Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование патогенеза болезни Альцгеймера на модели Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.03.06, Нейробиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование патогенеза болезни Альцгеймера на модели Drosophila melanogaster"

На правах рукописи

БОЛЬШАКОВА ОЛЬГА ИГОРЕВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ПАТОГЕНЕЗА БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА ЙА МОДЕЛИ 011030РН1ЬА МЕЬА№СА5ТЕ11

03.03.06 - нейробиология, 03.03.01 - физиология-

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

I 4 ОКГ 20.3

Москва-2013

005535909

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова» Национального исследовательского центра «Курчатовский институт».

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук

Саранцева С. В., заведующий лабораторией

ФГБУ «Петербургский институт ядерной физики

им. Б. П. Константинова» НИЦ «Курчатовский

институт»,

доктор биологических наук

Полетаева И. И., ведущий научный сотрудник

кафеды высшей нервной деятельности

Биологического факультета ФГБОУ высшего

профессионального образования «Московский

государственный университет имени

М.' В. Ломоносова».

доктор биологических наук

Климов Е. А., доцент, старший научный сотрудник кафедры генетики Биологического факультета ФГБОУ высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова»,

доктор биологических наук Рыбникова Е. А., ведущий научный сотрудник лаборатории нейроэндокринологии ФГБУН «Институт физиологии им. И. П. Павлова» РАН.

ФГБУН «Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии» РАН.

Защита состоится 18 ноября 2013 г. в 15 час. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 501 001 93 биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, строение 12, Биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке МГУ именй М. В! Ломоносова.

Автореферат разослан « октября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, .

Умарова Белла Анверовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Болезнь Альцгеймера (БА) -нейродегенеративное заболевание, одним из наиболее важных факторов риска развития которого является возраст. Показано, что с увеличением продолжительности жизни человека в развитых странах, а также с увеличением доли пожилых людей в популяции, БА стала самой распространенной формой среди деменций разного типа. БА - прогрессирующее старческое слабоумие, поражающее более 15 % населения в возрасте старше 65 лет. Первым признаком заболевания является легкое нарушение памяти на текущие события, которое появляется приблизительно за 5 лет до манифестации деменции (Petersen et al., 1999). Это может означать, что при БА нейродегенеративные процессы в мозге, по-видимому, начинаются задолго до начала заболевания. Наиболее важными нейропатологическими признаками этой болезни являются: нейродегенеративные изменения в структурах мозга, наличие внутриклеточных нейрофибриллярных клубков и внеклеточных отложений амилоидного пептида Р (Ар) в виде «сенильных бляшек». Хотя основные патологические характеристики БА хорошо известны, тем не менее, до настоящего времени еще не существует ясного понимания механизмов, лежащих в основе ее патогенеза. Важное значение придается гипотезе «амилоидного каскада» (Hardy, Selkoe, 2002), согласно которой к развитию БА приводит нарушение процессинга большого трансмембранного белка-предшественника амилоида (АРР), в результате чего образуется токсичный Ар42 пептид, который вызывает каскад событий, приводящих через многочисленные промежуточные этапы к развитию БА. Этот каскад включает: гиперфосфорилирование белка тау, разрушение микротрубочек, нарушение ионного гомеостаза нейронов и функций митохондрий, активацию глии, а также когнитивную дисфункцию вследствие развивающейся синаптической недостаточности. Однако в последние годы появилось много фактов, которые не укладываются в эту гипотезу. Кроме того, становится очевидной многофакторность данного заболевания. Нейродегенеративные изменения в мозге может вызвать сложное взаимодействие между генетическими предпосылками, экологическими факторами, старением, медиаторами воспаления и т. д. В настоящее время существует много различных гипотез патогенеза БА. Так, «тау-гипотеза» утверждает, что исходное нарушение при БА - это чрезмерное фосфорилирование белка тау, которое приводит к трансформации его нормальной структуры и образованию в итоге нейрофибриллярных клубков. Это, в свою очередь, вызывает дезинтеграцию микротрубочек, нарушение транспортной системы клетки - и приводит к ее гибели. Другие гипотезы

з

этиологии и патогенеза БА предполагают нарушение процессов воспаления (Lucas et al., 2006), нарушение гомеостаза кальция (Bezprozvanny, Mattson, 2008), гормональные дисфункции (Hampl, Bicíková, 2010), дисфункцию иммунной системы (Fulop et al., 2013), окислительный стресс (Tajes et al., 2013), нарушения процессов клеточного цикла и т. д. Все они пытаются объяснить причины когнитивных нарушений и нейродегенеративных изменений при БА. Исследование участия в патогенезе БА генетических предпосылок, таких как мутации в генах АРР и пресенилинов, а также изучение нарушения функций кодируемых ими белков и их взаимодействия, значительно расширяет наши представления об этом заболевании и дает возможность сделать предположения о происхождении спорадических форм этого заболевания.

Между тем, актуальность исследования БА и создание терапевтических препаратов, способных приостановить, или, по крайней мере, замедлить течение заболевания, стоит в последнее время особенно остро в связи с тем, что популяция пожилых людей в большинстве развитых стран растет более чем в 2 раза быстрее по сравнению с общей численностью населения (Castellani et al., 2010). Нет сомнения, что понимание фундаментальных процессов, лежащих в основе патогенеза этой болезни, будет иметь большое социальное значение.

Цель исследования. Целью работы было проанализировать роль трех важных «участников» патогенеза болезни Альцгеймера: АРР (белка-предшественника бета-амилиода), пресенилина 1 (PS1) и собственно амилоидного пептида ß (Aß42) в развитии признаков этого заболевания с использованием в качестве модели трансгенных Drosophila melanogaster.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. На трансгенных линиях Drosophila исследовать влияние экспрессии генов человека: АРР, АРР с мутацией Swedish, PS], его мутантных форм, а также последовательности Aß42 на продолжительность жизни, нейродегенеративные изменения мозга и поведение животных.

2. Провести анализ гибели холинергических и дофаминергических нейронов при экспрессии гена АРР человека в мозге Drosophila, а также попытаться разделить влияние экспрессии АРР и эффектов собственно амилоидного пептида ß.

3. Проанализировать влияние экспрессии гена PS1 человека и последовательности Aß42 на нейромышечные соединения (НМС) личинок Drosophila.

4. Провести исследование влияния экспрессии PS1 и последовательности Aß42 на распределение синаптических белков синаптотагмина и синаптобревина в мозге Drosophila.

4

5. Исследовать влияние никотиновой кислоты на выживаемость, нейродегенеративные процессы в мозге, а также на способность к обучению и память у мух с экспрессией в нервных клетках генов АРР и бета-секретазы человека {ВАСЕ).

Основные положения, выносимые на защиту:

• Снижение продолжительности жизни, нарушение поведения и нейродегенерация в мозге могут быть вызваны не только повышенным содержанием Aß42, но и гиперэкспрессией гена АРР человека и его мутантных форм.

• Избыточная экспрессия АРР может приводить к нейродегенерации в мозге, которая затрагивает основные группы нейронов, такие как холинергические и дофаминергические. Гибель этих нейронов происходит независимо от образования Aß42.

• Нарушение функций PS1, вызванное его гиперэкспрессией или мутациями, приводит к синаптическим нарушениям, которые усиливаются образованием АР42.

Научная новизна. В работе показано, что экспрессия гена АРР человека в мозге Drosophila вызывает нейродегенерацию холинергических и дофаминергических нейронов. Впервые исследовано влияние экспрессии гена PS1 человека и его мутантных форм на нейромышечные соединения (НМС) Drosophila - на величину и форму синаптических бляшек (бутонов), число активных зон, распределение пресинаптических белков: синаптотагмина и синаптобревина, а также на количество и размеры кластеров митохондрий. Исследовано также влияние совместной экспрессии PS1 человека, его мутантных форм и последовательности Aß42 на эти показатели, а также на распределение пресинаптических белков синаптотагмина и синаптобревина в грибовидном теле мозга Drosophila. Впервые показано влияние никотиновой кислоты на выживаемость и уровень нейродегенерации в мозге Drosophila.

Теоретическое н практическое значение работы. Исследование механизмов, лежащих в основе патогенеза БА, имеет большой теоретический и практический интерес, поскольку любые установленные факты патогенеза БА являются мишенью для разработки новых лекарств и лечебных мероприятий и могут иметь решающее значение для развития эффективной терапии. Кроме того, подобные исследования способствуют поиску новых возможностей для диагностики заболевания на ранних стадиях, т. е. до клинических проявлений, т. к. помогают лучше понять, каким образом синаптические изменения возникают и преобразуются в мозге.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на следующих отечественных и международных конференциях, конгрессах

5

и симпозиумах: Первом международном симпозиуме "Combinatorial Sciences in Biology, Chemistry, Catalysts and Materials" (Флоренция, 2007); Международном Междисциплинарном конгрессе «Нейронауки для медицины и физиологии» (Судак, 2007, 2011, 2012, 2013); Третьей международной конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2007); Международном симпозиуме "Biological Motility. From fundamental achievements to nanotechnologies" (Пущино, 2008); Первой международной конференции «Дрозофила в экспериментальной генетике и биологии» (Харьков, 2008); Российском конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное» (Санкт-Петербург, 2010, 2012); Двадцать втором Съезде Физиологического общества им, И.П. Павлова (Волгоград, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 4 работы опубликованы в журналах, включенных в список ВАК, 14 статей - в материалах российских и международных конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертация объемом 130 страниц включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты и обсуждение (29 рисунков, 10 таблиц), заключение, выводы и список литературы, включающий 265 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы цель и задачи исследования, его теоретическая и практическая значимость.

1. Обзор литературы. Рассмотрены современные представления о развитии патогенеза болезни Альцгеймера. Даны характеристики Ар, АРР и PS1, обсуждены данные о их роли в развитии болезни Альцгеймера. Обобщены данные о моделировании основных признаков болезни Альцгеймера на животных.

2. Материалы и методы. Перечислены линии Drosophila melanogaster, которые были использованы в работе. Описаны условия содержания мух и проведения экспериментов. Описаны основные методы, использованные в работе: высокоразрешающая сканирующая конфокальная микроскопия и световая микроскопия; приготовлениие препаратов мозга и нейромышечных соединений Drosophila; изготовление парафиновых срезов мозга Drosophila; иммуногистохимические методы; методы анализа поведения, выживаемости и продолжительности жизни насекомых, статистические методы обработки данных.

3. Реплыагы и обсуждение.

3.1. Анализ продолжительности жизни, нейроле! снераинн н повеления Urosophila при гниерэкспрессии н их нервных клетках генов человека: АРР, АРР с мутацией Swedish, PSI и его мутаитных форм, последовательности Ар«.

Для оценки того, какое участие в нейропатологин БА могут принимать АРР. Ар42 и PS1, мы провели сравнение интегратыюго показателя жизнедеятельности - продолжительности жизни, а также уровня нейродегенерации в мозге и поведения DrosophUa, с экспрессией в их нервных клетках генов человека: АРР, APP-Swedish. PSI, PS1.MI46V. PSI.P267S и собственно последовательности Aß42- Анализ кривых выживаемости показал, что в линиях с экспрессией АРР и APP-Sw, особенно у мух с экспрессией АРР, наблюдается массовая гибель в первые дни их жизни, связанная с появлением нежизнеспособных мух с морфологическими нарушениями. Продолжительность жизни мух с гнперэкспрсссией АРР и APP-Sw не сильно различалась между собой и составляла 40-44 дня. у мух с Aß« продолжительность жизни была несколько выше и составляла 49-50 дней. Экспрессия в геноме Drosophila PSI дикого тана и PSI с мутациями не снижала продолжительности жизни мух относительно контроля и составила 63 дня у контроля (Сатоп S), PSI, PSI.P267S и 67 дней - у PSI.MI46V. Одновременная экспрессия PSI и его мутантных форм с последовательностью Aß« вызывала снижение выживаемости мух. сопоставимое с выживаемостью при экспрессии АРР или APP-Sw.

Анализ 50 % выживаемости показал, что самая низкая 50 % выживаемость наблюдалась у мух с АРР и с APP-Sw. 50 % выживаемость мух с Aß« была достоверно выше, чем АРР и APP-Sw, но достоверно ниже, чем у мух контрольной линии и мух с экспрессией PSI и PSI.MI46V. 50 % выживаемость которых была равна контролю. В то же время у мух с мутацией PSI.P267S она была достоверно ниже контроля, на уровне мух Aß« (рис. I).

Рис. I. 50 % выживаемость мух в линиях: *lav;Canlon S, elav;APP и elav.APP-Sw. elav;Aß«, elav.PSI, elav;PSI. M146 V. elav.PSI. P267S. elav;Mfr,¿PSI.ela\;\$,SPSI.MI46V. I - контроль, 2 - АГР. 3 - APP-Sw, 4 - Aß«. 5 - PSI. 6 - PSI.M146V, 7 -PSI.P267S, 8- A ß4/Pi PS IM 146V. 9- Afa/PSI.P267S.

*, ** - достоверно отличаете! от контроля при р < 0.05 и р < 0.01 соответственно.

На рис. 2 представлены результаты анализа нейродсгенерации в мозге Drosophiia. с экспрессией в нервных клетках мух генов человека: APP. АРР с мутацией Swedish. PSN1, PSI.MI46V. PS1.P267S и последовательности Aß« на 25 день их жизни. Из рисунка следует, что самый высокий уровень нейродегенерации наблюдается у мух с экспрессией АРР. У мух с экспрессией PSJ дикого типа и с мутациями этого гена уровень нейродегенерации в мозге соответствует контролю.

Рис. 2. Уровень нейродегенерации в мозге Drosophiia melanogaster с экспрессией в их нервных клетках генов APP. APP-Sw. PSI. PSI.MI46V. PS IP267S и последовательности Лр42. / - контроль. 2 - АРР. 3 - APP-Sw. 4 _ Aß,j, J - PSI. б - PSI.MI46V. 7 -PSI P267S. 8 - Aß45/Рз PSI.MI46V. 9-AQty/PSI.P267S. •• - достоверно огличаегся от контроля при р < 0.01.

В таблице 1 представлены результаты анализа поведения Drosophiia с экспрессией в нервных клетках генов АРР. APP-Swedish. PSI. PSI.M146V. PS1.P267S и последовательности Aß«. Тесты заключались в оценке и анализе уровня локомоторной активности мух и геотаксиса.

Таблица I

Анализ поведения Drosophiia melanogasler. с экспрессией в их нервных клетках генов АРР. АРР с мутацией Swedish. PSI.

PSI.M146V, PSI.P267S и последовательности Aß42

—-—______Дни генотип 3 дня 25 дней

Контроль 97.7 + 0.35 74,2 + 4,23

elawAPP 90.2 + 0,55 17,6+6.41»»

elav.APP-Sw 88,9+ 1.25 27,6 +7,11»»

Wm.Aß« 93.0 + 0.58 6,3 + 1.66***

elav;PSI 90.6 + 0.35 31,4 + 5,77**

elav;PSI-MI46V 89.0+1,97 65,0+ 1.39

elav: PSI P267S 87.8 + 2.48 28,7 + 1,92»*

elav;M,SPSI 95.5 + 0.25 10.0 + 2,55**

ela\;AQ,y/PSI-MI46V 94,0+ 1,35 10.2 + 3.25**

ela\;A$t-/PSI -P267S 90.2 + 1.25 12.3+ 3.5**

• - достоверно отличается от контроля при р < 0.01. р< 0.001 соотвсгственно.

s

В первые дни жизни мухи исследованных линий не различаются между собой по этим параметрам. На 25 день у мух с экспрессией АРР. в отличие от контроля, обнаруживалось резкое снижение локомоторной активности и нарушение геотаксиса. Наблюдения показали, что у мух с экспрессией последовательности лр42 снижается только локомоторная активность, но не геотаксис. У мух с экспрессией PSI и PSI.P267S также наблюдалось ослабление локомоторной активности, однако, нарушение геотаксиса обнаруживали только мухи с экспрессией мутантного PSI. У мух с мутацией PSI.MI46V геотаксис был в норме, а локомоторная активность была снижена незначительно. Одновременная экспрессия PS J и последовательности Ар« вызывала снижение локомоторной активности у мух.

Полученные нами результаты полностью согласуются с данными о том, что при прямой экспрессии последовательности АР« в нервных клетках мух у них наблюдаются нарушения локомоторной активности, нейродегенерация в мозге и ранняя гибель (Iijima et al., 2004). В то же время, сравнивая эти нарушения с нарушениями у мух с экспрессией гена ЛРР, мы видим, что в последнем случае эффекты оказываются более сильными. Экспрессия PSI, кроме P5I.P267S, не влияла на выживаемость мух и уровень нейродегенерации в их мозге, но в то же время она влияла на поведение этих мух, причем во всех случаях по-разному. Это может быть следствием нарушения синаптических функций при гиперэкспрессии PS/. Наши данные подтверждают предположение о том. что функции АРР и PSI в БА не ограничены только участием в продукции Ар.

3.2. Анализ влияния гиперэкспрессии гена АРР человека на нейродегенераиню в мозге мух.

Многочисленные исследования показали. что дисфункция холинергических нейронов способствует развитию значительных когнитивных расстройств людей с БА. Предполагается, что важную роль в гибели и дисфункции холинергических нейронов при БА играет образование АР (Perez et al., 2005).

Мы исследовали роль гена АРР в развитии нейродегенерации на трансгенных линиях Drosophila, позволяющих дискриминировать эффекты экзогенного белка АРР и непосредственно Ар«. Анализ холинергических нейронов проводили на 3-5, 15 и 29-30 день их жизни методом конфокальной микроскопии, используя в качестве критерия общий уровень флуоресценции холинергических нейронов в мозге Как видно из полученных данных (рис. 3). уровень флуоресценции нервной ткани мух на 3-5 день одинаков в контрольной и опытных линиях, в то время как на 15-17 день он снижен в линиях, экспресснруюших АРР. и достоверно снижен в мозге мух этих линий

9

на 27-30 день. В контрольной линии относительный уровень флуоресценции во время опыта оставался практически неизменным.

Рис. 3. Влияние экспрессии генов АРР и ВАСЕ на холиисргнческие нейроны Drosophila. А. Относительные уровни флуоресценции

флуоресценции флуоресценции

образцов обрашов образцов

мозга 3-5 дневных мух. В. Относительные уровни мозга 15-17 дневных мух. С Относительные уровни мозга 27-30 дневных мух.

I - С1ю/+ (Контроль), 2 - СИа/АРР. 3 - СНа.АРР-З*. 4 - Он1/ВАСЕ:АРР^у.

* - достоверно отличается от данных контрольной группы при р <0.05.

Дисфункция дофаминергических нейронов характерна для различных нейродегенерэтивных заболеваний мозга и психических расстройств. С потерей дофаминергических нейронов в области черной субстанции в мозге человека связывают проявление симптомов паркинсонизма, которые наблюдаются у более чем трети больных БА (Kazee et а/., 1995; Burns el al„ 2005).

Рис. 4. Влияние экспрессии генов АРР и ВАСЕ на число дофаминергических нейронов в мозге ОгоюрИИа. Зависимость от возраста и генотипа.

A. Число дофаминергических нейронов в мозге 5-7 дневных мух.

B. Число дофамииергических нейронов в мозге 15-17 дневных мух.

C. Число дофаминержческих нейронов в мозге 27-30 дневных мух.

I _ СО&Ч.-р/лМКонтроль), 2 - СОЯ/ + ;А РР/ +:р1г/+. 3 - Сй8/+, АРР/ВАСЕ;р1е/+. 4 - С08/+;АРР-5^Ри. 5 - США ;ВА СЕ/+ ;А РР-Ян/рк.

• - достоверно отличается от данных контрольной группы при р < 0.05.

Дофаминергические нейроны в мозге ОгозорИИа собраны в небольшие билатеральные кластеры, расположенные по всему мозгу. Автоматический

ю

подсчет (программа ImageJ) числа дофаминергических нейронов был проведен на 3-5, 15-17 и 27-30 дни жизни. Полученные результаты представлены на рис. 4. Как видно из рисунка, количество дофаминергических нейронов, начиная с 15-17 дня, статистически достоверно снижается в линиях, экспрессирующих АРР. В то же время в контрольной линии количество дофаминергических нейронов остается на одном и том же уровне в течение всего этого временного периода. Между линиями, в которых гибель нейронов вызвана экспрессией АРР, и линиями с образованием Aß, статистически достоверных различий не выявлено. Таким образом, полученные нами результаты указывают на то, что гибель холинергических и дофаминергических нейронов, вызываемая экспрессией АРР, может происходить в мозге Drosophila в отсутствие образования Aß.

Анализ нейродегенеративных изменений при БА показывает, что у таких больных степень гибели холинергических нейронов коррелирует со степенью когнитивной дисфункции (Francis et al., 1999; Kar et al., 2004). Параллельно оценке состояния холинергических и дофаминергических нейронов в мозге Drosophila мы провели анализ способности мух к обучению и запоминанию навыка на 2-5 и 15 дни их жизни. Было использовано обучение мух избеганию удара электрического тока, ассоциированного с определенным запахом. Способность к обучению и запоминанию в этом тесте оценивали соответствующими индексами. В таблицах 2 и 3 представлены результаты тестов на способность мух к обучению и запоминанию.

Таблица 2

Влияние экспрессии генов АРР и ВАСЕ на обучаемость трансгенных мух

Возраст 3-5 дней 15-17 дней

Генотип

Cha/+ (Контроль) 15,6 ± 1,8 18,1 ±0,5

Cha/APP 4,8 ± 2,6* 2,6 ± 1,1*

Cha;APP-Sw 5,6 ± 1,04* 3,4 ± 1,4*

Cha/BA CE;APP-Sw 0,1 ±1,23* 2,5 ±0,6*

ple/+ (Контроль) 12,2 ±0,2 15,5 ±2,2

АРР; pie 3,2 ±0,6* 1,8 ±0,9*

A PP/BA CE;p le 1,0+1,1* 1,5 ±0,6*

APP-Sw/ple 3,9 ± 1,3* 4,3 ± 1,1*

BACE;APP-Sw/ple 0,3 ±3,5* 4,0 ± 1,7*

В таблице представлены индексы обучения, которые рассчитывали как разницу числа мух, сделавших «правильный» выбор (т. е. выбравших обонятельный стимул, не совмещенный с электрическим током), и числа мух, сделавших «неправильный» выбор, деленную на общее число мух и умноженную на 100.

* - достоверно отличается от контрольных линий при р < 0,05 (однофакторный ANOVA и post hoc тест Tukey-Kramer multiple comparison).

Таблица 3

Влияние экспрессии генов АРР и ВАСЕ на память трансгенных мух

Возраст Генотип 3-5 дней 15-17 дней

Cha/+ (Контроль) 18,6 ±2,4 16,8 ±0,8

Cha/APP 4,1 ±2,4 * 0,8 ±0,2*

Cha;APP-Sw 8,5 ± 1,3* 2,6 ± 1,2*

Cha/BACE;APP-Sw 4,4 ± 2,5* 2,8 ± 1,3*

ple/+ (Контроль) 11,3 ±2,2 12,6 ± 1,3

АРР; pie 6,0 ±0,9* 1,5 ±0,6*

APP/BACE;ple 2,0 ± 6,6* 1,3 ±0,9*

APP-Sw/ple 1,25 ±4,0* 1,4 ±0,8*

BACE;APP-Sw/ple 1,4 ± 1,7* 1,6 + 0,7*

В таблице представлены индексы памяти, которые рассчитывали как разницу числа мух, сделавших «правильный» выбор (т. е. выбравших обонятельный стимул, не совмещенный с электрическим током), и числа мух, сделавших «неправильный» выбор, деленную на общее число мух и умноженную на 100.

* - достоверно отличается от контрольных линий при р < 0,05 (однофакторный ANOVA и post hoc тест Tukey-Kramer multiple comparison).

Из этих данных следует, что способность животных к обучению и запоминанию была достоверно снижена по сравнению с контролем уже со второго дня жизни мух. Это показано как для линий, экспрессирующих только АРР (APP-Sw), так и для линий, у которых происходило формирование Aß42-Важно отметить, что гибель нейронов начинали регистрировать, начиная только с 15 или 30 дня жизни мух.

Таким образом, выявленное в наших экспериментах резкое снижение способности мух к обучению и запоминанию по сравнению с контролем указывает на то, что происходят более ранние события, чем формирование Aß, связанные, по всей видимости, с потерей синапсов. В этой связи надо отметить, что проведенные post mortem исследования мозга больных БА показали, что гибель синапсов предшествует изменению уровня СЬАТв (Tiraboschi et al., 2000).

3.3. Анализ морфологических и функциональных нарушений в нейромышечных соединениях личинок Drosophila при экспрессии гена PS1 человека и последовательности Aß«-

Гиперэкспрессия PS1 в нервных клетках Drosophila не вызывала преждевременной гибели мух и нейродегенерации, но изменяла поведение животных. Для анализа клеточных механизмов, лежащих в основе наблюдаемых нарушений, мы исследовали морфологическое и функциональное состояние нейромышечных соединений (НМС) личинок Drosophila при

экспрессии гена PSI, а также при совместной экспрессии PS] и последовательности Ар42. В отличие от центральных синапсов позвоночных, у насекомых каждый моторный нейрон, образующий пресинаптическое окончание, каждая «постсинаптическая» мышечная клетка легко различимы и уникальны. Это позволяет анализировать функции синапса in vivo на уровне одного нейрона.

Была осуществлена экспрессия гена PS1 человека и его мутантных форм в моторных нейронах личинок Drosophila, а морфология НМС детально исследована (рис. 5). НМС присутствовали во всех сегментах тела, и они имели стандартную морфологию. Было проанализировано количество синаптических бутонов. Полученные данные представлены в таблице 4.

Таблица 4

Количество синаптических бутонов в НМС личинок Drosophila разных генотипов

Линия Общее число бутонов Число больших бутонов Число саттелитных бутонов

Контроль 22,6 ± 1,6 20,0 ± 1,5 2,7 ± 0,3

PS1/+ 27,6 ± 2,6 17,0 + 1,0 9,7 ±2,2*

PS1.M146V/+ 22,1 ±2,1 18,2 ± 1,3 5,4 ± 1,2

PS1.P267S/+ 20,3 ± 2,7 11,7 ±0,9** 8,7 ±0,9*

Aß42/+; PS1/+ 27,4 ± 2,7 20,1 ± 1,4 7,4 ± 1,3*

A$42/+;PSI.M146V/+ 20,9 ± 1,0 16,5 ± 1,2 3,7 ± 0,7

*, ** - достоверно отличается от контроля при р < 0,05, р < 0,01.

При экспрессии гена PS1 дикого типа, его мутантных форм, а также последовательности Aß42 общее число бутонов не отличалось от контроля, в качестве которого использовали линию CD8/+;D42/+. В то же время было обнаружено увеличение числа саттелитных бутонов при экспрессии гена PS1, а также при одновременной экспрессии PS1 дикого типа и Aß42. Саттелитные бутоны - это растущие, отделяющиеся от родительских бутонов или от межбутонной связки (интерстициальные бутоны). Изменение их числа свидетельствует, в частности, о нарушениях в формировании НМС (Carrillo et al., 2013). Полученные данные свидетельствуют об участии пресенилина в образовании НМС.

Показателем функционального состояния НМС является число активных зон в пресинаптических терминалах. Активные зоны - это места высвобождения нейромедиатора и изменение их числа может свидетельствовать о наличии синаптической дисфункции (Smith, Taylor, 2011). На рис. 6 представлены снимки НМС разных генотипов (конфокальная микроскопия), на которых активные зоны визуализированы с помощью антител

к белку дрозофилы Bruchpilot, который является важным компонентом активной зоны синапса (Wagh et al., 2006). В таблице 5 представлены количественные данные по числу активных зон синапсов. Можно видеть, что в линиях с экспрессией гена PS1 дикого типа и его мутантных форм число активных зон ниже, чем в контроле более, чем в 2 раза. Наименьший эффект наблюдается для экспрессии PS1.P267S. При совместной экспрессии гена PS1 и последовательности А042 число активных зон было таким же, как при экспрессии только гена PSI.

Таблица 5

Анализ активных зон в НМС личинок Drosophila разных генотипов

Линия Число активных зон

Контроль 79,9 ±5,4

PS1/+ 32,9 ±4,6***

PS1M146V/+ 49 4 ± 5 2***

PS1.P267S/+ 55,0 ±2,2*

А042/+.-PS1/+ 39,7 ± 2,4***

Afii2/+;PS1.M146V/+ 54,5 ±5,4*

*, **, *** - достоверно отличается от контроля при р < 0,05, р < 0,01 и Р < 0,001 соответственно.

Другим важным показателем функционального состояния НМС является состояние митохондрий в аксонах и НМС. На рис. 7 и в таблице 6 представлены данные по количественной оценке кластеров митохондрий в НМС. В контрольной линии митохондрии собраны в большие ярко светящиеся кластеры. В линии с экспрессией гена PSLP267S наблюдалось уменьшение числа кластеров митохондрий и уменьшение их размеров. В остальных линиях число кластеров и их размер были на уровне контроля. Из таблицы 6 видно, что при одновременной экспрессии гена PS1 и последовательности Ар42 число кластеров митохондрий не отличается от контроля, но они меньше по размеру.

Таблица 6

Анализ митохондрий в НМС личинок Drosophila разных генотипов

Линия Число кластеров митохондрий Средний размер кластеров

Контроль 56,9 ±3,5 5,4 ±0,2

PS1/+ 63,4 ±3,2 4,0 ± 0,6

PSI.M146V/+ 49,9 ± 4,2 6,3 ± 0,6

PSI.P267S/+ 43,1 ±3,4* 3,1 ±0,3*

АР W+.-PSJ/+ 45,1 ±4,3 2,8 ±0,3**

Ар42/+;PSI.M146V/+ 44,5 ±4,6 2,8 ±0,3**

*, ** - достоверно отличается от контроля при р < 0,05 и р < 0,01 соответственно.

14

Масппаб, 25 мкм

Рис. 5. Анализ морфо.нн мн НМС личинок Огом>р1и1ч разных генотипов. Л - Контроль. В - Р31/+. В - Р81.М146У/+. I - Р51.Р267&+, Д - АР«/+.Я5//+. Е - Ар,/+;Р51.М146У/+.

1 4 / \ л * г ¡' \ -Г д ^

(08 / 1 / : 1 ! "V

г • > ч * * \

г • \ у. / 1 } , 1 % '

»* / ■ г* « \ V? V -

г V » Метвей А / < > В I Д Е

Масштаб. 25 чкч

Рис. 6. Анализ активных зон НМС личинок ОготрНИа разных генотипов. Л - Контроль, Б - /'5//+, В - Р31.М146У/+, Г - РБ/ Р267В/+, Л - Ар«»/+./>5//+, Е - Ар^.РБ! М146У/+.

1 • . в diîP • . •

У/

' »

è

0' i

• % t • ■ К

i 1 V

t ■ч \

mw

• _ 0 »

* ч

e л

• é

% * •

i * « i % »

t*

а ГП п ''П П

>1 M«R*<I M ш Iii и Ш

* / • ъ

*, < .4 г» г * V •

А >

; А i

¥

»

•

* .. Щ •* J %

А Б В Г Д Е

часипав - 25 мкм н 9.25 мкм

Рис. 7. Анаткз митохондрий в НМК Drosophila разных генотипов. А - Контроль. Б - PS//*. В - PSI.MI46V/+, Г - PS/.P267S/+, Л - A^+:PSI/+, F. - PS I. M146 V/+.

Число кластеров митохондрий в аксонах в линиях с экспрессией гена PS1 было снижено: контроль - 11,6 ±0,6; PS1/+ - 7,8 ±0,8 (р < 0,01); PSI.M146V/+ - 8,6 ±0,8 (р < 0,05); PS1.P267S/+ - 7,8+0,8 (р < 0,05); Aß42/+;PSl/+ - 7,5 ± 0,4 (р < 0,01); Aßn/+;PSl.Ml46V/+ - 8,7 ± 0,6 (р < 0,01 и р < 0,05 соответственно).

Следует отметить, что уменьшение числа митохондрий и нарушение их функций наблюдаются и в мозге больных БА (Mattson et al., 2008; Lin and Beal, 2006; Reddy, 2009; Wang et al., 2009). Однако в настоящее время не существует однозначного ответа на вопрос: являются ли эти нарушения следствием патологии при БА или основополагающими событиями в патогенезе этого заболевания. Полученные нами данные показывают, что при экспрессии гена PS1 человека и его мутантных форм, а также при экспрессии последовательности Aß42 происходит нарушение распределения митохондрий. Мы предполагаем, что обнаружение их сниженного числа в аксонах может свидетельствовать о нарушении транспорта митохондрий. В свою очередь, дефекты транспорта могут быть причиной синаптической дисфункции. Наблюдаемое уменьшение размеров кластеров митохондрий также свидетельствует о происходящих нарушениях, причем экспрессия Aß42 в этом случае вносит свой существенный вклад.

3.4. Распределение пресинаптических белков в мозге Drosophila при экспрессии гена PS1 человека.

Для оценки изменений в синапсах при гиперэкспрессии PSI, его мутантных форм и последовательности Aß42 мы исследовали распределение пресинаптических белков синаптотагмина 1 (synaptotagmin 1, sytl) и синаптобревина (n-synaptobrevina, n-syb) в линиях с экспрессией PS1. Мы проанализировали распределение sytl и n-syb в грибовидных телах и каликсе мозга Drosophila в зависимости от возраста мух. Грибовидные тела являются самыми важными ассоциативными центрами мозга мух. Они играют важную роль в координации сложного поведения: обучения и памяти. Анатомически грибовидные тела состоят, в основном, из аксонов определенной популяции нейронов, называемых клетками Кеньона. Дендриты этих клеток образуют другую структуру мозга - калике. Проведенный нами анализ распределения пресинаптических белков показал их присутствие не только в грибовидном теле, но и в каликсе. Недавние исследования выявили существование в каликсе пресинаптических активных сайтов. Предполагается, что через них осуществляется связь между отдельными субпопуляциями клеток Кеньона, в частности ответственными за восстановление и консолидацию памяти (Christiansen et al., 2011).

Анализ распределения sytl в мозге Drosophila на 30 день жизни представлен в таблице 7, из которой следует, что уровень sytl в грибовидном теле при экспрессии гена PS1 и последовательности Ар42 не отличается от такового в контроле. В то же время в каликсе уровень sytl резко снижен. То же самое было выявлено при совместной экспрессии PS1 дикого типа и последовательности АР42. При этом в случае совместной экспрессии последовательности Ар42 и мутантного PS1 количество этого белка в каликсе по сравнению с контролем не снижалось, а увеличивалось.

Таблица 7

Распределение sytl мозге Drosophila

Линия Грибовидное тело Калике

Контроль 26,0 ± 2,7 3,5 ±0,6

PSJ/+ 31,0 ±2,0 0

PS1.M146V/+ 32,2 ± 1,9 0

PS1.P267S/+ 30,0 ±1,1 0

Ар v/PSl 33,6 ±2,9 0

Ар 42/PSl.M146V 28,1 ±4,8 0

АР a/PSl.P267S 24,9 ± 1,9 37,9 ±4,2***

*** - достоверно отличается от контроля при р < 0,001.

Другая картина наблюдалась при анализе распределения n-syb (таблица 8). При экспрессии PS] его количество было уменьшенным по сравнению с контролем в грибовидном теле и в каликсе, хотя в каликсе снижение и не было столь сильным, как в случае с sytl. Однако в случае совместной экспрессии последовательности Ар42 и мутантного PS1(PS1.P267S) количество этого белка в каликсе по сравнению с контролем было также не снижено, а повышено.

Таблица 8

Распределение n-syb мозге Drosophila

Линия Грибовидное тело Калике

Контроль 63,6 ± 3,8 19,2 ±2,0

PS1/+ 39,7 ±2,7** 7,6 ± 1,0**

PS1.M146V/+ 35,6 ±3,5** 5,9 ± 1,0**

PS1.P267S/+ 29,7 ±2,3** 7,5 ± 1,5**

АР42/PSJ 22,5 ± 8,6** 7,5 ±0,5**

A$4t/PS1.MI46V 27,4 ±2,4** 4,2 ± 1,2**

A^2/PS1.P267S 26,6 ± 1,4** 25,7 ±2,5**

** - достоверно отличается от контроля при р < 0,01 соответственно.

18

Таким образом, в наших экспериментах были выявлены изменение уровня и перераспределение пресинаптических белков в линиях с экспрессией PSI. При этом образование Ар42 в большинстве случаев не вносило существенного вклада в наблюдаемые нарушения.

3.5. Исследование влияния никотиновой кислоты на выживаемость, нейродегенеративные процессы в мозге и поведение Drosophila при экспрессии в их нервных клетках генов человека: АРР, АРР с мутацией Swedish и ВАСЕ.

В настоящее время Drosophila melanogaster широко используется не только для изучения патогенеза нейродегенеративных заболеваний, но и для поиска средств их лечения (Crowther et al., 2005). Это осуществляют как добавлением в корм соответствующих химических соединений, так и путем генетической экспрессии в организме веществ пептидной природы (Nagai et al., 2003).

В данной работе было проведено изучение влияния никотиновой кислоты на выживаемость мух с экспрессией гена АРР человека. При добавлении в корм мух никотиновой кислоты существенного увеличения продолжительности жизни мух обнаружено не было. Так в линиях elav;APP/BA СЕ и elav;BA CE/APP-Sw при кормлении никотиновой кислотой, она увеличилась лишь на 5 %. У мух линий elav; АРР и elav;APP-Sw продолжительность жизни увеличилась на 10-16 % соответственно. В то же время при кормлении никотиновой кислотой наблюдалось изменение формы кривых выживаемости, а именно появление «плеча», что свидетельствует об уменьшении гибели мух в молодом возрасте. Кроме того, во всех исследованных линиях мы наблюдали достоверное увеличение 50% выживаемости: в линиях elav;APP и elav;APP-Sw на 18-30 %, а в линиях: elav; АРР/ВАСЕ и elav; BACE/APP-Sw на 18-23,5 % соответственно. В то же время мы не наблюдали различий между мухами с гиперэкспрессией APP(APP-Sw), а также при совместной экспрессии APP(APP-Sw) и ВАСЕ. Таким образом, применение никотиновой кислоты значительно повышало 50 % выживаемость и несколько увеличивало продолжительность жизни. Наличие «плеча» на кривой выживаемости подопытных животных говорит об эффективности используемого препарата. Оно свидетельствует об улучшении качества жизни животного и дает возможность использования дополнительной терапии в этот временной промежуток.

При кормлении никотиновай кислотой на 30-й день жизни мух площадь нейродегенерации в нейропиле центральных отделов мозга и в оптических долях была достоверно ниже в опыте, чем в контроле. В линиях elav;APP/BACE и elav;BACE/APP-Sw уровень нейродегенерации снизился на

19

27-37 %, а в линиях elav;APP и elav;APP-Sw на 40-45 %. Снижение уровня нейродегенерации так же, как и увеличение 50 % выживаемости, говорит о нейропротекторных свойствах никотиновой кислоты. Однако следует отметить, что применение никотиновой кислоты не привело к достоверному изменению показателей обучения и запоминания, хотя и наблюдалась явная тенденция к улучшению памяти. В то же время, имеющиеся в литературе данные о терапевтических свойствах ниацина в основном касаются его применения для профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний (МасКау et al., 2012) и только несколько работ касаются его использования для лечения когнитивных нарушений, в частности при БА (Morris et al., 2004; Morris et al., 2006). В то же время большое число работ посвящено эффектам никотинамида, близкого по составу к ниацину. Полученные нами данные на модели БА Drosophila melanogaster выявили нейропротекторный эффект никотиновый кислоты, в основе которого, как мы предполагаем, лежит также снижение окислительного стресса, развитие которого происходит при БА. Хотя, полученные результаты должны быть подкреплены данными по использованию никотиновой кислоты на других моделях нейродегенеративных заболеваний и БА в частности, а также в клинике, мы предполагаем, что использование ниацина может способствовать снижению нейродегенеративных изменений при БА.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Существование большого количества различных теорий о происхождении и развитии патологии при БА говорит в первую очередь о гетерогенности данного заболевания, патогенез которого не может быть вызван только избыточным образованием Aß42. Наши исследования показали, что участие таких факторов как мутации в генах АРР и PS], приводящие к семейным формам БА, нарушение клеточных функций белков АРР и PSI, а также образование Aß« вносят свой независимый вклад в патогенез заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Гиперэкспрессия генов человека: АРР, АРР с мутацией Swedish и последовательности Aß42 в нервных клетках Drosophila приводит к снижению продолжительности жизни мух, а также к нарушению их локомоторной активности и геотаксиса. В то же время гиперэкспрессия гена PS1 и его мутантных форм влияет только на поведение мух. Совместная экспрессия PS1 и последовательности Aß42 усиливает эффект PS1.

2. Гиперэкспрессия гена АРР человека в нервных клетках Drosophila приводит к прогрессирующей с возрастом нейродегенерации холинергических и дофаминергических нейронов, а также к снижению способности мух к обучению и запоминанию навыка. Показано, что эти изменения могут происходить и в отсутствие амилоида.

3. Экспрессия гена PS1 человека в моторных нейронах вызывает изменение морфологии нейромышечных соединений личинок Drosophila, снижает количество активных зон в синаптических бутонах, снижает число кластеров митохондрий в аксонах. Образование Aß42 усиливает эти нарушения.

4. Экспрессия гена PS1 дикого типа и его мутантных форм в нервных клетках Drosophila изменяла уровень пресинаптических белков и их распределение в отделах мозга, ответственных за формирование и консолидацию памяти. Образование Aß42 не вносило существенного вклада в эти нарушения.

5. Никотиновая кислота увеличивает 50 % выживаемость и снижает нейродегенерацию в мозге у мух линий, экспрессирующих гены АРР и ВАСЕ человека.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК России:

1. Большакова О.И., Жук A.A., Родин Д.И., Кислик Г.А., Саранцева C.B. Влияние гиперэкспрессии гена АРР человека на холинергические и дофаминергические нейроны Drosophila melanogaster // Экологическая генетика.-2013.-T. XI. № 1.-С.23-31.

2. Большакова О.И., Родин Д.И., Тимошенко С.И., Латыпова Е.М., Саранцева C.B. Влияние никотиновой кислоты на выживаемость и нейродегенерацию в мозге трансгенных Drosophila melanogaster с гиперэкспрессией гена АРР человека // Ученые записки СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова. - 2013. - Т. 20. № 3. - С. 14-16.

3. Саранцева C.B., Большакова О.И., Тимошенко С.И., Родин Д.И., Витек М.П., Шварцман А.Л. Изучение патогенеза болезни Альцгеймера на модели Drosophila melanogaster: дефицит синаптического белка синаптотагмина в мозге трансгенных мух с избыточной экспрессией АРР человека // Генетика. - 2009. - Т. 45. № 1. - С. 119-126.

4. Sarantseva S., Timoshenko S., Bolshakova О., Karaseva E„ Rodin D., Schwarzman A.L., Vitek M.P. Apolipoprotein E-mimetics inhibit neurodegeneration and restore cognitive functions in a transgenic Drosophila model of Alzheimer's disease // PlosOne. - 2009,- V. 4. N 12. - e8191.

21

Публикации в других изданиях:

1. Саранцева С.В., Большакова О.И., Шварцман АЛ. Синаптические нарушения, обусловленные мутациями в гене пресенилина // XXII съезд Физиологического общества им. И.П. Павлова. - Волгоград, 2013. - С. 465.

2. Bolshakova О., Zhuk A., Rodin D., Sarantseva S. Expression of presenilin 1 gene effects on distribution of synaptic proteins in Drosophila brain // IX International interdisciplinary congress "Neuroscience for Medicine and Psychology". - Sudak, 2013. - P. 87.

3. Bolshakova O.I., Timoshenko S.I., Sarantseva S.V. Modeling of the neuropathology of Alzheimer's disease in Drosophila melanogaster I I Third International Interdisciplinary Congress Neuroscience for Medicine and Psychology. - Sudak, 2007. - P. 61-62.

4. Bolshakova O.I., Timoshenko S.I., Zhuk A.A., Sarantseva S.V. Nicotinic acid inhibits lethality and neurodegeneration in transgenic Drosophila overexpressing human APP II VII International interdisciplinary congress "Neuroscience for Medicine and Psychology". - Sudak, 2011. -P.100-101.

5. Bolshakova O., Zhuk A., Rodin D., Sarantseva S. The effects of overexpression of human APP on cholinergic and dopaminergic neurons of brain of Drosophila melanogaster // VIII International interdisciplinary congress "Neuroscience for Medicine and Psychology". - Sudak, 2012. - P. 94-95.

6. Жук A.A., Большакова О.И. Влияние гиперэкспрессии гена АРР человека на холинергические и дофаминергические нейроны Drosophila melanogaster И XVI Царскосельские чтения. - Санкт-Петербург, 2012. -Т. IV. - С. 222-226.

7. Sarantseva S., Bolshakova О., Timoshenko S., Vitek M., Schwarzman A. Overexpression of human amyloid precursor protein causes neurodegeneration and loss of synaptic protein in transgenic Drosophila // New Trends in Alzheimer and Parkinson Related Disorders: ADPD. - 2009. - P. 245-248.

8. Саранцева С.В., Большакова О.И., Кузовкова Е.Ф., Родин Д.И., Тимошенко С.И. Моделирование нейродегенеративных заболеваний человека на трансгенных животных. В сб. «Бреслеровские чтения - II». -Гатчина, 2007. - С. 224-235.

9. Sarantseva S„ Bolshakova О., Timoshenko S., Vitek M., Schwarzman A. Combinatorial selection of phenotypes with memory impairment in transgenic Drosophila 1. Models of Alzheimer's disease pathology II First International Symposium on Combinatorial Sciences in Biology, Chemistry, Catalysts and Materials. - Firenze (Italy), 2007. - P. 75.

10. Саранцева С.В., Большакова О.И., Тимошенко С.И., Витек М., Шварцман А.Л. Нарушение синаптогенеза в мозге трансгенных Drosophila melanogaster с гиперэкспрессией гена АРР человека // Ш международная конференция «Фундаментальные науки - медицине». - Новосибирск, 2007. -С. 62.

11. Sarantseva S., Bolshakova О., Timoshenko S., Vitek M., Schwarzman A. Modeling Alzheimer's disease pathology in Drosophila: neurodegeneration and synapse dysfunction - disease of the cytoskeleton // Biological motility: achievements and perspectives. International symposium. - Pushchino, 2008. -P. 262-266.

12. Кислик Г.А., Родин Д.И., Большакова О.И., Саранцева С.В. Дефицит синаптических белков в мозге трансгенных Drosophila melanogaster с гиперэкспрессией гена АРР человека // 1 Всероссийский конгресс с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины». - Санкт-Петербург, 2010. - С. 45.

13. Sarantseva S.V., Bolshakova O.I., Timoshenko S.I., Vitek M., Schwarzman A.L. Human APP overexpression causes neurodegeneration and synaptic loss in neural cells in transgenic Drosophila // European journal of human genetics. -2007.-V. 15. S. l.-P. 307.

14. Саранцева C.B., Большакова О.И., Тимошенко С.И., Витек М., Шварцман А.Л. Моделирование нейропатологических процессов болезни Альцгеймера на Drosophila melanogaster: дефицит синаптических белков в мозге трансгенных мух с гиперэкспрессией гена АРР человека // 1 Международная конференция «Дрозофила в экспериментальной генетике и биологии». - Харьков, 2008. - С. 57-59.

Отпечатано в типографии ФГБУ «ПИЯФ» НИЦ «Курчатовский институт»

188300, Гатчина Ленинградской обл., Орлова роща Зак. 252, тир. 100, уч.-изд. л. 1; 26.09.2013 г.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Большакова, Ольга Игоревна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ПЕТЕРБУРГСКИЙ ИНСТИТУТ ЯДЕРНОЙ ФИЗИКИ ИМ. . Б .П.КОНСТАНТИНОВА НАЦИОНАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОГО ЦЕНТРА «КУРЧАТОВСКИЙ ИНСТИТУТ»

На правах рукописи

О/ ппл "ЗА?'"1,!

БОЛЬШАКОВА Ольга Игоревна

Исследование патогенеза болезни Альцгеймера на модели ОгоьорЬИа

melanogaster

03.03.06 - нейробиология, 03.03.01- физиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

доктор биологических наук Саранцева C.B.,

(

доктор биологических наук Полетаева И. И.

Москва 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений. 6

Введение. 7

1. Обзор литературы. 12

1.1. Болезнь Альцгеймера, патогенез и предположительные механизмы возникновения. 12

1.1.1. Нейропатоморфологические признаки. 13

1.1.2. Гипотезы развития БА. 16

1.1.2.1. Гипотеза «амилоидного каскада». 16

1.1.2.2. Холинергическая гипотеза. 21

1.1.2.3. Митохондриальная гипотеза. 24

1.1.2.4. Роль нейровоспаления. Воспалительная гипотеза. 26

1.1.2.5. Холестериновая гипотеза. 27

1.1.2.6. Гипотеза окислительного стресса. 3 О

1.1.2.7. Гипотеза иммунитета и другие гипотезы. 31

1.1.3. Генетические факторы Б А. 32

1.2. Моделирование признаков Б А на трансгенных животных. 3 8

1.3. Моделирование основных признаков Б А на Drosoph.Ua melanogaster. 41

2. Материалы и методы. 48

2.1. Линии ВгоБорЬИа, использованные в работе. 48

2.2. Конфокальная микроскопия: подготовка образцов. 49 2.2.1 .Приготовление препаратов мозга ИгозорИПа. 49

2.2.2. Приготовление препаратов нейромышечных соединений (НМС) Drosophila. 50

2.3. Конфокальная микроскопия: анализ изображений. 50

2.2.1. Анализ холинергических и дофаминергических

нейронов в мозге Drosophila. 50

2.2.2. Анализ митохондрий и синаптических белков в аксонах и НМС личинок Drosophila. 51

2.2.3. Иммуногистохимические методы. 51

2.4. Методика анализа нейродегенерации в мозге мух. 52

2.5. Анализ продолжительности жизни мух разных групп. 52

2.6. Методы анализа поведения. 53

2.6.1. Анализ геотаксиса и локомоторной активности. 53

2.6.2. Анализ способности к обучению и формированию памяти. 53

2.7. Использование никотиновой кислоты для модуляции выживаемости

и процессов нейродегенерации в мозге Drosophila. 55

2.8. Статистическая обработка результатов. 55 3. Результаты и обсуждение 56

3.1. Анализ продолжительности жизни, нейродегенерации и поведения Drosophila при гиперэкспрессии в их нервных клетках генов человека: АРР, АРР с мутацией Swedish, пресенилина 1 (PS1) и его мутантных

форм, последовательности Ар42. 56

3.2. Анализ влияния гиперэкспрессии гешАРР человека на нейродегенерацию в мозге мух. 62

3.2.1. Анализ гибели холинергических нейронов при экспрессии гена

АРР человека. 62

3.2.2. Анализ гибели дофаминергичеких нейронов при экспрессии гена

АРР человека. 66

3.2.3. Исследование памяти и способности к обучению Drosophila при экспрессии гена АРР человека в холинергических и дофаминергических нейронах. 69

3.3. Анализ морфологических и функциональных нарушений в нейромышечных соединениях личинок Drosophila при экспрессии гена

PS1 человека и последовательности А(342. 72

3.3.1. Анализ морфологии нейромышечных соединений в личинках Drosophila при экспрессии PS1 человека и последовательности А(342. 74

3.3.2. Анализ активных зон в нейромышечных соединениях личинок Drosophila при экспрессии PS1 человека и последовательности А042. 77

3.3.3. Анализ распределения митохондрий в аксонах и нейромышечных соединениях личинок Drosophila при экспрессии PS1 человека и последовательности Ар42. 79

3.3.4. Анализ распределения пресинаптических белков в нейромышечных соединениях личинок Drosophila при экспрессии PS1 человека и последовательности Ар42. 83

3.4. Распределение пресинаптических белков в мозге Drosophila при экспрессии гена PS1 человека. 86

3.5. Исследование влияния никотиновой кислоты на выживаемость нейродегенеративные процессы в мозге и поведение Drosophila при экспрессии в их нервных клетках генов человека: АРР, АРР с мутацией Swedish и ВАСЕ. 90

3.5.1. Анализ влияния никотиновой кислоты на выживаемость мух. 90

3.5.2. Анализ влияния никотиновой кислоты на нейродегенеративные

процессы в мозге, память и способность ИгоБоркИа к обучению. 92

Заключение. 97

Выводы. 99

Список литературы. 100

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БА - болезнь Альцгеймера

Ар - амилоидный пептид р

АРР - белок предшественник амилоида

PS 1 - пресенилин 1

PS2 - пресенилин 2

BASE - бета-секретаза человека

т - белок тау

НМС - нейромышечные соединения

UAS - upstream activatiting srquence

GFP - зеленый флуоресцентный белок

ароЕ - аполипопротеин Е

ЦНС - центральная нервная система

АФК - активные формы кислорода

ЦО - цитохромоксидаза

PBS - фосфатно-солевой буфер

ChAT - ацетилхолинтрансфераза

нАцХР - никотиновые ацетилхолиновые рецепторы

sytl - синаптотагмин1

n-syb - синаптобревин

Введение

Актуальность проблемы. Болезнь Альцгеймера (БА) нейродегенеративное заболевание, одним из наиболее важных факторов риска развития которого является возраст. Показано, что с увеличением продолжительности жизни человека в развитых странах, а также с увеличением доли пожилых людей в популяции, БА стала самой распространенной формой среди деменций разного типа.

Б А - прогрессирующее старческое слабоумие, поражающего более 15% населения в возрасте старше 65 лет. Первым признаком заболевания является легкое нарушение памяти на текущие события, которое появляется приблизительно за 5 лет до манифестации деменции (Petersen et al., 1999). Это может означать, что при БА нейродегенеративные процессы в мозге, по-видимому, начинаются задолго до начала заболевания. Наиболее важными нейропатологическими признаками ■ этой болезни являются: нейродегенеративные изменения в структурах мозга, наличие внутриклеточных нейрофибриллярных клубков и внеклеточных отложений амилоидного пептида Р (АР) в виде «сенильных бляшек».

Хотя основные патологические характеристики БА хорошо известны, тем не менее, до настоящего времени еще не существует ясного понимания механизмов, лежащих в основе ее патогенеза. Важное значение придается гипотезе «амилоидного каскада» (Hardy, Selkoe, 2002), согласно которой к развитию БА приводит нарушение процессинга большого трансмембранного белка-предшественника' амилоида^(АРР), в результате чего образуется токсичный АР42 пептид, который вызывает каскад событий, приводящих через многочисленные промежуточные этапы к развитию БА. Этот каскад включает: гиперфосфорилирование белка тау (т), разрушение микротрубочек, нарушение ионного гомеостаза нейронов и функций митохондрий, активацию глии, а также когнитивную дисфункцию вследствие развивающейся синаптической недостаточности. Однако в последние годы

появилось много фактов, которые не укладываются в эту гипотезу. Кроме того, становится очевидной многофакторность данного заболевания. Нейродегенеративные изменения в мозге может вызвать сложное взаимодействие между генетическими предпосылками, экологическими факторами, старением, медиаторами воспаления и т.д. В настоящее время существует много различных гипотез патогенеза БА. Так, «тау-гипотеза» утверждает, что исходное нарушение при БА - это чрезмерное фосфорилирование белка тау, которое приводит к трансформации его нормальной структуры и образованию в итоге нейрофибриллярных клубков. Это, в свою очередь, вызывает дезинтеграцию микротрубочек, нарушение транспортной системы клетки, и приводит к ее гибели. Другие гипотезы этиологии и патогенеза БА предполагают нарушение процессов воспаления (Lucas et al., 2006), нарушение гомеостаза кальция (Bezprozvanny, Mattson, 2008), гормональные дисфункции (Hampl, Bicíková, 2010), дисфункцию иммунной системы (Fulop et al, 2013), окислительный стресс (Tajes et al., 2013), нарушения процессов клеточного цикла и т.д. Все они пытаются объяснить причины когнитивных нарушений и нейродегенеративных изменений при БА. Исследование участия в патогенезе БА генетических предпосылок, таких как мутации в генах АРР и пресенилинов, а так же изучение нарушения функций, кодируемых ими белков и их взаимодействия, значительно расширяет наши представления об этом заболевании и дает возможность сделать предположения о происхождении спорадических форм этого заболевания.

Между тем, актуальность исследования БА и создание терапевтических препаратов, способных приостановить, или по крайней мере замедлить течение заболевания, стоит в последнее время особенно остро в связи с тем, что популяция пожилых людей в большинстве развитых стран растет более чем в 2 раза быстрее по сравнению с общей численностью населения (Castellani et al.,2010). Нет сомнения, что понимание фундаментальных

процессов, лежащих в основе патогенеза этой болезни, будет иметь большое социальное значение.

Цель исследования. Целью работы было проанализировать роль трех важных «участников» патогенеза болезни Альцгеймера: АРР (белка-предшественника бета-амилиода), пресенилина 1 (PS1) и собственно амилоидного пептида (3 (Ар42) в развитии признаков этого заболевания с использованием в качестве модели трансгенных Drosophila melanogaster.

Задачи исследования. В связи с этой целью задачами работы было:

1. На трансгенных линиях Drosophila исследовать влияние экспрессии генов человека: АРР, АРР с мутацией Swedish, PSI, его мутантных форм, а так же последовательности Ар42 на продолжительность жизни, нейродегенеративные изменения мозга и поведение животных.

2. Провести анализ холинергических и дофаминергических нейронов при экспрессии гена АРР человека в мозге Drosophila , а также попытаться разделить влияние экспрессии АРР и эффектов собственно амилоидного пептида р.

3. Проанализировать влияние экспрессии гена PS1 человека и последовательности Ар42 на нейромышечные соединения (НМС) личинок Drosophila.

4. Провести исследование влияния экспрессии PS1 человека и последовательности Ар42 на распределение синаптических белков синаптотагмина и синаптобревина в мозге Drosophila.

5. Исследовать влияние никотиновой кислоты на выживаемость, нейродегенеративные процессы в мозге, а также на способность к обучению и память у мух с экспрессией в нервных клетках генов АРР и бета-секретазы (ВАСЕ) человека.

Научная новизна. В работе показано, что экспрессия гена АРР человека в мозге Drosophila вызывает нейродегенерацию холинергических и дофаминергических нейронов. Впервые исследовано влияние экспрессии гена PS1 человека и его мутантных форм на НМС личинок Drosophila - на

9

величину и форму синаптических бляшек (бутонов), число активных зон, распределение пресинаптических белков: синаптотагмина и синаптобревина, а также на количество и размеры кластеров митохондрий. Исследовано также влияние совместной экспрессии PS1 человека, его мутантных форм и последовательности Aß42 на эти показатели, а так же на распределение пресинаптических белков синаптотагмина и синаптобревина в грибовидном теле мозга Drosophila. Впервые показано влияние никотиновой кислоты на выживаемость и уровень нейродегенерации в мозге Drosophila .

Теоретическое и практическое значение работы. Исследование механизмов, лежащих в основе патогенеза БА, имеет большой теоретический и практический интерес, поскольку любые установленные факты патогенеза БА являются мишенью для разработки новых лекарств и лечебных мероприятий и могут иметь решающее значение для развития эффективной терапии. Кроме того подобные исследования способствуют поиску новых возможностей для диагностики заболевания на ранних стадиях, т.е. до клинических проявлений, т. к. помогают лучше понять, каким образом синаптические изменения возникают и преобразуются в мозге.

Личный вклад автора. Основная часть работы выполнена автором самостоятельно. Она включает в себя непосредственное получение экспериментальных данных, обработку и интерпретацию полученных результатов. Часть представленных результатов получены совместно с C.B. Саранцевой, A.A. Жук, С.И. Тимошенко, что отражено в совместных публикациях. Автор выражает благодарность за помощь в работе Г.А. Кислик и Е. Рябовой.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на следующих отечественных и международных конференциях, конгрессах и симпозиумах: Первом международном симпозиуме «Combinatorial Sciences in Biology, Chemistry, Catalysts and Materials» (Флоренция, 2007);

Международном Междисциплинарном конгрессе «Нейронауки для медицины и физиологии» (Судак, 2007, 2011, 2012, 2013); Третьей международной конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2007); Международном симпозиуме «Biological Motility. From fundamental achievements to nanotechnologies» (Пущино, 2008); Первой международной конференции «Дрозофила в экспериментальной генетике и биологии» (Харьков, 2008); Российском конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное» (Санкт-Петербург, 2010, 2012); Двадцать втором Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Волгоград, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 4 работы, опубликованы в журналах, включенных в список ВАК, 14 статей - в материалах российских и международных конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертация объемом 130 страниц включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты и обсуждение, (29 рисунков, 10 таблиц), заключение, выводы и список литературы, содержащий 265 источников.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Болезнь Альцгеймера, патогенез и предположительные механизмы возникновения.

БА - нейродегенеративное заболевание, которое является основной причиной деменции людей в пожилом и старческом возрасте (Mohandas et al, 2009). Оно характеризуется распадом высших корковых функций и ведет к слабоумию. У больных начинаются прогрессирующие нарушения памяти и расстройства ориентировки в пространстве при сохранении осознания своей психической несостоятельности (БМЭ, 1974, т. 1, стр. 322). Затем нарушается речь, логическое и абстрактное мышление, утрачивается способность к обучению, наблюдается утрата привычных навыков. В дальнейшем происходит полное разрушение личности. Прогноз заболевания неблагоприятен. Одним из наиболее важных факторов риска БА является возраст (Bachman et al, 1993). Старение связано с нарушением множества биохимических и физиологических процессов в организме, которые способны внести свой вклад в патологию БА. Это и нарушение церебрального метаболизма глюкозы, и увеличение количества свободных радикалов, и появление дистрофических нейритов в мозге (Shi et al., 2009). Однако нет никаких данных, кроме накопления агрегированных белков, которые объясняли бы связь нейродегенеративных заболеваний с возрастом. Это свидетельствует о том, что нам пока не известны настоящие причины нейродегенерации (Коо, Корап, 2004). Кроме старения факторами риска являются генетические изменения, аномальные иммунные и воспалительные реакции, экологические факторы, к которым можно отнести травмы, гормональную терапию, окислительный стресс (Hardy, 1997; Small, 1998). Женщины заболевают чаще мужчин в 5-8 раз.

1.1.1. Нейропатоморфологические признаки БА.

К основным нейропатологическим признакам БА относят внеклеточные отложения Ар, так называемые сенильные бляшки, число которых увеличивается с возрастом, внутриклеточные нейрофибриллярные клубки, дистрофические нейриты и амилоидные ангиопатии (Mohandas et al, 2009). Кроме того, БА сопровождается нейродегенерацией преимущественно в гиппокампе и коре головного мозга (Haass et al., 1992), а также дисфункцией синапсов, которая может предшествовать развитию общей патологии мозга. Многие исследователи в настоящее время считают, что именно синаптическая дисфункция или утрата синапсов являются основными причинами когнитивных нарушений при этом заболевании (Коо, Корап, 2004).

Образование нейрофибриллярных клубков обусловлено патологическим накоплением и агрегацией в телах нейронов тау-белка (т). В здоровых клетках этот белок присутствует ■ в малых концентрациях и участвует в полимеризации микротрубочек (Drechsel et al., 1992; Угрюмов, 2010). При болезни Альцгеймера происходит гиперфосфорилирование т, которое нарушает его функции. Агрегаты, как полагают, вызывают гибель нейронов. Однако, последние данные говорят о том, что токсичными могут быть и растворимые, и неправильно упакованные, и смешанные формы гиперфосфорилированного тау (Kopeikina et al., 2012). В то же время есть предположение, что нейрофибриллярные клубки являются только результатом массовой гибели нервных клеток (Mori et al., 1995). Возможно, они играют защитную роль или. являются следствием клеточной адаптации, связанной с возрастом (Castellani et al., 2010), однако могут быть связанными с нарушением аутофагии при БА (Cuervo, 2008).

Сенильные бляшки в основном состоят из нерастворимого агрегированного полипептида Ар (Selkoe, 2001). Ар является нормальным растворимым метаболитом в организме человека (Abramov et al., 2009) и

образуется в межклеточном пространстве вследствие протеолитического разрезания большого трансмембранного белка-предшественника амилоида (АРР) двумя протеазами: (3- и у-секретазами. Третья протеаза - а-секретаза участвует в неамилоидогенн