Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ген кератина 10 человека: молекулярное клонирование, секвенирование нового структурного варианта и обнаружение высокой вариабельности двух экзонов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Ген кератина 10 человека: молекулярное клонирование, секвенирование нового структурного варианта и обнаружение высокой вариабельности двух экзонов"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ ЯАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

На правах рукописи

ТКАЧЕНКО . Андрея Викторович

УДК 577.212

(

ГЕН КЕРАТИНА 10 ЧЕЛОВЕКА: ВДЛЕГО-ЧИЯРКОЕ КЛОНИРОВАНИЕ,-СЕКВЕНКРОБАНЙЕ Н030Г0 СТРУКТУРНОГО ВАРИАНТА И ОБНАРУЖЕНИЕ ВЫСОКОЙ ВАРИАБЕЛЬНОСТИ ДВУХ ЗХЗОНС-В

Специальность 03.00.03 - молекулярная бмсшогия

/

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата Оиологических наук

ПОСКВА - 1992

Работа выполнена в ' лаборатории молекулярных основ онкогенеза Института молекулярной биологик Российской Академии Наук.

Научный руководитель:

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Л.Л. Киселев.

Официальные оппонента:

доктор биологических наук Рубцов В.М. доктор биологических наук Рысков А. Ги

Ведущая организация:

Институт' биологии развития РАН им. Н.К. Кольцова.

заседании Специализированного совета Д 002.79.01 при Институте . молекулярной биологии РАН по адресу: 117864, Москва, ул. Вавилова 32.

С диссертацией мозно. ознакомиться в . библиотеке Института молекулярной биологии РАН. «— „

Автореферат разослан "/сг А/СЬЫ'^иг- 199? г.

Зашита состоится

Учежя* секретарь Специализированного совета канд. хим. наук А. М- КРИЦЫН

Актуальность проблемы- В последнее вреая наблпдается все возрастающее число публикаций, посзяданных изучению повторов. Повторявшиеся последовательности ЛНК играют, по-Еидимоыу, зажнув роль в функционировании и эволюции геномов зукариот, а также в старении организмов. Концевые участки кератинов 1 и 10 человека, образующих пару, зкспрессирушую-ся в терминально дифференцированных кератнноаитах, содержат протяженные участки повторов. Они кграат важну» роль в формировании и стабилизации промежуточных филаыэитов. Поэтому обнаружение структурных перестроек в области повторов кератина 10 и изучение их дохаиизиа имеет большое значение для понимания биологии кожи. кДНК-копия кератина 10, выделенная в ходе работа, тают может быть использована в качестве маркера.

Лель работа. Цель» работы было изучение экспрессии гена, родственного гену К51 (выделен ранее из геномной крыелноя библиотеки по гибридизации с v-nos пробой в нестрогих условиях), в коже человека на ' разных стадиях развития, а такзз поиск гена, родственного гену К51, в геноме человека. Оказалось, что это ген, кодярушций кератин 10. Б первом и седьаоы экзонах. этого гена обнаружены структурные перестройки. Изучению этих перестроек и полиморфизма гена кератина 10 посвящена значительная часть работы.

Научная новизна работы- Образны РНК, выделенные из ко.•ai человека на разных стадиях раззития, использованы для блот-гибридязации с пробоя К51 с цельа обнаружения и анализа экспрессии гена, родственного гену К51 крысы, в кояэ человека на разных стадиях развития. Специфическая гибридизация наблюдалась с транскриптоы длиной 2.350 нуклеотидов. Максимальный уровень экспрессии наблюдался на 20-Я неделе внутриу-

тробного развития. Поли1аГрНК, выделенная из кожи эмбриона на этой стадии развития, использовала для создания библиотеки кДНК. Из нее выделена кДНК-копия кератина 10 по гибридизации с зондои К51 (который гибридизовался с транскр-иптом из кожи человека длиной 2.350 нуклеотидов ) в строгих условиях. В первом и седьмом экзонах гена кератина 10 обнаружены структурные перестройки, приводящие к изменению аминокислотного состава N- и С-концевых областей кератина 10, что может отражаться на его функции. Полиморфизм гена кератина 10" (и, возможно, других кератиноз I определяет разнообразие морфологии кожи в популяции человека.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано три работы.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всесоюзной конференции по геному человека "Геном человека -91" ( Переславль-Залесский. 1991 ).

Об ем раОотн- Диссертация состоит из введения* обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения' результатов и выводов. Работа изложена на страницах машинописного

текста и иллюстрирована 22 рисунками. Список цитированной литературы включает 119 наименований.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ экспрессии гена, родственного гену К51, в коже человека.Из кожи эмбрионов человека на разных стадиях развития (была использована кожа эмбрионов, находящихся на 14-ой, 20-оп, 22-оя неделях внутриутробного развития , а также кожа взрослого человека) была выделена суммарная РН1С. В свою очередь для некоторых образцов получали поли(А)*РНК и поли(А)~РНК. Эти образцы использовали для блот-гибридизации с пробой К51 с целью обнаружения и анализа экспрессии гена, родственного гену К51, в коже человека на разных стадиях развития (рис.1). Мы наблюдали довольно сильную фоновую гибридизацию зонда К51 с 1ÖS и 28S рРНК, а также с некоторыми другими транскриптами. Но анализ гибридизации поли(А)*РНК

1 2

5 6

t

¡Ш —26S К? -18S

ч

Рис.1. Блот-гибридизация zzР К51-пробы с образцами РНК из кож-! человека на разных стадиях развития. Дорожки: 1, тотальная РНК, 30 лет; 2, тотальная РНК. 14 недель; 3, тотальная РНК, 20 недель; 4, поли(А)*'РНК. 20 недель; 5, полШАГРНК, 20 недель; 6, тотальная РНК. 22 недели; 7, поли(А)"РНК, 22 недели; в, лоли(А)*РНК, 22 ведели.

и полШДГРНК с зондом показал, что наблюдается специфическая гибридизация с транс'кркптом длиной 2.350 нуклеотидов. Максимальный уровень синтеза этого транскрюгга происходит на 20-ой недоле' внутриутробного развития. .

Создание библиотек!*. кДНК из козси человека-Мы использовали поли1 А И РНК., Еыделенную из кожи змзриона челозека, находящегося на 20-ой неделе внутриутробного развития, для синтеза кДНК, так как на этой стадии наблюдаася максимальный уровень экспрессии транскрипта, специфически гибридизующэго-ся с зондом К51. Полученная кДНК была лигирована в вектор AgtlO и, таким образом, получена библиотека кДНК со средним размером вставки 1.5 т.п.о. Эта библиотека содержала около 60S рекомбинантов.

Молекулярное клонирование к ДНК-копии гена человека, родственного гену К51.Большая часть открытое рамки считывания клона К51 состоит из GC-богатых повторов, что затрудняет его использование в качестве специфически пробы для

Рмс-2. Повторы в структуре Рис.3. Блот -гибри-

к.-.онаК51. Анализ проведен мето- дизация усеченной К51-дом dot-matrlx. прозы с тотальной (А) и

П07ГИ1 А I* I В ; РНК.из коям пятимесячного зибриона-человека.

скрининга библиотеки (рис.2). Для того, чтобы преодолеть это затруднение мы изготовили серив делеционных цутантов и выбрали из них тоге, который давал наименьший фон при гибридизации с -РНК из ко .ад человека. К сожалении, эта усеченная проба обладала слабой аффинность» (рис.3), поэтому мы использовали комбинация полноразмерноя и усеченной проб К51 для скрининга библиотеки кДНК из ко si пятимесячного эмбриона человека. В результате скрининга библиотеки было выделено три клоно, дасшие сильный гибридизанионныя сигнал при гибридизации с полнеразмёрной К51-пробоя. Но только один из них гибридизовался с усеченной пробой (рис.4). Он содержал вставку длиной 1.536 п.о. и получил название НК51. Меченные зонды К51 и НК51 гибридизопались с одним и темже крысиным транскриптом длиной 2.100 нуклеотидов (рис.5), что подтверждает сделанный ранее вывод о родственности этих генов. Зонд НК51, кроме этого, слабо гибридизовался с транскриптом несколько меньшей длины.

-1.5 то.

'8S

I—-18S

Рис.4. Блот-гибридизация клона AgtiO/HK51, расщепленного рестриктазоя EcoBI, с усеченной 32Р К51-пробоя.

Рас.5-' ;Бют-гибридизация полм(А)^РНК крысы с меченными 32Р К51-пробой 11 ) и НК51-пробоя (2).

. Экспрессия гена НК51 в коже человека.йы использовали клон НК51 в качестве пробы для РКК-блот-акаяиза. Эта проба гибридизовапась с транскриптом длиной 2.350 нуклеотидов на разных стадиям развития кожи эмбриона человека i рис.6). Человеческий транскрипт был несколько больше соответствующего транскрипта в эпидермисе новорожденных крыс, но был того же размера, что и транскрипт, гибридизувшипся с К51-зондом Ijmc.l). Кроме этого, в РНК, выделенной из кожи эмбриона на 14-оя неделе развития, гибридизовался дополнительный транскрипт длиной 3.000 нуклеотидов. Mu также наблюдали фоновую гибридизацию с 18S и 28S РНК. В этом отношении поведение проб К51 и НК51 было похожим. Следует отметить, что при перекрестной гибридизации этих проб с РНК человека и крысы наблюдается значительно . более сильная фоновая гибридизация, чем при гибридизации с гомологичным материалом.

л

1 2

3 4

5 6

7

—28S

flr|f!" 83

Рмс.б. Блот-гибридизация "Р НК51-пробы с образцами РНК из кожи человека на разных стадиях развития. Дорожки: 1, тотальная РНК, 14 недель; 2, тотальная РНК, 20 недель; 3, поли!А)*РНК. 20 недель; 4, поли1А)"РНК, 20 недель; 5, тотальная РНК, 22 недели; 6, поли(А)"РНК, 22 недели; 7, поли(А)*РНК, 22 недели.

Первичная структура клона НК51- Для анализа первичной структуры клона НК51 был использован метод килосиквенса. На рис.7 показана нуклеотидная последовательность клона НК51 и. выведенная из нее аминокислотная последовательность. Сравнительный анализ показал, что клон НК51 содержит часть первого экзона и полную последовательность со второго по восьмой экзон гена человека, кодирующего кератин 10.

Повтори в структуре гена, кодирующего кератин 10 человека. Мы проанализировали структуру гена кератина 10, используя как вновь расшифрованную нами последовательность', так и последовательности, установленные ранее другими исследователями. В начале первого и в середине седьмого экзонов локализуются два сегмента длиной 300 п.о., состоящие из повторов - 1рис.0). В обоих сегментах можно заметить характерную внутреннюю структуру. На рис.9А,В показана

б

GtYYKTIDDLKNOILN M GGCAAATACTACAAAACCATCGATGACCTTAAAAATCAGATTCTCAAC U

1.TTDNANILLOIDNAK П CTAACAACTGATAATGCCAACATCCTGCTTCAGATCGACAATCCCAGG «к

IAADDFR LIYENE»AI « CTGGCAGCTGATOACTTCAGGCIGAAGTATGAGAATGACGTAGCTCTG »*»

ROSVEA DINGLRRlfLD W CGCCAGAGCGTGGAGGCTGACATCAACGGCCTGCGTAGGGTGCTGGAT 112

EITLTIADLEMOIESL » GAGCTGACCCTGACCAAGGCTGACCTGGAGATGCAAATTGAGAGCCTG »

TtELAYlHINHEEEMi » ACTGAAGAGCTGGCCTATCTGAAGAAGAACCACGASGAGGAAATauA 2B

DIRNVSTGDVNVENN* 1П GACCTTCGAAATGTGTCCACTGGTGATGTGAATGTGGAAATGAATGCT 31*

APGVDLTOILNNM1SO 1Я GCCCCGGGTGTTGATC1GACTCAACTTCTGAATAACATGAGAAGCCAA ЗИ

YEOLAEOHRKDAEAWF 1M TATGAACAACTTGCTGAACAAAACCGCAAAGATGCTGAAGCCIGCIIC 4E

NEISIELTTEIDNHIE 1« AATGAAAAGAGCAAGGAACTGACTACAGAAATTGATAATAACATTGAA 41*

01 SSYESE I TELI1NV 1* CAGATATCCAGCTATAAATCTGAGATTACTGAATTGAGACGTAATGTA 53Я

OALEIELOSOLALKOS IT! CAAGCTCTGGAGATAGAACTACAGTCCCAACTGGCCTTGAAACAATCC 514

LEASLAETEGRYCVOl 5" ' CICGAAGCCICCITGGCAGAAACAGAAGGTCGCTACTGTGTGCAGCTC 4»

SOIOAOISALEEOLOO 2M TCACAGATTCAGGCCCAGATATCCGCTCTGGAAGAACAGTTGCAACAG 672

IRAETECONTEYOOLL ATTCGAGCTGAAACCGAGTGCCAGMTACTGAATACCAACAACTCCTG ПА

DIIIRLENEIOTYIGL» GATATTAAGAICCGACIGGAGAATGAAAITCAAACCTACCGCGGCCTG ЗЫ

LEGEGSSGGGGRGGGS П2 CTAGAAGGAGAGGGAAGTTCCGGAGGCGGCGGACGCGGCGGCGGAAGT £M

FGGGYGGGSSGGGSSG 2Я TTCGGCGGCGGCTACGGCCGCGGAAGCTCCGGCGGCGGAAGCTCCGGC SH

GGHGGSSGGGYGGGSS W GGCGGCCACGGCGGCAGTTCCGGCGGCGGCTACGGAG<XXa<AAGCTCC «12

GGGSSGGGYGGGSSSG X» GGCGGCGGAAGCTCCGGCGGCGGCTACGGGGGCGGAAGCTCCAGCGGC »И

CHGGSSSGGYGGOS S g. » GGCCACGGCGGCAGTTCCAGCGGCGGCTACGGTGGTGGCAGTTCCGGC !M

GGGGGYGGGSSGGGSS 352 C«G«:C«OOCGOCTACGG(MCC«:i.GCTCC«:-CGGCGGCAGCiCC 1SU

SGGGYGGGSSSGGHS S XS TCCGGCGGCGGATACGGCGGCGGCAGCTCCAGCGGAGGCCACAAGTCC 11«

SSSGSVGESSSEGPSY ЭС4 TCCTCTTCCGGGTCCGTGGGCOAGTCTICATCTAAGGGACCAAGATAC 1132

IMCAAAACCAGAGTAATCAAGACAATTATTGAAGAGGTGGCGCCCGA UM CGGTAGAGTTCTTTCATCTATGGTTGAATCAGAAACCAAGAAACACIA 1W CTATTAAACTGCAICAAGAGGAAAGAGICICCCT7CACACA0ACC*TT Ш1 ATTTACAGATGCATGGAAAACAAAGTCTCCAAGAAAACACTTCTGTCT 1M4 TGATGGTCTATGGAAATAGACCTTGAAAATAAGGTGTCTACAAGCTGT 13S2 TTTGTGGTTTCTGTATTTCTTCTTTTCACTTTACCAGAAAGTGTTCTT 1MJ TAATGGAAAGAAAAACAACTTTCTGTTCTCATTTACTAATGAATTTCA ia AliAACTTTCTTACTGATGCAAACTAAAAAAAAA.UAAAAAAAAAAAA 153«

Рас.7. Нуклеотидная последовательность кДНК-вставки клона НК51, кодирующего кератин 10 человека, и выведенная из нее аминокислотная последовательность. Стов-кодон и сигнал полиаденилирования подчеркнуты.

структура повторов первого экзона. В 5'-концевоя области этого экзона располагается небольшой кластер коротких повторов, которая отделен от кластера длинных повторов в 3'-концевой области спеясером с низкой плотностью повторяющихся единиц. На рис.9С-Р представлении повторы седьмого экзона. В начале и в конце этого экзона располагаются длинные повторы, разделенные спенсером с низкой плотность» повторяющихся единиц и кластером коротких повторов. Структура этих двух районов с повторами не только имеет общее сходство, но и обнаруживает высокую степень гомологии, что хорошо видно на рис.вВ.1).

Сравнение нуклеотмдных последовательностей гена кератина 10 человека- Все известные в настоящий момент нуклеотидные последовательности гена кератина 10 значительно отличаются друг от друга (рис.10). Вдоль всего гена

Рис.8. Повторяющиеся единицы в структуре гена кератина 10. Проанализированы четыре нуклеотидные последовательности гена кератина 10 методом йог-шагг1х.

'; Хх XX 4 ^Х Ч -Сч чч\Х-ч:ч

УЧ'ПЧ'ХЛГЧЛХ' .. :\\\ .ч V; .;.

■ • ,, у ^Х^'Ч аЬотЪ

С герекгщ

В7.1ВА

вЬо!^ г«р««Ък

вЬох-г \

г«р«а£а

В

1 S7.ini _ 327

Е7.ЯХ

ч * \ ■ ч ч ч -Л

аЬогс ч . 1

Рис.9. Структура повторов первого 1А, В) и седьмого (С-Р) экзонов гена кератина 10 человека. Анализ проведен методом йог-шагг1х.

разбросаны точковые мутации, однако, наиболее интересные наблюдения касаются первого и седьмого экзонов, где выявляются заметные структурные перестройки. Более того, интроны

1

гена'кератина 10 значительно более консервативны, чем экзоны I и VII: интроны изменяются несущественно в пределах класса млекопитающих в то время, как первый и седьмой экзоны отличаются даже в пределах одного вида I Homo sapiens). Перестройки тесно связанны с районами повторов 1рис.Ю). Несмотря на кажущееся отсутствие закономерности в . этом процессе, открытая рамка считывания в консервативных областях и положение стоп-кодона остаются без изменений. Это говорит о том. что перестройки происходят по определенным законам, либо отбираются только те из них, которые удовлетворяют требованиям естественного отбора. Попытки анализировать перестройки в первом экзоне не привели к заметным результатам, однако можно заметить, что делециям подвергаются тринуклеотидные повторы AGC и AGG (рис.IIAJ. Перестройки в седьмом экзоне происходят в четко определенных сайтах (в

В

' с

I

i

:в

iss

Рис.10. Перестройки гена кератина 10. Показаны структурные перестройки первого и седьмого экзонов методом dot-ratrix.

1 и-ш1 1772 1 2.И1 2MB

5.ии слссатстстст-

К. ОНА САССАТСТСТСТТССАТАСАССТСААССЫ

-ССССТАСТССАСС*ССАССА*6

5. пей <к Г^АСС*ТТТ*ССТС*ОСООССТТСЛ<к С& ССС ТСТТ ГТАССС& СССЛССТСТОС - »и О ООАййАТТГАОСТСЛбООСССПСАй« СО« «СТСТТТТАГ.ССО< ОСйАССТаСй

х.оиа тссоссет<угтто«к^сдтСАСсто(ет*то(ис^п*с<цссттсст(хи

■ .ОНА ТССССиТССтССССбСТСАТС/ССТбССТАТОСАССДПМЖАССТГТТОСТССА

ЮТАТСМСССАССТ

пи ттослсссссс*тсосу^сссАсттсжтсххУХХАстт-сстсх^юсгс

I.ОМА ТТССАйС«»СА«тСОйАССТСССАОСТПССТО««*^

т.оиа

О.ОНА

§. ОКА СТТс ССТООАООССаТТТСаЦЖАДКТПССТОСТОСАТТ; ССАвСАСАе ССс ССС Т.ОНА

О.ОМА АСССТТТССТССТбСАТТТССАССАСАТССТССС

5.ОНА СТТСТСТаССАААТСАААААСТААаАТОСАСААТаСААТСАСССОтосатсст 1.0НА СТТСТСТаССАААТСАААААСТААССАТССАСААТСТСААТСАСССССТСССПССТ Т.ОЯА О.ОИА С

о.она астт(Х1»саааоттссссстстсоадоаатсааастатсасстссаасссаааатсад

$.ША ТАСТДСАААА1

ГАААААТСАС 'АААААТСАС

......ТО -

в

^ТАССССвССССААСС

-----^ЛССССйССССЛАОС

ПГСООССССООСТАССОСООСОСАДи

I ОССаиСТСГТСАТСТААСОСАССА*; I бСССОМТтСАТСТААв(»АССААа

гтгсттАстсАтссдгсаг^

ГТТСТТАСТСАТОС^ 1АС-1

_ ГТТСТТАСтОАТОС/ 1АС-1 _

КТГТСТТАСТСАТСС/ иш ПйАСАТТАСТСААТЮАйАССТААТСТАСААССТСТССАСАТлс£ЗП

Рис.11. Сравнение четырех нуклеотидных последовательностей первого экзона 1А), седьмого экзона (В) и 3'-концевой области кератина 10 человека. Сигнал полиаденилирования и 3'-концевой тетрануклеотид обведены.

Т.И1А - *(£ААА

О.ОКА ССАСТССТАТМАААвСАГСССААСТСАСЛТСАСССССАСССТССТСАСТАСАССААА

отличие от первого экзонаI и представляют собой делеции и/или дупликации тандемно повторяющихся последовательностей длиной от 12 до 76 п.о. I рис. 11В). При этом кластеры коротких повторов никогда не подвергаются полной делеции.

S.AK1 MSVRYi SSSlot SSSRSGGOOGGfe ■■■ ■ StmSSStCSLGOCfSSCGrSCCSr

I. AH I USVKY-SSSi' • SSS<SGGGGGG& CGGGGCVSSUI SSSMSLGGGFSSOGFSGGSF T.AM! O.AM)

G FGGGFGGDGGILSGNEX VTMQNLNDfcLAS Y LDK VIAilESNYE

S.A4I DDFK LKYFNEVAIROSVEADINGLRRVLDELTLT« ADLEUOl ESLTEELAYLXKNt EE R.A4I DDFRlKYENEVAL^USVEADtNGLRRVLCELTLTRADLEMOlESLTEtLAVKINHEE

T.AMI DDFKLIYENfVAUOSVbADIbCLtRVLDELTLKAOLEUOIESLTEELAYUSNHEF

0.AMI DDFtLKYENEVAfJ(0SVtAOiNCLK2VLI>ELTLTKADLEU01ESlTET« AYLiKNHEE

S.AJi:-EinHLKKV^TCDVWEUNAArGVI>LTOLU?an>OYEOU£OKRIOAEAVrNEtSKEL ft. AM! OfliOLRKVSKiOVHV EJAMAAPCVDLTOi-Ueee SOY tOUktQKMDAE A1 fKitSiEL Т.АЧ! EMDigWSTGO/NVEMNAAPtiVDLTOLINfCdlSoYEOLAECNB10AE.MTFNE К S К E L D.AMI EUKOUtNVSICOVNVbUNAAPb DLlQLLMNMK&OYEOlAEQNBLDAEAfctiLKUEl

S.AMI TT|lDmiEOlSSYKSEITELRXNVOALElElQS0LAL10SlEASLAETECRYCV0t.S

1.AVJ TTElDNNUjlSSYISEITEUHNVOALEIELOliOUUOSltASUETEClYCyOLS 1 .AWI TTEIDNNIEOlSSYKSEITElRRNVOALEIElOSOLAUOSlEASLAETkCRrCVQLS D.AMI TTfciD?«llOJSStlSEnElXlNVC»U)U.OSOLALIOSLEASiJkiTlO«YCVOU

S.AM! OlOAOISALEEOLb IKAETECOKTEYOOLfDIXlBLENEIOTYISLLiCEGSSCGGC

l.AKI Ot-AOISALEEOLOOIUnECOKTEYOOLUtUIRLENEIOTYRSLlEGEGSSGGGC

S.am1 »«ICSrDGinCCCSSCGCSSWCYTOfr-

t.AUl KCCGSFGGGY(K»SSGGCSSW;TGGCHCGSSCCGYGCCS£GGGSSCGCr6C(.:SSGQ

T.AUf »GGGSFGGGYGGGSWCGSS-GGGMCGSSGGGYGGGSSCGGSSGGGY-

D.AMI IGGGSFGGGYGGGi SGGCi SGCGYG£UHGGS3iGGYGr>Gi SCGCi SOXk-

S.AMj ^^gS^Wjj^SS^^&GCMCOT^gpCCSSSCCCYCKgp^GW

DIAK! »CES^» SJ «¿ggjggggiffjl ^ccalsMcaYGGe

S.AMI SSSGGHISSSSGSVGESSSIGPRY K.AMI SSSGGJaSSSSGSVGESSHGriy T.AMI SSUUttKSSSSGSVGESSSKGPKY D.AMI SSSGGHJCSSSSGSVGESSSiGm

Рис.12. Сравнение различных вариантов аминокислотных последовательностей кератина Ю.

Сравнение аминокислотных последовательностей кератина 10. Перестройки в первом и седьмом экзонах, приводящие к изменению аминокислотного состава N- и С-концов. Iрис.12), вызывают изменение профилей гидрофильности в концевых областях полипептидных цепей Iрис.13). Это может отражаться на структуре промежуточных филаментов, так как неспиральные концевые участки кератинов играют важную роль в упаковке и стабилизации суперспиральных структур цитоскелета клетки.

Различные варианты кератина 10 представляют собой продукты разных аллелей этого гена. Как об1яснить, что четыре известных последовательности гена кератина 10 так

1vj"—Г" ч : ■ [

т rf и * j $ * J i ! !

vr-"1 ! ! i ; i ! 1

4 J 4 H ! ! J <i 4 ' 'v-v ' ^Длл/5 vJ

r\s" * i T i 1 I i i 1 i !

» «i i s * I • L J J J

-» I [ 4-i-i- ! i 1 м-i-=1

Т. .AMI

D.ilil

S.AMI

Е.АИ1

exon VII

Рис.13- Профили гидрофильности различных вариантов кератина 10.

существенно отличаются в двух из восьми экзонах? По крайней аере, две возможности должны быть рассмотрены. (1) Наблюдаемые различия являются результатом ошибок секвенированил и не отражает реальных структурных различии между генами. Это пргдполояепие с трудом можно принять потомучто: (а) ошбки секвенирования, как правило, нарушают рамку считывания, чего не происходит в рассматриваемом случае; (б) если различия являются результатом случайных ошибок, то почему они сосрэдоточены только в двух экзснах из восьми во всех четчрех случаях и не разбросаны по всему гену? 12) Структурные различия в первом и седьмом экзонах отражают скорее полиморфизм гена кератина 10, чем артефакты клонирования и сиквенирования, так как все кДНК и геномный клон кератина 10 были выделены в разных странах от неродственных индивидуумов. Второе предположение казалось нам наиболее вероятным. Для того, чтобы проверить его, мы выделили образцы геномной ДНК из крови десяти пациентов и испольэова-

ли ее для блот-гибридизации. ДНК подвергли расщеплению рестриктазой ВйИ и Н1ш111, так как Н1пс1111 полностью вырезает ген кератина 10, а BglI располагается в тех повторах, которые подвергаются делециям и, следовательно, рестрикция по этому сайту должна давать'полиморфную картину. Результаты этого опыта полностью соответствовали шшиму предположению. Очевидно, что для гена кератина 10 характерна высокая степень полиморфизма, а различные варианта кератина 10 представляет собой продукты разных аллелей этого гекг..

Кератин 10 и кератин 1 являются основными составными компонентами цитоскелета зрелых кератиноцотов, образующих епидермис. Принимая во внимание тот факт, что концевые участки полипептидных цэпей кератинов играют ванную роль б формировании промежуточных филаментов, можно предположить, что полиморфизм кератинов имеет самое прямое отношение к различиям в морфологии ко»м, которые наблюдаются в популяции человека. Кроме того, делеции и дупликации в кератинах могут ускорять или замедлять процесс старения кожи. Перестройки в кератине 10 могут быть результатом, по крайней мера, двух процессов: неравного кроссипговера и проскальзывания ДНК-полимеразы. Однако второй механизм может быть задействован с большей вероятностью, так как неравный кроссинговер чащз всего вовлекает длинные повторяющиеся последовательности. Полученные данные могут быть использованы в медицине и криминалистике, так как ген кератина 10 - удобный полиморфный маркер.

Сортирование 3'-конца мРНК кератина 10. кДНК кератина 10, выделенная Багтоп с соавт., занимает особое положение. На 3'-конце этой' кДНК имеется дополнительный сегмент длиной 49 п.о. Это тем более интересно, что все мРНК кератина 10 на ковце имеют одинаковый тетрануклеотид АДСи (рис.11С). В случае упомянутой выше мРНК на месте этого тетрануклеотида располагается пентануклеотид ААСйи. вставка одного нуклеоти-да превращает природный тетрануклеотид ДДСи в ААССП и сдвигает действительный сайт полиаденилирования к следующему тетрануклеотиду ААСи, расположенному на растоянии 45 п.о. от природного сайта разрезания РНК-предпкзствеиника и на

расстоянии 66 п.о. от сигнала полиаденилирования ААРААА по году транскрипции. Эти данные показывают, что тетрануклеотид ААСи играет важную роль в реакции разрезания предшественника, возможно, являясь сайтом связывания для одного из белков, формирующих полиаденилируыций комплекс. Это может быть белок С (преобладающий белок, ассоциированный с гетерогенной ядерной РНК), который пришивается ультрофиолетом к сайту полиаденилирования. Интересно, что фланкируицие последовательности не оказывают никакого влияния на функционирование тетрануклеотида ААСО з качестве сайта разрезания предшественника, так как первый и второй тетрануклеотида окружены разными последовательностями. Некоторые данные, касаыциеся роли последовательностей, расположенных ниже сигнала полиаденилирования по году транскрипции, были опубликованы, но все они очень противоречивы. Разные РНК имеют огромное разнообразив 3'-концевых последовательностей, однако, мРНК, транскрибируемые с одного и тогоже гена млеют идентичные 3*-концы. Этот факт и данные, списанные выше, показывают, что последовательности, прилегапцие к сайту полиаденилирования, играют критическую роль в формировании З'-коща. Таким образом, формирование 3'-концов ыРНК направляется, вероятно, на только сигналом полиаденилирования и последовательностями, расположенными за ним, но и короткими нуклэотидными последовательностями, прилегапцими к сайту полиаденилирования и специфичными для каждой конкретной транскрипционной системы.

выгоды

•1. Изучена экспрессия гена, родствэнного гену К51, в коже человека на разных стадиях развития.

2. Сконструирована библиотека кДНК из коязд эмбриона человека и из нее выделен клон НК51 по гибридизации с крысиной пробой К51.

3. Расшифрованная нуклеотидная последовательность клона НК51 оказалась соответствующей гену, кодирушцег!у кератш 10.

4. Сравнение вновь определенной структуры с известнытли paEse показало, что между ними ' имеются существенные различия, которые сосредоточены в первом и,особенно, седьмом зкзоЕах и являются результатом структурных перестроек.

5. Повторы, локализованные в начале первого к середине седьмого экзонов играит важную роль в чтш собктчх.

6. Перестройки в К- и С-концевых областям кэратша 10 приводят к изменению профиля гидрофильности, что может иыеть биологическую роль.

7. Формирование 3'-конца мРНК направляется нэ только сигналом полиаденилирования и последовательностями, расположенными за ним, ео, вероятно, и короткие нуклеотидннж последовательностями, прилагавшими к сайту полиадевилиро- вания и специфичны»; для каждой транскрипционной системы.

CTEICOIi P£BOT, ОПУВЛИКОЕЙННЙЕ

по ЗЕК дассЕкшщи

1. V.R/ Babaev, M.E. Belowa, A.V. Tkschenko, E.M. Tararak, I.A. Kazaritaeva, I.M. Chumako7. The expression оf skin-

• specific gens E51 in the epidermal layer of human skin and in baaal cell carcinoma cells. - Arch. Dermatol. ■ Res., 1991, v. 283, p. 113-118.

2. A.B. Ткаченко, B.JI. Бухман, В.Б. Елиоиовский, Ю.П. Швец, Л.Л. Киселев. Экзоны I и VII гена-кератина 10 человека подвергаются структурным перестройкам в области повторов. Вторая всесоюзная конференция "Геном человека - 91". Переславль-Залесский,' 1Э91. Тезисы докладов и стендовых сообщений, с. 56.

3. A.V. Tkachenko, V.Z. Buchman, V.V. Bliskovsky, Yu.P. Shveta, L.L. Kisselev. Exons I and VII of the gene (Zer10) encoding human keratin 10 undergo structural rearrangements within repeats. - Gene, 1992, v. 116, p. 245-251.

«Подписало к ОЙ&Й 19

Литературного фонд* СССР _3£?Щ тАр. ТОО