Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и молекулярный анализ нового нейроспецифического гена, изменяюшего свою экспрессию в развитии

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и молекулярный анализ нового нейроспецифического гена, изменяюшего свою экспрессию в развитии"

Г. Г 1

4 I

На правах рукописи УДК 575:595

КИСЕЛЕВ Сергей Львович

КЛОНИРОВАНИЕ И МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ НОВОГО НЕЙРОСПЕЦИФИЧЕСКОГО ГЕНА, ИЗМЕНЯЮЩЕГО СВОЮ ЭКСПРЕССИЮ В РАЗВИТИИ

специальность 03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва

1995

Работа выполнена в лаборатории организации генома Института молекулярной биологии РАН им. В.А. Энгельгардта

Научные руководители:

доктор биологических наук Н.В. Гнучев,

кандидат биологических наук ВЛ.Бухман

Официальные оппоненты:

чл-корр. РАН, доктор медицинских наук, проф. Л.И.Корочкин, доктор биологических наук А.А. Габибов

Ведущая организация :

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится .....1995 года в

час. на заседании Диссертационного совета Д.200.30.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 117334, Москва, ул. Вавилова 34/5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В А Энгельгардта РАН

" « %

Автореферат разослан 1995 года Ученый секретарь

Диссертационного совгча • • •

канд. фарм,наук Грабовская Л.С.

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность задачи

Исследование мозга - одна из древнейших областей науки. Его изучение сильно ускорилось к концу XIX века, новые методики, разработанные после второй мировой войны, привели к значительным успехам, и в последнее десятилетие нейробиология стала одной из самых активных отраслей науки. Следствием этого недавно явился подлинный взрыв открытий и прозрений. Но тем не менее, изучение мозга только начинается. Констатация сложности мозга стала уже штампом, однако же это факт.

Весьма интенсивные функциональные изменения происходят в центральной нервной системе в течении раннего постнатольного развития организма млекопитающих. Исследования последних лет показали, что практически все гены эукариот имеют довольно сложную структуру, обуславливающую их правильную временную и тканеспецифичную экспрессию, а так же характер этой экспрессии. Регуляторная часть гена, обеспечивающая его работу в большинстве случаев находится в области, расположенной непосредственно перед точкой начала транскрипции и имеет размеры от нескольких тыс. нуклеотидных пар до нескольких сотен тысяч. Эта регуляторная часть может включать в себя модуляторы транскрипции, такие как сайленсеры и энхансеры, гомеобоксы, а также последовательности ДНК, связывающиеся с белками-трансрегуляторами.

Один из классов таких транс-регуляторных белков называется белком с цинковыми пальцами. Эти" белки связываются с нуклеиновыми кислотами и имеют общую характерную черту: определенное положение цистеиновых или цисте ин-

гистидиновых остатков, которые способны связывать ионы цинка. Некоторые из этих консенсусных аминокислотных последовательностей были охарактеризованы, и была установлена корреляция между их структурой, функцией и способностью связываться с нуклеиновыми кислотами. Белки со структурой цинковых пальцев являются широко распостраненными и участвуют в сборке вирусных частиц (Gorclick et al., 1988), эмбриогенезе (Vincent et al., 1988), определении пола (Mardon et al., 1989) и клеточной пролиферации (Joseph et al., 1988). Некоторые виды белков с "цинковыми пальцами" играют важную роль в развитии нервной системы (Gaul et al.,1987, Chowhuhury et al., 1988), но большинство известных на сегодняшний момент генов, кодирующих подобные белки, экспрессируются одновременно в большом количестве различных тканей, что указывает на их важную роль в процессе развития вообще и не являются специфическими для нейрогенеза.

В связи с вышеизложенным, несомненный интерес представляет клонирование и характеристика генов, экспрессирующихся в нейрогенезе и являющихся возможными регуляторами процесса развития центральной нервной системы в целом, а также ее отделов.

Цель работы.

Основная цель настоящей работы состояла в клонировании генов, специфически экспрессирующихся в центральной нервной системе в период раннего постнатального развития.

В ходе исследования предполагалось решение следующих экспериментальных задач:

1. Клонирование гена, экспрессирующегося на определенной стадии нейрогенеза.

2. Изучение его структуры.

к

3. Изучение специфичности его экспрессии в центральной нервной системе и на определенных стадиях ее развития.

4. Определение возможной роли клонированного гена в ■ процессе нейрогенеза.

Научная новизна и практическое значение работы.

В настоящей работе был применен метод дифференциальной гибридизации для идентификации генов крысы, экспрессирующихся в нейрогенезе. Клонирван ген нейро-ё4, экспрессируюшийся в определенных отделах нервной системы и изменяющий уровень экспрессии в процессе эмбриогенеза нервной системы и в постнатальном развитии. Ген высокоспецифично экспрессируется в церебелуме и кортексе и имеет наиболее высокий уровень экспрессии на 2-5 день после рождения. Открытая рамка считывания кодирует полипептид, состоящий из 387 аминокислотных остатков , не имеющий гомологий с известными белками, кроме района, имеющего характерную структуру для связывания ионов цинка. Обнаружен ряд. сплайс-вариангов гена, изменяющих его аминокислотную последовательность в районе "цинковых пальцев". Картина экспрессии гена специфична для различных групп нейронов. Предполагается, что нейро-с!4 является транскрипционным фактором.

Практическое значение настоящей работы состоит в исследовании механизмов развития нервной системы и факторов, оказавающих влияние на определенный путь развития отдельных отделов нервной системы и групп нейронов.

Работа была апробирована на следующих симпозиумах и конференциях: второй Лондонский симпозиум по нейробиологии

(1991), 15-ый Международный симпозиум Европейской Нейробиологической Ассоциации (Германия, 1992). Публикации.

По теме диссертации опубликовано две печатные работы.

.ш

Диссертация изложена на<Г™. страницах машинописного текста и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, выводы и список литературы. Библиография включает в себя 1Г?..< источников. Работа проиллюстрирована . рисунками и таблицами.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Конструирование и скрининг библиотеки кЛНК из крысиного

церебрального кортекса,

Для конструирования библиотеки была использована полиаденилированная РНК, выделенная из кортскса 7-9 дневных крысят. кДНК была синтезирована с помощью набора реагентов фирмы Амершам и клонирована в вектор на основе фага лямбда С высеянной библиотеки были сняты три реплики, содержащие суммарно более 60000 клонов. Для

дифференциального скрининга библиотеки использовали высокомеченную кДНК, полученную в реакции обратной транскрипции, трех различных мРНК: полиА+РНК из кортекса 7-9 дневных крысят, из кортекса взрослых крыс и печени взрослых крыс. Гибридизация проводилась в стандартных условиях. Сигналы, полученные на различных репликах, сравнивались между собой по наличию на всех репликах и интенсивности, полученные клоны отбирались для последующих циклов гибридизации. Клон, на котором остановилось наше внимание, давал сильный гибридизационный сигнал с кДНК, синтезированной на основе полиА+РНК из 7-9 дневных крысят,

гибридизовался слабо с кДНК кортекса взрослых крыс и не давал никакого сигнала с кДНК печени. Для этого клона подобное распределение интенсивностей имело место во всех трех раундах гибридизации, проведенных для очистки клона. Размер клонированного фрагмента составлял 850 н.п. и был использован для Нозерн-гибридизации с тотальной РНК из кортекса молодых крысят и печени взрослой крысы. После того, как подтвердилась нейроспецифичносггь клонированного фрагмента (рис. 1а), он был использован как зонд в дальнейшей работе. К сожалению, нам не удалось проклонировать из библиотеки кДНК фрагмент большего размера, как оказалось в последствии, мРНК гена нейро-(14 формирует очень прочную вторичную структуру на 3'-нетранслируемом конце РНК.

2. Структура клонированной кДНК. геномный клон.

Для того, чтобы преодолеть эту проблему, была сконструирована геномная библиотека. Из нее был получен клон, соответствующий геномному участку гена нейро-<14, полученный участок был картирован (рис.2), и различные участки этого клона использовались как зонды для получения перекрывающихся клонов кДНК, из заново сконструированной библиотеки, содержащей фрагменты кДНК большего размера, в том числе и практически полноразмерные. Клоны были субклонированы в плазмидные вектора и секвенированы по методу Сэнгера. Первичная нуклеотидная последовательность определялась по обеим цепям ДНК, были также секвенированы нуклеотидные последовательности участков слияния экзонов и интронов гена нейро d4 крысы, данные по которым сведены в табл.1. Полная нуклеотидная последовательность гена приведена на рис.3.

о

•в s

5

CD

С

?

Q.

1 Е15

г Е18

t Е21

с Р1

t Р4

к Р6

1 Р10

с Р15

1 РЗО

1 >45

El)

9

Q.

mri?-

m

fO ^ ID

^ 'p. in U1

I l II

cx

CRB

SPC

DRG

SPL

THY

LUNG

HEART

Рис.2. Карта гена нсйро-(34, соответствующего геномного клона и фрагментов кДНК. Я- ЕсоШ, Х- ХЬо1, В- ВашН1, Вв- В,

шлрон-экзонная организация гена нейро-<54.

3. Клонированный ген кодирует новый тип белка с "ЦИНКОВЫМИ_пальцами".

В наиболее протяженном транскрипте первый АТС кодон (53 нп) скорее всего является сайтом инициации транскрипции, т.к. он удовлетворяет условиям Козак (Когак, 1989) по инициации транскрипции : пурин -3 и О в +4 положении от первого нуклеотида АТС кодона, и таким образом, длина открытой рамки составляет 387 аминокислот. Проведенный компьютерный анализ поиска гомологии, в имеющихся базах данных (5\У!88Р1ЮТ, ОЕЫЕВАМК), не обнаружил никаких существенных гомологий, кроме одного района полипепгидной последовательности 193-221 а.к., который с высокой степенью точности совпадал с консенсусом последовательности белка с "цинковыми пальцами" Круппелевского типа (рис.3 и. 4а). Обычная протяженность петли, образованной между двумя соседними гистадииами в белках подобного типа составляет 2-4 аминокислоты. В случае <14 два гистидиновых основания обнаруживаются в позициях 216 и 218, и трудно предсказать, какой из этих гистидинов ориентирован на ион цинка. Если рассматривать гистшшн в позиции 218, как аминокислоту формирующую "цинковый палец", то расстояние между аминокислотами соответствует классическому типу, но с другой стороны, гистидин в позиции 216 лучше удовлетворяет критерию окружающих "цинковый палец" аминокислотных остатков. Сама "пальцевая" структура замыкается рядом глютаминовых кислот и одним глицином. Подобный кислый участок по некоторым данным (РсазЬпе, 1988) является важным участком активаторной последовательности в некоторых транскрипционных факторах. Основной аминокислотный^ домен находится на Ы-конце белка и структура этого домена содержит сигнальную последовательность ядерной локализации белка (СЬекку й а1., 1989).

м bawmimmmcwMfwuM

2 «TkmUW

<10

ТАБЛИЦА 1

и» ^'т^'-'т-'г-"-"" ■ r«m«

__т »»Щ it KlrttUwaiUjiiU

• I г» imtu мпл » мидтАтвоатгомдетстесо! «пледе

•tefiwiMi • mtt*trftkrCl<Tk(i<rt

Г"** * "*' ft» * ~rf ileCte* 1Г

1SV7 fiifm<n*ft~HrfT*fm"'^'"''f"*'*1^'J 4-№i ■ i-wrrtrrrri 1ЧЫ*

221 Ugflliifllaallfil8$UHleT*irel**r1*l**lel**,,e,*^BleAelL,e***

ОАО-gU» I ccgcag-CCT

CTG-gtu П ctcUg-GTT

Tea-jit» Ш ctcag-АТГ

CAG-jUg IV gccoag-AAA

AAG-gtil V cOeacGCO

АТА-gtg» VI ciceig-TCT

ААС-gtg» vn cccta)'Aui

CAG-jUg VUI tttcj-CXA

CAO-glg» К ccccca-GAC

AGG-Цаа DC ccccag-ACA

GAC-glg* X ■ ccccag-GAC

GAC-gtgm X cccog-GGT

AAO-gtg» XI ccgctg-GGA

ipci*lwlwpiwcii Нуютеотидные лоогсдовгтелъносхи участков слияния экзонов и

хнтронов rem d4 крысы. Нуклеотиды, входящие в состав экзонов. / показаны заглавными буквами, юлроны - строчными.

1IU 1 пилиыяздкот 2(23 2 МО 2111 27*« 2»Я

2»яа

мм

2022 aHWBHWiallMCUWtl lelt )lll JIM

.'iwiMt)'m«w*w

Рис3. Нукгоотаднм лоакдовсгахьмостъ кланов хДНК ген» мепро- -d4. Цмстсхны х хиспиххы; которые могут бшь вовлечены во вджмадсйсяшс с янхпм подчеркнуты. Кислый домен подчеркнут двойной ренней. Возможный екпал ядерной япшпша выделен жирных шрифтам. Сзрелпми укхзакы грамкцы хнтронов. Послед активности вовлеченные в дифференциальный сплайсинг . взяты в тернию imtfiiH.

а

Основываясь на полученных данных, мы попытались построить структурную модель для участка белка, содержащего структуру "цинковых пальцев". В первой модели (рис. 5) ДНК-сязывающий домен имеет две одинаковые пары пальце-подобных структур. В обеих парах первые "пальцевые" структуры Сх2-Схп-Сх2-С типа отделены от вторых "пальцев", которые относятся к Нх2-Схп-Сх2"С типу четырьмя аминокислотами и разделены обе пары всего двумя аминокислотными остатками. Кроме цистеина и гистидина обнаруживаются еще несколько аминокислот, которые являются консервативными между этими двуми районами (рис. 46). В предложенной схеме струюуры второго и третьего "пальцев" напоминают аналогичную структуру ядерных рецепторов стероидных гормонов (районы С1 (Green et al., 1988)) или белки семейства bmi-1 (Haupt et al., 1991). Следует отметить, что в этом случае отсутствует гомология по аминокислотной последовательности за исключением точного совпадения положений цисгсина. Белки, имеющие структуру "цинковых пальцев" НССС типа, не были известены ранее, хотя смешанные структуры были обнаружены, например, в bmi-1 семействе (van Lohuizen et al., 1991) и именно это может отражать различные функции для каждого "пальца" в паре, как это было предположено для bmi-1 семейства и непосредственно показано для стероидных рецепторов.

В соответствии со второй моделью структуры С-концевого домена (рис.5) , он разделен на две части, но для каждой из частей характерен один и тот же аминокислотный мотив Сх2-Сх4-Нх2-С, который присутствует в РНК-связывающих белках ретровирусов и ретротранспоэонов (Green & Berg 1989). Основное различие состоит в протяженности Н-С петли, состоящей из 4 аминокислот в ретровирусных белках и только из двух аминокислот ' для нейро-<14. Однако, наиболее

■Kr2 consensus KPYXCXXCGKAFXXXXXLXXHQRIHTGE

III T III ; • I T к л

neuro-d4 tinier I KPYVCDICGKRYKNRPGLSyiJYTaTHEAE

M

neuro-d4 finger II CDFCLGCSKKTGCPED-LISCADCGR

I III N I II 1

neuro-d4 finger IV ¿SLC-GTSENp qQLLFQDDC

GASWAGLTPQ

CDR

neuro-d4 finger III nauro-d4 finger V

HPSCLQFTVNMTAAVRTYRWQ^IEC ¿MYcisPP—M-AEPPEGSWSCHLC

rnse IAP CCHC I hamster IAP CCHC I neuro-d4 CCHC I neuro-d4 CCHC II ■ouae IAP CCHC II hanster IAP CCHC II

RTCFNCGKPGHFKKDCRA

Г IIITI: IT III! I

KACFNCGRMGHLKKD^QA ISCADCGRSGHPS-LFCDDCDRGYHMY—CtS

' 1 :1IT I I

—TifiYHRADQCRS

;YR£GKGYHRASE£R

Рис.4. Сражение амннокиелнтых последовательностей: а, "цпшиш пальцев- Крулпслыкхого типа нейроспеюфического белка тКх2 и испюпаюто! 193-221 нейро-<И. б, между парией предполагаемых "цинковых тльцев" в нсйро-<М в соответствии с первой моделью, о, между Сх2-Сх4- Нд4-С мотивами 1АР частицами дц- белка ишш и хомяка и предполагаемыми "цинковыми пяльцами" нейрочИ в соответствии со второй моделью. Вертикальными линиями обозначены совпадающие аминокислоты, а точками • хоновршпнп яилны.

к >

V У

I ■ I г

¿ 4 т &

к *

> *

ь

К >€ |

I Е-Г Х0—А'-Т-Н-У-А-А-Т-М-Ы-У-Т-Р-О-4. В-Р^ "V

^ 2 .4-1. З-Т— Э-Е-М-Й 0-0-4_-1_-Р 0-0 р

I/ у V У ХН

X I

с/ ^с с ^н в Л ../ ________________/ \_.У \/

/

Ь—Н З-УУ-Б-С-Е-Р-Р-Е-А-М-Р-Р-вЧ. У-М У

Рис,5. Модели структурной организации цистсин-гистидкн богатого района гена нейро-64.

iH

консервативные C-H петли очень схожи (рис.4б). В последней модели остается совершенно не ясной роль четырех Сх2-С последовательностей, расположенных на расстоянии 11-21 аминокислот. Конечно, хотелось бы предположить структуру типа "суперпальцев", но, очевидно, что этот вопрос требует более детального исследования цистеин-гистидин богатого района белкового продукта гена нейро-<!4.

4.0прелсление 5'-кониа клонированной кДНК. сплайс-варианты.

Для определения 5-конца кДНК был применен метод RACE, описанный Frohman et al. (1988). В качестве затравки использовали синтетический олигонуклеотвд, который перекрывал границу 1 и 2 экзонов. Эксперименты по RACE, секвенирование кДНК и геномного клона выявили, что нейро-<14 имеет очень сложную картину различных форм сплайс-вариантов мРНК. Были обнаружены четыре сплайс-варианта, но только один из них значительно изменял длину мРНК. Он имел дополнительные 783 нуклеотида в первом экзоне и на рис.1 виден как слабая полоса гибридизации, расположенная выше основной гибридизующейся полоски. При гибридизации с пробой, специфической только для первого экзона, гибридизовалась только одна полоса, соответствующая транскрипту большего размера. Различия по длине других сплайс-вариантов нейро-<14 не столь значительны и их не удается четко идентифицировать при Нозерн-гибридизации, но тем не менее, каждый из вариантов сплайсинга оказывал существенное влияние на структуру белка, транслирующегося с гена нейро-<34. В результате делеции во время сплайсинга участка 5-то экзона, соответсвуюшего 30 аминокислотам, произошло делегирование кислого (152-161 н.п. рис2) и основного ( 164-172) доменов в конечном белковом продукте. Следует отметить, что некоторые

транскрипционные факторы (например, глюкокортикоидный рецептор), имеют два сигнала внутриядерного переноса и основной домен, расположенный в экзоне V может играть роль дополнительного сигнала и отражаться на поведении, получившегося белка.

Дополнительные 10 аминокислот меняют структуру белка в ' цистсин-гистадии богатом районе. Эти изменения являются существенными как для первой так и для второй моделей. В первом случае удлинилстся петля IV "пальца" , во втором случае увеличивается расстояние между консенсусными последовательностями. Несомненно, что подобные изменения в области связывающей ДНК, могут оказывать существенное влияние на специфичность взаимодействия ДНК-белок.

В случае самого протяженного транскрипта, появляются стоп-кодоны во всех рамках считывания после первого метионина, но роль инициаторного кодона в этом случае может взять на себя Ме^б (рис.3), и получившийся белок, хотя и будет короче, но сохранит все свои специфические домены.

В случае последнего сплайс-варианта происходит делегирование 16 нуклеотидов самого протяженного клона в четвертом экзоне. Подобная делеция ведет к прерыванию основной открытой рамки считывания в позиции 1458-1550 н.п. (рис.3). И в этом случае другой' инициаторный кодон может являться сайтом инициации трансляции (1457-1459 н.п.). Однако, в этом случае белок утрачивает 179 аминокислотных остьатков на М-конце, что включает в себя предполагаемый сайг сигнала внутриядерной локализации и "цинковый палец" Круппелевского типа ( утрачивается первый цисгеин, связывающий ион цинка). Этот белковый продукт, тем «е менее, сохраняет цистеин-гистидин богатый и кислый район на С-конце. Следует отметить, что все упомянутые метионины полностью удовлетворяют критерию Козак и комгаотерному

моделированию вторичной структуры различных сплайс-вариантов нейро-с!4 мРНК. Сплайс-вариант мРНК, который вызывал сдвиг рамки был показан для дрозофил иного гена Krüppel, и как предполагается, это играет существенную роль в регулировании экспрессии этого гена в развитии (Gaul et al., 1987).

5. Диффернниальная экспрессия клонированного гена.

Различные фрагменты кДНК или геномного клона нейро-d4 были использованы для гибридизаций по Саузерну, Нозерну и для in situ гибридизации. Гибридизационные фрагменты, полученные на геномной гибридизации, полностью соответствовали структуре полученных геномных клонов, дажг з случае мягких условий гибридизации, что указывает что в крысином геноме ген Heftpo-d4 не представлен семейством родственных генов. Гибридизация с тотальной РНК на фильтрах показала, что экспрессия гена ограничивается только нервной системой как во взрослых, так и в новорожденных особях (рис.1). Максимальная экспрессия гена обнаруживается в центральной нервной системе, гаппокампе и кортексе, однако он присутствует в достаточно большом количестве также и в периферической нервной системе ( DRG нейроны). Наиболее замечательным является тот факт, что максимальный уровень транскрипции наблюдается в процессе эмбрионального развития и постепенно уменьшается в постнатальном развитии (рис. 1с). Другим геном экспрессирующимся только в нервной системе, является транскрипционный фактор NGFI-C, имеющий структуру "цинковых пальцев" и принадлежащий к группе генов раннего ответа. Но мы не смогли обнаружить какие-либо значительные изменения в уровне транскрипции гена Heftpo-d4 при воздействии метразолом на мозг крысы.

Рис.6, in situ гибридизация срезов крысиного мозга с меченным дигоксигенином нейро-й4 пробами, a-d, гибридизация срезов мозга взрослой, крысы с-антисенс РНК. гена, а-продольный разрез мозга, Ь- район гиппокампа и лежащего сверху кортекса, с, d- часть кортекса. Срез показанный на d v был перед '/ гибридизацией обработан РНКазой А. е, f - гибридизация мозга новорожденных крыс с антисмысловой (е) и с смысловой РНК 0).

Результаты гибридизации in situ (рис.6) полностью согласуются с результатами гибридизаций по Нозерну. Практически никакого гибридизаиионного сигнала не наблюдалось в районах не содержащих тела нейронов. Одновременно с этим нейроны, экспрессирующие нейро-с14 наблюдались в кортексе, гиппокампе, в некоторых стволовых клетках мозга и в церебелуме. В развивающемся церебслуме сильный сигнал наблюдался в обоих гранулярных слоях, а после созревания там обнаруживался только очень слабый сигнал и одновременно усиливался в клетках Пуркинье.

6. Представленность гена в других высших организмах, его возможное функциональное значение.

Поскольку нейроспецифический ген d4 представлял несомненный интерес в таком объекте как крыса, то было решено изучить его распостранение в природе. Была проведена гибридизация по Саузерну с геномами различных организмов. Как видно из рис.7, мышиный ген Hefipo-d4 обладает высокой гомологией со своей крысиной копией и даже имеет схожую локализацию в геноме. Со своим человеческим гомологом ген Heftpo-d4 имеет меньшую степень гомологии и совершенно иную геномную локализацию. В таких видах как дрозофила и лягушка гомологий с геном Hefipo-d4 вообще не обнаружено, даже в условиях очень мягкой гибридизации. Возможно предположить, что наличие гена d4 присуще только организмам с достаточно высокоразвитой нервной системой и обладающими сложными поведенческими рефлексами. Был про клонирован ген Heiipo-d4 из развивающегося мозга цыплят. Аналогично крысиному гомологу максимальная экспрессия цыплячьего d4 приходится на стадию эмбрионального развития Е12, что соответствует приблизительно Е20 -Р1 для крысы. Существенным отличием является то, что у цыпленка присутствуют варианты мРНК гена

(14, которые принципиальным образом отличаются от крысиного гомолога. Так, два варианта полностью утратили четыре "цинковых пальца" нового типа НССС и присутствует только классический "цинковый палец" Круппелевского типа, размер транслируемого полипептида значительно увеличивается. Одновременно с этим, присутствует вариант, имеющий высокую степень аминокислотной гомологии с крысиным нейро-с14 и имеющий аналогичную доменную организацию. Вероятно, наличие этих вариантов отражает эвалюционирование этого гена и, очевидно, его ДНК-связывающих свойств - функцию.

Рис.7. Геномная гибридизация нейро-ё4 с ДНК, выделенной из различных организмов. Цифрами приведен размер маркера.

ВЫВОДЫ

1. Клонирован новый ген, экспрессия которого строго ограничена нервной системой.

2. Новый ген нейро-с14 экспрессируется максимально во время эмбрионального развития ' и слабо. детектируется в постнатальном периоде развития.

3. Аминокислотная последовательность транслируемого полипептида Имеет структуру, связывающую ионы цинка,

предполагается, что продует гена nefipo-d4 может являться транскрипционным фактором. Аминокислотные домены, участвующие во взаимодействии с ионами цинка, представлены последовательностями нового типа, не описанными ранее.

4. Существующие сплайс-варианты мРНК гена изменяют ДНК-связывающий домен белка и, возможно, его функцию.

5. Ген распостранен в других организмах (цыпленок, мышь, человек), что указывает - на его важную роль в процессе формирования нервной системы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. V.L Buchman, N.N. Ninkina, S. L Kiselev, Y.D. Bogdanov, A-N.Akopian, O.Y. Krylova, K.V. Anokliin. A developmental regulated gene with expression restricted to the nervous system codes for a novel type of zinc-finger protein. Abs. of the 15th ann. meeting of the Europian neuroscience association. Munich 13-17 Sept, 1992, p. 162.

2. V.L Buchman, N.N.Ninkina, Y.D. Bogdanov, A-N.Akopian, S.L.Kiselev, O.Y. Krilova, G.P.Georgiev. Differential splicing creates a diversity of transcripts from a neurospecific developmental^ regulated gene encoding a protein with new zinc-finger motifs. NAR, 1992, N.20, pp.5579-5585.

Подписано к Отпечатано на ротапринте в Производственном комбинате Литературного фонда "

печати X/ 19&0 г. Формат бумаги 30x42/4 Объем п. л. Зак. Тир. 100' ;