Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование генов серобогатых кератинов овцы и человека и их сравнительное изучение

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование генов серобогатых кератинов овцы и человека и их сравнительное изучение"

••••• к-,* '.-л.

• о- -1 • •

ИШКСТЕРСТВО "ХЕДИЦШСКОИ И «ЙСРогпОЛОППЕСКОЯ ПРОШШЕННОСТИ СССР

ВСЕСОЮЗНШ Н&УЧЮ-ШУШДОВАТЕЛЬСКИЯ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

ч

5

на правах рузссппся

2УШБАЕВА БАКТЫГУЛ ДАУСКОЗАЕВНА

КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНОВ СЕ^ОБОГЛТШС КЕРАТИНОВ ОВЦИ И ЧЕЛОВЕКА И ИХ СРАВНИТЕЛЬНОЕ ШЗЗЧЬиЖ

03.00.23 Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

дисссртация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КОЛЬЦОВО-1992

Работ« выполнена в Отделе ыолекуллрной зибраогаютшш □ клеточной даффарсицировка Института молекулярной генетики PAI

Научный руководитель:

доктор биологических наук« прсфсссор К.Г.ГАЗАРПН

Официальные оппонента: -

доктор биологически наук, профессор Н.П.Мертвецов доктор Сиологпчеысих наук, профессор О.Л.СЕРОВ

Вэдутцап организация:

Защита состоится

- Всесоюзный научно-исследователь институт генетики и селекции прошшленных микроорганизмов Мшшедпроца СССР

■о ученого сове'

1992 г. в

заседании специализированного ученбго совета К.098.00.01. щ Всесоюзном научно-исследовательской институте молекулярной баоЛогаа по адресу:

633159, Новосибирская область, пос.Кольцово, НШГВвхтор".

С диссертацией шкко ознаконаться в библиотек БШШ истекуллрной й-.ологии.

Автореферат разослан

■Д" (pip-

.1992 г.

Ученый секретарь снеццалпзировашюго совета,' кандидат хишчеекпх наук

Т.Н.Шубина

тотальность теш. бэлзст, I!3 KOTOpliX состоят полос ЧОЛОВОКП H

'•êfe^fe'!ШКОШ1тащах, пиенуеиыв хераяшши, представляют собой боль-jyn и весьна гетерогенную группу плозо растворима белков. 1'м располагаем зграйне скудной и;::5ср:1ац*лей об этих белках п код /ш?« их гага? , тем, учитывал ванное хозяйствипгоз значение карста опци -рзшюго проштлениого сирья, выяснение природа и свойств, структуры i голекулярно-генотпчесзщх маханязков биосинтеза образущнх их бел-:сга язлязтсл одной из актуальных задач науки. Сереть сельхозигоот-П1Л, ео прешп.чешше качества обусловлены различишь параметрами та-шул, как длина, тонина, изпнтость а т.д.. Все зта параметр», в свою лередь, определяются тсн, из какпх белков состоит волокно шерсти, :ик она организованы п как формируется конкретный тап волоса из этих îbjkob в ходе терютальной доМэреицвровкп кератшгоЗрозугщих плеток.

в .настоящее время в гшвотноводство и прсингшвзпгости известно ■шогестао разных по ценности типов перста. Эта огречтае' разнообразил ¡гачества перста свидетельствует? о пстетах потенциях нолекулярно-гркетнчвекпх п клеточши шханпзиов биосинтеза, организации кератинов п морфогенеза злецентарзпк структур ceppTij.

Задача фундаментальных я прикладных направлений совремеш -Я бп-ологзл - по только изучить е лсонсмзрностп бпоепчтеза, структуры, организация бэлзеоз волос н их генетической основ«, но и вил«, .ить воз-LtoniocTn управления процессаип, спределяЕгзлзл становление ценшх дет про!злзляпюотн качеств сэр cm ссльхсзегвоткых.

Биотехнология - есть современное направление биологической науки, которое используя рз' /льтзтц фундаментальных исследований, раз-рабзтшзает путл а штоды пх практического использования. Являясь в основе фундаментальной, настоящая работа гшэла своей задачей вменение нолекулярно-генетичеекпх, конкретно - reiL ix и белковых основ, определяющих структуру волоса человеза н перста овец и создаэпе основа для новых подхс '■з в биотехнология - управления мехазш. л s мл, лзйащжш в основе формирования свойств шерсти. Однако, учитывая, что зта область науки очень нало разработана п имеются больше просела в наших представлениях о фундаментальных сторонах гетшо-Селкового устройства волоса, работа была посвящена, главным образом, получению новых дашшх о струк'.. ре геноз и белков одного из важнейших ыолеку-лярных компонентов волоса - серобогатих кератинов. В связи с зтии, более глубокое изуче1ше белков этой группы и кодирующих их генов, изучение их роли в ^риированпа волоса жазт бочьшое значение для современной биотехнологии, в частность, в создэшч пут ей ианипуллцип с кератиновцки генаия' пород овец с центах! качеотваии вр-отн .

ЦЕЛЬ К KOItKFETHUB ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящей работ: било проведение фундаментальных ыолекулярно-генетическлх исследоза пай систеии биосинтеза белков волоса человека и шерсти сельхоззошот них (овец), конкретно - клонирование и молекулярная характеристик генов серобогатых кератинов овцы н человека для их последующего пс пользовашш в биотехнологии - получения трансгешшх овец с улучшен ныын параметрами шерсти. Исходя пзэтой цели в задачу работы входа ло: I. клонирование и структурное изучение генов серобогатых кератв нов овцы и ловека; 2. сравнительное изучение этих генов и кодируе кых иш белков матрикоа шерсти овцц п человеческого волоса. .

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.И ПРАКТИЧЕСКАЯ. ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Впервые Dpi клонированы два гена серобогатых кератинов человека с протяженны флашафуицики областями, обозначенные как НВ2А и 1Ш2В. Установле] полная первичная структура кодирующих ч фланкирующих областей an генов. Изучение первичной структуры генов человека позволило вперв! получить 'информацию о структуре кодируемых этими генами белков.

В результате сравнительного изучения нуклеотидных последовотел ностей кчонированных генов с аналогичными генами овцы выявлены ко стонтные и из! .'Нчивые участки в кодирующих, а также в 5'- и З'-фла jaipyiociiix областях генов, высказаны предположения об пх возиогн фушсциональьой роли в регуляции транскрипции этих генов, в форкпр вании структуры волоса.

Анализ кодарущих областей генов серобогатых кератинов челове и овцы и их сопоставление с последовательностью аминокислот, коди] uui этими генаии, позволили выявить редко встречающийся случай 6¡ трого изменения участка белка путем локального сдвига рашш считш Ш1Я в результате однонуклеотидных вставок и делений.

Получен набор рокоибинаь.лых плазиид, содермп^и remi серобо: тых кератинов овцы казацкой тонкорунной порода, которые можно i пользовать для микроиньекции в зиготы и получения трансгешшх шв шх с измененными параиетраии сарсти.

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 5 работ, эультаты исследований докладывалась на республиканской научной и ференции по проблеиаи физико-химической биологии a биотехнологии, (Алма-Ата,1989), X симпозиуме СССР-Италия "Сиев,1990) и на втс рабочей совещании по проблеме "Регуляция экспрессии генов илекош кцих", (Новосибирск,* 991).

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, об: литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выв< и el ска литературы,вклхнающего 108 наименований. Работа изложен 108 страницах машинописного текста и содержит 26 рисунков и 2 Tai

- 3 -МАТЕРИАЛЫ И ГЕТОДЫ

БАНТЕИТДЛЬНЫЕ ШТА^Д!, ПЛАКДЗДЫ И БАКТЕРИОФАГИ. Шташш • colt DP-CO (Ианпатис п др.,1984) п ТАР-ЭО (Patterso. st.al., £37) бшга пспользовеш в качестве НС2 хозяина для выделения п зсгягогення рексибплантов бактериофага TG-1 (Магшатпс п др., БОЛ) я плазгадгаю вектора pBS* н pSR (Stratogene.CQlA) цс-ользовалпсь для работ по клонировании. Баетераофага !ЯЗ up 18 гф 19 (Yanlcli-Perrm et.al., 1985) попользовались для подучо-ия одкоцепспечной формы ДНК для секвенпрования. Бахтерсофаг-Л. 'ХЗЬ-З (Fricchnuf et al. ,1583) бил попользован для конструпро-аипя генс?люй библиотеки.

Вояы=аютво рестрпхцпокзшг зцдонуклваз п других "ргзнтоз полученн пз ЕНИИПЭ (г.Вплывзс), а таксе от фяри üobrlnser lürinhelra, ¿rarchan, Blolabo, Йнщоас1а-ШВ.

ДНК Ш Б2ЛЬ5 ЭЛЕМЕНТОВ КРОВИ взделялз по стандартной ятодзнэ ( Нзшатас п др.,1984) с накоторцга иодн^якацпяд!,

. ПЛАЗЗДШ) gait Евдзлпла щелочили игтодсмД В1тгГ ota, » ÍOly,1S79).

ШЩ^ЯГа САГОЕОП ДНК осупестштага d соответствия с описаний :,2То,"т:;.сЛ (Pattercori et aI.,1S3T).

7?Л1ЖГ0~ПЦПЛ клеток В.coll проводили по шгтоду Zainiaxana, лпсокмг^ в руководство ("Юняпроззяпе ДПК. Катода",ISB3).

fmt пз галл посла сепаративного олектрсфореза гсуг.зстзлпгп пра nci:ü~_-j t ктсаетшсй буиагп (ПА-45) (Schlcíher :nd Scliull, Запздззя Герцаппп) по ыротсссолу, предлагаемому ¡■зрцса.

im^uCC ДНК na иеЗгсноепй Спхьтри Ilybcnt. - !f (Дяггайаз, йнгсш) а ::айлоновь:з usajpami Geno Screen Plua ЩЕГ.США) прсво^алп по протс:аэлг.'? предлагаете фардай-пзготоЕзтелян.

KOKirii-j шЮВ&ШЗ геномной Спблээтгет овца на основа фагового пехтора СЛЗЬ-З, а такта попек рзвсыбанштых фагов с геизиз сероЗогатал караттюэ проводили по стандартнзи шгтодшеа:! ("эта-, атас п др.ДС84). Упаковочные экстракта балл получена в ППКО "Дзагностлку:!".

Гепст.т::.пл библиотека била лябззно предоставлена Г.ti.Долгспог.'.и (1!БХ MI СССР). t .

првдпгрддяздцгп п гаь'кщ'лтгд проводин прз 65°с по стандартно;! г-етодака (Ианпзтпс а др.,1^84). Для скрзклзггэ ге-иешгой Сг.Слдотска овци использовала олзгс:г7клеотидина ю: tj,

синтезированные исходя из первичной структура гык Е2А. Soí¡ метали достройкой в присутствии d-®^Р-трифосфатов (Ташкент) щ помощи Фрагмента Кленова. Для асршшнга геношгаД библиотеки чс ловека использовали, в качестве зонда, кодарущуы часть гена I овцы и метили при поионз рассешшой затравка с использование набора для меченая Uultlprlne DNA labeling Syaten) ("АюегвЬгш" ]

СЕКВЕНИРОВАНИЕ проводили по методу Сзнгера (Sonder et al, 1977) по протоколу, предложенному в руководстве фарт АюегвЬ: ("Ы13 cloning and sequencing handbook").

КОМПЬЮТЕРНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Сравнительный анализ нуклеотидных в аминокислотных последовательностей проводила использованием пакета програш! PC/Gene (Intelllgenetico, США Информация о нуклеотпдных последовательностях генов илеколита пцах и приматов получена из базы данных Информацпошюго цо:ггр 1ШГ АН СССР, сформированной на ос эвв БД ЕШЬ (Гейдельберг).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНОВ СЕРОБОГАТЖ КЕРАТИНОВ ОВЦЫ КАЗАХСКОЙ ТОНКОРУННОЙ ПОРОДЫ

Для выделения и клонирования генов серобогатых кератш семейства В2 проведен скрининг геношюй библиотеки овцы казг ской тонкорунной порода. Поиск генов проводился при помощи ои гонуклеотидных зондов, синтезировашых исходя из нуклеотнда последовательности гена серобогатого кератина В2А (Powell al.,1983). В результате скрининга 1,5 х I06 рекоыбинантных ( гов был найден один фаге iA клон с позитивным сигналом. Раз] клонированного фрагмента ДНК овцы составлял 16,6 т.п.н.. Pi триктная карта прок..онированного нами Sali- фрагмента, пост енная с использованием метода одиночных и двойных "перевар рестриктазами, показана на рис.1.. По данным блот-анализа фа вой ДНК на рестриктной карте Сшш локализованы два участ гибридизупцихся с зондом. Сравнение рестриктных карт этих фр ментов с опубликованной в литературе австралийскими учен (Powell et al., 1983) рестриктной картой показало, что нами делен из генома овцы фрагмент ДНК, содержащий гены серобеггг кератинов -В2А и В2Д (рис.1.). Как видно из этого pacyi рестриктная карта клонированного нами 16,6 т.п.н. фрагмента овцы казахской тонкорунной породи имеет большое сходство с г

t.

VIVJÎWB

'U 4 'ii'Cv^i 4

'I

Ж

i й if

î

ГШ

i

¿1 w я ^

й w«

L

лл/w-

4 4

Jîriur.

i 1 Sri

E»

Pnc.I. Сравнение рестриктзгой карта клонированного нага рашгнта ДШГ овиц, содержащего rein; В2А п В2Д (В.). с опублп-ювамюй в литературе аналогичной зсартой (Л.) (Powe'\ et al., 983). Застрахованные участки - кератиновыо* гены, вол!шст. • ппгаа - локализация повторор,

югпчнсй зсартой фрагмента ДНК, содержащего гены серобогатых ке-затинов овцы породы Австралпйсзшй мершюс. Тен не ыенее, при шпмательзюм пзучезшп их рестрпзшшх карт удается обнаругпть зазлячпя 1,'.еяду зама. Так, были найдет ХЬа1-сайт в З'-флазпшрузщей области гезш В2А п ЕсоЕ1-сайт, располохезпшй на 5,5 т.п.31. îMze от терзлпгарующего кодона гезш В2Д овцы зсязах-зкой тозпсорузшой породы, зсоторые отсутствуют i соответствующих золохениях фрагиезгга ДНК, зшозтровазпюго австралийсзазмп учезш-ии. Кроме того, отсутствует Stul-сайт, лозсализовазшый ь З'-кодирузсщей части гена В2А австралийсзсой породы, в аналогичной области зизозшровазшого нзздз гезш В2А. Эти различия позволяет сделать заключение, что несмотря зш большое сходство рес-тржстзых зсарт фрзгггзнтсв ДНК, содерзащих гезы серобогатых зсера-тизюз - В2Л п Е2Д - с эц пород казахская тонкоругаая и австра-лпйсзскЗ 1.:зрттзюс, варьирует длпзи зшзсотори рестриктзшх фрагиезз-тсв, что потаоляет в дальней-:»;» изучить гегтородннй полг-гор^изг* овез; с рзплггптн:,! тип^ч персти. 1 .

В .-яторатурз ( Ро'.тсИ et al.,1f^3, RogorB,19Q4) итавтся д?!ппт о нз.тппп четырех тппси повтороз во флзнзшрук^яз блпс-

тях генов серобогатих кератшюв овцы, природа которых остевй' лась невыясненной. Hau удалось при помощи блот-габрадазаци клонировашюй нами ДНК овцы с фрагментом ДНК, содераащш Pfltl-повтор, показать присутствие этих повторов во флшпшрующа; областях генов серобогатых кератинов овцц. Рв11 -повтори бил описаны ранее для генома быка и изучены Акошшои К.Г. п его со авторами (Лкопян и др.,1990). При этой ими било обнарукено, чт они характерны только для подотряда üualnantia и показана п локалиг>_ция во1фуг гена гормона роста быка. На рестриктной jcap те 16 т.п.н. Sali фрагмента ДНК овци показано, что область, го иологичная зонду , локализована в двух участках - Xbal/Pct (величиной 1,15 т.п.н.) и Fatl/EcoRI (800 н.п.).

Pot1-повторы были обнаруяены вблизи случайно выбрашш структурных генов - гена гормона тюста быка и кератиновых гено овцы. Это свидетельствует об определенной сцепле1шости ати повторов со структурными генами. Однако, функция этих повторе неизвестна. Возможно, они участвуют в регуляции активности эта генов.

2. клонирование фрагментов днк человека, мещих области

гомологии с mm серобогатого кератина овцы в2а

Для клонирования генов серобогатых кератинов человека на» были использованы четыре геномные библиотеки человек. В качес тва зонда бил использован один из фрагментов ДНК, вшцепляеш рестриктазой Нсо1 (рис.1.), содержащий ген кератина овцц B2J Успешным оказался скршшнг только одной пз четырех пепользова] 1шх библиотек ( предоставлена Г.М.Долгановым ). iia не-могем ni ка объяснить, поче1Г скрининг трех остальных библиотек, две i которых сконструированы на основе фагового вектора EMBL-3, одна на основе косниды, был неудачным, несмотря на тот фак' что ранее из этих библиотек' было внделено много других генов, том числе уникальных. Очевидно, ш столкнулись с трудностя)

* клонирования некоторых кератиновых генов, которые уяо о rua лись другими авторами. В результате скрининга был выдел единствешшй фаговый клон, содержащий фрагмент ДНК челове: размером 15 т.п. ..

Анализ ДЕК этого фагового клона методом блот-гибрпдазац показал наличие двух областей, гибридазующихся с зондом. В к честве зондов, в дашюм случае, использовался либо цеченн

загиезгг ДШС с гезюу В2А, либо иачезпия пара олигозгуклеотидгв, зпользояазазея для скршшзсга библиотеки овцу. Рестриктная змр-) 15 т.п.31. Грагисзгга ДШС человека, содераазцого два участка зуологип с гонаш зазратизюв овцы, представлена на рис.^.. Казс вдцо пз зтсй карта, расстогаше цеяду гекаш равно пряблиза-эльзю 6 т.п.и., что на 3,7 т.п.зь болызэ чей расстоязше иеяду 3313113 В2А а Е2Д овцу. Г£етодои Олот-гпСрпдозацил в выделззшои яозю била такта обнаружены участка, пзСрвдцзухзсгзеся с кечезг-ой тотальной ДНК человази, что свидетельствовало о наличии кд-пх-то часто повторлзш^хся последовательностей.

Рис.2. Рестризигаал зсарта 15 т.п.н. Фрагмента ДЕ&С человека, зодергацего гезш серобогатых зазратипоп. Закрашезоше участзш -гокализацпл гезюв, заптриховазпше - участка, гибридизущие с ^зчезшой тотальзюй ДНК человезса. Стрелками указаны направлезше а протякевпгость сезшениро. азпшх фрагментов ДЕОС.

Блот-гкбрпдпзоцяя клонпровазшого назга фрагкезгга ДНК человека с ранее зелонированныц 16,6 т.п.н. фрагнезпоы ДНК, содерзса-сда два гезш серобогатых кератинов овцы показала, что гомология иежду зоил распростразш° ся, главным образои, зм области, соответствуете генаы В2А и В2Д, а также на близлежащие флазоазруп-пре области генов, тогда как неагезшая область и последовательности, ззе ииезцие отзюпеняя к регуляции активности этих генов не имеют плп инеют мало гомологии с выделезшзш фрагментом ДНК человека. Эти результаты позволили сделать заключение, что клонировазпиге згага участзщ, гомолопггные генам серобогатых кератизгов в составе 15 т.п.н. фрагкезгга ДНК,из генома человезса сохразшли значитель- узо гомологии в ходе эволхшгт и соответствуют аззалогичзшзд генам гезюиа овцы.

1325 ,У00°

3. анализ нуклеотидньк последовательностей фрагментов днк человека. гомологичных гш в2а общ! -

Нуклеотадкую последовательность фрагментов ДНК, гомологи них гену В2А определяли по схеме, указанной ко рас.2.. В р зультате установлена первичная структура двух областей, гомол гичных зонду и включающих кодирухире о фланкирующие области г нов (рис.3, и 4.). В первой случае удалось определить нуклг тидную последовательность 353 нуклеотидов до AIG-кодона 345 нуклеотидов - после терминирующего кодона. Во втором а чае, из-за отсутствия удобных сайтов рестрикции для субшюни] вания, определили только нуклеотидную последовательность I' нуклеотида до Tomas инициации и 65 нуклеотидов после ст< кодона. Анализ их нуклеотидкых последовательностей показал i личие, в каадой из двух изученных областей, открытой рашш с1 тывакия: в первой случае длиной в 177 аминокислотных остатк во второй 175. Процентное содержание остатков цистеина рав соответственно, 25 и 26 процентам. Таким образом, очевидно, фрагмент ДНК, размером 15 т.п.н., содержит гены, кодирующие робогатые кератины человека. Анализ куклеотидных последовате ностей клонированных фрагментов ДНК, позволяет также сдел заключение, что подобно генам серобогатых кератинов овцы, £ логичные гены человека не содержат нитронов, что характерно всех изученных генов белков матрикса шерсти овцы (Frenke] al.*, 1936, Kuczek et al.,1987, Powel et al.,1983) Размеры t ков, кодируемых генами овцы и человека также очень близки сравнения кератины овцы содержат: В2А - 171 а.к., В2Д -а.к., В2С - 151 а.к. и i~B - 156 а.к.).

Одним из перр^х этапов анализа данных, полученных мет ми сеюзенирования нуклеотидкых последовательностей является иск гомологичных последовательностей и определение степени мологии при помощи компьютерного анализа. Результаты сравн фланкирующих и кодирующих областей генов серобогатых керат человека с аналогичными генами овцы высокую степень гоиол как в белок кодирупцих, так и во флаге чрупцих областях ге Учитывая вышеперечисленные характеристики, также исходя не го, что у энированные нами, имеют высокую гомолох

генами серобогатых кератинов овцы семейства В2, им были названия НВ2А и НВ2В ( Humana В2А и Нишалв В2В ).

а(затсастт6 тсслтбтлта ассасатбос ааассггсаас стсаабостс ллстпзлллт татассаттв тттбтаааса матотгаас атттттасса аэзасаааса сатттбйтвл статтасзсгш аб(зсаатаа6 слаалатсаа ттттсаоатл татттаааас ааттсабсат ттсаассатс абаюзссст а6лалозстб""етттаааблз та ас а аса, л аааатвттсзс тсбссасааа табаязаатт шхсабаст татааааабс сжсаотозл атанзсасзсс АТААТТСАвА ААСТССТССА АвСААССААС сттсаваттс аастсстсас АССАЮЗССТ 6ст6тса6ас саосттствт кзатттссса бсгестссас саствббасс кзсбвстсса (зскзстссса оссаабствс татбабасса бстсхпссса бссасбстос тстбабасса остестбсса 6ссаа6сюс тбссабасса (зсттстбтэз -атттсста6с ттстсаассб етббсасттб тбастстак: юстбосаос сааостбстб тбаааста(зс тбстбссабс саабстбста ссабассабс тсстбсббаа стс6стбт(36 саттбстбст ббсаттббст АтазссдазА азбСАБСАСТ етлостетба бсасссстат слеттезтсс сбсссабаст ' бссствтбвд «зстасстбс сгссссссст бстшзкэзт бабстсзсасл сссссатсст

бстбссабст бсассасбсс баоосстсст бстоссбссс атсстастбт ббасабтсст

бттбссоссс Аотстестбс тестАстест стбабсссас ттбттбааа'а сстссттсте ,

стбшзатсс тбатаабатб бсассттааа аста6ссааа ттабаатсст аасаатсттс ,! тбаастссаб тасстатаас тббссттоса асстстсатс асасабсслс атаааттсст аббаабтааа ттсатттаса атбзаайасс аааааттттт .сстаба тгб бттбтсаесс ааа(зтсстас ААТвТвМАА блбттабата статтттаст атааататса сстб^атат ; ттсаасастт аттоззастт ааактаата аааоттттса """тстслатб л^латтйтт ! сггттбаастт тстттстстт шаасссасс аа |

Рпс.Э. Нуклеогидная последовательность фрагмента ДНК человека, содерзащего ген НВ2Л. Подчеркнуты последовательности, пыесЕцие отношение к инициации п терюнацни транскрипции, стартовый- п стоп кодоны трансляции п инвертированные повторы в 5*-а З'-фланккрукцих областях гена.

3.1. Сравнение структуры генов 1ЩА п НВ2Е со структуро. аналогичных генов овцы.

ГТра сравнительном изучении кодирующих областей генов НВ2А п НВ2В человека с аналогичными генаш овцы было показано, что кодирующая область гена НВ2А пиеет гомологию с генои В2С на' 73Х, а с генои В2А - нч 75,2%. Ген НВ2В также высокогомологичен генам В2С (73,3%) и КгА (73,5%). При этом следует ответить, что для обоих генов консерватизм характерен, в основном, для второй половины генов. В зтих областях генов различие между гати определяется лишь нуклес ¿'Вдкыиа заменами. ""ничем заме}, встречаются

AATTATCCAA CACAATAAGG CAGAGCTTCT GAATTATGTA AACAGTAGCT GGCCAGGC ATAAAAGGCC AATGTGGCAG CCATCACCAA AACTCAGAAA CTCCTCCAAG CAACCCAC TTCATACCAG CTCCCAACAC CATGACCTGC TGCCAGACCA GCTTCTGTGG АТАТССС/ TGCTCCACCA GTGGGACATG CGGCTCCAGC TGCTGCCAGC CAAGCTGCTG TGAGACC; TGCTGCCAGC CAAGCTGCTG TGAGACCAGC TGCTGCCAGC CAAGCTGCTG CCAGACC/ TTCTGCGATT TCCTAGCTTC TCAACTAGTG GACCTGCAGC TCAGTTGCTG CCAGCCAJ TGCTGTGAGA CCAGCTGCTG CCAGCCAAGC TGCTGCCAGA CCAGCTCCTG CGGAACTC TGTGGCATTG GTGGTGGCAT TGGCTATGGC CAGGAGGGCA GCAGTGGAGC TGTGAGCJ CGTATCAi.3T GGTGCCGCCC AGACTGCCGT GTGGAGGGTA CCTGCCTGCC CCCCTGC: GTGGTGAGCT GCCACACCCC AACCTGCTGC CAGCTGCACC ACGCCGAGGC CTCCTGC' CGCCCATCCT ACTGTGSACA GTCCTGCTGC CGCCCAGTCT GCTGCTGCTA CTCCTGL CACTGCTAAA GCAGTTTGCT GATTTAACTS AAATTCCATT TCAGTTCCAT TCAGTTA, AATAATTCTA AGAA

Рис.4. Нуклеотидная последовательность фрагмента ДН человека, содеряащего ген НВ2В. Подчеркнуты последовательности шеище отношение к инициации и тер мшшщш транскрипции стартовый- и стоп-кодо1ш.

как в третьем положении, так и в первом и второй положениях ко дона. Однако, все-таки, во всех четырех случаях преобладают за иены нуклеотидов в третьем положении кодона, что, ввиду выроя денности кода, в большинстве случаев не приводят к аминокислот ным заменам в белке. Первая половина и 3'-концевые области ге нов подвержены как нуклеотидным заменам, так и инсерцияи/дела циям единичных нуклеотидов. Так, в гене НВ2А, при сравнении ei с генами В2А и В2С овцы обнаружено, соответствешю, 24 в 17 дс леций и наоборот, гены и В2С овцы по отношению к тену НВ2 имеют 18 и II делет>"1овашшх нуклеотидов, В аналогичных облас тях гена НВ2В также имеет место делецпя 19 и 13 нуклеотидох обнаруаешшх при сравнении их с генами В2А и В2С, соответстве1 но. А в генах В2А и В2С, относительно гена НВ2В, обнаружено 8 25 случаев делеции, соответственно.

Однако, следует отметить, что случаи нуклеотидных делещ в генах НБ2А и НВ2В, произошедших в ход' эволюции, не привод; к сдвигу всей рамки считывания, а обусловливает изменчивое] лишь определении участков гена. В данном случае мутация затрг гивает первую половину кодирующей области и небольшой участи прилежащий к 3'-концу гена, являющиеся мишенью для инсерций/ДЕ

зцй*. Ora дзико, поягзезпаш при српшкпшя зсодоругетх областей :ноэ ГШ2Д и IID23 чсловтсз с спалоиглиш областям! генов В2А п ЗС сзну, демонстрируют, что в хода зволщии гонк серобогатых :рзт::::с:з cdhji п челозэка прзторпопзя! изуззшнпя, сохраняя при rej кокеерзэттазше области.

Что зсзсазтся 5'-флазпсгрух^хх сблосгей гоноз ЕП32А и ЕШ2В, э срззнезта их с азизлопгпплз облзстама гонов В2А п В2С овщз зкгэ показало достаточно втсскуи гомология. Здесь, тоге momio вдзяпь "и-зстзсп с высокой в сллбой гсггалогаей. Однако, зю об-вртгяяо кокоЗ-лябо протязвянеа"- обязста о ярко взрахенной гомо-отпзЯ. Нзг^а::са гонолопгаш б'н^тассфТЕярп сблзсти гена ЕШ2Л эотг о тстоу о я область гзнз D2C (73,33), тогда itsic нзгду гепз-з Я22Д я ШД хе&ояагоа С7,ЗЯ. 'з,т?сь ucsno ornaran несколько r.:cüTpzr::~:r'?: унзстг.огз: последовательность, призяданщзя в точ-з шпгцяахрп, прсиоторнио , участки, содсгрзгг^ло ТАТА-бокса и ЛТ-сгатаз сбягетп.

0*-<-лз!гхз!руг!?эя область гозкз ПЕЗО таоот относатолыю оди-свбсыЗ уропскз» гслоясгся с акзяопгашя сбластяки с "оях гезгов G5,I3 п СЗ,С;*>. Тут, аз пскявчсшкш ТЛТА-послздозатольззостсЛ л сатодопатз.тагсстей, располо-еших о ргйоло -4? —36, в случае з:ш Е2Л, п —53--23, а случае гена Р2С, но ниептся зпзказсой

с1юлсгии.

Сузг-лг/я дзгама сргюттзяыюго тшзза б'-флаззкирузиднх сб-гстгй гатаз со%сботатлх кзрзтгяюз чзяовазаз - 1Ш2А п 1Ш2В - и büM - £2Д п Г2С, ползю капать, что для зпх знряду с вариа-'агь::жл.]п sevicia характера тзтси нггфотлпензше зсоззсерпатив-из упзстзш.

ЕТрдэтс^ляло тсзсге тггергс срзигсняа б'-нззи-дирувдях облас-'СЯ, 1!5ПССрС^С?2Э1С» пршпвеяззх к »цциршруггузау кодоззу генов Б2Д и П223 с г:илоп:™а' j сбязотлт гзноз Сслтсотз ттршсс" перст. Ранее, гта гззучезпп гаяоэ незюторнх бзлкогз иптршсса перста етгл (Рс'.тЛ? oí al.,1033, Kuczek et al,1S'27,7reri:ol ot al., S33), C'tm сЗлзртгэпа спсоясхеисбрзаттшя Ю-нукязотндиая по- -!яздооатэям?ооть, прядзггжзэя к /ЯС-кодояу п шяяатаал 'цзтргггс-гггг;гг.;1."пгой ..исяздса-талкгсстьэ''. Схаозлосг», wo эта !сслл"С25г:."г::згт& прт:су7сл^гс7 :i у гепоэ ссрсйогатах ;:срзглт:ов юлозс;» - 1ПЗЗА г: ГаШ. ' ¡Тгзкгзн ртагеиь го:?ологзгз 'датряхс-спьгтт^зчяазг лссл.здозз70ям»с7Р'* ксрагшгоп"х reiroa гад »зця ti ППЗД п 1Ш2В "т.'логгокз да^'з е:««, чегх кеггд/ ceJirSciii-iiiJ '&ITO3 друк!^ :r::;ccnrjz Co.r.Ttot> г?атр:гг:с/) гарст:? ot.iijj ),

-18 ссстсстстс I 1111 тасааттстс III 11111

-1

\acccaactcctgacacc атв I Ш1Ш1Ш1Ш! ■\gcccaactcctgacacc I II III ПИШИ СССАОСТСТсКбССТААССССТЗАСАСС III III! 11111

III

II

сссаоасттс ат асса(зстсссаасасс

И III

II

I

I

I

II

шшшшп

ссаассттса заттсаастсстоасасс

I I

III I

II

бссаааабааассаагйттсссээтбсс

I I

.III

III

тсаатаааааасасабсттсссаасасс

II I II шш

СЗСТСТССАЛе :сосссаасссазасасс

II 1111111 III

татссааатс лтсссастсствссаса

о. В2А о. В2Б о. В2С НВ2А НВ2В о. В III ВЗА о. В III В4 о. втк-р о. 6ТК-С2

94% 83% 72% 83% 44% 44% 61% 61%

Рас.5. Сравнение гомологии "иатрикс-спецвфзческвх" после довательностей генов белков ыатрикса шерсти овцы в серобогаты кератинов человеческого волоса ( в X ). ■

3.2. Сравнение структуры генов серобогатых

кератинов человека НВ2А и НВ2В

• Гены НБ2А и НВ2В человека высоко гомологичны ыевду собс (9515) (рис.6.). При сравнительном изучении нуклеотидных последовательностей кодирующих областей этих генов была обнаруке] 21 нуклеотидная замена ^лк в З-пологении кодона, ток при I-2-положениях. Кроме того, выявлено 6 случаев инсеродай/делец единичных нуклеоти„ов в разных кодонах, три из которых в це: тральном районе, три - в 3'-концевой области гена. Инсерци делецил в центральной области привела сначала к сдвигу, потом к восстановления рамки считывания ЗБ-нуклеотидно фрагмента гена, в результате чего был потерян один кодо Таким образом ген НВ2В, в котором, по сравнению с геном НЕ на 6 нуклеотидов меньше, кодирует бе. к, укороченный на £ аминокислотных.остатка.

Ген' НВ2В отличается также, наличием в нем Рв'Н-сай!

Рпс.6. Сравнение нуклеотидных последовательностей кодируюада облаете 11 генов - НВ2А и НВ2В человека.

Ш2А

тв

ЯВ2А №2В ЯВ2А НВ2В НВ2А КВ2В НВ2А НВ2В НВ2А НЕЙВ -НВ2А -НВ2В -НВ2А -НВ2В -НВ2А -НВ2В -НВ2А -НВ2В -НВ2А -НВ2В -Степень

АТеОССТОСТСТСАеАССАбСТТСТСТВвАТТТСССАбСтеСТССАСиАв -50

АТ6АССТБСТКЖАЬАССАВСТТСТ - 50

ТССБАССТБСв&ТТССАвСТВСТСССАвССААвСТВСТвТБАвАССАОСТ -100 Т&ЗвАСЛТвСв&ТССАвСТ -100

ССТ0ССА6ССАСССТ0СТ6Т(ЗА(ЗАССА6СТ0СТ6ССА6ССАА0СТ6СТ6С -150 6СТОССА(ЗССААБСТ ЭСТИС -150

- САСЗАССАСЗСТТСТСП^

- САСАССАОСТТСТК

ГТТССТАбСТТСТСААССОВТСЗЗ/ЗТТаТбА -200 ГТТССТАСКТТСТСААСТАОТС 3-} ССТСЗСАб -198

- СТЗТ/ЗСТОСТ6ССА6ССААОСТ6СТ6ТСАААСТА6СТ6СТ6ССАОССАА -250

СТ

!-/ ЗТТССТ6ССА0ССААССТ0СТ6ТвА6АССА0СТ0СТ6ССй1зССАА -24?

- ОСТ&ЛАССАвАССАвСТСС.аСввААСТваСТВУввС^Т&ЛввГвВС -300

- бСТССТОССМЗАССАОТ -297

- АТТОЭГГАТвСССАОБАввОСАвСАвТШвСТвТвАвСАСССвТАТСАв -350

- АТТООТЛТЖСАгаЛГЗГСАК^ -347

- ОТССТбССбСССАбАСтеССаТСТОСАВОСТАССтеССТБССССССТОСТ -400

- СТКЗТвССБСССАбАСТ(ЗСССТ СТШЛбОБТАССТ(ЗССП оССССССТОСТ -397

- ОС6ТШТ6АОСТОС-А°АСССССАТССТ6СТОССА6СТ(ЮАССАСБСС6А -44?

- етСТбаТбАбСТОССАСЛСССС-ААССТОСТбССАОСТССАССАСОССбА -446

- 66ССТССТ6СТ6СС6СССАТССТАСТ0Т66АСА6ТССТаТТ6СС6СССА0 -499.

- ШССТССТ6СТБСГТСССАТССТАСТСТ66АСА0ТССТ6СТССС0СССА6 -496

- ТСТБСТбСгеСТАСТбСТстЕ

ТСТЙСТССТОСТЛСТССТСТ гомологии - 95.47.

ЗАвСССАСТТвТ -АвСС-АСТ-вС

-531 -52Ё.

возникшего в результате замай 4-х нлслаотадов маня? пторой-трстьей долециячп в центральной области. Кодарущпе облаем генов содержат также протякешшо прлздш повтори, сосрздоточе] wie, в основной, и первой половина кодирующей области геши При помощи компьютерного анализа было обнаружено три близзщх « составу повтора из IS и.п.. Один из шх - ТСС ТСС CAG ДСС ¿I (I.) - встречается по два раза d обоих генах, тогда как втор! повтор (II.), отличающийся от первого только одной зацепой 7-: нуклео' 1да ( С на 0 ), обнаруживается в гено 1Ш2А два раза , а гене НВ2В - четыре раза. Третий повтор - ТСС ÏGC CAO• CCA Ai (III.), также имеющий большое сходство с повторами I и Г идентифицирован в четырех местах гена КВ2А. и в пяти - в ИВ2В.

Эти повторы локализованы друг sa другом собладая опред лешшй порядок чередования. Taie в обоих генах соблюдается сл.

дующий порядок расположения повторов! I------И-Ш-И-Ш-Г

I----•—Ii-Iii-Ii-Iii. Однако, следует отметить, что повторы

гене НВ2А менее консервативны, чем в гене НВ2В. Здесь обнаруж ваются нуклеотидные замены во всех трех типах повторов, в дв из которрх в результате замен нуклеотидов в порвем и втор положениях происходит замена аминокислот (Сув на Ser, Ser Arg и Сув на Тут ) в белке.

В 3*-области гена также обнаружен повтор - ТСС TGC CGC СС встречающийся по два раза в обоих генах. Таким образом, сравн тельное изучение кодирующих областей генов НВ2А в НВ2В п помочи программы NALICN пакета РССЖЕ позволило обнаружи в них присутствие прямых протяженных повторов, расположена тавдемно с характерным для них чередованием.

Сравнено Б'-флаю .,руюдих областей гонов ИВ2А и Ш-показало, что гомология имеется только в близлежащей накодару щой области (рис.7.). В зтой области кроме "натрикс-спещк! часких" последовательностей, характерных для. генов бели иатрикса овцы, выявлена еще одна область полной гомологии положении между -27 и -49 нуклэотидаш от инициирующего кодоз

Аналогичная область с высокой гомологией обнаружена и генов серобогатых ураганов овцы В?' и В2С, клонироваш Powell B.C. и его соавторами (I9Û3). Однако, обнаруженная ш область полной г чологии в района -27 а -49 н.п. имеет высоз гомологию лишь с соответствующей областью гона В2С ( по отног шю к ¡Ш2А - 86%, а к НВ2В - 99Я ). Powell B.C. с соавтор!

НБ2А - AGATCACTTGTCGATGTATAACCACATGGCAAACCTGAAGCT6AAGGCTC ЬО

HB2B - Á-----------------------------------------------------------------------------------1

HB2A - AAGTGGAAATTATACCArTGTTTGTAAACAAAATGTTAACATTrTTACCA ICO

НЕЙВ .........ATTAT-CCA---------------------ACA---------- 12

HB2A - AGGACAAACACATTTGGTGAGTATTAGCTGAGGCAATAAGGAAAAATGAA 150

НБ2В .................-................CAATÁÁGGCAGA--GC- 25

HB2A - TTTT6AGATATATTTAAAACAATTCAGCATTTGAACCA7CÁGAGGGCCCT -200

HB2B - TTCTGÁ-ÁT-TÁTGTÁÁÁ.....-CÁGTÁGCTG------------GCC— 54

HB2A - AGAAAGGCTGGTTTAAAGA(3TAACAAGATAAAAATGTT3CTCGCCACAAA 250

HB2B .....AÍ3GCT--TATAAA-AG..........-.....-.....GCC A—A 72

HB2A - TAGA&AATTGGCCCAGACTTATAAAAAGCCGuCAGTGGAATAGGCAGCC 3C0

HB2B - TG-------TGGC--------------AGCCATCA-------------CC 88

HB2A - ATAATTCAGAAACTCCTCCAAGCAACCAAC-CTTCAGATTCAAC7CCT6A 349

HB2B - ÁAÁÁCTCÁGÁÁÁCTCCTbcÁÁGgÁÁcjCAGAC 127 -i.

HB2A - CACC 353 HB2B - CACC 141

t

Степень гомологии ( 84. 4Т.)

Рас.7. Сравнение б'-фланкируюязх областей генов ' НВ2А и НВ2В человека.

подчеркивая роль только "ыатрикс-специфнческих" последовательностей, не°придают значение этой области. На наи взгляд, эта область такяе представляет интерес, если не у всех генов серо-богатых кератинов овцы, то у некоторых, например, для гена В2С овцы п генов НВ2А п НВ2В человека. Поэто:.(у эти последовательности, также заслуживают внимания как, вероятно, имеющие отнсше-ше к регуляции активности ¡тонированных на на кератиковых генов человека, а такте некоторых генов овцы.

В 5 * -фланкирующих областях генов НВ2А и НВ2В также показано наличие характерных для всех генов эукариот ТАТА- и СААТ-последовательностей. В частности, 5*-фланкирующая область гена :tB2A содержит четыре ТАТА-последовательностп. Однако, при сравнении их с аналогичными областями генов В2А п В2С овцы обнарукено, что только две из них, расположенные в -83 в -195 положениях, могут претендовать на роль ТАТА-боксов. Однако, функционально активным является только первый ТАТА-бокс в -85 положении, поскольку между первым и вторым ТАТА-боксами встречается АТС-последовательность, не имеющая отношения к инициации транскрипции. На 13 нуклеотидов выше TATA-6oitca рас-полояена АТТС-последовательность, т.е. СААТ-на противоположной цепи ДНК. Обнаружена еще одна СААТ-последовательность, локализованная в -184 положении. В 5'-фланкирующей области'гена НВ2В также найдены ТАТА- и СААТ-последователькости, расположенные, соответственно, в -82 и -129 положениях от АТС-кодона.

ТАТА-бокса обоих генов расположены примерно на одинаково! расстоянии от АТС-кодона и имеют одина!совые консенсус-последовательности - 5 * -ТАТАААА-3 *, тогда как СААТ-боксы спльнс отличаются как по своей локализации, так и своими консенсус-последовательностями. Следует отметить, что ТАТА-боксы гено: Б2А, вас и Б2Д овцы, клонированных группой австралийских уче h,ix, расположены на расстоянии 70 нуклеотидов ниже СААТ-боксов тогда как в случае генов HB2A и КВ2В, это расстояние равно 10 и 47 .нуклеотидам, соответственно.

3*- фланкирующая область гена HB2A содержит сигнал поли аденилирования, расположенный на 279 н.п. ниже терминируюцег ходона. Изучение фланкирующих областей этого гена, для которот удалось определить нуклеотидную последовательность 353 н.п. 5'- и 345 н.п. в 3*-фланкирующих областях, позволило обнаружит к них инвертированные последовательности. Так, в 5'-облает гека показано наличие одного палиндрома из 16-ти нуклеотидов спильки из 10 нуклеотидов с 3-х нуклеотидным основанием. 3'-фланк..;>укч;ей области идентифицировано 4 равных палиндроми последовательности из 10 и 12 нуклеотидов, одна из котор: расположена непосредственно перед сигналом поли(А).

- 17 -

4. АНЛЛУД АМИНОКИСЛОТНЫХ ПОСДЕДОБАТЕЯЬНОСХВИ БЕЛКОЗ, ВЫВЕДЕННЫХ [13 ПЕРЕИЧНОИ СТРУКТУРЫ ГЕНОВ НВ2А И НВ2В ЧЕЛОВЕКА.

Сравнительное пзучезгне аминокислотных1 последовательностей белков, кодируемых генами НВ2А и НВ2В человека показало довольно высокую гомологию между шли (84,6%) (рис.8.). Исключение составляют два участка, не имеющие гомологии. Первый участок, включающий 18 аминокислотных остатков, возникает вследствии сдвига а восстановления рамки считывания, о котором было сказано в предыдущей главе. Второй участок соответствует З'-хонцу гена, где произопла делеция трех нуклеотидов в гене НВ2В.

НВ2А - МАССОТЗРССГРЗСЗТЗСТСОЗЗССОРЗССЕТЗЗСОРНССЕТЗССОРЗСС -50 НВ2В - щссЬтзгсзугёсзтзбгё -50 нв2А - стзрсбррзрзтеатсоз-------зссорзссЕтзсссрзсудтззсат -эз

НВ2В - ОТЗГСокА--------ЗаЬУОЮЬЗССОРЗССЕТЗССОРЗССОТЗЗСЭТ -92

НВ2А - БСбЮббШУбОЕбЗЗбАУЗТ^КтаРОСетЕбТаРРССУУЗСТРРЗС -143 НВ2В - СЗССЗ 1(ЗСЗЗ I БУбОЕбЗЗбАУЗТИ I КУСРРОССТЕбТСЬРРССУУЗСНТРТС -142 НВ2А - СОЬННАЕАЗССКРЗУСбОЗССЯРУССС.УСЗЕРТС -177 НВ2В - СОЬННАЕАЗССКгеУСбОЗССРРУСССУЗС-ЗНС -175

Степень гомологии 84,6 7.

Рис.8. Сравнение аминокислотных последовательностей серобогатых кератинов человека НВ2А и КВ2В. о

Анализ аминокислотных последовательностей этих белков показал, что для ни* характерно присутствие тандемно повторяющихся аминокислотных последовательностей. По составу аминокислот и характеру чередования удается обнаружить два типа аминокислотных повторов: тот I - сув-сув-е1п-рго-яег; тап ХГ-сув-сув^1и-г11г-еег (рис.9.). Интересно отметить, что эта повтора, во-первых, преимущественно встречаются з п^рвоЯ

половине полшептидной цепи, во-вторте, располоилш тсвдсиио дуплетами или декапептадош, состоягдауп из I- в П-типов повторов. В обоих белках встречаются по пять иш дуплетов, по три и два вшете. .

ГГентапептвдкые повтора является неотьоияг^и элшзитецз серобогатих кераташеш овцы соиэйстзз ЕЗ и ИШ (ЕИеяап ot al. 1572, Kaylett et al.,1571, Harehall et al.,1S7G, lîcîiab ot al., 1939, Swart et al., 1971). Сравназшз пшгошептадешх повторов различных серобогатих карзтинов odu;j и человека, ■ вссяодокгк нами, показывает, что во всех пктшептцдщ« повторах попаиз дзе аимокислоти прсдставлэии цисгзшкшиа остат5М1Я. Читаер-тый аминокислотный остаток пентаплгшдз соройогатих jîopûTCHOJ овцы также консервативен (Pro), а третий'п пятгЯ сарпрую* ov белка к белку. Е дашюи случае, 1-пзн?ааеатпд!ша повтор чздого-ческого терзтшэ îîhjct болыазз сходство с оюткгга в той ишю» что nepsiis чотарз сетгога-.сло'кых сстатзи сбсояоию пд2;шп:г.:. А П-ыеш\'шепт1гдги.'£ потл'ср, an шяукчсниеи дэуг парсах кюлотшх остатков, из пизет ничего сй:;зго. В ¿лтервтурз lu сЗ-суздается воль этих консарзаатамск злемшггов соробогатыг isopa-такоз, Однако, суммируя результаты срасзттсльпого £нагаза пок-тапоптндкых повторов саробогаткх тератгошв епцы и человека, ио;шо сказать, что функционально вагзк'-и, елдгшо, лвдязтея, шанно, первые две аминокислоты (Сув-Сус-), а три оста лыса' га-полняпт вспомогательную роль, обеспечивал ни кообходждоа pse-стоязые. А сами пантаасптида, по всей Бвдкиста, яаягаэтег с.руктурнымц зле"езггаььз упорядочезшых структур полдыгатода.

Rogers G.E.(1S34) и Powell С.В.с соавторски (1903) изуче; а.'шнокпслотнъгй состав соробогатпх кератшгоз Е2А и б2д, ïî£ отмечают з них присутствия пентапаптн/дох повторов. 2о?я, в зли тоге мемно выявить два пеитапоптодзег: повтора слодуггрго сс.теа-па - Cys-Cye-Gln-Tlur-Ser (I.) ц Cyo-Cys-Gln-Pro-ïlir (II.). 1 белке В2А l-пентапептпд встрочгстсл только од'Ш раз, s II-пьнтапептид четыре раза. В отлична от иенгапептидоз чэлоеочос-кнх кер?1. .шов, где оку, сбразу^г дуиязт из двух типов цзстаяи-содорхащих пентапептадоз, пелгашнтада Н-7Ш13 бели ША, встречаются в дуплета с даупиз; пагичзпгптвд&и, iœ шгздхдо"-! i vboùt» ccc-ïiit '- i5"CTCi::ioi;'J.x сстаткоз - Cer-Ilo-Cln-Tiu'-Ecr • (III.), s-гот пентаязптад œtser сходетзо с поотгсептадса I-гзш бедка Е2Л, но в кем ш» дза шшкшеяохшос остатка,

НВ2В MET Thr pys Cys Gin Thr Serf Phe HB2AMET Ala

Cy;

Ser

Uys Gly Tyr Pro Ser tys Cys Gin Thr Ser{ Phe |Cvsj Gly Phe Pro Ser

I__ДГ X

Cys Cys fîln Pro ^er| Cys Cys Glu fhr Ser (Cys Cys Gin Pro Ser{

Cys Cys Gin Pro fo ! Cys Cys Glu Thr Ser.Ser Cys Gin Pro Arg ■ ' ! --isw ' ■■

Thr Ser Gly Thriuy Cv^Ser Thr Ser Gly Thr|Cv:

' ТГ

Cys Cys Glu Thr Ser Cys Cys Gin pys Cys Glu Thr Ser,pys Cys Gin

Vro Ser Pro Ser

il

Cys Cys Uln Thr Ser ÇvS' Cys Gin Thr Ser,

Phs Phe

ЛЕ

Asp Phe Leu Ala Ser Gin Gly Phe Pro Ser Phe Ser

z

Cys Cys Gin Pro Ser Cys Cys Gin Pro Ser

Cys Cys Glu Thr Ser ¡Cys Cys GTrTPro Ser £vs Cys Glu Thr SerijCys Cys Gin Pro Ser

Leu Val Asp Leu Gin Leu Thr Gly Gly Thr ÎCvsi Asp

X_

,Cys Cys Gin Thr Ser|Ser

- Ser

Ser Ser

Cys Туг bln Thr Ser Ser

'■лл^------

Cys Cys

Gly Gly

Thr Gly(Cysj Gly Ile Gly Gly Gly Ile Gly Tyr Gly Gin Glu Gly Ser Ser Gly Ala Val Ser Thr Arg Thr Gly (cvjj Gly Ile Gly Gly Gly Ile Gly Tyr Gly Gin Glu Gly Ser Ser Gly Ala Val Ser Thr Arg

Ile Arg Trp Cys Arg Pro Asp Cysj Arg Val Glu Gly Thr Cys Leu Pro Pro Cys Cys Val Val Ser Cys

lie Arg Trp Cvs Arg Pro Asp Cvs Arg Val Glu Gly Thr Cvs Leu Pro Pro Cvs Cys Val Val Ser Cys

Ш

Hls Thr Pro Thr Cys Cys Gin Leu His Hls Ala Glu Ala Ser Cys Cys Arg Proj Ser Tyr Cys Gly Gin

Thr Pro Pro Ser Cvs Cvs Gin Leu His His Ala Glu Ala Ser Cys Cvs Arg PrcJSer Tyr Cvs Gly Gin

Ш.

Ser ICys Cys Arg Pro Val Cys Cys Cys Tyr Ser K!vg| Ser His ICys)

Ser ICys Cys Arg Pro, Val Cvs Cvs Cys Tyr (Cysf Ser Glu Pro Thr ^ - —

Plie.9. Локализация пентаг.ептицных повторов в составе белков НВ2а" и НВ2В человека.

- го -

где произошли аминокислотные замены - Сув на Ser и Сув на Не. В силу таких перестроек у серобогатых кератинов овцы пентапептидные дуплеты менее обогащены цистеином, чем аналогичные повторы серобогатых кератинов человека.

Ка наш взгляд, кажутся интересныш такие аминокислотные замены в пектаяептидных повторах кератинов овцы. Мохет быть, напротив, такая замена аминокислотных остатков произошла в пента-пептидных повторах серобогатых кератинов человека в ходе эволюции, придавая тем самым человеческому волосу соответствующие свойства■

Видимо, исходя из вышеизложенного, авторы объединяют пен-тапептид Ii-типа с пентапептидом III-типа и именуют их декапеп-тидиыми повторами, имеющими в своем составе всего два остатка цистеика. Серобогатый кератин овцы В2Д отличается от В2А тем, что содержит в своем составе б-декапептидных повторов, а не Е как в Е2А, т.е. на десять аминокислот больше.

Таким образом, сравнивая аминокислотные последовательности пентвпептидных повторов серобогатых кератинов овцы и человека, мы увидели наряду с принципиальным сходством и некоторые отлн-4ï?.fl. С чей связано такое явление, пока не понятно. Мокет öuti sто является причиной существования различных типов шерсти ов цы, отличащихся по таким свойствам как тонина, растяжимость крепость, упругость и т.д. Этот ф^кт, обнаруженный нами при и сравнительном изучении, позволяет в дальнейшем планировать зкс перимйнты с использованием как регуляторных, так а структурны оо-'шстей генов серобогатых кератинов человека для получею трьнсгеккых животных.

Для С-конца полипептидной цепи НВ2А и НВ2В такие характе] ко присутствие повторов из 5-аминокислотных остатков - Ser-Cyj -Cyr,-Ar¿-?ro. Этот повтор встречается по два раза в обоих бе. ках. 4íO интересно, повтор такого же состава характерен и д С-кокця кератинов овцы В2А и В2Д (Powell et al., 1933). В эт области блике к терминирующему кодону овечьего кератина В2А п иай ртцл повторов присутствуют еще два пентапептида - Суе-Су Orln-Pro-Tîir, которые отсутствуют у серобогатых кератинов чело еекй.

К сожале чп, мы не имеем возможности сравнить первич> структуру белков, выведенной нами исходя из структуры генов, f.K.HiOKmviOTKOÄ последовательностью реально существуюсух се] богатых кератинов человеческого волоса ввиду того, что поа®

- 21 -

пял до сих пор не выяснена.

Сравнение аминокислотных последовательностей кератинов человека - НВ2А и НВ2В, выведенных из их нуклеотидннх последовательностей, мезду собой показывает, что в этих белках имеются участки, различающиеся по своему аминокислотному составу (рис.10.). Из рисунка хорошо видно наличие трех консервативных участков (1,111 п Y), два из которых примыкают к W- и С-концам. Скорее всего, они образуют основу упорядоченных структур. Зти участки содержат почти все остатки цистеинов, которые расположены регулярно на расстоянии 3-5 аминокислотных остатков. Оки способны образовать высокопрочные н, по-видимому, стандартные внутри- и (пли) межмолекулярные структуры, скрепленные S-S мостиками. Между этими участками выявляются еще два,, один из которых (IY), также консервативен и сильно обогащен глицином (10 из 19 а.к.). Пятый участок (под номером II на рис. 10.) характеризуется уникальной особенностью. Прежде всего, он не консервативен, содержит всего один остаток цистеина, и то в белке Н752А, Аминокислотные остатки внутри этого участка в двух балках на имеют какой-либо гомологии. Из сравнительного анализа нуклео-тидных последовательностей генов НВ2А и НВ2В, который рассматривался в предыдущей главе, молено отчетливо увидать, что фрагменты генов, кодирующие эти вариабельные участки соответствующих белков сохраняют высокую степень гомологии (рис.6.), а аминокислотные замены возникают по причине сдвига рамки, вызванного делецией или вставкой единичных нуклеотидоз в трех разных кодонах, что вновь восстанавливается ража считывания.

Пра анализе аминокислотных последовательностей серобогатых кератинов овцц В2А и В2Д ыокно также обнаруетть в них дна цистеинбогатых участка, разделенных между собой глицин-богатым участком. Однако, их глицин-богатый участок менее-обогащен глицином (8 из 17 а.к.). К тому ке здесь не иа-знти-фнцпрован вар1?1бельшй участок, который у серобогатых кератинов расположен между двумя цистеинбогатыш* участка!.® (рис.10.). Различие между овечьими серобогатыми кератинами 32А и ВЯД определяется вставкой декапептидного повтора (см. виде) на 65-атяшокислоте. Возникновение вариабельного участка в серобо-гатых кератинах человека," по всей видимости* характерно только для кератинов человеческого волоса.

В литературе имеются некоторые данные, свидетельствующие о вариабельности структуры белков ыатрихса волоса человека у раз-

________I_____

Ш£В*ТЁт Ihr Cys Cys Gin Ihr Ser Phe Oys Gly Tyr Pro Sor Oys Ser Thr Sor Gl y Tlir Cys Gl y Ser Ser

HE2A

ET Ala Cys Cys Gin Thr Ser Phe C^s Gly Phe Pro Ser Cys Ser Thr Ser Gly Thr Cys Gly Ser Ser

Cys Cys Gin Pro Ser Cys Cys Glu Thr Ser leys Cys Gin Pro Ser Cys Cys Glu Thr Ser

Cys Cys Gin Pro Ser Cys Cys Glu Ser Cys Gin Pro Arg Cys Cys Glu

Thr Ser Cys Cys Gin Thr Ser Cys Cys Gin

Pro Ser Cys Cys Gin Thr Ser Phe Cys Pro Ser Cys Cys Gin Thr Ser Phe Cys

¡Asp ply :

UV

Phe Leu Ala Ser Gin Leu Val Asp Leu Gin Leu — Phe Pro .Ser Phe Ser Thr Gly Gly Thr Cys Asp Ser

Iii.

Cys Cys Gin Pro Ser Cys Cys Glu Thr Ser Cys Cys Gin Pro Ser Cys Cys Glu Thr Ser

Cys Cys Gin Pro Ser Cys Cys Gin Cys Cys Gin Pro Ser Cys Tyr.Gin

Thr Ser Ser Cys Thr Ser Ser Cys

Ser Ser

Thr Gly Cys Gly Ile Gly Gly Gly Ile Gly Thr Gly Cys Gly Ile Gly Gly Gly Ile Gly

Tyr Gly Gin Glu Gly Tyr Gly Gin Glu.Gly

Gly Gly

VT

Ser Ser Gly Ala Val Ser Thr Arg Ser Ser Gly Ala V§1 Ser Ihr Arg

Ile Arg Trp Cys Arg Pro Asp Cys Arg Val Ile Arg Trp Cys Arg Pro Asp Cys Arg Val

Glu Gly Thr Cys Leu Pro Pro Cys Cys Val Val Ser Cys Glu Gly Thr Cys Leu Pro Pro Cys Cys Val Val Ser Cys

His Thr Pro Thr Cys Cys Gin Leu His His Ala Glu Ala Ser Cys Cys Arg Pro Ser Тут Cys Gly Gln Thr Pro Pro Ser Cys Cys Gln Leu His His Ala Glu Ala Ser Cys Cys Arg Pro Ser Tyr Cys Gly Gln

Ser Cys Cys Arg Pro Val Cys Cys Cys Tyr Ser Cys Ser His Cys — Ser Cys Cys Arg Pro Val Cys Cys Cys Tyr Cys Ser Glu Pro Thr Cys

Рис. 10. Лояйлизагога консервативных ( I, Ш, IV , Y. ) и

-— ' тт > t> (Wvnv HB2A и KE2B.

м to

:шх индивидов (Katemin-,I et al.,1939). Наличие такой вариабельности било обнаружено пр.л дпунернои электрофорезе З-клрбокс.'ше-пш производных этих белзсов. Теперь, после того, как была установлена первичная структура двух генов этой группы белков, иозаю попытаться выяснить, является ли вариабельность белков, обнаруживаемая при изучении их двумерным олектрофорезом, отра-гезшеи реального полиморфизма генов или но возникает на поот-траззскрипциозшом уровне синтеза белка и формирования структура волоса.

В настоящее вренч, пока еще недостаточно данных дм сколько-нибудь приемлемого объяснения этого феномена, Поэтому моано только огразшчиться козютатащзей факта. Фактом является то, что в исследуемых наш соробогатых кератинах явно шэзотся 2 вида участков - высозсоконсарвативзше по краям и изменчивые внутри. Далее, в изменчивой часта имеется участок, который кзиззотлея не путем длительного накопления нгедазства изменений, а, судч по всему, в результате двух событий (из'.серцнй/делещзй).

Тазсой механизм измеззешя струз;турн белзса обнаружен тазоте при сравнении первззчной структура кератинов человека и овцч (рис.11 п 12.). При этом показана достаточззо высокая гомология ыеяду этими белками. Тем но менее у обоих кератинов выявляются два участка, не имеющих зпзказеой гомологии. Первый вариабельный участок болта НВ2А характеризуется полвлозшец в его состава довольно протязюзпшх аздшозшелотзшх последовательностей (16 а.к. и 35 а.к.), которио отсутствовали в соответствующих белках овзда - В2А п Б2С (рис.11.). Для второго вариабельного участка,' наоборот, характерна потеря II а.зс. в обоих случаях на 170 аминозшолото. Такая тендезщия приобретезшя и потери фрагментов сохразшется и для белка НВ2В. На уровне нузизеотзздзгых последовательностей такое яплезше зш объясняется вставкой обширных обля t,1, зеодиругжда вззовь появившиеся аминокислотные последовательно. тн, а сдвигом рашот считывания, вызванного пнсерцией/дел?.мей.

Тазазм обрл tou, зш еще раз сталкиваемся с таким :*е з/.ехазшз-злом возникновения вариабельных участков кератиновых белков, зеоторый бил обнаружен при ерпвззеззии первичной структуры зеерати-зюв человека меззду собой. Такой механизм изменчивости мало распространен потоку, что чреват згекозггролируеинм выведением из строя белка. Но он изггересен тем, что позволяет, сохраняя пер-вичз1ую струзстуру гена ( или его участзса) сильно зз быстро "эме-

1.

В2А - MACCSTSFCGFPICSTGGTCGSSPCQPTCCQTSCCQPTSIQTSCCQPISI -50

H32A - KttCCQTSFCGFPSCSTSGTCGSSCCQPSCCETSSCQPRCCETSC -50

B2A - QTS----------------CCQPTSIQTSCCQPTCLQTSGCETGCGIGGS -84

HB2A - QTSFCSFPSFSTGGTCDSSCCQPSCCETSCCQKCYQTSSCGT(3CGIGGG -100

B2A - IGYGQVGSSGAVSSRTRWaRPDCRVEGTSLPPCCVVSGTPPSCCQLYYAQ -134

HB2A - IGYGQEGSSGAVSTRIRWCRPDœ^ -150

B2A - A3CCRPSYCGQSCCRPACCCQPTСIЕРIÇEPSCCEPTC -172 .

HB2A - ASCCRPSYCGQSCCRPVCCC-----------YCSEPTC -177

Степень гомологии - 74.4%

2.

HB2A - KÎACCQTSFCGFPSCSTSGTCGSSCCQPSCCETSSCQPRCCETSCCQPSCC -50

B2C - MACCSTSFCGFPICSTAGTCGSSCCRSTCSQTS—----------------33

HB2A - QTSrCGFPSFSTGGTCDSSCCQPSCCETSCCQPSCYQTSSCGTGCGIGGG -100

B2C --------------------CCQPTSIQTSCCQPTCLQTSGCETGCGIGGS -64

НВРЛ - IGYGQEGSSGAVSTRIRwCRPDCRVEGTCLPPCCVVSCTPPSCCQLHHAE -150

B2C _ - TGYGQVGSSGAVSSRTRWRPDCRVEGTsLprcCVVSCTSPSCCQLYYAQ -114

HE2A - A5CCRP3YCGQSCCRPVCCCY-----------CSEPTC -177

B2C - A5CCRP5YCGQSCCRPACCCQPTCTEPVCEPTCSQPIC -152 Степень гомологии - 73%

Fuc.IX. Сравнение аминокислотных последовательности кер тина человека ¡¡Б2Л с аналогичными последовательностям;! керат нов овцы - В; . (I. ) и Б2С (2. ).

НВ2В - MTCCQTSFCGYPSCSTSGTCGSSCCQPSCCETSCCQRSCCETSCCQPSCC -50

B2A - (MCCSTSFCGFPICSTGGTCGSSPCQPTCCQTSCC ----47

HB2B - QTSFCDFLASQLVDLQLSCCQPSCCETSCCQPSCCQTSSCGTGCGIGGGI -100

B2A -------------ISIQTSCCQPTSIQTSCCQPTCLQTSGCETGCGIGG31 -85

HB2B - GYGQEGSSGAVST RI RWORPDCRVEGT CLPPCCVVSCHTPTCCQLHHAEA -150

B2A - GYGQVGSS^VSSRTRVCRPDCRVECTSLPrcCWSCTPPSCCQLYYAQA -135

HB2B - SCCRPSYCGQSCCRPVCCCYSCS------------HC -175

B2A - SCCRrëYCGQSCCRPACCCQPTCIEPICEPSCCEPTC -172 Степень гомологии - 69,2% 2.

HB2B - MCCQTSFCGYPSCSTSGTCGSSCCQPSCCETSCCQPSCCETSCCQPSCC -50

B2C - MACCSTSFCGFPICSTAGTCGSSCCRSTCSQTSCCQPTSIQTSCCQPTCL -50

HB2B - QTSFCDFLASQLVDLQLSCCQPSCCETSCCQPSCCQTSSCGTGCGIGGGI -100

B2C - QT-----------------------------------SGCETGCGIGGST -65

HB2B - GYGQEGSSGAVSTRIRVCRPDCRVEGTCLPPCCVVSCHTPTCCQLHHAEA -150

B2C - GYGQVGSSGAVSSRTRV.'CRPDCRVEGTSLPPCCVVSCTSPSCCQLYYAQA -115

HB2B - SCCRPSYCGQSCCRPVCCCY----------SCSH--C -175

B2C - SCCRPSYr'fSQSCCRPACCCQPTCTEPVCEPTCSQPIC -152

Степень гомолиии - 69.7%

Рис.12. Сравнение ашноютслотноЯ последовательности кератина человека НВ2В с аналогичными последовательностями* кератинов овцы - В2А (I.) и (2.).

•' - 26 -

1ШТЬ структуру кодируемого бедка путем сдвига рвшси. Нельзя исключить, что есть случаи, когда это важно, т.е. измененнс структуры белка долкно достигаться без заметного изменит* структуры гена. В пользу этого предположения мосет слуззт пример с геном гндролазы Flavobacterlura Sp.K1.72. (02mo,1S37! утилизирующей Бысокоспецпфическпе нейлога. В зкстремаяьшх де бактерий ситуациях, при которых происходило замена одного субстрата другим, этот топ изменчивости обеспечил ш быструю адаптация к новым условиям существования . Выпадание только одзгаг< ïr/клеотнда привело к полному нзмэне1вш структуры этого форманта, в результате чего првобратдвгаго доугуа субстрат-спец£'|рическуи активность.

Однако, в случае кератиновах генов, сдат paiscn ira пршзо дат к полному иаруыашга их структура, Еатрахпшгп лшь опрадз-лекнае области тонов, сохраняет коггоьрггтгааша участка (илп до ие-.г,;) втпх структурных белкоз волоса. Пз этого следует, что гс ни сероботатмх кераткнов человека п езцл ci:om скяокша к нуга цпи участки (пдг. "горячие" точга ). У генов серойоготых карата ков человека и оицц еупвд-эюш нузиссотадов происходит такпа сб разом, что при атом сокращается число кодонов с той шш шш гене, чем объясняется парнация разброс пояхтептадшас цепей Таким образом, иохно предположить что для исследуемых лек; го нов этот ксхьиизм оказался нуЕзшм дгл Састрого изменения спро деленного участка. В этой связи, гозшжает вопрос! на этот x механизм является ответственный sa вариабельность белкоз' п?ст Классе, обкаруки^чемая в системе двумерного электрофореза (Rat ¡rural et fil., 1535) ?

Несомненно, сбаарусаваемай naît:; способ изменения при epsi нательном изучении структура генов и кодируеьых икн серобогатг, кератинов человека и овцы, представляет Сольсой интерес, пре*^ всего, с точки зрения зболицип. По это самостоятельная пробле ма, требукцал новых исследований.

Таким образом, сравнение генов серобогатых кератинов озг и чэлове, < позволяет выявить консервативные участки п подтве] дать их необходимость для функционирования. Такими последов! тельностяыи являются: а) сигналы инициации и тершнации тран< кркпцйи и б) "чятрикс-спеияфическая*' последовательность, общ рукеннке Powell B.C. с соавторами п подтверздегоше наш; п) 2?.-куклеотидная последовательность, обнаруженная нами в pi гуля-.орных областях геков НВ2А и 1ГВ2В человека, также имеющая'

- 27 -

1 аналогичных областях генов серобогатых кератинов овцы.

Анализ кодирующих областей генов серобогатых кератинов ов-%1 н человека позволяет обнаружить механизм вариабельности ге-юз, приводящий к пзкенешщ структуры белков в определенных участках.

- 28 -ВЫВОДЫ

1. В результате клонирования и структурного изучения геноз серобогатых кератинов овцы - В2А и В2Д - казахской тонкоруизш! порода позсазано большое сходство с аналогпчзшш генаыа овц породы - Австралийский меринос, изученных группой Pouell В.С í19831.

2. Во фланкирующих областях генов серобогатых кераишо овцы обнаружены Pet1-повторы, характерные для генома быка.

3. Обнаружено, что гены серобогатых кератинов озцы пмзе гомологию, достаточную для использования пх и качестве зонде для выделения генов серобогатых кератинов человезса.

4. С использованием этих зондов в нашей работе сперва проклонированы гены серобогатых зшра танов человезса и детальз изучена их структура.

5. Структурное изучезше областей, содержась гезш серобс га тих зеератинов человезса, показало, что, пак и гоны саробогатг кератинов овцы, они расположены зшастерзго с тазздешой ергазиз) црей. При этом расстоязше между геззэыа серобогатых квратвгп человека больше, чем у аналогичных генов овца (зга 3,7 т.п.н.)

6. Позсазано, что гомология между генами серобогатых кар; тинов овцы и человека распростразшвтся тользео на кодирукциа близлежащие фланкирующие области гезюв.

7. Во фланкиругадих областях гоззоз серобогатых зшратш: человека обнаружены неиденгифицировазшыэ повторы, характеры д я тезюма человека.

8.. Определена полная первичная структура зюдзруюцах Манкирующих областей генов серобогатых кератинов человека. структурный анализ показал:

о) структурная часть генов кодирует полипептидоше цепи длиной 177 и 175 а.к.;

б) эти гены высокогомологичны между собой ( 95,4%)¡

в) в Б'-флаззкирующей области генов серобогатых кератинов 4ej веча г шляется характерная для генов беж< э матрикса шерс оьцы, 18-нузслеотидная последовательность, прилегащая АТО-кодону;

г) в 5*-фланкирующей области генов содержится высококонсер] тивный участик из 22-з(уклеотидов.

В. На основании определенной нами первичной структуры те: рассчитана последовательность закодированных в зшх аминозшел

что по:гаолнло впервые получить сведения о структурных особенностях серобогзтих кератинов человека.

Анализ рассчитанной структуры этих белков, названных нйь-д НВ2А и НВ2В , показал:

а) топология аминокислотных последовательностей двух белков высокая (84,6%);

б) обнаружены характерные для серобогатых кераткноэ человека пентапептидные повторы, отличающиеся от аналогичных повторе-:! кератинов овцы; f

в) в составе серобогатых кератинов человека можно отчетливо ьы-явить 5 участков, различающихся по структуре (предположительно доменов ): 3 консервативных цистеинбогатых, I глицинбогатый и I неконсервативный, изменчивый , ________

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТОЛК ДИССЕРТАЦИИ.

1. Акопян К.Х., Хумабаева Б.Д., Генинг Л.В., Тарантул 3.3., Га-зарян К.Г. Клонирование и частичная характеристика повторов генома овцы, имеющих гомологию с Pst1-семейством генома быка.- Колек, генетика, микробиология и вирусология, 1990,Т.II.,С.13-16.

2. £умабаева Б.Д., Генинг Л.В., Газаряк К.Г. Клонирование и структурное изучение генов серобогатых кератинов человека.- Молек. биология (в печати).

3. Газарлн К.Г., Генинг Л.В., Андреева Л.Е., Кузнецоз Ю.М., Га-зарян Т.Г., Зумабаева Б.Д.- "Получение линий трансгенных сельхсоггл-вотных путем переноса в их геном генов, кодирующих ванные физиологические признаки",- Тезисы докладов I Всесоюзной планово-отчетной конференции по направлению "Генная и клеточная инженерия", Пущино-на-Оке, 1990 г.

4. Зумабаева Б.Д., Генинг Л.В., Газарян К.Г.- "Сравнительное изучение первичной структуры генов серобогатых кератинов овцы и человека" Тезисы докладов второго рабочего совещания по проблеме "Регуляция экспрессии генов млекопитающих",- Новосибирск,IS9I.

5. Zhuuabayeva B.D.,Genlng L.V..Gazaryan К.С.- "Cloning oi Keratin genea oi KazaWi Fine Fleeced Sheep",-Republican Scientific conference, Abstracts, Alma-Ata,1989.

6. Akopyan K.Zh..Zhumabayeva B.D., Gening I. VI, Tarantul 7.2., Gazaryan K.G.- "Cloning and characterization oi last repeated DN'A sequences Hanking the bovine growth Horron genes and sheep .keratin high-sulphur'genes", - The X-th Bllaterial Syraposim USSR-France,•

abstracts, Kiev,1990.