Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Филогенетические аспекты структуры ДНК некоторых беспозвоночных

ВАК РФ 03.00.08, Зоология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Алешин, Владимир Вениаминович

ВВВДЕНИЕ.

I. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

1. Материал.

2. Выделение ДНК.

3. Фрагментирование ДНК .II

4. Определение длины фрагментов.II

5. Радиоактивное мечение ДНК in vitro

6. Кинетика реассоциации ДНК.

7. Получение уникальных последовательностей.

8. Молекулярная ДНК-ДНК гибридизация и изучение термостабильности дуплексов.

9. Критерий гибридизации

10. Нукяеазная обработка.

11. Измерение радиоактивности.

II. СТРУКТУРА ГЕНОМА

1. Введение.

2. Кинетика реассоциации ДНК стрекоз

III. ГОМОЛОГИИ ПОВТОРЯЩИХСЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ! ДНК

1. Введение.

2. Гибридизация повторяющейся ДНК стрекоз

IV. ГОМОЛОГИИ УНИКАЛЬНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНК

I. Введение.

2. Гомологии УП ДНК стрекоз надсемейства 11Ье11и1о±аеа . 50,'

3. Гомологии УП ДНК стрекоз надсемейства Соепадгд.опо1с1еа

4. Гомологии УП ДНК стрекоз надсемейства АезсИпс^еа , ,,

5. Сопоставление уровня гомологии уникальной ДНК стрекоз и других животных.

7. ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Благодарности

Введение Диссертация по биологии, на тему "Филогенетические аспекты структуры ДНК некоторых беспозвоночных"

2. Кинетика реассоциации ДНК стрекоз. 26III. ГОМОЛОГИИ ПОВТОРЯЩИХСЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ! ДНК1. Введение.352. Гибридизация повторяющейся ДНК стрекоз. 39IV. ГОМОЛОГИИ УНИКАЛЬНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНКI. Введение.482. Гомологии УП ДНК стрекоз надсемейства 11Ье11и1о±аеа. 50,'3. Гомологии УП ДНК стрекоз надсемейства Соепадгд.опо1с1еа 564. Гомологии УП ДНК стрекоз надсемейства АезсИпс^еа 605. Сопоставление уровня гомологии уникальной ДНК стрекоз и других животных.637. ОБСУЖДЕНИЕ.66ВЫВОДЫ.72Благодарности 73СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.74- 4 -ВВЕДЕНИЕВ гаплоидном наборе хромосом человека содержится примерно три с половиной миллиарда пар нуклеотидов. Каждый из них занимает своё положенное ему место, замена даже единственного нуклео-тида способна привести к мутации, к тяжелой наследственной болезни. И хотя набор нуклеотидов в ДНК невелик (всего четыре варианта), совокупная "запись" из миллиардов букв содержит очень большую информацию (в шенноновском смысле). Эта информация в ДНК не меньше той, что содержится в наследственно определенном фенотипе особи (в строении, в инстинктах), а, принимая существование "эгоистичной" ДНК (не оказыващей влияния на фенотип) [41, 72] - эта информация ещё больше.

Рассматриваемые последовательности нуклеотидов каждого вида возникли не "вдруг", а из последовательностей в ДНК вида-предка. Таким образом в ДНК каждого вида не только содержится очень большая информация, по которой его можно от других видов отличить, но также - в скрытш виде - очень большая информация о предках. Кажется поэтому заманчивым использовать ДНК для выяснения родства видов или же для построения филогенетической системы [1, 2] > особенно в случаях, трудных для геккелевской "триады" методов, используемой обычно в филогенетических реконструкциях. В конечном итоге это могло бы представить интерес не только для кладис-тики. Независимый от "триады" хороший метод оценки родства был бы полезен для изучения закономерностей эволюции, например, касающихся параллелизмов в различных филогенетических ветвях.

Хотя конкретное место в участке ДНК может занимать только один из четырех нуклеотидов, но если нуклеотидов --уже три десятка, то их можно преобразовать таким числом способов, сколько зерен пшеницы потребовал в награду изобретатель шахматной доски. Расчеты показывают, что случайно две последовательности (если онидостаточно протяженные - несколько десятков нукяеотидов) не.могут стать похожими, несмотря на то, что в геноме миллиарды нукле-оздов. Насколько случайно последовательности преобразуются в эволюции - не известно, но мы пока не знаем способа, по которому они изменялись бы конвергентно. По крайней мере естественный отбор, важный фактор конвергентных изменений морфологии организмов, строг^ледя за фенотипом, довольно безразлично относится к самой наследственной основе. Оценки говорят, что примерно 25 % замен нуклеотидов в кодирующей части генов не приведут к заменам аминокислот в соответствующем беже из-за вырожденности кода [61] а \ эксперименты показывают, что по крайней мере половина из этих возможных синонимных мутаций в эволюции фиксируется [16]. Вместе с тем, поскольку информация о предках содержится в ДНК в "скрытой", видоизмененной форме, пока ее трудно использовать душ нужд / филогенетики. Трудности можно разделить на три группы.

Во-первых, все гомологии в ДНК, хотя они истинные гомофилии, а не гомоплазии, они также суть плезиоморфии по хенниговской терминологии. Следовательно, мы принципиально не можем воспользоваться методикой обычного филогенетического анализа, пытаясь на их основе строить филогенетическое древо. Обнаружение гомологичных последовательностей действительно в данном случае говорит о родстве, о том, что у видов был когда-то общий предок, однако -без дополнительных постулатов - не позволяет оценить степень родства. Факт, что общего предка имели ленточный червь и человек, коза и капуста, достаточно очевиден. Задача состоит в установлении именно степени родства. И если процедура классического филогенетического анализа осложняется трудностью отличить: а) прод-двинутое состояние (синапоморфии) от примитивного, б) гомофшшю от конвергенции, то попытка построения древа по плезиоморфиям (в том числе по гомологиям в ДНК) требует принять особые, необязательные для хенниговского анализа постулаты, например допустить, что эволюционная скорость изменения (потери) предковых последовательностей в разных филогенетических ветвях приблизительно одинакова (теория "молекулярных часов").

Во-вторых, принимая сильные постулаты, мы пока только интуитивно можем полагать, хороши они или нет: о закономерностях изменений ДНК в эволюции известно относительно мало. Например, гипотезу, что гены могут удваиваться и после этого дивергировать по функциям, обсуздал уже А. С.Серебровский, а о том, что после удвоения они могут изменять друг у друга первичную структуру, эволюционировать согласованно, стало известно очень недавно[71, 80,м] а распространенность и значение согласующего их "молекулярного привода" (тяги, "drive") ш только сейчас начинаем в полной мере осознавать благодаря Г.Доуэру ^2,43. Видимо, корректные допущения могут быть сделаны, когда мы больше узнаем о сходствах и различиях в ДНК групп разного возраста и морфологического разнообразия, когда допущения будут обосновываться или опровергаться не из общих соображений или нескольких примеров, а на большом фактическом материале.

В третьих, не вполне разрешены методические трудности. Например, молекулярная ДНК-ДНК гибридизация в обычных условиях позволяет сравнивать только очень похожие последовательности, различающиеся не более чем на 20-30 %, тогда как нередко необходимо сравнить сильно удалившиеся друг от друга последовательности [53].

Все это вместе говорит об актуальности сравнительного изучения ДНК. Таьфэго рода сравнения одобряют известные отечественные эволюционисты-зоологи [6, 13].

Один из методов сравнения геномов заключается в изученииреассоциации фрагментов ДНК. С его помощью можно получить све- ;'перестройках,дения о крупных изменениях содержания ДНК на клетку, крупныхгенома. Прямые измерения доли гомологичных последовательностей у двух сравниваемых видов позволяет провести другой метод - молекулярная ДНК-ДНК гибридизация [5, 54, 65]. В сочетании с изучением кинетики реассоциации и препаративным выделением отдельных кинетических компонентов она позволяет установить абсолютное содержание гомологичных последовательностей в интересующих фракциях, генома. Подвергая гибридные молекулы тепловой денатурации, можно дополнительно измерить в пределах гомологичных последовательностей процент совпадающих нуклеотидов (способ расчета см. [31]). Перечисленные методы были использованы в данной работе.

Проведенное исследование охватывает 29 видов из 10 семействотряда Odonata (Odoriata, Insects). По возрасту И СКОРОСТИ МОрфологической эволюции семейства стрекоз, в целом, типичны для насекомых и являются мезо-кайнозойскими. Древнейшие из современных семейств (Gomphidae, Petaluridae, Aeschnidae)цзвеСТНЫ ИЗ Юры. Libellulidae и Современные семейства Zygoptera встречаются С верхнего мела или с палеогена, причем эти относительно молодые группы дали широкую радиацию и доминируют в современной фауне; легко видеть, что их дифференцировка заняла примерно столько же времени, сколько - дифференцировка отрядов плацентарных млекопитающих. ЭВОЛЮЦИОННО консервативные же Gomphidae, Petaluridae, Aeschnidae - ровесники археоптерикса. Поэтому казалось интересным определить, какая доля ДНК отдаленных видов стрекоз сохраняет заметное сходство, и сравнить этот уровень с тем, что известно для таксонов позвоночных такого же ранга. Это было поставлено как первая задача работы.

Второй задачей было - попытаться оценить вклад, вносимый в дивергенцию геномов крупными перестройками ДНК. Кариологически стрекозы хорошо изучены [59] это достаточно однородная группа. Поэтому возможные отличия видов по содержанию ДНК и ее фракцийсвидетельствовали бы о деятельности механизмов, независимых от изменений кариотипа.

В третьих, нам хотелось получить информацию, которую можно было бы использовать для спекуляций о родственных отношениях изучаемых стрекоз.

Ввиду отсутствия исследований геномов стрекоз и немногочисленности таковых для насекомых в целом, мы не сочли целесообразным составлять специальную главу с обсуждением литературы. Систематическая ревизия отряда со списком всех современных и ископаемых родов и обсуждением возможных путей эволюции ж филогении семейств проведена относительно недавно Ф.Фрэзером [45]. Современные знания о палеонтологии отряда сведены Л.Н.Притыкиной [21]. Анализ эволюции кариотипа стрекоз дан Б.Киаутой [59] со списком хромосомных чисел почти четырех сотен видов.

Заключение Диссертация по теме "Зоология", Алешин, Владимир Вениаминович

ВЫВОДЫ

В результате исследования геномов стрекоз семейств Gamphidae,

Aeschnidae, Cordulegasteridae, Corduliidae, Macrodiplactidae, Libel-lulidae, Coenagrionidae, Platycnemididae, Lestidae, Calopterygidae

методами кинетики реассоциации ДНК и молекулярной гибридизации повторяющихся и уникальных последовательностей при разных критериях сделаны следующие выводы.

1. Геномы стрекоз испытывали в эволюции крупные перестройки, особенно значительные при образовании семейств. Образование видов и родов сопровождалось, видимо, меньшими перестройками.

2. Повторяющиеся и уникальные последовательности ДНК отдаленных видов стрекоз дивергировали в очень сильной степени. Уровень гомологий в них находится в соответствии скорее с геологическим возрастом групп, чем с таксономическим рангом (сравнительно с позвоночными).

3. Полученные данные о гомологиях в ДНК позволяют сделать ряд предположений о филогении наиболее молодых (меловых и кайнозойских) групп стрекоз, но не проясняют родственных » связях более", древних таксонов.

4. Значительная консервативность фенотипа стрекоз может поддерживаться при малой (всего несколько процентов) гомологии общей ДНК видов, определенной методом молекулярной гибридизации при нынешних модификациях метода.

Выполнение данной работы обеспечила поддержка научного руководителя М.С.Гшшрова, а ее экспериментальной части - поддержка заведующего отделом эволюционной биохимии А.С.Антонова. Данная работа выполнена также благодаря разносторонней помощи, которую оказывал мне научный консультант Н.Б.Петров.

За помощь и ценные советы я многим обязан Н.Н.Акрамовскому, А.С.Антонову, С.И.Лёвушкину, А.Б.Полтараусу, Г.В.Фарафоновой (определившей также часть материала), А.Ю.Харитонову, сотрудникам отдела эволюционной биохимии и кафедры зоологии беспозвоночных МГУ. Компьютерная обработка была проведена И.А.Милютиной и В.А.Дубовицким. Е.А.Щубина и В.А.Горшков передали мне препараты ДНК позвоночных. Мечение ДНК с использованием Т4-полимеразы цроводила Н.С.Владыченс-кая. В сборе материала мне оказали помощь Н.Н.Акрамовский, В.К.Дле-шина, В.С.Пулатов, А.М.Мехтиев и другие. Я рад выразить им здесь • свою глубокую благодарность.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Алешин, Владимир Вениаминович, Москва

1. Антонов A.C. Экспериментальное обоснование некоторых концепций геносистематики. Автореферат дисс. на соискание ученой степени доктора биологических наук.-М.: Изд-во МГУ, 1973.-72 с.

2. Белозерский А.Н., Антонов A.C., Медников Б.М. Введение.В сб.: Строение ДНК и положение орйгнизмов в системе. М.: ^ Изд-во МГУ, 1972, с. 3 - 16.

3. Бердников В.А., Родин С.Н., Жарких A.A. Эволюция величины генома на основе неравного кроссинговера. Докл. АН СССР, 1982, т. 263, № 2, 464 - 467.

4. Бианки В.Л. Стрекозы. В кн.: Якобсон Г. Прямокрылые и ложное етчатокрылые Российской империи и сопредельных стран. -СПб, 1905.

5. Вальехо-Роман K.M. Гибридизация ДНК. В сб.: Молекулярные основы геносистематики. - М.: Изд-во МГУ, 1980, с. 86 - 105.

6. Воронцов H.H. Сравнительные подхода в "классической" и "современной" биологии. Предисловие редактора. В кн.: Гинату-лин A.A. Структура, организация и эволюция генома позвоночных. - М.: Наука, 1984, с. 3 - 5.

7. Высоцкая Л.В., Тутурова К.Ф. Повторяющиеся нуклеотидные последовательности, гетерохроматин и содержание ДНК у некоторых видов саранчовых. Изв. СО АН СССР, 1981, 10, № 2, 95 - 101.

8. ГиНатулин A.A. Структура, организация и эволюция генома позвоночных. М.: Наука, 1984. - 293 с.

9. Дубовицкий В.А., Милютина И.А. Метод.гистограммной обработки экспериментальных кривых реассоциадии ДНК. Труды конференции молодых ученых ИЖ АН СССР, 1982.

10. Залесский Ю.М. Новый метод построения родословной схемы и филогении ископаемых и современных стрекоз. Палеонтол. сб. Львовского ун-та, № 2, вып. I. - Львов, 1965.

11. Майр Э. Принципы зоологической систематики. М.: Мир, 1971. - 454 с.

12. Медников Б.М. О реальности высших систематических категорий позвоночных животных. Яурн. общ. биол., 1974, т. 35, J& 5, с. 659 - 665.

13. Медников Б.М. Применение методов геносистематики в построении системы хордовых. В сб.: Молекулярные основы геносистематики. - М.: Изд-во МГУ, 1980, с. 203 - 215.

14. Петров Н.Б. Методы изучения реассоциации ДЕК. В сб.: Молекулярные основы геносистематики. - М.: Изд-во МГУ, 1980, с. 51 - 77.

15. Петров Н.Б., Владыченская Н.С., Кедрова О.С. Связь между содержанием сильнодивергированной повторяющейся ДНК и типом организации геномов эукариот. Докл. АН СССР, 1984, т. 276, 1514 - 1516.

16. Петров Н.Б., Полтараус А.Б., Антонов A.C. Измерение дивергенции гистоновых генов у беспозвоночных животных. Биохимия, 1979, т. 44, £ 12, с. 2208 2217.

17. Петров Н.Б.»Полтараус А.Б., Антонов A.C. Определение степени консервативности рибосомных генов у представителей некоторых типов беспозвоночных животных. Биохимия, 1980, т. 45, $ I, с. 165 - 172.

18. Полтараус А.Б., Петров Н.Б., Антонов A.C. Дивергенция повторяющихся последовательностей ДНК у иглокожих. I. Сравнение последовательностей с высокой степвнью внутригеномной дивергенции. Мол. биол., 1980, т. 14, вып. 3, 661 - 674.

19. Полтараус А.Б., Петров Н.Б., Антонов A.C. Дивергенция повторяющихся последовательностей ДНК у иглокожих. II. Сравнение последовательностей с низкой степенью внутригеномной дивергенции. Мол. биол., 1980, т. 14, № 5, с. 1046-1056.

20. Расницын А.П. Происхождение и эволюция перепончатокрылых насекомых. М.: Наука, 1980.23i Ado N. Y., Antonov A; S;, Petrov N, В; Homologies in Insect DNA, In: The FEBS Meeting. Abstracts, 1983, S-16, WE-182, pi 307.

21. Britten R, J., Kohne D, E. Repeated sequences in DNA. Science,1963, v. :(:, p. 529 540.

22. Britten R, J,, Graham 0. E., Eden F, C., PainchaQd 0. M., DavidAson E. H. Evolutionary divergence and length of repetitive sequences in sea urchin DNA. J. Mol. Evol,, 1976, v. 9» p. 1 - 25.

23. Britten R; J., Gra^h^m D. E., Neufeld B. R. Analysis of repeat,ting DNA sequences by reassociation. Ins Methods in enzymology, 1974, v. 29E, N. Y.s Academic Press.r