Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярная филогения и анализ таксономических отношений бычковых рыб (Gobiidae) Черноморско-Каспийского бассейна

ВАК РФ 03.02.06, Ихтиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярная филогения и анализ таксономических отношений бычковых рыб (Gobiidae) Черноморско-Каспийского бассейна"

На правах рукописи

МЕДВЕДЕВ Дмитрий Александрович

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ФИЛОГЕНИЯ И АНАЛИЗ ТАКСОНОМИЧЕСКИХ ОТНОШЕНИЙ БЫЧКОВЫХ РЫБ (СОВ1ШАЕ) ЧЕРНОМОРСКО-КАСПИЙСКОГО БАССЕЙНА

03.02.06 - ихтиология

5 ДЕК 2013

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2013

005541719

Работа выполнена в Лаборатории экологии низших позвоночных Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института проблем экологии и эволюции им. А Н. Северцова Российской академии наук

Научный руководитель: Доктор биологических наук

Виктор Павлович Васильев

Официальные оппоненты: Сергей Афанасьевич Евсеенко

доктор биологических наук, заведующий Лабораторией океанической ихтиофауны Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института океанологии Российской академии наук

Николай Сергеевич Мгоге

кандидат биологических наук, заведующий Лабораторией популяционной биологии Всероссийского научно-исследовательского института рыбного хозяйства и океанографии

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетного

учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук

Защита состоится 25 декабря 2013 г. в 10 час. на заседании диссертационного совета Д 002.213.02 при Федеральном государственном учреждении науки Институте проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33., тел./факс 8(495)9523584, email: zashita@sevin.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОБН РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33.

Автореферат разослан 22 ноября 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

• Е.А. Кацман

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Рыбы, принадлежащие к семейству СоЬШае одна из наиболее сложных групп Понто-Каснийского региона. Всего в бассейне обитает около 50 видов, большая часть которых является эндемиками. Систематика черноморско-каспийских бычков является объектом продолжительных дискуссий. Не решенными остаются вопросы, касающиеся таксономической структурированности представителей семейства на уровне рода и филогенетических связей между этими родами. Продолжается также дискуссия в отношении таксономической самостоятельности отдельных популяций широко распространенных в Черноморско-Каснийском бассейне видов. Применение генетических методов, по мнению многих исследователей, способно решить большинство имеющихся проблем.

Геологическая история Понто-Каснийского региона богата событиями, которые не моги не отразиться на эволюции гидробионтов. К ним можно отнести разделение и последующее неоднократное возникновение связей между бассейнами Каспия и Черного моря, за время их существования, кроме того влияние оказали значительные изменения, происходившие во время чередования ледниковых и межледниковых периодов.

Оценка влияния последовательных геоморфологических преобразований на гидробионтов Понто-Каспийского региона послужило целью многих филогеографических работ (Аискуопуге е( а]., 2006, 2008; Сг^езси е1 а1., 2003; 01етЫик е1 а1., 2006 и др.). Было показано, что наиболее полную картину дает изучение групп родственных видов, имеющих сходную биологию. Такие работы были проведены в отношении ряда групп беспозвоночных. Среди позвоночных наиболее перспективно изучение распределения генетических линий широко распространенных в регионе видов семейства СоЬнйае.

Цель исследования. Выявление филогенетических связей бычков Черноморско-Каспийского бассейна на основе изменчивости митохондриального гена цитохрома Ь и реконструкция эволюционной истории этой группы.

В работе решались следующие задачи.

- реконструкция филогенетических связей черноморско-каспийских представителей сем. ОоЬнс1ае

- анализ филогеографической структуры широко распространенных

видов

- анализ особенностей молекулярно-генетического разнообразия в связи с исторической геоморфологией региона

- решение некоторых таксономических проблем: популяционно-видовой структуры широко распространенных видов, таксономической структуры некоторых родов и родовой структуры семейства СоЬп<Зае Понто-Каспия.

Научная новизна работы. Изучена изменчивость митохондриального гена цитохрома Ь, позволившая проанализировать филогенетические связи черноморско-каспийских бычков и представить новую оригинальную таксономическую концепцию, имеющую в своей основе наиболее полный объем имеющихся в настоящее время данных.

На основе оригинальных данных была проанализирована филогеографическая структура наиболее широко распространенных видов и групп близких видов. Для N. эугтап анализ филогеографической структуры был представлен впервые. Сопоставление филогеографических паттернов позволило выявить общие черты в характере дивергенции различных видов и их связь с палеогеографической историей Понто-Каспийского региона.

В ходе работы была впервые обнаружена генетическая линия каспийских бычков, относящихся к подроду РопШоа, и отличающаяся морфологически от всех изученных ранее видов этого региона.

Теоретическое и практическое значение. Понто-Каспийский регион, чья историческая геоморфология хорошо документирована, предоставляет хорошие возможности в отношении познания генезиса его фауны и анализа формирования генетического разнообразия обитающих здесь видов. Представители семейства СоЬиёае являются основным элементом ихтиофауны этого региона, а некоторые из них имеют важное промысловое значение.

Результаты работы вносят вклад в исследование формирования генетического разнообразия различных групп животных Понто-Каспийского региона, фауна которого включает значительное число эндемичных видов. Изучение генетической дифференциации популяций, видов и отдельных групп бычковых рыб Черноморско-Каспийского бассейна из различных изолятов, наложение молекулярно-генетических данных на карты исторической геоморфологии и анализ полученных результатов представляет несомненный общебиологический интерес. Результаты анализа данных по изменчивости гена цитохрома Ь в контексте геоморфологических преобразований рассматриваемого региона позволило подтвердить некоторые гипотезы, выдвигавшиеся в отношении широко распространенных видов бычков. Прежде всего, в этом заключается теоретическая значимость настоящей работы.

Практическое значение диссертации обусловлено в первую очередь тем, что некоторые виды бычков имеют хозяйственное значение как объекты рыболовства. Рациональная эксплуатация таких групп видов предполагает знания их таксономической и популяционной структуры. Кроме этого

4

некоторые виды черноморско-касгшйских бычков проявили способность к активной колонизации и распространились в водоемах западной Европы и Северной Америки. Изучение филогеографической структуры таких видов может не только способствовать выявлению источников инвазии, но и позволяет выявлять виды, обладающие потенциальной способностью к активному расширению своего ареала. Изучение генетического разнообразия гидробионтов Понто-Каспия имеет большое природоохранное значение для сохранения биологического разнообразия этого региона, и могут найти применение в природоохранных программах.

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на научной конференции: «Молекулярно-генетические подходы в таксономии и экологии» (Ростов-на-Дону, 2013), Всероссийской конференции молодых ученых: «Биоразнообразие: глобальные и региональные процессы» (Улан-Удэ, 2013) и Международных научных конференциях: «Популяционная генетика: современное состояние и перспективы» (Москва 2011), World Conference on Marine Biodiversity (Aberdeen, Scotland, 2011), «Эктотермные позвоночные Восточной Европы и сопредельных территорий: эволюционные, экологические и природоохранные аспекты» (Тамбов, 2013).

Положения, выносимые на защиту:

1. Митохопдриальный ген цитохрома b является эффективным молекулярным маркером при решении проблем, связанных с систематикой и филогенией черноморско-каспийских рыб семейства Gobiidae на родовом, видовом и популяционном уровнях.

2. Группа эндемичных сарматских бычков имеет монофилетическое происхождение и включает в себя ряд близких родов: Benthophilus; Caspiosoma; Mesogobius; Neogobius sensu Берг, 1949; Proterorhinus.

3. Род Neogobius sensu Берг имеет парафилетическое происхождение объединяя две филетические линии Ponticola (N. constructor, N. cephalargoides, N. ratan, N. cyrius, N. eurycephalus, N. gorlap, N. platyrostris, N. kessleri, N. syrmart, N. rhodioni, N. gymnotrachelus) и собственно Neogobius (N. melanostomus, N. fluviatilis, N. caspius). Это может свидетельствовать о таксномической неоднородности p. Neogobius.

4. Генетическая близость бычка травяника (Cobius ophiocephalus) к другим представителям p. Gobius не дает оснований для его выделения в самостоятельный род (p. Zosterisessor).

5. Популяции широко распространенных видов, населяющие различные изоляты Понто-Каскийского региона, имеют заметные, а в ряде случаев существенные, различия в структуре гена цитохрома Ъ.

6. Изменение палеоэкологических условий Понто-Каспийского региона в позднем плиоцене-голоцене привело к формированию близких филогенетических линий, имеющих различные экологические предпочтения.

7 Обнаруженные генетические различия между изолированными популяциями близких видов в ряде случаев являются значимыми, согласуются с имеющимися таксономическими гипотезами и могут быть отражены в систематике черноморско-каспийских бычков.

Публикации результатов работы. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, из них 3 статьи в журналах, включенных в «Перечень ведущих рецензируемых журналов и изданий в которых должны быть опубликованы результаты диссертации на соискание научной степени доктора и кандидата наук».

Личный вклад автора. Автор принял непосредственное участие на всех этапах исследования, включая сбор материала с 2008 по 2011 гг.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Основное содержание работы изложено на 137 страницах печатного текста, иллюстрировано 29 рисунками и 18 таблицами. Список литературы содержит 227 цитируемых работ.

Благодарности. Автор считает своим долгом выразить искреннюю признательность научному руководителю д.б.н. В.П. Васильеву, а также д.б.н. Е.Д. Васильевой за предложенную тему, всестороннюю помощь, ценные советы и консультации в ходе написания данной работы.

Автор выражает сердечную благодарность д.б.н. М.В. Холодовой, к.б.н. П.А. Сорокину и всем сотрудникам кабинета методов молекулярной диагностики ИПЭЭ РАН за предоставленную возможность и помощь в проведении молекулярно-генетического анализа, ценные замечания и советы при обсуждении результатов работы; заведующему лабораторией экологии низших позвоночных ИПЭЭ РАН д.б.н. М.И. Шатуновскому за поддержку при выполнении работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Первая глава включает в себя три раздела, в которых представлены основные предпосылки к решению поставленных нами задач, современные взгляды и дискуссионные проблемы.

1.1. Молекулярио-генетические методы в зоологических исследованиях. В разделе представлен обзор посвященный применению молекулярно-генетических методов в современных зоологических филогенетических исследованиях. Дана краткая характеристика некоторым наиболее распространенным молекулярно-генетическим маркерам. Особое внимание уделено использованию в качестве молекулярно-генетических маркеров кодирующих последовательностей ДНК. В разделе кратко описаны основные направления, в которых применяются эти методы.

1.2. Геологическая история Попто-Каспийскогорегиона и ее влияние на гидробионтов. В разделе изложена периодизация геоморфологических событий, происходивших в истории Понто-Каспийского бассейна и отразившихся на его обитателях. Среди наиболее важных отмечено время разделения единого Сарматского моря на западный (Черноморский) и восточный (Каспийский) бассейны (около 5 млн. лет назад). Приведено время восстановления и существования связи между Черноморским водоемом и Каспийским в Плейстоцене (приблизительно 2,0 - 0,9 млн. лет назад) и время чередования ледниковых и межледниковых периодов на территории Среднерусской равнины в течение Плейстоцена и Голоцена (около 1,6 млн. лет 10000 назад) приводивших к резким колебаниям солености и фаз трансгрессии и регрессии бассейнов.

Кроме того описаны результаты исследований филогеографической структуры черноморско-каспийских видов беспозвоночных и позвоночных. Замеченные различия в уровне дивергенции и сопоставление их со временем появления генетических линий легло в основу трех зоогеографических гипотез, объясняющих полученные филогеографические картины.

1) Глубокие генетические различия являются следствием древней викариантной дивергенции, связанной с разделением Восточного Паратетиса на восточный - Каспийский и западный - Черноморский бассейны.

2) Сравнительно небольшие генетические различия могли возникнуть в результате недавнего расселения и последующей дивергенции.

3) Смешанный вариант, при котором недавнее расселение накладывается на уже существовавшую древнюю дивергенцию.

1.3. Современные представления о систелге бычковых рыб бассейна Потпо-Каспия. Раздел посвящен рассмотрению таксономических гипотез выдвигавшихся на разных этапах изучения черноморско-каспийских бычков. Внимание уделяется изменением взглядов исследователей по мере накопления данных, основным таксономическим проблемам и дискуссиям, возникавшим вокруг них. Рассмотренные таксономические проблемы можно объединить в две группы. 1) Проблемы связанные с филогенетической структурой черноморско-каспийских бычков, родственными связями между обособленными ¡руппами, местом черноморско-каспийских бычков в семействе ОоЬйс1ае. 2) Проблемы таксономического статуса обособленных

популяций. Одной из важнейших частей этого раздела является рассмотрение современных таксономических представлений, формирование которых было бы невозможно без применения молегулярно-генетических методов.

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

В работе были использованы материалы по 15 видам бычковых рыб Черноморско-Каспийского бассейна, собранные с 2003 по 2012 гг. и представленные в коллекции Зоологического музея Московского государственного университета. В том числе были использованы собственные сборы, проводившиеся с 2008 по 2011 гг. в различных районах Черного и Каспийского бассейнов (рис. 1). Структура митохондриального гена цитохрома Ь изучена у 181 экз.

Рис. 1. Точки сбора материала в пределах бассейна Понто-Каспия

Выделение ДНК из изучавшихся образцов было проведено с использованием набора «DNA Diatom PREP» («Изоген», Россия). При амплификации полной последовательности митохондриального гена цитохрома Ъ были использованы праймеры AJG15, Н5 (Akihito et al, 2000). AJG15 - CAA-AAA-CCA-TCG-TTG-TAA-TTC-AAC-T, H5 - GAA-TTY-TRG-CTT-TGG-GAG

Для амплификации участка цитохрома Ъ длиной 408 п.н., который использовали при предварительном анализа филогеографической структуры представителей рода Proterorhinus были использованы праймеры Glu, СЬ2 (Kocher et al. 1989).

G1U-(L 14724) TGA-TAT-GAA-AAA-CCA-TCG-TTG Cb2-(H 15174) CCC-TCA-GAA-TGA-TAT-TTG-TCC-TCA

Для секвенирования использовали автоматический генетический анализатор ABI 3500 (Applied Biosystems, USA).

Выравнивание последовательностей, подбор моделей молекулярной эволюции, построение филогенетических деревьев, расчет показателей генетического разнообразия и дистанций, оценка степени насыщения последовательностей нуклеотидными заменами и оценка селективной нейтральности нуклеотидных замен были проведены с использованием пакетов программ: BioEdit 7; DAMBE v.5.3.8; DnaSP v5; Modeltest 3.7; MEGA5; PhyML 2.4.4; MrBayes 3.1.2; Network 4.6.1.1

Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ

У 181 изученных экземпляров бычков бассейна Понто-Каспия, принадлежащих 15 видам, выявлено 90 гаплотипов митохондриального гена цитохрома Ь, 16 из которых совпали с гаплотипами, ранее включенными в базу данных NCBI. Вместе с гаплотипами из базы NCB1 для филогенетического анализа было использовано 364 гаплотипа (475 последовательностей). После выравнивания длина сравниваемых последовательностей составила 1098 пл.

3.1. Реконструкция филогенетических связей черноморско-каспийских представителей семейства Gobiidae

Работе по реконструкции филогенетических связей предшествовала оценка эффекта насыщения. Данный анализ необходим, так как при насыщении последовательностей нуклеотидными заменами возможны искажения в филогенетических построениях.

Нами был рассчитан уровень насыщения для имеющегося набора данных и его критические значения для деревьев с ассиметричной топологией. Полученные данные показали, что наблюдаемый уровень насыщения в 2 - 4 раза ниже критических значений, а, следовательно, наблюдаемое насыщение не вносит искажения в наши филогенетические построения.

В результате анализа данных были построены филогенетические деревья методами максимального правдоподобия (ML), максимальной экономии (MP) и ближайшего соседа (NJ) объединенные на рис. 2. Топология каждого из них, независимо от метода и модели построения, показывает четкую обособленность представителей родов эндемичной сарматской группы, от бычков имеющих средиземноморское происхождение. На деревьях MP и NJ виды, распространенные в Средиземном море и Восточной Атлантике (роды Knipowitschia, Pomatoschistus, Gobius s. strict и бычок-травяник) оказались в одной кладе (рис. 2). Дерево, построенное методом максимального правдоподобия (ML), в отличие от двух других показало обособленность родов Knipowitschia и Pomatoschistus от других представителей средиземноморских бычков (рис. 2).

В отношении ветвей эндемичной сарматской клады топология филограмм

ML и NJ оказалась сходной, но отличающейся от МР филограммы положением подклады, включающей виды родов Benthophilus и Caspiosoma (рис. 2). На схемах ML и NJ филетическая группа бычков-пуголовок Benthophilus -Caspiosoma близка к подкладе, включающей роды Proterorhinus, Mesogobms и часть видов рода Neogobius s. lato, обозначенную на всех схемах как филетическая линия «Ponticola». МР-схема, напротив, демонстрирует близость подклады бычков-пуголовок к филогенетической группе /V. melanostomus - N. fluviatilis - N. caspius (обозначена на филограммах как линия «Neogobius»). Эти различия топологий согласуются с относительно низкими значениями бутстрэп-поддержки образования подклады Benthophilus-Caspwsoma. На всех деревьях группа видов, рассматривавшаяся Бергом (1949) в качестве рода Neogobius, распадается на две обособленные филетические линии: «Ponticola» и «Neogobius» с высокими значениями бутстреп-поддержки; при этом сестринская группа линии «Ponticola» на всех схемах формируется видами

родов Mesogobius и Proterorhinus (рис. 2).

Видовой состав указанных филетических линий стабилен на всех полученных схемах (рис. 2). Линия «Ponticola» включает наибольшее число изученных видов: сюда вошли все представители подрода Ponticola в понимании Ильина (1927) и бычок-гонец Neogobius gymnotrachelus, относимый им к монотипичному подроду Babka. Ближайшая к Ponticola филетическая линия включает виды рода Proterorhinus и бычка-мартовнка Mesogobms batrachocephalus. В пределах подклады бычков-пуголовок на всех филогенетических схемах с высоким уровнем бутстрэп-поддержки от собственно пуголовок (род Benthophilus) отделяется линия Caspiosoma. В кладу Neogobius вошли виды, относимые ранее к трем подродам Neogobius s. lato:

Apollonia, Eichwaldiella, Neogobius.

Наибольший уровень генетических дистанций в пределах клады, объединяющей бычков из Средиземноморья и Атлантики, обнаруживает бычок Gobius mger (табл. 1). На всех филогенетических схемах G. mger образует сестринскую группу по отношению к подкладе, объединяющей остальные виды рода Gobius s. stricto и бычка-травяника G. ophiocephalus (рис. 2); оценки генетических дистанций между всеми видами этой подклады достаточно сходны (табл. 1).

Таблица 1. Значения генетических дистанций были рассчитаны с использованием модели TN93 между видами рода Gobius, в программе MEGA 5.0 на основе 8 последовательностей гена цитохрома b

Виды 1 2 3 4

1 G. ophiocephalus

2 G. couchi 0,186

3 G.fallax 0,180 0,163

4 G. bucchichi 0,161 0,178 0,182

5 G. niger 0,248 0,232 0,242 0,218

во И N. kesslerí юо [U N. eurycephalus

j-< N. gorlap

Г N--Ir- N.

f N. J- N.

»4 N.

N. sp. N. cyrius

cephalargoides constructor '. rhodioni platyrostris N. ratan

_i N. syrman syrman

loot дг. syrman eurystomus —t N. gymnotrachelus

-1 M. batrachocephalus

^ P. marmoratus P. semilunaris

- 73 p< P. sen

_P- P. sp.

100Ц P. nass

3»

o"

о 5Г

nasalis C. caspium 9oj— B. abdurahmanovi "I— B. granulosus

_f B. mahmudbejovi

loot B. stellatus

¡I-< N. fluviatilis fluviatilis

1-< N. fluviatilis pallasi

N. caspius

_p N. melanostomus affinis

ioo 4 N. melanostomus melanostomus - G. niger

CD О <Q О

o-

5' 0}

581-

» 72П—

—f

100 L-

- G. ophiocephalus G. bucchichi

— G. fallax —t G. couchi

-1 Pom. sp.

-< K. sp.

Рис. 2. Филогенетические отношения ряда видов бычков (сем. Gobiidae) Черноморско-Каспийского бассейна по данным анализа генетических дистанций рассчитанных по модели TN93+G в программе MEGA 5.0 методом максимального правдоподобия (ML) на основе гаплотипов цитохрома Ь, мтДНК (1098 п.н.). Индексы - бутстрэп-поддержка в % от 1000 реплик. Длина отрезка соответствует дистанции указанной под ним. Различия, наблюдаемые в топологии деревьев построенных различными методами обозначены серым. Положение клады (Benthophilus-Caspiosomoi) на МР дереве показано кругами, клады (Knipowitschia — Pomatoschistas) на NJ и МР деревьях - треугольниками.

3.2. Филогеография бычков, широко распространенных в

Чериоморско-Каспийском бассейне.

Многие представители бычков, имеющих сарматское происхождение, широко распространены в пределах Черноморско-Каспийского бассейна. Некоторые исследователи выдвигали гипотезы о таксономической самостоятельности отдельных популяций. Работы по выявлению особенностей географического распределения генетических линии в пределах рассматриваемого региона проводились ранее и включали несколько наиболее многочисленных видов N. N. теШоХоти*, N. еутпоьасЫи*. Е

тагтогашя. Нам удалось получить данные по ряду видов, не охваченных подобными исследованиями ранее, N. еигусеркаЫ, N. &ог\ар. N. ке.^сп, N. пгтап В основе филогенетического анализа лежала изменчивость участка митоховдриального гена цитохрома Ь длиной 1098 п.н. При помощи теста Таджимы (Тарта, 1989) проводилась оценка нейтральности происходящих эволюционных процессов в каждой популяции (генетической линии). Было показано что во всех рассмотренных нами популяциях эволюция нуклеотидных последовательностей была нейтральной кроме популяции черноморского бычка цуцыка (табл. 2). Результаты анализа ™етическо о разнообразия и средние внухритрупповые дистанции каждой популяции или

филетической линии представлены в таблице 2.

V ттаНШ. Полученные нами гашютипы образуют две ветви, обособленные генетически и географически, представленные на филогенетическом дереве, построенном на основе собственных данных (рис. 36) Уровень бугстреп-поддержки образования ветвей филогенетичесих деревьев, соответствующих черноморским и каспийским линиям, высок (рис. 2) вне зависимости от метода построения деревьев. При рассмотрении филогенетических деревьев и медианной сети гаплотипов (р"с. 4б) полученных нами в результате филогенетичесого анализа, виден значительна уровень дивергенции между двумя линиями. Дистанция между линиям ^ /ШаШЬ (9,4%) оказалась более чем в десять раз больше средних

внутригрупповых дистанций (табл. 2).

N щеЬпо.потш. Картина распределения генетических линии N. теЬпосЮтиз аналогична картине полученной в отношении популяции бычка-песочника. Также как и у N. мы видим дифференциацию гаплотипов

Га две географически обособленные лини (рис. Зв). Одна, из которых включает гаплотипыиз бассейна Черного моря, а вторая из Каспия. Образованные клады шеют вьюокий уровень бугстреп-поддержки (рис. 2). Уровень различии между Линиями N. теЕшсЬпш значительно ниже, чем у

продемонстрировано на филогенетических деревьях фис. Зв) и «

сетях гаплотипов (рис. 4в). Межгрупповые дистанции (1,1 /о±0 3 /„) более чем в два с половиной раза превышает уровень внутригрупповых Дистанции (0,4 /0).

N. зугтап. Полученные филогенетическое дерево и медианная сеть гаплотипов, включающие все имеющиеся данные по гену цитохрома Ъ N.

syrman (рис. Зд, 4д) продемонстрировали образование двух, обособленных гаплогрупп с высоким уровнем бутстреп-поддержки. Одна из линий включала гаплотипы из Каспия, а вторая из Черноморского бассейна. Полученная картина дивергенции говорит о невысоком уровне расхождения между двумя популяциями. Дистанция TN93+G между 2 каспийскими образцами почти в 5 раз превышала среднюю внутригрупповую дистанцию черноморской популяции. Средняя межгрупповая дистанция (0,72%) оказалась в десять раз больше внутригрупповой дистанции бычков из Черного моря и только в два раза больше дистанции между каспийскими гаплотипами N. syrman.

Таблица 2. Генетическое разнообразие линий и результаты теста Таджимы на нейтральность, рассчитанные в программе DnaSP 5 (N - число последовательностей; S - число вариабельных сайтов; h - число гаплотипов; Hd - гаплотипическое разнообразие; я - нуклеотидное разнообразие; SD -стандартное отклонение; к - среднее число нуклеотидных различий; D - тест Таджимы на нейтральность). Средние внугригрупповые дистанции TN93+G линий и стандартная ошибка - SE, рассчитаны в программе MEGA5.

Наименование генетической линии N S h Hd± SD1U n± SD„ (%) k D Средние внугригрупповые дистанции ± SE (%)

N. f.fluviatilis 11 17 4 0,673± 0,123 0, 636± 0,112 6,982 0.909 0,9+0,14

N. f. pallasi 8 29 6 0,929± 0,084 1,103± 0,131 12,107 0,437 0,8±0,11

N. т. mclanostomus 12 15 7 0,924± 0,047 0,374± 0,036 4,106 -0.744 0,4±0,07

N. т. afmis 7 1 2 0,286+ 0,196 ü,052¿ 0,036 0,571 -1,237 0,4±0,08

N. s. syrman 12 3 4 0,561± 0,154 0,080± 0,025 0,879 -0,379 0,08 ±0,05

N. s. curystomus 2 4 2 1,000 0,364 4,000 - 0,37

N eurycephahts 10 11 4 0,644± 0,152 0,291± 0,098 3,200 -0,793 0,29±0,09

N. kessleri 15 5 4 0,371± 0,153 0,101¿ 0,043 1,105 -0,950 0,1 ±0,05

N. gorlap 9 19 6 0,833± 0,127 0,516+ 0,154 5,667 -0.929 0,52±0,12

N. sp. 11 17 9 0,964+ 0,051 0,384+ 0,046 4,218 -1,224 0,39±0,11

P sp. 4 15 3 0,S33± 0,222 0,789± 0,208 8,667 0,603 0,79±0,21

P. semilunares 58 41 28 0,904± 0,029 0,675± 0,031 7,405 -0,680 0,67±0,!5

P. nasalis 30 18 13 0,860± 0.042 0,232± 0,042 2,540 -1.519 0,27±0,08

P. marmoratus 82 35 28 0,807+ 0,039 0,142+ 0,020 1.554 -2,462 0,17±0,04

Рис. 3. Фрагменты филогенетического дерева (рис 2) и схемы пространственного распределения гаплотипов а) РгокегогЫпш, б) N. АиукйШк, в) N. те1апо8(отш, г) N. кеээ1еп, N. еигусеркаЫь, N. %ог1ар, N. ьр, д) N. хугтап.

РшП

Рт9 ЕЫ444637

тЧв—I

Е1144464П Е11444616

Рш 171

, Рт16

* Е1 444646

-/IX/-

Рт61 РтбО * Рт62 *

[¡11444649

о Рт65

00444345

б)

N(1121 (,'0444338'

00444411

-/100/

00444372

4 4

> N0 с

N14

Мб N('5

N1111« . ЕШ31165

N1114 ЕШ31215 N1113

ПИ« , ыши 1114^4-

N1112

N1118

Еи331175

V

N1^1 й"

Г.1526768 11526769

к 1.1526770

№26761 [•'1527659

3 1 ^N1-2

-/27 А

Л)

N.44 N531

1-7526774

N51 • N52

Рис. 4. Медианные сети гаплотипов а) РгоИегогЫпия, б) N. /?гш'сШ'/и, в) N. те1апо51отт, г) N. ке.ч.ч1еп, N. еигусерка1ш, N. %ог1ар, N. эр, д) N. зугтап. Цифрами обозначено число эволюционных шагов между гаплотипами и узлами ветвления. Диаметр окружностей на рис. 4г и 4д пропорционален количеству гаплотипов.

N. kessleri, N. eurycephalus, N. sorlap, N. sp. Результаты филогенетического анализа показали близость видов N. gorlap, N. kessleri, N. eurycephalus (рис. 2). Гаплотипы бычков пойманных в Каспийском море в районе г. Актау (Казахстан) образовали самостоятельную ветвь близкую к вышеперечисленным видам. Каждая из четырех рассматриваемых линий генетически обособлена. Наименьшая средняя внутригрупповая дистанция была обнаружена у N. kessleri (0,1%), наибольшая у N. gorlap (0,52%) (табл. 2). N. kessleri и N. eurycephalus образуют общую кладу, также как и N. gorlap с N. sp. поддержки ветвления каждой из этих двух клад на отдельные линии значительны, но не максимальны и требуют обсуждения. Образование клад N. kessleri - N. eurycephalus и N. gorlap - N. sp. имеет максимальное значение бутстреп-подцержки независимо от .метода построения деревьев (рис. Зг). Наиболее близкими оказались N. kessleri и N. eurycephalus, генетическая дистанция между ними (0,0196) значительно больше средних внутригрупповых дистанций этих видов. Остальные межгрупповые дистанции сопоставимы и находятся в пределах 0,0353 - 0,0411. Медианная сеть гаплотипов демонстрирует иную картину (рис. 4г). Галогруппы N. gorlap и N. sp. обособлены друг от друга и приблизительно одинаково удалены от N. kessleri и N. eurycephalus, имеющих монофилетическое происхождение (рис. Зг). Бычки, относящиеся к линиям N. gorlap и N. sp. были собраны в пределах бассейна Каспийского моря, но в одних локалитетах не встречались. Рыбы, относящиеся к линиям N. kessleri и N. eurycephalus из Черного моря, напротив, были пойманы вместе в оз. Сасык и в р. Дунай у г. Измаил (рис. Зг).

Proterorhinus. Оценка изменчивости мигохондриального гена цитохрома b бычка-цуцыка проводилась нами в два этапа. Первоначально мы проанализировали изменчивость небольшого участка длиной 408 п.н. у 45 особей (8 гаплотипов) из 15 точек, дополнив собственные даные последовательностями, представленными в базе данных NCBI. В качестве внешней группы для филогенетического анализа были использованы 2 ганлотипа N. melanoctomus из р. Черная, п-ов Крым. Увеличение длины последовательности маркера до 1098 п.н. и включение материала из ряда необследованных ранее точек позволило получить более полную информацию об изменчивости цитохрома Ъ и пространственном распределении генетических линий. Вместе с данными из базы NCBI было проанализировано 174 последовательности, среди которых было выявлено 72 гаплотипа. Филогенетический анализ выявил одинаковую картину, как при использовании последовательности длиной 1098 п.н. так и при изучении участка длиной 408 п.н. Были обнаружены четыре генетически обособленные гаплогруппы (рис. За, 4а), две из них «Р. marmoratus» и «Р. semilunaris» найдены в водоемах северозападной части Черноморского бассейна. Линия «Р. nasalis» оказалась наиболее широко распространенной, гаплотипы принадлежащие этой линии были обнаружены в бессточных реках Большой и Малый Узень, бассейне р. Волга, бассейне Азовского моря, включая Керченский пролив. У восточного побережья и в северном Каспии были обнаружены гаплотипы принадлежащие

линии представленной в предшествующих работах одним гаплотипом из Z ЙЛмческой впадины «Р. Уровень гаплотипическои изменчивости

„их групп оказался приблизительно одинаков (табл. 2). Наименьшее значение нуклеотидного разнообразия наблюдалось в линии, ооозначеннои Р mZJZs. ТесЛаджимы на селективную нейтральность выяви,• нейтральных эволюционных изменений в линии P. marmoratus (Р < 0.01) (табл^ 2) Учитывая значения гаплотипической и ну^еотиднои изменчивости и з ездообразную структуру данной гаплогруппы на медианнои сети у „ас есть основания говорить о наличии эффекта основателя в этой линии Значения средних внутригрупповых дистанции, рассчитанных с использованиГммодели тЛ, невысоки и составляют менее 1% для каждой ш гаплогрупп. Значения средних межгрупповых дистанции сильно варьируют между линей P. marmoratus и остальными линиями она составляет 0,145 - 0,153 и 0,022 - 0,034 между линиями P. nasalis, P. semilunaris и P. sp.

Глава 4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Филогенетические отношения бычковых рыб Черноморско-Каспииского бассейна рассматривались ранее разными авторами на основе различных сисГем признаков в том числе и с использованием данных о нуклеотидных последовательностях кодирующих участков ДНК (Nelson, Step.cn, 2009^ По сравнению с предшествующими молекулярно-генетическими исследованиями, благодаря добавлению оригинальных данных по ряду не изученных ранее нопуГций, нами были получены новые результаты, представляющие несомненный интерес с точки зрения выяснения филогенетических отноше , обоснования таксономических гипотез и оценки степени дивергенции популяций и видов из различных изолятов Понто-Каспийского решена. Изучение изменчивости гена цитохрома Ь бычков из различных популяции в пределах естественного ареала позволило рассмотреть в новом свете таксономические гипотезы, касающиеся широко распространенных видов. Однако молекулярно-генетические данные имеющиеся в нашем распоряжении позволяют обсуждать лишь некоторые из существующих таксономических проблем этой группы.

4.1. Филогения представителей семейства Gobiidae Черноморско-

Каспииского бассейна w„y

Согласно полученным нами данным, виды эндемичных понто-каспииских

бычков объединенные Бергом (1949) в один род Neogobius, разделяются на две самостоятельные филетические линии, одна из которых включает также понто-каспийские роды Mesogobius и Proterorhinus Эти Результаты схо;да с полученными Степьен с соавторами (Step.en et al„ 2005; Stepien, Tumeo 2006, Neilson Stepien, 2009a) и подтверждают парафилетичность выделенного Бергом рода Neogobius. Следует отметить, что положение группы видов бычков-ZTonoL!Benthophilil- Caspiosoma в наших филогенетических послоен (рис. 2) и на филогенетических деревьях, представленных в работе Неилсона и

Степиен (Neilsoll, Stepien, 2009a) неустойчиво. Бутстрэп-поддержки образования подклады Benthophilus-Caspiosoma и на наших деревьях, и на деревьях цитируемых авторов не велики, только на дереве, построенном на основе изменчивости гена COI (Fig. 4, Neilson, Stepien, 2009a) бутстреп-поддержка значительна и составляет 87%. На основании сопоставления этих результатов можно полагать, что выявленная неустойчивость положения филетической линии Benthophilus-Caspiosoma обусловлена неполной представленностью бычков-пуголовок в филогенетическом анализе. К группе бычков-пуголовок в настоящее время относят 4 рода и 21-24 вида, тогда как до сих пор для филогенетического анализа доступны (и использовались в настоящей работе и Neilson, Stepien, 2009а) всего 5 видов двух родов, что составляет менее 25 %. В этой связи мы считаем, что полученные к настоящему времени молекулярно-генетические данные недостаточны для построения надродовой системы бычков Понто-Каспия. Тем не менее, они позволяют решить некоторые вопросы на уровне отдельных родов.

Согласно нашим данным, бычок-травяник Gobius ophioeephalus на каждой из полученных филогенетических схем группируется вместе с другими видами рода Gobius, обнаруживая наибольшую близость (и соответственно наименьшую генетическую дистанцию) к бурому бычку G. bucchichi (рис. 2, табл. 1). Оба эти вида наиболее близки и по внешним морфологическим и краниологическим характеристикам (Васильева, 1992а), что было отмечено ранее Световидовым (1964), объединявшим их в отдельный подрод Zosterisessor. Ряд авторов выделяют в самостоятельный род Zosterisessor лишь бычка-травяника (Ильин, 1927 (как Zostericola); Miller, 2004; Богуцкая, Насека, 2004; Kottelat, Freyhof 2007; Neilson, Stepien, 2009a; Kovacic, Patzner, 2011). Наши данные показывают необоснованность этой таксономической концепции (как и объединения в самостоятельный таксон надвидового ранга бурого бычка и травяника) и подтверждают принадлежность травяника к роду Gobius s. stricto (Васильева, 1992а).

В пределах филогенетической группы N. melanostomus - N. fluviatilis - N. caspius уровень генетической дистанции между всеми видами достаточно сходен - 0.101-0.124. В разное время все эти виды выделяли в самостоятельные подроды рода Gobius s. lato: Apollonia с типовым видом Gobius melanostomus, Neogobius с типовым видом G. fluviatilis и Eichwaldia Smitt, 1900 с типовым видом G. caspius. Поскольку название Eichwaldia оказалось преоккупированным для рода ископаемых брюхоногих моллюсков, позднее для последнего подрода было предложено замещающее название - Eichwaldiella Whitley, 1930. Однако в последующем большинство авторов не выделяли хвалынского бычка N. caspius в самостоятельный род или подрод, за исключением Богуцкой и Насеки (2004). Два других вида этой клады на основе данных молекулярно-генетического анализа сначала были объединены в самостоятельный род Apollonia, противостоящий остальным видам, оставленным в роде Neogobius (Stepien, Turneo, 2006). Затем к ним добавился хвалынский бычок, и родовое название было заменено на Neogobius (Neilson,

Stepien, 2009a). Согласно полученным нами данным, в один таксон родового ранга следует объединить все виды, входящие в эту филетическую линию. Как уже указывалось ранее (Vasil'eva, 2003), руководствуясь статьей 23.9.3 Международного кодекса зоологической номенклатуры, за этим родом следует закрепить название Neogobius Iljin, 1927.

Среди видов рода Neogobius sensu Берг, 1949, вошедших в филетическую линию «Ponticola», ранее выделяли два подрода: Babka с типовым видом бычок-гонец Gobius gymnotrachelus Kessler, 1857 и Ponticola с типовым видом G raían Nordmann, 1840 (рис. 2). Берг (1949) считал, что бычка-гонца следует включить в отдельный род Mesogobius вместе с бычком-кнутом М. batrachocephalus (Pallas, 1814). Неправомочность такого объединения была показана Васильевой и Богачик (1991), а краниологические отличия Gobius gymnotrachelus от видов, включавшихся в подрод Ponticola, рассматривались как свидетельство в пользу правомочности выделения его в подрод Babka рода Gobius (Васильева, 19926). Ряд авторов подняли статус монотипического подрода Babka до родового (Neilson, Stepien, 2009а; Freyhof, 2011). На каждой из полученных нами филограмм бычок-гонец образует сестринскую группу по отношению к остальным изученным видам данной группы; монофилетическое происхождение объединенной филетической линии «Ponticola» не вызывает сомнений (рис. 2). Уровень генетической дистанции между бычком-гонцом и видами Ponticola s. stricto крайне низок (0.083) на фоне дистанций между другими номинальными таксонами и не достигает уровня генетических дистанций как между видами рода Gobius (0,161 - 0,248), так и между видами филетической линии «Neogobius» (0,101 - 0,124). Эти результаты свидетельствуют в пользу таксономического единства (на надвидовом уровне) бычка-гонца и видов, выделявшихся ранее в подрод Ponticola. Уровень генетической дистанции видов этой филогенетической линии от видов филогенетической линии «Neogobius» сопоставим с уровнем их дистанции от видов родов Gobius, Mesogobius, Benthophilus. Полученные результаты предполагают родовой статус филетической линии «Ponticola» (рис. 2). Поскольку оба входящих в нее подрода были описаны одновременно (Ильин, 1927), за данным родом следует сохранить более распространенное название Ponticola.

Таким образом, представленная в настоящей работе таксономическая интерпретация филогенетических отношений черноморско-каспийских бычков принципиально отличается от системы, предложенной ранее Нейлсоном и Степиен (Neilson, Stepien, 2009а), где род Neogobius sensu Берг, 1949 разделен на три рода - Neogobius s. stricto, Ponticola и Babka, a вид Gobius ophiocephalus выделен в род Zosterisessor. Полученные нами молекулярно-генетические данные не подтверждают данную концепцию. Более того, если следовать логике цитируемых авторов, то следует выделить несколько новых монотипических родов как среди видов родов Ponticola и Neogobius s. stricto, так и видов рода Gobius.

4.2. Анализ распределения филогенетических пиний широко распространенных видов и групп близких видов бычков в пределах Понто-Каспийского региона.

Полученные нами данные во многом сходы с результатами исследований, проводившихся ранее. Привлечение новых данных о генетической структуре рыб из необследованных ранее районов, позволило сопоставить филогеографическую структуру ряда близких видов черноморско-каспийских бычков и попытаться проследить этапы формирования их генетического разнообразия.

Обнаруженные генетические линии N. fluviatilis, N. melanostomus, N. syrman географически обособлены в бассейнах Черного и Каспийского морей. В связи с этим можно предположить, что возникновение этих линий связано с их географической изоляцией. Это заключение справедливо как для N. syrman обитающего исключительно в морских водах (13-14 %о) (Miller (ed), 2003), так и для двух других видов не смотря на их присутствие в бассейне р. Волга. Уровень генетической дивергенции между популяциями этих видов различен. Если наблюдаемые дистанции между линиями N. melanostomus и N. syrman сходны и составляют 0,011 и 0,0072, то дистанция между линиями N. fluviatilis, приблизительно в 10 раз больше и составляет 0,094. Изучение морфологической изменчивости широко распространенных представителей рода Neogobius sensu Берг 1949 приводило исследователей к выводам о таксономической самостоятельности отдельных популяций этих видов (N. fluviatilis, N. melanostomus, N. syrman, N. ratan, N. gymnotrahelus). Последующие исследования внешних морфологических признаков и особенностей строения черепа не подтвердили существование большинства этих подвидов. Однако, обнаруженные генетические различия могут говорить о таксономической самостоятельности черноморских и каспийских популяций N. fluviatilis, N. melanostomus, N. syrman.

Состав группы N. kessleri, N. gorlap, N. eurycephalus и N. sp. был определен на основе результатов реконструкции филогенетических связей черноморско-каспийских представителей семейства Gobiidae (рис. 2). Все эти виды, как и рассмотренный ранее N. syrman, относятся к группе Ponticola, при этом N. kessleri, N. gorlap, N. eurycephalus и N. sp. образуют общую монофилетическую кладу. Как и следовало ожидать, гаплотипы всех рассмотренных нами видов образовали соответствующие филетические линии.

Существование одной из рассматриваемых в этой группе линий N. sp. из Каспийского моря было показано впервые. Изначально при видовой идентификации эти рыбы были отнесены к виду N. gorlap из-за наличия сходных морфологических черт, но при этом оставались сомнения в их видовой принадлежности, и, поэтому они были обозначены N. sp. В результате филогенетического анализа гаплотипы N. sp. образовали сестринскую ветвь по отношению к линии N. gorlap. Рыбы, относящиеся к линии N. sp. были обнаружены в Каспийском море у г. Актау, приэтом рыб, относящихся к линии N. gorlap, в этом месте обнаружено не было. Как и следовало ожидать N. gorlap

и N. kessleri оказались генетически близкими. Долгое время два этих вида рассматривали как одни. Это происходило до тех пор, пока в результате применения методов сравнительной кариологии не были выявлены различия между ними. При этом ареалы видов не пересекаются (Miller (ed), 2003).

В то время как на филогенетических деревьях наблюдается образование одной клады, включающей линии N. gorlap и N. sp. (рис. Зг) построенная нами метианная сеть гаплотипов показывает равное удаление двух этих линии от черноморской группы (рис. 4г) и, соответственно, невозможность объединения их в один кластер. В результате анализа распределения филогенетических линий мы можем говорить о существовании видов имеющих черноморское {N. eurycephalus и N. kessleri) и каспийское (N. gorlap и N. sp.) происхождение. Наибольшую генетическую близость в группе проявили N. eurycephalus и N. kessleri. Средняя межгрупповая дистанция TN93+G составила 0,0196. N. eurycephalus и N. kessleri имеют «хорошие» морфологические отличия, а также каждый из видов имеет определенные предпочтения к уровню солености. N. eurycephalus встречается в солоноватых водах и лишь иногда заходит в пресные, а N kessleri встречается только в водах с соленостью 0-3 %о. Нередко оба вида можно обнаружить в одних и тех же локалитетах (Манило, 2009), что еще раз свидетельствует о эвригалинности этих видов. Возможное симпатрическое видообразование N. eurycephalus и N. kessleri объясняет наличие явных морфологических различий, но факторы способствовавшие разделению этих видов, как и причины возникновения различных предпочтений к уровню

солености остаются невыясненными.

На филогенетическом дереве Proterorhinus представлены четыре линии. Их распределение на первый взгляд не связано с существующими в настоящее время бассейнами, к тому же две из представленных линий были обнаружены в одних и тех же локалитетах. Линия, наиболее удаленная от остальных Р. marmoratus (генетическая дистанция между P. marmoratus и другими линиями находится в пределах 0,1446 - 0,1528), локализована в северо-западнон части Черного моря, включая побережье Крыма, Одесскую бухту. Рыбы с гаплотипом, принадлежащим к линии P. marmoratus, были обнаружены в нижнем течении р. Днестр Три другие линии имеют сходные межгрупповые дистанции, находящиеся в пределах 0,0219 - 0,0339. Одна из этих линий, P. semilunaris, распространена в тех же пределах что и линия P. marmoratus, но в отличие от нее проникает в реки значительно дальше вверх по течению. Наиболее широко распространенной в пределах Понто-Каспийского региона является линия Р. nasalis. Гаплотипы, принадлежащие к этой линии, были обнаружены в бассейне Азовского моря, Керченском проливе, бассейне Волги и бессточных реках Большой и Малый Узень. Гаплотипы, относящиеся к третьей линии, были обнаружены как в Кума-Маныческой впадине, так и в Каспийском море (рис. За).

Таблица 3. Галлотипический состав смешанных («морских» и «пресноводных») черноморских популяций Рго1егоНипи.<: (по данным изменчивости участка су1 Ь длиной 408 п.н.)

Локальности Соленость Число гаплотипов /экземпляров относящихся к черноморским линиям Proterorhinus

P. semilunaris P. marmoratus

Дельта р. Днепр 0-2 %о 9/10 3/5

Одесский залив 14- 11 %а 4/5 12/17

Предшествующие исследователи рассматривали P. marmoratus и Р. semilunaris как соответственно морской и пресноводный виды и на основе этого выдвигали гипотезы об их происхождении. Однако, полученные нами данные позволили показать, что возникновение этих видов не связано с изменением солености в пределах Черного моря. В противном случае эти два вида вряд ли бы обитали совместно (табл. 3). Это не отрицает возможности формирования у двух этих видов предпочтений к различным уровням солености.

Гаплогруппа соответствующего P. marmoratus s. stricto из северовосточной части Черного моря включает экземпляры из устья и пресноводной части р. Черная (Крым), а также бычков из Казачьей бухты и оз. Донузлав, обладающих тем же самым гаплотипом, что и экземпляр из верхнего течения р. Черная, и рыб преобладающих в Стрелецкой бухте (66.7 %) и Севастопольском Заливе (90 %). Вероятно тот же самый гаплотип был свойственен голотипу Gobius marmoratus описанный из Севастополя. Молекулярный анализ не подтверждает валидности P. tataricus описанный из этой области после оценки морфометрических различий (Freyhof, Naseka 2007). Несмотря на необходимость дальнейшего исследования ядерного генома бычка-цуцика из других популяций, следует отметить, что морфологический анализ проводился на основе генетически гетерогенных выборок. В связи с этим не вызывает удивления высокая морфологическая изменчивость P. tataricus и малая диагностическая ценность обнаруженных различий. Все это свидетельствует о видовом единстве P. tataricus и P. marmoratus.

Третья генетическая линия «Р. nasalis» имеет наиболее широкое распространение. Гаплотипы относящиеся к этой линии были обнаружены в бассейне Азовского моря и бассейне р. Волга. Область происхождения этой линии однозначно установить не представляется возможным. В этой связи наиболее вероятными выглядят две таксономических гипотезы, основанные на данных молекулярного анализа:

1) Бычок-цуцик, относящийся к третьей генетической линии, действительно принадлежит широко распространенному в бассейнах Каспия и

Азовского моря виду P. nasalis (в этом случае P. semipellucidus должен

рассматриваться как его младший синоним);

2) Третья генетическая линия представляет отдельный вид, занимающей бассейн Азовского моря и бассейн р. Волга, генетически отличный от линии бычка-цуцика, обитающей в Каспийском (или в Середнем и Южном Каспии) и

определенной как P. nasalis s. stricto.

Обнаруженный Nielsen, и Stepien (20096) гаплотип из Черноземельского канала имел не большие, но заметные отличия от остальных гентических линии Proterorhinus. Nielsen, и Stepien (20096) предположили существование самостоятельной генетичесой линии P. sp. изолированной в Черноземельском канале (Кумо-Маныческая впадина). Полученные нами гаплотипы из Северного Каспия и восточного побережья Каспийского моря показали значительное сходство с гаплотипом из Кумо-МаныческоЙ впадины. Представленная картина в значительной степени удовлетворяет второй гипотезе. В пользу каспийского происхождения линии широко распространенной в пресноводном бассейне Северного Каспия и бассейне Азовского моря говорит обнаружение гаплотипов, принадлежащих этой генетической линии, в бессточных реках Большой и Малый Узень, которые были изолированы в течение последних 25 тыс. лет.

Сравнение филогеографических картин характерных для различных широко распространенных видов позволяет выделить линии дивергенция между которыми имеет наивысшие значения. Генетические дистанции TN93 между линиями P. marmoratus s. stricto и остальными тремя линиями Proterorhinus находятся на уровне 15%, а дистанции между черноморской и каспийской линиями N. jluviatilis - 9,4 %. Эти дистанции значительно превышают различия между изолированными популяциями остальных рассмотренных видов. Nielsen, и Stepien (20096) предполагали, что дивергенция линии P. marmoratus s. stricto от остальных связана с колебаниями уровня солености в позднем миоцене, однако эта гипотеза не подтвердилась. Близость трех генетических линий P. nasalis, P. semilunaris, P.sp. две из которых имеют каспийское происхождение, наводит на мысль о возникновении столь глубокой дивергенции в результате древнего разделения бассейнов Каспия и Черного моря (~5 млн. лет назад). Различия в уровне дивергенции между линиями, имеющими каспийское и черноморское происхождение, могут быть связаны с отсутствием селективной нейтральности черноморской линии P. marmoratus s.

stricto. „ д.

Дивергенция между черноморскими и каспиискими линиями Jy.

melanostomus, N. svrman, а также линиями N. kessleri - N. gorlap, N. gorlap - N. eurycephalus, N. gorlap - N. sp., N. kessleri - N. sp., N. eurycephalus - N.. sp., P. nasalis - P. semilunaris. P.sp. - P. nasalis и P. semilunaris - P.sp. значительно ниже и связана с возникновением непостоянных соединений между двумя бассейнами в конце плиоцена - голоцена (2 млн. лет - н.в.). На данный момент такая трактовка является наиболее аккуратной и правдоподобной в отличие от иных гипотез (Nielsen, Stepien, 2009а). Подобная картина дивергенции наблюдается и у других видов Понто-Каспийских гидробионтов (Audzijonyte et

а1., 2006, 2008; СгЫеБси е1 а!., 2003; ОешЬшк е1 а1., 2006 и др.) и соответствует упомянутым выше зоогеографическим гипотезам.

Сложная картина пространственного распределения генетических линий черноморско-каспийских бычков и различия в уровне дивергенции между ними является отражением богатой геоморфологическими событиями истории Понто-Каспийского региона. Полученные нами результаты свидетельствуют в пользу гипотез о таксономической обособленности изолированных популяций бычков в Черном и Каспийском морях.

В данной работе рассмотрена лишь часть проблем, касающихся генетического разнообразия, филогении и таксономии черноморско-каспийских бычков. Не решенными остались вопросы, касающиеся филогении и таксономии обособленной группы бычков-пуголовок {ВепЛорЫк^, ВегикоркИспск^, Саярюзота, АпаЫгозШт), филогенетической структуры рыб, относящихся к группе кавказских речных бычков. Представляет интерес изучение филогении группы песчаных бычков {РотШозсМзШз, КтроюШсЫа, Соиисики, ЕсопитхсПсЫЬуз). Дискуссионным остается систематическое положение эндемичных черноморско-каспийских бычков в семействе ОоЬпс1ае.

выводы

1. Митохсшдриальный ген цитохрома b является эффективным молекулярным маркером при решении проблем связанных с систематикой и филогенией Черноморско-каспийских рыб семейства Gobiidae на родовом,

видовом и популяционном уровнях.

2. Группа эндемичных сарматских бычков имеет монофилетическое происхождение и включает в себя ряд близких родов: Benthophilus; Caspiosoma; Mcsogohius; Neogobius sensu Берг, 1949; Proterorhinus. Однако, для выяснения положения черноморско-каспийских бычков в таксономической структуре семейства необходимо использование маркеров имеющих меньшую скорость эволюции.

3. Род Neogobius sensu Берг имеет парафилетическое происхождение, объединяя две филетические линии Ponticola (N. constructor, N. cephalargoides, N. ratan, N. cyrius, N. ewycephalus, N. gorlap, N. platyroslris, N. kessleri. N. syrman, N. rhodioni, N. gynmotrachelus) и собственно Neogobius (N. melanostomus, N. fluviatilis. N. caspius). Это может свидетельствовать о таксономической

неоднородности рода Neogobius.

4. Генетическая близость бычка травяника (Gobius ophiocephalus) к другим представителям рода Gobius не дает оснований для его выделения в самостоятельный род Zosterisessor.

5. Популяции широко распространенных видов, населяющие различные изоляты Понто-Каспийского региона, имеют заметные, а в ряде случаев существенные, различия в полиморфизма гена цитохрома Ь. Различный уровень дивергенции популяций таких видов связан с неоднократным разделением их ареалов. Основное влияние на дивергенцию широко распространенных видов и групп близких видов оказали два последовательных этапа преобразования Понто-Каспийского региона: 1) древнее разделение бассейнов Черного и Каспийского морей (5 млн. лет назад), 2) возникновение временных связей между изолятами Понто-Касиия в плиоцене - голоцене (2 млн. лет-н. в.).

6. Обнаруженные генетические различия между изолированными популяциями близких видов в ряде случаев являются значимыми, согласуются с имеющимися таксономическими гипотезами и могут быть отражены в систематике черноморско-каспийских бычков.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Sorokin Р.A., Medvedev D.A., Vasil'ev V.P., Vasil'eva E.D., 2011. Further studies of mitochondrial genome variability in Ponto-Caspian Proterorhinus specíes (ACTINOPTERYGII: PERCIFORMES: GOBIIDAE) and their taxonomic implications // ACTA Ichthyologica et Piscatoria. V. 41, №2, P. 95-104.

2. Медведев Д.А. 2013. Молекулярная филогения и некоторые особенности формирования генетического разнообразия бычковых рыб (Gobiidae) сарматской группы // Вестник Тамбовского государственного университета Т.18, №6, С. 3045-3049.

3. Медведев Д.А., Сорокин П Л., Васильев В.П., Чернова Н.В., Васильева Е.Д. 2013. Реконструкция филогенетических связей черноморско-каспийских бычков (Gobiidae, Perciformes) на основе изменчивости митохондриального генома и некоторые проблемы таксономии // Вопросы ихтиологии. Т. 53, №6, С. 687-698.

Тезисы в сборниках материалов конференции:

1. Медведев Д.А., Сорокин П.А., Васильева Е.Д., Васильев В.П. 2011. Продолжение исследований изменчивости митохондриального гена цитохрома Ъ Понто-Каспийских видов Proterorhinus (Gobiidae) и их таксономическое значение. // Популяционная генетика современное состояние и перспективы: Материалы молодежной международной конференции 17-18 ноябрь. Москва, Россия. М.: Цифровичок. С. 2Ó4.

2. Vasil'eva Е., Sorokin Р., Medvede\> D„ Vasil'ev V. 2011. New taxonomic hypotheses for the tubenose goby genus Proterorhinus (Gobiidae) resulted from phylogeographic studies // Combined Abstract Booklet. World Conference on Marine Biodiversity, September. P. 181.

3. Васильева Е.Д., Медведев ДА., Васильев В.П. 2013 Проблемы таксономии бычковых рыб (Gobiidae, Piscies) Понто-Каспия: данные молекулярно-генетических исследований // Молекулярно-генетические подходы в таксономии и экологии: тезисы докладов научной конференции (г. Ростов-на-Дону, 25-29 марта 2013 г.) / отв. ред. чл.-корр. РАН Д.Г. Матишов. -Ростов н/Д: Изд-во ЮНЦ РАН, С. 24.

4. Медведев Д.А. 2013. Молекулярная филогения черноморско-каспийских бычков (Gobiidae, Perciformes) и некоторые проблемы таксономии. // Биоразнообразие: глобальные и региональные процессы: Материалы всероссийской конференции молодых ученых, Улан-Удэ (Россия), 16-21 сентября 2013 г. - Улан-Удэ: Изд-во БНЦ СО РАН, С. 10-11.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Медведев, Дмитрий Александрович, Москва

Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова Российской академии наук

На правах рукописи

о4201454809

МЕДВЕДЕВ Дмитрий Александрович

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ФИЛОГЕНИЯ И АНАЛИЗ ТАКСОНОМИЧЕСКИХ ОТНОШЕНИЙ БЫЧКОВЫХ РЫБ (СОВПБАЕ) ЧЕРНОМОРСКО-КАСПИЙСКОГО БАССЕЙНА

(03.02.06 - ихтиология)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук В.П. Васильев

Москва, 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................3

Глава 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР..................................................8

1.1 Молекулярно-генетические методы в зоологических исследованиях...................................................................................8

1.2. Геоморфологическая история Понто-Каспийского региона и ее влияние на гидробионтов....................................................................25

1.3. Современные представления о системе бычковых рыб бассейна Понто-Каспия..................................................................................33

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..............................................46

Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ...............................................................55

3.1. Реконструкция филогенетических связей черноморско-каспийских представителей семейства Gobiidae.......................................................55

3.2. Филогеография бычков, широко распространенных в Черноморско-Каспийском бассейне........................................................................68

Глава 4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ........................................95

4.1. Филогения представителей семейства Gobiidae Черноморско-Каспийского бассейна........................................................................95

4.2. Анализ распределения филогенетических линий широко распространенных видов и групп близких видов бычков в пределах Понто-Каспий ского региона.......................................................................101

ВЫВОДЫ..............................................................................113

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ............................115

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. Рыбы, принадлежащие к семейству ОоЬпс1ае одна из наиболее сложных групп Понто-Каспийского региона. Всего в бассейне обитает около 50 видов, большая часть которых является эндемиками. Систематика черноморско-каспийских бычков является объектом продолжительных дискуссий. Не решенными остаются вопросы, касающиеся таксономической структурированности представителей семейства на уровне рода и филогенетических связей между этими родами. Продолжается также дискуссия в отношении таксономической самостоятельности отдельных популяций широко распространенных в Черноморско-Каспийском бассейне видов. Применение генетических методов, по мнению многих исследователей, способно решить большинство имеющихся проблем.

Геологическая история Понто-Каспийского региона богата событиями, которые не моги не отразиться на эволюции гидробионтов. К ним можно отнести разделение и последующее неоднократное возникновение связей между бассейнами Каспия и Черного моря, за время их существования, кроме того влияние оказали значительные изменения, происходившие во время чередования ледниковых и межледниковых периодов.

Оценка влияния последовательных геоморфологических преобразований на гидробионтов Понто-Каспийского региона послужило целью многих филогеографических работ (Аис12уопу1е е1 а1., 2006, 2008; Сг^еБси е1 а1., 2003; 01етЫик е1 а1., 2006 и др.). Было показано, что наиболее полную картину дает изучение групп родственных видов, имеющих сходную биологию. Такие работы были проведены в отношении ряда групп беспозвоночных. Среди позвоночных наиболее перспективно изучение распределения генетических линий широко распространенных в регионе видов семейства ОоЬпс1ае.

Цель исследования. Выявление филогенетических связей бычков Черноморско-Каспийского бассейна на основе изменчивости

митохондриального гена цитохрома Ъ и реконструкция эволюционной истории этой группы.

В работе решались следующие задачи.

- реконструкция филогенетических связей черноморско-каспийских представителей сем. ОоЬпёае

- анализ филогеографической структуры широко распространенных

видов

- анализ особенностей молекулярно-генетического разнообразия в связи с исторической геоморфологией региона

- решение некоторых таксономических проблем: популяционно-видовой структуры широко распространенных видов, таксономической структуры некоторых родов и родовой структуры семейства ОоЬпс1ае Понто-Каспия.

Научная новизна работы. Изучена изменчивость митохондриального гена цитохрома Ъ, позволившая проанализировать филогенетические связи черноморско-каспийских бычков и представить новую оригинальную таксономическую концепцию, имеющую в своей основе наиболее полный объем имеющихся в настоящее время данных.

На основе оригинальных данных была проанализирована филогеографическая структура наиболее широко распространенных видов и групп близких видов. Для N. Бугтап анализ филогеографической структуры был представлен впервые. Сопоставление филогеографических паттернов позволило выявить общие черты в характере дивергенции различных видов и их связь с палеогеографической историей Понто-Каспийского региона.

В ходе работы была впервые обнаружена генетическая линия каспийских бычков, относящихся к подроду РопШоа, и отличающаяся морфологически от всех изученных ранее видов этого региона.

Теоретическое и практическое значение. Понто-Каспийский регион, чья историческая геоморфология хорошо документирована, предоставляет хорошие возможности в отношении познания генезиса его фауны и анализа формирования генетического разнообразия обитающих здесь видов.

Представители семейства ОоЬпёае являются основным элементом ихтиофауны этого региона, а некоторые из них имеют важное промысловое значение.

Результаты работы вносят вклад в исследование формирования генетического разнообразия различных групп животных Понто-Каспийского региона, фауна которого включает значительное число эндемичных видов. Изучение генетической дифференциации популяций, видов и отдельных групп бычковых рыб Черноморско-Каспийского бассейна из различных изолятов, наложение молекулярно-генетических данных на карты исторической геоморфологии и анализ полученных результатов представляет несомненный общебиологический интерес. Результаты анализа данных по изменчивости гена цитохрома Ъ в контексте геоморфологических преобразований рассматриваемого региона позволило подтвердить некоторые гипотезы, выдвигавшиеся в отношении широко распространенных видов бычков. Прежде всего, в этом заключается теоретическая значимость настоящей работы.

Практическое значение диссертации обусловлено в первую очередь тем, что некоторые виды бычков имеют хозяйственное значение как объекты рыболовства. Рациональная эксплуатация таких групп видов предполагает знания их таксономической и популяционной структуры. Кроме этого некоторые виды черноморско-каспийских бычков проявили способность к активной колонизации и распространились в водоемах западной Европы и Северной Америки. Изучение филогеографической структуры таких видов может не только способствовать выявлению источников инвазии, но и позволяет выявлять виды, обладающие потенциальной способностью к активному расширению своего ареала. Изучение генетического разнообразия гидробионтов Понто-Каспия имеет большое природоохранное значение для сохранения биологического разнообразия этого региона, и могут найти применение в природоохранных программах.

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на

научной конференции: «Молекулярно-генетические подходы в таксономии и

экологии» (Ростов-на-Дону, 2013), Всероссийской конференции молодых

5

ученых: «Биоразнообразие: глобальные и региональные процессы» (Улан-Удэ, 2013) и Международных научных конференциях: «Популяционная генетика: современное состояние и перспективы» (Москва 2011), World Conference on Marine Biodiversity (Aberdeen, Scotland, 2011), «Эктотермные позвоночные Восточной Европы и сопредельных территорий: эволюционные, экологические и природоохранные аспекты» (Тамбов, 2013).

Положения, выносимые на защиту:

1. Митохондриальный ген цитохрома Ъ является эффективным молекулярным маркером при решении проблем, связанных с систематикой и филогенией черноморско-каспийских рыб семейства Gobiidae на родовом, видовом и популяционном уровнях.

2. Группа эндемичных сарматских бычков имеет монофилетическое происхождение и включает в себя ряд близких родов: Benthophilus; Caspiosoma; Mesogobius; Neogobius sensu Берг, 1949; Proterorhinus.

3. Род Neogobius sensu Берг имеет парафилетическое происхождение объединяя две филетические линии Ponticola (N. constructor, N. cephalargoides, N. ratan, N. cyrius, N. eurycephalus, N. gorlap, N. platyrostris, N. kessleri, N. syrman, N. rhodioni, N. gymnotrachelus) и собственно Neogobius (N. melanostomus, N. fluviatilis, N. caspius). Это может свидетельствовать о таксномической неоднородности p. Neogobius.

4. Генетическая близость бычка травяника (Gobius ophiocephalus) к другим представителям p. Gobius не дает оснований для его выделения в самостоятельный род (p. Zoster is ess or).

5. Популяции широко распространенных видов, населяющие различные изоляты Понто-Каскийского региона, имеют заметные, а в ряде случаев существенные, различия в структуре гена цитохрома Ь.

6. Изменение палеоэкологических условий Понто-Каспийского региона в позднем плиоцене-голоцене привело к формированию близких филогенетических линий, имеющих различные экологические предпочтения.

7. Обнаруженные генетические различия между изолированными популяциями близких видов в ряде случаев являются значимыми, согласуются с имеющимися таксономическими гипотезами и могут быть отражены в систематике черноморско-каспийских бычков.

Публикации результатов работы. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, из них 3 статьи в журналах, включенных в «Перечень ведущих рецензируемых журналов и изданий в которых должны быть опубликованы результаты диссертации на соискание научной степени доктора и кандидата наук».

Личный вклад автора. Автор принял непосредственное участие на всех этапах исследования, включая сбор материала с 2008 по 2011 гг.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Основное содержание работы изложено на 137 страницах печатного текста, иллюстрировано 29 рисунками и 18 таблицами. Список литературы содержит 227 цитируемых работ.

Благодарности. Автор считает своим долгом выразить искреннюю признательность научному руководителю д.б.н. В.П. Васильеву, а также д.б.н. Е.Д. Васильевой за предложенную тему, всестороннюю помощь, ценные советы и консультации в ходе написания данной работы.

Автор выражает сердечную благодарность д.б.н. М.В. Холодовой, к.б.н. П.А. Сорокину и всем сотрудникам кабинета методов молекулярной диагностики ИПЭЭ РАН за предоставленную возможность и помощь в проведении молекулярно-генетического анализа, ценные замечания и советы при обсуждении результатов работы; заведующему лабораторией экологии низших позвоночных ИПЭЭ РАН д.б.н. М.И. Шатуновскому за поддержку при выполнении работы.

Глава 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Молекулярно-генетические методы в зоологических

исследованиях.

Развитие молекулярно-генетических технологий и теоретической базы их использования в зоологических и эволюционных исследованиях позволило осуществить значительное продвижение в понимании филогенетических и филогеографических отношений многих групп животных. Кроме этого значителен вклад молекулярно-генетических технологий в современных таксономических исследованиях. Ежегодно в свет выходят сотни работ раскрывающих филетические связи между организмами. Широчайший спектр не подвергавшихся ранее анализу признаков предоставили данные молекулярной генетики. В настоящее время из молекулярно-генетических данных наиболее широко для филогенетических реконструкций используются данные об изменчивости последовательностей ДНК. Применение генетических данных открыло новые возможности для исследователей и способствовало возникновению новых направлений имеющих фундаментальное и прикладное значение. Однако, многие идеи, реализованные при помощи современных методов, имеют глубокие корни в своей основе.

Первая филогенетическая схема, так называемое, Древо жизни принадлежит Жану Батисту Ламарку (1809 г.). В это время происходила закладка основных направлений в биологии, имевших впоследствии огромное значение в развитии эволюционных взглядов. Такие направления как эмбриология, сравнительная анатомия, палеонтология обеспечили исследователей обширным материалом, обобщение которого способствовало развитию эволюционных взглядов и выяснению родственных отношений между организмами. Филогенез (филогения) как термин, подразумевающий историю развития органического мира, был введен Э. Геккелем. Раздел биологии занимающийся изучением филогенеза получил название

филогенетика. Последующее развитие систематики было тесно связано с эволюционной теорией.

К концу 60-х годов XX века в популяционную генетику стали проникать

молекулярно-генетические методы, которые впервые обеспечили

непосредственный доступ к генетической информации любого организма (см.

обзор Avise, 2000). Внедрение молекулярно-генетических признаков в решение

проблем систематики стало новой вехой. Преимущества этих методов были

очевидны, в первую очередь они могли воспроизводиться, их можно было

сравнивать и формализовать. Одним из основных преимуществ молекулярно-

генетических методов стала их универсальность. Их привлекательность связана

с тем, что интерпретация признаков однозначна и они имеют прямую связь с

генотипом. Применение этих методов открывало широкие возможности для

внедрения в решение проблем систематики подходов популяционной генетики.

Развитие молекулярно-генетических методов послужило основой для создания

теории нейтральности (Кимура, 1985). Применение молекулярных методов

казалось в силах решить большинство проблем стоящих перед систематиками.

Результаты филогенетических исследований, основанные на молекулярных

данных, выражаются в виде дендрограмм, построение которых проводится или

на основе сравнения дискретных признаков или используя генетические

дистанции. С этого момента филогенетические деревья перестали быть

результатом многолетней работы, а стали материалом, на основе которого

строились гипотезы о родстве и происхождении организмов. Применение

молекулярно-генетических данных, на первый взгляд, могло не только

определять видовые границы на основе анализа генетических дистанций, но и

создать новую альтернативную систему идентификации организмов. Работы,

проводившиеся на популяционном уровне, также оказались успешными.

Выявленная связь между генетическими линиями и их географическим

распределением легла в основу такого направления как «филогеография»

(Avise et al., 1987). Применение молекулярных методов привело к

значительному росту числа публикаций пересматривающих сложившиеся

9

представления о систематике и филогении различных групп организмов. Однако, после того как некоторый ажиотаж вокруг молекулярно-генетических методов улегся, исследователям в очередной раз пришлось признать, что молекулярно-генетические методы, хотя и являются универсальными, таят немало «подводных камней», которые требуют отдельного обсуждения.

Многие исследователи на данный момент говорят о приоритете генетических методов (Абрамсон, 2007), а работы по систематике зачастую не воспринимаются всерьез, если в них отсутствует раздел посвященный генетическим особенностям организма. Безусловно, во многих случаях эти замечания обоснованы, так как некоторые вопросы могут быть решены только с применением генетических методов. Генетические признаки обладают рядом привлекательных качеств, отсутствующих в других системах признаков. Это и большая разрешающая способность, универсальность и воспроизводимость получаемых данных. Говоря о генетических подходах, мы неосознанно обобщаем значительный пласт довольно разнообразных методов разработанных в рамках молекулярно-генетических и цитогенетических исследований, которые часто дают не только различные результаты, но и не согласуются между собой. Методы сравнительной кариологии давно и успешно применяются в систематике близких видов многоклеточных организмов, в том числе и рыб (Васильев, 1985, КПпкЬагсИ: е1 а1. 1995, Ага1, 2011). Основная сложность или ограничение, стоящее перед исследователями заключается в трудоемкости кариологического метода.

Молекулярно-генетические методы в филогенетических исследованиях

включают в себя широчайший спектр подходов к анализу изменчивости

генетического материала. Они позволяют выявлять различия непосредственно в

нуклеотидных последовательностях и в структуре мультилокусных признаков

(Банникова, 2004). Эти мет