Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Филогения и систематика морских ежей семейства Strongylocentrotidae по результатам молекулярной гибридизации их ДНК

ВАК РФ 03.00.08, Зоология

Автореферат диссертации по теме "Филогения и систематика морских ежей семейства Strongylocentrotidae по результатам молекулярной гибридизации их ДНК"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА,. ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННОЙ'УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

ТАТАРЕШ ДМИТРИЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ

УДК 57,06:593.577.323.75

ФИЛОГЕНИЯ И СИСТЕМАТИКА МОРСКИХ ЕЖЕЙ СЕМЕЙСТВА •

5ТЕ0ШШХЖГ1ЮТ1РАЕ ПО'РЕЗУЛЬТАТАМ МОЛЕКУЛЯР-; НОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ ИХ ДНК.

Специальность 03.00.08 - зоология, 03.00.03 - молекулярная биология :

АВТОРЕФЕРАТ '

диссертации на соискание, ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1991..

Работа выполнена на кафедре зоологии и сравнительной анатомий беспозвоночных животных Биологического факультета и в Ьекторе эволюционной биохимии Межфакультетской проблемной научно-исследовательской лаборатории молекулярной биологии и биоорганической химии им, А.Н.Белозерского Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова.

Научные руководители: доктор биологических наук П.В.Матекин

доктор биологических наук А.С.Антонов

Научный консультант: кандидат биологических наук

А.Б.Полтараус Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Б.М.Медников

^метта^биологических наук А.Н.Миронов

Ведущая организация - Палеонтологический институт.АН СССР Зашита диссертации состоится "%0 " 1991^г./

в ^М&^асов на заседании специализированного, совета Д.063.05.34 при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу; 119899 Москва, Ленинские горн» МГУ, Биологический факультет. .•'■'''

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке"Биологического факультета, МГУ. -

Автореферат разослан Ученый секретарь '

специализированного совета ^ • ^ч '

кандидат биологических наук ХлуЪ /Г

Л.И.Барсова

ОБШАЛ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Построение естественной системы, отражающей филогенетическое родство организмов, является важнейшей задачей биологик. Наши сегодняшние представления о систематики и филогении иглокожих основаны на результатах классических зоологических исследований.. Несмотря на очевидные, успехи современной таксономии иглокожих, перед систематиками по-прежнему стоит много нерешенных, проблем. Одно из основных препятствий, которое подчас не позволяет достоверно гшявить филогенетическое родство тех или иных групп животных., заключается в возможной конвергенции многих признаков. ■

В этом отношении очень перспективен метод молекулярной гибридизации ДНК, поскольку конвергенция на уровне первичной структуры НИК практически отсутствует. С точки зрения систематики этот поп-ход интересен и тем, что позволяет сравнивать виды по очень большому количеству признаков - на несколько порядков больше, чем в обычной морфологической работе.. Вовлечение в анализ сколь угодно значительной доли генома также позволяет оперировать несоизмеримо большей выборкой .из генофонда популяции и одновременно дает возможность сократить, число обследованных индивидуумов, не искажая при этом истинной гюпуляиионной структуры. Кроме того, извлекая огромную информацию, которая содержится в ДНК, мы получаем количественную оценку дивергенции геномов и можем выявить не только родственные связи между, таксонами,: но и объективно определить ранг этих таксонов (РатнерД972; Медников,ГЗЯО).

• Дальнейшей сопоставление.дан'нмх по морфологии, эмбриологии, палеонтологии ,й.молекулярной ЙЖ-ЛНК гибридизаций позволяет сделать важные, выводы о соотношении эволюции генотипа и фенотипа, а также решить актуальные проблемы как макро-, так и микросистема тики:''

ЦЕЛЬ РАБОТЫ. В задачу настоящего исследования входило определение темпов дивергенции и изучение внутривидовой изменчивости уникальных последовательностей ЛИК морских ежвй'.йемвйства 51хоп-еу1осоп1;го11с)ае. Основная цель работы заключалась в изучении филогении и систематики этой гоуппн иглокожих по данным ДНК-ДНК гибридизации и сравнительной морфологии.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Подробно изучены Филогенетические . связи морских ежей семейства 31:гопеу1осеп1:гои(1ае." Впервые на основе геносИотематических исследований доказана конспецифичность ряда форм морских ежей данной группа. Показано, что результаты гибридизации ДНК сравниваемых видов морских ежой этого семейства в целом соответствуют уровню морфологической дивергенции. На основе молекулярно-генетичееких, морфологических и эмбриологических данных предлагается описание нового рода. Показано, что такой ком" плексный подход к таксономическим вопросам может с успехом применяться .в практике зоологической систематики.

ПРАКТИЧЕСКОЕ- ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Проведенные исследования указывают на перспективность широкого.использования данных сравнительного анализа первичной структуры ДНК для оценки .родственных, связей организмов, что в свою очередь позволяет решить актуальные проблемы таксономии. Таким образом, метод, молекулярной гибридизации ДНК может найти применение в практике различны* зоологических учреждений.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы райоты были представлены на VI Всесоюзном симпозиуме по игликоямм (Таллин, 1987), на II Всесоюзной конференции по проблемам эволюции (Москва, 1989), а также на совместном заседании кафедры зоологии беспозвоночных Биологического факультета МГУ и сектора эволюционной биохимии Межфакуль-. тетской проблемной научно-исследовательской лаборатории биоорга- . нической химии и молекулярной биологии им. А.Н.Белозерского,"'.МГУ. По теме диссертации опубликовано 3 работы и 2 сданы в печать. ' .

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит на иьбДОНИЯ, четырех глав, выводов и списка литературы, включающего : названий, в том числе 5".-работ иностранных авторов. Материал изложен на . страницах машинописного текста, содержит ¿Г таблиц и рисунков.

Глава I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ

Объектами исследования служили ра.злмчнне. видн морских ежей, собранные на морских биологических станциях АН СССР, а также полученные из различных источников, в том числе зарубежных,

.ДНК выделяли из фиксированных этанолом зрелых гонад самцов •или .лкофышзированной снврмн (Антонов м ир.,1971). С-.гектральшш параметры свидетельствовали о достаточной чистоте выделенных препаратов ДНК (А260/А230 » 2,2; А260/А280 >1,8).'

Фрагментирование высокопоии'мерной ДНК проводили ультразвуком а атмосфере азота или при .помощи виеокоскороитного гомогенизатора VirTis-БО. В последнем случае препарат аатинной ДНК растьоряли' в 10 мл 0,3 М натрий-ацетата; в раствор добавляли 20 мл глицерина (по весу) и ШШ фрагмеитировали в стеклянном стакане при 44000 otj/мин в течение.20 мин при охлаждении льдом, после.чого фрагменты "ДНК осаждали изояропанолом на. холоду. Последующее аналитическое центрифугирование в щелочном растворе (0,9 М NaCl, 0,1 М NaOH рН. 12,5-13) показало' высокую степень гомогенности полученных фрагментов ДНК по длине (350-400 нуклеотидов у рааных препаратов) . '

Фрагменты унттьноЯМиС репер наго вида получали в четыре этапа. Дважды отжигали ДНК.до Cot = 300, а затем дважды до Cot -10000, при этом отделяя термолабильную фракцию (45* - .70°С), т.е. "ископаемыеповторы". Таким образом получили "истинно" уникальные последовательности, которые метили.. посредством ДНК-полимеразноЙ реакции по оноообу "ншс-трансмншт" о некогашми модификациями

(Петров, Алешин,ШЗ). Очистку от продуктов реакции проводили ..н-з колонке о Sepliadex G-50, уравновешенной 0,12. М ФБ (фосфатным буфером); центрифугировали 4 мин, 3000 об/мин. После этого наноеилу на колонки с оксиапатитом и чистили 0,24 М ФВ, 8 М Мочевиной, I К . Naül pH 6,8. Затем отмывали от мочевины 0,12 М ФБ pH 6,8.

Продуцируемые ДНК-цолимеразой I инвентированные повторы отделяли хроматографией меченой ДНК на колонке с .ГАЛ (оксиапатитом),

уравновешенной 0,12 М ФБ pH 6,8 при 50°непосредственно после теп-

ö

ловой диссоциации в том же буфере (100 ,7-8 мин). Однонитчатук фракции уникальных последовательностей собирали в объеме 1-2 мл и диалиэовали против дистиллированной вод», после чего лиофилизиро-вали и растворяли в буфере для гибридизации (1' М NaCl, 0,01 М ФЕ и 0,001 М ЭЛТА' pH 6,8), '

о о

ДНК-ДНК гибридизацию проводили при 55 0, что на 15 ниие стандартной. Смесь меченых .■■фрагментов уникальной ДНК с фрагментами тотальной ДНК (1:1000) инкубировали до значения Cot = 10000/ кап и контрольные пробы для учота самореассоцишщи, содержащие [И3] ДЛИ репера и фрагменты ДНК Fi. col i.

Температурную элюцию ДНК проводили, используя термостатированные колонки с оксиапатитом (0,1 м.л). После инкубации пробь разбавляли в 0,2 мл 0,1.4 М ФБ и наносили на колонки при 45°. Од-нонитчатую ДНК элюмровали 0,14 М ФБ.(200 мкл -t 5 раз по 100 мкл), . а затем 0,12 М ФБ (7 раз по 100 мкл). Дальнейшую.элюцию ДНК . про-. водили 0,12 М ФБ, ступенчато поднимая температуру колонки от 4Е

о О

до 95 с интервалом в 5 . Элюаты собирали в сцинтилляционные флаконы. Измерение радиоактивности после кислотного .гидролиза ffiff проводили в диоксановом сцинтиллятрре ЖС-8 в сцинтилляционны> счетчикахJJelta-300 И Mark-3 ("Nuklear Chicago", США).

. Опыты по гибридизации проводили не менее, чем в.трех параллелях. -Процент нуклеотидннг; замен определяли по.раэиице температур

плавления в гомологичной и гетерологичной рьакшых, при ¡пом ошибка не превосходила 1%, а доля общих последовательностей ДНК •вычислялась с точностью до

• Математическая обработка иолучвнннх результатов осуществлялась по KITSCH и FITCH программам (Fitch,Margoliash,I967; Cava Hi -Sforza,Edwards,1967), а также методом ьагноровских расстояний (Farris,1972). ,

Для микросистематических исследований ьнйирали наиболее типичные формы морских ежей (подтверждающее определение было сделано З.И.Барановой).

Глава II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУPU

В этой главе изложены основные введения по филогении и систематике морских ежей отряда Echinoida, более подробно•рассматривается' таксономическая структура семейства Strongy locanlroUdae, обсуждаются морфологические признаки и систематическое положение видов, входящих в состав этой группы.

Кроме.того, дан обзор работ, посвященных исследованию структуры генома иглокожих, а также гонетичоским связям морских ежей по даниым-ДНК-ДНК.и ДНК-РНК гибридизации.

Глава III.• ШКРОСЙСШАТИКА МОРСКИХ ЕЖЕЙ. РОДА 5TR0NGYI0CEN-

TR0T1JS ПО ДАННЫМДНК-ДНК ГИБРИДИЗАЦИИ Виды рода Sírongylocentrotus. близки друг к другу по морфологии и физиологии, для; некоторых из них неоднократно отмечалось образование гибридных личинок . (Swan,IS53; .Мотавкин,Евдокимов, 1978).,- При этом; некоторое" сходство,, особенно хорошо выраженное у ряда видов, нередко сочетается с характерной для этих иглокожих морфологической и экологической изменчивостью, Что создает определенные трудности в разработке, системы' данной группы. До сих пор в научной литература обсуждается.вопрос о положении в системе морских ежей S.pulcholliis и 3. intermedins (Mor tensen, 1943d;. Дья-

конов, 1943,1949,1958; Jensen,1974; Баранова,1971; Левин,Бакулин, 1984 и др.), поэтому ми поставили задачу оценить генетическую общность этих организмов, используя метод ДНК-ДНК гибридизации.

Результаты нашей работы не выявили различий между уникальными последовательностями, выделенными из типичного экземпляра S.intermedias (N I в ТаблЛ) и ДНК других экземпляров S. intermedius и S.pulchellus. Наблюдаемые значения степени дивергенции близки ошибке эксперимента, равной 1%. В то же время при сопоставлении реперной ДНК и ДНК других видов Strongylocentrotidae оценка степени их дивергенции достоверна и достигает 7-12% нуклеотидных замен.

При сравнении уникальных Последовательностей ДНК наиболее типичного экземпляра S.pulchellus с ДНК других особей. S.pulchellus и S.intermedius значение степени дивергенции тоже колебалось * в очень небольших пределах и не превосходило 2,2% нуклеотидных замен. По литературным данным уровень внутривидового полиморфизма уникальных последовательностей ДНК у морских ежей S.purpuratus, S.droebachiensis, S. fraii.ciscanus и S.intermedius примерно одинаков и составляет 2-4$ нуклеотидных замен (Britten, et'aí ..,1978; Gruía et al.,1982). ^ . , ; : : '

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, .что степень дивергенции геномов S.intermedius и S.pulchellus не превосходит диапазона внутривидовых различий S.intermedius и по этому признаку виды между собой не различаются. Это говорит в пользу взглядов Левина и Бакулина (1984) о необходимости пересмотра таксономического статуса S.pulchellus как вида и сведения его названия в синонимию S.intermedius.

Таблица I. Оценка генетической близости 3. Шеппед1из и З.ри1-сЬеПиз и их сравнение с другими видами^орских ежей

Репер ЗлгйептекНив I Репер 5.ри1с11е11из I доля общих % нуклео- доля общих % нуклео-

Источник ДНК последова- тидных последова- тидных

тельностей замен тельностей замен

да, % э ДНК, %

S.pulchellus I 100 0

S.pulchellus 2 98 1,2

S.pulchellus 3 100 0(-1) 100 0(-0,6)

S. interrnedius I 100 0 "97 2,2

S.intermedius 2 98 1,3 . 99 1,0

S.interrnedius 1-3 98 1,5 99 0,7

S.pallidus 100 7,1 100 7,2

S.droebachiensis 100 7,7 96 8,2

S.nudus 100 9,5 94 9,4

H.pulcherrimus 100 11,1 99 11,7

S.franciscanus 96 . 11,6 93 12,5

Tr.gratilla 28 26,2

Par.lividus 62 28,0

До последнего времени в научной литературе обсуждаются вопро-

»

сы диагностики^морских ежей S.pallidus и S.droebachiensis и таксономический статус S.echinoides и S.sachalinicus. О систематическом положении этих морских ежей высказывались самые разные мнения (Баранова,1957,1977; Бажин,1989; Могtensen,1943; Vasse-ur,1951,1952; Swan,I9S2; Jensen,1974; Strathmann,I98I; Wader Wim et al.,1986 и др.), поэтому мы решили изучить их• генетические связи путем прямого сопоставления нукяеотидных последовательностей.'

»• ß •«•

При сравнении"реперной ДНК S.droebachiensls с гомологичным« последовательностями ДНК представителей рода Stron^ylocentrotus обнаружен примерно одинаковый уровень дивергенции. Наименьшие различия были найдены относительно уникальной ДНК G.pallitius нуклоотилных.'заней), что сравнимо с аналогичными данными для других близкородственных видов (Табл.8).

Это позволяет'нам сделать вывод, что различия в ДНК- S.palli-dus и S.droebaohieiisis соответствуют межвидовым и эти морские ежи представляют собой близкие, но несомненно . разные и генетичеоки хорошо обособленные виды,

Б другой серии опытов в качество реперных мы использовали уникальные последовательности ДНК S.sachalinicuä.. Полученные результаты не позволили обнаружить существенной разницы между ДНК этого морского ежа.и гомологичными последовательностями геномов »S.echinoides-й типичной формы S.pallidus, взятой с побережья Норвегии. Так,, степень дивергенции уникальной ДИК S.sachaHnicus и S.ochinoides составила 2,2% нуклвотияиых замен и 2,8% по сравнению с ДНК S pal Heins. В то же время для других представителей, рода Strongyloeeatrotus эти различия оказались значительно больше.

Таким образом,, принимая'во внимание вышеупомянутые данные по внутривидовой изменчивости уникальных последовательностей ДНК рода Strongylooentrotus, можно сдедать вывод о том, что отопенъ дивергенции геномов S.sachaHnicus, S.eohinoides и S.pallidus но превосходит известного для зтой группы уровня внутривидового полиморфизма. Следовательно, особи, которые согласно морфологическим описаниям являются S.sachalinicus и S.echinoides, . по нашим данным относятся к полиморфному виду S.pallidus, имеющему обширный циркумполярный ареал,: что поятверждает ранее высказанное мне-, ние Енсен (Jensen,1974) и других, авторов.

В Таблице 2 также представлены результат« гибридизации с. ЛИК

Таблица 2. Сравнение уникальной ДНК З.-заеЬаИпКтз и Э.йгоеЬаоМ-епз1з с ДНК других морских ежей . , . ,

Репер З.эасЬаПгпсиз Репер З.ск-оеЬаЫпегЫэ доля общих % нуклео- доля общих % нуклво-

Источник ДНК последова- тидных последова- тидных

тельностей замен тельностей замен

ДНК, % : ДНК, %

S.sachalinicus 100 0

S.echinoides 100 2,2

S.pallidus 100 2,8 90 5,0

S.droebachiensis 100 6,6 100 0

S.polyacanthus 100 7,2 92 . ■5,5

S.intermedius 87 5,8

S.purpuratus 100 7,7 90 7Д

S.nudus V ' 95 11,2 89 ' 10,5

A.crassispina 58 ; 21,0-

Tr.gratílla , 47 21,4

Sp.granularis 54 , 23,0

представителей других семейств (Echinofnetridae: Antocidaris cras-sispina; Toxopneustidae: Sphaer.echinus granularis, Tripneustes gratilla). При этом обнаружена значительно меньшая доля гомологичных последовательностей и отмечена максимальная степень их дивергенции, что указывает на корреляцию данных признаков с филогенетической удаленностью.сравниваемых таксонов (См. также ' Табл.1,/ где показаны данные гибридизации с представителем Parechinidao - ■ Paracentrotus lívidus). í '.'.;■•' :.-■*'.'■ ■ . ; ' д , ' ' 5;.;-

Полученные' в настоящей работе результаты, хотя и включают сравнение ,только с одним видом из семейства Echinometridae, ,;¡ дают

основание утверждать, что это несомненно самостоятельная группа морских ежей (Jensen,1981), т.к. обнаруженные различия намного превосходят межродовой уровень и вполне соответствуют генетическим расстояниям между семействами.

Полученные данные также показывают примерно одинаковый уровень дивергенции ДНК Sp.granularis и Tr.gratilla относительно гомологичных последовательностей ДНК реперной формы S.pallidus (Табл.2). Обнаруженные при этом значительные отличия близки к аналогичным данным для A.crassispina и свидетельствуют о том, что Sp.granularis не следует сближать с семейством Strongylocentrcti-dae только на основании его полипоровости (Clark,1912). ГЛАВА IY. МАКРОСИСТЕМАТИКА И ФИЛОГЕНИЯ МОРСКИХ ЕЖЕЙ СЕМЕЙСТВА .

STROHGYLOCEN7ROTIDAB Одним из основных систематических вопросов,который был решен г нами с помощью метода молекулярной гибридизации ДНК заключался в определении таксономического положения морского ежа Ps.depressus. Ранее этот вид включали в состав рода Strongylocentrotus (Clark, 1925), однако по мнению Мортенсена он не имеет ничего, общего с настоящими стронгилоцентротидами (кроме полипоровости) и по це--лому ряду других признаков должен входить в состав семейства То-xopneustidae (Mortensen,I943a,6). До последнего времени эта точка зрения была общепринятой,но согласно полученным нами результатам, Ps.depressus генетически сильно удален от этой группы.

Так при сравнении с уникальной ДНК Tripneustes grati11а было обнаружено 65^ гомологичных последовательностей,степень дивергенции которых составила 27,3$ нуклеотидных замен. Это сопоставимо с аналогичными данными,когда в качестве реперной использовалась ДНК представителей семейства Strongylocentrotidae, а в качестве неме-ченной брали ДНК Toxopneustidae, а также Echinometridae и Раге--chinidae.B то же время при гибридизации уникальной 'ДНК Ps.depressus с ДНК стронгилоцентротид наблюдался очень высокий процент то-

мологичных последовательностей, близкий к 100/,-му уровню,что указывает на тесную генетическую связь данного вида с этим семейством. Этот вывод также подтверждается данными элоктрофоретичео-кого анализа 15 различных белков (Matsuoka,1987),когда было показано ,что Ps.depressus обнаруживает большее сходство с морскими ежами S.intermedius,S.nudus и H.pulchorrimus, чем с представителями Toxopneustidae. Поэтому геном Ps„'\iepressus был исследован наравне с ДНК других представителей семейства Strongylocentroti-dae.

Для построения филограммы ceM.Strongylocentrotidae после проведения всех прямых и решшрокных реакций гибридизации мы получили полную матрицу фекетических расстояний, которые выражаются в процентах нуклеотидных замен (Табл.3). Как показал анализ полученных данных по этому признаку, семейство Strongylocentrotidae распадается на три группы, степень дивергенции между которыми составляет примерно 12-15$ нуклеотидных замен. В состав первой группы входят пять видов морских ежей: S.pallidus, S.droebachien- / sis, S.polyacanthus,S.intermedins, S.purpuratus. Степень дивергенции.между ними не превышает 7-8$. В состав второй группы входят три вида - S.nudus, S.franciscanus и Ps.depressus, причем между двумя первыми существует- более, тесная генетическая связь (6,7£), в то время кале уникальная ДНК Ps.depressus отличается от гомологичных.последовательностей ИНК S.riudus и S.franciscanus соответственно на 8,5 и 8,9$ нуклеотидных замен (Табл.3). И, наконец, третью группу морских ежей представляет только один вид H.pulcherrimus, который генетически значительно дивергировал от остальных представителей семейства Strongylocentrotidae.

¡Математическая обработка полученных . нами результатов осуществлялась тремя различными способами, в том числе и по "KITSCH"-'программе, которая предполагает равенство скоростей эволюции.уникальных последовательностей ДНК в разных филогенети-

Таблица 3. Матрица фонетических расстояний (% нуклеотидных эамен)

12 3 4 5 6 7 8 9

I.S.pallidus О 5.8 7.0 7. .2 7.0 II. .3 II.0 12.5 13.5

2.S.dr oebachiens i s 0 6.3 6. .7 7.1 10. ,3 12.1 12.5 14.5

3.S.polyacanthus 0 7, .8 7.9 12. .0 II.5 13.3 13.5

4.S.in-termedius 0 7.8 II. .6 II.3 12.0 14.2

5.S.purpuratus 0 12, .3 II.4 14.1 15.3

6.H.pulcherrimus 0 12.7 15.3 16.8

7.S.nudus 0 6.7 8.5

8.S. franciscanus 4 0 . 8.9

9.Ps .depressus 0

ческих линиях (т.е. принимается гипотеза молекулярных часов эволюции). При этом оказалось,что морские ежи данного семейства принадлежат к двум основным филогенетическим ветвям. К одной из них относится группа иглокожих в составо S.nudus, S.franciscanus и Ps.depressus, а к другой все остальные представители рода Stron-gylocentrotus и Hemicentrotus pulcherrimus (Рис.1).

Такая же картина наблюдается и в тех случаях, -когда расчеты велись методом вагнеровских расстояний (Farrls,IS72) ■ или по "FITCH''-программе (Рис.2,3). Эти способы обладают - рядом преимуществ, в том числе не требуют допущения равномерности темпов молекулярной эволюции. Но и здесь сохраняются основные черты топологии: структура этих двух деревьев,в основном, совпадает с топологией KITSCH -дерева, т.е.- совершенно очевидно,что виды семейства Strongylocentrotidae эволюционировали по двум главным направлениям. .

Морской еж Н.pulcherrimus на KITSCH и FITCH деревьях стоит

I', ►о

чг

iä

а 55

a t a -5

a

ч

N.

•т; г> Ч

ч»

•1

«г

S3

« Vi '3

*> {; .

ч

<

Ч)

<3

?

5. 2 ?

ts 3 С 1

ъ й

j t^»^- ^ ^ ^ ^

■3

54

f

. 3 «

>1 »i

^ ^

я

5

5<

К'

Ч) ^^

■ a с

Лч

>-5

Рис.1 KITSCH - дерево

Рис.2 FITCH - дерево:

Рис.3 Вагнеровское дерево

достаточно' обособленно и занимает положение сестринского таксона по'отношению к остальным видам данной филогенетической ветви (степень дивергенции составляет примерно 12% нуклеотидных замен). На вагнеровском дереве он находится внутри ветви и его обособленность подчеркивается только высокими темпами молекулярной эволюции уникальных последовательностей ДНК по сравнению с Jlffif близкородственных видов. •

Известно, что с точки зрения эволюционной таксономии горизонтальные связи, также как и вертикальные взаимоотношения между таксонами, являются важным критерием для определения места объекта в системе и присуждения'ему соответствующего ранга.

Следовательно, выявленная нами значительная генетическая дистанция, отражающая горизонтальные связи H.pulcherrimus по отношению к близкородственным видам, свидетельствует о самостоятельном статусе этого монотилического рода.

Относительно пяти представителей Strongylocentrotus , входя-. ших в эту филогенетическую ветвь, показано, что на всех трех фи-лограммах они по-разному отходят от общего ствола (ср.Рис.1,2 и 3). При этом следует отметить,что с классической точки зрения KITSCH - дерево наиболее точно отражает существующее морфологическое сходство^

Это в полной мере относится и к топологической структуре другой ветви, в которую входят морские ежи S.midus, S.franciscanus и Ps.depressus. Эта часть килограммы KITSCH -дерева оказалась топологически идентичной аналогичной структуре вагнеровского дерева. При этом S.nudus и S.franciscanus представляют собой сестринские таксоны.. Морской еж Ps.depressus первым отделился от общего с ними ствола и. дивергировал. от них примерно на 9$ нуклеотидных замен. По нашему мнению данное генетическое расстояние соответствует внутрвродовому уровню для этого семейства и позволяет объади-

нить все эти три вида в отдельный род.

На FITCH -дереве (Рис.2) S.nudus является сестринским таксоном по отношению к группе S.franciscanus - Ps.depressus, несмотря на то, что этот морской еж генетически ближе всего к S.franciscanus (степень дивергенции между ними составляет 6,4£ нуклеотиднпк замен), в то время как Ps.depressus занимает более продвинутое положение. Здесь мы встречаемся с ситуацией аналогичной только что рассмотренному случаю с H.pulcherrimus и поэтому более тесная связь между S.nudus и S.franciscanus представляется нам гораздо более существенной, чем топология этой ветви FITCH -дерева.

Согласно построенным нами филограммам, S.nudus, S.franciscanus и Ps.depressus следует выделить в отдельный род. Однако известно, что систематика учитывает не только степень родства, но и степень сходства. Поэтому для решения вопроса о целесообразности выделения нового рода и его видовом состава мы сочли необходимым обратиться к морфологг'геским и эмбриологическим данным, что составило следующую часть нашей работы.

Мортенсен, отстаивая свою точку зрения на систематическое положение. Ps.depressus в семействе Toxopneustidae (Morten-'■sen, 1943а,б), считал, что полипоровость этого ' рода. и полипоро-. вость представителей Strongylocentrotidae являются конвергентными

признаками. Поэтому он придавал особое значение структуре-створок >> .

глобиферных педицеллярий, форме спикул, наличию жаберных щелей и корзинкообразному строению личиночного скелета Ps.depressus.

Однако Мортенсен не учитывал, что у этого морского ежа, также как и у всех стронгилоцентротид, отсутствуют стебельковые железы в глобиферных. педицелляриях, характерные для представителей Toxopneustidae. Жаберные щели у Ps.depressus очень мелкие, что в ■ целом также не характерно для токсопнеусти'д. Имеется и ряд других морфологических отличий Ps.depressus, Которые прямо указывают ria

Рио; 4, Вторичные зубные пластинки морских ежей:

а - S.franciscanus; б,в - Ps.depressus, г. >- Tr.ventrico-sus, д - L.variegatus, e - Sp.granularis (I;+ каринальный отросток', 2 - латеральная часть): Масштаб (мкм):а,д в 800; б,г 500; .в - 1000. . ^i';' < :

весьма отдаленную связь этого вида с сеМ-ТохорпеизШае (Ма1зи-0ка,1935).

С целью уточнения принадлежности Рз.йергоззи5> к той или иной группе ми провели элоктронномикроскопичсский анализ вторичных зубных пластинок данного вида, а также представителей семвйстп 51гоп£у1осеп1:гоШа9 и ТохорпеизШае (Тг1рпеи^ез уепШсоэиэ, Ьу1вс1йп«5 уаг!ега1из, ЗрЪабгеЫппиз ггапи1аг1з). Наше исследование показало, что все виды сем.5*гопгу1осеп1:гоШап, включая АЛгагШз, имеют близкие по своей структуре вторичные зубные пластинки, четко отличающиеся от пластинок токсопнеустил. Для сравнения мы привели рисунок о электронномикроскопической фотографии зубных пластинок 5.1гапо1зсапиз (Рис.4а). Это типичная зубная пластинка, характерная для стронгилопонтротид. Основные морфологические отличия от токсопнеустштого типа заключаются в форме каринального отростка, а такжо в соотношении длин этого отростка к латеральной части пластинки..У стронгилоцентротид кари-йальний отросток обычно составляет 0,5 или чуть больше от длины латеральной стороны, в то время как длина каринального отростка у . изученных наш Тохорпеиэ и бае обычно Превышает ее (Рйс.4г ,д,е). .Результаты исследования морфологии зубных пластинок'2-х экземпляров Рз.бергевзиз свидетельствуют, что один из них По этому признаку им-чи явное сходство с сем.51гоп?у1осоп1гоШао (Рис.46), а зубные пластинки другого оказались промежуточными между стронги-лоцентротидным и токсопноустидним типами (Рис.4в). .-Для окончательного решения этого вопроса нужно.исследовать эубние пластинки представителей всех родов сом.ТохорпоизНбае и подробнее изучить Их внутривидовую изменчивость. В нашем распоряжении, .нет такого полного, материала, но уже эти. данные показывают, что по этому признаку Рз^ергбз$из ближе к 5(гопу:уДосеп^оШае, чем к ближайшему. "родственному виду . 5р..егапи1аг1з"(сем.Тохорпеиз1:1 -

dae,PHC.4a), как неоднократно объединял их Мортенсен.

. В качестве аргумента Мортенсен также приводил строение личиночного скелета Ps.depressus, имеющего типичную токсопнеустидную структуру. Мы считаем необходимым остановиться на этом подробнее, Taií как в пределах сравнительно небольшого семейства Strongylo-centrotidae встречаются разные типы строения скелета личинок и некоторые из них приближаются к корэинкообразному скелету плуте-усов токсопнеустид.

Анализируя структуру внутреннего скелета плутеусов I стадии (данные взяты из работ:Oka,1952; Strathmann,I9?9; Morten-sen,1943а; Крючкова,1987), мы предлагаем выделить три типа строения '(Рис .,5). К первому, типу относится большая часть представителей семейства: S.droebachiensis.S.pallidus, S.intermedius, S.pur-puratus и A.fragil is. Учитывая хорошо выраженное морфологическое сходство взрослых морских ежей этой группы с S.polyacanthus, можно предположить, что еще не описанная личинка данного вида скорее . всего будет иметь скелет именно такого строения (схема представлена на Рис.5а). Плутеусы этих видов имеют булавовидные дисталь-ные концы с небольшими шипиками. Пары посторальных и антеролате-ральных игл служат опорой для двух пар рук. Поперечные вентральные иглы очень короткие.

Ко второму Ttiny мы отнесли скелет плутеуса H.pujcherrímus • (Рис.56). Для него характерны такие же булавовидные базальные игг лы, прикасающиеся дистальными концами. Однако внутренние поперечные иглы, в отличие от.предыдущего типа, хорошо развиты и соприкасаются друг с другом (Oka,1952).

•Плутеусы I стадии S.nudus и S.frariciscanus мы отнесли к третьему типу (Рис.5в), который в значительно большей степени от-личавтоя от первого и второго, чем они.между собой. В первую очередь это касается структуры базальных игл, их дистальные концы

а 5

Рис. 5 Схемы скелетов плутеус'ов морских ежей I стадии:

а - S.pallidus, S.droebachiensis, S.intermedius, S.purpu-ratus, A.fragilis; d - H.pulcherrimus; в S.nudus, ■■ S. fralnciscanus; г - Ps.depressus. .

йагнутц, утолщены и несут крупные выросты, посредством которых они временно соединяются. Поперечные иглы также соединяются друг с другом, а к ним прикрепляются вторичные базаз1,ьные иглы, отсутствующие у всех остальных представителей семейства. • На .этой стадии они еще короткие и не соединяются друг с другом. Яарваль-ныа скелеты этих двух видов очень похожи на всех стадиях'развития. ÍStrathmann,I979). Кроме того, S.nudus и S.franciscanus обладают ems личиночными Педипелляриями, которые формируются у. плутеусов на.третьей стадии.

Теперь рассмотрим строение личинки Ps.depressus (Mortan-sen, 1943а; Oka,1952). Плутеус первой стадии этого морского ежа имеет скелет корзинообразной формы.(Ряс.5г.). Его базальные иглы срастаются яистальннми концами, образуя дугу с многочисленными шипикамк на внешней стороне. Внутренние поперечные иглы соединяются друг с.другом, вторичные базальные иглы хорошо развиты - они. раздваиваются, образуя внешнюю и внутреннюю ветви, Внешние выросты соединяются короткими апикальными ветвями базальных игл, " а внутренние соединяются друг с другом. Таким образом, получается простая корэинообразнаяг структура ("simple basket structure"). При этом видно,что наибольшее сходство с данной структурой обнаруживают скелеты плутеусов S.nudus и S.f ranci scanus (Ср.5в и 5г )-.

В качестве дополнительного признака мы исследовали .^соотноше-нип числа пар пор к диаметру скорлупы у 5.intermedins и S.nudus (Рис.6) и сравнили их с известными данными для некоторых стронги-лоцентротид (Roberts-et al,,1985).Это соотношение оказалось алло- . метрически идентичным у S.nudus я S.franciscanus и в то же время отличным от закономерностей развития амбулакров у S.droebachi-ensis, S.purpuratus и S.intermédius.

. Таким образом,-мы. можем сделать два основных вывода, . Во-первых, обобщая молекулярно-гёнетичоские и . морфологические данные,

-и-

гоо .....1 1 1 О —-Г" О 1 ч 1 ■ —

190 !Ш 4 О а 8 Л ' о О -

170 «г» о о »

160 <9 о в 1

150 • А л Л □ - » в «

140 130 ■ °д ю ' а п & 0 Л О а ы Ш о

120 •

, д

по - а 1» • о а Л ригрит^из 5.1и1ест»еНиз

100 3 «

1 ■

90 » • .

40 50 60 70 80 90

Рис..6 Аллометрическая зависимость количества пар, амбулакральных пор от диаметра панциря. : ' ,, / . . •

.прикопим к заключению, что Ps.depresstta является представителем семейства Strongylocentrotidae. На основе результатов ДНК-ДНК гибридизации этот вид следует объединить с S.nudus и S.francisca-lius в отдельный род. Но учитывая существование значительных морфологических различий, для Ps.depressus должен быть сохранен статус монотипического рода в сем.Strongylocentrotidae.

Во-вторых, если оценивать ту же совокупность данных по морфологии, эмбриологии, а также результатам сравнения геномов стронги-лоценгротил, указывающим на эволюционные связи внутри семейства, то становится понятным, что S.nudus и S. franciscanus не просто сходны между собой по целому ряду признаков, но и стоят достаточно обособленно от других представителей рода Strongylooentrotus. Подробный анализ структуры личиночного скелета плутеусов, а также данные ДНК гибридизации, до последнего времени практически не применявшиеся в систематике этой группы, показывают, что S.nudus и S.franciscanus необходимо выделить в самостоятельный таксон родового ранга. Описание нового рода Seraicentrotus приводится в работе.

Таким сбраэом, исходя из проанализированного .нами комплекса Признаков, мы предлагаем обновленный' список видов семейства Strongylocentrotidae:

"^trongyiocentrotus Brandt ,

1. S.droekachiensis (O.F.Muller)

2. S.pallidus (Sars)

3.- S..polyacarithus A.Agassiz

; 4.: S.intermedius (A.Agassi?),-'; 5. S.purpuratus (Stimpson)

Allocentrotus Mortensen ' . 6. A.fraeilis (Jackson)

Hemieonirotus Mortensen

7. H.pulchet't'imus (A.Agassiz) Semicentrotus Tatarenko et PoUaraus •8. Sem.francisöanus (A.Atjassiz) 9. Setn.nudus (A.Aeassiz) Pssudocentrotus Mortonsen _I0. Ps.depressus (A.Aeassiz) ВЫВОДЫ

1. Результаты ДНК-ДНК гибридизации свидетельствуют о конспе-цифичности морских ежей S.pnlcheilus И S.intermedius, что говорит й пользу взглядов Левина и Еакулина (1984) о необходимости пересмотра таксономического статуса S.pulchollus как вида и сведения его Названия в синонимию S.intermedius.

2. Данные по молекулярной гибридизации ДНК подтверждают существующее мнение (Jensen,1974; Бажин,1989) о том, что S.pallidus имеет обширный циркумполярный ареал, й ранее выделяемые в отдельные виды морские ежи S.sacha lin i cus и S.echinoídes являются' его дальневосточными формами.

3. Показано, что морской еж H.pulclierrimus генетически сильно отличается от всех Представителей рода Strongylocentrotus,4To подтверждает самостоятельный таксономический статус этого Моноти-

' пического {¡ода в coM.Strongylocentrotidae.

4. Лолекулярно-гонетичес'кие исследования, а также данные по морфология дают основание для пересмотра таксономического положения морского ежа Ps.depressus и переноса его из ceM.Toxopneusti-dae в ceM.Stroneylocerttrotidae с сохраненном родового статуса.

5. Согласно данным молекулярной гиоридиэации ДНК, морфологии и эмбриологии приводится описание нового рода в ceM.Sírongylo-centrotidae- Semi centro tus. В его состав входят морские ежи Sem.nudus и Sem.franciscanus, последний является типовым видом этого таксона.

Работы, опубликованные по теме диссертации: ■ I. Татаренко Д.Е., Полтараус А.Б. Генетическое сходство морских ежей Strongylocentrotus intermedius (A.Agassiz) и S.pulchel-Jus (A.Agassiz et Clark) по результатам сравнения их ДНК// Проблемы филогении и систематики иглокожих: Тез. докл. YI Веес.симп. по иглокожим.-Таллин.-1987.-с.89. '..•''

2. Татаренко Д.Е.', Полтараус А.Б. Генетическое единство морских ежеИ Strongylocentrotus intermedins и S.pulcliellus (Echino-idea.Strongylocentrotidae) //Зоол.ж.-1988.-т.67,Вып.5.-с.713-718.

3. Татаренко Д.Е., Полтараус А. Б. Эволюция .ДНК морского ежа Hemicentrptus puleherrimus' относительно ДНК близкородственных видов //Проблемы макроэволюции: Материалы II Всес. конф. по проблемам эволюции.-М.:Наука.-1988.-с.55-56.

4. Татаренко Д.Е.Полтараус А.Б. К вопросу о принадлежности морских ежей S.echinoides A.Agassiz ot Clark и S.sachalinicus Do-darlein к виду S.pallidas (Sars) и их генетические связи в роде Strongylocentrotus по данным сравнения геномов // Биология моря. -В печати.

5. Татаренко Д.Е., Полтараус А.Б. Принадлежность морского ежа Pseudocentrotus depressus к семейству Strongylocentrotidae й выделение в этой группе нового рода Stemicentrotus по.даннвм ДНК-ДНК гибридизации и сравнительной морфологии // Зоол.ж.-В печати. .

Подписано в печать 21,04.Sir. Формат 60<£Ч'/ц Тираж W Заказ ЫШ ' • Курское полиграфическое объединение