Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ген кератина 10 человека: молекулярное клонирование, секвенирование нового структурного варианта и обнаружения высокой вариабельности двух экзонов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Ген кератина 10 человека: молекулярное клонирование, секвенирование нового структурного варианта и обнаружения высокой вариабельности двух экзонов"

1.1 3-й

российская академия наук ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ Биология

На правах рукописи

ТКАЧЕИКО Андрзй Викторович

УДК. 577.212

ГЕН КЕРАТИНА 10 ЧЕЛОВЕКА? КОЛБКУЛЯРЙОЕ ¡ШНКРОВАНИБ, СЕКВЕЙИРОЗАКНЕ НОВОГО СТРУКТУРНОГО ЗАР!ЙНТА И ОБНЛР^дНННЕ ВЫСОКОЙ .-ВАРИАБЕЛЬНОСТИ ДВУХ ¿хзэясз

Специальность 03.00.03 - молекулярная биология

л

/.вгс?£тгрлт

■•«г» Г;/-.- "Л'Г^ *

Работа выполнена а лаборатории молекулярных основ онкогенеза Института молекулярной биологии Российской Академии Наук.

Научная руководитель:

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Л.Л. Киселев-

Официальные оппонента:

доктор биологических наук Рубцов П.И. доктор биологических наук Рысков. А.П.

Ведущая организация:

Институт биологии развития РАН им. Н.К. Кольцова.

Зашита состоится " я? г. в^^час. на

заседании Специализированного совета й 002.79.01 при /Институте молекулярной биологии РАН по адресу: 117984, Москва, ул. Вавилова 32.

С диссертацией шзно. ознакомиться в , библиотеке Института молекулярной биолог»

Автореферат разослан

/Ученый секретарь Специализированного совета канд. хим. наук А.И. КРИЦЫН

/

г0СУД/>г;- твйчна л

I 9тгя | | ¿все ггтайа* *

.Актуальность проОлекы. В последнее время наблюдается все возраставшее число публикаций, посвяцгнных изучению повторов. Повторяющиеся последовательности ЛК играет, по-Еидимоыу, важнуо роль в Функционировании и эволвции гекоиов гукариот, а также в старании организмов. Концевые участки кератинов I и 10 человека, образуских пару, зхспрессирушую-ся в терминально дифференцированных кератиноаитах, содержат протяженные участки повторов. Они кграот важную роль в формировании и стабилизации промежуточных филаментов. Поэтому обнаружение структурных перестроек в области повторов кератина 10 и изучение их механизма иыеог большое значение для понимания биологии кожи. кДНК-копия кератина 10, выделенная в ходе работы, такзэ может быть использована в качестве маркера.

Цель работа. Целью работы было изучение экспрессии гека, родственного гену К51 I выделен ранее из геномной крысиной библиотеки по гибридизации с у-еоб пробой б нестрогих условиях), в ко-ге человека на ' разных стадиях развития, а также поиск гена, родственного гену К51, в геноме человека. Оказалось, что это ген, кодирующий кератин 10. Б первом и седьмом экзонах - этого гена обнаружены структурные перестройки. Изучению этих перестроек и полиморфизма гена кератина 10 посвяшена значительная часть работы.

Научная новизна работы. Образны РНК, выделенные из кош человека на разных стадиях развитая, использованы для Слот-гибридиэации с пробоя К51 с цельо обнаружения и анализа экспрессии гена, родственного гену К51 крысы, в коя® челове-. ка на разных стадиях развития. Специфическая гибридизация наблюдалась с транскриптоы длиной 2.350 нуклеотидов. Максимальный уровень экспрессии наблюдался на 20-я педеле виутриу-

гроОного развития. Поли! A J* РНК, выделенная из кожи эмбриона на этой стали* развития, использована для создания библиотеки кДНК. Из нее выделена кДНК-копия кератина 10 по гибридизации с зондом К51 (который гибридизовался с трансхр-иптоы из кожи человека длиной 2.350 нуклеотидов) в строгих условиях. В первом и седьмом экзонах гена кератина 10 обнаружены структурные перестройки, приводящие к изменению аминокислотного состава N- и С-концевых областей кератина 10, что моает отражаться на его функции. Полиморфизм гена кератина 10" (и, возмозио, других кератинов! определяет разнообразие морфологии кожи в популяции человека.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано три работы.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всесоюзной конференции по геному человека "Геном человека -91" (Переславль-Залесский, 1991).

Об ем работи. Диссертация состоит из введения", обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения' результатов и выводов. Работа изложена на страницах машинописного

текста и иллюстрирована 22 рисунками. Список цитированной литературы включает 119 наименований.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ экспрессии гена, родственного гену К51, в коже человека.Из коли эмбрионов человека на разных стадиях развития (была использована кожа эмбрионов, находящихся на 14-ои, 20-оя, 22-оЯ неделях внутриутробного развития , а также кожа, взрослого человека) была выделена суммарная РНК. В свою очередь для некоторых образцов получали поли! А)* РНК и полЖАГРНК. Эти образцы использовали для блот-гибридизации с пробоя К51 с целью обнаружения и анализа экспрессии гена, родственного гену К51, в коже человека на разных стадиях развития (рис.1). Мы наблюдали довольно сильную фоновую гибридизацию зонда К51 с 1ÖS и 28S рРНК, а также с некоторыми другими транскриптами. Но анализ гибридизации поли!А)*РНК

12 34 56 78

»

«I

Рис.1. Блот-гибридизация г2Р К51-пробы с образцами РНК из ко:я1 человека на разных стадиях развития. Дорожи: 1, тотальная РНК, 30 лет; 2, тотальная РНК. 14 недель; 3, тотальная РНК, 20 недель; 4, по ли (А)* РНК. 20 недель; 5, поли(А)"РНК, 20 недель; 6, тотальная РНК. 22 недели; 7, шли(А)"РНК, 22 недели; б, поли! А ГРНК, 22 ведели.

и поли(А)~РНК с зондом показал, что наблодается специфическая гибридизация с транс'криптом длиной 2.350 нуклеотидов. Максимальный уровень синтеза этого транскривта происходит на 20-ой неделе'внутриутробного развития. .

Создание библиотеки кДНК из коза человека-Мы использовали поли1А)*РНК, выделенную из кожи зьйриона человека, находящегося на 20-ой неделе внутриутробного развития, для синтеза кДНК, так как на этой стадии наблюдался максимальный уровень экспрессии транскрипта, специфически гибридизуюшэго-ся с зондом К51. Полученная кДНК была лигврована в вектор .ЛёгНО и, таким образом, получена библиотека кДНК со средним размером вставки 1.5 т.п.о. Эта библиотека содержала около 50% рекомбинантов.

Молекулярное клонирование кДНК-копии гена человека, родственного гену К51-Болыпая часть открытая рамки считывания клона К51 состоит из йС-богатих повторов, что затрудняет его использование в качестве специфической пробы для

1 К51 2К1

Рис.2. Повторы в структуре Рис.З. Блот -гибри-

клона К51. Анализ проведен пето- дизааия усеченной К51-дом с1о1-юа1:г1х. прозы с тотальной (А) и

поли! А)* (В) РНК .из кожи пятимесячного - эыбриона-человека.

скрининга библиотек;: (рис.2). Для того, чтобы преодолеть это затруднение иы изготовили серию депецуонних мутантов и выбрали из них того, которая давал наименьший фон при гибридизации с РНК из кохи человека. К сожаления, эта усеченная проба обладала слабой аффинностью ¡рис.3), поэтому ыы использовали комбинат» полноразыерной и усеченной проб К51 для скрининга библиотеки кДЖ из кожи пятимесячного эмбриона человека. £ результате скрининга библиотеки было выделено три клона, даюшие сильный гибридизацконныя сигнал при гибридизации с полнсразмераой К51-проСоя. Но только один из них гибридизовался с усеченной пробои (рис.4). Ок содержал вставку длиной 1.536 п.о. и получил название Н!С51. Меченные зонды К51 к НК51 гибридизовались с одним и теаже крысиным транскриптом длиной 2.100 нуклеотидов (рис.5), что подтверждает сделанный ранее вывод о родственности этих генов. Зонд НК51, кроме этого, слабо гибридмэовался с транскриптом несколько меньшей длины.

1 2

Рис.4- Блот-гмбридизация Рис.5-'¿Ееат-гибридизация

клона А^иО/ЖЛ, расщепленного поля! А >ЖРНК крысы с мечен-

рестриктазой ЕсоН1, с усеченной нами 32Р К51-пробой 11) и

32Р К51-пробои. НК51-пробоя 12).

. Экспрессия гена НК51 в коже человека. 1& использовали клон НК51 в качестве пробы для РНК-блот-акаяиза. Эта проба гибридизовалась с транскриптом длиной 2.350 нуклеотидов на разных стадиях развития кожи эмбриона человека Iрис.6). Человеческий транскрипт был несколько больше соответствующего транскрипта в эпидермисе новорожденных крыс, но был того же размера, что и транскрипт, -гибридизуюшиися с К51-зондом ('¿)ис.п. Кроме этого, в РНК, выделенной иэ кожи эмбриона на 14-оя неделе развития, гибридизовапся дополнительный транскрипт длиной 3.000 нуклеотидов. Ми такав наблюдали фоновую гибридизацию с 186 и 283 РНК.. В этом отношении поведение проб К51 и НК51 было похожим. Сгедует отметить, что при перекрестной гибридизации этих проб с РНК человека и крысы наблюдается значительно оолее сильная фоновая гибридизация, чем при гибридизации с гомологичным материалом.

1 2 3 4 5 6 7

и-VI

— гаэ

—чвв

.Г

Рнс.6. Блот-гкбридизация НК51-пробы с образцами

РНК из кожи человека на разных стадиях развития. Дорожки: 1, тотальная РНК, 14 недель; 2, тотальная РНК, 20 недель; 3, поли! А)*РНК. 20 недель; 4, поли1А)"РНК, 20 недель; 5, тотальная РНК, 22 недели: 6, поли(А)"РНК, 22 недели; 7, поли(А)*РНК, 22 недели.

Первичная структура клона НК51. Для анализа первичноя структуры клона НК51 был использован ыетод килосиквенса. На рис.7 показана нуклеотидная последовательность клона НК51 и. выведенная из нее аминокислотная последовательность. Сравнительный анализ показал, что клон НК51 содержит часть первого экзона и полнуо последовательность со второго по восьмой экзон гена человека, кодирующего кератин 10.

Повторы в структуре гена, кодирующего кератин 10 -человека. Мы проанализировали структуру гена кератина 10, используя как вновь расшифрованную нами последовательность, так и последовательности, установленные ранее другими исследователями. В начале первого и в середине седьмого экзонов локализувтся два сегмента длинои 300 п.о., состоящие из повторов - 1рис.й). В обоих сегментах мозио заметить характерную внутреннюю структуру. На рис.ЭА.В показана

С1УГ1Т>ОВ1_1Н011» м

ООСАААТЛСТАСААААССАТССАТОЛССТТААЛААТСАОАТТСТСЛАС «I

СТМСЛЛСТСАТШСССЛЛЫТССТКТТСЛСАТССЛСЛАТКЖЛа; »

1ЛАООГ«1»УЕЫЕ»А1 т

СТСОСАОСТОАТСАСТТСАгССТОААОТАТОАОДАЮАОСТАОСТСТС 1«

Е1Т1.Т(«01Е1101Е£1 ■

САгС7а1СССТСАССАА£СГГСАГСТССАСА7ССАААТГ<>иМССС7С М

Т{Е1«Т1К1К1ЕЕЕМ1 М

АаСААСАССТССССТАТСТСААСАДСААССАССАСаАССАЛАТС.иЛ Ш

^>^^^l^v%■т г, огигенна ш

йАССПСОЛААГСТСТССАСТСОТОАГСГСААТСГСОАААЮААГОСТ 3*

АРСУ1>1.Т01 Ь N N М I 5 О 1Я

СССССССОТСПСАТСЮАСТСААСТТСТОААТААаГСАЛААОССАА ЗИ

УЕО1АЕ0КУ.11)»Е«»Г 1« ТЛТОЛАСААСТГССТОААСААААССССАААОАТССТОААССаОСТТС

О Л Ь Е ) Е10£01А|.10£ СААССТСТСОАСАТАОАЛСТАСАСГСССААСТССССТТОАААСАЛТСС 5«

5010А015Л1ЕЕ01.00 2М ТСАСАОАТТСА(ХКССАОАТА1ССОСГС1СОААСААСА(ГПССААСАС АН

011|«1.ЕМЕ10ТУ1С1 Я* ОА1АТТААСАТССОАСТСОЛОААГСАААТТСАААСС1АССОСССаГГС ЗИ

ГСГ, СУС.СГ. 55ССС55С

ТТСОСССОСООСТЛСОССС-СССОААОГГСССССОССООААССТССОа: м

ССНСС55С. ССТСОСХ! »•

(тКССАСССССССАОТТСССОСОТСССТАССОАОааИААОСТСС П2

ССВХ50С01Г000555С Я»

(ЮСМссаллостссоссоссскктлсоооожглААастсслйСОсс «а

ОСССОУСОС55ССС5$ 352

сетихсссаасспАсмососсаАгассосссссссСАйСАсс ив*

55505УСЕ55510Р»Т Я*

ТССТСТТССаООТСССГСОСССАСТСТТСАТСТААОООАССААОАГЛС 1152

14АСААААССАОАСТААТСААСАСААТТАТТОАЛСАССТССССССССА 12М

СОСТАСАСТТСТТТСАТСТАТССТГСААТСАСААЛССААСАААСАСТА 12«

аАТТАААСТССАТСААСА(й/ААСАСТСТСССТ1САСАСА5АССАТ1 1355

АГТГАСАСАТССАТССААААСАААСТСТССААСААААСАПТСТСТСТ 13«

ТГ.АТСОТСТЛТСйАААТАОАССТТОААААТЛАССТОТСТАСААЯГГСТ 12!2

ТТТОТОСТТТСТОТАТПаТСТТТТСЛСТТТАССАОАААСТСТТСТГ 1 «о ТААТОСАЛАСАААААСА/СТТТСТСТТСТСАТТТАС1ААТСААТТТС1 I «3

ЯМДСТТТСТТАСТСАТССАААСТААА/ААААААААААААААААААА 1X14

Ряс. 7. Нуклеотидная последовательность кЛНК.-вставки клона НК51, кодирующего кератин 10 человека, и вызеденная из нее аминокислотная последовательность. Стоа-кодон и сигнал полиаденилирования подчеркнуты.

структура повторов первого экзона. В 5'-концевой области этого экзона располагается небольшой кластер коротких повторов, который отделен от кластера длинных повторов в 3'-концевой области спенсером с низкой плотностью повторяющихся единиц. На рис.9С-Е представлении повторы седьмого экзона. В начале и в конце этого экзона располагаются длинные повторы, разделенные спейсероы с низкой плотностью повторяющихся единиц и кластером коротких повторов. Структура этих двух районов с повторами не только имеет общее сходство, но и обнаруживает высокую степень гомологии, что хорош видно на рис.8В,0.

Сравнение нуклеотидиых последовательностей гена кератина 10 человека. Все известные в настоящий момент нуклеотидные последовательности гена кератина 10 значительно отличаются друг от друга, (рис.10). Вдоль всего гена

Рис.8. Повторяющиеся единицы в структуре гена кератина 10. Проанализированы четыре нуклеотидные последовательности гена кератина 10 методом dot-matrix.

\ - ;„ 1

м short \

в repeat* . s

г . \ »««.V

е>

• i *

ч i ^

Ж >

• • 4 ^ v\\ \

"V'AHAV^

:. ;оч\.ч 4N\;. i--'V.V'W'W

abort

С repeats

abort \

repeat« \ Л: ... Л*

," -V-' N

В S i s -- *<- i V

1 S7.nu 327

■ \ ' V ч Ч V;-w

л\\ \ -Aw-

-v • \ >

"\н s. t,V»iu>

v. V-N4 * \ -ч vs ^ "

JLWX

Bbcrt D repent в

D7.KU

-

• ч х-л?

—

\ V

ninil \iiii •

1 il | •»•». » «)

abort \

I repeat ь \

V • \Л. • \ \ • V4

viVv.

Рис.9. Структура повторов первого (А, В) и седьмого IC-F) экзонов гена кератина 10 человека. Анализ проведен методом dot-matrix.

разбросаны точковые мутации, однако, наиболее интересные наблюдения касаются первого и седьмого экзонов, где выявляются залетные структурные перестройки. Более того, интроны

X

гена"кератина 10 значительно более консервативны, чей экзоны I и YII: интроны изменяются несущественно в пределах класса млекопитающих в то время, как первый и седьмой экзоны отличаются даже в пределах одного вида I Ново sapiens >. Перестройки тесно связанны с районами повторов (рис.10). Несмотря на кажущееся отсутствие закономерности в этом процессе, открытая рамка считывания в консервативных областях и положение стоп-кодона остаются без изменении. Это говорит о том, что перестройки происходят по определенным законам, либо отбираются только те из них, которые удовлетворяют требованиям естественного отбора. Попытки анализировать перестройки в первом экзоне не привели к заметным результатам, однако можно заметить, что делениям подвергаются тринуклеотидные повторы AGC и AGG 1рис.ИА). Перестройки в седьмом экзоне происходят в четко определенных сайтах (в

Рис. 10- Перестройки гена кератина Ю. Показаны структурные перестройки первого и седьмого экзонов методом dot-matrix.

•ССССТЛСТССЛССДСОССААД

[.ОКА С

Г.ОКА

».СКА

I & Г<1дС<УТПАССТСАСМС0СГГСАГк оа СССТСТТТТДССССс СОСАССТСТМ

к ь» ой*сй*гплйстсАСоосйСГгсм> со ойстатгтлг-ссс^ йшласгсй

(.ОКА ТСОСО*ТС^ТТйСЛйОСТаТСлаГТбОСТАТООАС^ТТАОСАОСТШ^СТОСА Т.ОНА 0. СКА

¡.РИА СС7АХТТТО ТСОЛЛССТЛТОСЛЛСТЛССМ/С111ЗСТН&АбГТЛТС&АЯСАССТ 1.0НА ОСТАОСТТГО Т.ОМА О.ОКА

£. ГИД СТТе апССЛСССООС Т ТТССМХЛСССТПОСТССГГССА ТТг ССАОСАОА{ ССг ссс (.ОНА Ш1С01салихсшттгссАМ^>стпсбт&стситссА(^аАтастсш Т.ОНА

В. ОНА АСССТГГОСТССТОСАТТТССАССАСАТХТССС

$.®НА тСТПСТССАААТСАААААОТиССАТОСАСААТГТСААТСАСССС.ТССйтест ¡.мл С7тШтстйймлтслмллатмссл1аслс4лтс7СЛАгалсс<хаахттсст

Т.ОНА

О.ОКА СТтСТСТ0(ШАТСАААААСТиССАТССАСААТас^ТСАСС1ХСГСССТТГСТ

О.ОНА АСТТС^ААЛОТГСССССТСТСОЛЛйЛЛТСЛАЛСТ^ $.ИМ ССМёССТЛТОАее АОГАТСС

1.0КА «МТОСТАТСААЛАССАТ« . ________________________._______________

Т.ОНА __ - кОСААА

В.ОНА ССАСПЖТАТ(^ииц^ТСССиаСАСАТСАНЖ№ЮССТССТСАСТАСАаААА

1-Й" 1*ст*смЗКеатссАТс

ссттааааатсао £СТТааалаТСАС ссттааааатсао ССТТАААААТСАС

в

5.ОНА К.РИА Т.ОНА О.ОНА

ГГСОСССОССССТАСССССССБСААСС гтссссссссастАссасссссАЛс •

$.ом* ссосль

К.ОНА

той*

О.ОМА

К.ОНА I______........... .......

Т.ОНА ОСХ)СйАОТ^ГГСАТСТААСООАСС*АС О.ОМА ССШиСТСТТСАТСТААССОАССААС

----- .•еСТССТСТТСССОСТСССТ

;асаайгсстсстсггссс«отссот

.»АСААСГССТССТСТТССООСТСССТ

:сАСААСтсстсстсггсаостссот

^САСАГГАСТСААГГСАСАССГАЛТСГ<1СААССГСТвСЛСАГАС£0

Рис-11- Сравнение четырех нуклеотидных последовательностей первого экзона 1А), седьмого экзона (В) и З'-концевоя области кератина 10 человека. Сигнал полмаденилирования и 3'-концевой тетрануклеотид обведены.

тазсссАактсстссстАлоАлт» тстаоо с сааасостсссп с

ТСССТАДСААТ1 ТСТАйСо СААЛСОСТСССТт б

отличие от первого экзона) и представляет сооои делеции и/или дупликации тандемно повторяющихся последовательностей длиной от 12 до 76 п.о. Iрис.115). При этом кластеры коротких повторов никогда не подвергаются полной делеции.

г*С55СО0СЯ5С55ОСУ«Я0СТСССЧГ| ССТСКЭТПЮ'УБСКГШ* ГЮГО СОТ «.АЧ1 $ао&50бссгос$5ссгсоиссгссс&г-с£гс£&$гсс$уса$гссо>(сос$гс><к<

Т.ам: .«

и. а*;

С. дм] СГаССРССООС1и(МиГТи(ЖЬтжи$УШУ11А1ЕЕ$ГОГС

S.AVI 1шиьУвоНс»5«осЕР»пу«ту1:т1вди;?Ю11^ттачАМ^101охА»1АА Т.ач!

С.АМ1 1Е«ИЕ«Е1НСН$ЖЮЕРт5ХУТКТ100иМУ11КТ1£«иН1и101ША1иА

Б.«4» ЮТШУШУАШ£УЕА1>1ЖЛШ1тТ1Ле II

R.AVI ГОГШ>ЕЯЕУА1№$УЕЛ01№1КЯУиЕ1Т1иЛ01ЕМд1Е51ТЕЕШЧМЮ<ЕЕ

7.АЧ1 ООП И*ЕМГ>АЬ80$УЬА01МЭ188У10Е!1.Т1ТКАС1Еи01Е51ТЕЕЫУ11£К"НЕЕ

й.АМ! 0ОГШУЕМЕУАиО$У£Аа1№и>.ЗУШ1ТШ.и)1ЕиО1Е51ТЕг«АУикШЕЕ

5.АЫ1 - ЭДНитоШУтиНААГСУОЬТОШГЭП« 01'ЕО 1Л ЕОМК К ОАЕ А УШЕК 5К Е1.

R.AVI ЕМХ|>1К^ТСОУНУ^ШМУ111Т0иЕ№««&бУЕ0иЕОНЯ1ОАЕА«РНЕ1:$1СЕ1

Т.АЧ1 ЕМХ01т$ТС[)У1<УЕММАА1>и\Т)ЕТ011тСа50УЕ0и£ОЯВ1ОАЕА»Г«ЕК5)СЕ1.

О.АМ) ЬаШЦКШСО^УЕШААРС* ВШШОАКДОЕдиЕОКШМЕАЪ №СиЕ1

ТТ110т1Е01$$УК5Е1ТЕиКМУОЛШЕи}тА1КО£1Ш1АЕТЕСКУСУО^

Х.А«; 010*011Л1ШН.а 1иЕТЬСОНТЕУ<Х31л й1111!11еКЕ1дт5иЬСЕ«$ОООС R.AVI 01«А01и1ЕЕОШиАПЕСОКТЕТООа01К111ЕМЕ10ТУ*^11ЕОЕСгЛОООС Т.АМ1 01ОАО15А1ЕЕ010д1*АЕТЕСО?'ТЕу2С1и51*1*1ЕК11рП'?и иЕСЕС^СО«. О.АМ1 С1ОАО1и1и0^11АЕТЕС0т^5оШ)1Х(КШа]ОШ5и.ЕСЕС$и|С</

Б.АМ! К.АМ1 Т.АМ1 &.Ш)

К.АМ1

1 .Ш1 О.«У

5.МО к.лит Т.АМ1 0.АМ1

■соя гкхусадосазд-«хжйиоосусооидсшсооу-.' —

ЫХЖШГОаЮг 5С6МЬСЮС<й£ССйУС«* Ш-

-£$^ССНСС555ССУС6СУ ССССССГ6СС$$0СС$$$СС5УССС$5$СССУССС

БСССЗ БХОСЖК^^УаЯХШКлЮУСССИ-СОб^ 5У50С*00С

^ & ^ е $1 ССУСЮСе $ССОС№ « а • $——-—-~-«Ю&$5ОС0У60С

Б^ССГСХШС^СЕ^ЮМУ

ЗиКНДОДОСТОЕШКСПУ

Ркс.12. Сравнение различных вариантов аминокислотных последовательностей кератина 10.

Сравнение аминокислотных последовательностей кератина

10- Перестройки в первом и седьмом зкзонах, приводящие к изменению аминокислотного состава И- и С-концов. I рис.12», вызывают изменение профилей гидрофильности в концевых областях полипептидных цепей Iрис.13). Это может отражаться на структуре промежуточных филаментов, так как неспиральные концевые участки кератинов играют важную роль в упаковке и стаОилизалии суперспиральных структур цитоскелета клетки-

Различные варианты кератина 10 представляют сооои продукт« разных аллелей этого гена. Как об«яснить, что четыре известных последовательности гена кератина 10 так

' !

Т.АМХ

5.Ш1

В.АМ1

Рис-13. кератина 10.

ехоп VII

Профили гидрофильности различных вариантов

существенно отличаются в двух из зосыш экоонах? По крайней мере, две возможности должны быть рассмотрены. (1) Наблюдае-гиые различия являются результатом ошибок секвенированил и не отражаат реальных структурных различии между генами. Это предположение с трудом ыолио принять потомучто: !а) ошибки секвенирования, как правило, нарушает рамку считывания, чего ке происходит в рассматриваемом случае; (б! если различия являются результатом случайных ошибок, то почему они сосрэдоточены только в двух экзонах из восьми во всех четырех случаях и не разбросаны по всему гену? (2) Структурные различия в первом и седьмом экзонах отражают скорее полиморфизм гена кератина 10, чем артефакты клонирования и сиквенирсЕания, так как все кДНК и геномный клон кератина 10 были выделены в разных странах от неродственных индивидуумов. Второе предположение казалось нам наиболее вероятным. Для того, чтобы проверить его, мы выделили образцы геномной ДНК. из крови десяти пациентов и использова-

ли ее для блот-гиОридизации. ДНК подвергли расщеплению рестриктазой В811 и Н1пс1111, так как Ш.гк1111 полностью вырезает ген кератина 10, а Ве11 располагается в тех повторах, которые подвергаются делениям и, следовательно, рестрикция по этому сайту должна давать полиморфную картину. Результаты этого опыта полностью соответствовали нашиму преддолоасению. Очевидно, что для гена кератина 10 характерна высокая степень полиморфизма, а различные варианты кератша 10 представляет собой продукты разннх аллелей этого гена.

Кератин 10 и кератин 1 является основными составными компонентами цитоскелета зрелых кератиноцитов, образующих епидермис. Принимая во внимание тот факт, что концевые участки полипептидныг цепей кератинов играют ванную роль в формировании промежуточных филаментов, мокко предположить, что полиморфизм кератинов имеет самое прямое отношение к различиям в морфологии кожи, которые.наблюдаются в популяции человека. Кроме того, делеции и дупликации в кератинах могут ускорять или замедлять процесс старения коки. Перестройки в кератине 10 могут Сыть результатом, по крайней мере, двух процессов: неравного кроссивговера и просьсальзызания ДНК-полимеразы. Однако второй механизм монет быть задействован с большей вероятностью, так как неравный кросскнговер чащз всего вовлекает длинные повторянциеся последовательности. Полученные данные могут быть использованы в медицине и криминалистике, так как ген кератина 10 - удобный полиморфный маркер.

&ормкроаание 31 -конца иРНК кератина 10. кДНК. кератина 10, выделенная Оаппоп с соавт., занимает особое положение. На 3'-конце этой кДНК имеется дополнительный сегмент длиной 49 п.о. Это тем более интересно, что все мРНК кератина 10 на конце имеют одинаковый тетрануклеотид АДСи (рис.НС). В случае упомянутой выше мРНК на месте этого тетрануклеотида располагается пентануклеотид ААСШ. Вставка одного нуклеоти-дд превращает природный тетрануклеотид АДСЧ в ААСХЗи и сдвигает действительный сайт полиаденилирования к следующему тетрануклеотиду ААСи, расположенному на растоянии 45 п.о. от природного сайта разрезания РНК-предшественника и на

расстоянии 66 и.о. от сигнала полиаденилирования а&ХЗ&АА по гаду транскрипции. Эти данные показывают, что т&грануклеотид ААСи играет важную роль в реакции разрезания предшественнин-а, возможно, являясь сайтом связывания для одного из белков, формирующих полиаденилирупций комплекс. Это может Сыть белок С (преобладающий белок, ассоциированный с гетерогенной ядерной РНК), который пришивается ультрафиолетом к сайту полиаденилирования. Интересно, что фланкирующие последовательности не оказывают никакого влияния на функционирование тетрануклеотида мси в качестве сайта разрезания предшественника, так как первый и второй тетрануклеотида окружены разными последовательностями. Некоторые данные, касающиеся роли последовательностей, расположенных ниже сигнала полиаденилирования по коду транскрипции, были опубликованы, но все они очень противоречивы. Разные РНК имевт огромное разнообразие 3'-концевых последовательностей, однако, мРНК, транскрибируемые с одного и тогоже гена имеют идентичные 3'-концы. Этот факт и данные, описанные выше, показывают, что последовательности, прилегающие к сайту полиаденилирования, играют критическую роль в формировании 3'-конца. Таким образом, формирование З'-концов мРНК направляется, вероятно, не только сигналом полиаденилирования и последовательностями, расположенными за ним, но и короткими нуклэотидными последовательностями, прилегающими к сайту полиаденилирования и специфичными для каждой конкретной транскрипционной системы.

выводы

•1. Изучена экспрессия гена, родственного гену К51, в коже человека на разных стадиях развития.

2. Сконструирована библиотека кДНК. та кожи эмбриона человека и га нее выделен клон НК.51 по гибридизации с крысиной пробой К51.

3. Расшифрованная нуклвотвдная последовательность клона НК51 оказалась соответствующей гену, кодирующему кератин 10.

4. Сравнение вновь определенной структуры с известными ранее показало, что между ними 'имеются существенные различия, которые сосредоточены в первом и,особенно, седьмом экзонах и являются результатом структурные перестроек.

5. Повторы, локализованные в начале первого к серэдине седьмого эхэанов играют важную роль в чтих сойктияа.

6. Перестройки в М- и С-концевых областям кератина 10 приводят к изменению профиля гидрсфильности, что может иметь окологичзскукз роль.

7. Формирование 3' -конца мРНК направляется не только сигналом полиаданилировавия и последовательностями, расположенными за ним, но, вероятно, и короткими нуклеотиднымк последовательностями, прилегающими к сайту шлиадеяилиро- вавия и спэщфтчвымк для хакдой транскрипционной системы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. V.R. Babaev, М.Е. Belowa, А.У. Ikachenko, Е.М. Тагагак, I.A. Kazantseva, I.H. ChunaiCDV. The expression of skln-

• speoliio gene £51 In tlio epldernal layer oi human akin and In basal cell carcinoma cells. - Arch. Dermatol.• Вез., 1991, v. 283, p. 113-118.

2. A.B. Ткаченко, Б.Л. Бухыан, В.В. Блисиовский, Ю.П. Швец, Л.Л. Киселев. Экзоны.1 и УН гена кератина 10 человека подвергаются структурным перестройкам в области повтороз. Вторая всесоюзная конференция "Геном человека - 91". Переславль-Эалесокий, 1991. Тезион докладов и стендовых сообщений, с. 56.

3. A.V. Tkachenko, V.I. Buchman, V.y. Bllskovaky, Yu.P. Shvets, l.L. Kiaaelev. Esona I and VII of the gene (2er10) encoding human keratin 10 undergo structural rearrangements within repeats. - Gene, 1992, v. 116, p. 245-251.