цели работы и задачи исследования

В соответствии с этими целями были поставлены следующие задачи:

3. Определить и описать формы альтернативного сплайсинга гена пресенилина 1 человека.

4. Провести поиск возможных клеточных гомологов генов PS. Клонировать удаленные гомологи генов пресенилинов и провести первичный анализ экспрессии в клеточной культуре млекопитающих in vitro, и in vivo - на модели нокаутированных дрожжевых клеток и при ингибировании генов у почвенных нематод С. elegans методом дцРНК интерференции.

Научная новизна и практическая ценность работы

3. Выявлены и описаны различные формы альтернативного сплайсинга гена пресенилина 1 человека, а также впервые разработан чувствительный метод детекции транскрипта пресенилина 1 человека с делецией экзона 9.

4. Идентифицировано новое семейство генов-гомологов пресенилинов IMPAS (IMP). Впервые клонированы три изоформы гена ММР1, определены некоторые структурно-функциональные особенности IMP1 гена человека и его гомологов в системах клеток млекопитающих, беспозвоночных и дрожжей. Получены как теоретические, так и экспериментальные данные свидетельствующие о том, что hIMPI, как и пресенилин, является политопной аспартатной протеазой.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Григоренко, Анастасия Петровна

выводы

1. Сконструированы рекомбинантные плазмиды, содержащие нормальные и мутантные формы гена пресенилина 1 человека (hPSl) и его гомологов {IMPAS), способные экспрессироваться в клетках млекопитающих или дрозофилы. Получены клеточные линии млекопитающих (человека НЕК293, крысы PC 12, китайского хомячка СНО) и трансгенные линии Drosophila melanogaster, трансфицированные этими рекомбинантными плазмидами, которые могут быть использованы для изучения молекулярно-генетических механизмов Болезни Альцгеймера (БА).

3. В клетках мозга человека обнаружены две новые формы альтернативного сплайсинга гена hPSl. Разработан эффективный метод детекции транскриптов сплайсированной формы hPSl (hPSl&9) в лейкоцитах человека. Показано, что уровень экспрессии hPSlA9 может варьировать у различных людей.

4. Идентифицировано новое семейство генов, кодирующих консервативные политопные трансмембранные белки эукариот (импасы/ IMPAS/IMP) и архей (мембразы/ Membrase), которые имеют ряд важных структурных сходств с пресенилинами эукариотических организмов, включая инвариантные аминокислотные остатки и домены, регулирующие эндопротеолиз.

5. Клонированы и идентифицированы три альтернативные формы сплайсинга гена IMP1 человека. Показана экспрессия hIMPI в различных тканях и органах человека на уровне транскрипции. В клеточных культурах, трансфицированных геном hIMPI, показано, что белок hIMPI подвергается N-гликозилированию и детектируется в клетке, как в виде мономера, так и в составе высокомолекулярного комплекса.

6. Получены экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что hIMPI является аспартатной мембранной протеазой, отвечающей за расщепление политопных белков. В модельной системе трансфицированных клеточных линий показано участие hIMPI в протеолитическом расщеплении полноразмерной формы hPSl. Определена критическая роль инвариантных аспартатов и С-концевого пролинаhIMPI в протеолизе hPSl.

7. На модели нокаутированных линий дрожжей Saccharomyces cerevisiae показано, что гомолог генов IMP AS у дрожжей не является критическим фактором индукции UPR-сигнального клеточного ответа.

8. На модели нематоды Caenorhabditis elegans при инактивировании гена ортолога hIMPI - Ce-imp-2 методом дцРНК интерференции установлено, что этот ген необходим для нормального развития. Инактивация Ce-imp-2 приводила к эмбриональной гибели, а также гибели личинок на всех стадиях развития нематод за счет специфических нарушений процессов линьки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенной работы были получены новые векторные ДНК конструкции, содержащие нормальные и мутантные формы гена пресенилина 1 человека (hPSl). Сконструированные плазмиды были использованы для трансфекции клеток феохромацитомы крысы PC 12 и получения стабильных линий. Линии феохромацитомы крысы PC 12, экспрессирующие различные мутантные и нормальные формы гена hPSl, были исследованы на чувствительность к апоптотическим стимулам (депривации по трофическим факторам и факторам роста). Полученные данные свидетельствуют о том, что гиперэкспрессия мутантных форм пресенилина 1 человека (hPSl) C410Y и M146V в культуре клеток феохромоцитомы крысы линии PC 12 приводит к повышенной чувствительности клеток к различным апоптотическим стимулам, угнетению их пролиферативной активности, а также проявляется в отрицательной селекции трансгена в поликлональных культурах. Результаты получены для двух независимых мутаций, вызывающих БА. Наши исследования чувствительности клеток к апоптозу при экспресии мутантных форм hPSl согласуются с данными ряда авторов, полученными на других модельных системах (knock-in мыши, M146V - Guo et al., 1999b), для других мутаций в гене hPSl (L286V - Guo et al., 1999a), для других апоптотических стимулов (M146V, действию Р-амилоида - Guo et al., 1999а), а также для мутаций в гене-гомологе hPS2 (Deng et al., 1996; Wolozin et al., 1996). Стабильные нейрональноподобные культуры PC 12 с негативным действием мутантных генов пресенилинов могут быть использованы в дальнейшем как для изучения взаимодействия различных генов и белков в клетке, экспресии генов, так и для поиска синтетических соединений, потенциальных терапевтических средств БА.

Конструкции с различными формами генов пресенилина и никастрина, были использованы для получения трансгенных линий D. melanogaster. При исследовании влияния мутантных форм на структуру фасеток глаз трансгенных мух, фенотипических изменений выявлено не было. Действительно, независимые исследования группы М. Fortini (Университет Пенсильвании, США) на линиях, экспрессирующих мутантные гены пресенилина, показали, что апоптоз в фасетках глаз можно вызвать только при 2-4-х кратном увеличении дозы генов в трансгенных мухах. При этом фенотип "неровного" глаза обнаруживается как при гиперэкспресии мутантных, так и нормальных форм пресенилина, что по-видимому свидетельствует о не физиологичности наблюдаемых эффектов. В нашей работе мы показали, что экспрессия одной копии трансгена (PS или Net) не нарушала основных функций при формировании структуры фасеток D. melanogaster.

В клетках мозга человека были найдены формы альтернативного сплайсинга гена hPSl - hPSlA9 и hPSlA9tr. Данные изоформы пресенилина интересны тем, что кодируют белки с инактивированным каталитическим центром. Возможно, hPSlД9 является фактором, регулирующим активность основной полноразмерной клеточной формы пресенилина. С помощью нового чувствительного метода амплификации сплайсированного транскрипта, экспрессия HPS1A9 альтернативного транскрипта была обнаружена в клетках крови человека. Предварительные данные показывают, что образование сплайсированной формы hPS!A9 динамически регулируется в клетках крови человека.

В настоящей работе был проведен поиск дальних гомологов пресенилинов. Было идентифицировано и описано новое семейство генов и белков (импас/IMPAS), ранее не описанных в литературе, которые имеют ряд важных структурных и функциональных сходств с пресенилинами эукариотических организмов. Человеческий IMP1 ген был клонирован, выявлены альтернативные транскрипты hIMPI гена в мозге и в клетках крови человека. Исследование транскриптов гена hIMPI показало высокий уровень его экспрессии в различных тканях и органах человека, за исключением сердца и скелетных мышц. В различных культурах клеток млекопитающих (НЕК293, PC 12, СНО) для белка hIMPI характерно образование высокомолекулярных комплексов, встречающихся в клетке наряду с мономерной формой белков. Эндогенный белок hIMPI, также как и экзогенный, детектировался как в виде мономера, так и в составе высокомолекулярных комплексов. Было также найдено, что hIMPI в клетках подвергается N-гликозилированию.

Функциональное исследование гена hIMPI включало несколько модельных систем - трансфицированные клеточные линии млекопитающих, клетки дрожжей, нематод. Получены экспериментальные данные свидетельствующие о том, что hIMPI, как и пресенилины, является политопной аспартатной протеазой. В модельной системе трансфицированных клеточных линий показано участие hIMPI в протеолитическом расщеплении полноразмерной формы hPSl. В независимых исследованиях группы В. Martoglio недавно было показано, что SPP (синоним hIMPl) может расщеплять сигнальные пептиды внутри мембранного домена, что также свидетельствует о функциональном сходстве импасов и пресенилинов (Weihofen et al., 2002). В наших исследованиях было впервые показано, что субстратом интрамембранных протеаз может быть политопный мембранный белок.

На модели нокаутированных линий дрожжей S. cerevisiae были получены данные, свидетельствующих о том, что IMPAS не играет функциональной роли в индукции UPR-сигнального ответа в клетке. Показано, что IMPAS не является жизненно-необходимым геном для нормального развития, образования диплоидов и споруляции дрожжей.

Оригинальное исследование функций ортолога hIMPl гена в многоклеточном организме С. elegans проведено с помощью двуцепочечной РНК интерференции (дцРНКи, dsRNAi). Показано, что Ce-imp-2 играет важную роль как в эмбриональном, так и в личиночном развитии С. elegans, обеспечивая нормальное прохождение процессов линьки. Т.к. Ce-imp-2 является высококонсервативным гомологом гена hIMPl, можно сделать предположение о важной роли гена IMP1 человека в процессах развития.

Таким образом, в данной работе был проведен структурно-функциональный анализ различных изоформ генов пресенилинов и их гомологов с использованием широкого круга методических подходов и разнообразных модельных систем, что позволило получить ряд важных данных в изучении природы аспартатных протеаз и их функций в жизнедеятельности организма, в норме и патологии. Использование полученных конструкций и клеточных линий позволит в дальнейшем провести более детальные исследования роли генов пресенилинов и их гомологов в нормальном развитии и при БА.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Григоренко, Анастасия Петровна, Москва

1. Григоренко, А. П., Моляка Ю. К., Коровайцева, Г. И., Рогаев, Е. И. Обнаружение нового класса полнтопных белков с доменами, ассоциированными с возможной протеиназной активностью. Биохимия, 2002, т.67, стр.995-1005.

2. Маниатис, Т., Фрич, Э., Сэмбрук, Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.

3. Alzheimer's Disease Collaborative Group. The structure of the presenilin 1 (SI82) gene and identification of six novel mutations in early onset AD families. Nat.Genet., 1995, v. 11, pp.219-222.

4. Andersson, С. X., Fernandez-Rodriguez, J., Laos, S., Baeckstrom, D., Haass, C., and Hansson, G. C. Shedding and gamma-Secretase mediated intramembrane proteolysis of the mucin-type molecule CD43. Biochem.J., 2004

5. Araki, W., Yuasa, K., Takeda, S., Shirotani, K., Takahashi, K., and Tabira, T. Overexpression of presenilin-2 enhances apoptotic death of cultured cortical neurons Ann.N.Y.Acad.Sci., 2000, v.920, pp.241-244.

6. Asai, M., Hattori, C., Szabo, В., Sasagawa, N., Maruyama, K., Tanuma, S., and Ishiura, S. Putative function of ADAM9, ADAM 10, and ADAM 17 as APP alpha-secretase. Biochem.Biophys.Res.Commun., 2003, v.301, pp.231-235.

7. Bardy, S. L. and Jarrell, K. F. Cleavage of preflagellins by an aspartic acid signal peptidase is essential for flagellation in the archaeon Methanococcus voltae Mol.Microbiol., 2003, v.50, pp. 1339-1347.

8. Bardy, S. L., Eichler, J., and Jarrell, K. F. Archaeal signal peptides-a comparative survey at the genome level. Protein Sci., 2003, v.12, pp.1833-1843.

9. Barinaga, M. Is apoptosis key in Alzheimer's disease? Science, 1998, v.281, pp.1303-1304.

10. Blacker, D., Bertram, L., Saunders, A. J., Moscarillo, T. J., Albert, M. S., Wiener, H., Perry, R. Т., Collins, J. S., Harrell, L. E., Go, R. C., Mahoney, A., Beaty, Т.,

11. Boulianne, G. L., Livne-Bar, I., Humphreys, J. M., Liang, Y., Lin, C., Rogaev, E., and St George-Hyslop, P. Cloning and characterization of the Drosophila presenilin homologue. Neuroreport, 1997, v.8, pp.1025-1029.

12. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal.Biochem., 1976, v.72, pp.248-254.

13. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans.Genetics, 1974, v.77, pp.7194.

14. Brown, M.S., Ye, J., Rawson, R.B., and Goldstein, J.L. Regulated intramembrane proteolysis: a control mechanism conserved from bacteria to humans. Cell, 2000, v. 100, pp.391-398.

15. Cao, X. and Sudhof, T. C. A transcriptionally correction of transcriptively. active complex of APP with Fe65 and histone acetyltransferase Tip60. Science, 2001, v.293, pp. 115-120.

16. Cao, X. and Sudhof, T. C. Dissection of amyloid-beta precursor protein-dependent transcriptional transactivation. J.Biol.Chem., 2004, v.279, pp.24601-24611.

17. Capell, A., Steiner, H., Romig, H., Keck, S., Baader, M., Grim, M. G., Baumeister, R., and Haass, C. Presenilin-1 differentially facilitates endoproteolysis of the beta-amyloid precursor protein and Notch. Nat.Cell Biol., 2000, v.2, pp.205-211.

18. Chu, S., DeRisi, J., Eisen, M,, Mulholland, J., Botstein, D., Brown, P. O., and Herskowitz, I. The transcriptional program of sporulation in budding yeast. Science, 1998, v.282, pp.699-705.

19. Combarros, O., varez-Arcaya, A., Sanchez-Guerra, M., Infante, J., and Berciano, J. Candidate gene association studies in sporadic Alzheimer's disease. Dement.Geriatr.Cogn Disord., 2002, v. 14, pp.41-54.

20. Conlon, R. A., Reaume, A. G., and Rossant, J. Notchl is required for the coordinate segmentation of somites. Development, 1995, v.121, pp.1533-1545.

21. Cox, J. S., Shamu, C. E., and Walter, P. Transcriptional induction of genes encoding endoplasmic reticulum resident proteins requires a transmembrane protein kinase. Cell, 1993, v.73, pp.1197-1206.

22. Deng, G., Pike, C. J., and Cotman, C. W. Alzheimer-associated presenilin-2 confers increased sensitivity to apoptosis in PC 12 cells. FEBS Lett., 1996, v.397, pp.50-54.

23. Donoviel, D. B„ Hadjantonakis, A. K., Ikeda, M., Zheng, H., Hyslop, P. S., and Bernstein, A. Mice lacking both presenilin genes exhibit early embryonic patterning defects. Genes Dev., 1999, v.13, pp.2801-2810.

24. Eckert, A., Marques, C. A., Keil, U., Schussel, K., and Muller, W. E. Increased apoptotic cell death in sporadic and genetic Alzheimer's disease. Ann.N.Y.Acad.Sci.,2003, v. 1010, pp.604-609.

25. Edbauer, D., Winkler, E., Haass, C., and Steiner, H. Presenilin and nicastrin regulate each other and determine amyloid beta-peptide production via complex formation. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 2002, v.99, pp.8666-8671.

26. Edbauer, D., Winkler, E., Regula, J. T., Pesold, B., Steiner, H., and Haass, C. Reconstitution of gamma-secretase activity. Nat.Cell Biol., 2003, v.5, pp.486-488.

27. Farrer, L. A., O'Sullivan, D. M., Cupples, L. A., Growdon, J. H., and Myers, R. H. Assessment of genetic risk for Alzheimer's disease among first-degree relatives. Ann.Neurol., 1989, v.25, pp.485-493.

28. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., and Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature, 1998, v.391, pp.806-811.

29. Forman, M. S. Genotype-phenotype correlations in FTDP-17: does form follow function? Exp.Neurol., 2004, v. 187, pp.229-234.

30. Fortna, R. R., Crystal, A. S., Moráis, V. A., Pijak, D. S., Lee, V. M., and Doms, R. W. Membrane topology and nicastrin-enhanced endoproteolysis of APH-1, a component of the gamma-secretase complex. J.Biol.Chem., 2004, v.279, pp.36853693.

31. Fraering, P. C., Ye, W., Strub, J. M., Dolios, G., LaVoie, M. J., Ostaszewski, B. L., van, D. A., Wang, R., Selkoe, D. J., and Wolfe, M. S. Purification and characterization of the human gamma-secretase complex. Biochemistry, 2004, v.43, pp.9774-9789.

32. Glenner, G. G. and Wong, C. W. Alzheimer's disease and Down's syndrome: sharing of a unique cerebrovascular amyloid fibril protein. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1984, v.122, pp.1131-1135.

33. Glenner, G. G. and Wong, C. W. Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1984, v. 120, pp.885-890.

34. Goutte, C., Hepler, W., Mickey, K. M., and Priess, J. R. aph-2 encodes a novel extracellular protein required for GLP-1-mediated signaling. Development, 2000, v.127, pp.2481-2492.

35. Goutte, C., Tsunozaki, M., Hale, V. A., and Priess, J. R. APH-1 is a multipass membrane protein essential for the Notch signaling pathway in Caenorhabditis elegans embryos. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 2002, v.99, pp.775-779.

36. Gowrishankar, K., Zeidler, M. G., and Vincenz, C. Release of a membrane-bound death domain by gamma-secretase processing of the p75NTR homolog NRADD. J.Cell Sci., 2004, v.l 17, pp.4099-4111.

37. Graeber, M. B., Kosel, S., Grasbon-Frodl, E., Moller, H. J., and Mehraein, P. Histopathology and APOE genotype of the first Alzheimer disease patient, Auguste D. Neurogenetics., 1998, v.l, pp.223-228.

38. Graeber, M. B. and Mehraein, P. Reanalysis of the first case of Alzheimer's disease. Eur.Arch.Psychiatry Clin.Neurosci., 1999, v.249 Suppl 3, pp.10-13.

39. Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K., Quinlan, M., Tung, Y. C., Zaidi, M. S., and Wisniewski, H. M. Microtubule-associated protein tau. A component of Alzheimer paired helical filaments. J.Biol.Chem., 1986, v.261, pp.6084-6089.

40. Guo, Q., Robinson, N., and Mattson, M. P. Secreted beta-amyloid precursor protein counteracts the proapoptotic action of mutant presenilin-1 by activation of NF-kappaB and stabilization of calcium homeostasis. J.Biol.Chem., 1998, v.273, pp.12341-12351.

41. Guo, Q., Fu, W., Holtsberg, F. W., Steiner, S. M., and Mattson, M. P. Superoxide mediates the cell-death-enhancing action of presenilin-1 mutations. J. Neurosci. Res., 1999, v.56, pp. 457-470.

42. Hardy, J. The Genetics of Alzheimer's Disease. Alzheimer's Disease and Related Disorders: Research Advances. Ana Asian Intl. Acad, of Aging, Bucharest, Romania, 2003, pp. 29-47.

43. Hardy, J„ Duff, K., Hardy, K. G., Perez-Tur, J., and Hutton, M. Genetic dissection of Alzheimer's disease and related dementias: amyloid and its relationship to tau. Nat.Neurosci., 1998, v.l, pp.355-358.

44. Hardy, J. A. and Higgins, G. A. Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis. Science, 1992, v.256, pp. 184-185.

45. Hecimovic, S., Wang, J., Dolios, G., Martinez, M., Wang, R., and Goate, A. M. Mutations in APP have independent effects on Abeta and CTFgamma generation. Neurobiol.Dis., 2004, v. 17, pp.205-218.

46. Ikeuchi, T. and Sisodia, S. S. The Notch ligands, Deltal and Jagged2, are substrates for presenilin-dependent "gamma-secretase" cleavage. J.Biol.Chem., 2003, v.278, pp.7751-7754.

47. Iso, T., Kedes, L., and Hamamori, Y. HES and HERP families: multiple effectors of the Notch signaling pathway. J.Cell Physiol, 2003, v.194, pp.237-255.

48. Janicki, S. and Monteiro, M. J. Increased apoptosis arising from increased expression of the Alzheimer's disease-associated presenilin-2 mutation (N1411). J.Cell Biol., 1997, v.139, pp.485-495.

49. Jarriault, S., Brou, C., Logeat, F., Schroeter, E. H., Kopan, R., and Israel, A. Signalling downstream of activated mammalian Notch. Nature, 1995, v.377, pp.355358.

50. Kametani, F. Secretion of long Abeta-related peptides processed at epsilon-cleavage site is dependent on the alpha-secretase pre-cutting. FEBS Lett., 2004, v.570, pp.73-76.

51. Kim, D. Y., Ingano, L. A., and Kovacs, D. M. Nectin-1 alpha, an immunoglobulin-like receptor involved in the formation of synapses, is a substrate for presenilin/gamma-secretase-like cleavage. J.Biol.Chem., 2002, v.277, pp.4997649981.

52. Kimberly, W. T., Zheng, J. B., Guenette, S. Y., and Selkoe, D. J. The intracellular domain of the beta-amyloid precursor protein is stabilized by Fe65 and translocates to the nucleus in a notch-like manner. J.Biol.Chem., 2001, v.276, pp.40288-40292.

53. Kitagawa, N., Shimohama, S., Oeda, T., Uemura, K., Kohno, R., Kuzuya, A., Shibasaki, H., and Ishii, N. The role of the presenilin-1 homologue gene sel-12 of Caenorhabditis elegans in apoptotic activities. J.Biol.Chem., 2003, v.278, pp. 1213012134.

54. Kosik, K. S., Joachim, C. L., and Selkoe, D. J. Microtubule-associated protein tau (tau) is a major antigenic component of paired helical filaments in Alzheimer disease. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 1986, v.83, pp.4044-4048.

55. Kume, H., Maruyama, K., and Kametani, F. Intracellular domain generation of amyloid precursor protein by epsilon-cleavage depends on C-terminal fragment by alpha-secretase cleavage. Int.J.Mol.Med., 2004, v.13, pp.121-125.

56. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, v.227, pp.680-685 .

57. LaPointe, C. F. and Taylor, R. K. The type 4 prepilin peptidases comprise a novel family of aspartic acid proteases. J.Biol.Chem., 2000, v.275, pp.1502-1510.

58. LaVoie, M. J. and Selkoe, D. J. The Notch ligands, Jagged and Delta, are sequentially processed by alpha-secretase and presenilin/gamma-secretase and release signaling fragments. J.Biol.Chem., 2003, v.278, pp.34427-34437.

59. Lee, H. J., Jung, K. M., Huang, Y. Z., Bennett, L. B., Lee, J. S., Mei, L., and Kim, T. W. Presenilin-dependent gamma-secretase-like intramembrane cleavage of ErbB4

60. J.Biol.Chem., 2002, v.277, pp.6318-6323.

61. Lee, S. F., Shah, S., Li, H., Yu, C., Han, W., and Yu, G. Mammalian APH-1 interacts with presenilin and nicastrin and is required for intramembrane proteolysis of amyloid-beta precursor protein and Notch. J.Biol.Chem., 2002, v.277, pp.4501345019.

62. Levitan, D. and Greenwald, I. Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer's disease gene. Nature, 1995, v.377, pp.351-354.

63. Levitan, D. and Greenwald, I. Effects of SEL-12 presenilin on LIN-12 localization and function in Caenorhabditis elegans. Development, 1998, v. 125, pp.3599-3606.

64. Levitan, D., Lee, J., Song, L., Manning, R., Wong, G., Parker, E., and Zhang, L. PS1 N- and C-terminal fragments form a complex that functions in APP processing and Notch signaling. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 2001, v.98, pp.12186-12190.

65. Levy-Lahad, E., Wasco, W., Poorkaj, P., Romano, D. M., Oshima, J., Pettingell, W. H., Yu, C. E., Jondro, P. D., Schmidt, S. D., Wang, K., and . Candidate gene for the chromosome 1 familial Alzheimer's disease locus. Science, 1995, v.269, pp.973977.

66. Li, J., Xu, M., Zhou, H., Ma, J., and Potter, H. Alzheimer presenilins in the nuclear membrane, interphase kinetochores, and centrosomes suggest a role in chromosome segregation. Cell, 1997, v.90, pp.917- 927.

67. Li, X. and Greenwald, I. HOP-1, a Caenorhabditis elegans presenilin, appears to be functionally redundant with SEL-12 presenilin and to facilitate LIN-12 and GLP-1 signaling. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 1997, v.94, pp. 12204-12209.

68. Li, X. and Greenwald, I. Additional evidence for an eight-transmembrane-domain topology for Caenorhabditis elegans and human presenilins. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 1998, v.95, pp.7109-7114.

69. Alzheimer's disease with genetic variation in multiple members of the GAPD gene family. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 2004, v.101, pp.15688-15693.

70. Logeat, F., Bessia, C., Brou, C., LeBail, O., Jarriault, S., Seidah, N. G., and Israel, A. The Notch 1 receptor is cleaved constitutively by a furin-like convertase. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 1998, v.95, pp.8108-8112.

71. Luo, W. J., Wang, H., Li, H., Kim, B. S., Shah, S., Lee, H. J., Thinakaran, G., Kim, T. W., Yu, G., and Xu, H. PEN-2 and APH-1 coordinately regulate proteolytic processing of presenilin 1. J.Biol.Chem., 2003, v.278, pp.7850-7854.

72. Luo, X. and Hofmann, K. The protease-associated domain: a homology domain associated with multiple classes of proteases. Trends Biochem.Sci., 2001, v.26 , pp. 147-148.

73. Mahon, P. and Bateman, A. The PA domain: a protease-associated domain. Protein Sci., 2000, v.9, pp. 1930-1934.

74. Marambaud, P., Wen, P. H., Dutt, A., Shioi, J., Takashima, A., Siman, R., and Robakis, N. K. A CBP binding transcriptional repressor produced by the PSl/epsilon-cleavage of N-cadherin is inhibited by PS1 FAD mutations. Cell, 2003, v.l 14, pp.635645.

75. Mattson, M. P. Oxidative stress, perturbed calcium homeostasis, and immune dysfunction in Alzheimer's disease. J.Neurovirol., 2002, v.8, pp.539-550.

76. Mattson, M. P. and Chan, S. L. Neuronal and glial calcium signaling in Alzheimer's disease. Cell Calcium, 2003, v.34, pp.385-397.

77. Maurer, K., Volk, S., and Gerbaldo, H. Auguste D and Alzheimer's disease. Lancet, 1997, v.349, pp.1546-1549.

78. May, P., Reddy, Y. K., and Herz, J. Proteolytic processing of low density lipoprotein receptor-related protein mediates regulated release of its intracellular domain. J.Biol.Chem., 2002, v.277, pp. 18736-18743.

79. May, P., Bock, H. H., Nimpf, J., and Herz, J. Differential glycosylation regulates processing of lipoprotein receptors by gamma-secretase. J.Biol.Chem., 2003, v.278, pp.37386-37392.

80. Moliaka, Y. K., Grigorenko, A., Madera, D., and Rogaev, E. I. Impas 1 possesses endoproteolytic activity against multipass membrane protein substrate cleaving the presenilin 1 holoprotein. FEBS Lett., 2004, v.557, pp.185-192.

81. Moon, R. T., Kohn, A. D., De Ferrari, G. V., and Kaykas, A. WNT and beta-catenin signalling: diseases and therapies. Nat.Rev.Genet., 2004, v.5, pp.691-701.

82. Ni, C. Y., Murphy, M. P., Golde, T. E., and Carpenter, G. gamma -Secretase cleavage and nuclear localization of ErbB-4 receptor tyrosine kinase. Science, 2001, v.294, pp.2179-2181.

83. Niwa, M., Sidrauski, C., Kaufman, R. J., and Walter, P. A role for presenilin-1 in nuclear accumulation of Irel fragments and induction of the mammalian unfolded protein response. Cell, 1999, v.99, pp.691-702.

84. Novak, M., Kabat, J., and Wischik, C. M. Molecular characterization of the minimal protease resistant tau unit of the Alzheimer's disease paired helical filament. EMBO J., 1993, v. 12, pp.365-370.

85. Okochi, M., Steiner, H„ Fukumori, A., Tanii, H., Tomita, T., Tanaka, T., Iwatsubo, T., Kudo, T., Takeda, M., and Haass, C. Presenilins mediate a dual intramembranous gamma-secretase cleavage of Notch-1. EMBO J., 2002, v.21, pp.5408-5416.

86. Pedersen, N. L., Gatz, M., Berg, S., and Johansson, B. How heritable is Alzheimer's disease late in life? Findings from Swedish twins. Ann.Neurol., 2004, v.55, pp.180-185.

87. Peterson, G. L. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Anal.Biochem., 1977, v.83, pp.346-356.

88. Prasher, V. P., Farrer, M. J., Kessling, A. M., Fisher, E. M., West, R. J., Barber, P. C., and Butler, A. C. Molecular mapping of Alzheimer-type dementia in Down's syndrome. Ann.Neurol., 1998, v.43, pp.380-383.

89. Raff, T., van der, G. M., Endemann, D., Wiederholt, T., and Paul, M. Design and testing of beta-actin primers for RT-PCR that do not co-amplify processed pseudogenes. Biotechniques, 1997, v.23, pp.456- 460.

90. Ray, W. J., Yao, M., Nowotny, P., Mumm, J., Zhang, W., Wu, J. Y., Kopan, R., and Goate, A. M. Evidence for a physical interaction between presenilin and Notch. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 1999, v.96, pp.3263-3268.

91. Rocchi, A., Pellegrini, S., Siciliano, G., and Murri, L. Causative and susceptibility genes for Alzheimer's disease: a review. Brain Res.Bull., 2003, v.61, pp. 1-24.

92. Rocheleau, C. E., Downs, W. D., Lin, R., Wittmann, C., Bei, Y., Cha, Y. H., Ali, M., Priess, J. R., and Mello, C. C. Wnt signaling and an APC-related gene specify endoderm in early C. elegans embryos. Cell, 1997, v.90, pp.707-716.

93. Schlondorff, J. and Blobel, C. P. Metalloprotease-disintegrins: modular proteins capable of promoting cell-cell interactions and triggering signals by protein-ectodomain shedding. J.Cell Sci., 1999, v.l 12 ( Pt 21), pp.3603-3617.

94. Schroeter, E. H., Kisslinger, J. A., and Kopan, R. Notch-1 signalling requires ligand-induced proteolytic release of intracellular domain. Nature, 1998, v.393, pp.382-386.

95. Schulz, J. G., Annaert, W., Vandekerckhove, J., Zimmermann, P., de, S. B., and David, G. Syndecan 3 intramembrane proteolysis is presenilin/gamma-secretase-dependent and modulates cytosolic signaling. J.Biol.Chem., 2003, v.278, pp.4865148657.

96. Serpell, L. C. Alzheimer's amyloid fibrils: structure and assembly. Biochim.Biophys.Acta, 2000, v.1502, pp.16-30.

97. Shearman, M. S., Ragan, C. I., and Iversen, L. L. Inhibition of PC12 cell redox activity is a specific, early indicator of the mechanism of beta-amyloid-mediated cell death. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 1994, v.91, pp. 1470-1474.

98. Shen, J., Bronson, R. T., Chen, D. F., Xia, W., Selkoe, D. J., and Tonegawa, S. Skeletal and CNS defects in Presenilin-1-deficient mice. Cell, 1997, v.89, pp.629-639.

99. Sherman, F. Getting started with yeast. Methods Enzymol., 2002, v.350, pp.3-41.

100. Sherrington, R., Rogaev, E. I., Liang, Y., Rogaeva, E. A., Levesque, G., Ikeda, M., Chi, H., Lin, C., Li, G., Holman, K. , and . Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease. Nature, 1995, v.375, pp.754760.

101. Simons, M., de, S. B., Multhaup, G., Tienari, P. J., Dotti, C. G., and Beyreuther, K. Amyloidogenic processing of the human amyloid precursor protein in primary cultures of rat hippocampal neurons. J.Neurosci., 1996, v. 16, pp.899-908.

102. Sisodia, S. S. and St George-Hyslop, P. H. gamma-Secretase, Notch, Abeta and Alzheimer's disease: where do the presenilins fit in? Nat.Rev.Neurosci., 2002, v.3, pp.281-290.

103. Six, E., Ndiaye, D., Laabi, Y., Brou, C., Gupta-Rossi, N., Israel, A., and Logeat, F. The Notch Iigand Delta 1 is sequentially cleaved by an ADAM protease and gamma-secretase. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 2003, v. 100, pp.7638-7643.

104. Struhl, G. and Adachi, A. Nuclear access and action of notch in vivo. Cell, 1998, v.93, pp.649-660.

105. Struhl, G. and Greenwald, I. Presenilin is required for activity and nuclear access of Notch in Drosophila. Nature, 1999, v.398, pp.522-525.

106. Struhl, G. and Greenwald, I. Presenilin-mediated transmembrane cleavage is required for Notch signal transduction in Drosophila. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 2001, v.98, pp.229-234.

107. Su, J. H., Anderson, A. J., Cummings, B. J., and Cotman, C. W. Immunohistochemical evidence for apoptosis in Alzheimer's disease. Neuroreport, 1994, v.5, pp.2529-2533.

108. Swiatek, P. J., Lindsell, C. E., del Amo, F. F., Weinmaster, G., and Gridley, T. Notch 1 is essential for postimplantation development in mice. Genes Dev., 1994, v.8, pp.707-719.

109. Tabara, H., Hill, R. J., Mello, C. C., Priess, J. R., and Kohara, Y. pos-1 encodes a cytoplasmic zinc-finger protein essential for germline specification in C. elegans. Development, 1999, v. 126, pp. 1 -11.

110. Takasugi, N., Tomita, T., Hayashi, I., Tsuruoka, M., Niimura, M., Takahashi, Y., Thinakaran, G., and Iwatsubo, T. The role of presenilin cofactors in the gamma-secretase complex. Nature, 2003, v.422, pp.438-441.

111. Taniguchi, Y., Kim, S. H., and Sisodia, S. S. Presenilin-dependent "gamma-secretase" processing of deleted in colorectal cancer (DCC). J.Biol.Chem., 2003, v.278, pp.30425-30428.

112. Tirasophon, W., Lee, K., Callaghan, B., Welihinda, A., and Kaufman, R. J. The endoribonuclease activity of mammalian IRE1 autoregulates its mRNA and is required for the unfolded protein response. Genes Dev., 2000, v. 14, pp. 2725-2736.

113. Urban, S., and Freeman, M. Intramembrane proteolysis controls diverse signalling pathways throughout evolution. Curr. Opin. Genet. Dev., 2002, v. 12, pp.512-518.

114. Van, B. C., Backhovens, H., Cruts, M., De, W. G., Bruyland, M., Cras, P., and Martin, J. J. Mapping of a gene predisposing to early-onset Alzheimer's disease to chromosome 14q24.3. Nat.Genet., 1992, v.2, pp.335-339.

115. Walter, J., Capell, A., Grunberg, J., Pesold, B., Schindzielorz, A., Prior, R., Podlisny, M. B., Fraser, P., Hyslop, P. S., Selkoe, D. J., and Haass, C. The

116. Alzheimer's disease-associated presenilins are differentially phosphorylated proteins located predominantly within the endoplasmic reticulum. Mol.Med., 1996, v.2, pp.673-691.

117. Wang, X. Z., Harding, H. P., Zhang, Y., Jolicoeur, E. M., Kuroda, M., and Ron, D. Cloning of mammalian Irel reveals diversity in the ER stress responses. EMBO J.,1998, v.17, pp.5708-5717.

118. Weihl, C. C., Ghadge, G. D., Kennedy, S. G., Hay, N., Miller, R. J., and Roos, R. P. Mutant presenilin-1 induces apoptosis and downregulates Akt/PKB. J.Neurosci. ,1999, v.19, pp.5360-5369.

119. Weihofen, A., Binns, K., Lemberg, M. K., Ashman, K., and Martoglio, B. Identification of signal peptide peptidase, a presenilin-type aspartic protease. Science, 2002, v.296, pp.2215-2218.

120. Wilhelmsen, K. and van der, G. P. Phorbol 12-myristate 13-acetate-induced release of the colony-stimulating factor 1 receptor cytoplasmic domain into the cytosol involves two separate cleavage events. Mol.Cell Biol., 2004, v.24, pp.454-464.

121. Wimo, A., Winblad, B., guero-Torres, H., and von, S. E. The magnitude of dementia occurrence in the world. Alzheimer Dis.Assoc.Disord., 2003, v. 17, pp.63-67.

122. Wisniewski, K. E., Wisniewski, H. M., and Wen, G. Y. Occurrence of neuropathological changes and dementia of Alzheimer's disease in Down's syndrome. Ann.Neurol., 1985, v. 17, pp.278-282.

123. Wolfe, M. S., De Los, A. J., Miller, D. D., Xia, W., and Selkoe, D. J. Are presenilins intramembrane-cleaving proteases? Implications for the molecular mechanism of Alzheimer's disease. Biochemistry, 1999, v.38, pp.11223-11230.

124. Wolfe, M. S., Xia, W., Ostaszewski, B. L., Diehl, T. S., Kimberly, W. T., and Selkoe, D. J. Two transmembrane aspartates in presenilin-1 required for presenilin endoproteolysis and gamma-secretase activity. Nature, 1999, v.398, pp.513-517.

125. Wood, J. G., Mirra, S. S., Pollock, N. J., and Binder, L. I. Neurofibrillary tangles of Alzheimer disease share antigenic determinants with the axonal microtubule-associated protein tau (tau). Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 1986, v.83, pp.4040-4043.

126. Xia, W., Zhang, J., Perez, R., Koo, E. H., and Selkoe, D. J. Interaction between amyloid precursor protein and presenilins in mammalian cells: implications for the pathogenesis of Alzheimer disease. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 1997, v.94, pp.82088213.

127. Yamatsuji, T., Okamoto, T., Takeda, S., Murayama, Y., Tanaka, N., and Nishimoto, I. Expression of V642 APP mutant causes cellular apoptosis as Alzheimer trait-linked phenotype. EMBO J., 1996, v. 15, pp.498-509.

128. Ye, Y. and Fortini, M. E. Apoptotic activities of wild-type and Alzheimer's disease-related mutant presenilins in Drosophila melanogaster. J.Cell Biol., 1999, v.146, pp.1351-1364.

129. Ye, Y., Lukinova, N., and Fortini, M. E. Neurogenic phenotypes and altered Notch processing in Drosophila Presenilin mutants. Nature, 1999, v.398, pp.525-529 .

130. Zhang, Z., Nadeau, P., Song, W., Donoviel, D., Yuan, M., Bernstein, A., and Yankner, B. A. Presenilins are required for gamma-secretase cleavage of beta-APP and transmembrane cleavage of Notch-1. Nat.Cell Biol., 2000, v.2, pp.463-465.

131. Zhao, G., Mao, G., Tan, J., Dong, Y., Cui, M. Z., Kim, S. H., and Xu, X. Identification of a new presenil in-dependent zeta -cleavage site within the transmembrane domain of amyloid precursor protein. J.Biol.Chem., 2004,

Информация о работе

Григоренко, Анастасия Петровна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.15

Диссертация

Исследование гена пресенилина 1 человека и его гомологов в модельных системах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы