Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНОВ СЕРОБОГАТЫХ КЕРАТИНОВ ОВЦЫ И ЧЕЛОВЕКА И ИХ СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНОВ СЕРОБОГАТЫХ КЕРАТИНОВ ОВЦЫ И ЧЕЛОВЕКА И ИХ СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ"

А-ъош

МИНИСТЕРСТВО МЕДИЦИНСКОЯ И ШКРОБЯОЛОГИЧВСКЖ ПРОМШЯИОСТК СССР

ВС8СОВЗШК ШТЧНО-ШЯДОШГВЛЬСКЖ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

' кв щипах ружсоиов

XnUBâKU ВАКТЫГУЛ ДШЗГОШВШ

КЛОНИРОШЯЕ ГЕНОВ СГЧЭ60ГАТЫХ ККРАХЮОВ ОВД! К ЧЕЛОВЕК! И ИХ СРАВНИТЕЛЬНОЕ ■ЗГОь.ДЕ

03.00.23 бноФехноптая

IBfOFltIPiT

диссертации на соискание тронов степени кандидата биологических наук

КОЛЬЦОВО-1992

Работа вшодненд в Отдала иолшкудяриоа эибристене тики и клеточной дафференцировкя Института иалекуляртюЯ генетика РАН

Научный руководи те хь: - доктор биологических на ух, •

Профессор К.Г.ГДЗАЕЯН ; ■ ■

официальные оапаненты|,>- доктор Овологаческкх карг,

профессор Н.П.Мертвецов - .

- доктор биологических наук, Профессор О.Л.СЕРОВ •

Ведущая организация! - Всесоюзный научно-исследовательский

институт генетики я селекции ! прошллекных микроорганизмов Шпшеддрсиа СССР

" дро ■

Защита состоится "_" р. в * у 9 на .

заседании специализированного ученого совета К.038.08.01. при -Всесоюзном научно-исследовательском институте иолекудврноВ бпоЛогии по адресу:

633159, Новосибирская овласть,пос.Кольцово, НП0*Вектор*'.

С диссертацийО ютно оанахоиаться в библиотеке ИМИ иолекулярноД й^^догни. ;

Автореферат разослан " ; 1992 г.

Ученый секретера "" '" ' —"ша иного сова

х наук / ,11 А^Л—Ч / (Т.Н.НуОина

-г ■

:у АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМИ, Белка, из которых! состоят полос человека и тереть илекопитавщ», именуеиыо кератшаю/представляв? собой большую и весядо гетерогенную группу плохо растворимых белков. Ыы располагаем крайне скудной информацией об этих белках в код . /ющх их ге-лах* Между теи, учтивая ваюгое хозяйственное значение шерстя овцы -ценного промшлекногосырья,. выяснение природа и свойств, структур имшюкудярно-генетическнх механизмов. биосинтеза образующих их бел-ксвявдяетсяодаоа из актуальных задач наука. Шерсть селыозжнБот--'кых, ее прадьвшшшае качества обусловлены различными параметрами такими, как длина, тонина, извитость а т.д.. Все эти параметры, а свою этередЬг ОПредэляится теи, вэ хатах белков состоит волокно юероти, как ош организованы а как формируется конкретный тип волоса из этих белхдвв хода терминальной даффервлцаровки кератшюбразунцих клеток, • в настоящее время в животноводстве и промышленности известно шюкество разных по ценности. типов шерсти. Эта стройные' разнообразия качества шерсти свидетельствуют ошироких потенциях молекулнрно-гелэтичесзшх о шштсчних механизмов биосинтезаорганизации керата-эш» а морфогенеза .элеиентармах структур люрстц. ' ' - ■ ■ ■: . - . ' Задача фундаментальных я прикладных направленна совремшс: <й Си-оюш - ш толькопзучать Ежономерностп баос1»чтеза, структура, организаций балков волос я вх генетической ословя, но в выделить воз-иоян'оста утзр'авлвзшя ородессаиа; опредзляпцима становление цеюшх для промышленности качеств' шерсти свльхоэживотных.

. Биотехнология - есть современное направление биологической наука« которое используя реОдьтаты фундаментальных исследований, разрабатывает су та и методы ах практического использования. Являясь в &жо»ё фундадо}ггвльной; настоящая работа имэла своей задачей выясна-ние ыолекулярно-генвтическнх. конкретно - ген.;и я бёлковых основ, 'опредолягщах структуру волоса человека а шерсти овец и создание основы для новых подхс. ч» в биотехнологии - управлеииямехани ламп, лежащими в основа формирования свойств Персти. Однако, учитывая, что ата область наука оче>п> и ало разработана в имеются больше пробели в наших представлениях о фундаментальных сторонах генно-белкового устройства волоса, работа была посвящена, главным образом, получению новых денных о струк',,ре генов и белков одного из важнейших молекулярных компонентов волоса - серобогатых кератинов. & связи с этим, более глубокое -изучение белков этой группы и кодирующих их генов, изучение вх роли в Нормировании волоса вмеет большое значение дня современной биотехнологии, в частность, в создании путем манипуляции ; с кервтиновыми генами' пород ов^ц^р^дыы^д^ачеств зми шерсти.

нлуч ля с> ...ямотека Моек. сол аюх".з. академии

в: № ¿х.~Л(г

не.

. ЦЕЛЬ И КОПКРЕТЯШ ЗАДАЧИ ИССЛВДОВДЯИЯ. Цель» настоящей работы Сило проведение фундаментальных иоле кулярно-генетаческих исследований си степи биосинтеза белков волоса человека а иорсти сеяыозхивот-ш (овец)» конкретноклонирование в молекулярная характеристика генов серобогатых кератинов овцы и человека ддя ш последующего использования в биотехнологии - получения; трансгешшх овец' с улучшенный! параметрами шерсти. Исходя иэ' этой цели в задачу- работы входило: I. клонирование в структурное изучение генов серобогатых керати--нов овцы и " ловека[ 2. сравнительное изучение этих генов я кодируемых нш белков матрюсса шерсти овцы и человеческого волоса. ^ ^

НАУЧНАЯ НОВИЗНА'.И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Впервые Про-клоптрованы два гена серобогатых кератинов человека с оротякеннюо); фланкирут^ши областями, обозначенные как НВ2А и КВ2В.: Установлена полная первичная структура кодирующих ч ®яанкирумццх областей этих г*нов. Изучение первичной структуры генов человека позволило впервые получить 'информация о структуре кодируемых этими генами белков..;1

8 результате сравнительного изучения нуклеотидашх последовательностей хчолшровашшх генов с аналогичными генами овца выявлены константные в иэ1.<нчивые участки в кодирующих, а также в 5*-и Э*-фланкирующих областях генов,;высказаны предположения об их возможной функциональной роли в регуляции транскрипция этих генов, в формировании структуры волоса. V V■' '■ : .-'.■'■/:■ . . у •' . Анализ кодирующих областей генов серобогатых кератинов человека и овцы и их сопоставление с последовательностью аминокислот, кодеру -шх этими генаш» позволили выявить редко встречающийся случай быстрого изменения участка белка путей локального сдвига рамкд счятыва-нал в результате одаонуклеотадных вставок и делецаЛ.;

Получен набор рекомбинан.ли шюзмид, содержащих геш серобота-тих кератинов овцы казацкой тонкорунной породы» которые ' можно использовать для микроикьвкциивзаготыя получения трансгешшх живот-.них с измененными параметрами перста.

. ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано & работ. Результаты исследований докладывались на республиканской научной конференции по проблемам физико-химической биологии и биотехнологии, (Алма-Ата,19В9), X симпозиуме СССР-Италия "(аев,1990) в на втором рабочем совещании по проблеме "Регуляция экспрессии генов мле носата-ицих", (Новосибирск,* "991)-.""' ■■\,ь-: ■'.■■','■"■■■

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ, Диссертация состоят из введения« обзора литературы, экспериментальное части(Обсуждения результатов»выводов и га /ска.литературы(Вклозаоцего 108 наименований. Работа иал оленя на 100 страницах машинописного текста и содержат26 рисунков а3 табл.

... ' ' -3 ■ „ .

, { • ШТЕРИ4ЛЦ И МЕТОДЫ-:

БЦСПДЛШДДЫВ ЕГШСД1, 1ШЗШДЫ К БАКТЕРИОФАГИ. Иташы К.coll DP-50 (Ыакватас в др.,1984) в ТДР-ЭО (Patterso. et.al., 1587)были,испольэоваш в качества ЕК2 хозяина для выделения я рззмножешя рткоиЗинантов бвктеряофага X. ТС-1 (Ызкиатпс в др.» 1984) и V пдаэшдные вектора рВЗ+ ир£К (Stratagene.cniA) использовались дня р&Зот со клонированию. Бактериофаги ШЗ ир 18 я мр 19 (Yantsli-Ferron et.al., 1505) использовались*дет получения сдноцепочечжД формы ДЙК для секвенвров&ная. Бактериофаг-^ ЫЮЬ-З (Friecbaui et al., 1903) Сад использован ддя кокструиро-ваная гекоиноа библиотека. • V':j

Бояьшкство рестршащошшх вадшужлеаэ в других ферментов получены из ШИШ (г.Вохыв»)« в также от форм Вов1ш1п^г1!агюЬвШ,1л»Г8Ьам, В1о1аЬв, РЬахтс1а-1ДВ.

• ДЩС ta Бгшд ЭЛЕМЕНТОВ КРОВИ вкделяд do стандартной - , методике ( Ыашатис я др.,1Э84) сиекоторищ иодифякацшша.

- .-' шизыиднго ДНК вадедяда щелочюп! методом.( Blrti' otra,

. EUgbwdi^it САГОВОЙ ДШГ остцествхнш в соответствии с описан-воЗ иатодвкоа (P&ttereoa et а1.,133Г). -*

" ТРШЭВСИВДЯП кдаток S.coll проводила oo методу Хвннахака, оаасыпюыу в ртководстве ("(Ьдопроваше ДВД. Кетою",1938); .

. ЭЛЛИРСЗЙПЗЯ ДВС вз гею после препаративного электрофореза оскретвхяла ори пшаф i жоОвшй бушто (Hi-45) (Sclilelher .and Scbull, Западная Гвр*авня)по протоколу, предлагаемому . фпрмо®.

. ПЕРЕПОС ЛЩ та нсадоаовыо Сшьтри ttybonc - H (¿rershnm, Англия) в кейлоновывнадаЗраян Оегш Screen Fluo (КШ.СЗА) срооодхш по протокола»/ предлагаема* фиритй-язготовите^и.

КШСТРУИРОВДЯПВ геиюшгой библиотека овцы на основе фагово-, то вектора HÎBL-Э, а также поиск рекоиОипантмл фагов с гезншд сероОогатш кератинов проводил до отаццаргаш методикам (Цанн-. атис и др.,1Э84). Упаковочные экстракты били долучены в ШЛО ■"Диагкостскгм". • * ... * .

была любезно: предоставлена Г,М.Да«гаж>вым {ИЕХ Ш ССО1). . - ( .

У . ПРЕДГШТОШШП И ГИ5РЯДЕСШШ проводили при 65°С по стандартов катодпеэ (Макпатис и Для скрининга ге-

ноиков библиотеки овин ■ всоажьзсваяа одпгсктклеотиддае -к» -ы.

.- ._< ., 4 - '■;..■-.; ....., ... синтезированные всходя из . сертягеноО. структуры гена В2А. Зонд летали достройкой в присутствии <*-32Р-трифосфатов (Талхент) opa * почат фрагмента Кленом, Для скрининга геномной Спблиотекя человека использовали, в качестве оонда, кодируйте часть гена BU. овцы и метили ори nouoógiрассеянной затравка с использованием набора для меченая líultiprlne ША labeling Syst en ("АюегвЬав"). ;

ШШЕНИРОВШИЕ ироводала по методу Сэнгера (Sanger et al., 1977) по протокол?! предясоюнкоцу.в руководств Сорим АявгвЬам ("М13 cloning and sequencing handbook"). :v"; ■ ; V '

КОШЬДТЕРНЦЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Сравнвтвдьнаа анлляэ ; нухлеотидннх а аминокислотных последовательностей проводила о использованием пакета програш КУСео» (Inteiligen»tica, QU. ). Информация о куххеогадных ооояедаватеяыюстях генов идакопнта-щих в приматов подучена из вазы данных Иифориацяоннсго центра ШГ Aß СССР, сформированной на ос эве БД ИШЬ (ТеАдальберт).

РЕЗУЛЬТАТЫ И in ОВОТДЕНИЕ-' . :

I. КЛОНИРОВАНИЯ ГЕНОВ СЕРОБОГАТШС КЕРАТИНОВ ОВЦЫ КАЗА2СК0Я ТОНКОРУННОЙ ПОРОДИ у

Дня выделения и клонирования генов серобогатых кератинов. семейства В2 проведен скрининг геномной библиотеки овцы казахской тонкорунной породы. Попек генов проводился при помощи охи-гонуклеотидных зондов« синтезировании! исходя из нуклеотиднов последовательности . гена серобогатото кератина ОДА (Powell et al,,1983). В результате скрининга 1,5 х 10® реком&шантных фагов был найден один фаге Л клон с позитивным сигналом. Размер клонированного фрагмента ДНИ овцы составлял 16,6 т.d.h., Рес-трдастная карта прок„одаровйккого наш Sali- фрагмента, - построенная с использованием -метода одиночных в двойных "переваров" рестриктазама, показана на рис.1.. По данкыы Олот-енаяаза фаговой ЯНК на рестриктной карте били локализованы два участка, . гибриднэувщихся о зондом. Сравнение рестриктних карт втах фрагментов о опубликованной в литература австралийским! , учеными (Powell ©t al., 1983) рестрихтной хартой,показало, что ваш выделен из реноме"овцц фрагмент ДНИ, содержащий гены серобогатых кератинов - В2А - и В2Д (роо.1.).?Как водно из этого рисунка, рестриктная карта клонированного наш Гб.бт.П.н.фрапгентаДНК : овцы казахской тонкорунной порош шюет Солыме сходство сана-

, $ smmt

ШШ

"ТШП™

а;

I VjSSiln : ; J ,,

.Ц

R

' ' ' ' ' ' tit I I I I ТУ . 1 «• .

■.С ■"".■■■; Рис Л. Сравнение рестршсгной карты клонированного папа фрагмента ДЩС\ овци, содержащего геш В2А и В2Д (В.), с осубля-кованной в литературе аналогичной картой (A.) (Ро*e'\ et al., 1983). Заштрихованные участки - кератимовые' гены, волнист, i лшшв - локализация повторор.

логичной картой фрагмента ¿ЩК» содержащего гены сероОогатых кератинов овци порода Австралийский меринос. Теи то иенае, ара внимательном изучения юс рестрикгных карт удается обнаружить различия между кипа. Так, были' найдены Xbal-caftr в б'-фдаюшругщей области гена В2А иЕсоН1-сайт, расположенный на 5,6 т.п.н. ниже от терминирупцего ходона гена В2Довиы казахской тонкорунной породы, которые отсутствуют I СООТВеТСТВУТДИ! положениях фрагмента ДНК, клонированного австралийскими ученики. Кроме . того, отсутствует Stul-сайт, локализованный l З'-нодарущей часта гена В2Д австралийской порода, в аналогичной области клонированного наш гена В2Д. Эти различия позволяют сделать заклвчение» что несмотря на большое сходство рес-триктных карт фрагментов ДНК, содержащих rem серобогатых кера-' тинов - В2А и В2Д - с гц пород казахская тонкорунная и австралийский меринос, варьирует длина некоторых рестрикпшх фрагыек-тов, что позволяет в дальнейшем изучить межпородный полиморфизм овец с различным типоч шерсти. \ '. '

В 'литературе ( Powell et Rogers, 1904) имеются

данные о наличии четырех типов повторов во фланкирующих ' бл"с-

тях генов серобогатых кёратвно® овил* природа которых оставалась невыясненной. Яви удалось ■ при помощи бдот-гпбрадиааира клонированной нацаДГОС овци с Фрагментом ЙК, . содергад^ш Pet 1-повтор, показать' присутствие этих повторов во фяаююрувщх областях генов серобогатых кератинов celji. petl-ооатори били описаны ранее для геноиа быка а иэучени Акошшои K.I. о его соавторами (Ахопян а др.,1Э90>. ПР° атои'виа Сило обнаружено, что они характерны только для подотряда Itunlnaittla я показана кх локализация вокруг гена горионэ роста быка. II» рестриктноО карте 16 т.о.н.;Еа!Г фрагмента ДПК овци показано, что область, гомологичная зонду . локализована в двух участках - Xb&1/PetV; (величиной 1,15 т.о.н.) a Petl/EcoRI (ООО и.о.). ' '

Petl-оовторы билв обнаружены вблизи случайно выбранных-структурных генов - гена гормона поста Оыка н кератиновах генов овци. Это свидетельствует об определенной ■ сцешшнности этих повторов со структурными генами,iОдаако, функция этих повторов неизвестна. Возможно, они участвует в регуляции активности этих генов, ■ ■ ■■"'■.■'." ' '■'' ■' '. .- ...'"■.■'.■'"■■ .'"'...■■

2. КЛОНИРОВАНИИ ФРАГМЕНТОВ ДНК ЧЕЛОВЕКА, ГОШКИ ОБЛАСТИ ■ ГОМОЛОГИИ С ГОШ СЕРОБОГАТОГО КЕРАТИНА ОБЩ В2А

Для клонирования генов серобогагах кератинов человека .нами были использованы четыре геномные;библиотеки человека, В качество 'зонда бил использован один из фрагментов ДНК, выщепляемых рестриктазой Нсо1 (рис.1.), содержащий тек кератина овци В2А. Успешный оказался скрининг только одной вэ четырех использованных библиотек ( предоста^ена Г.М.Долгановым}, Ш не-можеи пока объяснить, аочек скрининг трех остальных библиотек, две из которых сконструированы; на основе фагового вектора EUHL-Э, а . одна ка основе космиды, бил неудачный, несмотря на тот факт, что ранее из этих библиотек было внделено иного других генов, в той числе уникальных.;" Очевидно, мы столкнулись о трудностями клонирования некоторых нератиновых генов. которые уже отыеча-лясь другими авторами,; В результатескрининга был выделен единственный фаговый клон, содержащий фрагмент ДОК человека размером 15 т.п. .. -' V* ' .■ ■■■

; ■ Анализ ДНК этого фагового клана методой Слот-гяСрадиэации ' показал наличие двух областей, гибридаэувдцхся о зондом.' В качестве ■ зондов, в данном случае, использовался либо меченный

фрагмент 0ЯС о геном В2А, либо меченная пара олигонуклеотидгв, использованная для скрининга библиотека овцы. Рестриктная карте . 15 т.п.н. Срагмента ЩК человека, содержащего два участка гомологии с генами кератинов овод, представлена на рис.л.. Как видна пз этой карты* расстояние между генами равно приблизительно 6 т.п.н., что на З,7 т.п.н. болыхэ чем расстояние между геиакаВгд в ВЗД овщ1. На то дом блот-габрадизаши в выделенном жлонв вмяв также обнаружена участка, гибрадвзующиеся с меченной тотедыюа ДНК человека» что свидетельствовало о наличии каких-то часто повторяясрхся последовательностей.

П 1' I { , |1Тр*> У| 1 |М| |

им.

№26

Рис.2. Рестрактнаяхарта 15 т.п.н. Фрагмента ДНК челоь^ка, содержащего гены серобогатых кератинов. Закрашенные участки -локализация генов. эаатрихованные— участи, гибридазуищае с меченной тотальной ДШС человека; Стрелками указаны направление В протяженность сехвенира^анных фрагментов ДНК.

Блот-гибрадизация клонированного нами фрагмента ДНК человека с ранге клонированным 16,6т.ц,н. фрагметс« ДНК, содержащим два гена серобогатых кератинов овцы показала, что гомология между ними распространяйся, главным обраэш, на области,'соответствую^» генам В2А аВ2Д, в также на близлежащие фланкирующие области генов, тогда как межгенная область и последовательности , Не имеще' отношения к" регуляции активности этих генов не имеют ала имеют мало гомологии с выделенным фрагментом ДНК человека. Эти реь^льтаты позволила сделать заключение« что клонированные нами участки, гомологичные генам серобогатых ' кератинов в составе 15 т.о.н. фрагмента ДНК,иэ.генома человека сохранила значатель'тю гомологии в годе эволицт и соответствуют аналогичным генам генома овцы. '

- с - ...

3. АНАЛИЗ НТКЛЕОТКДШХ ПООШДОВАТЕШЮСТЕЯ ФРШДШТОВ ДНК ЧЕЛОВЕКА. ГОМОЛОГИЧНЫХ ГЕКУ Б2А ОВЦЦ - ....

Кукдеотпдную последовательность фрагментов ДНК. гомологичных гену BZÂ определяла по схеые, указанной lia pao.2,. В результате установлена первичная структура двух областей, гомоло-^ гнчных зонду в включающих кодьрупцве a флашшрутщэе области генов (рис.Э. и 4.). В первой случае удалось опредодяггь нухлео-тидную последовательность 353 нухлеотвдов ' до : ÜTG-кодона. в 345 нухлеотидов - после терминирущего кодока, Во второй случае, из-за отсутствия удобных сайтов рестрикции для суСклонаро-вания, определила только куклеотидкуп последовательность 141 нуклеотида до " точки инициации а 65 нухлеотадов после croa- : кодона. Анализ их нуклеотидных п осле дов а те льносте й показал наличие, в каждой из двух изученных областей, открытой рамка счи-- TusatatH! в первой случае* длиной в 177 аминокислотных остатков, во втором 175. Процентное содержание остатков цистеана равно, соответственно, 25 а 26 процентам. Таким образом, очевидно, что фрагмент ДНК, размером IS т.п.н., содержит гены, кодирупцае се-робогатме кератины человека. Анализ нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов ДНК, позволяет также сделать заключение, что подобно генам серобогатых кератинов овцы, ена-•логичные гены человека не содержат из (тронов, что харахтеркодля всех изученных ! генов белхов катрикса шерсти овцы (Prenkel et &1.*,198б, Ruczek et al.,1907, Po*el et fid.,1983) Размеры белков, кодируемых генами овцы и человека также очень близкиV(для сравнения кератины овод содержат! В2А - 171 а.к., В2Д - 181 «.К.» В2С -151' а.к. и L-B - 156 а.к.). ' : i-

. Одним из перрчх этапов анализа данных, полученных методами секвестрования нуклеотидных последовательностей является поиск гомологичных последовательностей и определение степени гомологии при помсики компьютерного анализа. Результаты сравнения фланкирующих и кодирующих областей генов серобогатых кератинов человека о аналогичными генами овцы высокую степень Гомологии как в белок кодирующих, так а. во Флаж чрущих областях генов. Учитывая вышеперечисленные характеристики,: также исходя из того, что ^ены, к )нироваюше нами, i имеют высокую гомологи» с генами серобогатых кератинов овцы семейства В2, мм были даны .. названия КВ2Д. а КВ2В С Киюагш В2А a Humana В28 >. -

AGAICACTTQ TCGATGTATA ACCACATGGC AAAOCTGAAS CTGAAGGCTC ААйГОЗАААТ ' . TATACCATTQ TTTGTAAACA AAATG[TAAC АТТГТТАССА AGGACAAACA CATTTQTGA 4' ■ ■'' ^ GTATTAGCTG AGGCAATAAG GAAAAATGAATTTTGAGAfA TATTTAAAAC AftTTCAGCAT TTGAAOTATC. AGAGGGCCCT AGAAA^QCTG^fTTAAAGAS TAACAAGA.a AAAATGITOC ; TCOCCACAAA TAGAGGAATT GGCCCAGACT TATAAAAAGC CGGCAfJTGGA ATAGGCAGCC ATAATTCAGA AACTCCTCCA AGCAAOCAAC CTTCAGATTC AACTCCTGAC ACCATGGOCT ' GCTGTCAGAC CAGCTTCTGT GGATTTCCCA GCTGCTCCAC CAGTGGGACC TGCQGCTCCA -. GCTGCTGCCA GCCAAOCTGC TGTGAGACCA GCTCCTGCCA GCCACGCTQC TGTGAGACCA : - . GCTGCTGCCA GCCAAOCTGC TGCCAGACCA GCTTCTGTGG 'ATTTCCTAGC TTCTCAACCG . GTQGGACTtG TGACTCTAGC TGCTGOCAQC CAAGCTGCTG TGAAACTAGC TGCTGCCAGC CAAGCTGCTA CCAGACCAGC TCCTGCGGAA CTQGCTGTGG CATTGGTGGT GGCATTGGCT ; .' ..- : ; . ATGGCCAGGA GGQCAGCAGT GGAGCKJTGA QCACCCGTAT CAGGTGGTGC C0CCCA6ACT '

GCCGIGTGGA GGGETACCTGC CTGCCCCCCT GCTGOGTGCT GAGCTGCACA CCCCCATCCI ■ : GCTGCCAGCT QCACCACGCC GAGQCCTCCT GCTGCCGCCC ATCCTACTGT GGACAGTCCT GTTGCCGCCC AGTSTQCTGC TGCTACTOCT CTGABOCCAC TTCTTGAAAA CCTOCTTCTG j CTGQBGATCC TGATAAGATG GCACCTTAAA ACTIAGCCAM TTAGAATCCT AACAATCITC , TGAACICCAG TACCTATAAC TGGGCTTGCA ACCTCTCATC ACACAGCCAC ATAAATTCCT J ' -' ■ 1 AGGAAGTAAA TTCATTTACA ATGGAAGAOC AAAAATTITT •CCTAGA '"ЛО GTTGTCAGCC ' : AAAGICCTAC AATGTGAAAA GAGTTAGATA СТАТШACT ATAAATATCA CCTTG^ATAT TTCAACAGTT ATTGGGACIT АААПТААТА AAAGTTTTCA ""TCTCAATQ ATGAATTCTT ' OTITTGAACTT TCTTTGTCTT GGAACCCACC AA

Рис.Э. Нужяеотвдная последователыюсть фрагмента ДКК чело- { ' века, содержащего ген /КВ2Д. Подчеркнуты последовательности, [ . нмеидае отношение х инициации а тершнацви транскрипция, стар- - | тов^-истоткодога1тралюляцтаиш1вер в

5*-и Э'-флангартхвцх обдаете гена..

3.1. Сравнении структуры генов КВЗА в НВ2Е ■ . ; \'

' со структурой акалагичнш генов овщи ; • : •

При сравнительной изучении кодаруииид облаете а генов ПВ2Д \ в RB2B челоьека с аналогичны« генами овцы было показано, что < -кодирупцая область гена RB2A имеетгомологию с геном В2С на* . ! 73Х, а с геном В2А - >«ч 75,2Х. Ген НВ2В твкхе выеокогомологичеи генам В2С (73,ЭХ) в В^А (73,5Х). При этом следует отметить, что для обоих генов консерватизм характерен, в основном, для второе :■■.■ половины генов. В этих областях генов различМр между ними определяется лит, нукяео<*ядньши заменам*, "течем эанеь встречаются

aattatccaa cacaataagg cagagcttct gaattatota aacagtagct g3ccaggcti aîaaaagocc aatct6qcab ccatcaccaa aactcagaaa ctcctccaag caacccagac ttcataccaq ctcccaacac catgaccîgc tgccagacca gcîtctgtgg atatcccagc tgctccacca gtgggacatg cgqctccaqc tgcîoccagc сааолоста t6agaccacc tgctgccagc caagctgctg tgagaccagc tgctgccagc! caagctgctg çcagaccàgc ttctgcsatt tcctagcttc tcaactagtg gacctqcaqc tcagttgctg ccagccaaqc toctgîgaga CCÀGCîCCTB ccagccaaqc tgctgccaga ccagctcctg cgsaactggc tgtggcattg gtggîggcat tggctatqgc caggagggca gcagtggagc tgtgagcacc cgtatcaujt ggtgccgccc agactgccct ctggagggta cctgccttgcc cccctgctgt gtggtgagct gccacacccc aacctgctgc cagctgcacc acgccgaggc ctcctgctgc cqcccatcct actgtggaca otcctgctgc cgcccagtct gctgctgcta ctcctgtagc саст6стдаа gcagtttgct catttaacts aaattccatt tcagttccat tcagttaagc

• aataattcta agaa '■'•' '■.'.

* ■ . '

Pue,4. Нуклеотидадя последовательность фрагмента ДЕК человёка, содержа дето ген НВ2В. Подчеркнуты последовательности, имеицне отношение к инициации и теришицоа транскрипции, стартовый- и стоп-кодоиы.

как в третьей положении» так и в первой п второй положениях кодека. Однако, все-таки, во всех четырех случаях преобладают запень! нуклеотидов в третьем положении кодона, что, ввиду вирах- ! денности кода, в большинстве случаев не приводят к видаю кислотны« заменяй в белке. Первая половина в 3*-концевые области генов подвержены как нуклеотидюш заменам,' так а пнеервдяц/деде- -цияы единичных нуклеотидов, Так, в гене ПВ2А, при сравнении его с генаии В2А и В2С овцы обнаружено, соответственно, 24 в 17 деле ций в наоборот, гены и В2С овцы по отношению к те ну 1Ш2А имеют IB и II делет"*ювашшх нуклеотидов. В аналогичных областях .гена НВ2В также имеет место делеция 19 и 13 нуклеотидов, ' обнаруженных при сравнении ох с генома В2А и В2С, соответственно. А в генах В2Д и В2С, относительно гена НВ2В, обнаружено 8 а 25 случаев делецва, соответственно.

Однако, следует отиетить, что случаи нуклеотцдных делений ' в генах КВ2А в НВ2В, произедодших в ход*, аволщия, не приводят К . сдвигу всей рамки считывания, а обусловливает изменчивость , лишь определении". участков гена. В данном случае мутация затрагивает первую половину кодирующей области в небольшой участок, прилежащий к 3'-концу гена, являвдиеся ышаеньв для инсерций/де-

и _ г; -/;';'. '.'"■■.

- «mía. Эта дошке, получешиа при ср£В5:елнп кодирующих областей генов ИП2А a человвкл о акалогишшш сйластяш генов В2А а •' V2C одцн, данокотрир7х1т, что в хода эвсшщип г«ш серобогатых . ' керапюоз сеци в челооеха претерпевала ажзквтя, сохраняя про . втоц 1 консервативные оСяэств, • ■г/'- Что касается З'-флашшруищх областей генов НВ2А и КВ28, то сравнение вх оаналопгташшсймстяшгеноввгд в ВЗС овод . тепе показало достаточно виссхцз гоиолспт. Здесь, тоже можно

■ выделять участка с высокое в.сдабов гошлотаеЗ, Однако, не об-паругепо какой-либо протащенной" области о ярко выраженной гоио-

> ■ лотвеа; Нлзбояее гомологична В'-флтвшрущоа области reita НВ2Д соотиэтствугсая область ггна ЕЗС (73, ЗХ), тогда как иеадг гена-юВЕЕДв ША гсиологвя Б7.3Х. 'Здзсь шжно отметить несколько коясорватшяпа участков: последовательность, аршшхащм и точ-

- «в шсщзацап, врсгисггср1ые , участка, содэрхгеаэ ТДТД-Соксы г АТ- ; боптше. Области. '" ■ ■ .'.*■'

Б'-Слзшшрупвзя обшсть'гена П32В еизет относительно ода-

■ ; мякобцд уровень'гомология с акалопгсшш областями с'оях генов

(65,12 n C6,9S). Тут, за исключением ТАГА-Последовятельиостад U

- псстедоватолыюстев, распоясавших в раЗгха -А9 - -35, в ехгчае тепа Е2Д, в /-62'- -23, в случае генаВЗС, не имеется никакой

. *■; геаюлогви. -у': v ' ■..'■■* *■■.. г; ■ "'■'■'; Сушируя данниэ срввязтельцого якалзэа В'-флонкирукщх об- _; . , ластеа геж® серо<ктатих кератшюо чэловежа - Ш]гА и Нвгв - и . 0га31 - ESA в Б2С,1аисЮ ; лазать, что для них наряду с вараа-белы зла учлетхаю характерны также неоротяжеюш о консерватив-

Представляло также интерес сравнение Б'-неjwдиругсях областей, кгпосредстоэшю пряшкяссих к тшзпгрухщему яодону генов BS2A о НВЯ5 с ишюлгчм i областями геноэ Се л сов метрике- перста. Ранее« при иэучегсгагеноэ,некоторых бзлиов ютргосса шерсти ' oeict (Fct?»H et al.,1C33, KuczeS et al,15GT,rrettfeel et al-,

1S39), была обнаружена шссюококеерзативаая Хв-куклеотвдшя по-' - сдедовлтглыюсть, прядегажедя к UC-кодону и названная ; . "матрояо-аищ^пчяов ..^слэдозательяоетьd". Оказалось, что эта оосидогательшсть присутствует я у гездасеробогатих хератшюэ человека - НЕ2А . и ПС2В. Прочей ртепекь гомологии "мзтргасс-спеця'вчких послддозстэлы'хстр'» каратамов^т генол П2Д - овца и ГСВ2А и ПВ2В челоевхв дахе вкьо, чаи иедд/ сеиеЯствяип ; , гвков других язвестних бел^адэ мтршсса шерсти овин Грис.Е

д..

СССТССГГСТ сйасссааст CCTGACACdATG

1 1111

I 11Ш1ШШШ1

TACДАТТСТСДОСССААСТССТОАСАСС

111 Ш11

I II Ш IIIIиш

CCCAQCTCTC ЧЗССТ AACCCCTGАСАСС

III

II

I III 1111 шп

CCCAGACITC ATACCAGCTCCCAACACC

И III

II

I

I I

1 . 11

I пшшшш

ССААССТТСА jATTCAACTCCTGACACCt

1 1

III 1

II

GCCAAAAGAA ftCCMGCTTCCCGGTGCC

I 1 .111 • III

ТСААТАААААACACAGCTTCCCAACACC

III II 11Ш1

GCTCTCCAAC XGCCCAACCCA6ACACC

11 Ш11П Ш

1АТ ОС АААТфТТ CCCACTCCTGCCACА

о. В2А O.B2D О.Е2С

:.'/■ нв2А Г;.' ивгв о. В in ВЗА? о. Б III В4 O.GTK-F о. GTK-C2 .

941 ; 83Х 72Z " 83Х 441 Л 44Х

- ■" 61 х; • 61*

Рис.5. Сравнение гомологии "матрихс-специСических" последовательностей генов белков иатртсса шерсти овцы в серобогатых кератинов человеческого волоса ( В X )♦ >

3.2. Сравнение структура генов серобогатых кератинов человека НВ2А a ИВ2В ■' • Гены НВ2А и НВ2В человека высоко гомологичны между собой (95S) (рис.6.). При сравнительном изучении нуклэотидных последовательностей кодирующих областей этих генов била обнаружена 21 кукяеоткднвя замена чак в З-лоложекии ходона, так при I- и 2-положениях. Кроме' того» выявлено б случаев инсерций/делеций единичных нуклеоти^в в разных код она i, три пэ которых в центральной районе« три - в 3*-концевой области гена. Инсерция/ делеция в центральна области привела сначала к сдвигу, а потом к восстановлению рамка считывания Зб-нуклеотидаого Фрагмента гена, в результате чего Сил потерян один кодш. Таким образом ген 1Ш2В, в котором, по сравнении с геном НВ2А на б куклеотидов меньше, кодирует бе. к, укороченный на два , аминокислотных.остатка.

Ген' НВ2В отличается также, наличием в нем Pat1 -сайта.

Рве.6. Сравнение нуклеотидгшх, последовательностей ; .'кодирутаЕКХ Областей.генов - НВ2А и НВ2В человека.

гттссг даггтсгсдАссш'е ш сттстоа тсстлоттстсмстлете з-а ьстосаи

нв2а ат13асстастетсдоассаоттст6то13аптсхкасст0стсса(хав

нвгв - АтЬдотосгах^

нвгд таоа^аазостссАОСТота^^

нвгв - теоаАСАТосоостГОАОСТост^

..■-..'^сстахАогодрал^слщ^жхжэстасхе^ нвгв - естЬссАОссААэст^ нвгд - саеаосаосттст нвгв". - :саоассаосттст1

нв2а т

нвгв - стр- фгтЬстасЬ'дассц^^

НВ2А - ОСТОСТАОСАОАССАвСТСС . ЗОЭОААСГГЫХГГШ'ОЗС/ "ТОЗТОЗТОЗС

нвгв -ЬстостоссАате^

нв2а . аттсастатооскао^оожабсаот^остстбаосасссотатсао

нвгв - аттоЬстатэзсса^ нвгд

нвгв - ЕГеотоссосссАоетох

НВЗА - ОСОТ ЭОТОАбСГГСС- ^ АСССССАТССТОСТСГОАВСТОСАССАСОССт

* ■ л ' Ь * + % • щ , * Ь * % Ь + * * ш Ь *++* + + ш ****** +

нвгв - ототьотьаьстоссасрьссс- аасстостоссаьстьсассас^

НВ2А -СЮССТОТСЮГГОХвСХтССТАСТет

нвгв - ЬЬсстсстастахтс^^

-531

-50 -50 -100 -100 -150 -1Б0 -200 -193 -250 -247 -300 -297 -350 -347 -400 -397.. -44С -446 -499., -496

тстостостсстастбстст закхх!асттет

тс1сзсггсзстост астсстст -шзс-аст-ос

Степень .гомологии - 95.41

возившего в рээудьтате замен 4-х нуклаотидов иахду второй- о третьеЯ далацяяш в центральной. сбластз. Кодорущие' областэ генов оодержат также протяженны* прштповтори, сосредоточенные, в основной, в парвоа половянэ кодярутеоЗ обязстя генов* Пра помощи компьютерного анализ* било обнаружено три бяиэкцхпо составу повтора яэ 16 Л.П.. Один из ш. - TCO TCO СЮ ¿СО ACO (I.) - встречается по два раза в обсзх генах, тогда как второй повтор (II.>■ отлачапциПся от первого только одной заманоЙ 7-го нуклес 1да ( с на С), обнаруживается вгоне ÍÍE2A двараза,а в гене КВ2В - чешре раза. Трети! повтор - ТСС ТСС С 1С • CCA AW (III.), также имеющий большое сходство о повторами 1 /и II, идентифицирован в четырех мостах гена НЕ2А и в пяти - в HBZS,

Эти повтори'лоналиэовпш друг за другой соблюдая определенный порядок чередовании. Tax в обоих генах соблюдается сле-дувдий порядок расположения.повтыров»^ I—™11-111-П-111гИ-I—-'—II-III-11-Ш. ' Однако, следует отметить,- что' повтор« в гене НЕЗА менее консервативны, чем в гене ИВ2В, Здесь обнаруживаются нуклеотндные замены во всех трах типах повторов, в двух из HOTopí'i в результате замен нуклеотадов в первом и втором положениях происходит заменааминокислот (Суя на Ser,1 Ser на Arg и Суа на Туг J в белке.

В 3*-области гена также обнаружен повтор - ТСС ТСС CGC CCA,' встречающийся по два раза в обоих генах. Таким образок, сравнительное изучение кодирующие областей генов НВ2А в КВ2В при помощи программы KlLICîi пакета РССШЕ позволило обнаружить в них присутствие прямых протяжакных повторов, рвсполож0шшх тандемно о характерным для них чередованием.

Сравнение 8'-фяа»».руксщ . областей генов НВ2А и 1Ш2В □оказало, что гомология имеется только в близлежащей некодирую-щай области (рисЛ.). В этой области кроме "иатрико-спецафи-чаоких" последовательностей, характерных для генов белков матрухса овцы, выявлена еще одна область полной'гомологии в положении между -27 и -49 нуклеотидамя от инициирующего кодона.

Аналогичная область о высокое roucmcratfl обнаружена в у генов ■ серобогатах -кератинов овцы В2* и В2С, клонированных Powell B.C. и его соавторами {1983)," Однако, .обнаруженная каш область полной г чологии 8 районе -37 в -49 к.п, имеет высокую гомологию лишь с соответствующей областью'гена В2С ( по отнояе-нию к НВЗА - В6*, а к ККВ - 9М ), Ро*еЛ1 B.C. с соавторами

НВ2А . ■ AGATCACTTGTCWTGTATMQ3ACATGGCAAACCTGAAGCTGAAGGCTC ЬО .

КБ2В - A———................................. 1

HB2A : AAGTGGAAATTATACCATTGTTTGTAAACAAAATGTTAACATTTTTACCA -100

HE2B - ATT AT - CCA- - - ;— АСА-.- ------- -12 :

HB2A - AGGLftCAAACACATTTGGTGAGTATTAGCTGAGGCAATAAGGAAAAATGAA 150

KE2B .; r - --CMT AÄGGCAGÄ- - GC- ■ 2& -

HS2A - TTTTGAGATATATTTAAAACAATTCAGCATTTGAACCATCAGAGGGCCCT -200

.'HB2B / _TTCTM-AT-TAOT^-r™-C^ißCTß-T----------GCC--. 34- .

.' HB2A ' AQAAAGGCTGGTTTAAAGAGTAACAAGATAAAAATGrTGCTCGCCACAAA ' 250 .

ивгв ■ - "--AGGCT--hTÄAA-ÄG----------------------C5CCA—A 72

HB2A :т TAGAdSAATTGGIXCAGACTTATAAMAGCCGGCAGTGGAATAGGCAGCC -SCO

HB2B - TG-------TG3C--------------AGCCATCA-----—--—CC ;ßS ■

-49 -Z7 ■ . ■

HB2A ATAATTCAGAAACICCTCCAAGCAACCAAC-CTTCAGATTCAACTCCTGA 349 ,

HB2B - АААкяС&Ш&^ОТ 137

-i. Г" '

■ HBÜA CACC ■ 353 ' ' HB23 - елее 141

Степень гомологии ( 84. ;

Рис.7. Сравнение 5'-фланкирующие областей генов '

ЯЭгл а КВ2В человека. _ ^

' подчаргашая роль только "матрикс-епецифическкх" последователь' ноетей, не*придаот значение этой области. На нам взгляд, эта о&гасть также представляет интерес, если не у всех генов серо-богатых херапгнов овцы, то у некоторых, например, для гена Б2С свци а генов НВ2А я HB2S человека. Поэтому эти последовательности, такхе заслуживают внимания как, вероятно, имеющие отноше ние х регуляции активности клонированных каш кератяновах генов человека, а также некоторых генов овцы. •

В 5'-фланкирующие областях генов НВ2А и НВЗВ также показано наличие характерных для всех генов эухариот ■ ТА1Д- и СААТ-последозателъносте Я .В частности, 5'-фланкирующая область гена ÎIE2A. содержит четыре' ТАТА-последовательноств. Однако, при сравнении их „ с ; аналогичными областями генов ' В2Д и Б2С овцы обнаружено, что только два из них, расположенные в -СЭ п -195 положениях, могут претевдовать на роль ТАТА-боксов. Однако, функционально активным является только первийТАТА-бонс в -83 положении, поскольку между оершм а вторым ТАТА-боксвма встречается АТС-последовательность, ■ не имеющая : откоаекия к инициации транскрипции. На Î3.нуклеотидов вмае ТАТД-бокса pac-пол ояе на АТТС-последовательность, т.е. СААТ-на противоположной цепи JÇK. Обнаружена еща одна СААТ-посдедовательность, ; локализованная в -I&4 положении. В 5*-фланка руицей области гена НВ2В также найдены TATA- и СААТ-последовательностя, расположенные, соо-гветствекно, в -С2 я -129 положениях от АТС-кодом «

ТАТА-боксы обоих генов расположены прицерно^иа. одинаковом расстоянии от АТС-кодона и " " тлеют одинаковые ' консенсуо-п оследов а тельности - 5*-ТАТАААА-3*, тогда клк СААТ-боксы сильно отличаются как по своей локализации; так в. свояю ' консенсус-после дова тельностями. Следует отметить* что ТАТА-боксы генов' В2А, В2С и , Б2Д овцы, клонированных группой австралийских, ученых, расположены" на расстоянии 70 кукле отидовнижа СААХ-боксов, тогда как в случае генов КВ2А и НБ2В, это расстояние равно 101 и 47 нуклеотидам, соответственно. . ■-■■-.■.■."--Ч

3*- фланкир-ющая область, гена НВ2А содержит сигнал волв-адешлирования, / расположенный на 279 н.п. ниже терминирующего кодоиэ. Изучение фланкярукадях областей этого гена, для которого удалось определить нуклеотидную последовательность 353 и.п. в 5*- и 345 н.п. в 3*-фланкируыцих областях, Тюэволило оОнаррвт в них инвертированные последовательности. Так, в 5*-области гена показано наличие одного палиндрома из 16-ти нуклеотидов и спилькя из 10 нуклеотидов с 3-х нуклеотадным основанием. В 3'-||лянк.;'|ую(цей области идентифицировано 4 равных палиндронных последовательности Из 10 и 12 нуклеотидов, одна из которых расположена непосредственно перед сигналом (юли(А). .

■ 17 - .;■: - . ■

-',' :-" 4. анализ аминокислотных псоедобдтеленостел ■ -лу у''етов^швщ1стд-иэ.перигаои структуры генов нв2а И кв2в ч2л0вша.

: \ Сравнительное изучение аминокислотных ■ последовательностей белков* кодируемых генами НБ2А и НВ2В человека показало довольно ; высокую гомологи» между тши (&4,БХ) (рис.8.Исключение составляют два участка, не имеющие гомологии. Первый участок, вхлючаадий -18 'аминокислотных' остатков, . возникает ^следствии сдвига'и восстановления райки считывания, о которой было сказано в предыдущей главе. Второй участок соответствует 3'-концу гена, где произошла деления трех нуклеотидов в, гене НВ2Б.

НВ2В -, ШсЬЬт^сЬуРЗ^ -50 '

НВ2А - дТЗГССРРЗРЗТО(ГСПЗ-"----5таРБССП5СС0Р2СУдТ55СВТ -93 -НВ2В - -92 .

НВ2А - Ш31саЗШУаоЕС350АУ5ТК1КУС^[ХЖЕШаРРССТЧЗСТРР2С -143 ;

нв28 - Ьсш азЬIетЬдЁжйаубтиI¡^кр[гетЁстс1ррссу^зснтЬс -142-.

НВ2А - С01ЛНАЕА5ССВР5УС005ССРРУСССУС2ЕРТС -177

НВ2В - ООШН^лаССК^^ССдЬ«^^ -175 . , '/

Степень'гомологии 84,8 7. *

Рис.8. Сравнение аминокислотных последовательностей серобогатых кератинов человека НВЗА и НБ2В.

Анализ аминокислотных последовательностей этих белков показах, что для них" характерно присутствие тандемно повторию-пихся аминокислотных последовательностей. По составу аминокислот и характеру чередования удается обнаружить два типа аминокислотных повторов: тип I - суе-суа-£1п-рго-еег; тал II-сув-сув-е1и-*Ьг-вег .(рио.9.). Интересно . отметить, что эти повторы, во-первых, преимущественно встречаются в г~рвоД

; половике' полипептвдюй цепи, во-вторых, располсдазны такдеыно дунлеташ или деклаептвдаыл, состоящий» ' из I-,s. ХГ-тшюз повторов. Б обеих белках встречоотся по пять таких дуплетов, со : три я дэа вместе. „ - -■'/■; v.''-v '.'■.

ГТектаоептядныеповторы являются неотъемлемый яле1Ж1гта»а серсФогатых . кератинов овцы семейстэа В2 в ПШ (ХПмш M al, 1S72, Kaylett et al.,1971, Uarehall etal.,1976, UcHab et al., 1989, Swsrtet al., 1971). Сравнения сентапеотидпых повторов рамздчных серобогатых кграттов овда в человека, осслэдуешх нами, показывает, что :во всех пгнтвпгптидгшх повтор« першо дае аминокислоты представлены цистепковьпя остатками. Чотвер-: тыг аминокислотный остаток пе»гтапептяда серобогатых кара по юз овцы также консераатиэок {рго), а треткй я пяткЯ варяруют от бедка,к белку. 8 данной случае, 1-сентгаоптидныЯ повтор человеческого кератина имеет большое сходство с овечьяш в той шшш, что первые четыре еметохяслоткыхостатхз вбсаявтяо идэнтсгпм. А. и-пентапептидный повтор, за пашзчетеи дзу! паршх шю-кяолотких остатков, не sueur тчого сбадзто. В литература пз с&~ суждзется роль »таг консервативных элэмантов ссрсбогатых Герата нов. однако, суммируя результаты сравнительного анализа пея-тбпептидных повторов серобогатызс кераттшв ' ошда в человека* , иояно 1 сказать, что функционально ваюслш, вядако, являются, именно, первыедве аминокислоты (Cys-Cya-), а три остальных пояняют вспомогательную роль, обеспечивая rat необходимо расстояние. а сами пентапептяды, по всей вадамистз, иелоттся с.руктурнами элементами : упорядоченных структур полшептадэ. ' .' ■ Eoßere C.E. (1934) и • Powell С.В.с соавторе^ (1533) изучал : аминокислотный состав серобогатнх кератинов евщ В21 а В2Д, на итмечакт з них присутствия пентвпеп-пдашх повторов. Хот, t дох ' токи можно выявить два пектапеатидиах повторе следугдото состава' - Cys-Cye-Gltt-ïhr-Ser (I.) и.. Сув-Суа-Cln-Pro-ïbp (XI.). £ 'белке В2А l-пентапептцд встречаэтся только одам раз» а II-пента'пептмд четыре раза, В отдочие от пеятапевтедов че.тогечес-ких.керл тов, где они образуют отмети из дэ/х «шов цгеташ-содерхашх пентапептидоа, аентояеятида» II-трпа беяха GZ1, встречается в дуплете о другими пг:гггпеп1идзыа, не вмевида« В. своем состар? цистеияоиых cctûtkod Ser-Ile-Cln-Tbr-Ser -(III.). Зтот иекталептид акеет сходство с пзнтепгптэдем 1-тапо. белка В2Л, ко В ней изменены пергуэ дза аыинОЕОЯСлопшх остатка.

ЕВ2В Ш" Thr 3ys Cys Gin Tíir Ser Phe EÇ3 Gl у Туг Pro Ser (ад Ser.Thr Ser Gly ThrICy: HB2AMET Ala Jys Cys Gin Thr Ser Rie (ç^ Gly Phe Pro Ser [cysj Ser Thr Ser Gly Thr [С

\ i - • -X .. - . ; x • ' ; Ж

Oys Cys ülu Ihr Ser )Cys Cys Gin Pro Set] Cys Cys Glu Thr '¿er fcys

* Eys Cys Uln Fro ber

•jCys Cys Gin Pro Г.»

^ys Cys Glu Thr Ser¿ Ser Cys Gin Projyy Pys Cys Glu Thr Ser.fcys

Cys Gin Cys Gin

tWser Pro Ser

Oys' dys lilriThr'Sër JJvS' Cys Gin Thr Ser

Asp Phe Leu Ala Ser Gin Leu Val Asp Leu Gin Leu Gly Phe Pro Ser Phe Ser Thr Gly Gly Thr ICvsl Asp

" I' : X

—! Ser Ser Ser

Cys Cys Qln kro Serj fcys Cys Glu Thr Ser Kys Cys Gin hro .Ssij.Cys Cys Gin Thr'Ser',Ser ; Cvs Cvs Gin Pro 5eriCysiCys Glu Thr Sen ?ys Cys Gin Pro Serj Cys Туг- Gln Thr Ser Ser

Thr Glyl Thr GlyI

Ile Arg Trpj lie Are Trpj

! Gly lie Gly Sly Gly lie Gly Туг Gly Gin Glu Gly Ser Ser Gly Ala Val Ser Thr Arg (Gly Пе Gly Gly 61y lie Gly Tyr Gly Gin Glu Gly Ser Ser.Gly Ala Val Ser Thr Are

I Arg Pro Asp I I Are Pro Asp!

Щ Are Val Glu Gly Thr d Arg Val Glu Gly Thr

Cys Cys;

Leu Pro Pro Leu Pro Pro

Ш

Cys Cys Cys Cys,

Val Val Ser (Cys) Val Val SerlCysl

His Thr Pro Thr Thr Pro Pro Ser

Ш

Cys Cys Cys Cys

Gln Leu His His Ala Glu Ala Ser Gln Leu His His Ala Glu Ala Ser

Cys Cys Are Pro] Ser Tyr Cys Cys Arg Prd Ser Tyr

üys

Cvs

Gly Gln Gly Gln

Ser Ser

Pys fcys Arg ProiVal СУ? Cvs Arg Proi Val

Cys Cys Cys Cys Cys Cvs

Tyr Ser^Ser Н1з(Ш —

TyríCyslSer Giü Pro Thr —

■ Рис.9. 'Локализация пситдоштициых повторов в составе белков 1 ' ШЙЛ и 1Ш2В человека.

где произошли аминокислотные зшш - Суа на . Ser к Oye на Не. Б - силу таких перестроек у серобогатых кератинов ¿вци пентапептидкые дуплеты менее обогащены цистеиноы.чем аналогичные повтори серобогатых кератинов человека.

На нал взгляд, кажутся интересными такие аминокислотные замены в пентааептиднмх повторах кератинов овцы. Ыохет быть, напротив, тахал замена аминокислотных остатхов произошла , в пента-пеитедных повторах серобогатых кератинов человека в ходе эволюции, 'Придавая тем самым человеческому волосу соответствующие свойства. 1 "-'■ ; ' . '■.""'■

>Видимо, исходя из вышеизложенного, авторы объединяет пен-тааептид П-типа о пентаоептидом III-типа и именуют их дакапеп-

■ тидныиа повторами, имениями .в своем составе' всего два остатка цистеина. Серобогатый кератин овцы ВЗД отличается от В2А тем, что содержит в своем составе, &-дехапептидных повторов, а не б как в Е2А, т.е. на десять аминокислот больше.

Таким образом, сравнивая аминокислотные последовательности - пентлпептидных повторов серобогатых кератинов овцы и человека» мы увидели наряду с принципиальным сходством и некоторые ■ отличил. С чем связано'такое явление, пока ке понятно, №ясет быть . зто является.причиной суирствования различных типов'шерстя ов-щ, отличаюдахся по таким свойствам как тоника, растяжимость, крепость, упругость я т.д. Этот факт, обнаруженный нами ори их сравнительном изучении, позволяет в дальнейшем планировать эксперименты с использованием как регуляторных, так л структурных 'областей: генов серобогатых -". кератинов человека для получения ■ трансгеккых животных. -V/1

Для С-кокца полилептидной цепи.квгд и КВ2В тахже характерно присутствие повторов из 5-аминокислотках остатков - Ser-Cye--Cye-Arg-?ro, Этот повтор встречается no два раза в обоих белках. Что интересно, повтор такого же состава характерен и для С-конца кератинов овцы КА и В2Д (Powell et al,, 1903). В этой области ближе к тернинируюцеыу кодону овечьего кератина В2А помимо »ти* повторов присутствуют ewe два центапептида - Сув-Сув-&ln-?ro-TUr, которые отсутствуют у серобогатых кератинов чело-

■ еека.

К сожйл!*-ч», мы не имеем возможности сравнить первичную :структуру белковi' ыгеед^нноз нами исходя из структуры генов, с («кислотной последовательностью реально сушествующих , серо-богатых кератинов человеческого волоса ввиду того, что послед-"

- 21 -

няя до cwt пор не выяснена. ' .4 _

Сравнение ашнокислотных последовательностей кератинов человека - НВЗАи КЕ2В, выведенных из их куклеотмдиих последовательностей, мекду собой показывает, что в этих белках имеется участки, разлщаюдаася по своему аминокислотному составу (рмс.ХО,)* Из рисунка хорошо видао наличие трех консервативных участков (1,Ш a Y), два из которых примыкают к Н- и С-кокцам. Скорее всего, они образуют основу упорядоченных структур. Эти участки содержат почти все остатки цястеинов, которые расположены регулярно на расстоянии 3-5 аминокислотных остатков. Oct способны образовать высокопрочные в. по-видимомуа стандартные внутри-, а (или) ыежмолекуллрные структуры, скрепленные S-3 мостиками. Между этими участками^выявляются еще два,.один из которых (17), также консервативен и сильно обогащен глицином {Id аз 19 а.х.). Пятый участок (под номером XX на pao. ICO характеризуется уникальной особенностью. Прежде всего, он ке консервативен содержит всего одик остаток цистеина, и то в белке КВ2А, Аминокислотные остатка внутри этого участка в двух белках не имеюткакой-либо гомологии. Из сравнительного анализа нуклао-тидных последовательностей генов ИВ2А и НБ2Б, который рассматривался ■ в предыдущей главе! можно отчетливо увидать, что фрагменты генов, кодирующие зти вариабельные. участки соответствующих белков сохраняю» высокую степень гомологии (рис.5.), а аминокислотные замены возникают по причине сдвига рамки, вызванного делецией или вставкой единичных куклеотидов в трех разных кодонах; что вновь восстанавливается рамка считывания.

. При анализе аминокислотных,последовательностей1серобогетых кератинов овцы S2A И В2Д можно также обнаружить в кнХ дна цистеикбогатых участка, разделенных . между собой глицин-' богатым участком. Однако, их глицин-богатый участок менее' .обогащен глицинам (в из 17 а.к.). К тому же здесь не ид-тти-* фицироаан вариабельный участок, который у серобогатых кератинов расположен между двумя хдотеинбогатымс* участками (рис.10.). Различие меаде овечьими серобогатыми кератинами S2A и В2Д определяется витавкой дехапет-идного повтор» (см* выам) на в5-емннокнслоте. Возникновение вариабельного участка в серобогатых кератинах человека/ по всей видимости« характерна только для кератинов человеческого волоса.

В литературе имеются некоторые данные, свидетельствуема су вариабельности структуры балков ыатрикоа волоса человека у раз-

).£Т ТЫ Суз Су;; С1п ТЫ Бег Ите Суз И у Туг Рго Суэ Бег ТЫ-Бог 01 у ТИг Суэ Бег Бег Л1а Суз Суз ф'п ТЫ Бег РЬе С^з С1у РЪе' Рго Бег Суз Бег ТЫ Бег 61у ТЫ Суэ С1у Бе!" Бег Суэ .Суз 61п Рго Бег Суз Суз 61и ТЫ Бег Суэ Суз 61п Рго Бег: Суз Суэ 61 и ТЫ Бег Суз Суэ б1п Суз Суз 61п Рго Бег Суз Су® Б1и ТЫ Бег Бег Суз 61п Рго Агг Суз Суэ 61и ТЫ Бег Суз Суз Ип

Рго Бег Суз Суз 61п ТЬг Бег РЬе Су5 Рго Бег Суз Суэ 61п ТЫ Бег. РЬе Суз

Азр РЪе ии А1а Бег 61п Ьеи Уа1 Азр ии Шп Ьеи — 31у И» Рго 5ег РГ» ТЫ 61у 61у ТЫ Суз Аэр Бег Зег Зег

III. ■ ■■

Суз Суз 61п Рго Бег Суз Суз (31и ТЫ Бег Суз Суз(Нп Рго Бег Суз Суз Ип ТЫ Бег Бег Суз Суз Суз С1п Рго Бег Суэ Суэ Йи ТЫ Бег Сув Суз С1п Рго Бег Суэ Туг'.Ип ТЫ Бег Бег Суз 51 у 31 у

IV.

ТЫ 61 у Суэ С1у 116 61у 61 у 61У Не Шу Туг 61 у 61п 61 и е!у ТЫ 61 у Суз 61У Не 61у С1у 61у Ие Е1у Туг 61у61п61и61у Зег Бег 61у А1а Уа1 Бег ТЫ Аге Бег Бег 01у А1а Уа1 Бег ТЫ Аге

V.

Не Аге Тгр Суз Аге Рго Агр Суэ Аге Уа! Ии С1у ТЫ Суз Ьеи Рго Рго Суз Суз Уа1Уа! Бег Суз Не Аге Тгр Суэ Аге Рго Азр Суз Агр Уа1 61и 61у ТЫ Суэ ии Рго Рго Суз Суз Уа1 Уа1 Бег Суэ Н1з ТЫ Рго ТЫ Суз Суз 61п Ьеи Н13 Н1з А1а С1и А1а Бег Суз . Суз Агг Рго Бег Туг Суз 61у 61п ТЫ Рго Рго Бег Суз Суг Йп ии Н1з Шэ А1а 61и А1а Бег Суэ Суз Агг Рго Бег Туг Суэ <Цу б1п

Бег Суз Суз Агг Рго Суг Суэ Суз Туг Бег Суэ Бег Шэ Суэ г— - 1 Бег Суз Суэ Агг Рго Уа1 Суз .Суэ Суз Туг Суз Бег 61и Рго ТЫ Суз —

. Рис. 10. 1 Локализазия консервативны* ( I, III» IV, V } н

вариабельного ( II. ) участков в белках НВ2А и НВ2В.

-I . I 8 .

шх индивидов(IC&teuumt et al^,i989). Наличие такой вариаСеяь-ноств Сило обнаружено пря даумарнон электрофореза S-карбокеиме-ш производных, этахбелхов, Теперь, после того, как Сила уста-повлйна. первячнвя структура' двух тенов э^оа группы белков, можно попытаться .выяснить,' является ли вариабельность белков, обнаруживаемая i^ù изучении их двумерным электрофорезом, отра-жендвиреальногополиморфизиа генов пли же возникает на пост-трансхршщионном уровне синтеза белка и формирования структура ; волоса,' ' i 1 ; '■■- ;;■■"■"■.' .. i-.

В настоящее времт, пока еще недостаточно данных для сколько-нибудь приемлемого объяснения этого феномена. Повтому ' можно только ограничиться констатацией факта. Фактом является то, что в. исследуемых наш серобогатых кератинах - явно имеются 2 вида ;участков - высококонсервативные по кряям и изменчивые внутри. Далее, в изменчивой часта имеется участок, который изменился не ' путем длительного накопления множества изменений, а, судя по всему, в результате'двух событий (инсерций/делеций), :

Такой механизм изменения структуры белка обнаружен также при сравнения первичной структуры кератинов человека и овцы (рис.11 и 12.). При этой показана достаточно высокая гомология ыежду.этими белками. Тем не менее у обоих кератинов выявляются два участка, на'имеющих шгкакой гомологии. Первый вариабельный участок белка КВ2А характеризуется появлением в его составе довольно протяженных аминокислотных последовательностей (16 а.к.и 35а.к. ), которые отсутствовала в соответствующих белках овцы - В2А и вгс (рис,11.). Для.второго вариабельного участка,* наоборот, характерна потеря Па.к, в обоих случаях на 170 ' аминокислоте. Такая тенденция приобретения ' и потери фрагментов сохраняется и 'для белка НВ2В. На уровне нуклеотидкых последовательностей такое явление не объясняется вставкой обширных обл» tt;Я, кодирующих вновь появившиеся аминокислотные последователе ж сти». а сдвигом рамки считывания, вызванного инсерцией/дед^ыей.

Таким обр*чом,' мы еще раз сталкиваемся с таким же механизмом возникновения ' вариабельных ' участков кератиновых белков, который №л обнаружен при сравнении первичной структуры кератинов человека между собой. ~ Такой механизм изменчивости мало распространен потому, что'чреват неконтролируемым выведением из строя белкя, Но он интересен тем, что позволяет, сохраняя; первичную структуру гена ( или его участка) сильно и быстро «зме-

• 1.

' Е2А

.HESA . Б2А ЯКА E2A .. . ' HB2A • E2A .HE2A -.

MACCSTSFCGFPJ C^QGTCCSSTOPTCCQTSCCQPTS IQTSCCQPIS I- 50.;

qts----------—---CCQPTSIQTSCCqPTCUiTSGC^tgcaiggs -64 --.ч.■■ .

qTSFCGireFSTGGTCDSSOCQP^^

; IGYQQVGSSGAVSSRTRW^RPDCRVEGTSlj'PCCTVSCTPPSCCQLYYAQ -134;', -IGYGQECKSGAVSTRI ГЙККРЬСКУЕСТЙЯРС^ -150

ASCCRPSYCGQSCCRPACCCQPTCI ЕР ICEPSCCEPTC -172 - -./- '

/¿^(^YCGC^RPYCCC-----------YCSEPTC. -177 - ' •

, Степень гомологии - 74.iX. ■

НБЗА

б2с

НБ2А

8CC

НГ^Л

esc ;

* HB2A ■ DEC ; '

- MACCSTSFCGFPICSTAGTC6SSCCRSTCSQTS-

-60 -33 -100 '

-----------———:-CCQPTSIQTSCCQPTCLQTSGCETGCGIGGS -64 ';

IGYSQEGSSGAVSTRIRVCRPDCRVSCTFT'SOTLHHAE -150 V TGYGQVGSSGAYSSCT^ -114 —V

ASCCRPSYCC3QSCCFff1VCCCY~r-------CSEPTC-177

jsCcfreYCGQSCC№ACCCQPTCTEPVCEF^ -152

Степень гомологии - 73X

fko.it. Сравнение аминокислотных последовательности кератина человека НВ2А с аналогичными последовательностями кератинов овил - el * (I.) и Б2С (2.), .

НВ2В .'г MTCCCn'SFCSVPSCSTSGTCGSSC^PSCCCTSCC^ >50

B2A- - MACCSli^TOFPICCTGGTCGSS^CQi^TO^SCCQPTSIQTSCCQP--- -4? НБ2В - QTSFCDFWSCH-VW/}L5CC4PSCCCTSCCX3 1GGGI' -iOO"

г ' ■ . - ' + j * ч » ' J J * * 1 * 4 £ * * ! *!♦•!*! I '1

ВЙА ^ - ISIQTSCCQPTSIQTSCCQnCLQTSGCETGCG 1 GG3*I -83

HB28 - GVQQEGSSGAVSTR I R^O^IXRVEOTCLPFCCTVSCWPTC^LHHAEA -150 B2A - i^VGS^VSSCTi^RnXJCT -135

HB28 - SCCRPSYCCjOSCCRPVCCCYSCS-*----—-.--HC -175 .. '

B2A V _ 5ССЖРЭТСО05ССКР)№СС^РТС1№1СЕР5ССЕРТС "172 "

■ Степень гомологии - 69.2X • \ ■ 2. ■ ■ ." \ \ ' . ' HB2B - - mC^TSFCGYPSCSTSGTOGSSCC^^ -50.

B2C ' - MACCST£FCOT4CSTACT -50

- HB2B - QTSFCTFU^LVDLQLSCC^FSCCETSCCQPSCOQTSSCGTGCG IGQGI -10Q

B2C ■ - QT——---—------------------—----j^TGOTtCGST -65

HB2B - (WaQBaSSGAVSTRIFfrf^RPDCRVKTCX^^ -150*

• JJt .Itfltjj J jt<*«««44 * < J « < * * ' ' t

B2C - GYGQVGSSGAV^CTR^ -115

HE2B - SCCRPSYCSQSCCRPVCCCV-"-r---T-SCSH—С -175 ■ BSC, - Sra^i&nOQS^^ -152 ' '

Степень гомоАтгии - 69.71 ■ •

Рис.12. Сравнение аминокислотной последовательности * кератина человека HBZB о аналогичным! последовательностям кератинов'овцы - Е2А.(1.) я (2.).

пять структуру кодируемого Солка путеи сдакга раыхи. Нельзя исключить; что есть случаи, когда это важно, т.е.- изменение структуры белха должно достигаться - без заметного изменения' структуры гена.' В пользу этого предположения иожет служить; пример е геном гидролазы Flavob&eterlun Sp.Kt.TO. (0bno»tS87) уЫиизирунщрй, ''высокоспецифические нейлоии. В экстремальных дна бактерий ситуафях, при которых происходила замена одного субо-трата другим, этот тип Изменчивости обеспечил int быструю одаа-таадпо; к новым условиям сущеетвовакпв . Бипадение только одиого нуклеотыда привело к, полному .-* изменение структуры атогофор-ыекта, в ' результате чего приобретавшего крутую субстрат-специфическую активность. :'■"■ . ■■" ■■' ■ V

Однако, в случае кератиновмх гекоо, сдвиг рамки на ораво-дат к полному нэрушегеотих структуры, затрагивая лига» определенные области генов, сохраняет консервативные участта (или домены) этих структурных белков волоса* Из этого следует, что гены серэЗогятых кератинов человека? а овцы имеет склонные к мутации участка (или "горячие" точки) . У генов серобогатых кератинов человека и овод вшаденпе нуктеотвдов проасходит тагам ; оО-разом, .что при атом сокращается число кодовое в той ш . ином гене, чем объясняется вариация размеров поляпептядише цгпей. Таким образом, можно предположить что для исследуемых tatet ге-. нов этот механизм оказался нужный длябыстрого нзмекемм - определенного участка. В этой связи; возникает вопросt не этот ла механизм является ответственным за вариабельность белков' этого lu^cca, обнаруживаемая в системе двумерного электрофореза (Kat-svnrat et al.,1909) ? .;'.-..'■ -

' Несомненно, обнаруживаемый нами способ изменения ври сравнительном изучении структуры генов и кодируемых вин серобогатых кератинов человека и овод, представляет большой интерес, прежде всего, с точка зрения эволюции. Но »то самостоятельная проблема, требуювдя новых исследований.

Таким образом, сравнение генов серобогатых кератинов овцы и чэлове, » позволяет выявить консервативные участки я подтвердить их необходимость для функционирования. Такими последовательностями пвлййтся: «) сигналы инициации и термидора транс-. кркт(ии и б) "ччтрмкс-епецифическая" последовательность, обнаруженные Powell B.C. с соавторами п подтвержденные наш; п) га-нуплйотиднэя последовательность, обнаруженная нами в ре-гуляторнах областях генов НБ2А и ПБ2В человека, также имеющаяся

в аналогичных Областях re нов серобогатых кератинов овцы*

.yta кератинов ов-

цы а человека иоэводяет обнеружить иеханнзн вариабельноота генов* - ориводйвдй к изиененшо структуры белков в определенных

■ участках. ;'■■;■',■ V- ' '>■;.''-'■■:. . г'

выроди

; I. В результате клонирования и структурного изучения генов > : серобогатых кератинов овца - В2А в В2Д - казахской тонкорунной порода показано большое сходство с аналогичными генами овцы ; породаАвстралийский-меринос, изученных группой Powell B.C. ti9C3j. о :/.'';■ ' .' v -v:' '■

. 2. Во флвнкнрущнх областях генов серобогатых кератинов овцы обнаружены Pat1-повторы, характерные для renoua дика. : ; '"■■ ! 3. Обнаружено, что тени сероОогатых кератинов овцы виеот

.гомологию, достаточную для использования пх в качества зондов для выделения генов сероОогатых кератинов человека. ~ С использованием атих зондов в ваша работе впервые ;

• . проклонировзкы геш серобогатых кератинов человека я детально '...;.■.' изучена их структура. 'Ху'■'-■/' ' ^ ■

.* 6, Структурное изучение областей, содержащих гены серобо^ гатых кератинов человека, показало, что, как в гены сероОогатых кератинов овцы, они расположены кластерно с тандемной сргакиза-цией. При этом расстояние между генана серобогатых кератинов человека больше, чей у аналогичных генов овил (на 3,7 т.п,н<).

■ 6. Показано, .что гомология меяду генана серобогатых кера- -: тиноб овцы в человека распространяются только на ходярукядае и . близлежащие флднкирунцие области генов,.v.-; 7. Во фланкирупщах областях генов серобогатых кератинов : ■ человека обнаружены неидентифицированные повтора, характерные . .! л я генома человека. у-'-X~ . '.'.-["■'■

! i ' : ' ' , а». Определена полная первичная структура , кодирущих а ] ','.■' фланкирующих.областей генов серобогатых кератинов человека. Их

■■";■ структурный анализ показал! ;-. - •

а) структурная часть генов кодарует полипептидные цепа длиной в ' . 177 и I7S а.к.; :\ '■•." - . ■ " -: .'•.'•■-• ;

\ б) эти гены высокогомологичны между собой ( 95,45)1 в> в S'-фланкирующей области генов серобогатых кератинов человека » (вляется характерная для генов белш в матрикса шерсти. • овцы,1 18-нуклеотидкая последовательность, прилегающая к ATG-кодоиу ; '.' '.

V) в 5*-фланирующей оСласти генов содержится высохоконсерва-тивныЯ участок из 22-нуклеотидов.

Э. Ка основании определенной нами аервичной структуры генов ifi Г/ ; ркссчытвна последовательность закодированных в них/аминокислот,

: \ "■-■■''.-''■.Ч'/'' ■ - 29" V■ .■'• V "

что позволило впертые получить, сведения■о структурных особех-ноетях серобогатых кератинов человека.'

Анализ рассчитанная структуры зтих белков, названных Kaiiit НБ2А о НЕ2В , показал: V

а) гомология аминокислотных последовательностей ' двух белков высокая (84,6-X);

б) обнерукены- характерные 'для серобогатыхкератинов челоэек»

' п ентапеп тидкые повторы,'; отличанциесл от' аналогичных поптот>с.ч ' кератинов'Овцы s !, ' '.

, в) в составе сер^тбогатых кератинов человеке можно отчетливо вы. явить, 5 участков, различающихся по структуре , (предположительно " доменов )[ 3 хонсервативных цистеинбогатых, I глицпнбогатыЛ и I неконсервативный, измекчцауЛ ,.'.. . ■ "' '•

-■' СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИЯ. ' '

' I. Акоплн К.Х., Хумабаева Б.Д., Генинг Л.В., Тарантул В.З., Га- . заряк'К,Г.: Клонирование в частичная характеристика повторов генома овш, вмеицих гомологию с Ра ^семейство« генома быка.- Колек, гене- | ■ тика, микробиология и вирусология, 1Э90,Т.П.,СЛЭ-16.

2. Хумабаева Б.Д., Генинг Л.В., Газарян К.Г. Клонирование и структурное изучение генов серобогатах кератинов человека.- Кодек. ' "■ биология (в печати).., V. _■■*'' \

,3.Газерян К.г., Гекикг Л.В., Андреева Я.Е.,'кузнецов Ю,М., Га- ! заряк Т.Г., Хумабаева Б.Д.- "Получение линий трансгенных сельхозха- ■ вотных путем перекоса в их геном генов, кодирующие важные флзиологи- . | чесхие признаки",- Тезисы докладов I Всесоюзной планово-отчетноа . конференции no^направлению "Генная и клеточная инженерия", ■ ' >

Пуцино-на-Оке, 1990 г. ' * !

'4. Хумабаева 6.Д., Генинг Л.В., Газарян К.Г.-"Сравнительное i изучение первичной структуры генов серобогетых кератинов овцы и че-■ ловека",- Тезисы докладов.. второго рабочего совещания1 по проблеме i "Регуляция экспрессии генов ылекоштаишх**,- Новосибирск,IS9I. ■• '

5. Zhuraabayeva B.0.,Centng Ь,7. »Сагагуап К.С.- "Cloning о! Ке- : - ratlngenea oiKazatth .Fine Fleeced Sbeep",-Republican Sclenttile

conlorence, Abstracts, Alma-Ata,1989.

6. Alcopyan K.Zh.,2h\mbayeva B.D., Genlng L.V1, Tarantul V.Z,, . ;■ Cazaryan K.G.- "Cloning ^ and ■ characterisation oi fast repeated ША

Bequencee Hanking the bovlnegrowth Horroon genes and sheep Keratin, hlgh-eulphur'genes", - The X-th. Bllaterlal Eynpoaim USSR-France,* abstracts, Kiev,1990.

j^y i.w "

Подписано в печать 1 02.92 г. Формя 60x84/16. Овмм I п.л.

■ Тираж. 100 экз. Заказ .» 19.__' ' - '" '

; ротапринт НИИ СО и УК.. , Ю3062, Иосква, 1мш 1»р.*Д.За.