Эколого-генетические и эволюционные аспекты биоразнообразия животных

Челомина, Галина Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Эколого-генетические и эволюционные аспекты биоразнообразия животных
ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Эколого-генетические и эволюционные аспекты биоразнообразия животных"

На правах рукописи

Г Г и ОД

1 8 ?Г;

ЧЕЛОМИНА Галина Николаевна

ЭКОЛОГО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И ЭВОЛЮЦИОННЫЕ АСПЕКТЫ БИОРАЗНООБРАЗИЯ ЖИВОТНЫХ

03.00.16 - экология 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Владивосток - 2000

Работа выполнена в лаборатории эволюционной зоологии и генетики Биолого-почвенного института ДВО РАН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.А. Костенко

доктор биологических наук, профессор Л.Л. Соловенчук доктор биологических наук, А.Л. Дроздов

Ведущая организация: Тихоокеанский институт биоорганической

химии ДВО РАН

Защита состоится " ¿?3 " , 9е ^15 2000 г. в 9 часов на за-

седании диссертационного совета Д 064.58.01 при Дальневосточном государственном университете по адресу: 690000, г. Владивосток, ул. Мордовцева, 12, к. 139, факс: (4232) 310-193.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Дальневосточного государственного университета.

Автореферат разослан "_" _2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Т.А. Комарова

Е ом.

ОБЩАЯ ХАРАКТВ'ИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Изучение биологического разнообразия - одна из актуальных проблем классической экологии. Биоразнообразие является результатом тесного взаимодействия биосферы с физической оболочкой земли, каждый вид представляет собой итог естественно исторического развития всего органического мира. Биоразнообразие необходимо для сохранения функциональной структуры биосферы и составляющих ее экосистем, а также, в силу своей эстетической ценности, - для экологического здоровья человеческой популяции. Феномен видового богатства, или альфа-разнообразие, сообществ является одной из самых важных интегральных характеристик сообщества и экосистем (Уиттекер, 1980). На 17-ой ассамблее МСОП (Коста-Рика, 1988) было дано следующее определение биологического разнообразия: «Изменение и изменчивость всех живых организмов. Это включает генетическую изменчивость внутри видов и их популяций, изменчивость видов и их жизненных форм, разнообразие сообществ, взаимодействий и экологических процессов, с которыми они связаны». В конечном счете, биологическое разнообразие является генетическим разнообразием, а величина и характер этого разнообразия могут быть проверены на любых организмах и иерархических уровнях, от микро- до макроэволюционных. Сохранение же биоразнообразия, видимо, следует рассматривать, прежде всего, как сохранение генофонда биосферы.

Таким образом, генетические методы исследования являются неотъемлемой и важной частью современной экологии. «Генетика - сердцевина биологической науки, лишь в рамках генетики разнообразие жизненных форм и процессов может быть осмыслено как единое целое» (Айяла, 1987). Роль генетических методов в экологических и эволюционных исследованиях заметно усилилась с разработкой таких высоких технологий, как молекулярное клонирование и секвенирование последовательностей ДНК, полимеразная цепная реакция. Появилась уникальная возможность анализа микроэволюционных процессов в малых изолированных популяциях редких видов, находящихся под жестким антропогенным прессом. Сформировалась новая отрасль знаний - молекулярная экология, открывающая дополнительные перспективы и позволяющая получать более совершенную информацию о биоразнообразии. В совокупности с молекулярной филогенетикой молекулярная экология приближает к созданию наиболее естественной системы живых организмов, открывает перспективу историко-фаунистических реконструкций, способствуя пониманию путей и механизмов развития экосистем в целом. Такая возможность имеет особое значение, поскольку относится непосредственно к историческому звену системной триады экологии (история, структура, функция) (Красилов, 1992). Значимость эволюционного подхода в биологии, поддержанная многими видными учеными, афористически выражена Ф.Добржанским (1936): «все в биологии приобретает смысл лишь в свете эволюциожого учения».

Адаптация видов к среде их обитания занимает центральное место в теор биологической эволюции и рассматривается как движущая сила эволюционнс прогресса. С позиций современной синтетической теории эволюции адаптац трактуется как следствие отбора случайных мутаций. Обладая незначительна фенотипическим эффектом, они служат материалом для естественного отбор Отсюда следует, что крайне необходимо изучение генетических механизмовадаптац организма к окружающей среде, с целью выявления генетических факторов или систем, которые придают мелким мутациям таксономический вес и определя! эволюционный прогресс. При этом «самые сложные и самые запутанные груш наиболее привлекательны, т.к. они самым непосредственным образом ведут проблематику видо- и расообразования» (Ренш, 1934). Не менее важным являет изучение молекулярной (генетической) природы сальтационного видообразован (получившего в последнее время широкое признание), сопряженного с быстрь изменением именно видовых признаков, приводящих к репродуктивной изоляции. Б такой информации невозможно создание общепризнанного определения вида, а таю завершенной теории видообразования и биологической эволюции.

Цель и задачи исследования

В настоящей работе предпринята попытка исследования молекулярк генетических аспектов некоторых проблем биологического вида, касающихся е объема и разнообразия, становления, экологической адаптации и эволюции. Основн цель - изучение молекулярных основ биоразнообразия, то есть особенност структурной организации и эволюции эукариотического генома в целом и е отдельных компонентов, сопряженности молекулярных преобразований генома надмолекулярной изменчивостью и условиями существования видов. Для ее решен было выбрано несколько, с нашей точки зрения наиболее ярких, модельных систе каждая из которых призвана решать конкретные задачи.

Для достижения поставленной цели общие задачи работы конкретизировала следующим образом:

- исследование особенностей молекулярных преобразований генома в процес эволюционной адаптации животных к изменяющимся условиям существован на примере некоторых видов морских беспозвоночных, свободноживущих паразитических червей, лососевых рыб

- изучение характера микроэволюционных процессов в малых изолирована популяциях на примере редких и исчезающих видов животных (хищники), также широкоареальных охотнич>их видов птиц (пластинчатоклювые);

- выявление особенностей генетического разнообразия шире распространенных, гибридизуючух в природе таксонов и их фенотипическ гибридов (на примере домовой мыши и врановых птиц);

- проведение сравнительного молекулярно-генетического анализа особенност видообразования и эволюции эукариотического генома, а также возможност геносистематики в двух группах грызунов (высшие песчанки, лесные и полев! мыши), отличающихся уровнем экологической пластичности и характер! кариотипического становления и эволюции.

Научная новизна и теоретическое зючение работы

Представленные в диссертационной работе экспериментальные данные и теоретическое обобщение можно рассматривать как развитие нового научне направления - молекулярной экологии. Впервые в едином методическом блоке контрастных примерах ярких биологических явлений и с позиций системной теор эволюции проведены сравнительные исследования особенностей генетическс

разнообразия, а также инициирующих это разнообразие молекулярных преобразований эукариотического генома. Результаты имеют теоретическое значение в плане всестороннего изучения биоразнообразия и являются определенным вкладом в разработку современной концепции биологического вида, его границ, становления и эволюции. Полученные данные дополняют существующие представления о микроэволюционных процессах в гибридных и малых изолированных популяциях, об общих закономерностях эволюции на молекулярном уровне и ее взаимосвязи с экологической пластичностью видов, кариотипическими изменениями генома эукариот, соотношении темпов эволюционных преобразований по разным системам признаков, демонстрируют необходимость применениямолекулярно-генетическихисследований в решении конкретных таксономических задач и разработки корректной систематики.

Впервые проведено молекулярно-генетическое типирование и анализ молекулярной организации генома ряда видов, представляющих разные классы позвоночных и беспозвоночных; продемонстрированы диагностические возможности молекулярных маркеров. Обнаружен универсальный характер расщепления эндонуклеазами рестрикции геномной ДНК плоских и кольчатых червей. Существование данного феномена было положено в основу гипотезы о «спиральном» характере изменчивости ПДРФ яДНК в процессе эволюционного «старения» видов.

Раскрыты и дополнены молекулярные механизмы сальтационного и градуального видообразования в группах грызунов, отличающихся адаптивными возможностями, предложена возможная схема последовательности эволюционных преобразований при быстром хромосомном видообразовании узкоспециализированных видов. Разработана обобщающая схема молекулярной организации и эволюции сатДНК мышевидных грызунов.

Впервые получены экспериментальные данные о генетической изменчивости природных популяций двух редких видов хищников, занесенных МСОП вКрасную книгу (амурский тигр, дальневосточный леопард). Выявлены крупные геномные мутации, не связанные с видообразованием, у карликовьк форм двух видов лососевых рыб

Впервые описаны особенности генетического разнообразия на уровне макромолекулы ДНК гибридизующих в природе таксонов (серой и черной ворон, домовых мышей) и их фенотипических гибридов. Показано, что на российском Дальнем Востоке у домовых мышей помимо межподвидовой существует межвидовая гибридизация.

Практическое значение работы

Предложен новый методический подход к изучению организации нуклеотидных последовательностей в макромолекуле ДНК с помощью сравнительной характеристики кинетики реассоциации ДНК, фрагментированной до разныхмолекулярных весов.

Аргументы о целесообразности присвоения лесным и полевым мышам надродового статуса, а также вывода азиатских видов в самостоятельные таксоны подродового и родового рангов могут быть использованы при таксономической ревизии рода Ародетиэ.

Данные по генетической изменчивости редких видов являются первостепенно важными для оценки генетического статуса, выживаемости популяций и разработки адекватной стратегии восстановления единиц сохранения.

Результаты генетического и таксономического анализа грызунов, а также врановых птиц представляют практический интерес, поскольку все эти виды являются компонентами многих биогеоценозов и переносчиками инфекционных заболеваний человека и животных, вредителями сельского хозяйства.

Полученные в работе экспериментальные данные и основные выво/i диссертации могут лечь в основу курсов лекций для студентов биологичесю специальностей.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Процесс эволюционной адаптации видов (черви, лососевые рыбы, крупнь хищники) к изменениям среды обитания осуществляется посредством различнь молекулярных механизмов, детерминирующих как микро-, так и макромутащ генома.

2. Межвидовая и межподвидовая гибридизация (вороны, домовые мыши, крякв! инициируют увеличение генетического разнообразия природных популяци характер геномных преобразований гибридов зависит от степени дифференциал скрещивающихся форм: он дискретен в первом случае и континуален во втором.

3. В основе альтернативных типов видообразования, градуального широкоадаптированных лесных и полевых мышей и сальтационного у бол! специализированных высших песчанок, лежат принципиально разные механизм молекулярного преобразования генома в области высоких повторов.

4. Традиционная схема классификации лесных и полевых мышей не в полной ме| соответствует генетической дифференциации и требует ревизии на ба: дополненных генетическими исследованиями данных.

Апробация работы

Основные положения диссертации докладывались и обсу>едались на XIV и X Тихоокеанских научных конгрессах (Владивосток, 1981; Пекин, 1995), V Съез; Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им.Н.И. Вавилова (Москва, 1987 VII Всесоюзном совещании по грызунам (Свердловск, 1988), V, VI и IX Съезд; Всесоюзного терриологического общества (Москва, 1990; 1999; Минск, 199; Всесоюзной конференции «Эволюционные и генетические исследован! млекопитающих» (Владивосток, 1990), Международных симпозиумах «Современнь достижения в популяционной, эволюционной и экологической генетике» (Владивостс 1995; 1998), Международной конференции по грызунам (Марокко, 1997), Ежегоднс совещании терриологического общества Японии (Саппоро, 1997; Тояма, 2000), V Евр американском конгрессе по млекопитающим (Сантьяго де Компостелла, Испанн 1998), II Международном конгрессе по млекопитающим (Явяскюле, Финляндия, 199! на Международной конференции по биоразнообразию и динамике экосистем северной Евразии (Новосибирск, 2000), семинарах в лаборатории эволюционн( зоологии и генетики, в отделе эволюционной зоологии и семинарах i биоразнообразию БПИ ДВО РАН (1998, 2000).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 46 печатных работ.

Объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 425страницахи включает 29 таблиц и " рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, метод! исследования, трех глав, посвященным результатам исследований, заключен выводов и списка литературы, состоящего из 518 публикаций, из которых 3! иностранных.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования велись на 50 видах животных, включая 9 видов беспозвоночж и 41 - позвоночных (из которых 3 вида рыб, 13 видов птиц и 25 - млекопитающи Использованы как собственные сборы, так и сборы других сотрудников: А.С.БогданоЕ

С.Н.Борхсениуса, Н.Н.Варнавской, Ю.Н.Журавлева, И.В.Картавцевой, В.П.Кораблева, К.В.Коробицыной, А.П.Крюкова, С.В.Межжерина, М.В.Павленко, Л.Н.Спиридоновой, Х.Сузуки, К.Сучия, Л.В.Фрисман и Л.В.Якименко, за что автор им глубоко благодарен.

Выделение ДНК из свежих тканей позвоночных и морских ежей проводили стандартным фенольно-детергентным способом с обработкой препаратов проназой и РНК-азой, как описано (Маниатис и др., 1984). Для получения ДНК из фиксированных этанолом тканей использован специально разработанный метод (Антонов и др., 1971). ДНК свободноммвущих и паразитических червей выделяли го (Searcy, 1969).

Молекулярную гибридизацию фрагментов ДНК в растворе выполняли согласно (Britten, Kohne, 1967), с разделением 1- и 2-цепочечной ДНК на гидроксиаппатитных колонках.

Рестрикционный анализ ДНК проводили как описано (Маниатис и др., 1984), с разделением продуктов гидролиза в 0.7-1.2% агарозных, или 4-8% полиакриламидных гелях.

Блот-гибридизацию по методу Саузерна выполняли согласно описанию (Маниатис и др., 1984). Радиоактивные Р ДНК зонды получали ник-трансляцией (Протопопов, Калачиков, 1990), либо с помощью случайных граймеров.

RAPD-PCR анализ проводили как описано (Захаров, Челомина, Журавлев, 2000), с помощью 10-нуклеотидных праймеров («Operon», США), используя автоматический термальный циклер модели PJ2000 (Perkin Elmer), или Biometra UNOII (Германия) с температурным режимом по (Реунова и др., 1996). Подукты амплификации анализировали в 2% агарозных, или 4% полиакриламидньх гелях.

Продукты PCR, генерированные специфическими к участку гена цитохрома b мтДНК праймерами, секвенировали с Dye Primer Cycle набором (ABI) на автоматическом секвенаторе (модель 373 ABI) в Университете Хоккайдо (Япония). В первой PCR амплифицировали фрагмент длиной 1.1 тпн с помощью универсальных праймеров Кохера: L14724 и Н5915 (Kocher et al., 1989), во втрой PCR использовали укороченную версию универсального праймера L14724 и обратный праймер U-H15155 (Irwin et al., 1991).

Филогенетические реконструкции выполняли с помощью пакетов программ NTSYS и PHYLIP, используя невзвешенный парно-групповой метод с арифметическим усреднением UPGMA (Sneath, Sokal, 1973), метод ближайшего связывания NJ (Saitou, Nei, 1987), метод максимальной экономии и бутстрепа (для оценки значимости филогенетических рекострукций, в рамах 100 репликаций) (Felsenstein, 1985).

Фактическим материалом для диссертации послужили данные экспериментальных исследований, полученные автором самостоятельно, или совместно с сотрудниками руководимой группы Л.Н.Спиридоновой, С.М.Новиковой, а также коллегами Института цитологии и генетики СО РАН С.В.Ивановым и Университета Хоккайдо (Саппоро, Япония) Х.Сузуки, за что автор выражает им искреннюю признательность. Автор также благодарен всем сотрудникам лаборатории эволюционной зоологии и генетики, академику РАН Ю.Н.Журавлеву (БПИ), Е.А.Ляпуновой и пофессору Н.Н.Воронцову (ИБР РАН) за постоянный интерес к работе, критические замечания и полезные рекомендации.

3. ГЕНОМНЫЕ ПРЕОБРАЗОВАНИЯ ПРИ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ АДАПТАЦИИ

Согласно наиболее распространенной точке зрения адаптация - это морфофизиологические изменения особей отдельных популяций, возникающие при их взаимодействии с измененной средой и способствующее сохранению целостности вида. Адаптация популяции может происходить как на основе уже имеющегося генофонда (фенотипическая адаптация), так и за счет количественного и качественного изменения генофонда (генотипическая адаптация). Причем, любая адаптация есть приспособление к конкретным факторам среды, т.е. является по сути

экологической. Неспособность популяции к приобретению новых адаптаций измененной среде ведет к ее вымфанию.

Механизмы гено- и фенотипической адаптации могут действовать к. совместно, так и раздельно, но любое изменение в организме в конечном счет связано с какими-то преобразованиями, происходящими на молекулярном уровне. Г длительности адаптацию подразделяют на три типа: немедленную, когда изменень среды сопровождается почти мгновенной адаптивной реакцией; акклимацию акклиматизация, когда адаптация осуществляется в течение жизни индивидуума; эволюционную адаптацию - наиболее длительный процесс адаптации, «зависящий ( приобретения новой генетической информации, детерминирующей новь фенотипические признаки» (Хочачка, Сомеро, 1977). Адаптивная норма, направление на поддержание генетического гомеостаза популяций, включает широкий спею генетических отличий. Процесс адаптации и отбора тесно связан с возникновение мутаций, а уровень мутабельности является одним из основных адаптивных признаке вида.

3.1. Внутрипогуляционные отличия в структуре геномов у двух видов дальневосточных лососей

Яркий пример морфологической изменчивости в связи с адаптацией к разны условиям обитания среди особей одного вида представляют проходные лососевь рыбы. Кроме сезонных рас, популяций четных и нечетных лет в популяциях лососевь рыб часто встречаются так называемые карликовые формы. Эти формы рь отличаются от обычных размерами, соответственно в 10-15 раз меньшим весом ите! что всю жизнь проводят в пресной воде озера-нерестилища. Исследования дв; ведущих групп под руководством Ю.П.Алтухова и В.С.Кирпичникова показали, чт самцы карликов жилой формы резко отличаются повышенной гетерозиготносты Сравнение структуры геномов обычных и карликовых форм двух видов тихоокеансм лососей проведено нами с помощью метода молекулярной гибридизации ДНК собственной модификации (Vorob'ev, Kosyuk, 1974; Косюк, 1984).

В соответствии со ступенчатым характером реассоциации повторяющие! последовательности легко могут быть разделены на 4 фракции; 1- палиндромные высокоповторяющиеся, Cot<2x10>2; II-III - две дискретные фракции час-повторяющихся последовательностей, реассоциирующих в пределах Cot=2х10"2 2х10"1; IV—умеренно повторяющиеся, реассоциирующие в пределах Cot 101-7х11 (Косюк, Борхсениус, 1981). Для первых трех фракций относительные количества Д|-оказались постоянными. Наибольший интерес представляет фракция IV. В ее состэе четко выявляются внутрипопуляционные различия между обычными и карликовыи формами рыб, в то время как ни межпопуляционные различия у нерки, ни межвидовь различия нерки и мальмы не заметны (рис. 1). У обычных форм в пределах фракции I можно выделить три субфракции последовательносвй, повторяющихся не менее ЮС (а), около 100 (б) и около 10 раз (в). У карликовых форм во фракции IV заметны толы две субфракции (а1, б'). Создается впечатление, что субфракция б, составляющая нормальных рыб 10% генома, у карликовых (в') «выпадает», в то время как количеств материала субфракьуи а, также составляющей у нормальных рыб 10% генома, карликовых увеличивается до 20% (а'). Различия у двух исследованных видов рь имеют совершенно сходный характер. При реассоциации крупных фрагментов (2.5-3 тпн) становятся заметными различия между ДНК нерки и мальмы в области значен Cot 1-5х10"2, а различия между ДНК обычной и карликовой форм оказывают! статистически недостоверными.

Отметим, что различия в структурах геномов обычной и карликовой фор| относящиеся к умеренно повторяющимся последовательностям и затрагивающие

данном случае около 20% генома, не ведут к образованию новых видов. Обычная и карликовая формы и соответственно их геномы представляются двумя относительно устойчивыми состояниями единой системы, способными переходить друг в друга. Мы предполагаем, что геномы обеих форм содержат все варианты нукпеотидных последовательностей, и различие состоит лишь в том, что часть из них, составляющая фракцию умеренных повторов, гредставлена разным количеством копий.

Рисунок 1.

Кинетика реассоциац^и тотальной ДНК из молок рыб, фрагментированной до 300 пн. 1-3 -обычная, 4- карликовая формы нерки; 5- обычная, 6- карликовая формы мальмы. I-IV- фракции повторяющихся последовательностей нуклеотидов. Субфракции обычных (а, б, в) и карликовых (а', б') форм характеризуются следующими значениями Cot 05: а, а'- 2x10'; б, б'- 8x101; в- 5x102. По оси ординат - реассоциированная ДНК(%), абсцисс - значения Cot.

Независимо от того, является ли карликовая форма первичной или вторичной в эволюционном плане, геномные отличия этой формы от проходной по частотам повторяемости нукпеотидных последовательностей прямо указывают на регуляторную роль фракции IV. Эти последовательности, по-видимому, перемежаются с уникальными участками, непосредственно кодирующими полипептидные цепи, и в соответствии с существующими гипотезами (Britten, Davidson, 1968; Georgiev et al., 1974) могут быть вовлечены в регуляцию транскрипции. Альтернативный вариант регуляторной роли этих последовательностей, менее вероятный с нашей точки зрения, может состоять в том, что они прямо определяют дозы некоторых генов, подобно тому, как это происходит у рибосомных генов дрозофилы (Tartoff, 1975).

3.2. Геномные преобразования, сопровождающие переход к паразитичесюму

образу жизни

Примером крупных геномных преобразований, приводящих к возникновению новых видов, может быть адаптация свободно живущих форм к паразитическому образу жизни. Паразитизм возник на самых ранних этапах развития жизни на Земле,

вскоре после начала ее дифференциации. Являясь с биологической точки зрени прогрессивным явлением, как наиболее выгодный в энергетическом физиологическом аспектах способ существования живых организмов, он получи чрезвычайное распространение в природе. Паразитический образ жизни оказалс столь успешным в эволюции, что паразиты стали более многочисленны разнообразны, чем свободноинвущие организмы, а среди Metazoa, практически, нет н одного крупного таксона, в котором не было бы паразитов. Скачок с свободноживущего к паразитическому образу жизни совершили представители лип тех ветвей эволюции, «в которых сохранились циклы развития и пластичность обмен древних эукариот», а также «генетически унаследованная способность развития нескольких средах...», появилась «молекулярно-генетическая преадаптация» эндопаразитизму (Согрунов, 1987).

Анализ ПДРФ суммарной клеточной ДНК двух свободно живущих черве! дождевого червя Lumbriculus vartiegatus и турбеллярии Phagacata sibirica (Челомин. Пашкова, 1991) продемонстрировали «универсальный» характер расщеплена эндонуклеазами рестрикции часто повторяющейся ДНК обоих видов, т.е. при смен рестриктаз рестрикционные картины практически не изменялись. Данный феноме отличает указанные виды от всех изученных к настоящему времени представителе позвоночных, хотя диапазон видо- и нукпеазоспецифичности их геномов достатс^ велик. Максимальная оценка суммарного количества ДНК, выщепляемой различным рестриктазами, составила 15% для дождевого червя и более 80% - для турбелляри! что вполне сопоставимо с имеющимися по данной группе беспозвоночных данным (Moritz, Roth, 1976). Нет оснований для утверждения, что выявленные нам особенности структуры генома турбеллярии, т.е. универсальный характе расщепления ДНК эндонуклеазами рестрикции, являются молекулярно-генетическс преадаптацией к паразитизму, но потенциально такую возможность исключить нельзя

Результаты сравнительного анализа ПДРФ суммарной клеточной ДНК тре видов паразитических червей класса трематод: Calicoforon ijimai, Euritrerr pancreaticum и Isopararchis hypselobagri, для которых турбелярия являете филогенетическим предком, подтверждают данные других авторов о том, что перехс червей к паразитизму сопровождается избирательной элиминацией повторяющей! ДНК: максимальная оценка количества повторяющихся последовательностей геномах паразитов не превышала 5%, в то время как для их свободноживуще! филогенетического предка оно составила не менее 26%, и показывают, что мещ степенью паразитической специфичности (следовательно, и эволюционным возрасто» и уровнем ПДРФ клеточной ДНК существуют коррелятивные связи: наиболе полиморфными оказались повторы самого специализированного вида.

Уникальность обнаруженного нами свойства молекулярной организации геном червей побудила нас к более тщательному анализу собственных и литературнь данных ПДРФ яДНК животных. Обобщение этих данных позволило предположит гипотезу о «спиральном» характере изменения ПДРФ во времени. В рамках даннс гипотезы уровень ПДРФ яДНК в геномах как эволюционно молодых, так и старых вудс будет понижен, но с противоположным вектором (в смысле гомогенизации) эволюце повторяющихся элементов ДНК. Подобные рассуяадения приводят нас к вопросу, h является ли высокая степень гомогенизации часто повторяющих! последовательностей ДНК отражением эволюционного тупика - стабильности вида, их высокое содержание - значительным генетическим потенциалом, который може реализоваться (и реализуется) при резких изменениях условий существования? какой то мере эти предположения подтверждаются данными ПДРФ ДНК китообразнь (Arnason et al., 1984).

Сравнивая столь различные примеры адаптации видов у червей и лососей, м

обнаруживаем, что в обоих случаях организмы адаптировались к жизни в различных средах. Главное разлитичие в том, что крупные мутации, сопровождающиеся видообразованием, затрагивают разные по частотам повторяемости последовательности ДНК, в то время как для вида эти мутации локализованы преимущественно в определенной геномной фракции.

3.3. Молекулярные и надмолекулярные изменения в связи с условиями существования видов (морские беспозвоночные)

Для двух близких видов морских ежей установлен параллелизм между теплоустойчивостью ДНП и мышечной альдолазы, а также соответствие выявленных различий отличиям в условиж существования этих видов.

3.4. Особенности генетической изменчивости и таксономическая доагностика

редких и ценных видов

Одним из важных компонентов биоразнообразия, находящимся под угрозой вымирания, являются редкие и промысловые виды, подвергающиеся наиболее жесткому антропогенному прессу. Вымирание видов - одно из наиболее ярко выраженных эволюционных явлений, характеризующее некогерентные фазы эволюции жизни, а также период антропогенных кризисов наших дней. Считается, что в настоящее время число видов животных составляет всего 1% от всех ранее живших на Земле. По некоторым оценкам за два десятилетия, предшествующих 2000 году, исчезло от 0.5 до 2 млн видов, т.е. 15-20% от их общего числа. По мнению некоторых авторов сейчас мы переживаем время первого массового вымирания видов с конца Мелового периода, тысячи видов животных и растений требуют срочной охраны.

Неустойчивость среды обитания чревата не только массовыми вымираниями видов. Для многих форм появляется возможность более полной реализации их потенций, результатом чего может быть слияние видов путем гибридизации. Гибридизация, интрогрессия и видообразование - примеры естественного и динамичного эволюционного процесса, который оказывает большое влияние на организацию и распределение генетического разнообразия. Естественная мех«идовая гибридизация, в том числе индуцированная интродукцией видов в ареалы родственных им форм, представляет реальную угрозу генофонду, зачастую вызывая необратимые последствия, когда один вид «поглощается» другим.

3.4.1. Сравнительный RAPD-PCR анализ генетического разнообразия природных популяций дальневосточного леопарда и амурского тигра

До настоящего времени в Приморском и Хабаровском краях российсмэго Дальнего Востока сохранился участок девственного леса, по территории равный Италии. В мировом масштабе это уникальное явление: лишь в северной тайге и тропических лесах встречаются участки леса, сравнимые по площади с данной территорией. Регион удивительно богат видовым разнообразием, включая многие эндемичные виды, сохранившиеся благодаря тому, что льды ледникового периода оставили нетронутой часть территории. В этом уголке уникальной природы обитают два представителя семейства кошачьих, существование которых находится под реальной угрозой исчезновения: амурский тигр Panthera tigris altaica и дальневосточный леопард P.pardus oríentalis. Последний считается наиболее уязвимым: его популяция состоит не более, чем из 30 особей, ареал обитания сократился до небольшого участка Южного Приморья, а в зоопарках мира число чистокровных особей ведется на единицы. По сравнению с ним амурский тигр более благополучен: в последние годы численность его популяции увеличилась примерно до

400-500 особей, несколько расширился ареал, он содержится практически во все: зоопарках мира.

Нами получены первые в мировой практике данные сравнительного анализ; генетической изменчивости природных поггуляций амурского тигра и дальневосточной леопарда. Ограниченность материала обусловлена его уникальностью i малодоступностью. До нас в широкомасштабных исследованиях генетическоп разнообразия P.pardus, как представители дальневосточного подвида, использовалис животные из зоопарков, часто имеющие неясное происхождение. Аналогична ситуаци! с амурским тифом: сведения о генетическом разнообразии его природнойпопуляции i литературе пока отсутствуют. Вместе с тем, оценка генетической изменчивости малы: изолированных популяций имеет особо важное значение при разработке адекватны: стратегий сохранения редких видов, т.к. для них велика угроза вырождения i результате инбридинга. Такие популяции характеризуются пониженной генетическо! изменчивостью, что существенно ограничивает их адаптивный потенциал. Они боле< чувствительны к демографическим изменениям, способным вызвать эффек «бутылочного горлышка», когда восстановление численности после ее резкоп снижения ведет к генетической однородности. В случае приспособления к тако! ситуации малые популяции подвергаются еще большему риску при появлени! реальной возможности вливания новых генов (Chepko-Sade, Halpin, 1987; O'Brien 1984).

Вопреки предположениям об относительном генетическом благополучш амурского тигра, базирующимся на данных восстановления численности, уровень еп генетического разнообразия оказался ниже такового для дальневосточного леопарда явно находящегося под угрозой исчезновения: D=0.069; Р=23% и D=0.141; Р=37°/с соответственно. Уровень генетической дифференциации между тигром и леопардог существенно выше средних значений внутривидовой изменчивости: D=0.370; и: дивергенция с дальневосточным лесным котом (род Felis) достоверно превышав межвидовые генетические дистанцш (Chelomina et al., 2000).

Результаты о более низком генетическом разнообразии тигра соответствую данным других генетических исследований Felidae, подтверждают предположение i нежизнеспособности тигров в так называемых блоках его сохранения в рамка: долговременной перспективы и ассоциируются с эффектом «бутылочного горлышка (Kitchener, 1999). Существует предположение, что демографическую катастрофу wpt пережили почти одновременно с гепардом (около 10 000 лет назад), и имеют с ни! примерно одинаково тяжелые последствия. Очевидно, это в полной мере справедлив' и для дальневосточного подвида.

Таким образом, популяция амурского тигра остается еще крайне уязвимо вследствие генетической обедненности по причине прохождения через «бутылочно! горлышко», а постановка вопроса о его выводе из категории №1 Красной книги MCOI преждевременна. Генетический потенциал дальневосточного леопарда, как и вида целом, выше, но для него первостепенную угрозу, вероятно, составляет физическо истребление из-за браконьерства.

3.4.2. Подвидовая диагностика и оценка генетического полиморфизма дальневосточного леопарда из зоопарка и природной популяции

С помощью RAPD-PCR анализа проведено сравнение дальневосточного персидского подвидов леопарда, а также особей дальневосточного подвида и природы и зоопарка (рис. 2) (Chelomina, 1998; Челомина и др., 1999). Выявлен! праймеры, маркирующие подвиды леопарда и способные отличать природных коше данного вида от содержащихся в неволе, а также их различные селекционные лини1 Анализ результатов с помощью аналитических программ (рис. 3) подтверждав

высокую дивергенциацию родов Felis и Panthera, а также четко подразделяет всех изучаемых леопардов на три фило- и фенетические группы: 1- ДВ леопарды из природной популяции, 2- персидские леопарды и 3- ДВ леопарды из зоопарка. Самые высокие значения генетических дистанций (D=0.274) выявлены для дальневосточного леопарда из природы с персидским подвидом. Уровень генетических отличий персидского подвида с дальневосточным из зоопарка оказался значительно ниже (D=0.108) этих значений, а также дивергенции ДВ подвида из природы и зоопарка (D=0.220). Использованные в работе экземпляры P.p.orientalis южного Приморья оказались генетически более разнообразными, чем любая другая пара кошек этого подвида из зоопарка, а также селекционных линий персидского подвида, что (при соблюдении соответствующих природоохранных мероприятий) дает повод для более оптимистической оценки как жизнеспособности, так и прогноза выживаемости данной

ОРВ-19 1 2346789 ЮМ 1 23456789 ЮМ ОРА-20

Рисунок 2

RAPD-PCR-спектры леопардов из зоопарка (1-7) и природной популяции (8,9) (1-5,8,9-дальневосточный леопард, 6,7- персидский леопард, Ю-дикий лесной кот). М - маркер молекулярного веса.

природной популяции. Что касается экземпляров P.p.orientalis, содержащихся в зоопарке, здесь затрагиваются два аспекта: степень генетического разнообразия и происхомедение. Значительная генетическая близость между собой кошек зоопарка очевидна и может быть следствием генетической обедненности, практически всегда сопутствующей разведению животных в неволе. Интересно, что оценки генетического разнообразия природной популяции тигра практически совпали с таковыми для леопардов из зоопарка. Последние могут иметь как гибридное происхождение, так и принадлежность к другому подвиду Дальнего Востока. Это обстоятельство необходимо учитывать при реинтродукции видов в природу в восстановительных программах. Так или иначе, наша работа может считаться частью программы сохранения P.pardus orientalis и P.tigris altaica. Их присутствие в природе, помимо несомненной генетической уникальности, чрезвычайно важно и потому, что, находясь на вершине пищевой цепи, эти хищники влияют на целостность всего биологического сообщества.

MSP

UPGMA

6,7

1-5

8,9 10

ф -персидским подвид

0 -дальневосточньй подвид из зоопарка

О -дальневосточньй подвид из природы

" -лесной кот

Рисунок 3

Дендрограммы генетического сходства и филогенетических связей леопардов п< данным RAPD-PCR анализа. В квадратах указаны значения бутстрепа в рамках 10( репликаций.

3.4.3. RAPD-PCR анализ генетического разнообразия и филогенетических связей трех видов птиц рода Anas (Anseriformes)

Известно, что около 10% видов орнитофауны способно гибридизовать и дават жизнеспособное потомство. В частности, только для пластинчатоклювых Anseriforme известно 78 вариантов межвидовых скрещиваний. Ярким примером быстрой перемешивания генных пулов является скрещивание кряквы Anas platyrhynchos ■ американской A.rupripes и австралийской A.superciliosa черными утками. Последстви такой гибридизации могут быть весьма впечатляющими: 50% смешанных популяци! уток Новой Зеландии (куда кряква была интродуцирована в прошлом веке) составляю гибриды и менее 5% - фенотипически черные утки (Панов, 1993). На российски Дальнем Востоке в последние десятилетия наблюдается расширение ареала черно! кряквы в более северные территории, где обитает близкородственный ей вид ■ обыкновенная кряква. Движение это вызвано нарушениями мест обитания по причин! усиливающегося антропогенного пресса и глобальных климатических изменений. Ест сведения, что в местах перекрывания ареалов этих двух видов встречаютс фенотипические гибриды Anas platyrhynchos х A.poecilorhyncha. Тем не менее количественные оценки гибридизации между восточноазиатскими кряквами и черным! кряквами не даны. Отсутствуют и данные генетических исследований.

С целью изучения филогенетических связей и возможных свидетельст межвидовой гибридизации птиц, был проведен RAPD-PCR анализ (рис. 4 особенностей генетического разнообразия кряквы A.platyrhynchos, черной крякв!

А.роесИогЬупсЬа и серой утки (полукряквы) А.з^ерега (1Моу1коуа, СЬе1огшпа, 2Иигау1еу, 2000). Если принять во внимание некоторые особенности экологии и поведения крякв, и, в частности, тот факт, что самки всегда возвращаются в места своего происхождения в сопровождении самцов, с которыми они встретились на зимовках, а моногамия самцов носит сезонный характер, становится очевидным, что основная роль в индуцировании генетического разнообразия и эволюционных преобразований ядерного генома крякв может принадлежать именно самцам. Это означает, что у этих птиц исследование изменчивости яДНК по сравнению с таковой митохондриального генома может быть более перспективно для выявления общего уровня генетического разнообразия популяций. С другой стороны, дифференциация популяций по ядерным маркерам может быть ниже, чем по митохондриальным по причине постоянного перемешивания генных пулов ядра.

ОРС-02

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 М

Рисунок 4

RAPD-PCR спектры кряквы (1-14), серой утки (15-17) и черной кряквы (18-21). М -маркер молекулярного веса.

Средние значения внутривидовых генетических дистанций и полиморфизма широко варьировали: от D=0.280, Р= 44% у A.strepera до D=0.293, Р= 81% у A.platyrhynchos и D=0.367, Р= 85% у A.poecilorhyncha. Межвидовое сравнение показало, что наиболее дивергировавшей среди птиц является полукряква: ее дистанции с кряквой и черной кряквой составили 0.499 и 0.650, соответственно. Эти значения вполне сопоставимы с теми, что были получены нами при анализе филогенетических связей 8 видов отряда Anseriformes (Chelomina et al., 1998), а также другими авторами, исследовавшими мтДНК уток (Johnson, Sorenson, 1998). Средние значения внутривидовых генетических дистанций черной кряквы оказались чуть ниже оценок ее дивергенции с кряквой (D=0.367 по сравнению с D=0.396). Анализ характера распределения внутривидовых генетических дистанций, а также фено- и филогенетических построений (рис.5, 6) указали на генетическую обособленность полукряквы и отсутствие четких генетических границ между двумя другими видами. Можно предложить два альтернативных объяснения полученным результатам: интрогрессивной гибридизацией кряква х черная кряква и недавним парафилетическим происхождением крякв. Если справедливо первое, мы вправе предполагать, что в исследуемой части ареала кряквы может развиться сценарий, аналогичный описанному для конспецифических форм из Северной Америки, Австралии и Новой Зеландии, приводящий к исчезновению вида, гибридизующего с кряквой. Согласно альтернативному варианту (имеющему поддержку в выводах авторов,

анализировавших особенности изменчивости североамериканской кряквы и черно! утки) кряква парафилетична по отношению к черной крякве, поэтому филогенетически реконструкции могут объединять разные виды в

иРвМА

Рисунок 5

Дендрограмма генетического сходстава уток (1к-22к - кряква, 23-25 рк - серая утка, 26 30 сИк - черная кряква), построенное 1!РСМА методом по данным ЯДРО-РСИ анализа

виды

роес|1огЬупсЬа+р1а1угЬупсЬа р1а1угЬупс11оз+51герега р^угИупсИоэ 5иерега+роес11огЬупсЬа роесМогЬупсЬа э^ерега О

Рисунок 6

Распределение попарных генетических дистанций трех видов уок. один филум, если оперативной единицей является индивидуум. В таком случае можно предполагать, что указанные особенности формообразования крякв и их эволюционная молодость могут быть генетическими предпосылками для межвидовой гифидизации.

4. ОСОБЕННОСТИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ШИРОКОАРЕ^ЛЬНЫХ ГИБРИДИЗУЮЩИХ В ПРИРОДЕ ТАКСОНОВ И ИХ ФЕНОТИ1ИЧЕСКИХ ГИБРИДОВ

Многие биологи-эволюционисты рассматривают гибридные зоны как природные лаборатории для изучения генетических и экологических взаимодействий между дифференцированными популяциями. Понимание причин и последствий этих взаимодействий дает неоценимый вклад в область важнейших проблем эволюционной биологии. Некоторые авторы считают, что ее влияние ничтожно мало - на уровне «эволюционного шума», другие придают ей большое значение, связывая непосредственным образом с повышением генетической изменчивости и приобретением у популяций новых адаптаций. Феномен гибридизации порождает по крайней-мере два круга проблем: связанные с вопросами номенклатуры и классификации, а также с раскрытием закономерностей микроэволюции. Причины этого феномена не могут быть понятыми без детального анализа микроэволюционных процессов, происходящих на уровне молекулярной организации генома.

4.1 Особенности молекулярной организации генома и генетической изменчивости врановых птиц

С точки зрения экологии врановые птицы Западно-Сибирской равнины четко подразделяются на две группы: связанные с лесными экосистемами и с открытыми пространствами. Последняя, куда входит серая и черная вороны, характеризуются склонностью к синантропизации и отсутствием четкого подразделения трофических и топических ниш, что делает этот экологический комплекс достаточно своеобразным и обособленным. Являясь обычными по всей палеаркгике, серая и черная вороны остаются одним из величайших таксономических камней преткновения. Одни авторы считают их разными биологическими видами, другие придерживаются точки зрения их конспецифичности. Среди многих видов эти птицы выделяются уникальностью распространения: в центре ареал серой вороны, по краям - черной. В местах перекрывания ареалов (известно 4 таких участка) серая и черная вороны гибридизуют, образуя гибридные зоны (Блинов, 1998; Madge, 2000).

4.1.1 .Организация генома врановых

По количеству видов птицы являются наиболее многочисленным после рыб классом позвоночных. Тем не менее, структура их геномов на молекулярном уровне изучена хуже, чем у представителей других классов. Нами проведен анализ ПДРФ суммарной яДНК серой Corvus cornix, черной С.согопе ворон и их фенотипических гибридов из зоны гибридизации в Западной Сибири, а также родительских форм из отдаленных популяций, где их гибридизация исключена (серая ворона из Подмосковья, черная - Дальнего Востока). Для сравнения использовали два других вида врановых: большеклювую ворону Coivus macrorhynchos - дальнего филогенетического родственника, хорошо отличимого на морфологическом, этологическом и экологическом уровнях, и сороку Pica pica, представляющую отдельный, филогенетически более древний род врановых (Jollie, 1978).

Полученные данные (Chelomina et al., 1991; Крюков, Уфыркина, Челомина, 1992) подтверждают следующие особенности организации генома птиц: 1- наличие двух классов нуклеотидных последовательностей с двукратным отличием частоты повторяемости; 2- определенное соотношение количества повторов в разных

кинетических классах (1:1, или 1:1.5-2), а также показывают, что 1- картины рестрикци! нукпеазо- и таксоноспецифичны; 2- выявленные последовательности повторяющейс ДНК организованы различным способом, одна из фракций представлена классически! тандемом, внутренняя иерархия которого аналогична описанной для сатДНК цыпленк; (ОапсПеи е1 а1., 1984); 3- уровень межродовых отличий, а также между «хорошими видами внутри рода (серая и черная вороны по сравнению с большеклювой) ДН1 сопоставим с таковым для других животных; 4- различия между серой и черно! воронами ограничиваются незначительными количественными вариациями, что таюм отмечалось для некоторых близкородственных видов млекопитающих; 5- гибридны формы имеют те же рестрикционные картины ДНК, что их родители, но отличаются п; вариациям количественного содержания нуклеазоспецифичных повторов.

В целом, результаты подтверждают основные принципы организации геном; птиц, а также близкое генетическое родство серой и черной ворон, указывают н; повышенную изменчивость количества нукпеазо-специфичных повторов в гибридны геномах, коррелирующую с широко известным фенотипическим разнообразие! гибридов.

4.1.2. Особенности ПДРФ чхтоповторяющейся ДНК ворон

Наличие легко идентифицируемого сателлитного компонента в геномах воро1 (см. выше) открывало перспективу получения молекулярного зонда для тестировани степени дивергенции видов и гибридных форм по сатДНК - общепризнанном молекулярному маркеру в эволюционных исследованиях. В этой связи для изучени организации часто повторяющейся ДНК в геномах птиц семейства врановых бьи использован дополнительнный набор рестриктаз. Результаты показали, что степен сходства картин рестрикции суммарной яДНК ворон коррелирует с филогенетическим; отношениями внутри Согас1ае: сходные профили разделения продуктов гидролиз яДНК нуклеазами рестрикции наблюдается у близкородственных видов (серой черной вороны), а существенные отличия от них - у более далекого вид (большеклювой вороны).

Метод анализа ПДРФ яДНК в сочетании с блот-гибридизацией позволи. обнаружить гетерогенность частоповторяющейся яДНК ворон (Челомина и др., 1995 (рис. 8). Показано, что выявленное семейство повторов содержит регулярные сайт! рестрикции для Мэр!, А1и1 и ВвиРЛ эндонуклеаз, имеет тандемную организацию кратный 210 пн размер рестрикционых фрагментов. Характеризуемая фракци повторов обладает определенной степенью консерватизма, так как проявляэт высокун степень сходства у обособленных далеко дивергировавших видов (большекпюва ворона по сравнению с серой и черной воронами). Остальные повторы, Н( гибридизуюцуеся с молекулярным зондом из выявленного нами семейства характеризуются наличием как эволюционно мобильных (РуиП, ВатН1), так I консервативных (ЕсоЯ1, НтсНИ) сайтов рестрикции и, вероятно, отсутствиемтандемно организации.

Сравнительный анализ результатов блот-гибридизации данного семейств, повторов обнаружил также межвидовые различия яДНК исследуемых птиц, которы можно квалифицировать как количественные (интенсивность сигнала гибридизации так и качественные (мультимерность рестрикционных фрагментов). Перво< подразумевает видоспецифичность содержания каждой из Мэр!, А1и1 и ВэиР последовательностей. Второе, т.е. более выраженная «лестница» Мэр! фрагментов геноме черной вороны по сравнению не только с большеклювой, но и серой вороной делает целесообразным использование Мэр1 зонда яДНК серой вороны дл генетического анализа отличающихся фенотипически особей из зоны гибридиза^ С.согтх и С.согопе.

При сравнении видоспецифических особенностей ПДРФ тандемных частоповторяющихся ДНК птиц, изученных в настоящей работе, а также ранее описанных повторов млекопитающих на примере BspR-повторов Carnivora, Canidae (Иванов и др., 1991) можно выделить следующие закономерности: как в случае Corvidae, так и у Canidae при межвидовых сравнениях легко регистрируются количественные вариации в содержании повторов. Различия количественных соотношений между рестрикционными полосами могут маркировать отдельные виды, находящиеся в близком родстве, как это видно на примере C.cornix и С.согопе. Это свидетельствует об амплификационных событиях, имевших место в ходе дивергенции близкородственных видов от общего предо.

Alul BsuRI Pstl Msp1 Alul BsuRI Pstl Msp1 Alu! BsuRI Pst! Msp1

Рисунок 8.

Блот-гибридизация гидролизованной рестриктазами суммарной ДНК ворон с Р32 Мэр! фрагменом серой вороны (а, б, в - гидролизаты суммарной ДНК серой, черной и большекпювой вороны, соответственно).

Единственное качественное отличие, выявленное нами при сравнении повторов C.cornix и С.согопе, выражается в большей протяженности мультимерного Mspl профиля у С.согопе. Подобные рестрикционнье профили выявляются также при сравнении видов Canidae и, как предполагается, отражают многоэтапный процесс эволюции с участием механизмов селективной амплификации (Иванов и др., 19916; Сосновцев и др., 1993). Интересно, что подобный молекулярный механизм был задействован, по-видимому, и в ходе дивергенции близких видов ворон.

В целом же данные, полученные на представителях двух классов позвоночных -птиц и млекопитающих, - подтверждают представления о видоспецифическом характере эволюции повторяющейся ДНК, типичных для эукариотического генома, и позволяют выявить наиболее общие механизмы эволюции повторов и, следовательно, - эволюции генома эукариот.

4.1.3. Молекулярная филогения рДНК ворон

Повторяющаяся последовательность рДНК птиц, подобно другим животным, состоит из 28S, 18S и 5.8S генов, двух внутренних транскрибируемых спейсеров, ITS-1 и ITS-2 и двух внешних: ETS (транскрибируемого) и NTS (нетранскрибируемого), фланкируещих соответственно 18S и 28S кодирующие области. В отличие от консервативных кодирующих областей спейсерные участки достаточно вариабельны, поэтому анализ ПДРФ ядерной рДНК широко применяется для установления генетического родства и филогенетических связей таксонов видового или подвидового

рангов. Доказано, что филогенетические реконструкции таксонов, базирующиеся нг данных ПДРФ ядерной рДНК, не требуют больших выборок, а внутригеномна! гетерогенность рДНК находится в пропорциональной зависимости от размерг популяции, которую представляет конкретная особь (Suzuki et al., 1990; 1994).

Проведена блот-гибридизация яДНК серой, черной и большеклювой ворон гидролизованной 12 рестриктазами с Р мечеными 18S, INT и 28S рДНК зондам! (Chelomina et al., 2000). Основываясь на полученных данных, а также рестрикционно! карте рДНК курицы, как стандарте, была сконструирована рестрикционная карта дл! рДНК врановых птиц. Согласно результатам, несмотря на некоторые размерные вариации в спейсерных областях, распределение рестрикционных сайтов в рДН1-серой и черной ворон одинаково. Большеклювая ворона отличается от них не толькс инсерцией, но также двумя заменами. Размер повторяющейся последовательносп рДНК составил 22 тпн для серой и черной ворон и 22.5 тпн- для большеклювой.

Вычисленные по данным полиморфизма рестрикционных сайтов значени: межвидовых генетических дистанций ворон (0-0.26%) не сопоставимы с таковыми длв видов млекопитающих, что, по крайней мере, отчасти может быть связано с низким! скоростями молекулярной эволюции птиц, широко обсуждаемыми в настоящее врем5 (Quinn, 1996). Если рДНК ворон эволюционирует со скоростью примерно 0.84x10" изменений за 1 млн лет (Munechika et al., 1997), то большеклювая ворона отделилаа от серой и черной примерно 130 тыс лет назад, а дифференциация серой и черной ворон не достигла эволюционной значимости. Однако, если в расчетах генетически: дистанций опираться на первичные данные ПДРФ рДНК, дивергенция для парь серая/черная, серая/большекпювая и черная/большекпювая вороны состави примерно 0.48, 0.72 и 0.79, соответственно. Эти значения ближе к тем, которые получены для разных видов как млекопитающих, так и птиц (включая врановых, КрюкоЕ и др., 2000) при изучении их мтДНК. В таком случае можно считать, что серая и черна! вороны разделились между собой около 210, а с большеклювой вороной - 380 тыс. ле' назад. Но и этот возраст совсем юный, если учесть, что Corvidae появились в Евразш 20-30 млн лет назад (Sibley, Ahlquist, 1985).

Таким образом, нами были получены новые данные о рестрикционно« полиморфизме рДНК врановых птиц Результаты подтвердили установленную ранее филогенетическую удаленность большеклювой вороны (очевидную уже по внешни» морфологическим и поведенческим признакам) и показали, что для исследование гибридных популяций ворон могут быть полезными лишь немногие варианты анализ. ПДРФ рДНК. Тем не менее, окончательно филогенетические отношения межд; воронами остались невыясненными. Поэтому далее мы использовали более чувствительный молекулярный метод современной генетики.

4.1.4. RAPD-PCR анализ серой, черной ворон и их гибридов

С помощью предварительно отобранных праймеров, различающих черную i серую вороны (Spiridonova, Chelomina et al., 2000), анализировали малую выборк (п=16), состоящую из фенотипических гибридов серой и черной ворон и западносибирской зоны гибридизации, а также фенотипически чистых родительски форм из отдаленных популяций, где гибридизация исключена. Дивергенция ме>ед; серой и черной воронами (с учетом только полиморфных аллелей), а также межд; ними и их фенотипическими гибридами оказалась почти одинаковой (D=0.410 i D=0.416) и значительно выше таковой для фенотипически чистых серой (D=0.195) i черной ворон (D=0.312) в отдельности и их фенотипических гибридов между coéoi (D=0.226). Филогенетические реконструкции хорошо различают указанны! фенотипические группы (рис. 9). Отличия серой и черной ворон между собой в 2 и : раза ниже, чем с большеклювой вороной и сорокой, соответственно. Примечательно

что геномы всех фенотипических гибридов имели по сравнению с родительскими формами дополнительные фрагменты ДНК, что свидетельствует не только об их большей генетической гетерогенности, но и о структурных реоранизациях. Аналогичную ситуацию мы наблкэдали у межвидовых гибридов сусликов (Спиридонова, Челомина и др., 2000), чешуекрылых (Захаров, Челомина, Журавлев, 2000). Более того, полученные данные позволяют полагать, что генотипические границы западносибирской зоны гибридизации серой и черной ворон перекрывают фенотипические, что известно для других случаев межвидовой естественной гибридизации живэтных.

C.cornix

С. corone х О C.cornix

С. corone

C.cornix

С. corone х C.cornix

Рисунок 9

Филогенетические древа серой, черной ворон и их фенотипических гибридов, построенные по данным RAPD-PCR анализа.

4.2. Генетическое разнообразие домовых мыией фауны бывшего СССР: данные

RAPD-PCR анализа

По степени синантропии, а также экологической пластичности мыши надвидового комплекса Mus musculus s.lato существенно различаются: от M.m.domesticus, почти никогда не покидающей жилье, до M.m.hortulanus, ведущей дикий образ жизни и делающей запасы корма. В этой связи возникает естественный вопрос о том, какие генетические особенности и эволюционные процессы позволяют различным формам домовой мыши приспосабливаться к разным условиям существования. Основные дости>мэния генетических исследований домовой мыши подробно изложены в двух, практически, одновременно опубликованных монографиях: «Домовая мышь» (1994) и «Genetics in wild mice» (1994). Тем не менее, до сих пор в данной области существует множество проблем. Прежде всего, нельзя считать окончательно сложившимися представления об объеме и структуре таксона Mus,

существует необходимость в количественной оценке генетической и географической изменчивости домовой мыши. Ясно, что решение перечисленных проблем требует привлечения современных методов генетического анализа.

4.2.1. Молекулярное типирование, таксономическая диагностика и филогения домовых мышей

RAPD-PCR анализ суммарной клеточной ДНК кариологически и биохимичесм типированных экземпляров домовых мышей фауны России и стран ближнего зарубежья дал адекватные оценки возможностей метода для изучения генетического разнообразия, меж- и внутривидовой дифференциации, таксономической диагностику и анализа фено- и филогенетических связей домовых мышей (Chelomina et al., 1998 Челомина и др., 1999). В целом спектры амплифицированных фрагментов ДНК различных особей высоко изменчивы (рис. 10). Тем не менее, даже визуальный анали; позволяет выделить два основных уровня дифференциации: более высокий межд^ видами и менее выраженный - внутри них. Эти уровни наглядно демонстрируе" гистограмма распределения значений попарных генетических дистанций. Кроме того она указывает на внутривидовую гетерогенность M.musculus, коррелирующую с ее наиболее высокой в надвидовом комплексе экологической пластичностью. Высокук дискретность сравниваемых видов подтверждают и данные количества полиморфны) последовательностей ДНК: 93% - для полной выборки, 11 %, 16% и 75% - в отдельность для hortulanus, abbotti и musculus. Генетические дистанции (D) между M.abbotti с M.hortulanus составляют 0.60. Дифференциация этих видов с M.musculus более существенна: D=0.88 и D=0.80, соответственно. Внутри группы M.muscului генетические дистанции составляют в среднем 0.20.

Фено- и филогенетические реконструкции (рис. 11) указывает на высокук дифференциацию трех сравниваемых видов - M.musculus, M.abbotti и M.hortulanus обнаруживая географическую подразделенность генетических групп M.musculus v парафилетичность мышей Тувы. Примечательно, что филогенетическая схема MST: выделяет среднеазиатских мышей, как группу, находящуюся в равновероятном родстве с M.musculus других регионов. Такое положение среднеазиатской мыши моке1 быть связано с историей расселения данного таксона. По одной из имеющихся версий (Klein et al.,1987) домовая мышь распространялась из Азии (Пакистана, где онг возникла) в двух направлениях: восточном и западном. Небезынтересно также, чте согласно полученной реконструкции, именно через мышь Средней Азии M.muscului объединяется с другими родственными ввдами -M.abbotti и M.hortulanus.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1516

OPD-05

Рисунок 10

RAPD-PCR спектры Mus hortulanus (1,2), M.abbotti (3,4) и M.musculus (5-16). М-маркер.

-cg

ris

Z о

_ m

- p

- n

J O.O

UPGMA

()

O-Û

MST

M.abbotti, M hortulanus

О □

M.musculus

1.0

Рисунок 11

Дендрограммы генетического сходства и филогенетических связей видов Mus.

4.2.2. Высокая генетическая изменчивость дальнгвосточных популяций домовой мыши

Известно, что популяционная структура видов является результатом тесных взаимодействий экологических, микроэволюционных и демографических процессов, а также исторической биогеографии генетических линий. В геномах животных генные потоки сдерживают генетическую дивергенцию популяций, в то время как генетический дрейф, филопатрия, высокие скорости мутаций и отбор на локальную адаптацию способствуют усилению внутривидовой филогеографической структуры. История освоения Дальнего Востока позволяет полагать, что фауна домовой мыши данного региона могла сформироваться как за счет таковой Китая, Кореи, так и Сибири, Амурской области, а также Украины и европейской части России. Следовательно, домовые мыши Дальнего Востока в экологическом, генетическом и систематическом отношениях должны быть высоко гетерогенной и своеобразной группой грызунов, представляющей несомненый интерес для широкого популяционного исследования.

При попарном сравнении шести локальных выборок домовой мыши дальневосточной фауны (Chelomina et al., 1998; Челомина и др., 1999) нами получены достаточно высокие значения их генетического разнообразия (табл. 1). Не обнаружено

строгой зависимости между уровнями генетической дифференциации и степенью территориальной разобщенности локальных популяций. Так, самые низкие значения генетических дистанций и полиморфизма и высокие генные потоки зарегистрировань между мышами Хасана и Краскино, обитающими в одном административном районе. Между географически изолированными мышами Приамурья и Камчатки эти показатели выше, наблюдается слабый генный поток. Однако самые высокие значения генетической дифференциации обнаруживают мыши Турьего Рога и Владивостока, территориально более разобщенные, чем мыши Хасанского района, но значительнс более близкие, чем мыши Приамурья и Камчатки.

UPGMA дендрограмма генетического сходства указывает на достаточно строгое деление животных соответственно местам их отлова. Такую кластеризацию поддерживает MST филогенетическое древо. Однако NJ древо строгую дифференциацию локальных популяций обнаруживает лишь для выборки Турий Рог-Владивосток. Выборочные данные представлены на рис. 12.

Хотя по совокупности признаков каиедая локальная популяция имеет собственное «генетическое лицо» и отдельную фенетическую линию, четки* молекулярных маркеров для них выявить не удалось. О возможной филогенетической значимости дифференциации популяций можно говорить лишь в отношении мышей Турьего Рога и Владивостока

4.2.3. Свидетельства musculus х domesticas гибридизации на российском Дальнем Востоке

Известны три различной степени изученности зоны гибридизации домовых мышей: европейская, закавказская и восточноазиатская. До настоящего времени считалось, что на российском Дальнем Востоке (в отличие от первых двух зон) принимают участие лишь различные формы musculus и castaneus (Межжерин и др., 1994). Недавние исследования генетической изменчивости домовых мышей данного региона неожиданно обнаружили у некоторых экземпляров «domesticus» - тип D-петли мтДНК (Yonekawa et al., 2000). В этой связи нами проведен RAPD-PCR анализ выборку мышей (п=48) из с.Иннокентьевка Приморского края (в которой обнаружен «domesticus» -тип мтДНК), а также выборки мало изученных мышей г.Кяхта (Бурятия), Приамурья, Нижнего и Среднего Поволжья (Челомина и др., 2000), имеющих, согласно данным этих же авторов, мтДНК «musculus»-типа.

Полученные данные позволяют полагать, что на российском Дальнем Востоке имеет место не только интрогрессия отдельных генов domesticus, но также интрогрессивная гибридизация между формами musculus и domesticus, причем интрогрессия последней более широка, чем можно предположить по данным анализа мтДНК. Высокая частота присутствия последовательностей ДНК «domesticus» - типа в популяции мышей с.Иннокентьевка сопровождается не только увеличением степени разнообразия спектров амплификации ДНК (для данной выборки характерны самые высокие значения Р и D), но также их переходом на качественно другой уровень, т.е. с континуальности на дискретность. Мозаичность распределения маркеров musculus и domesticus находит подтверждение в данных других генетических исследований домовой мыши дальневосточного региона (Якименко идр., 2000).

Для всех мышей г.Кяхта удалось выявить маркерную область, состоящую из четырех ОРС-26 полос. Присутствие фиксированных отличий (6% фрагментов ДНК) у мышей Кяхты в совокупности с особенностями их морфологии и других генетически) характеристик (Якименко и др., 2000) позволяет предполагать возможность таксономической значимости выявленных молекулярных отличий. Некоторые и; вариантов амплификации могут считаться маркерными для мышей с.Иннокентьевка.

0,64

-С.

Кяхта

Иннокентьевка

Приамурье

Поволжье

А В Р

С р

в Н I

К L М

Хасан

Краскино

0.70

0.96

Рисунок 12

иРСЗМА дендрограммы генетического сходства домовых мышей для попарно сравниваемых локальных популяций, построенные по данным ИАРО-РСР? анализа.

Высокое генетическое сходство мышей Среднего Поволжья и Приамурья (см. табл.1) с одной стороны, и более высокая дифференциация локальных популяций мышей г.Кяхта и с.Иннокентьевка с другой, подтверждают описанное выше отсутствие у синантропных грызунов строгой корреляции между генетической дифференциацией и простанственной изоляцией и позволяют более аргументировано говорить о высоком значении торгово-транспортных связей, а также разной конкурентной способности различных видов и подвидов домовых мышей, включая эффект основателя и существование аборигенных форм. Кроме того, анализ обобщенных данных указал на возможность большего генетического разнообразия домовых мышей из зон экологического оптимума, а также на принадлежность именно к этой зоне локальных популяций с максимальными генетическими отличиями и полиморфизмом (рис.13,15; табл.1).

Рисунок 13

Зависимость генетической дифференциации от территориальной разобщенности домовых мышей й- генетические дистанции, Ь- расстояние в условных единицах.

1 2Л 3 4 5 б"1 7Л 8й 9 10 11 12 13 14 15 16 М

ОРС-05

Рисунок 14

RAPD-PCR спектры Иннокентьевки (1-10) и Кяхты (11-15). М- молекулярный маркер, d- животные с domesticus типом мтДНК (Yonekawa et al., 2000)

Рисунок 15

Гистограмма средних значений генетических дистанций (О) и полиморфизма (Р) внутри локальных популяций (ВЛП), между локальными популяциями (МЛП), между видами (МВ), внутри зоны экологического оптимума (ВЗО) и в разных экологических зонах(РЗ)

Таблица 1

Генетические характеристики локальных погуляций домовой мыши в пяти попарных сравнениях.______

Локальности п Р (%) 1Мт О

Владивосток 106 72.64 0.28

Турий Рог 110 75.45 0.23

Турий Рог/Владивосток 0.44

Турий Рог+Владивосток 143 86.01 0.62 0.31 0.31

Хасан 110 54.55 0.17

Краскино 116 56.89 0.20

Хасан/Краскино 0.25

Хасан+Краскино 128 70.31 0.27 1.40 0.21

Амур 113 66.37 0.23

Камчатка 92 48.91 0.15

Амур/Камчатка 0.30

Амур+Камчатка 123 75.61 0.35 0.93 0.22

Поволжье 86 73 0.25

Приамурье 89 70 0.28

Поволжье/Приамурье 0.30

Поволжье+Приамурье 115 81 0.11 4 0.27

Иннокентьевка 104 87 0.43

Кяхта 86 76 0.40

Иннокентьевка/Кяхта 0.52

Иннокентьевка+Кяхта 137 91 0.20 2 0.48

п - число признаков; Р - полиморфизм; О генетические дистанции; Рэ1- коэффициент генных фиксаций;1Мт - число мигрантов на генерацию.

5. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭВОЛЮЦИЯ У ТАКСОНСВ, ОТЛИЧАЮЩИХСЯУРОВНЕМ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ ПЛАСТИЧНОСТИ и ттом ХРОМОСОМНОГО ВИДООБРАЗОВАНИЯ: ПУНКТУАЛИЗМ И ГРАДУАЛИЗМ

Если под микроэволюцией подразумеваются внутривидовые преобразования, т под макроэволюцией - комплекс процессов, ведущих к формообразованию таксоно высокого ранга. Процесс видообразования связывает микро- и макроэволюцию единый процесс филогенеза. Известно, что любой вид своеобразен на каждом уровн его организации: генетическом, морфофизиологическом, экологическом. Однак пределы возможности его существования широко варьируют, отсюда различен вкла, отдельных видов в эволюцию. Анализируя системные реорганизации генома пр формообразовании, Стегний (1991) выделил виды с лобильным и консервативны геномами, характеризующее соответственно виды с узкими и широкими адаптивным возможностями. Первые занимают центральное положение в филумах и являютс генераторами образования дочерних видов, вторые - терминальное. Таким образои особенности организации генома детерминируют способность/неспособность реорганизациям в видообразовательном аспекте.

Нами изучались молекулярные особенности разнообразия, молекулярно структуры и эволюции геномов в двух группах грызунов, демонстрирующих, как на! представляется, градуальное и пунктуальное видообразование: экологическ пластичных лесных и полевых мышах (2п-48) и более специализированньк высши песчанках (2п=40-72), соответственно.

5.1.1. Частоповторяющаяся ДНК, хромосомный полиморфизм и видообразовани

песчанок

Песчанки (ОегЬНПпае) являются сравнительно молодой, возникшей в плиоцен (Громов, 1961) узкоспециализированной и распространенной в определенны климатических условиях (аридных зонах) группой грызунов с хорошо выраженным морфологическими отличиями (РеИег е1 а1., 1972). Из 145 видов песчанок мирово фауны 8 обитают на территории бывшего СССР: в аридных зонах Закавказы Прикаспия, Казахстана, Средней Азии, Тувы и Забайкалья. Все они являютс носителями особо опасных инфекций (прежде всего - чумы), что определяв потребность в сведениях об их экологии, хорошо разработанной систематике генетике группы. Кариологические исследования позволили разработать схем филогенетических взаимоотношений видов, разработать внутриродовую таксономи! (Коробицына, Картавцева, 1983). Молекулярно-генетические исследования песчано! включающие виды со стабильным и ла&тьным кариотипами, не проводились.

Рестрикционный анализ яДНК трех видов песчанок рода Мепопе: малоазийской Ш^гапп (2п=72), полуденной М.тепсИапиз (2п=50) и монгольско М.ипдшсиШиз (2п=44), по морфологическим данным наиболее близкородственных данной таксономической группе, но имеющих максимальные отличия по хромосомны числам выявил лишь единичные межвидовые отличия (Челомина и др., 1990). Та1 эндонуклеаза ВврГ^, имеющая множество сайтов узнавания в яДНК всех трех видое только в геноме малоазийской песчанки выявляет дискретный низкомолекулярны фрагмент размером ~20 пар оснований и его димер. Наиболее вероятной причино межвидовых различий, видимо, следует считать амплификацию, так как случа возникновения новых геномных компонентов в процессе эволюционнь преобразований генома редки. Можно предположить, что доза низкомолекулярног ВзрШ-фрагмента находится в прямой связи с числом метацентрических разрыве хромосом: его амплификация могла стать причиной массовых хромосомных разрыво! которые привели к образованию кариотипа нового вида (малоазийская песчанка хромосомно отличного от предковой формы. Первопричиной геномны

преобразований могут быть мобильные генетические элементы. Последовательную цепь эволюционных событий можно тогда представить следующим образом: 1) мутация в области МДГ (всплеск активности в ответ на экзо- или эндогенное воздействие), 2) амплификация короткой последовательности (как результат действия МДГ), 3) метацентрические разрывы (следствие амплификации), 4) видообразование (по причине хромосомных разрывов, нарушивших «привычное» расположение генов).

Нукпеаза Мэр1 генерирует множество полос ДНК слабой интенсивности. Тем не менее, сходство видов, вычисленное по данным их полиморфизма, соответствует аналогичным расчетам, основанным на карисшогических данных.

Таким образом, полученные результаты подтверждают существование положительной корреляции между молекулярной и надмолекулярной структурой генома (т. е. тонкой структурой хромосом) и ее отсутствие междууровнями ПДРФ яДНК и изменчивостью кариотипических чисел. Хромосомные преобразования, сопровождавшие формообразование исследованных грызунов, осуществлялись, по-видимому, с помощью механизмов, обеспечивающих сохранность молекулярной организации повторов. При наличии определенного генетического потенциала видообразование может успешно осуществляться с помощью крупных хромосомных преобразований, максимальным сохранением общей организации генома на молекулярном уровне и в сопровождении «скачкообразных» изменений лишь ограниченной части повторяющейся ДНК. Имеющиеся к настоящему времени данные позволяют заключить, что такой путь эволюции генома может быть общим для молодых в эволюционном отношении групп млекопитающих, тяготеющих к крупномасштабным хромосомным реорганизациям. Стабилизация кариотипа, вероятно, обеспечивает возможность дивергенции основной части повторяющихся последовательностей по пути постепенного накопления более мелких мутаций. В таком случае степень дивергенции повторяющейся ДНК (в том числе и по картинам ПДРФ) будет отражать эволюционный возраст сравниваемых видов.

5.1.2. Молекулярная филогения песчанок по данным 1ЗДРО-РС17 анализа

Так как возможности анализа ПДРФ яДНК высших песчанок оказались весьма ограниченными, для реконструкции молекулярной филогении видов был использован метод ВДРО-РСР{ анализа. Этой части работы придавалось особое значение, т.к. аналогичные реконструкции, основанные на кариотипических данных, позволили авторам выдвинуть гипотезу о том, что кариотипическая эволюция высших песчанок шла не по пути слияния акроцентриков, как у большинства животных, а по пути метацентрических разрывов, т.е. увеличения числа хромосом (Коробицына, Картавцева, 1988). Наши результаты показали, что данный метод хорошо различает все сравниваемые виды. Филогенетические реконструкции не опровергли высказанного кариологами предположения о направленности эволюции в данной группе видов. Однако корреляция между кариологической и молекулярной филогенией песчанок может быть признана лишь удовлетворительной.

5.2. Особенности молекулярной эволюции, видообразования и генетического разнообразия лесных и полевых мьшей рода Арос!ети5

Транспалеарктический род лесных и полевых мышей Аробетиэ представляет собой идеальную природную модель для изучения комплекса экологических, эволюционных и генетических проблем. Интересен он также для систематических исследований. Современная зоологическая классификация выделяет около 20 форм лесных мышей видового статуса и более 35 - подвидового, принадлежащих к нескольким подродам (Мизэег, СаМекэп, 1993). Тем не менее, полного единства мнений относительно внутривидовой таксономии среди зоологов пока не достигнуто. Ситуация

осложняется неравномерной изученностью видов данной группы, а такж продолжающимся первоописанием новых форм (Воронцов и др., 1992). Кроме тоге существует мнение о возможности гибридогенного видообразования (Гептнер, 194С Ларина, 1962) и продолжения формообразовательных процессов в популяциях лесны мышей и в настоящее время (Воронцов и др., 1992; Орлов и др., 1996). Групп Apodemus заселяет среднеширотный широколиственный лес палеарктическог региона, что делает ее почти уникальной среди 122 родов подсемейства Murinae распространение которых почти ограничено субтропическим и тропическим ареало! Старого Света. В силу широкого распространения и высокой численности эти грызун! имеют большую значшость в природных биогеоценозах и экосистемах.

5.2.1. Дивергенция двух семейств повторяющейся ДНК лесных и полевых мыше!

рода Apodemus

В предыдущих исследованиях ряда авторов с помощью эндонуклеаз рестрикци EcoR1 и Hind 111 в геномах лесных и полевых мьшей рода Apodemus были выявлены частично охарактеризованытаксоноспецифичные EcoR1- и Hindlll-последовательност ДНК, представляющие соответственно диспергированные и тандемно организованны повторы (Cooke,1975; Brown and Dower, 1981). Дальнейший анализ указанны последовательностей на примере большего числа видов позволил нам разделит животных на две группы: «Rattus»- и «/V/uss-подобные (Челомина, 1993). Полученны данные предполагали определенную последовательность формообразования мыше типа «Rattus» (предположительно, одна филетическая линия) и отмечали высоки уровень дивергенции геномов (не укладывающихся в одну филетическую линию представляющих тип «Mus».

Из наших результатов следует, что в геномах лесных и полевых мыше сохраняется неизменной доля 1850 пн EcoRI диспергированной родоспецифическо последовательности, но изменяется количество диспергированного 1350 пн EcoR повтора, специфичного для таксона более высокого ранга. Hindlll сатДНК разных виде отличается по длине мономера, размеру наиболее представленного мультимерг расщепляемостью звена повторяемости одноименной нуклеазной рестрикцт количество Hindlll сатДНК коррелирует с содержанием 1350 пн EcoRI-повторг Обнаружены ранее неидентифицированные компоненты геномов Apodemus. Данны позволяют предполагать наличие прямой зависимости между эволюционны возрастом лесных мышей и длиной Hindlll-мультимера и обратной - межд количеством Hindlll сатДНК и 1350 пн EcoRI повтора. Последнее может быт интерпретировано как согласованность эволюции разных семейств повторяющейс ДНК.

5.2.2. Молекулярно-генетическое типирование трех представителей транспалеарктичесюго рода лесных и полевых мышей

Используя рестриктазы EcoRI и Hindlll, сравнивали геномы лесных мышей и горных (Кавказ) и островных (Япония) популяции: A. ponticus, A. fulvipectus и / argenteus, соответственно (Челомина и др., 1995). Их видовой статус был окончательн подтвержден совсем недавно в результате широкомасштабных исследований применением комплекса генетических методов (биохимических, кариологически: морфометрических), проводимых с целью таксономической ревизии рода Apodemu (Воронцов и др., 1988; Межжерин и др., 1992).

Результаты показали, что формы действительно высоко дифференцированы ка между собой, так и с ранее изученными видами; каждая из них имее видоспецифические особенности; A. ponticus является наиболее близкой из все представителей Apodemus к европейским A. sylvaticus и A. flavicollis; A. fulvipectu

имеет особый характер расщепления как EcoRI (специфичной к диспергированным повторам) так и Hindlll (специфичной к сатДНК): в геноме этого вида содержатся три семейства EcoRI-повторов, обнаруженных ранее у разных видов (европейских и азиатских) лесных мышей, и Hindlll-компоненты, характерные как для полевых, так и для лесных мышей. A.argenteus выделяется среди всех изученных представителей Apodemus, геном большинства из которых содержит 375 пн Hindlll-сателлит, наличием фракции EcoRI сатДНК, состоящей из 240 пн единиц повторяемости.

5.2.3. Mus тип сегментации сатДНК японской лесной мыши

Уникальный для Apodemus тип внешней сегментации сатДНК A.argenteus продиктовал необходимость ее более подробного изучения. Суммируя полученные с расширенным кругом рестриктаз результаты, можно сказать, что сатДНК A.argenteus организованна в протяженные (10 тпн и более) блоки, состоящие из 240 пн Sau3a последовательностей. Часть из них имеет регулярно повторяющиеся Csp6l или EcoRI сайты, возможно, характеризующие различные подсемейства последовательностей сатДНК. Аналогичную организацию имеет альфоидная ДНК человека и приматов, а также сатДНК крыс (Willard, 1985).

Опираясь на данные палеозоологии о последовательном отделении от общей филетической линии Muridae родов Mus, Apodemus и Rattus (Громов, Баранова, 1981), мы пришли к одному из примечательных предположений, вытекающих из наших результатов, которое заключается в том, что в геномах Apodemus сатДНК может быть представлена как последовательностями-«предшественниками», так и последовательностями-«потомками», поскольку имеет оба варианта сегментации: характерный для более старого рода Mus и более молодого, чем Apodemus рода Rattus. Это хорошо согласуется с гипотезой существования в геномах млекопитающих библиотеки сателлитных последовательностей ДНК (Salser et al., 1976). Кроме того, это может быть аргументом в пользу обсуждаемой в литературе возможности гибридогенного происхождения лесных и полевых мышей. Хотя такая ситуация не исключается и при одновременной дифференциации родов мышевидных грызунов (Bonghomme et al., 1986), предполагающей наличие общих предковых форм, а следовательно и общих последовательностей «предшественников» для сатДНК.

Таким образом, в отличие от данных других авторов, подчеркивающих консерватизм сателлитных последовательностей ДНК лесных мышей, наши результаты предполагают наличие существенных отличий в организации генома Apodemus в целом и его особого компонента - сатДНК. Возможно, последовательности с «Mus» вариантом расщепления сатДНК представлены в геномах и других видов лесных мышей. В таком случае, различия в количестве «Mus» подобной сатДНК должны быть результатом независимой эволюции гомологичных последовательностей в геномах каждого вида при их видообразовании и дивергенции. Чтобы понять значение вариантов сегментации сатДНК, необходимо применение более тонких и чувствительных методов исследования (преяеде всего секвенирования), а также изучение распределения этих вариантов между близкими видами более полно, неприменно используя мало изученные формы ю>жой Палеарктики.

5.2.4. Дифференциация ГЦ-богатых сайтов рестрикции в частоповторяющэйся

ДНК Apodemus

Использовали эндонуклеазы рестрикции, специфичные к ГЦ-богатым сайтам: Mspl (CCGG), BspRI (GGCC), Mval (CCA/TGG), так как их относительный дефицит в геномах млекопитающих предполагает более высокую специфичность распределения (Челомина, 1993а). По результатам ПДРФ ДНК вычислены межвидовые генетические дистанции, построены дендрограммы сходства. Располагая виды грызунов в порядке

их дивергенции с эволюционно наиболее молодыми видами, мы нашли, чт становление A.peninsulae приходится на период между дифференциацией от общег филогенетического ствола Muridae домовых мышей и крыс, что находит полно подтверждение в палеозоологических данных. Таким образом, ГЦ-богаты последовательности, очевидно, могут служить для мышевидных грызуно своеобразным эволки+юнным маркером.

Сопоставление наших результатов исследования часто повторяющейся ДН Muridae с полученными ранее (Brown, Dover, 1980; Witney, Furano, 1983; Gupta, 1983), также со сведениями о BspRI повторе генома лисицы, имеющего сложну иерархическую структуру (Потапов и др., 1990), позволяет полагать, что молекулярны механизмы эволюции в этих филогенетических линиях млекопитающих имеют сходны характер. Можно предположить, что сатДНК Apodemus произошла от различнь последовательностей двух семейств повтров, эволюционирующих на более ранну этапах обособленно и сохранивщихся в таком состоянии в геномах Mus, где он организованы в - 240 и 130 пн сатДНК (суммарная длина мономеров которых равн размеру звена повторяемости сатДНК лесных мышей, а также крыс). Действительн сателлитный мономер генома лесных мышей, расщепляется (рестриктазами Tagl Hindlll) на два субповтора, имеющих примерно такой же размер, как минорный мажорный компоненты сатДНК домовой мыши. Кроме того, эти данные хорои совместимо с гипотезой существования в геномах млекопитающих «библиотеки относительно простых последовательностей, амплификация которых может привести образованию новой сатДНК (Salser et al., 1976).

5.2.5. Особенности рестрикционного полиморфизма ДНК европейских и

азиатских видов лесных мышей рода Apodemus

Изучение повторяющейся ДНК лесных мышей было продолжено с помощь рестриктаз Alul, Tagl, Csp6l и Bglll, места узнавания которых (AGCT, TCGA, GTAC AGATCT, соответственно) могли произойти от одного тетрануклеотида путе мультипликаций и инверсий. Поскольку один из сайтов включен в блок нуклеотидо! узнаваемый нуклеазой Hindlll (AAGCTT), который маркирует сатДНК лесных мыше! мы надеялись более подробно охарактеризовать именно сателлитную фракцию геном - общепризнанный молекулярный маркер в эволюционных и филогенетичесм исследованиях Такой набор позволял нам также опробировать дифференцированнь подход в выборе рестриктаз (узнающие сайты счетырьмя типами азотистых основали по сравнению с GC-специфичными) для изучения сателлитной фракции геном грызунов (Челомина, 1996).

Согласно результатам, сравниваемые формы хорошо разделяются на де группы - эволюционно молодую и старую, включающие соответственно европейские азиатские (вместе с полевой мышью) виды лесных мышей. Рестрикционнье картин ДНК для двух групп видов хорошо различаются. Европейские виды характеризуютс более низким межвидовым и внутригеномным ПДРФ ДНК, наличием мажорных поло< Азиатские виды значительно более полиморфны и гетерогенны, в их генома практически не обнаруживаются мажорные фрагменты ДНК. Так как анализирование здесь фракция повторов представляет в основном сатДНК, адаптивная роль которс признается достаточно широко, мы можем предполагать адаптивную и эколог« географическую направленность наших ре^льтатов.

5.2.6. Генетическая дифференциация лесных мышей Кавказа: сравнение морфологической хромосомной и молекулярной дивергенции

Теоретически совершенно очевидно, что молекулярная основа ядерного геном определяет как его хромосомную структуру, так и набор синтезируемых белш

Предполагается также, что для видов с постепенным хромосомным образованием, к которым принадлежат лесные и полевые мыши рода Аробетив, хромосомному формообразованию предшествует накопление множественных мелких мутаций, что допускает некоторое отставание хромосомной эволюции от эволюции ДНК на уровне ее первичной последовательности, а следовательно - от биохимической и морфологической эволюции. Вместе с тем ясно, что генетическая неравнозначность даже мелких мутаций может существенно повлиять на результаты реализации генетической информации. Кроме того, эспериментальные данные позволяют полагать, что характер морфологической эволюции видов детерминируется типом их хромосомной эволюции. Замечательным в данной ситуации является тот факт, что, будучи генетически более стабильными, т.е. эволюционно более консервативными, кариологические характеристики сравниваемых видов могут наиболее точно указать последовательность формообразовательных процессов. Это важно потому, что палеонтологические данные свидетельствуют лишь о существовании всех трех форм анализируемых лесных мышей, соответствующих сравниваемым ведам, уже в позднем плейстоцене. В нашем примереочередность видообразования, очевидно, следующая: АЛМресЮз, А.ига1епз1'з, А.ропИсиз, что согласуется с выводами морфологических исследований данных видов (Лавренченко, Лихнова, 1995). Принимая ее за основу, мы можем сопоставить уровни генетических различий по разным группам признаков (хромосомных, биохимических и молекулярных - ДНК) не только между собой, но и с относительно-временной дивергенцией видов. Последнее позволяет судить о темпах эволюции видов на разных уровнж их организации (Челои/ина и др., 1998).

Как видно из рис. 16, степень дифференциации сравниваемой группы видов имеет наименьшие значения на морфологическом уровне, наибольшие - на изозимном и средние - на молекулярном и хромосомном. Для каждого конкретного вида ситуация разная, но в совокупности полученные данные приводят нас к выводу о зависимости степени дифференциации вида на разных уровнях организации от его эволюционного возраста. Так, дифференциация А.ропНсиБ, принимаемой нами за самый молодой вид, одинаково высока на морфологическом и изозимном уровнях. При этом молекулярная дивергенция данного вида с другими является самой низкой. Последовательное повышение степени дивергенции вида при переходе от морфологического к хромосомному и изозимному уровню его организации наблюдается лишь для А.ига1епз1з. Эволюционно наиболее старый с нашей точки зрения вид - А/иЛфесГив -имеет равновысокую дивергенцию на всех уровнях генетической организации. Различная степень согласованности молекулярной, хромосомной и морфологической филогении показана также для других таксонов (Скурихина и др., 1993; Банникова и др., 1995; Медников и др., 1995).

Попарное сравнение показывает, что одна пара видов (А.рописив/А^иМреаиэ) дивергировала максимально на морфологическом и хромосомном уровнях, другая (А.игаШпзМААиМрресЮз) - на молекулярном и биохимическом, а третья (,А.ропИсиз/А.ига1епз'13) оказалась дивергировавшей более равномерно на всех уровнях организации. Вместе с тем согласно кариологическим данным время дивергенции А.ропНсиэ и Аига/епэ/з, а также А.ига/епэ/э и А/иМресШз должно быть значительно ниже, чем у пары А.ропИсиз/А.^МресШэ. Степень молекулярной и биохимической дивергенции последней пары, напротив, уступает таковым у первых двух. Следовательно, различные пары видов лесных мышей могут иметь различные скорости молекулярной дивергенции (наиболее высоки они у пары А.ига1епз'1з/А^ЫфесЮз) и, может быть, даже разную направленность (у пары А.ропМсиз/А^МреЫиз по сравнению с двумя другими парами). Хотя в эволюционных исследованиях основное внимание уделяется анализу степени дивергенции видов, принципиальная возможность конвергентной эволюции неотрицается. Причиной этому

может быть неодинаковый генетический потенциал отдельных групп родственнь видов, особенности истории формирования ареалов, викариантных событий демографического пресса, чему в настоящее время уделяется все больше внимания, также специфики видообразования. Последнее обстоятельство особенно актуал^ для изучаемой группы в связи с возможностью гибридогенного формообразования.

D 1.0 1

j^T .............

.............

Мр* Хр* Из* Мл

Рисунок 16

Распределение относительных значений дивергенции (D) между 3 видами род Apodemus на различных уровнях организации: морфологическом (Мр), хромосомно (Хр), изозимном (Из) и молекулярном - ДНК (Мл)

1 - А. ponticus; 2 -А. fulvipectus; 3 - Л. uralensis; 4 - среднее. * - литературные данные

Таким образом, детальное сопоставление степени сходств и различий видов н различных уровнях их организации указывает, что проблема взаимоотношений меж; ними является весьма непростой, и чтобы окончательно разрешить ее, необходим проведение дальнейших исследований.

5.2.7. Молекулярная филогетя лесных и полевых мьшей рода Apodemus по данным рестрикционного анализа суммарной яДНК

Исследование в филогенетических и таксономических исследовани; суммарной яДНК имеет преимущество в том, что позволяет получать прямую, а н опосредованную через надмолекулярные структуры, белки или фермент информацию, а также дает возможность анализировать значительно большую, и 41 особенно важно - различную в функциональном плане часть генома, чем пр использовании в качестве молекулярного маркера индивидуальнь последовательностей/генов ядерной или цитоплазматической/ митохондриальной ДН1 Кроме того, метод применим для сравнения высоко дивергировавшихвидов и таксонс более высокого ранга, т.к. относительно низкие скорости эволклуи яДНКпо сравнени с мтДНК приводят к минимальной потере генетической информации при сравнена далеких разобщенных форм.

Нами проведен филогенетический анализ 9 видов лесных и полевых мыше рода Apodemus по данным ПДРФ суммарной яДНК. Мы также попытались провеет сравнение полученных результатов с аналогичными построениями, основанными н

базах данных других генетических исследований, и с зоологической классификацией рода лесных и полевых мышей (Челомина, 1998а).

Согласно данным, время дивергенции рода Apodemus от общей филетической линии грызунов, из расчета, что 1% дивергенции нукпеотидных последовательностей соответствует 1 млн лет дифференциации видов (Suzuki et at., 1990), составляет около 12 млн лет. Примерно 8 млн лет назад дифференцировались восточноазиатские и полевая мыши. Видообразование еврокавказских видов происходило в последние 2 млн лет, а самые близкие из них разделились всего 200-300 тысяч лет назад.

Рисунок 17

Схема филогенетических отношений видов Apodemus, построенная методом бутстрепа по данным анализа ПДРФ суммарной яДНК.

M-, R-, А- соответственно «Mus», «Rattus» и «Apodemus» типы сатДНК. Цифрами указаны значения бетстрепа в рамках 100 репликаций

Кладистический анализ и анализ фенетического сходства лесных и полевых мышей рода Apodemus как по данным 169 суммарных, так и 110 информативных признаков (рестрикционных фрагментов яДНК) позволяет с высокой степенью достоверности (94-100 из 100 репликаций) разделить исследованные виды по крайней мере на три группы: 1) южнопалеарктическую, представленную A.argenteus, и две северопалеарктических, 2) восточную, состоящую из A.speciosus, A.peninsulae и A.agrarius и 3) западную, включающую A.ponticus, Auralensis, A.fulvipectus и A.sylvaticus (рис. 17). Такое деление коррелирует с разнообразием типов внешней сегментации сатДНК, а также с кариологическими особенностями лесных и полевых мышей. У вида первой группы размер повтора сатДНК составляет 240 пн («Mus» - тип сегментации), у видов второй группы основная фракция сатДНК сегментирована на фрагменты примерно пхЗО пн («Apodemus»- тип), а все виды третьей группы характеризуются 375 пн сатДНК («Rattus» - тип сегментации). По кариологическому сходству северо-палеарктические виды подразделяются на две группы, соответствующие выделенным нами, а наиболее обособленна - южноазиатская A.argenteus, имеющая в своем кариотипе не 48, как все лесные и полевые мыши, а 46 хромосом (Yoshida et al., 1975). Филогенетические реконструкции рода Apodemus по базам данных изозимной изменчивое™ также поддерживают такое деление видов на группы, высоко дифференцируя A.peninsulae , A.speciosus и A.argenteus (Межжерин, Зыков, 1991;

Павленко, 1990). Высокую дискретность сравниваемых групп видов демонстриру( схема распределения попарных генетических дистанцьм (рис. 18).

Slv Als arg

Slv I I I I О

Slv+Als arg

Als I I [=□

Slv Als

arg r~ I

0 1 D

Рисунок 18

Распределение относительных межвидовых генетических дистанций лесных и полевь

мышей по данным ПДРФ яДНК

Slv- Sylvaticus, Als- Alsomys, arg-Apodemus argenteus

Взаиморасположение эволюционно более старых видов на эволюционнс древе относительно стабильно, в то время как в эволюционно молодой группе он может изменяться в зависимости от применяемого метода обработки данны Наиболее близкими в филогенетическом аспекте, не всегда подтверждаемом н уровне фенотипического сходства, определяются либо A.pontlcus с A.flavicollis , лиЕ A.ponticus с A.fulvipectus . Простым дефицитом взвешиваемых признаков там колебания объяснить, с нашей точки зрения, невозможно, т.к. аналогичный характе неустойчивости подтверждается по крайней мере и на изозимном уровне (Межжерин др., 1992; Pavlenko, 1995). Скорее всего, этот результат отражает особенное" формообразования и молекулярной эволюции лесных и полевых мышей.

Наиболее существенное отличие наших данных от зоологическс классификации заключается в возможности выделения A.argenteus в самостоятельнь таксон не ниже подродового статуса, т.к. данный вид формирует отдельну филетическую ветвь, имеющую высокие вероятностные оценки ее монофилетичнос и имеет самые высокие (на уровне межродовых) генетические дистанции с остальным предствителями Apodemus.

Четкая дифференциация A.peninsulae с A.agrarius в сочетании с высокс вероятностью монофилетичности их происхождения коррелирует с неоднозначность положения указанных видов во внутриродовых зоологических систем; классификации, относящих виды либо к одному (Alsomys) (Громов, Баранова, 1981 либо к двум (Alsomys и Apodemus) (Павлинов и др., 1995; Musser, Carlcton, 199: разным подродам. Кластеризация еврокавказских видов в единую монофилетическу группу полностью соответствует зоологической классификации рода Apodemu никогда не имевшей на этот счет серьезных разногласий. Примечательное положения A.speciosus на филогенетической схеме заключается в его больше близости к эволюционно молодой группе еврокавказских видов, что другим генетическими исследованиями не отмечалось. Напротив, данные анализа ПДРФ рД1-ядер определяли A.speciosus как эволюционно более старый и наиболе дивергировавший среди лесных и полевых мышей вид ßuzuki etal., 1990).

Результаты сравнительного анализа ядерного генома позволяют, на на взгляд, 1) сделать заключение о более высокой специализации как еврокавказею

видов лесных мышей, так и южнопалеарктической лесной мыши по сравнению с другими видами, предположить 2) наличие более тесных филогенетических связей южнопалеарктической фауны лесных мышей с еврокавказской и 3) существование общего для северопалеарктических видов генетического пула у североазиатских видов, а также 4) рассматривать южную Азию как реальный центр формообразования Аробетиз.

5.2.8. Секвенирование гена цитохрома Ь и реконструкция матриархальныхсвязей лесных и полевых мышей рода АроИетиэ

Филогенетические исследования животных и растений, способствуюнуе прояснению систематического положения видов, чаще проводятся на уровне мтДНК. Это объясняется наличием у митохондриального генома ряда привлекательных черт, таких как невысокая молекулярная масса, отсутствие повторяющихся последовательностей и межгенных спейсеров, консервативность расположения генов в молекуле, высокие скорости эволюции, отсутствие в эволюционной истории рекомбинаций, материнский тип наследования. В целом результаты исследований мтДНК могут представлять не только самостоятельный интерес, но также служить тестом для эволюционных гипотез, основанных на другихпризнаках.

Согласно современным представлениям, использование в качестве молекулярного маркера в эволюционных и филогенетических исследованиях последовательности гена цитохрома Ь мтДНК является наиболее предпочтительным для количественной оценки степени генетической разобщенности родственных видов и создания для них корректной схемы эволюционных взаимоотношений. Хотя ясно, что в силу особенностей наследования филогения, опирающаяся на результаты сравнения мтДНК, может отличаться от построенной традиционно (т.е. зоологической) и по результатам исследований на уровне ядерного генома.

Нами проанализирован участок последовательности гена цитохрома Ь митохондриального генома девяти видов Аробетиз, и на базе полученных данных сконструировано гипотетическое филогенетическое древо. Использовали фрагмент первой половины белок-кодирующей области размером 402 пн, с инициирующим кодоном АТв (Челомина и др., 1998).

Показано, что эволюционно консервативные и лабильные последовательности анализированного участка мтДНК камдого вида перемежаются неравномерно. По 20-ти позициям произошли родоспецифические замены, разделяющие всех лесных мышей с серой крысой. Еще по 31-ой позиции мутировало более половины видов. Замены в трех позициях (192, 348 и 354 пн) дифференцируют еврокавказские и азиатские виды Аробетиэ . Примерно четверть инвариантных для рода лесных мышей нуклеотидных последовательностей гена цитохрома Ь сгруппирована в непродолжительные кластеры длиной от 7-12 пн (позиции 1-8, 88-95, 152-164, 178-188, 211-221 и 262-268 пн нуклеотидов от инициирующего кодоны). Аналогичной длины вариабельные кластеры отсутствуют, хотя можно выделить несколько зон повышенной мутации в пределах анализируемого участка мтДНК (рис. 19). При сравнении полученных последовательностей выявлено, что большинство мутаций являются синонимичными, а общее число транзиций преобладает над числом трансверсий (табл. 2).

В популяциях все замены являются синонимичными, с преобладанием С-Ттипа (62% по сравнению с 38% для замен типа А-С). Замены типа трансверсий обнаружены только при межвидовом и межродовом сравнении. Их доля в целом составила 38%. Как и в межпопуляционном анализе, при таком варианте сравнения чаще всего (51% всех замен) регистрировались С-Т транзиции. Сопоставление характера замен в позициях, отличающих все (или 8 из 9) виды лесных мышей от внешней группы (так называемые родоспецифичные сайты), выявило преобладание в них трансверсий (в

основном типа С-А), а также более высокое содержание О-С и (особенно) С-Т заме1 Интересно, что редкие типы трансверсий обнаруживаются лишь уэволюционно старь видов (А.адгапш, А.агдеМеив, А.ветоЮз) и (одна замена) у А.вуЫаИсиз. Соотношену транзиций и трансверсий изменяется в пользу последних с увеличением времен дивергенции сравниваемых видов.

35 -

30 -

25 - —

20 П р >—] П [—|

15 - — Г ~1 ~

10 - "" - — 5 — _

о [т.!...........I.I,. I I Ii II I II I II II I I H I I I 1 II .1..... I,,) 11 | I I I _

& до с? ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ,

Рисунок 19

Распределение мутационных замен на участке гена цитохрома b мтДНК 9 виде Apodemus

Принимая скорость эволюции мтДНК равной 2.5% замен оснований за 1 мг лет, как это рассчитано для млекопитающих (Irwin et al., 1991; Meyer et al., 1990), м получили временной интервал эволюции Apodemus , равный немногим более 6 мг лет. Эволюционный возраст самой молодой пары видов (A.ponticus/A.flavicollis оценивается примерно в 2.5 млн лет, а всей еврокавказской группы - в 4 млн ле Дифференциация островных популяций A.speciosus проходила 100 тыс. -1.5 млн ле назад.

Реконструированное молекулярно-филогенетическое древо, отражающе матриархальные связи видов лесных и полевых мышей, в целом согласуется аналогичными построениями, основанными на анализе ПДРФ суммарной яДН (рис.20). Оба подхода дифференцируют род Apodemus на три групт южнопалеарктическую, а также восточную и западную северной Палеарктик! Примечательно, что наблюдается полное совпадение деления видов на группы г сходству их митохондриального генома с делением этих же видов по типам внешне сегментации последовательностей сатДНК. Этот факт позволяет сделать заключение согласованности молекулярной эволюции высоких повторов ДНК ядерного генома индивидуальных генов мтДНК лесных и полевых мышей, а также предполагай отсутствие определяющего влияния на этот процесс межвидовой интрогрессивнс гибридизации, если она имела место в истории данной группы видов. Принципиалы-новый и важный момент полученных результатов заключается в строгс

дифференциации между собой азиатских видов на северо- и южнопалеарктическую группы.

Таблица 2

Характер нуклеотидных замен в области гена цитохрома Ь МТДНК некоторых животных

Типы замен Лесные и полевые мыши Кошачьи* Подкамен-

основании щиковые рыбы**

популяции виды родоспец-е

сайты

С-Т 62 51 15 60 35

в-А 38 11 22 20 43

100 62 37 81 78

С-А 0 26 42 9 20

Т-А 0 11 17 6 1

в-С 0 1 1 1 1.5

й-Т 0 1 3 2 1

38 63 19 22.5

транзиции/

трансверсии 1.63 0.87 4.26 3.55

* - по данным Масуды с соавторами (Маэис1а е! а1., 1994) " - поданным Кирильчик с соавторами (1995)

Плезиоморфность большинства объединяющих признаков позволила российским зоологам допустить возможность парафилетического происхождения северопалеарктических грызунов, объединяемых в секцию «Аробетиэ», включающую лесных и полевых мышей (Павлинов и др., 1995). На основании данных сравнительной морфометрии, цитогенетики и биохимического тестирования авторы пришли также к выводу о целесообразности присвоения подродам Аробетив и Бу^аетиэ родового статуса. На базе полученных нами результатов вряд ли можно сделать определенный вывод относительно числа исходных форм исследуемого таксона. Однако они ясно указывают, что в его формировании по материнской линии могли принимать участие по крайне мере три типа мышей-родоначальниц кахедой из трех групп (филумов). Мы полагаем, что высокая дифференциация каждого филума как по мтДНК, так и по высокоповторяющэйся яДНК (см. выше), вполне может служить поводом для пересмотра их таксономического статуса, тем более, что деление на филумы совпадает с высокой морфологической, кариологической и биохимической дифференциацией.

Основываясь на том, что географическое распределение определенных типов мтДНК в популяциях животных оказывается тесно связанным с историей расселения видов, а также учитывая глубокую зависимость лесных мышей от лесных ресурсов, можно предположить, что род Ародетиз имеет южноазиатское происхождение, а заселение северной Палеарктики лесными мышами шло с азиатского юга по двум направлениям: восточному и западному. Являясь более длительным, западный путь смог обеспечить формообразование в эволюционном отношении наиболее молодой и поэтому генетически менее дифференцированной, но более многочисленной группы видов, объединяемой ныне в род ву^аетиз. Более древний путь оставил высоко дивергировавшую группу видов, объединение которой даже в два таксона подродового ранга, что мы имеем на сегодняшний день, представляется весьма сомнительным. К сожалению, мы располагаем лишь фрагментарными данными генетического анализа

континентальных видов кжноазиатской фауны, без которой общая картина эволюции филогении Ародетиэ не может считаться окончательно решенной. Первой от обще предка отделилась А.агдеМеив (южнопалеарктический вид), обитающая на японсю островах, до сих пор сохранивших без значительной деструкции третичные ле< (Мю1ке, 1989). В результате второй радиации произошли восточноазиатские виды, третьей - еврокавказские (северопалеарктическая фауна). Происхождение заселение лесных мышей тесно связано с глобальными климатическими геологическими изменениями, а также экспансией широколиственных лесов.

NJ, яДНК

NJ, мтДНК

— Pt

— fv*

— ur*

-sp -ag -P

*ur-*s • *fv " sp -ag • sem -

-arg arg

Рисунок 20

Филогенетические древа лесных и полевых мышей по данным ПДРФ яДНК секвенирования 402 пн участка гена цитохрома b мтДНК, построенные NJ методом, s- sylvaticus, f- flavicollis, pt- ponticus, fv- fulvipectus, ur- uralensis, p- peninsulae, s speciosus, sem- serrotus, ag- agrarius, arg- argenteus, R- Rattus norvegicus

Несовпадение деталей молекулярных филогений, выведенных по даннь первичной последовательности гена цитохрома b мтДНК и по результатам анали ядерных генов (ПДРФ рДНК и секвенирования гена IRBP) (Suzuki et al., 1990; Serizav et al., 1999), видимо, следует расценивать как свидетельство сложного эволюционно пути лесных и полевых мышей, включая особенности их молекулярной эволюции формообразовательных процессов. Вместе с тем, согласованность ключев! положений системы матриархальных связей с филогенией, выведенной по даннь ПДРФ высокоповторяющейся яДНК, может свидетельствовать об един< эволюционной стратегии видов лесных и полевых мышей на уровне ядерного митохондриального геномов, как бы сложно не проходили их видообразование эволюция.

5.2.9. Гипотетическая схема организации и эволюции сатДЖ мышевидных

грызунов

Согласно данной схемы, построенной по совокупности собственных литературных данных, при всем отличии во внешней сегментации повтор сатД! лесных, полевых, домовых мышей и крыс имеет один и тот же тип внутренн! сегментации, т.е. состоит из двух базисных последовательностей длиной 28 и 30 г Множественность вариантов комбинаций одних и тех же базисн!

последовательностей обеспечивает высокое разнообразие типов сатДНК при их безусловном (большем или меньшем) филогенетическом родстве. Таксоны надвидового и родового рангов отличаются размерными характеристиками внешней сегментации сатДНК

5.2.10. Генетическое разнообразие, молекулярное типироваже и таксономическая диагностика малой лесной мыши

Генетическая дискретность малой лесной мыши А.(3).ига1еп$13 и ее конспецифичность по обширному ареалу от Центральной Европы на западе до югозападного Зауралья на востоке были подтверждены по ряду морфологических отличий, результатам исследования белкового полиморфизма и экспериментам по гибридизации. Хотя сам факт существования как генетической, так и эколого-морфологической дифференциации малой лесной мыши сомнений не вызывает, существует ряд систематических проблем, требующих привлечения современных методов исследования (Ог1оу е( а1., 1996; Богданов, 2000).

Методом ГЧАРО-РС[Ч анализа мы провели сравнение дискретных хромосомных форм А.(8).ига1еп513, четко различающихся по содержанию С-окрашиваемого гетерохроматина, а также локализации ядрышкового организатора (ЯОР). Хотя точно границы ареалов данных популяций еще не определены, установлено, что восточноевропеская форма заселяет Центральный и Центрально-Черноземный регионы России, Среднее Поволжье, Южный Урал, Междуречье Волги и Урала; азиатская форма - области восточного Казахстана, Узбекистан, Туркмению, а также Непал. Предполагается, что в образовании двух данных форм основную роль сыграла непродолжительная географическая изоляция исходно широко распространенных популяционных комплексов (Богданов, 2000).

ОРР-08 ОРР-05 ОРС-05

123456 123456 123456

Рисунок 21.

(ЧАРО-РСК спектры мелкой лесной мыши (1-3 - восточноевропейская, 4-6 - азиатская популяции).

При анализе продуктов амплификации с каждым праймером между географическими формами обнаруживались вполне определенные отличия; высокая диввергенция малой лесной мыши с восточноазиатской и полевой мышами была очевидной (рис.21). Примечательно, что результаты амплификации с праймером ОРС-05 выявили высокую корреляцию мэлекулярных данных с кариологическигм, а именно:

все особи из европейской популяции Б.ига/епз/з, имеющие мажорные С-бло> характеризовались яркими ДНК-полосами, в то время как у азиатских форм, б аналогичных блоков, в данной части спектра идентифицировались слабо выраженж фрагменты.

9 7 6 8 5 |

о-ннны

1 10 11 12

0.32 ,

иРвМА

д МБТ

А.ига1епз'13, Европа □

Л.ига/елгв, Азия

А.рептзШае

А.адгаг'шз

СЕ

гС

3 10 11 12 2

6 8 7 9

А з и я

в р

о п а

У рептзи1ае и адгапиг

Рисунок 22

Дендрограммы генетического сходства и филогенетических связей азиатских европейских популяций малой лесной мыши, построенные по данным ЯАРО-Р( анализа.

Всего в геномах малых лесных мышей (малая выборка) идентифицировано 1 признака, из них 68% - полиморфных, в том числе 62% для восточно-европейски> 65% - для азиатских форм. Доля фиксированных отличий составила 6.8% для первое 4.9% - для второй популяции. Генетические дистанции для восточноевропейск мышей оказались выше, чем для азиатских: 0=0.20 и 0=0.15, соответствен! Генетические дистанции между географическими популяциями превыша внутрипопуляционные более, чем в два раза: Р=0.43. Такие различия (их уровни соотношения) вполне сопоставимы с теми, что наблюдаются при классическ (географическом) видообразовании грызунов на изозимном уровне (Фрисм;

Павленко, 1987). Распределение попарных генетических дистанций малой лесной мыши отличалось от нормального и имело два пика, что является показателем высокой генетической неоднородности выборки. Генный поток между популяциями оценивался по Fst (0.59) и Nm (0.35). Самые высокие оценки генетических дистанций получены при сравнении uralensis с peninsulae и agrarius: D=0.84 и D=1.07, соответственно, что согласуется с имеющимися по данной группе данными (Межжерин, Зыков, 1991; Челомина и др., 1998). UPGMA NJ дендрограммы распределяют малую лесную мышь согласно географической принадлежности - в два кластера, причем азиатские формы формируют два подкластера. MST-древо такое деление поддерживает, указывая, что восточноевропейские и азиатские популяции uralensis объединяются через мышь Туркмении (рис. 22).

Таким образом, анализ результатов RAPD-PCR свидетельствует о достаточно высокой генетической дифференциации малых лесных мышей азиатской и восточноевропейской частей ареала. Ограниченный генный поток между ними, значительные значения генетических дистанций и наличие фиксированных геномных отличий позволяет допустить, что сравниваемые формы вполне могут быть видами на стадии становления, или полувидами в рамках концепции надвида. Однако на данном этапе эта проблема наврядли может считаться окончательно решенной.

5.2.11. Особенности генетического разнообразия и эволюционные аспекты колонизации северовосточной Азии восточноазиатской лесной мышью

Фауна мелких млекопитающих северовосточной Азии, ареал которых включает множество разделенных географически доменов, представляет несомненный интерес для эволюционной биологии, экологии, историко-фаунистических реконструкций и понимания общей направленности генетической дифференциации. Восточноазиатская лесная мышь A.peninsulae населяет наиболее северные пространства азиатской части ареала Apodemus. Приуроченность экологического оптимума к хвойно-широколиственным, широколиственным и долинным лесам позволяет считать его неморальным фаунистическим элементом восточноазиатского генезиса. Хотя неарктические связи у него не прослеживаются, наблюдается тесная, на уровне эндемичных видов, связь с фауной Японии и северовосточного Китая (Костенко, 1997).

Результаты собственных исследований (Челомина, 1993; 1996; Челомина и др., 1998 а, б), а также данные других авторов (Suzuki et al., 1990; Serizawa et al, 1999) указывают на продолжительную, до 10 млн лет, эволюционную историю восточноазиатской лесной мыши. Тем не менее, внутри вида отсутствует ясно выраженная морфологическая и кариологическая подвидовая дифференциация, а белковый полиморфизм между популяциями, относящимися к разным морфологическим подвидам, соответствует минимальным значениям межпопуляционных отличий в различных подвидах грызунов (Воронцов и др., 1977; Павленко, 1997).

Результаты анализа изменчивости быстро эволюционирующей последовательности участка гена цитохрома b мтДНК (Serizawa, Suzuki, Iwasa, Tsuchiya, Kartavtseva, Pavlenko, Cheiomina et al., 2000) показали, что A.peninsulae имеет два клада мтДНК с центрами их географической локализации на Корейском полуострове и Приморском крае российского Дальнего Востока. Низкие, согласно полученным данным, генетические дистанции между гаплотипами мтДНК предполагают 1-15 000 летний период внутривидовой дифференциации восточноазиатской лесной мыши исследуемых территорий. Таким образом, широкая экспансия восточноазиатской лесной мыши началась после глобальных климатических изменений, в результате которых многие виды крупных млекопитающих пережили демографическую катастрофу и исчезли, либо, как это показано для тигра, прошли

через генетическое «горлышко бутылки». Низкий уровень различий по мтДНК меж, лесными мышами Кореи и Приморья контрастирует с высокой меж-внутрипопуляционной дифференциацией мтДНК родственных ей видов как азиатского (А.адгапиз и А.зресЬэиз) (КоИе, 1986; Челомина и др., 1998), так европейского (А^у/уа^ак и А.Пау/соШз) (Теде^гот, иаага1а, 1989) частей ареа.) Арос1етиз. В этой связи возникает вопрос о возможности события реколонизац) северовосточной Азии восточноазиатской лесной мышью (хотя даннь палеонтологических находок Аробетиз на этих территория отсутствую Существование двух кладов мтДНК для популяций Корейского полуострова Приморья соответствуют палеографическим данным по восточной Азии (Твикай 1985; Назаренко, 1990). Указанные территории могут рассматриваться к послеледниковые рефугиумы, являющиеся резервуаром генетического разнообраз! А.рептзи1ае, из которого в период Голоценового оптимума эта мышь широ распространилась по Дальнему Востоку и Сибири.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Современная экология - стремительно развивающаяся наука, поэтому < понятийный, методологический и теоретический аппараты нельзя счита окончательно сложившимися. Молекулярная экология - одно из наиболее интенсив! разрабатывающихся направлений, представляющая синтез классической экологи филогенетики и популяционной молекулярной биологии. Проблема биоразнообраз животных рассматривалась нами в рамках именно этого направления, на пример ярких биологических явлений. Совокупность полученных данных указывает, ч дискретность - основная черта молекулярной организации эукариотического геном Тем самым подтверждается основной тезис о том, что дискретность жизни - один наиболее фундамнтальных законов природы. Полученные результаты являют одновременно подтверждением единства структуры и функции органического мир главной стратегии его развития. Биоразнообразие - это сотни тысяч виде разнообразие внутри видов и популяций, т.е. разнообразие на каждом уров! организации биосферы - от генов до экосистем. Биоразнообразие имеет четк^ функциональную основу и является компромиссом между генетически заложеннь потенциалом формообразования и ресурсами среды. Каждый компоне биоразнообразия формируется системой, в которую он входит, и, в свою очере; влияет на эту систему, определяя особенности ее структуры и функционировав Только системный подход дает возможность в полной мере оценить суть т экологических и биологических явлений, с которыми мы сталкиваемся сейчас, прогнозировать будущие события. Поскольку эволюция направлена на увеличен! разнообразия, ключевыми в исследовании механизмов взаимодействия организма средой, а, следовательно, и принципов формирования биоразнообразия (альф разнообразия) являются молекулярно-генетические методы, обогащенм эволюционным подходом. Разумное использование генофонда растений и животнь его долговременное сохранение возможно лишь при ясном понимании процессов взаимодействий между всеми компонентами экосистем и прежде всего - от познан разнообразия. Процесс этого познания неисчерпаем, т.к. с каждым столетж возникают новые задачи, решаются которые всем методическим и методологичесю комплексом биологических наук.

ВЫВОДЫ

1. Получены новые данные об особенностях молекулярной организации и эволюции ядерного и митохондриального геномов ряда видов беспозвоночных и позвоночных. Анализ кинетики реассоциации, особенностей ПДРФ суммарной яДНК и мутационных замен структурных генов (цитохрома b мтДНК, рРНК ядер) подтверждает тезис о том, что дискретность жизни - один из наиболее фундаментальных законов природы.

2. Процесс эволюционной адаптации видов к изменениям среды обитания на популяционном уровне может сопровождаться крупными геномными реорганизациями: феномен макромутаций, вовлекающих около 20% генома, принадлежащих к фракции умеренных повторов, обнаружен у двух видов дальневосточных лососей.

3. Обнаружен «универсальный» характер расщепления эндонуклеазами рестрикции геномной ДНК свободноживущих червей, что может рассматриваться в качестве потенциальной возможности молекулярной преадаптации видов к паразитизму, как частному случаю приспособления к изменениям условий существования. Данные легли в основу гипотезы о «спиральном» характере изменения ПДРФ клеточной ДНК эукариот во времени.

4. Впервые с использованием RAPD-PCR метода проведено молекулярно-генетическое типирование двух представителей крупных кошек Российсюго Дальнего Востока, занесенных в категорию №1 международной Красной книги. Обнаружено, что уровень генетического разнообразия ниже у амурского тигра (по численности на порядок превосходящего дальневосточного леопарда). Отсутствие прямой связи между уровнем генетического разнообразия и численностью популяций объясняется различными адаптивными стратегиями видов. Делается вывод, что первостепенную угрозу для выживания восстановленной популяции амурского тигра представляет ее генетическая обедненность, а для популяции дальневосточного леопарда - физическое истребление.

5. Результаты сравнения степени генетического родства дальневосточных леопардов из природных популяций и зоопарка между собой и с персидским подвидом подтверждают существующие предположения о том, что большинство представителей дальневосточного подвида, содержащихся в неволе, не являются генетически «чистыми»формами. Данные рекомендуется учитывать при разработке адекватных програм сохранения и реинтродукции видов в природу.

6. Результаты RAPD-PCR анализа генетической изменчивости трех дальневосточных видов рода уток свидетельствуют, что реальную угрозу генофонду представляет естественная межвидовая гибридизация, которая может стать причиной поглощения одного вида другим, возникающая в условиях перекрывания ареалов в результате глобальных климатических изменений и усиливающегося антропогенного преса на естественные места обитания видов.

7. На основании данных RAPD-PCR анализа показано, что естественная гибридизация между видами и подвидами животных увеличивает генетическое разнообразие природных популяций. Локальные выборки животных из зон гибридизации характеризуются соответственно континуальным или дискретным характером распределения RAPD-PCR спектров.

8. RAPD-PCR анализ домовой мыши обширной части ареала обнаружил свидетельства гибридизации на юге Приморья между формами musculus и domesticus, отсутствие у синантропных грызунов строгой зависимости между уровнями генетической дифференциации и пространственной изоляции популяций и возможность концентрации генетического разнообразия в зонах экологического оптимума.

9. Согласно данным распределения ядерных (КАРР) и цитоплазматических (участ гена цитохрома Ь мтДНК) маркеров, восточноазиатская лесная мышь имеет д центра генетическго разнообразия, откуда в современность она распространила по всему Дальнему Востоку и Сибири; малая лесная мышь исследованной час ареала представлена двумя высоко дивергировавшими популяциями, что мож быть использовано в качестве аргумента для таксономической ревизии.

10. Обнаружен низкий межвидовой ПДРФ ДНК в группе относитель узкоспециализированных высших песчанок, характеризующихся значительны! отличиями по основному набору хромосом (2п=44, 50, 72) и широкий спектр ГЩ ДНК у кариотипически стабильных (2п=48) широкоадаптированных лесных полевых мышей. Показано существование прямых корреляций меж особенностями организации высоких повторов и тонкой структуры хромосом, также эволюционным возрастом видов, и обратных - между ПДРФ клеточной ДНЬ полиморфизмом кариотипических чисел. Таким образом, сальтационн видообразование сопровождается максимальным сохранением молекулярн структуры высоких повторов, градуальное - накоплением мутаций во времени.

11.Обнаружено, что кариологически наиболее лабильные в родственной группе ви^ грызунов по основному (малоазийская песчанка) или добавочно (восточноазиатская лесная мышь) набору хромосом отличаются содержанием геномах низкомолекулярных сателлитных компонентов. Предложена схе( последовательных эволюционных событий, сопряженных с появлением так сатДНК и ведущих, через множество хромосомных разрывов, к образованию вид; высоким кариотипическим числом - малоазийской песчанки.

12.0бнаружены новые для рода Аробетиэ типы внешней сегментации сатДНК, >-отвергает ранее существовавшее представление о сатДНК лесных мышей > эволюционно консервативном компоненте генома. Типы сатДНК коррелируют гаплотипами мтДНК, географическим распространением и таксономическ классификацией лесных и полевых мышей. По совокупности экспериментальн данных сконструирована гипотетическая схема молекулярной эволюции сатД мышевидных грызунов.

13. По данным ПДРФ ДНК Ароёетиз выявлена корреляция размерных количественных характеристик часто повторяющихся тандемных диспергированных последовательностей нежду собой и с эволюционным возраст видов. Делается заключение о согласованной эволюции различных семейс повторов. Обнаруженные закономерности характерны для других исспедованн таксонов животных.

14.no данным изменчивости гена цитохрома Ь митохондриальной ДНК и ПД1 геномной ДНК реконструированы схемы молекулярных филогений лесных полевых мышей; получены свидетельства реальности гибридогенн< формообразования и конвергентной эволюции в отдельных филетических лин1 лесных и полевых мышей; сделан вывод о монофилетичности европейских вид; объединяемых ныне в род Бу^аетиз, и полифилетичности азиатских вид Обосновывается положение о целесообразности придания группе лесных полевых мышей надродового статуса с выводом восточноазиатских видов таксоны родового (А.агдеМеиз) и подродовых (А.Адгаг'шэ, А.рептзи1ае, А.зресюз рангов.

СПИСОК РАБОТ, ОП/БЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Васильева B.C., Глушанкова М.А., Жирмунский A.B., Косюк (Челомина) Г.Н. 1969. Теплоустойчивость клеток и мышечной альдолазы морских ежей рода Strongylocentrotus и двустворчатых моллюсков семейства Pectinidae в связи с условиями существования видов// В сб.: Научные труды Института биологии моря ДВО РАН. Вып.1. Владивосток, С.4648.

2. Баренбойм Г.М., Борхсениус С.Н., Жирмунский A.B., Косюк (Челомина) Г.Н., Щелчков Б.В. 1969. Сравнительное исследование тепловой денатурации нуклеотидных комплексов спермы двух близких видов морских ежей// В сб.: Научные труды Института биологии моря ДВО РАН. Вып.1. Владивосток, С.29-34.

3. Vorob'ev V.l., Kosjuk G.N. 1974. Distribution of repetitive and nonrepetitive nucleotide sequences in the DNA of sea urchin// FEBS letters. V.47. P.43-46.

4. Косюк (Челомина) Г.Н. Распределение повторяющихся и неповторяющихся нуклеотидных последовательностей ДНК в эмбрионах морского ежа и транскрипция неповторяющихся последовательностей в раннем эмбриогенезе. Автореф. дисс... канд. биол. наук. Ленинград, 1977, 21с.

5. Косюк (Челомина) Г.Н., Борхсениус С.Н. 1981. Внутрипопуляционные различия в структурах геномов у двух видов лососевых рыб/ Молек.биол. Т.15. С.547-553.

6. Косюк (Челомина) Г.Н., Пучкова Л.В., Заленский А.0.1983. Идентификация информационных РНК, кодирующих синтез протаминоподобных белков хроматина спермиев мидии Грея// В кн.: Биология мидии Грея/ Ред.Свешников В.А., М.: Наука, С.60-63.

7. Косюк (Челомина) Г.Н. 1984. Организация генома мидии Грея// Биология моря. С.23-27.

8. Заленский А.О., Косюк (Челомина) Г.Н. 1984. Идентификация и частичная характеристика мРНК для спермийспецифических белков хроматина моллюска (Crenomytilus grayanus )// Молек.биол. Т.20. С.838-844.

9. Челомина Г.Н., Гинатуллина Л.К., Мирошниченко И.Л., Гинатуллин A.A. 1984. Рестрикционный анализ митохондриальной ДНК корюшки Osmerus eperlamus dentex /IV Всесоюзн. Биохим. Съезд. Тезисы доп. М.: Наука. С.373-374

10. Челомина Г.Н. 1987. Структура и эволюция митохондриальной ДНК млекопитающих (обзор)// В сб.: Вопросы эволюционной зоологии и генетики млекопитающих. Владивосток, С.67-87.

11.Челомина Г.Н., Подгорная О.И. 1987. Рестрикционньй анализ яДНК песчанок// V Всесоюз. Съезд Генет. Тезисы докладов. М.:Наука, С.294-295.

12.Челомина Г.Н. 1988. Анализ митохондриального генома домовых мышей из Приморья// Всесоз. Совещ. по грызунам. Тезисы докл. М.:Наука. Т.З. С.137.

13.Челомина Г.Н. 1989. Эволюция митохондриального генома позвоночных (обзор)//В сб.: Современные подходы изучения изменчивости позвоночных. Владивосток: ДВО РАН. С.32-42.

14. Челомина Г.Н. 1990. Анализ EcoRI последовательностей ДНК песчанок// V Съезд ВТО. Тезисы докладов. М.:Наука. С. 109.

15.Челомина Г.Н. 1990. Рестрикционный анализ мтДНК двух представителей отряда хищных// Эволюционные генетические исследования млекопитающих Матер. Всесоюз. Совещ. Генет. Владивосток: ДВО РАН. С.33-34.

16. Челомина Г.Н., Кораблев В.П. 1990. Сравнительный анализ ядерного и митохондриального генома Берингийского суслика//Там же, С.110-112.

17.Челомина Г.Н., Коробицына К.В., Картавцева И.В. 1990. Повторяющаяся ДНК, хромосомный полиморфизм и видообразование песчанок// Генетика. Т.26. С. 14691477.

18. Челомина Г.Н., Пашкова J1.H. 1991. Универсальный характер расщеплен частоповторяющейся ДНК червей эндонуклеазами рестрикции// Генетика. Т.27. 1152-1157.

19.Chelomina G.N., Pashkova L.N., Kruykov А.Р. 1991. Thr restriction analysis of nDI from corvids (Passeriformes, Aves)// Сотр. Biochem. Physiol. V.100B. P.601-604.

20.Крюков А.П., Уфыркина О.В., Челомина Г.Н. 1992. Анализ геномов ворон (Corvids Passeriformes) из зоны перекрывающихся ареалов и гибридизации// Генетика. T.Í С.136-140.

21. Челомина Г.Н. 1993. Дивергенция двух семейств повторяющейся ДНК лесн мышей рода Apodemus II Генетика. Т.29. С.1163-1171.

22. Челомина Г.Н. 1993. Дивергенция ГЦ-богатых сайтов рестрикции частоповторяющейся ДНК лесных мышей// Генетика. Т.29. С.1172-1179.

23.Челомина Г.Н. 1994. Дивергенция высокоповторяющейся ДНК лесных мышей// Съезд ВОГиС. Тезисы докладов. Генетика. Т.ЗО. С. 175.

24.Челомина Г.Н., Иванов С.В., Крюков А.П. 1995. Особенности ПД1 частоповторяющейся ДНК ворон// Генетика. Т.31. С.174-179.

25.Челомина Г.Н., Ляпунова Е.А, Воронцов Н.Н., Сучия К. 1995. Молекуляр> генетическое типирование трех представителей транспалеарктического ро лесных и полевых мышей (Apodemus , Muridae, Rodentia)// Генетика. Т.31. С. 82 824.

26.Chelomina G.N. 1995. Molecular-genetic diversity of wood mice species// XVIII Рас Science Congress. Beijing, China, GS-PO-08P-28.

27.Chelomina G.N. 1995. Molecular-genetic typing of 3 rodent forms beloning to I transpalearctic genus Apodemus (Muridae, Rodentia)// V Intern. Conf. Rodent a Spatium. Abstracts. Rabat, Morocco. P. 129.

28.Chelomina G.N. 1995. Rodent satDNA evolution: hypothesis and fac Intern.Symp.'Modern achievements in population, evolutionary and ecological genetic MAPEEG-95. Vladivostok, Russia. P.1.

29. Челомина Г.Н. 1996. Особенности рестрикционного полиморфизма яД европейских и азиатских видов лесных мышей// Генетика. Т.32. С.13811386.

30.Chelomma G.N., Pavlenko M.V., Kartavtseva I.V., Suzuki H., Moriwaki К., Tsuchiya

1997. Evolution and phylogeny of wood mice of the genus Apodemus (Muridi Rodentia)//Ann.Symp.Rodent Soc.Japan. Abstracts. Sapporo, Japan. P.154.

31.Челомина Г.Н., Павленко M.B., Картавцева И.В., Боескоров Г.Г., Ляпунова Е. Воронцов Н.Н. 1998. Генетическая дифференциация лесных мышей Кавка сравнение изозимной, хромосомной и молекулярной дивергенции// Генетика. Т.: С. 213-225.

32.Челомина Г.Н., Сузуки X., Сучия К., Мориваки К., Ляпунова Е.А, Воронцов Н

1998. Секвенирование гена цитохрома в мтДНК и реконструкция матриархальн связей лесных и полевых мышей рода Apodemus (Muridae, Rodentia)// Генети Т.34. С. 650-661.

33. Челомина Г.Н. 1998. Молекулярная филогения лесных и полевых мышей ро Apodemus (Muridae, Rodentia) по данным рестрикционного анализа суммарн яДНЮ/ Генетика. Т.34. С. 1286-1292.

34.Chelomina G.N. 1998. RAPD-PCR analysis of Far-Eastern leopard genome// Eu American Mammal Congress. Santiago de Compostela, Spain. Abstracls, P. 274-275.

35.Chelomina G.N., Novikova S., Zhuravlev Y.N., Zakharov E. 1998. Using RAPD molecular-genetic typing and analysis of phylogenetic relationships among Anseriforrr of the Russian Far East// Intern. Symp. "Modern achievements in population, evolution; and ecological genetics". MAPEEG-98. Vladivostok, Russia. Abstracts, P. 2-3.

36.Chelomina G.N., Spiridonova L„ Pavlenko Т., Korobitsyna K.V., Frisman L.V., Yakimer

L.V., Kartavtseva I.V., Moriwaki К. 1998. RAPD analisis of mice beloning to the genus Mus: genetic differentiation, polymorphism and phytogeny // lbs., P. 3-4.

37.Kruykov A.P., Suzuki H., Chelomina G.N. 1998. Molecular analysis of phyiogenetic relations between hooded and carrion crows, forming the natural hybrid zones// lbs., P.10-11.

38. Челомина Г.Н., Спиридонова Л.Н., Козыренко M.M., Артюкова Е.В., Челомин Ю.В., Журавлев Ю.Н. 1999. Использование ПП-ПЦР анализа клеточной ДНК для оценки генетического полиморфизма и подвидовой диагностики дальневосточного леопарда Panthera pardus orientalisll Генетика. Т.35. С. 681-687.

39.Chelomina G.N., Serizawa , Suzuki H., Tsuchiya К. 1999. Molecular phylogeny and systematics of the genus Apodemus based on nuclear and mitochondrial DNA variation// 3rd European Congress of Mammology. Jayvaskyla, Finland. Abstract. P.87.

40. Челомина Г.Н., Ключникова T.B., Коробицына K.B., Фрисман Л.В., Якименко Л.В., Мориваки К. 1999. Использование RAPD анализа в генетических и таксономических исследованиях надвидового комплекса Mus // Матер. VI съезда ВТО. М.: Наука. С.275.

41.Челомина Г.Н., Спиридонова Л.Н., Мориваки К. 1999. Генетическая вариабельность домовых мышей Дальнего Востока России по данным RAPD анализа// Там же, С. 274.

42.Novikova S.M., Chelomina G.N., Zhuravlev Ju.N. 2000. RAPD-PCR analysis of phyiogenetic relationships of three species belonging to the genus Anas: A.platyrhynchos, A.poecibrhyncha and A.strepera (Aves, Anseriformes): introgressive hybridization A.platyrhynchos xA.poecilorhyncha or paraphylitic origin of Mallard?// Proceedings Intern. Conf. "Biodiversity and dynamics ecosystems in North Eurasia". V.I. P. 79-80.

43.Chelomina G.N., Spiridonova L.N., Zhuravlev Ju.N. 2000. Comparative analysis of genetic diversity in natural populations of endangered Far-Eastern subspecies of tiger and leopard: evidences of "botlleneck" event in the Amur tiger population// lbs. P. 29-30.

44.Spiridonova L.N., Chelomina G.N., Kryukov A.P. 2000. Some peculiarities of genetic diversity among birds of Corvidae family: data of FRAPD-PCR analysis//lbs. P. 110-112.

45.3ахаров E.B., Челомина Г.Н., Журавлев Ю.Н. Выделение ДНК из музейных экспонатов бабочек (Lepidoptera, Papilionidae) и ПЦР амплификация со случайными и универсальными генспецифическими праймерами// Генетика. 2000. Т.36. С.1221-1229.

46.Spiridonova L.N., Chelomina G.N.,Yonekawa Н., Moriwaki К. Genetic variation and geographical differentiation in house mice of some regions of Central and East Asia from the Former USSR: RAPD-PCR data// Proceedings of Intern. Meetings of Biodiversity in Asia 2000. Tokyo. Japan. P. 18.

47. Serizawa K., Suzuki H., Iwasa M., Tsuchiya K., Pavlenko M., Kartavtseva I., Chelomina G., Dokuchaev N., Han S.H. An evolutionary aspect of geographic expansion of Apodemus peninsulae in North East Asia based on the mitochondrial cytochrome b gene variation// Biochem Genet. 2000. In press.

48.Chelomina G.N., Suzuki H., Kruykov A.P. Phyiogenetic relations of carrion and hooded crows (Corvidae, Aves) based on the RFLP of nuclear rDNA// Cytol.Genet. (Ukr.). 2000. In press.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Челомина, Галина Николаевна

Список сокращений

Введение

ЛАВА 1. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭВОЛЮЦИЯ

ГЕНОМА ЭУКАРИОТ (обзор литературы)

1.1 Стуктурно-функциональные особенности ядерного генома эукариот

1.2. Особенности молекулярной структуры и эволюции митохондриального генома позвоночных

1.3. Генетические исследования редких и ценных видов животных: проблемы, факты, решения.

ЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы исследования

2.2 . Условия проведения экспериментов

2.2.1. Выделение ДНК

2.2.2. Молекулярная ДНК/ДНК гибридизация в растворе (реассоцияция)

2.2.3. Рестрикционный анализ частоповторяющейся ДНК

2.2.4. Блот-гибридизация ДНК на нейлоновых фильтрах

2.2.5. Секвенирование участка гена цитохрома Ь мтДНК

2.2.6. RAPD-PCR анализ

2.2.7. Методы фено- и филогенетического анализа

ЛАВА 3. ГЕНОМНЫЕ ПРЕОБРАЗОВАНИЯ ПРИ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ

АДАПТАЦИИ ВИДОВ 105 3.1. Внутрипопуляционные отличия в структуре геномов у двух видов дальневосточных лососей

3.2. Геномные преобразования в процессе перехода видов к паразитическому образу жизни

3.3. Молекулярные и надмолекулярные изменения в связи с условиями существования видов

3.4. Особенности генетической изменчивости и таксономическая диагностика редких и ценных видов

ЛАВА 4. ОСОБЕННОСТИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ШИРОКОАРКАЛЬНЫХ ГИБРИДИЗУЮЩИХ В ПРИРОДЕ ТАКСОНОВ И ИХ ФЕНОТИПИЧЕСКИХ ГИБРИДОВ

4.1. Молекулярная организация, генетическая дифференциация и изменчивость врановых птиц

4.2. Генетическое и таксономическое разнообразие домовых мышей фауны бывшего СССР

ЛАВА 5. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭВОЛЮЦИЯ У ТАКСОНОВ С РАЗНЫМИ УРОВНЯМИ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ ПЛАСТИЧНОСТИ И ТИПОМ ХРОМОСОМНОГО ВИДООБРАЗОВАНИЯ: пунктуализм и градуализм.

5.1. Генетическая дифференциация и молекулярная эволюция высших песчанок

5.2. Генетическая дифференциация, молекулярная эволюция и таксономия лесных и полевых мышей

Введение Диссертация по биологии, на тему "Эколого-генетические и эволюционные аспекты биоразнообразия животных"

Изучение биологического разнообразия одна из актуальных проблем классической экологии. Биоразнообразие является результатом тесного взаимодействия биосферы с физической оболочкой земли, каждый вид представляет собой итог естественного исторического развития всего органического мира. Биоразнообразие необходимо для сохранения функциональной структуры биосферы и составляющих ее экосистем, а также, в силу своей эстетической ценности, - экологического здоровья человеческой популяции. Феномен видового богатства, или альфа-разнообразие, сообществ является одной из самых важных интегральных характеристик сообщества и экосистем (Уиттенер, 1980). Видовое разнообразие сообществ зависит от дробности деления экологического пространства, а последнее - от устойчивости условий. В целом число видов (S) можно определить по формуле: S=a+f3+y, где а- разнообразие видов в сообществах, (3- разнообразие сообществ, у- разнообразие биомов (Красилов, 1992). На 17-ой ассамблее МСОП (Коста-Рика, 1988) было дано следующее определение биологического разнообразия: «Изменение и изменчивость всех живых организмов. Это включает генетическую изменчивость внутри видов и их популяций, изменчивость видов и их жизненных форм, разнообразие сообществ, взаимодействий и экологических процессов, с которыми они связаны». В конечном счете, биологическое разнообразие является генетическим разнообразием, а величина и характер этого разнообразия могут быть проверены на любых организмах и иерархических уровнях, от микро- до макроэволюционных. Сохранение же биоразнообразия, видимо, следует рассматривать, прежде всего, как сохранение генофонда биосферы.

Таким образом, генетические методы исследования являются неотъемлемой и важной частью современной экологии. Бурное развитие генетика получила в нынешнем столетии, начало которого ознаменовалось переоткрытием законов Менделя. Именно тогда Г. де Фризом была разработана мутационная теория, согласно которой ведущую роль в эволюции играет видообразовательная, или мутационная изменчивость. Основные ее положения во многом совпадали с концепцией гетерогенезиса С.И.Коржинского и хорошо согласовывались с концепцией чистых линий В.Иогансена, по которой изменения происходят скачкообразно, за счет спонтанных мутаций. Таким образом, отвергалась определяющая роль естественного отбора, а ведущее значение в видообразовании придавалось генетическим факторами - "спонтанному мутационному процессу, создающему прерывистую изменчивость, а также комбинированию наследственных факторов" (Кайданов, 1996).

К выводу, что гены играют ключевую роль в функционировании и эволюции высших организмов, пришли в первой половине нашего столетия, спустя более полувека после открытия Г.Менделем в 1866 г законов, заложенных в основу генетики. Понимание молекулярных основ наследственности стало возможным после открытия в 1953 г Дж. Уотсоном и Ф.Криком химической структуры ДНК. Предложенная ими модель двойной спирали объясняла, каким образом генетическая информация может быть записана в молекуле ДНК и как данная молекула может самовоспроизводиться. Данное открытие явилось мощным стимулом для теоретических и экспериментальных работ, приведших к бурному развитию молекулярной генетики. Единство всего живого было подтверждено фактом, что генетический код един для всех организмов. Основы молекулярной филогенетики были заложены А.Н.Белозерским и его учениками в середине 20 века. Значительную роль в развитии теории молекулярной эволюции сыграла концепция «молекулярных часов» Цукеркандла и Полинга, а также теория нейтральности молекулярной эволюции Кимуры. Формализованность критериев, используемых молекулярной филогенетикой, дает ей принципиальное преимущество перед традиционным подходом, т.к, позволяет избегать субъективизма в оценке значимости тех или иных признаков, а также критериев их эволюционной продвинутости. Молекулярные основы наследственности остаются основной темой современной генетики. «Генетика - это сердцевина биологической науки, лишь в рамках генетики разнообразие жизненных форм и процессов может быть осмысленно как единое целое» (Айала,1987).

Роль генетических методов в экологических и эволюционных исследованиях заметно усилилась с разработкой таких высоких технологий, как молекулярное клонирование и секвенирование последовательностей ДНК, полимеразная цепная реакция. Появилась уникальная возможность анализа микроэволюционных процессов в малых изолированных популяциях редких видов, находящихся под жестким антропогенным прессом. Сформировалась новая отрасль знаний - молекулярная экология, открывающая дополнительные перспективы и позволяющая получать более совершенную информацию о биоразнообразии. В совокупности с молекулярной филогенетикой молекулярная экология приближает к созданию наиболее естественной системы живых организмов, открывает перспективу историко-фаунистических реконструкций, способствуя пониманию путей и механизмов развития экосистем в целом. Такая возможность имеет особое значение, поскольку относится непосредственно к историческому звену системной триады экологии (история, структура, функция) (Красилов, 1992). Значимость эволюционного подхода в биологии, поддержанная многими видными учеными, афористически выражена Ф.Добржанским (1936): «все в биологии приобретает смысл лишь в свете эволюционного учения».

Эволюционное направление в экологии во многом обязано популяционно-генетическим исследованиям, обосновавшим положение о популяции как целостной системы, представляющей элементарную единицу эволюционного процесса. Эволюционная экология, по сути, является популяционной, исследующей экологические механизмы и факторы микроэволюционного процесса, происходящие в популяциях. Изучение пределов изменчивости популяций в их естественной среде обитания - одна из наиболее важных задач эволюционной экологии (Шварц, 1980). По С.А.Северцеву эволюционная экология - это, прежде всего, анализ эволюционных преобразований экологических отношений и их влияния на процесс эволюции. Таким образом, экология оказывает важное влияние на развитие теории эволюции, заметно усиливающееся с развитием эволюционного направления. Адаптация видов к среде их обитания занимает центральное место в теории биологической эволюции и рассматривается как движущая сила эволюционного прогресса. С позиций современной синтетической теории эволюции адаптация трактуется как следствие отбора случайных мутаций. Обладая незначительным фенотипическим эффектом, они служат материалом для естественного отбора. Отсюда следует, что крайне необходимо изучение генетических механизмов адаптации организма к окружающей среде, с целью выявления генетических факторов или их систем, которые придают мелким мутациям таксономический вес и определяют эволюционный прогресс. При этом «самые сложные и самые запутанные группы наиболее привлекательны, т.к. они самым непосредственным образом ведут в проблематику видо- и рассообразования» (Ренш, 1934). Не менее важным является изучение молекулярной (генетической) природы сальтационного видообразования, сопряженного с быстрым изменением именно видовых признаков, приводящих к репродуктивной изоляции. Без такой информации невозможно создание общепризнанного определения вида, а также завершенной теории видообразования и биологической эволюции.

По имеющимся оценкам за почти 4-х миллиардный период существования жизни на Земле общее число видов, когда-либо живших на нашей планете, составляет от 200 млн до 10 мллрд (Кайданов,1996). Представление о виде лежит в основе систематики, обеспечивающей упорядочение биологического разнообразия и установления взаимосвязей между его элементами. Видовое разнообразие является основой для характеристики биоценозов и их емкости, для проведения природоохранных мероприятий и т.д. С момента возникновения научного интереса к проблеме биологического вида данная проблема, как и область эволюционных исследований в целом, представляет собой поле непрекращающихся дискуссий. Первое определение вида, его реальности и универсальности как единицы классификации было дано К.Линнеем. Основы системы эволюционных воззрений были созданы в середине 19-го века на базе общирного фактического материала, накопленного к тому времени зоологами и систематиками. Тем не менее, следует признать, что до сих пор мы не располагаем общепризнанным определением вида и завершенной теорией видообразования.

Согласно типологической концепции существующее на Земле биоразнообразие отражает наличие ограниченного числа "универсалий", т.е. типов, а ранг любого выделенного таксона конвекционален. Однако обосновывание в рамках данной концепции видовой принадлежности по некоторому стандарту в ряде случаев невозможно (например, для видов-двойников, в случае выраженных отличий, связанных с индивидуальной изменчивостью - такой как половой диморфизм и т.п.) (Майр, 1971).

Номиналистская концепция (в настоящее время представляющая преимущественно исторический интерес) отрицает наличие "реальных универсалий", признавая лишь существование конкретных особей (Майр, 1971).

Более современная (ее основные положения были сформулированны К.Йорданом еще в 1905 году) биологическая концепция (Майр, 1971), в которой впервые были учтены результаты генетических исследований, определяет вид как замкнутую генетическую систему свободно скрещивающихся популяций. От предыдущих она отличается тем, что подчеркивает популяционный аспект и генетическую интегрированность вида с его исторически сложившимся генофондом, снимая противоречие во взглядах на вид как постоянную категорию, но, вместе с тем, весьма изменчивую и пластичную. Тем не менее и она имеет ряд ограничений. С ее позиций, к примеру, невозможно доказать конспецифичность, она неприложима к организмам, культивируемым, разобщенным в пространстве и времени, размножающимся не перекрестным опылением.

Развитие генетических исследований привело к доказательству первичности генетической дискретности как критерия вида (Алтухов, Рысков, 1972; Алтухов, 1993), а также ее несоответствия репродуктивной изоляции в природе. Тем самым был предопределен возврат интереса к типологической концепции. Его итогом было создание эволюционной концепции (Cracraft, 1983), определяющей вид как единицу эволюции филума, диагносцируемого по единству генного пула (Алтухов, 1993). Основная проблема (ограничение) концепции - в определении для вида "исторически значимого периода времени". Эволюционная концепция включает в число видов мегаподвиды и полувиды.

Существуют также другие менее жесткие и категоричные критерии вида. Во всяком случае репродуктивная изоляция у них не имеет решающего значения. Это филогенетическая, эвоюционно-морфологическая и зоографическая концепции. Первая по существу очень похожа на морфологическую концепцию, «обогащенную динамизмом эволюционного подхода». Основная эволюционирующая единица в ней соответствует подвиду в понятиях биологической концепции, т.е. она дает самую низкую границу вида (Haffer, 1986; Панов, 1993).

Зоогеографическая концепция (Haffer, 1986) дает самую широкую трактовку вида, допускающую объединение нескольких репродуктивно изолированных биологических видов. Наконец, эволюционно-морфологическая концепция, в рамках которой вид по традиционной систематике соответствует подроду. Единственным критерием вида здесь служит его широкая симпатрия с другими родственными формами (Панов, 1993).

Вместе с разработкой концепций биологического вида и накоплением данных кариологической, биохимической и молекулярной генетики развивается теория механизмов видообразования. Все большую поддержку и признание в последние годы стала получать сальтационная теория, согласно которой видообразование сопряжено с быстрым (скачкообразным) изменением видовых признаков, приводящих к репродуктивной изоляции. В отличие от нее более широко распространенная концепция трактует видообразование как вероятностный внутрипопуляционный процесс, основанный на внутривидовой наследственной изменчивости, вызывающей небольшие, но накапливающиеся изменения фенотипа. Согласно данной концепции видообразование может быть лишь градуальным (т.е.постепенным).

В 20-е годы открывается видоспецифичность кариотипа, значение полиплоидии в видообразовании у высших растений, чередование ядерных фаз в эволюции низших животных. Делается первая попытка синтеза генетики и дарвинизма, положившая начало генетике природных популяций и процессу эволюционного синтеза. Происходит становление широкой концепции политипического вида, основанной прежде всего на географической изменчивости организмов. Возникла идея хромосомного видообразования, согласно которой появление структурного изменения хромосомного набора может приводить к репродуктивной изоляции новой формы (Воронцов, 1960; White, 1968, 1978). Таким образом, был сделан крупный вклад в развитие теории эволюции и систематики, определивший контакт многих биологических дисциплин между собой, и прежде всего - с генетикой (Гептнер, 1971; Воронцов,1996).

Открытие гибридного происхождения видов сначала у растений, а затем и у животных обусловило выделение синтезогенеза как одну из форм видообразования. Возврат к концепции симбиогенеза показал роль симгенеза не только в микро- и макро-, но и в мегаэволюции (Воронцов, 1980; 1984; 1996). Таким образом, общепризнанными оказались четыре формы видообразования во времени: анагенез (прогрессивное развитие таксонов без формирования боковых ветвей), кладогенез (дивергентное развитие с образованием боковых ветвей), стасигенез (процесс длительного сохранения видов) и синтезогенез, или симгенез (возникновение новых видов через слияние ранее независимых).

Новейшие данные генетики заставили вернуться к полузабытым идеям Р.Гольдшмидта о «многообещающих монстрах». Можно считать доказанной роль дупликационных мутаций в возникновении признаков высокого таксономического ранга, а также факт переноса вирусами участка генома от одного таксона к другому. Поиски объективных критериев в систематике привели к созданию нумерической таксономии, возврату к идеям В.Хеннига и построению бесчисленных кладограмм для групп разного таксономического ранга (цит. по: Воронцов, 1996).

В настоящей работе предпринята попытка исследования молекулярно-генетических основ некоторых проблем биологического вида, касающихся его объема и разнообразия, становления, экологической адаптации и эволюции. Основная цель - выявление молекулярных основ биологического разнообразия животных, т.е. механизмов и особенностей организации и эволюции эукариотического генома в целом и его отдельных компонентов, сопряженности молекулярных преобразований генома с надмолекулярной изменчивостью, формообразованием и адаптацией. Для ее решения было выбрано несколько, с нашей точки зрения наиболее ярких, модельных систем, каждая из которых призвана решать конкретные задачи.

Особенности геномных преобразований при экологической адаптации, демонстрирующие высокую пластичность эукариотического генома, включая способность к крупномасштабным реорганизациям. рассматривается на примерах карликовых популяций двух видов дальневосточных лососей по сравнению с их нормальными аналогами, а также на примере свободноживущих и паразитических червей. Расшифровка молекулярных механизмов данного феномена является принципиально важным и ключевым моментом в молекулярно-генетических исследованиях, способным разрешить ряд общебиологических проблем, в том числе касающихся роли избыточной ДНК и механизмов функционирования регуляторных генов. Особое внимание уделено универсальному характеру расщепления эндонуклеазами рестрикции геномной ДНК, обнаруженному нами у свободноживущих червей (что выделяет их среди всех изученных к настоящему времени эукариот).

Другой пример - это адаптация к антропогенному прессу редких, исчезающих и промысловых видов. Генетика редких и исчезающих видов, как правило, имеет дело с кризисной для данных видов ситуацией, характеризующейся рядом особенностей. Нами данная проблема рассматривается на примере крупных кошек, занесенных МСОП в международную Красную книгу: амурского тигра (численность которого в последние десятилетия после резкого сокращения начала восстанавливаться) и дальневосточного леопарда (находящегося под явной угрозой исчезновения). Разработка адекватных мероприятий по их разведению в неволе и восстановлению в природе невозможна без молекулярно-генетического типирования. Именно данные молекулярно-генетических исследований в совокупности с результатами экологических, этологических и физиологических исследований могут дать точную оценку генетического статуса таксона и перспективы его выживаемости. Полученные нами данные о генетическом разнообразии дальневосточных подвидов тигра и леопарда являются приоритетными и могут считаться опредленным вкладом в программу их сохранения в природе. Охотничьи виды пластинчатоклювых птиц является примером, когда целостность, либо само существование вида подвергается опасности не только по причине антропогенного пресса, но также в связи со склонностью видов к межвидовой гибридизации.

В соответствии с биологической концепцией гибридизация является одним из критериев биологического вида. Поэтому в каждом случае гибридизация порождает по крайней мере вопрос о таксономическом статусе скрещивающихся форм. На уровне генома - это событие экстраординарное. Нами проанализированы два различных примера генетической изменчивости широкоареальных видов позвоночных животных, формирующих естественные зоны гибридизации. Особенности организации гибридного генома, проблема объема вида (в плане уточнения таксономического статуса скрещивающихся форм) и его вариабельности рассматривается на примере врановых птиц. Особенности генетического полиморфизма популяций в широких зонах интрогрессивной подвидовой гибридизации, проблемы таксономической идентификации и разнообразия, а также широкой экспансии синантропных грызунов анализируются на примере домовой мыши. Результаты исследований указывают, в частности, на существование на российском Дальнем Востоке зон межвидовой гибридизации домовых мышей - факт ранее неизвестный. Обобщение результатов исследования на врановых птицах и домовых мышах позволило выявить общие черты для гибридных геномов.

Особенности видообразования и эволюции эукариотического генома, а также возможности молекулярной геносистематики рассматриваются на примере двух групп грызунов, узко- и широкоспециализированных. Следуя классификации Стегния (1894), эти виды можно отнести соответственно к эволюционно консервативным видам-терминаторам и эволюционно активным видам-генераторам (наиболее перспективным в эволюционном плане). Привлекательность данной модели состоит в том, что она рассматривает относительно близкие таксоны, различающиеся адаптивными способностями и характером кариотипической эволюции. Это дает возможность выявления и изучения молекулярных механизмов градуального (род лесных мышей, с постоянным числом основного набора хромосом) и сальтационного (род высших песчанок, с высокой вариабельностью кариотипического числа) видообразования, а также судить о сопряженности преобразований генома на молекулярном и хромосомном уровнях с формообразовательными процессами. Можно считать, что в результате проведенных нами экспериментов раскрыты и дополнены молекулярные механизмы сальтационного и градуального видообразования грызунов, для первого варианта предложена возможная схема последовательности эволюционных преобразований генома.

В целом представленные в диссертационной работе данные и их теоретическое обобщение можно рассматривать как развития нового научного направления - молекулярной экологии. Впервые в едином методическом блоке на контрастных примерах ярких биологических явлений и с позиций системной теории эволюции проведены сравнительные исследования особенностей генетического разнообразия ряда видов, представляющих разные классы позвоночных и беспозвоночных. Результаты имеют теоретическое значение в плане всестороннего изучения биоразнообразия и являются определнным вкладом в разработку современной концепции биологического вида, его границ, становления и эволюции. Полученные данные дополняют существующие представления о микроэволюционных процессах в гибридных и малых изолированных популяциях, об общих закономерностях эволюции но молекулярном уровне и ее взаимосвязи с экологической пластичностью видов, кариотипическими изменениями генома

15 эукариот, соотношении темпов эволюционных преобразований по разным системам признаков, демонстрируют необходимость применения молекулярно-генетических исследований в решении конкретных таксономических задач и разработки корректной систематики. Результаты генетического и таксономического анализа грызунов, а также врановых птиц представляют практический интерес, поскольку все эти виды являются компонентами многих биогеоценозов и переносчиками инфекционных заболеваний человека и животных, вредителями сельского хозяйства. Полученные в работе экспериментальные данные и основные выводы диссертации могут лечь в основу курсов лекций для студентов биологических специальностей.

Заключение Диссертация по теме "Экология", Челомина, Галина Николаевна

374 ВЫВОДЫ

1. Получены новые данные об особенностях молекулярной организации и эволюции ядерного и митохондриального генома животных. Анализ кинетики реассоциации, особенностей ПДРФ суммарной яДНК и мутационных замен структурных генов (цитохрома Ь мтДНК, рРНК ядер) подтверждает тезис о том, что дискретность жизни - один из наиболее фундаментальных законов природы.

2. Процесс эволюционной адаптации видов к изменениям среды обитания на популяционном уровне может сопровождаться крупными геномными реорганизациями: феномен макромутаций, вовлекающих около 20% генома, принадлежащих фракции умеренных повторов, обнаруженных в популяциях двух видов дальневосточных лососей.

4. Впервые с использованием RAPD-PCR проведено молекулярно-генетическое типирование двух представителей крупных кошек из природных популяций Российского Дальнего Востока, занесенных в категорию №1 международной Красной книги. Обнаружено, что уровень генетического разнообразия ниже у амурского тигра (по численности на порядок превосходящего дальневосточного леопарда). Отсутствие прямой связи между уровнем генетического разнообразия и численностью популяций объясняется различными адаптивными стратегиями видов. Делается вывод, что первостепенную угрозу для выживания восстановленной популяции амурского тигра представляет его генетическая обедненность, а дальневосточного леопарда - физическое истребление.

5. Результаты сравнения степени генетического родства дальневосточных леопардов из природных популяций и зоопарка между собой и с персидским подвидом подтверждают существующие предположения о том, что большинство представителей дальневосточного подвида, содержащихся в неволе, не являются генетически «чистыми» формами. Данные рекомендуется учитывать при разработке адекватных программ сохранения и реинтродукции видов в природу.

6. Результаты RAPD-PCR анализа генетической изменчивости трех дальневосточных видов рода уток свидетельствуют, что реальную угрозу генофонду представляет естественная межвидовая гибридизация, которая может стать причиной поглощения одного вида другим, возникающая в условиях перекрывания ареалов в результате глобальных климатических изменений и усиливающегося атропогенного пресса на естественные места обитания видов.

7. На основании данных RAPD-PCR анализа показано, что естественая гибридизация между видами и подвидами животных увеличивает генетическое разнообразие природных популяций. Локальные выборки животных из зон гибридизации характеризуются соответственно континуальным или дискретным характером распределения RAPD-PCR спектров.

8. RAPD-PCR анализ домовой мыши обширной части ареала обнаружил свидетельства гибридизации между формами musculus и domesticus на юге Приморья, отсутствие у синантропных грызунов строгой зависимости между уровнями генетической дифференциации и пространственной изоляции популяций и возможность концентрации генетического разнообразие в зонах экологического оптимума.

9. Согласно данным распределения ядерных (RAPD) и цитоплазматических (участок гена цитохрома b мтДНК) маркеров, восточноазиатская лесная мышь имеет два центра генетического разнообразия, откуда в современность она распространилась по всему Дальнему Востоку и Сибири; малая лесная мышь исследованной части ареала представлена двумя высоко дивергировавшими популяциями, что может быть использовано в качестве аргумента для таксономической ревизии.

10. Обнаружен низкий межвидовой ПДРФ ДНК в группе относительно узкоспециализированных высших песчанок, характеризующихся значительными отличиями по основному набору хромосом (2п=44, 50, 72), и широкий спектр ПДРФ ДНК у кариотипически стабильных (2п=48) широкоадаптированных лесных и полевых мышей. Показано существование прямых корреляций между особенностями организации высоких повторов и тонкой структуры хромосом, а также эволюционным возрастом видов, и обратных - между ПДРФ клеточной ДНК и полиморфизмом кариотипических чисел. Таким образом, сальтационное видообразование сопровождается максимальным сохранением молекулярной структуры высоких повторов, градуальное - накоплением мутаций во времени.

11. Обнаружено, что кариологически наиболее лабильные в родственной группе виды грызунов по основному (малоазийская песчанка) или добавочному (восточноазиатская лесная мышь) набору хромосом отличаются содержанием в геномах низкомолекулярных сателлитных компонентов. Предложена схема последовательных эволюционных событий, сопряженных с появлением такой сатДНК и ведущих, через множество хромосомных разрывов, к образованию вида с высоким кариотипическим числом -малоазийской песчанки.

12. Обнаружены новые для рода Apodemus типы внешней сегментации сатДНК, что отвергает ранее существовавшее представление о сатДНК лесных мышей, как эволюционно консервативном компоненте генома. Типы сатДНК коррелируют с гаплотипами, мтДНК* географическим распространением и таксономической классификацией лесных и полевых мышей. По совокупности экспериментальных данных сконструирована гипотетическая схема молекулярной эволюции сатДНК мышевидных грызунов.

377

13. По данным ПДРФ ДНК Apodemus выявлена корреляция размерных и количественных характеристик часто повторяющихся тандемных и диспергированных последовательностей между собой и с эволюционным возрастом видов. Делается заключение о согласованной эволюции различных семейств повторов. Обнаруженные закономерности характерны для других исследованных таксонов животных.

14. По данным изменчивости гена цитохрома b митохондриальной ДНК и ПДРФ геномной ДНК реконструированы схемы молекулярных филогений лесных и полевых мышей; получены свидетельства реальности гибридогенного формообразования и конвергентной эволюции в отдельных филетических линиях лесных и полевых мыше; сделан вывод о монофилетичности европейских видов, объединяемых ныне в род Sylvaemus, и полифилетичности азиатских видов. Обосновывается положение о целесообразности придания группе лесных и полевых мышей надродового статуса с выводом восточноазиатских видов в таксоны родового (A.argenteus) и подродового (A.agrarius, A.peninsulae, A.speciosus) рангов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Экология - молодая развивающаяся наука, поэтому ее понятийный, етодологический и теоретический аппараты нельзя считать окончательно пожившимися (Розенберг, 1999). Большинство экологов понимает под кологией науку о популяциях (Большаков, Добринский, 1999). Одно из амостоятельных научных направлений экологии - эволюционное, в задачу второго входит исследование основных закономерностей эволюционного эоцесса (какова взаимосвязь между экологией и генетической структурой эпуляций, как отражается изменение экологической структуры популяции на в генетическом составе и т.п.). При этом важным моментом эволюционной юлогии является изучение пределов изменчивости видов и популяций в ;тественной среде их обитания, а также соотношения микро- и акроэволюции (Шварц, 1980). Молекулярная экология - одно из наиболее олодых и интенсивно развивающихся направлений, представляющая синтез юлогии, молекулярной биологии, филогенетики и популяционной биологии, рамках развития данного направления нами была предпринята поаытка эшения некоторых экологических и общебиологических проблем вида, и >ежде всего - биоразнообразия - с помощью арсенала генетических этодов, включая самые новейшие из них (PCR амплификация и !Квенирование последовательностей ДНК), разработанные на основе .юоких технологий современной науки и техники, открывающие уникальную >зможность исследования микроэволюционных процессов в малых олированных популяциях.

Совокупность полученных данных, а именно: особенности кинетики ассоциации ДНК, ПДРФ суммарной и рибосомальной ДНК ядер, лиморфизма амплифицированных с помощью случайных праймеров следовательностей ДНК, а также характера распределения мутационных мен в структурных генах (цитохром b мтДНК), указывает, что дискретность -новная черта молекулярной организации эукариотического генома. Тем мым подтверждается основной тезис о том, что дискретность жизни - один з наиболее фундаментальных законов природы. Полученные результаты вляются одновременно подтверждением единства структуры и функции рганического мира, главной стратегии его развития: «Многообразие - одно з самых удивительных свойств живой природы. Весьма примечательная собенность этого разнообразия заключается в его прерывистости, в том, что но слагается из дискретных единиц - видов» (Майр, 1968).

Экспериментальные, а также литературные данные позволяют с эстаточной убедительностью заключить, что основные механизмы армирования и молекулярной эволюции часто повторяющихся, эганизованных тандемно и диспергированных, последовательностей ДНК :нома эукариот имеют сходный характер в разных филетических группах пекопитающих и птиц. Их размерные характеристики и количественное держание коррелируют между собой и с эволюционным возрастом видов. В астности, из результатов следует, что эволюция сатДНК врановых птиц, а »кже мышевидных грызунов, подобно таковой хищников (Иванов и др., 1991), ■ражает многоэтапный процесс с участием механизмов селективной лплификации. И у грызунов (собственные данные), и у приматов (Джиллеспи др., 1986) эволюционное старение филумов сопровождается сокращением 1личества семейств диспергированных повторов. У обезьян Старого, Нового зета, а также приматов и человека обнаруживается соответственно одно, sa или три семейства Kpnl последовательностей, принадлежащих к LINES, ^алогичным образом, у эволюционно молодых видов лесных мышей ;рокавказской группы содержатся два, а у эволюционно старых юточноазиатских видов - одно EcoRI семейство, представляющее LINES.

Популяционно-генетические исследования . : позволили авторам эормулировать очень важное положение о том, что элементарной единицей олюционного процесса является популяция. Изучение закономерностей армирования природных популяций, выявление популяционной структуры дов имеет важное значение для понимания сущности вида, его критериев, аниц, объема, а также для внутривидовой таксономии и систематики. ажнейшим свойством популяции является разнокачественность признаков и зойств особей, которая обеспечивает популяции определенную устойчивость постоянно меняющихся условиях среды (Шилов, 1977). Гетерогенность эиродных популяций - один из важных компонентов биоразнообразия, эддерживаемого генетическими механизмами. Таких механизмов эддержания генетической разнородности и постоянного обогащения гнофонда должно быть множество, т.к. обогащение генофонда популяции эвышает не только ее адаптивные возможности в целом, но и увеличивает (нетическую емкость отдельных особей (Шварц, 1980).

Яркий пример внутривидовой популяционной структурированности, как ^аптации вида к условиям среды обитания, представляют лососевые рыбы пава 3). У разных видов лососевых существуют сезонные популяции, опуляции четных и нечетных лет, карликовые популяции, позволяющие 1дам наиболее полно использовать ареал обитания в пространстве и >емени. Освоение большого числа экологических ниш - отличительная ;рта адаптивной стратегии северопалеарктических видов животных, и в юбенности - лососевых рыб. В противоположность им, адаптация и юлюция южнопалеарктических форм направлена на совершенствование ециализации. В результате 60% биоразнообразия сосредоточено в зонах опических лесов, занимающих всего 6% территории суши (Лопатин, 1997). спользуя метод молекулярной гибридизации в растворе (реассоциация НК), мы сравнивали геномы весенне-летней и осенней популяций нерки, >рмальных и карликовых форм нерки и мальмы и геномы нерки и мальмы »кду собой.

Исследования, проведенные на . мелких грызунах показали, что зонные генерации характеризуются комплексом биологических обенностей. Весенние быстро созревают, размножаются и осенью 1мирают, имея все признаки старости. Осенние - зимуют и, сохраняя все изнаки физиологической юности, размножаются весной (Шварц, 1980). В вестной мере, это характерно и для лососей: длительность пребывания на нересте весенне-летней и осенней рас у них существенно отличается. Перечисленные особенности предполагают генетические отличия. Однако наши попытки выявить геномные отличия между сезонными расами нерки успехом не увенчались - метод оказался, очевидно, неадекватным.

Результаты сравнительного исследования геномов карликовых и нормальных форм двух видов дальневосточных лососей, нерки и мальмы, напротив, превзошли все наши ожидания. Хотя a priori мы были вправе рассчитывать, что такие серьезные морфофизиологические отличия, которые сопутствуют возникновению карликовости, должны затрагивать значительную часть генома. Впервые обнаруженный нами феномен геномных макромутаций в популяциях одного и того же вида, вовлекающих около 20% повторяющейся ДНК, как уникальное биологическое явление заслуживает особого внимания и, безусловно, дальнейшего исследования. Оно может быть сопоставимо по своим масштабам с теми изменениями, которые происходят на уровне регуляции транскрипции в раннем эмбриогенезе, при дифференцировке тканей и при адаптации к паразитическому образу жизни (хотя в последнем случае эти изменения ведут к видообразованию) (Косюк, 1977; Хесин, 1984; Сопрунов, 1987; Nagl, 1978). Следовательно, для достижения различных Зиологических целей у эукариот могли быть задействованы сходные молекулярные механизмы на уровне структурных реорганизаций генома. Мало вероятно, чтобы такие эффекты возникли на базе стахостического мутагенеза. Веолятнее всего, они требуют координированной работы многих •енов, для их осуществления необходим канализированный мутагенез. Мы юлагаем поэтому, что обнаруженное нами явление крупномасштабных "еномных преобразований тихоокеанских, лососей, обладающее выраженным |юнотипическим эффектом, может быть (наряду с таким феноменом как доминуция хроматина) достойной внимания и достаточно уникальной лоделью для изучения роли повторяющейся ДНК и механизмов действия )егуляторных генов.

Кроме лососевых, карликовые формы самцов известны у глубоководных удильщиков, некоторых губанов и т.д. Для жилых карликовых самцов проходных видов сиговых, численность которых колеблется в зависимости от условий среды и численности проходных самцов (подобно камчатским лососям), доказана нормальная воспроизводящая функция. Численность карликовых самцов, очевидно, детерминирована генетически (см. главу 3). Доказано участие карликовых самцов дальневосточных лососей в размножении с нормальными самками, хотя результаты его остаются, практически, неизвестными. Кариологический анализ потомства указывает на повышенную вариабельность хромосомных наборов в бластулах «гибридных» икринок (Черненко, 1968; 1976), что может быть следствием обнаруженных нами геномных изменений, дисбаланса в количестве копий разных последовательностей ДНК. Вместе с тем, межвидовые гибриды тихоокеанских пососей, существенно отличающиеся кариотипическим числом, вполне ■кизнеспособны и имеют сумму наборов хромосом родительских видов Фролов, Максимович, 1992). Эти результаты ясно указывают, что зозникновение карликовости и видообразования тихоокеанских лососей )бусловлено изменениями различных функциональных частей генома.

Половая структура тихоокеанских лососей характеризуется юстоянным преобладанием самцов в отдельных возрастных группах, или :уицественными колебаниями в соотношении самцов и самок (Коновалов, 985). Соотношение карликовых самцов и самок обычно составляет 10:1. Следовательно, самцы и самки карликовых популяций подвергаются азличным силам естественного отбора, и их генетическая структура должна ыть разной. Действительно, работами двух-ведущих групп исследователей, уководимых Ю.П.Алтуховым и В.С.Кирпичниковым, получены убедительные оказательства генетических отличий карликовых самцов, а именно - крайне ысокие значения их гетерозиготности. Таким образом, можно считать, что зновная биологическая роль карликовости - поддержание генетической азнородности популяций и увеличение экологической пластичности вида, т.е. эго жизнеспособности (в равной мере, по видимому, это можно отнести к :езонным и годовым генерациям). Во всяком случае карликовые самцы имеют эпределенные селективные преимущества перед крупными - они успешно (онкурируют с ними при нересте на мелководье. Однако в условиях интенсивного промышленного лова эти приобретенные популяцией в ходе эволюции адаптации могут сыграть негативную роль. Это связано с тем, что наибольшей эксплуатации подвергаются крупные самцы, первые ■фиступающие к нересту, вследствие чего непропорционально увеличивается шсленность мелких самцов, выполняющих функцию резерва генетического )азнообразия. Таким образом нарушается исторически сложившаяся енетическая структура стада, характеризующаяся определенным оптимумом етерозиготности (Кайданов, 1996). Складывается парадоксальная ситуация енетической деструкции популяции по причине пробладания гетерозигот, в юрме повышающих жизнеспособность популяции.

Уровень геномных отличий двух видов лососевых рыб по данным инетики реассоциации ДНК оказался невысоким и касающимся лишь области 1Ысоких повторов, что делает данную ситуацию сходной для других юдственных видов животных (см. обзор литературы). Отдавая полный отчет том, что сходство кинетики реассоциации ДНК не является подтверждением дентичности ее нуклеотидной последовательностей, нам хотелось бы братить внимание на следующее обстоятельство. Межвидовые отличия атрагивают область высоких повторов, включая сатДНК, адаптивная роль оторой общепризнана. Следовательно, видообразование нерки и мальмы опровождалось, как минимум, дивергенцией их адаптивных стратегий (что полне естественно и логично). Внутривидовые изменения (в сравнении арликовых и нормальных форм) затрагивают.: область, умеренных повторов, ключающих, главным образом, регуляторные участки генома. Таким бразом, карликовость может быть проявлением уже имеющегося даптивного видового потенциала, осуществляемого посредством еорганизации регуляторной части генома, и, возможно, проявлением признака высокого таксономического ранга. В этом случае разумно предположить существование аналогичных геномных отличий у других видов рыб, имеющих своей интегральной частью карликовые популяции (и видов других классов позвоночных?).

Крупные геномные мутации, проявляющиеся в виде элиминации значительной части генома (до 98%!) эукариотической клетки и характерные для процессов адаптации видов к паразитическому образу жизни (приводящие к видообразованию). В этом отношении полученные нами результаты явились лишь подтверждением имеющихся в литературе сведений. Открытый выдающимся немецким биологом Т.Бовери более 100 лет назад феномен диминуции хроматина аскариды до сих пор является одним из немногих примеров глубокой перестройки структуры геномов. В настоящее время среди беспозвоночных известно несколько десятков аскарид, циклопов и некоторых миксин, обладающих подобным эффектом (Акифьев и др., 1998). Минимальное количество повторяющейся ДНК свободноживущего хищника турбеллярии по нашим данным составляет около 26%, в то время как у его филогенетических потомков, паразитических трематод, оно не выше 5%. Однако основная ценность полученных нами данных заключается, по нашему мнению, в обнаружении у свободноживущих червей универсального характера рестрикции ДНК различными рестриктазами, что потенциально может рассматриваться как генетическая преадаптация к паразитизму. В широком смысле такое состояние генома, возможно следуе рассматривать как наиболее оптимальное для его эеорганизации при резких изменениях условий существования. Уникальность эбнаруженного нами свойства молекулярной: организации генома червей побудила нас к более тщательному анализу данных ПДРФ яДНК эукариот. Эбобщение этих данных позволило предложить гипотезу о «спиральном» (арактере изменения ПДРФ во времени. В рамках данной гипотезы уровень ПДРФ яДНК в геномах эволюционно молодых, на стадии становления, и эволюционно старых «сложившихся» видов будет ниже, чем у развивающихся» форм, но с противоположным вектором. В определенной мере это соответствует гипотезе о возникновении и эволюции сатДНК эукариот, сформулированной Р.Бриттеном и Е.Дэвидсоном (Britten, Davidson, 1968) в самом начале интенсивных исследований молекулярной организации эукариотического генома и может рассматриваться как ее экспериментальное подтверждение.

Сравнивая примеры эволюционной адаптации к изменяющимся условиям жизни лососевых рыб и червей, на первый взгляд не имеющих ничего общего, кроме сходства в масштабах геномных отличий, мы открываем для них удивительно простую общность: и те, и другие адаптировались к жизни в разных средах. Это дает нам право предполагать , что в геномах не только беспозвоночных, но и позвоночных сохранилась информация о жизни далеких предков всех эукариот. Основное отличие молекулярных механизмов адаптации (вызванных разными причинами и призванные решать различные биологические задачи) в том, что геномные изменения в приспособительной реакции вида ограничиваются фракцией, главная функция которой -регуляция работы генов. Видообразование в данном случае (паразитизм) сопровождается, как следует из литературных источников, крупными преобразованиями многих геномных фракций.

Согласно основным положениям системной теории эволюции, «связывающей развитие любой биологической системы с эволюцией систем более высокого порядка, в которые она входит в качестве элемента», когерентная, т.е. прогрессивная, эволюция (на ценотическом уровне характеризующаяся увеличением биомассы, сокращением отношения продуктивности к биомассе, увеличением - общего разнообразия, уменьшением конкурентного давления-: и производства мортмассы, возрастанием целостности системы и замкнутости круговоротв веществ) на протяжении истории земли неоднократно прерывалась некогерентными эпизодами - «так называемыми великими вымираниями, или геобиологичексими кризисами». Неустойчивость среды в эти периоды ведет к упрощению структуры экосистем, прерыванию сукцессий, увеличению минимальных размеров популяций и как результат - к сокращению биоразнообразия. Перечисленные закономерности действительны и для антропогенных кризисов наших дней (Красилов, 1992). Что весьма примечательно, после каждой экологической катастрофы орагический мир нашей планеты не только обновлялся, увеличивалось видовое разнообразие и ускорялись темпы эволюции (Ушаков, Ясаманов, 1984).

По мнению многих ученых в настоящее время мы переживаем период первого массового вымирания видов после того, как на рубеже мела и палеогена (около 60 млн лет назад) вымерла динозавровая система (Holzinger, 1996). Сохранение видов стало актуальным для всего человечества. Редкость видов - надежный индикатор его уязвимости. Спасая виды животных, «мы спасаем комплексные экосистемы и ареалы видов, которые могут исчезнуть с лица земли под напором нескончаемого наступления человека с его потребностями.» (Бердж, 1999). Одна из серьезнейших причин уменьшения биоразнообразия - фрагментация мест обитания (см. обзор литературы). Многие небольшие популяции крупных хищников, оказавшиеся в условиях полной изоляции, находятся в критическом положением перед угрозой вымирания. В международную Красную книгу внесены 4 подвида (из 7 видов) медведя (Соколов, 1978), 18 из 35 видов семейства псовых (Wayne, 1996), и 36 из 38 (!) видов семейства кошачьих (O'Brien, 1996). Зачастую эти виды играют ключевую роль в регуляции популяций жертв, поэтому их потеря влечет за собой разрушение экосистем. Полностью исчезли подвиды тигра, некогда обитавшие на Бали, Яве и в Прикаспии (Сайденстикер и др., 1999): Положение усугубляется тем, что содержащиеся в зоопарках животные, представляющие вымирающие виды или популяции, часто оказываются гибридного происхождения. Например, большинство особей дальневосточного леопарда из зоопарков произошли от одного основателя (зарегистрированного в Международной племенной книге под №2), чья генетическая чистота сейчас вызывает серьезные сомнения: у многочисленных потомков указанного производителя стали выщепляться признаки, несвойственные дальневосточному подвиду. По мнению опециалистов, проекты сохранения этих крупных хищников (и не только их) должны строиться на экологической основе, с учетом данных генетических чсследований, позволяющих дать корректную оценку генетического статуса фиродоохраняемых объектов, а также адекватности использования тех или 1ных особей при искусственном размножении видов в неволе и их юинтродукции в природу. Содержание и разведение диких животных (редких 1 с малоизученными свойствами) для создания искусственных популяций с ^елью сохранения генофонда и самих видов приобрело большое значение во юем мире. Необходимое требование этих мероприятий - генетический юнтроль. Генетический анализ позволяет также понять недавнюю ютественную историю, современное состояние и перспективы выживания юдвергающихся опасности популяций (O'Brien, 1994). В этом отношении ;есьма показателен пример с американской пумой.

Считают, что американская пума (флоридская пантера) имеет самую ысокую скорость исчезновения с лица Земли со времени вымирания .инозавров (Roelke et al., 1993). Существует она как небольшая реликтовая опуляция из 30 особей, обитающих на юге Флориды. Данные аллозимного олиморфизма (Р=27%; Н=1.8-6.7%), изменчивости минисателлитной ДНК э=9.5%) и мтДНК (всего два гаплотипа), низкое разнообразие генов лстосовместимости свидетельствуют о том, что в современной истории олридских пантер имел место значительный инбридинг (после одного или вух популяционных событий, именуемых «бутылочным горлышком») и опутствующая ему потеря генетической информации. Какова же цена такого знетического единообразия? У флоридской пантеры содержание подвижных пермиев в эякуляте в 18-30 раз ниже, чем у других подвидов пум, а число номальных спермиев достигает 94,3%. Из других нарушений следует назвать эипторхизм (в 1975 году его не было вообще, а в 1989 году его имели уже Э% самцов), дефекты сердца (обнаруживаются в 80% по сравнению с 4% для других видов кошек) и высокая чувствительность к инфекциям (в том числе, наличие иммунодефицитного вируса кошек -FIV) (Roelke et al., 1993; O'Brien, 1994). Демографическое моделирование (включающее такие показатели, как точный возраст, социальная структура, скорость рождения и т.п.) предсказало, что американская пума может исчезнуть в течение 25-40 лет (Roelke et al., 1993). Ознакомившись с имеющимися данными, рабочая школа по управлению флоридской пумой в октябре 1992 года утвердила две рекомендации в стратегии ее сохранения: 1- инициировала программу сохранения в неволе и 2- разработала план интродукции во флоридскую популяцию пум рожденных в Техасе, т.к. критическое состояние флоридской пантеры требовало срочного генетического вливания (в 19 веке ареалы двух популяций перекрывались, т.е. существовала возможность генетического обмена, что может быть достаточным для генетической совместимости популяций в настоящее время). В данный период ситуация с флоридской пантерой стабилизировалась и есть все основания для оптимистических прогнозов (Сайденстикер и др., 1999).

Полученные в нашей работе данные являются весомым вкладом в разработку стратегии сохранения дальневосточных подвидов леопарда и амурского тигра. Несмотря на то, что широкомасштабные генетические исследования обоих видов уже проводились (и продолжают проводиться) в цругих лабораториях мира, в них не были включены особи из природных популяций российского Дальнего Востока. Наши исследования в этом этношении приоритетны. Они выявили маркерные области, пригодные для юдвидовой молекулярной диагностики и могут рассматриваться как подтверждение возможности прохождения тигром в позднем плейстоцене :тадии «бутылочного горлышка» (O'Brien et al.,: 199) и гибридогенного происхождения разведенных в одном из зоопарков России леопардов дальневосточного подвида. Обнаруженное нами существенное превышение ■енетической изменчивости леопарда по сравнению с тигром возможно обязано различиям их адаптивных способностей. Как отмечалось в обзоре литературы, виды могут функционировать как «восстанавливающие», «контролирующие» и как сочетающие обе функции. Первые из них, основная адаптивная реакция которых сводится к повышению численности популяции, оказываются наиболее уязвимыми при разрушении среды обитания. Согласно нашим данным, стратегия сохранения тигра и леопарда также должна быть разной: для тигра реальную угрозу может представлять пониженная генетическая изменчивость (хотя есть примеры, когда виды вполне благополучны при аналогичных показателях), поскольку его численность начала уже восстанавливаться; леопарду угражает прежде всего физическое истребление.

Неустойчивость среды в некогерентные фазы эволюции, а также в периоды антропогенного кризиса чреваты не только массовыми вымираниями доминирующих или редких видов. Для выживших форм появляется возможность более полной реализации их потенций. Как правило, изолирующие механизмы ослабевают, в результате чего становится возможным слияние видов путем гибридизации. Поэтому кризисные популяции характеризуются широким размахом изменчивости, часто превосходящим не только видовые, но и родовые пределы (Красилов, 1992). Из этого следует, что примеры естественной гибридизации видов и популяций, которые мы можем набдюдать в наши дни, предоставляют интригующую возможность заглянуть в прошлое и увидеть, в определенном ракурсе, будущее развитие жизни на нашей планете в самые экологически кризисные периоды ее существования.

Гибридизация видов и подвидов - более широко распространенное явление во всех классах позвоночных, чем это представлялось раньше. Особенно это характерно для птиц, значительная часть которых у них плодовита. Шварц (1980) приводит такую статистику: среди Anura известно 400 межвидовых гибридов, млекопитающих - 256, а птиц -1000; из них к межродовым относится соответственно 3, 11 и 4.4%. С усилением антропогенного пресса на окружающую среду случаи гибридизации между различными формами стали возрастать. Например, в Мексике в результате вырубки леса оказались нарушенными экологические барьеры Pipilo ocai и P.erithrophtalmus, что привело к массовому появлению гибридов (Sibley, 1954).

Миграция птиц - перемещение на большое расстояние, вызванное изменением условий существования, или связанное с размножением. Территория Приморья представляет собой важный регион для мигрирующих птиц Австралийско-Тихоокенского пролетного пути, включая арену жизни для трех из них (Нечаев и др., 1999). Вероятно, одной из причин проникновения черной кряквы на юг Приморья, отмечаемого в последние 50 лет, также является изменение окружающей среды (общее потепление, осушение болот, возрастание антропогенного пресса и т.п.). Есть и другие причины для межвидовой гибридизации крякв экологического и отологического порядков: общая территория зимовки, избыток самцов у крякв и более раннее завершение у них пар, наконец, ярко выраженный половой диморфизм у кряквы по сравнению с черной кряквой, благодаря которому самки черной кряквы предрочитают селезней кряквы, имеющих более яркое оперение (Belanger, 1986). Согласно данным наших исследований генетического своеобразия трех видов крякв, между кряквой (охотничий вид) и черной кряквой (занесенного в региональную Красную книгу) возможна интрогрессивная гибридизация: генетические дистанции между видами чуть ниже высшего предела внутривидовых, что может быть следствием существенного генного потока между Anas platirhynchos и A.poecilorhyncha; к тому же, на фено- и филограммах черная кряква не образует собственного кластера, частично объединяясь с кряквой. Это может означать, что в перспективе на российском Дальнем, Востоке может развиться сценарий, аналогичный описанному ранее для конспецифических форм Северной Америки и Австралии, когда поглощается вид, гибридизующий с кряквой (Панов, 1993).

Таким образом, биоразнообразие может быть потеряно, когда генетическая изменчивость внутри вида нарушается через гибридизацию.

Интербридинг популяций может разрушать генетическую изменчивость, так как высоко подразделенные популяции могут оставлять больше генетического разнообразия во времени, чем панмиктические популяции того же размера. Гибридизация генетически различных популяций может быть нежелательной, так как сталкивается с естественным процессом дифференциации и видообразования, что может потенциально мешать локальной адаптации/ или приводить к аутбредной депрессии (Tarr, Fleischer, 1999). Многие биологи-эволюционисты рассматривают гибридные зоны как природные лаборатории для изучения генетических и экологических взаимодействий между дифференцированными популяциями. Понимание причин и последствий этих взаимодействий дает неоценимый вклад в область важнейших проблем эволюционной биологии и экологии. Некоторые авторы считают, что ее влияние ничтожно мало - на уровне «эволюционного шума», другие придают ей большое значение, связывая непосредственным образом с повышением генетической изменчивости и обретением у популяций новых адаптаций (Riesenberg, Wendel, 1996).

Выяснение молекулярных барьеров, препятствующих межвидовой гибридизации, - один из ключевых общебиологических вопросов в общей проблеме феномена межвидовой гибридизации и существования гибридных зон. Серия проводимых американскими авторами исследований позволила ;делать заключение о том, что одним из молекулярных барьеров могут быть эазличия в регуляторных системах родительских геномов. Действительно, у некоторых гибридов рыб глюкоза-6-фосфат дегидрогеназа кодируется включительно отцовскими аллелями, а у некоторых гибридов эепрессированы оба родительских аллеля (цит. по Шварц, 1980). Дальнейшие ^следования изозимной изменчивости в гибридных популяциях обнаружили шличие у гибридных особей новых белковых вариантов - «гибризимов», )тсутствующих у родительских форм (Woodruff, 1989). Число работ подобного олка на уровне молекулярной организации генома крайне ограничено. Суммируя их достижения, следует подчеркнуть, что отличия в молекулярной организации гибридного генома возрастают с увеличением уровня дивергенции скрещивающихся форм. Таким образом, мы переходим ко второму (после микроэволюционных процессов) вопросу, порождаемому межвидовой гибридизацией, - о таксономическом статусе вступающих в гибридизацию форм. С позиций биологической концепции вида (получившей широкое признание) гибридизация между видами исключена. Однако факты--' позволяют в этом усомниться. Таким образом, изучение каждого конкретного ^ случая естественных зон гибридизации включает решение таксономических проблем. На примере гибридизации серой и черной ворон, а также домовых мышей мы пытались понять особенности генетического разнообразия гибридизующих таксонов и их фенотипических гибридов, подойти к решению таксономических вопросов.

С точки зрения экологии галка, грач, сорока, черный ворон, ворона, характеризующиеся склонностью к синантропизации и отсутствием четких подразделений трофических и топических ниш, являются достаточно обособленным и своеобразным комплексом (Блинов, 1998). Являясь обычными по всей Палеарктике, серая и черная вороны остаются одним из величайших таксономических камней преткновения и характеризуются интригующим характером ареала, в котором центральную часть занимает серая ворона, а по краям - черная (Modge, 2000). На первом всесоюзном совещании «Экология, биоценотическое и хозяйственное значение врановых птиц» было констатировано, что «значительный рост численности врановых привел к увеличению их отрицательной роли в сельском и охотничьем хозяйстве, на урбанизированных территориях, в местах массовых концентраций». Таким образом, необходимость генетических исследований ворон была продиктована, помимо научного интереса, связанного с гибридизацией, их практической значимостью.

Полученные нами данные (глава 4.1) не дают Однозначного ответа на вопрос о таксономическом ранге серой и черной ворон. Мы также согласны с мнением тех ученых, которые утверждают, что генетические дистанции между таксонами не определяют их таксономический ранг. Ясно, что дискуссия о таксономическом статусе требует информации о предпочтениях в поведении при скрещивании, плодовитости гибридов. К счастью, аналогичные сведения о воронах в литературе имеются. Особенности географического и ландшафтного поведения, а также предпочтения при спаривании конспецифических особей, свидетельствуют о .существенной эколого-физиологической специфичности этих форм и некоторой степени их репродуктивной изоляции. Феномен относительно стабильной гибридной зоны серой и черной ворон в Запарной Сибири объясняется зоологами действием комплекса прекопуляционных факторов изоляции: поведенческих, хронологических, расстоянием за счет филопатрии в совокупности с поглотительным скрещиванием на краях ареала (Блинов, 1998). В совокупности сведения об этих аспектах биологии серой и черной ворон и данные генетического анализа изменчивости врановых, проведенные нами и другими авторами (Уфыркина и др., .1995; Крюков и др., 2000) склоняют нас к мнению (вопреки мнению цитированных авторов), что указанные формы вполне могут быть самостоятельными биологическими видами, возможно, парафилетического происхождения. Особенно весомыми в этом направлении нам представляются собственные данные RAPD-PCR анализа (обнаружившие повышенную гетерогенность гибридных геномов, включая появление новых геномных компонентов) и литературные-анализа последовательности гена цитохрома Ь мтДНК (Крюков и др., 2000) (выявившего между геномами серой и черной ворон трансверсионные замены - признак глубокой дифференциации сравниваемых форм)

Присутствие черной вороны на большей части евразийского массива со вставкой серой вороны в середине является привлекающим внимание фактом, дающим широкие возможности для интересных спекуляций. Некоторые авторитеты допускают, что в течение последнего ледникового периода 125-10 тысяч лет назад черная ворона была вынуждена отступить на территории с менее жесткими климатическими условиями - югозападную

Европу и дальневосточную Азию. Серая ворона могла иметь северовосточное /1 северозападное распространение и колонизовать пространства, которые эще не были заселены воронами, и от которых уже отступили ледники. По прошествии времени две популяции черной вороны с находящейся между ними серой вороной распространялись до тех пор, пока не встретились и создали ситуацию, которую мы наблюдаем в настоящее время (Modge, 2000).м

В отличие от диких животных, выживаемость-а также распространение - ; <омменсальных форм тесным образом связано с деятельностью человека. /1менно это обстоятельство привело к феноменуширокомасштабной лнтрогрессивной гибридизации парапатрических форм Mus musculus, которая л выделяет ее среди всех грызунов Палеарктики. Благодаря своим высоким адаптивным возможностям и человеческой деятельности, домовая мышь эыстро распространилась по всему миру. По степени своей экологической пластичности и синантропизации виды подрода Mus существенно эазличаются: от живущих в дикой природе и запасающих на зиму корм <урганчиковых мышей M.hortulanus до М.т.musculus, M.m.castsneus и M.m.domesticus, тесно связанных с жильем человека и покидающим его лишь в благоприятное время года (Котенкова, Прилуцкая, 1994). В этой связи зозникает естественный вопрос, какие генетические характеристики и эволюционные процессы позволяют различным формам приспосабливаться к эазным условиям существования? Чтобы ответить на данный вопрос, необходимо тщательное изучение генетического и таксономического эазнообразия домовой мыши терриофауны нашей страны (как наименее изученной), с обязательным включением в исследования зон генных /штрогрессий, поскольку неординарные ситуации скорее всего обнаруживают -енетические потенции форм и пределы их изменчивости, ведут к пониманию проблем видо- и расообразования.

Нами проведен RAPD-PCR анализ генетического и таксономического эазнообразия домовой мыши фауны бывшего СССР из разных географических и экологических зон (глава 4.2). Результаты указали на высокие генетические отличия между M.musculus и M.hortulanus с M.abbotti, обнаружил на российсокм Дальнем Востоке интрогрессивную гибридизацию между M.musculus и M.domesticus, выявил своеобразие мышей Тувы и Кяхты, имеющее, вероятно, таксономический вес, продемонстрировал отсутствие у синантропных грызунов строгой корреляции между генетической дифференциацией и пространственной изоляцией, впервые дал количественные оценки генетической дифференциации внутри и между локальными популяциями, предоставил аргументы в пользу высокого значения торгово-транспортных путей, а также разной конкурентной способности различных форм домовой мыши, включая эффект основателя и существование аборигенных форм. Наши данные указали на более высокое генетическое разнообразие мышей из зон экологического оптимума. Возможно, эти генетические отличия связаны со способностью указанных форм адаптироваться в природных биотопах. Тогда полученные данные будут иметь особое значение не только в плане установления происхождения домовой мыши, но также для многих других аспектов ее генетики, включая обнаружение консервативных в эволюции генов. Вместе с тем ясно, что разнообразии домовой мыши тесно связано со временем колонизации ими урбанизированных территорий. В таком случае по геногеографии домовой мыши возможны исторические реконструкции заселения людьми различных областей и связей между ними. Плодотворность иследований такого толка великолено проиллюстрировано японскими авторами в коллективной монографии "Gentics in wild mice" (1994).

Как и у врановых птиц, у домовых мышей из зон гибридизации геномы (гибридов) отличаются повышенной гетерогенностью, . либо (в случае межвидовых гибридов домовых' мышей) • крайней обособленностью от родительских геномов. Эти данные согласуются с представлением о гибридизации, как важном эволюционном процессе, увеличивающем общее биоразнообразие. Обособленность RAPD-PCR спектров гибридных геномов может быть следствием серьезных преобразований генетического материала, т.е. доказательством того, что дивергенция геномов скрещивающихся форм достигла эволюционной значимости.

Если под микроэволюцией подразумеваются внутривидовые преобразования, то под макроэволюцией - комплекс процессов, ведущих к формированию таксонов высокого ранга. Процесс видообразования связывает микро- и макроэволюцию в единый процесс филогенеза. Их связь настолько тесна, что о ней можно говорить лишь условно (Шварц, 1980). Ограничение средств экспериментального изучения процессов макроэволюции привело к ситуации, когда большинство исследователей в настоящее время изучают микроэволюционные процессы, происходящие в популяциях. Таким образом, наметилось некоторое отхождение от решения центрального вопроса эволюционного учения - о соотношении микро- и макроэволюции. Нами молекулярные механизмы видобразования и эволюции изучались на двух группах грызунов - лесных и полевых мышах рода Apodemus и высших песчанках рода Meriones.

Рассматривая проблему вида с позиций эволюционной экологии, мы особое внимание уделили изучению сатДНК, адаптивная роль которой широко обсуждается. Вопреки имевшим место представлениям о сатДНК лесных и полевых мышей рода Apodemus как достаточно консервативной части генома, нами продемонстрирована ее чрезвычайная вариабельность, и не только по количественному содержанию, но также по первичной последовательности, протяженности основного мультимера и типу внешней сегментации. Помимо известного (370 пн) мы обнаружили новые типы сатДНК с длиной мономеров равной 240 пн и 30 пн, названные нами «Rattus», «Mus» и «Apodemus» гипами, соответственно. Дифференциация видов Apodemus по типам их сатДНК совпадает с географическим распространением, внутриродовой гаксономией, а также системой матриархальных связей лесных мышей. «Rattus» тип сатДНК доминирует у наиболее поздно радиировавших видов эврокавказского региона (северозападная Палеарктика), «Mus» тип сатДНК эказался характерным для южнопалеарктического вида, a «Apodemus» тип атДНК (в действительности высоко гетерогенный, в отличие от первых двух) >бъединяет эволюционно старые виды северовосточной Азии северовосточная Палеарктика). Примечательно, что в геномах лесных 1ышей оказались типы внешней сегментации сатДНК, обнаруженные как у волюционно более молодых видов рода Rattus, так и более старых, чем 1 podemus, видов рода Mus (т.е. соответственно «последовательности-отомки» и «последовательности-предшественники»), что может ассматриваться в пользу гипотезы существования библеотеки оследовательностей сатДНК в геномах млекопитающих (Salser et al., 1976).

Обобщение многочисленных литературных данных, а также езультатов собственных исследований, позволило нам разработать шотетическую схему молекулярной организации и эволюции сатДНК ышевидных грызунов. Согласно логике наших рассуждений, многообразие шов внешней сегментации сатДНК лесных мышей обусловлено различными шбинациями базисной последовательности, имеющей размер равный эимерно 28 и 30 пн, и селективной амплификации, причем таксономический зс имеет тип внешней сегментации.

Известно, что любой биологический вид своеобразен на каждом уровне о организации: генетическом, морфофизиологическом, экологическом, днако пределы возможности его существования, т.е. эволюционный ггенциал, широко варьирует. Отсюда различен вклад отдельных видов в юлюцию. По мнению некоторых авторов «Потентные виды обеспечивают ■.пышку адаптивной радиации и дают начало новому роду, объединяющему южество видов; виды узкой специализации приобретают морфологические личия родового и более высокого ранга и дают начало монотипическим ксонам» (Шварц, 1980). По мнению Бердникова (1981) также еспециализированные примитивные виды (эволюционно активные) ладают большим запасом неинформативной ДНК по сравнению с роцветающими» (эволюционно инертными) видами». Существует и другая чка зрения. Анализируя системные реорганизации генома при формообразовании Стегний (1991; 1993) выделяет виды с лабильным и консервативным геномами, характеризующимися, соответственно узкими и широкими адаптивными возможностями. Первые занимают центральное положение в филумах и являются генераторами образования дочерних видов (у которых геномы становятся консервативными), вторые - терминаторами, занимающими терминальное положение в филумах. Таким образом, особенности организации генома детерминируют его способность/неспособность к реорганизациям в видообразовательном аспекте. Бауэр (1936) тоже считал, что «материал для эволюции поставляют не победители в борьбе за существование, а побежденные, т.е. не те виды, которые имеют в данный момент самый обширный ареал». Из этого следует, что род лесных и полевых мышей и род высших песчанок - удобная модель для сравнительного изучения двух типов эволюционных процессов и формообразования в группах с разными адаптивными возможностями.

Согласно полученным нами данным молекулярная эволюция высоких повторов у видов лесных мышей и высших песчанок, действительно, имеет принципиальные отличия (глава 5). Кариологически стабильные широко адаптированные лесные мыши высоко вариабельны по ПДРФ тандемной и диспергированной ДНК, в то время как более специализированные и кариологически лабильные песчанки имеют почти одинаковые картины рестрикции яДНК. Тем не менее, у малоазийской песчанки, характеризующейся самым высоким хромосомным числом, нами был обнаружен видоспецифичный низкомолекулярный (примерно 20 пн) BspRI компонент. Данный результат позволил нам предложить определенную модель молекулярного видообразования у Meriones, видимо, связанного с инсерционным мутагенезом, и которая может реализоваться в других группах кариологически лабильных животных. Особого внимания этот факт заслуживает в свете обнаружения видоспецифичного BspRI сателлита с короткой (примерно 30 пн) последовательностью у восточноазиатской лесной мыши, выделяющейся, как мы отмечали, не только среди всех родственных видов, но и других таксонов млекопитающих высоким числом и полиморфностью добавочных хромосом. Мало вероятно, что совпадение двух событий соряженности появления низкомолекулярного сателлитного компонента с высоким кариотипическим полиморфизмом видов, имеет случайный характер.

Реконструкция системы филогенетических связей видов внутри рода Meriones по данным RAPD-PCR анализа выявила ее удовлетворительное соответствие аналогичным построениям, основанным на результатах кариологических исследований, и в целом подтвердила сделанные кариологами выводы о том, что хромосомная эволюция внутри рода высших песчанок шла не по пути слияния акроцентриков, как у большинства животных, а по пути разрыва метацентрических хромосом (следовательно, и по пути увеличения хромосомных чисел). Тем не менеее, для более глубокой обоснованности наших выводов необходимо использование других методических подходов и новых молекулярных маркеров.

Широко адаптированные и кариологически стабильные лесные мыши, включая эволюционно самые молодые и близкие по другим генетическим критериям виды, по результатам ПДРФ яДНК хорошо отличались. Поэтому данная группа грызунов была нами изучена более подробно, причем с применением дифференциального подхода в использовании ферментов эестрикции. Принимали во внимание те факты (не учитываемые большинством авторов), что, во-первых, различные нуклеотиды мутируют с эазной скоростью, а во-вторых, содержание GC-nap в геномах млекопитающих строго регламентировано. Их игнорирование, с нашей точки зрения, недопустимо, так как на интерпретацию данных они могут оказывать значительное влияние.

Действительно, как показали наши результаты, гипотетические филогенетические древа, построенные по данным ПДРФ яДНК, енерируемого рестриктазами, специфичными к GC-богатым сайтам юстрикции, а также к сайтам, содержащим все 4 азотистых основания предположительно, сатДНК), оказались различными. В первом случае ответвление видов постепенное. Если их расположить в соответствии со сходством к наиболее близкой паре видов, то окажется, что серая крыса Rattus norvegicus (взятая нами в качестве внешней группы) локализуется между восточноазиатской и остальными видами лесных мышей. Данный, на первый взгляд парадоксальный, результат можно объяснить тем, что GC-богатые участки генома грызунов могут использоваться как молекулярные маркеры в эволюционных исследованиях крупных таксонов: по эволюционному возрасту еврокавказские виды лесных мышей ближе к серой крысе, чем к восточноазиатской лесной мыши (Громов, Баранова, 1981). Во втором варианте все виды подразделяются на два кластера, один из которых объединяет эволюционно молодые еврокавказские виды, другой -эволюционно более старые восточноазиатские, т.е. обитающие в существенно отличающихся климатических условиях. Таким образом, есть основания считать, что эти результаты в большей мере отражают адаптивную стратегию видов лесных и полевых мышей.

Анализ матриархальных связей указал на то, что группа мышей, )бъединяемых в род Apodemus, имеет несколько (по крайней мере, три) лышей-родоначальниц для каждого из трех филумов. Такое деление на филумы соответствует результатам реконструкций филогенетических связей ю данным ПДРФ яДНК: каждому из филумов мтДНК соответствует >пределенный тип сатДНК. Кроме того, собственно разработанный подход шлиза данных ПДРФ яДНК дал нам возможность для выводов о более ысокой специализации еврокавказских видов видов лесных мышей и южно-алеарктической лесной мыши по сравнению с остальными видами; о аличии более тесных филогенетических связей между еврокавказскими и >жнопалеарктическими видами; о существовании общего для северо-алеарктических видов генетического пула у североазиатских видов; о южной ,зии как реальном центре формирования Apodemus.

Согласованность ключевых положений молекулярных филогений, выведенных по данным ПДРФ яДНК и вариабельности последовательности участков генов мтДНК свидетельствует о единой эволюционной стратегии зидов лесных и полевых мышей на уровне ядерного и митохондриального -еномов, как бы сложно ни проходили их видообразование и эволюция. Сложность эволюционного процесса исследуемой группы грызунов юдтверждают данные сравнительного анализа степени дивергенции видов лышей Кавказа на разных уровнях (морфологическом, кариологическом, 13озимном, последовательностей ДНК) их организации, согласно которым :равниваемые виды имеют разные отличия по разным системам признаков. :роме того, данные предполагают, что среди Apodemus могут эффективно ротекать не только дивергентные, но и конвергентные процессы. В целом езультаты не исключают возможности ретикулярности эволюции, т.е. 4бридогенного формообразования некоторых видов (на что неоднократно бращали внимание зоологи), поскольку в деталях реконструкции, встроенные по молекулярным маркерам с различными типами наследования суммарной яДНК, мтДНК (собственные данные) и генов рДНК (Suzuki et al., 590) - отличаются.

С точки зрения внутривидовой таксономии наши данные можно осматривать как весомый вклад в имеющуюся проблему. В целом их можно ггерпретировать как аргумент в необходимости новой классификации lodemus, с приданием группе лесных и полевых мышей надродового атуса, выделением еврокавказских видов в отдельный род (что дтверждают недавние выводы российских зоологов-таксономистов), а сточнопалеарктических видов - в монотипические таксоны не ниже дродового ранга (зоологами такое право признается лишь за полевой 1шью), а южнопалеарктическую - в отдельный таксон родового ранга (такой прос специалистами еще не поднимался).

Поскольку лесные и полевые мыши рода Apodemus имеют глубокую 5исимость от лесных ресурсов, их эволюционная история, надо полагать, двух кладов мтДНК, для популяций Корейского полуострова и Приморья, с крайне низкими значениями их дивергенции. В соответствии с ними на исследуемой территории внутривидовая дифференциация восточно-азиатской лесной мыши проходила 1-15 тысяч лет назад, т.е. после глобальных климатических изменений, в результате которых многие виды крупных млекопитающих пережили демографическую катастрофу и исчезли, либо (как, например, предполагается для амурского тигра) прошли через генетическое «горлышко бутылки». Таким образом, указанные территории могут рассматриваться как послеледниковые рефугиумы, являющиеся резервуаром генетического разнообразия A.peninsulae, из которого эта мышь распространилась по Дальнему Востоку и Сибири (Serizawa, Suzuki, Tsuchiya, Kartavtseva, Pavlenko, Chelomina et al., 2000). Эти результаты имеют значительный элемент неожиданности: недавняя внутривидовая дифференциация A.peninsulae резко контрастирует с высоким (до 10 млн лет) эволюционным возрастом указанного вида, определенным как в собственных, так и других авторов (Suzuki et al., 1990; Serizawa et al., 1999) исследованиях. Контрастируют они и с результатами исследований генетической изменчивости лесных и полевых мышей, согласно которым эволюционно наиболее молодые предствители Apodemus колонизовали северную Палеарктику, значительно раньше восточноазиатской лесной мыши. В этой ситуации возникает естественный вопрос, не является ли современная экспансия A.peninsulae реколонизацией северовосточной Азии? К сожалению, в литературе отсутствуют сведения о палеонтологических находках Apodemus на данной территории, которые могли бы подтвердить нашу догадку.

Не менее интересным в проблеме происхождения, распространения и эволюции видов Apodemus является вопрос о причинах и месте возникновения предка еврокавказских видов лесных мышей. Если установленный нами эволюционный возраст лесных мышей является верным, то радиация данной группы имела место в плиоцене. Таким образом, развитие видового разнообразия в Европе может быть ассоциировано с перемещением широколиственных лесов через исчезновение и развитие новых видов. В западном направлении они стали продвигаться недавно, возможно, в плейстоценовое время, в сопровождении видовой радиации на новых территориях. Результаты сравнения двух полуляций (европейской и азиатской) мелкой лесной мыши с восточных частей ее ареала указали на их значительную дивергенцию, что предполагает 140-430 летний период раздельной эволюции. Примерно в тоже время, по нашим оценкам (см.выше), дивергировали между собой различные формы ворон. Совпадение этих событий, очевидно также связано с глобальными климатическими изменениями.

Возвращаясь к видам-генераторам и видам-терминаторам (см. выше), можно предположить, что лесные и полевые мыши по крайней мере трижды в своей эволюционной истории имели виды с лабильным кариотипом, давшие всплеск адаптивной радиации. Появление таких видов можно связать с межвидовой гибридизацией. Гибридизация, как мы уже отмечали, очевидно имела место внутри рода Apodemus, т.к. последовательность отделения видов в эволюционных филумах лесных мышей по данным мтДНК и яДНК, отличаются. Возможно, свидетельством тех событий является наличие в геноме A.argenteus не 48, как у всех лесных и полевых мышей, а 46 хромосом. Широкую межвидовую гибридизацию могут инициировать глобальные экологические кризисы (Красилов, 1992), с которыми эволюционная история Apodemus широко ассоциируется. Таким образом, можно полагать, что для поступательной эволюции (по крайней мере, некоторых групп видов) необходимо чередование лабильных и консервативных геномов. В противном случае, правы те авторы, которые считают, что широкую радиацию видов следует ожидать от экологически пластичного широко адаптированного предка. Действительно, результаты филогенетических реконструкций внутри эода лесных и полевых мышей дают большие вероятностные оценки для деревьев в форме двух кустов видов: европейских и азиатских (глава 5.2).

373

Таким образом, биоразнообразие - это сотни тысяч видов, разнообразие внутри видов и популяций, т.е. разнообразие на кзркдом уровне организации биосферы - от генов до экосистем. Биоразнообразие имеет четкую функциональную основу и является компромиссом между генетически заложенным потенциалом формообразования и ресурсами среды. Каждый компонент биоразнообразия формируется системой, в которую он входит, и, в свою очередь, влияет на эту систему, определяя особенности ее структуры и функционирования. Только системный подход дает возможность в полной мере оценить суть тех экологических и биологических явлений, с которыми мы сталкиваемся сейчас, и прогнозировать будущие события. Поскольку эволюция направлена на увеличение разнообразия, ключевыми в исследовании механизмов взаимодействия организма со средой, а, следовательно, и принципов формирования биоразнообразия (альфа-разнообразия) являются молекулярно-генетические методы, обогащенные эволюционным подходом. Разумное использование генофонда растений и животных, его долговременное сохранение возможно лишь при ясном понимании процессов и взаимодействий между всеми компонентами экосистем и прежде всего - от познания разнообразия. Процесс этого познания неисчерпаем, т.к. с каждым столетием возникают новые задачи, решаются которые всем методическим и методологическим комплексом биологических наук (Алтухов, 1995; Красилов, 1992; Лопатин, 1997).

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Челомина, Галина Николаевна, Владивосток

1. Банникова А.А., Долгов В.А., Федорова Л.В. и др. Дивергенция землероек (Inseotivora, Sorioidae) по данным реотриктазного анализа повторяющихся последовательностей ДНК// Зоол. журн. 1996. Т. 75. Вып. 2. С. 256-270.

2. Банникова А.А., Долгов В.А. Федорова Л.В. и др. Родственные отношения ежей подсемейства Erinaceinae (Mammalia, Insectivora) по данным рестриктазного анализа суммарной ДНК // Зоол. журн. 1995. Т. 74. Вып. 5. С. 90-106.

3. Бекасова Т.С. Сравнительная кариология и систематика некоторых мышеобразных Muridae азиатской части СССР: Автореф. .канд. биол. наук. Владивосток, 1980.

4. Бирштейн В.Я. Цитогенетические и молекулярные аспекты эволюции позвоночных. М.: Наука, 1987.283с.

5. Боескоров Г.Г., Картавцева И.В., Загороднюк И.В. и др. Ядрышкообразующие районы и В-хромосомы лесных мышей (Mammalia, Rodentia, Apodemus) II Генетика. 1995. Т. 31. № 2. С. 185-192.

6. Боескоров Г.Г., Ляпунова Е.А., Белянин А.Н. и др. Ядрышкообразующие районы хромосом лесных мышей (Apodemus s.l.) // Эволюционные и генетические исследования млекопитающих. Владивосток, 1990. Т. 2. С. 3 4.

7. Большаков В.Н., Добринский Л.Н. Академик С.С.Шварц в современной экологии// Экология. 1999. №2. С.84-88.

8. Боркин Л.Я., Даревский И.С. Сетчатое (гибридогенное) видообразование у позвоночных//Журн. общ. биологии. 1980. Т.41. №4. С. 485-506.

9. Борхсениус С. Н., Белозерская Н. А., Меркулова Н. А., Воробьев В. И.// Мол. биол. 1978. Т. 12. С. 676-687.

10. Булат С.А., Мироненко Н.В. Идентификация грибов и анализ их генетической изменчивости методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гено-специфичными и неспецифичными праймерами // Генетика. 1996. Т. 32. №2. С. 165-183.

11. Булатова Н.Ш. Кариологическое разнообразие и родственные связи азиатских Mus/Домовая мышь. М.: Наука. 1994. С.154-177.

12. Буторина О.Т., Сейболд И., Хелбиг А., Соловенчук Л.Л. Эволюция гена цитохрома b митохондриальной ДНК у тетеривинных птиц// Генетика. 2000. Т.36. С.925-931.

13. Виленчик М.М. 1987. Нестабильность ДНК и отдаленные последствия воздействия излучений. М.: Энергоиздат. 190с.

14. Владыченская Н. С., Кедрова О С. Антонов А. С // Научн. докл. высшей школы, биол. науки. 1975. №7. С. 105-110.

15. Владыченская Н. С., Кедрова О. С., Антонов А. С.// Научн. докл. высшей школы, биол. науки. 1976. №10. С.5-20.

16. Воронцов Н.Н. 1980. Синтетическая теория эволюции: ее источники, постулаты и нерешенные проблемы//Ж.Всесоюз. хим. о-ва им. Д.И.Менделеева. Т.25. С.295-314.

17. Воронцов Н.Н. 1984. Теория эволюции: истоки, постулаты и проблемы. М.: Наука.

18. Воронцов В. В., Коробицына К. В. Сравнительная кариология высших песчанок (роды Meriones и Rhombomys; Gerbillinae, Bodentia) // Млекопитающие (эволюция, кариология, систематика, фаунистика). Новосибирск: 1969. С. 111-116.

19. Иванов С.В., Потапов В.А., Филипенко Е.А., Ромащенко А.Г. Гетерогенность семейства Bsp-повторов Canidae: обнаружение EcoRI-подсемейства//

20. Генетика. 1991. Т. 27. № 6. С. 973 981.

21. Коробицына К. В., Картавцева И. В. Некоторые вопросы эволюции кариотипа песчанок подсемейства Gerbillinae Alston, 1896 (Rodentia, Cricetidae) // Эволюционные исследования. Макроэволюция. Владивосток: ДВНЦ АН СССР, 1984. С. 118-119.

22. Коробицына К. В., Якименко Л.В., Фрисман Л.В. К вопросу о систематике домовых мышей фауны СССР (цитогенетические данные)/ Эволюционные генетические исследования млекопитающих. 4.1. Вл-к: ДВО РАН. 1990. С.55-78.

23. Корочкин Л.И. Эволюционное значение подвижных элементов// Цитология и генетика. 1983. Т. 17. С.67-75.

24. Котенкова Е.В., Прилуцкая Л.И. Экологические характеристики видов/ Домовая мышь. М.: Наука. 1994. С. 178-185.

25. Крогиус Ф В.// Вопр. ихтиологии. 1978. Т.18. С. 211-221,

26. Крохин Е. М.// Вопр. ихтиологии. 1967. Т. 7. С. 433-445.

27. Крюков А.П., Блинов В.Н. Взаимодействие серой и черной ворон (Corvus cornix L., С. согопе L.) в зоне симпатрии и гибридизации: есть ли отбор против гибридов?//Журн. общ. биологии. 1989. Т. 50. №1. С.128-135.

28. Куприянова Н. С., Тимофеева М. Я. Баев А. А.// Мол. биол. 1976. Т.10. С.412-422.

29. Куприянова Н. С., Тимофеева М. Я. Характеристика промежуточной фракции повторяющихся нуклеотидных последовательностей ДНК// Молекуляр. биол. 1973. Т. 7, № 1. С. 140—150.

30. Кучерук В.В. Формирование современного ареала домовых мышей. Ареал домовых мышей надвидового комплекса Mus musculus s.lato/ В кн.: Домовая мышь. М.: Наука. 1994. С.56-80.

31. Nature. 1987. V. 325, N 6099. P. 31-36. inn R.L., Stoneking M., Wilson A.C. Mitochondrial DNA and human evolution //

32. Evolution. 1985. V. 39. P. 783-791. slsenstein J. PHYLIP (Phylogeny Inference Package) manual version 3.3. Berkeley.

33. Rosicky, 1952)//Z. Saugetierkunde. 1983. V. 48. P. 155-160. эттеке H. Protein variation und Taxonomie in der Gattung Apodemus (Mammalia,

34. J. Mol. Evol. 1991. V. 32. P.128-144. ffreys AJ., Wilson V., Thein S.L. Hypervariable minisatellite region in human DNA //

35. DNA// Biochim. Biophys. Acta. 1978 V. 83. P. 269—273. jrland C.G. 1992. Evolution of mitochondrial genomes and the genetic code//

36. Sci. USA. 1994. V. 91. P.5748-5755. 'Brien S.J. Genetic and phylogenetic analyses of endangered species//

37. Annu.Rev.Genet. 1994a. V.28. P.467-489. 'Brien SJ., Everman J.F. Interactive influence of infectious disease and genetic diversity in natural populations //Trands Ecol. Evol. 1988. V. 3. № 10. P. 254259.

38. Brien SJ., Goldman D., Merril C.R., Bush M. The cheetah is depauperate in genetic variation // Science. 1983. V. 221. P. 459-462.

39. USA). V.68. P.799-802. eek R.E. // Science. 1981V.213. P.443-445.mmer A.T. A sample technique for demonstrating centromeric heterochromatin //

Информация о работе

Челомина, Галина Николаевна
доктора биологических наук
Владивосток, 2000
ВАК 03.00.16

Диссертация

Эколого-генетические и эволюционные аспекты биоразнообразия животных - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы