Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль генов пресенилина 1 и белка предшественника амилоида в дисфункции синапсов при болезни Альцгеймера.

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Роль генов пресенилина 1 и белка предшественника амилоида в дисфункции синапсов при болезни Альцгеймера."

На правах рукописи

005053230

САРАНЦЕВА Светлана Владимировна

РОЛЬ ГЕНОВ ПРЕСЕНИЛИНА 1 И БЕЛКА ПРЕДШЕСТВЕННИКА АМИЛОИДА В ДИСФУНКЦИИ СЩАПСОВ ПРИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург

2012 ПОНТ 2012

005053230

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Петербургский институт ядерной физики им. Б. П. Константинова».

Научный консультант: доктор биологических наук

Шварцман Александр Львович, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Петербургский институт ядерной физики им. Б. П. Константинова».

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАМН, профессор,

доктор медицинских наук Баранов Владислав Сергеевич, заведующий лабораторией НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта, Санкт-Петербург,

профессор, доктор биологических наук Евгеньев Михаил Борисович,

заведующий лабораторией Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта, Москва,

доктор биологических наук Камышев Николай Григорьевич, заведующий лабораторией Института физиологии им. И. П. Павлова РАН, Санкт-Петербург.

Ведущее учреждение: Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург.

Защита состоится в^часов на заседании диссертаци-

онного совета Д 212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан

Л&С&АЯУу/л. 2012г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук Л. А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Болезнь Альцгеймера (БА) представляет собой наиболее распространенную форму первичных нейродегенератив-ных заболеваний пожилого возраста, которая характеризуется потерей памяти, расстройством речи и распадом психической деятельности [Davis, Samuels, 1998]. Несмотря на огромный объем накопленных за последнее время данных, этиология и патогенез заболевания остаются неясными. Лекарственные препараты, применяемые в настоящее время для лечения БА, имеют ограниченный эффект, временно улучшая симптоматику, и не задерживают процесс развития заболевания.

Нейроморфология БА хорошо известна и характеризуется накоплением в мозге больных амилоид-бета-пептида (Aß) в составе экстраклеточных амилоидных отложений, агрегированного белка тау в составе внутриклеточных нейрофибриллярных клубков, дисфункцией и дегенерацией синапсов и гибелью нейронов. Однако первые проявления симптомов заболевания, связанные с потерей памяти и нарушением когнитивных функций, происходят при отсутствии каких-либо признаков амилоидоза или нейрофибриллярной патологии и сопровождаются лишь значительным уменьшением синаптической плотности [Terry, 1992, 2000]. Даже на более поздних стадиях БА потеря синапсов часто отмечается при отсутствии гибели нейронов, что указывает на первичное поражение синапсов при развитии заболевания [Masliah et al., 1994].

Доминирующей гипотезой развития БА является гипотеза амилоидного каскада, в основе которой лежит положение о том, что повышенная секреция нейротоксичных форм Aß, являющегося главным компонентом амилоидных отложений в мозге больных, обусловливает всю цепочку патологических изменений, приводящих в конечном счете к амилоидозу, нейродегенерации, гибели нейронов и развитию деменции [Hardy, Higgins, 1992; Hardy, Selkoe, 2002]. Главными доказательствами этой гипотезы являются генетические данные о том, что семейные формы БА (СБА) обусловлены мутациями в генах белков, непосредственно участвующих в генерации Aß: в гене белка предшественника Aß, получившего название АРР (amyloid precursor protein); гене пресенилина 1 (PSI) и гене пресени-лина 2 (PS2) [Hardy, Selkoe, 2002].

Несмотря на широкое признание гипотезы амилоидного каскада, первые сомнения в ее универсальном характере вызвали сообщения о том, что у больных в ранней фазе СБА нарушения памяти и дисфункция синапсов происходят при отсутствии амилоидогенеза или нейрофибриллярной дегенерации и предшествуют гибели нейронов [Masliah et al., 1994]. Аналогичные результаты были получены и у трансгенных мышей, несущих СБА-мутации в генах АРР и PSI [Oddo et al., 2003]. И, наконец, изу-

чение больных с наследственными формами БА продемонстрировало, что мутации в PS1 и АРР не обязательно ведут к повышению тотального уровня Ар, а, напротив, могут приводить к его снижению [Stenh et al., 2002; Bentahir et al., 2006; Kumar-Singh et al., 2006]. При этом в ряде случаев отмечалось изменение отношения секретируемого Ар, содержащего 40 и 42 аминокислоты (Ар40 и Ар42 соответственно) [Bentahir et al., 2006; Kumar-Singh et al., 2006]. Эти результаты однозначно показывают, что для ясного понимания патогенеза СБА необходимо учитывать не только изменение секреции АР, но и возможные нарушения клеточных функций АРР и пресенилинов.

Цели и задачи исследования. Основная цель диссертационной работы - выяснение роли генов пресенилина 1 и АРР в развитии синаптиче-ской патологии при БА. В работе поставлены следующие задачи:

1) определить клеточную локализацию PS1 в поляризованных клетках с высоким уровнем экспрессии эндогенного PS1 и исследовать его роль в установлении межклеточных контактов нейронов;

2) определить эффект мутаций в гене PS1 на образование межклеточных контактов. Выявить возможные связи между нарушением нормальных функций PS1 (участие в клеточной адгезии) и дисфункцией синапсов;

3) провести анализ структурных, морфологических и функциональных изменений в синапсах при гиперэкспрессии гена АРР человека в Drosophila melanogaster. Создать модель БА на Drosophila melanogaster, позволяющую разделить цитотоксические эффекты АРР и АР;

4) провести анализ нейропротекторных свойств пептидов-миметиков аполипопротеина Е на модели БА Drosophila melanogaster.

Научная новизна работы. Методом высокоразрешающей сканирующей иммуноэлектронной микроскопии и конфокальной микроскопии показано, что PS1 участвует в процессах клеточной адгезии. Впервые показано, что в линиях нейронов, полученных от мышей с нокаутом гена PS1, происходит дегенерация конусов роста (КР) и уменьшение числа синапсов. Впервые показано, что мутации в гене PSJ снижают накопление PS1 в межклеточных контактах и ведут к нарушениям клеточной адгезии. Впервые разработана модель БА на Drosophila melanogaster, позволяющая разделить цитотоксические эффекты АРР и Ар. Впервые показано, что экспрессия АРР может приводить к структурным и функциональным изменениям в синапсах, нейродегенерации, экспрессии синаптических белков и когнитивным нарушениям независимо от образования Ар. Впервые показано, что пептиды-миметики аполипопротеина Е уменьшают нейро-дегенерацию и восстанавливают когнитивные функции животных на модели БА в Drosophila melanogaster.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные в настоящей работе данные имеют фундаментальное значение для понимания патогенеза наследственных форм БА. Полученные результаты расширяют представления о роли генов АРР и PS1 в дисфункции синапсов при БА. Проведенные исследования представляют теоретическую базу и адекватную экспериментальную модель для исследования роли АРР и PS1 в проявлении и развитии синаптических нарушений при БА. Итоги работы представляют несомненный интерес для практической медицины. Результаты проведенных исследований показывают, что миметики аполипопро-теина Е являются перспективными агентами для разработки лекарственной терапии БА. Полученные результаты могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических и медицинских специальностей.

Основные положения, выносимые на защиту:

• клеточные функции PS1 и природа дисфункций, вызываемых мутациями в этом гене при наследственных формах БА, не исчерпываются участием PS1 в гамма-секретазном комплексе. PS1 вовлечен в процессы клеточной адгезии, формирование и образование синаптических контактов;

• нокаут гена PS1 может приводить к нарушениям в образовании синапсов;

• экспрессия гена АРР человека и его мутантной формы APP-Swedish в нервных клетках Drosophila вызывает изменение синаптогенеза, проявляющееся в уменьшении содержания синаптических белков в мозге. Этот эффект коррелирует с нарушением у животных способности к обучению и запоминанию. Экспрессия АРР приводит к структурным и функциональным нарушениям синапсов нейромышечных контактов личинок (НМК) Drosophila. Наблюдаемые синаптические нарушения предшествуют нейродегенерации и обусловлены экспрессией гена АРР независимо от образования Aß;

• пептиды-миметики аполипопротеина Е, созданные на основе его ре-цептор-связывающего домена, эффективно подавляют нейропатологи-ческие процессы, вызываемые экспрессией гена АРР человека на модели БА Drosophila melanogaster. Эти пептиды могут быть использованы для создания нейропротекторных лекарственных препаратов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на следующих отечественных и международных конференциях и симпозиумах: второй Международной конференции «Биотехнология - биомедицина - окружающая среда» (Пущино, 2005); Всероссийской конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2005); Европейской конференции по нейропсихофармакологи (Амстердам, 2005); третьей Международной конференции «Наука и бизнес» (Пущино, 2006); Международном симпозиуме «Биологическая подвижность: фундаментальные исследования и практика» (Пущино, 2006); Международном симпозиуме

«Biological Motility: Basic Research and Practice» (Пущино, 2006); второй научной конференции «Молекулярная генетика, биофизика и медицина» (Бреслеровские чтения - II, Санкт-Петербург, 2006); первом Международном симпозиуме «Combinatorial Sciences in Biology, Chemistry, Catalysts and Materials» (Флоренция, 2007); Европейской конференции по генетике человека (Париж, 2007; Гетеборг, 2010; Амстердам, 2011); Международной конференции «Нейронауки для медицины и физиологии» (Судак 2007, 2008, 2011); третьей Международной конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2007); Международном симпозиуме «Biological Motility: Achievements and Perspectives» (Пущино, 2008); Российском конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное» (Санкт-Петербург, 2010); Международном симпозиуме «Biological Motility. From Fundamental Achievements to Nanotechnologies» (Пущино, 2010); Международной конференции «Дрозофила в экспериментальной генетике и биологии» (Харьков, 2008; Одесса, 2010; Киев, 2012); XXI съезде физиологического общества им. И. П. Павлова (Калуга, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 38 печатных работ, в том числе 14 оригинальных работ, опубликованных в журналах, включенных в список ВАК, две главы в коллективной монографии и 10 статей в сборниках и материалах российских и международных конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертация объемом 234 страницы включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты и обсуждение, 55 рисунков, 10 таблиц, заключение, выводы и список литературы, включающий 496 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В работе использованы следующие клеточные культуры:

Т-лимфоциты человека (Jurkat-клетки) и клон FH-CRC Е6-1 были получены в компании АТСС (American Type Culture Collection). Культуры нейронов, полученные от мышей с нокаутом гена PS1, были любезно предоставлены доктором Де Струпером и доктором Сафтигом (Dr. В. De Strooper and Dr. P. Saftig, Experimental Genetics Group, Center for Human Genetics, Campus Gasthuisberg, Belgium). L-фибробласты мыши и эпителиальные клетки человека НЕр 2 были получены в компании АТСС (American Type Culture Collection).

В работе использованы следующие линии Drosophila melanogasíer: UAS-APP, содержит ген АРР человека (далее в тексте АРР); UAS-APP-Swedish, содержит ген АРР с мутацией Swedish (670K3N,

671M3L), приводящей к наследственной форме БА (далее в тексте APP-Sw)\ UAS-APPACT (укороченная форма АРР, кодирует белок без внутриклеточного фрагмента); UAS-APPANT (укороченная форма АРР, кодирует белок без экстраклеточного фрагмента); UAS-BACE, содержит ВАСЕ человека (далее в тексте ВАСЕ).

Экспрессия трансгенов была проведена в системе UAS-GAL4 [Brand and Perrimon, 1993]. Были использованы следующие активаторы транскрипции: GAL4-elavcI55 - экспрессия в нервных клетках Drosophila (далее в тексте elav)\ GAL4-D42 (далее в тексте D42) - экспрессия в моторных нейронах личинок третьего возраста Drosophila melanogaster.

Для анализа распределения синаптических белков в мозге мух были использованы линии: GAL4-elavclss,UAS-syt-eGFP (далее в тексте sytl), содержащая последовательность elav, последовательность гена синаптотагми-на 1 (synaptotagmin 1) и последовательность, кодирующую зеленый флуоресцентный белок (GFP) [Zhang et al., 2002]; GAL4-elavc'",UAS-n-syb-GFP (далее в тексте syb), несущая последовательность elav, вставку гена нейро-нагтьного синаптобревина (n-synaptobrevin) и последовательность, кодирующую зеленый флуоресцентный белок (GFP) [Zhang et al., 2002].

Для изучения морфологии нейромышечных соединений Drosophila melanogaster использовали линию UAS-CD8-GFP (далее в тексте CDS), мембраны нервных клеток мух в которой мечены GFP.

Для визуализации и количественного анализа митохондрий в нейромышечных соединениях была использована линия UAS-mito-GFP, мембраны митохондрий мух в которой мечены GFP.

Линии получены из коллекции Drosophila Bloomington Stock Center. Во время проведения экспериментов мух содержали на стандартной дрожжевой среде при температуре 25 или 29 °С и 12-часовом световом дне. В работе использованы методы:

• высокоразрешающей сканирующей иммуноэлектронной микроскопии, конфокальной микроскопии, световой микроскопии;

• иммуногистохимии и иммунофлуоресценции;

• цитологические при приготовлении парафиновых срезов головного мозга и нейромышечных соединений личинок Drosophila;

• физиологические при анализе экзо- и эндоцитоза в НМК личинок;

• ПЦР в режиме реального времени, иммунопреципитации, Вестерн-блота гибрдизации, клонирования фрагментов ДНК, трансфекции клеток, экдизон-индуцибельной экспрессионной системы (Invitrogen) для регулируемой экспрессии GFP-PS1 кДНК;

• синтеза пептидов и разработанный нами метод инъекций меченых пептидов в абдомен мух с последующим их выявлением в мозге.

Результаты и обсуждение

Локализация АРР и PS1 в культуре эмбриональных нейронов

В настоящее время показано, что появление ранних клинических симптомов БА происходит при отсутствии каких-либо признаков амилои-доза или нейрофибриллярной дегенерации и коррелирует лишь с потерей или дисфункцией синапсов [Walsh, Selkoe, 2004]. Для понимания этого феномена необходимо ясно представлять по крайней мере функции двух белков АРР и PS1, мутации в генах которых приводят к подавляющему большинству СБА. Как правило, функции белков отражены в особенностях их клеточной локализации, и поэтому в наших экспериментах мы в первую очередь исследовали особенности клеточного распределения АРР и PS1 в нейронах. Локализацию АРР и PS1 в культурах эмбриональных нейронов на покрытых L-полилизином стеклах проводили в присутствии 10 % сыворотки крови теленка. Среда не изменялась в течение всего периода культивирования, вплоть до фиксации и окраски. Антитела к АРР или PS1 выявляли более 90% клеток, демонстрируя интенсивное флуоресцентное окрашивание сомы, коротких и длинных нейритов и КР (рис. 1А, Б).

Эти результаты согласуются с представленными ранее результатами для АРР и PSI [Sabo et al, 2003; Uemura et al., 2007; Parent and Thinakaran, 2010]. Однако в нашей работе значительные различия наблюдались в локализации этих белков на поверхности клеток (рис. 1В, Г). Если PS1 концентрировался лишь на поверхности КР, то АРР не был обнаружен на поверхности КР, а был равномерно распределен на поверхности сомы и нейритов. Эти особенности в распределении двух белков указывают на принципиальное различие в их клеточных функциях.

Рис. 1. Иммунолокализация АРР и PS1 в культуре 15-дневных кортикальных нейронов мыши.

A, Б - иммунофлуоресцентная микроскопия, масштаб - 20 мкм.

B, Г - сканирующая электронная микроскопия, масштаб - 13,9 мкм, стрелками указаны КР. В - в левом верхнем углу выделено изображение конуса роста, Г - в правом верхнем углу выделено изображение части нейрита

Мы проверили, не является ли поверхностная локализация АРР и PS1 отражением их внутриклеточного распределения. Конфокальная микроскопия демонстрировала стандартное специфическое сегментальное флуоресцентное окрашивание как АРР в нейритах, так и PS1 в KP в пер-меабилизированных клетках (рис. 2). Подобное распределение указывает на образование микрокластеров этих белков в структурных компартментах клеток и на их связь с цитоскелетом [Ferreira et al., 1993; Sabo et al., 2003].

Рис. 2. Иммунолока.пизацня PSI в KP и АРР в нейритах в культивируемых кортикальных нейронах мыши. А -сканирующая микроскопия, масштаб -30,4 мкм, большой стрелкой указан исследуемый KP, малой стрелкой — исследуемый нейрит. Б, Г - выделенные изображения: Б — KP, Г — нейрита. В, Д - конфокальная имму-номпкроскопия: В - KP, PSI, Д -нейрит, АРР

Спустя 3-4 дня после начала культивирования в эмбриональных культурах нейронов происходило образование межнейронных синапсов, плотность которых возрастала в течение 14 дней культивирования. Для оценки синаптической плотности в качестве маркера в наших экспериментах мы избрали белок синаптических везикул синаптофизин, который идентифицирует пресинаптический терминал и, по сути, определяет плотность морфологических синапсов в культуре. В культуре нейронов синаптофизин концентрируется в специальных кластерах, которые определяют положение синаптиче-ского контакта [Sabo et al., 2003; Masliah et al, 2001, 2006]. Аналогичное окрашивание было показано ранее для многих белков пресинаптического терминала [Masliah et al., 2001]. На рис. 3 показано совместное окрашивание АРР, PS1 и синаптофизина, доказывающее участие АРР и PS1 в синаптических контактах.

Рис. 3. Конфокальная микроскопия: АРР и PS1 в синапсах в культивируемых кортикальных нейронах мыши. АРР - иммунофлуорсснентная окраска АРР, Syn — им-мунофлуореснснтная окраска синаптофизина, PS1 - иммунофлуорсснентная окраска PS1, АРР + Syn - колока-лизация АРР и Syn, PSI + Syn - колокализация PSI и Syn. Стрелками показаны сайты колокализации

Обсуждая возможные функции АРР и PS1, мы обращаем внимание на принципиальное различие в локализации этих белков на поверхности нейронов. Действительно, характер распределения АРР на нейронах (рис. 1, 2) и описанное в литературе взаимодействие с интегринами на поверхности аксонов и дендритов [Yamazaki et al., 1997] дают основание предполагать, что АРР в фокальных участках адгезии участвует во взаимодействии нейронов с клеточным матриксом. Напротив, концентрация PS1 на поверхности мотильных элементов (рис. 1) предполагает непосредственное участие этого белка в межклеточных взаимодействиях.

Анализ конусов роста и структуры их цитоскелета в культуре эмбриональных нейронов мыши с нокаутом гена пресенилина 1

Предполагая, что анализ морфологии КР представляет значительный интерес в понимании роли PS1 в межнейронных контактах, мы провели сравнительное исследование морфологии КР в нейронных культурах мышей дикого типа и мышей с нокаутом гена PS1.

У мышей с нокаутом гена PS1 в эмбриогенезе наблюдаются выраженные скелетные аномалии, кортикальная дисплазия, нарушение миграции нейронов и гибель клеток Кахаля - Ретциуса в маргинальной зоне коры мозга. Хотя эти нарушения летальны, эмбриональные PS1(-/-)-нейроны могут быть культивированы и использованы для исследования [De Strooper et al., 1998].

При анализе PS1(+/+)- и />5'7(-/-/)-нейронов методом сканирующей электронной микроскопии мы не отмечали каких-либо выраженных различий в форме клеток или длине нейритов. Лишь для некоторых Р5/(''-/-,)-нейронов было замечено незначительное увеличение числа ответвлений коротких нейритов. Наибольшие различия для исследуемых культур были отмечены для КР (табл. 1).

Таблиг/а 1

Характеристика конусов роста PS !(+/+)- и PS1(-/-)-нейронов

Нейроны Конусы роста (х < 10 мкм") Конусы роста (10<х< 100 мкм") Конусы роста (х> 100 мкм2) Конусы роста Дегенерация Коллапс

PSK+/+) 8 (9,7 %) 31 (37,8%) 37 (45,1 %) 6 (7,3 %)

PS1(-/-) 20 (22,7 %) 17(19,3 %) 20 (22,7 %) 31 (35,2%)

* Для сравнения параметров КР исследовали по 60 нейронов, полученных из PSI(+/+)- и PS1 (-/-^-культур; х - площадь КР (расстояние от «шейки» КР до г раницы филоподнй).

.Р57(+/+,)-нейроны характеризовались значительно более высокой долей КР с размерами 10 < х < 100 мкм2 и х > 100 мкм2. Для Р8(-/-)-

нейронов, напротив, часто встречались КР с размерами х < 10 мкм2. Морфология КР варьировалась в зависимости от их размера. Как правило, КР с площадью х > 100 мкм2 характеризовались выраженной адгезией на поверхности матрикса и присутствием значительных по размеру ламелляр-ных радиальных структур с множеством длинных филоподий. КР с площадью х < 10 мкм2 часто не имели какой-либо выраженной формы и представляли собой небольшие утолщения, не имеющие четких филоподий. В то же время на разветвленных нейритах обнаруживались сравнительно небольшие КР, имеющие, однако, значительное число филоподий.

Через 3-4 дня роста нейронов значительная часть КР в PS1 (-/-)-культурах подвергалась спонтанной дегенерации, включающей как центральную зону, так и ламеллиподии и филоподии. Эти результаты указывают, что PS1 является одним из ключевых белков КР и вовлечен в процессы формирования и роста нейритов.

Так как ранее было показано, что PS1 связан с актиновым цитоске-летом клеток [Singh et al., 2001], мы предположили, что нарушение миграции эмбриональных нейронов обусловлено аномалиями цитоскелета КР. Поэтому мы исследовали структуру КР в культурах первичных PS1 (-/—)-нейронов. Как и ожидалось, в этих КР актиновые филаменты цитоскелета не образовывали радиальных элементов, а представляли аморфный материал, расположенный на границе ламеллиподиума и в различных областях КР (рис. 4). Эти данные играют важную роль в понимании роли PS1 в си-наптогенезе. Действительно, хотя в настоящее время не остается сомнений, что PS] играет значительную роль в дифференцировке нейронов, его функции в образовании нейронных сетей остаются недостаточно изученными. КР, интегральной частью которых является PS1, непосредственно вовлечены в ветвление аксонов и дендритов — процессов, лежащих в основе образования нейронных сетей и синаптических контактов.

Рис. 4 Структура актиновых фила,ментов КР в культурах ™><*'*>PS !(+/+) и PS1(-/-) эмбрио-

нальных нейронов (окраска ра-домин-фаллоиднн). Верхняя нацель - PS ¡(+/+J-H ей ро н ы, нижняя панель - PS1(-■/-)-psi(-/-/нейроны. Над каждой панелью

указаны размеры КР

В целом наши данные указывают, что взаимодействие PS1 с цитоске-летом нейронов представляется ключевым процессом в образовании и поддержании структуры КР.

Анализ числа синапсов в культуре эмбриональных нейронов мыши с нокаутом гена пресенилина 1

Если наша гипотеза о том, что PS 1 принимает участие в образовании синапсов верна, то мы вправе были ожидать, что в культурах эмбриональных нейронов PS1(-/-), полученных от мышей с нокаутом гена PS1, плотность синапсов будет ниже, чем в культурах нейронов, полученных от мышей дикого типа PS1 (+/+). Для определения общей плотности синапсов использовали стандартную иммунофлуоресцентную окраску преси-наптического белка синаптофизина. И действительно, для единичного нейрона в PS 1 (-/-)-культуре отмечали почти трехкратное снижение числа пресинаптических терминалов, окрашиваемых антителами к синаптофизи-ну (PS1(+/+)PS1 (-/-) -78 ± 22 и PS1(-/-) -24 ± 16 соответственно). Следует отметить, что в этих экспериментах мы можем говорить лишь о плотности «морфологических синапсов», которые, по сути, отражают присутствие синаптических контактов.

Для получения независимого доказательства участия PS1 в образовании синапсов эмбриональные нейроны были трансфецированы кДНК PS1, включающей последовательность, кодирующую зеленый флуоресцентный белок (GFP). Трансфекция GFP-PS1 кДНК была проведена с помощью FuGENE™6 с такой плотностью посева, чтобы можно было выделить единичный нейрон. Были трансфецированы 3- и 7-дневные нейроны (рис. 5А, Б), которые сохраняли флуоресцентную метку в течение последующих двух недель культивирования. В этот период для «зрелых» нейронов отмечалось наличие разветвленной синаптической сети. На рис. 5В представлены результаты иммунофлуоресцентной окраски белка синаптофизина (сайты возможных синаптических контактов показаны стрелками). Поскольку трансфекция нейронов была проведена при уже достаточной плотности сформированных синапсов, эти результаты по меньшей мере могут означать транспорт GFP-PS1 к пресинаптическому терминалу.

2

ш FMiMP'J

ШЁ. Ш г*

kDa < з

130 — :N-CatMFL

r

37 ■« N CadfCTF

Рис. 5. Трансфскция С^Р-И кДНК в эмбриональные кортикальные нейроны мыши.

А - трансфекция 677,-/,Л7 кДНК в 3-дневный нейрон. Б - трансфскция СГР-Р81 кДНК в 7-днсвный нейрон. 1 - световая микроскопия трансфецированных нейронов, 2 - наложение изображений световой и флуоресцентной микроскопии трансфецированных нейронов.

В - колокализация СРР-Р81 и синап-тофнзина в синапсах трансфецированных нейронов, масштаб -20 мкм, стрелками показаны сайты колокализации.

Г - образование комплексов вГР-Р81-1М-кадхерин в трансфецированных нейронах. Вестерн-блот с антителами к 1Ч-кадхерину: 1 - 14-кадхерин в экстрактах трансфецированных нейронов, 2 - иммунонре-ципитация экстрактов нейронов с СРР-аптитслами

Ранее было доказано, что один из основных белков нейроадгезии, N -кадхерин, образует комплексы с PS1 в синаптических контактах [Parisiadou et al., 2004; Uemura et al., 2007]. При этом PSI, являясь у-секретазой, вызывает частичный протеолиз N-кадхерина (отщепление С-концевого фрагмента). В наших экспериментах GFP-иммунопреципитаты экстрактов трансфецированных нейронов содержали N-кадхерин, что доказывало участие GFP-PS1 в образовании синаптических контактов (рис. 5Г).

Анализ эффекта мутаций в гене пресенилина 1, наблюдаемых при семейных формах болезни Альцгеймера, в трансфецированиых фибробластах

Для доказательства роли PS1 в межклеточных взаимодействиях был использован классический метод идентификации белков клеточной адгезии, разработанный Эдельманом [Edelman et al., 1987]. В основе метода лежит наблюдение, что L-фибробласты, дефектные по межклеточным взаимодействиям, после трансфскции кДНК исследуемого белка, участвующего в клеточной адгезии, образовывают межклеточные контакты и клеточные кластеры различного размера. В наших экспериментах такой кДНК служила GFP-PS1 кДНК. Ожидалось, что после трансфекции GFP-PS1 кДНК дикого типа L-фибробласты будут образовывать межклеточные контакты. При этом, если мутации в PS1 нарушают его функции в клеточной адгезии, то мы были вправе ожидать нарушение межклеточного взаимодействия и резкое снижение количества агрегированных клеток.

Влияние мутаций в PS1 на клеточную адгезию исследовали методом конфокальной микроскопии в L-клетках с экспрессией GFP-PS1 дикого типа и его мутантных аналогов. В отсутствие индуктора - понастерона А не наблюдалось флуоресценции GFP, свидетельствующей об экспрессии GFP-PS1. При этом L-фибробласты не образовывали клеточных кластеров. Напротив, клетки, экспрессирующие как GFP-PS1 дикого типа, так и мутантные формы, спустя 8-12 часов после индукции формировали небольшие кластеры флуоресцентных клеток. В случае экспрессии GFP-PS1 дикого типа кластеры были большего размера и характеризовались в основном присутствием полигональных клеток с четкой границей латеральных доменов контактирующих клеток. Флуоресцентный сигнал определялся в основном в межклеточных контактах. Экспрессия GFP-PS1 с мутациями, приводящими к аминокислотным заменам G209V и E318G, и экспрессия GFP-PS1 N288, кодирующая укороченную форму PS1, также вызывала агрегацию клеток и образование клеточных кластеров. Однако их морфология была отличной от наблюдаемой при экспрессии GFP-PS1 дикого типа. Клеточные кластеры были меньшего размера, содержали значительное число клеток неполигональной формы, GFP-флуоресценция в основном была локализована в цитоплазме. Количественная оценка эффекта мутаций в PS1 на агрегацию трансфецированиых фибробластов была проведена по измерению числа агрегатов и единичных клеток в суспензии. Через 16 часов после индукции экспрессии GFP-PS1 наблюдалась значительная агрегация клеток, экспрессирующих GFP-PS1 дикого типа, по сравнению с клетками, экспрессирующими мутанты G209V, E318G или N288 (рис. 6).

Рис. 6. Количественная оценка агрегации L-клеток. ИТ - нетрансфецированные L-клетки; ДТ - L-клетки с экспрессией GFP-PS1 дикого типа; G209V, E318G и N288 - L-клетки с экспрессией мутантных форм GFP-PS1. Статистически значимые различия

в агрегации определяли согласно критерию Стыодснта (Student's Mest, р)

Мы также исследовали распределение GFP-PS1 и его мутантных аналогов в трансфецированных эпителиальных клетках человека НЕр 2 (рис. 7), в которых внутриклеточное распределение мембранных белков происходит по механизмам, наблюдаемым в нейронах [Dotti, Simons, 1990].

Рис. 7. Иммунолокализация GFP-PS1 в трансфецированных эпителиальных клетках НЕр 2, масштаб - 50 мкм. А - экспрессия GFP-PS1 дикого типа. Б - экспрессия GFP-PS1 E318G. В - экспрессия GFP-PS1 G209V. Г - экспрессия GFP-PS1 N288

В наших экспериментах GFP-PS1 дикого типа концентрировался в межклеточных контактах плазматической мембраны (рис. 7А), в то время как GFP-PS1, содержащий мутации G209V, E319G или N288, был локализован в основном в цитоплазме клеток (рис. 7Б-Г).

Проведенные эксперименты показали, что межклеточные взаимодействия происходят при концентрации PS1 в межклеточных контактах. Мутации, вызывающие СБА, подавляют взаимодействие трансфецированных клеток.

р=р.ОЗ

р-о.ооу

р=0.|)05 / /

к

i 40

20 '

1

Роль гена белка предшественника амилоида в сипаптогенезе

Моделирование нейропатологии болезни Альцгеймера в Drosophila melanogaster

В большинстве моделей БА, созданных на млекопитающих, гиперэкспрессия АРР, а также его совместная экспрессия с PS1 или PS2 приводят к увеличению уровня Ар и накоплению олигомеров Ар, которые могут вызывать синаптические нарушения и дефицит когнитивных функций [Walsh, Selkoe, 2004]. Хотя гиперэкспрессия АРР и отложения Ар в трансгенных животных не полностью воспроизводят все аспекты БА, эти модели создают реальные возможности для изучения нейропатологии, связанной с БА. В частности, они помогают объяснить вклад АРР и Ар в патогенез СБА. И в этой связи Drosophila melanogaster имеет ряд преимуществ перед другими модельными объектами, поскольку позволяет дифференцировать эффекты АРР и Ар. Во-первых, ген APPL, ортолог АРР у Drosophila, не содержит региона, кодирующего Ар. Во-вторых, у Drosophila представлены все компоненты белкового комплекса, ответственного за активность у-секретазы, но отсутствует или является необычайно низкой активность p-секретазы. Поэтому для генерации Ар необходимы двойные трансгены, экспрессирующие ВАСЕ и полноразмерный АРР человека. Это обстоятельство дает возможность разделения эффектов АРР и Ар, при котором достаточно сравнить трансгены АРР, содержащие и не содержащие ВАСЕ. При замене гена АРР дикого типа на АРР с мутацией, вызывающей СБА, представляется возможность исследовать эффект мутации. Таким образом, исследования различных ДРР-трансгенов на Drosophila позволяют дифференцировать эффекты АРР и Ар и ответить на вопрос о природе основных патогенетических механизмов БА. Следует сказать, что разделение цитотоксических эффектов Ар и АРР имеет первостепенное значение для выработки подходов в терапевтическом лечении БА.

Для экспрессии гена АРР человека в нервных клетках Drosophila мы использовали бинарную дрожжевую систему UAS-Gal4 [Brand and Perrimon, 1993]. Мухи, несущие в геноме трансген UAS-АРР, в состав которого входит кДНК гена АРР, расположенная за последовательностью UAS, были скрещены с мухами, несущими трансген GAL4-elavc155, который запускает транскрипцию в нервных клетках. Как было показано, в линии elav;APP уровень экспрессии АРР выше, чем у его ортолога [Greeve et al., 2004; Merdes et al., 2004]. Использование антител 22C11, распознающих экстраклеточный N-домен АРР, выявило образование полноразмерного АРР в линиях с экспрессией АРР (рис. 8А). Совместная экспрессия АРР и ВАСЕ приводила к уменьшению количества полноразмерных молекул АРР и образованию мономеров и SDS-стабильных олигомеров

Ар, которые были выявлены в белковых экстрактах мозга 2-дневных мух методом иммунопреципитации антителами 4в8. В линиях с экспрессией только АРР не детектировалось образование мономеров и олигомеров Ар. С возрастом происходило отложение агрегатов Ар в мозге мух, которое мы детектировали с 15-го дня их жизни методом иммуногистохимии на парафиновых срезах. Агрегаты Ар откладывались в мозге мух в районах расположения нейронов и глиальных клеток только в двойных трансгенах с совместной экспрессией АРР и ВАСЕ (рис. 8Б).

Рис. 8. Экспрессия АРР человека в нервных клетках Drosopliila melanogaster. А - определение образования АРР и Ар методом Вестерн-блота. Для определения АРР были использованы моноклинальные антитела 22С11; А|1 был иммуноире-ципннирован с моноклинальными антителами 4G8. Блоты были сканированы, и относительные количества белка на каждой дорожке были определены с помощью программы Image J. Б - отложения Ар в мозге Drosopliila. Возраст мух - 15 дней. Иммуногистохимии с антителами 4G8. Стрелками показаны поля увеличения. Масш таб — 50 мкм (а, б), 10 мкм (в, г). В - определение амилоидных отложений в мозге Drosopliila. Стрелками показаны амилоидные отложения. Окраска тнофлавином S. Масштаб - 100 мкм (левая колонка), 5 мкм (правая колонка)

Чтобы подтвердить, что наблюдаемые отложения имеют амилоидную природу, мы окрасили препараты флуоресцентным красителем тиоф-лавином S, специфически окрашивающим амилоидные структуры. На 20-й день жизни мух наблюдали отложения, расположенные между клетками только в линиях с совместной экспрессией АРР и ВАСЕ (рис. 8В).

Анализ распределения синаптических белков в мозге мух с экспрессией АРР человека

Мы исследовали распределение синаптических белков синаптотаг-мина 1 (synaptotagmin 1, sytl) и синаптобревина (n-synaptobrevin, n-syb) в линиях с экспрессией АРР. Выбор в качестве маркера синаптотагмина 1 был обусловлен теми обстоятельствами, что его содержание прямо коррелирует как с образованием синаптических везикул, так и с плотностью зрелых синапсов у млекопитающих и насекомых и резко падает в мозге больных со спорадической и с наследственными формами БА [Littleton et al., 1993; Masliah et al., 2001; Yao et al., 2005]. Синаптобревин, один из основных пресинаптических белков, является связующим звеном между си-наптическими везикулами и компонентами цитоскелета. Таким образом, распределение этого белка может демонстрировать целостность цитоскелета и указывать на возможные нарушения в синаптической функции.

Мы использовали трансгенные линии Drosophila melanogaster с экспрессией в нервных клетках АРР человека, АРР с мутацией Swedish, укороченные формы АРР {АРPANT и АРРАСТ) и пресинаптические маркеры синаптотагмин и синаптобревин, включающие последовательность зеленого флуоресцентного белка.

При экспрессии sytl и syb в нервных клетках мух трансгенных линий Drosophila они обнаруживались преимущественно в составе нейропиля, обогащенного нейрональными синапсами, а именно в антеннальных долях мозга (АД, antennal lobes), включающих обонятельные центры, и грибовидных телах (ГТ, mushroom bodies), отвечающих за ассоциативное обучение, память и поведение. Об изменениях синаптогенеза судили по изменению на конфокальных срезах интенсивности флуоресценции GFP и ее распределению в АД и долях (а, р, Р' и у) ГТ мозга Drosophila. Оценка интенсивности флуоресценции была проведена на микрофотографиях конфокальных срезов в программе Image J (version 1.38а for Windows).

На второй день жизни имаго интенсивность сигнала в контрольной линии sytl практически одинакова в ГТ и АД (рис. 9). Однако в мозге мух этого возраста с экспрессией АРР, APP-Swedish и APPANT наблюдается значительное понижение сигнала в структурах ГТ. Несмотря на уменьшение сигнала в Р- и а-долях, в линии АРРАСТ оно статистически достоверно не отличается от контроля. В АД 2-дневных мух статистически достоверное уменьшение сигнала характерно только для линии APP-Swedish.

У 30-дневных мух наблюдалось снижение интенсивности флуоресцентного сигнала в линии sytl как в ГТ, так и в АД (рис. 9). Оно было также характерно и для линий с экспрессией АРР и его фрагментов. Однако эффект носил менее выраженный характер по сравнению с наблюдаемым у 2-дневных мух. В то же время следует отметить, что, как и в варианте опыта с 2-дневными мухами, наибольшее уменьшение сигнала было ха-

рактерно для линий АРР, APP-Swedish и APPANT и статистически не отличалось от такового в линии АРР ACT в а-, ß-долях ГТ и АД.

Рис. 9. Интенсивность флуоресценции зеленого белка в структурах ГТ (у-, Щ р'- и а-долях) и АД мозга 2-дневных (столбцы серого цвета) и 30-днсвных (столбцы черного цвета) мух. 1 - 2 - $уИ;АРР/+; 3 -

¡уИ-,АРР^/+-, 4 - гу/1 ;АРРШТ/+; 5 -,1у11 ;АРРАСТ/+; б - *у>1;вАСЕ/+;ЛРР-

Как и в опыте с синаптотагмином, на второй день жизни имаго интенсивность сигнала в линии иуЬ различается довольно слабо в ГТ и АД (рис. 10).

Рис. 10. Интенсивность флуоресценции зеленого белка в структурах ГТ (?-> Р-5 Р'- и а-долях) и АД мозга 2-дневных (столбцы серого цвета) и 30-дневных (столбцы черного цвета) мух. По оси абсцисс - генотипы линий: 1 - зуЬ; 2 - ф;ЛРР/+\ 3 -*уЬ;АРР-Ям>/+; 4 - .■¡уЬ;АРРЛ!\'Г/+; 5 -¡уЬ;АРРЛСТ/+; 6 - syЬ;BACE/+;APP~ Эм>/+; 7 - ¡уЬ;ВА СЕ/ А РР

Однако в мозге мух этого возраста с экспрессией АРР (APP-Sw) наблюдается значительное понижение сигнала в структурах ГТ и АД. В линии же с экспрессией APPANT понижение наблюдалась в АД и ГТ, кроме у + Р'-доли ГТ. Уменьшение сигнала в а- и р-долях в линии АРР ACT также статистически неотличимо от контроля. Снижение интенсивности флуоресцентного сигнала в мозге 30-дневных мух в контрольной линии syb наблюдалось в слабой мере как в ГТ, так и в АД (рис. 10). Снижение было более характерно для линий с экспрессией АРР и его фрагментов. Следует отметить, что по сравнению с контролем у всех анализируемых линий проявлялось сильное уменьшение сигнала как в ГТ, так и в АД.

Одновременно с исследованием роли АРР в синаптогенезе мы оценивали влияние Ар на экспрессию и распределение маркерных белков. В опыте с синаптотагмином на второй день жизни имаго в мозге мух BACE;APP-Sw наблюдается значительное понижение сигнала во всех структурах ГТ и АД (рис. 9). Однако, несмотря на уменьшение сигнала, оно статистически достоверно только для Р'- и у-долей и АД.

У 30-дневных мух наблюдалось снижение интенсивности флуоресцентного сигнала как в ГТ, так и в АД. Однако, как и в вариантах опыта без ВАСЕ, эффект носил менее выраженный характер по сравнению с наблюдаемым у 2-дневных мух, а в АД интенсивность сигнала практически была одинаковой как у 2-дневных, так и 30-дневных мух. В случае синапто-бревина как на 2-й, так и на 30-й день в мозге мух с совместной экспрессией АРР (APP-Sw) и ВАСЕ наблюдается статистически достоверное понижение сигнала во всех структурах ГТ и АД по сравнению с контрольной линией (рис. 10). Однако для линии BACE;APP-Sw уровень сигнала не отличается от такого в линии с экспрессией только APP-Sw. В линии ВАСЕ/АРР уровень сигнала был статистически достоверно ниже, чем в линии АРР только в (3-доли ГТ и АД на 2-й и 30-й дни.

Таким образом, мы наблюдали уменьшение уровня синаптотагмина и синаптобревина в линиях с экспрессией АРР начиная с первых дней жизни имаго. Это уменьшение было особенно заметно в линиях с экспрессией полноразмерного АРР или АРР с мутацией. Обращает внимание, что наличие мутации статистически достоверно не изменяло уровень исследованных синаптических белков по сравнению с экспрессией АРР дикого типа. Образование Ар также понижало уровень флуоресцентного сигнала, но он статистически достоверно не отличался от линий с экспрессией полноразмерного АРР {APP-Sw).

Учитывая тот факт, что прогрессирующее снижение уровня синаптических белков наблюдается уже на самых ранних стадиях БА [Masliah et al., 2001], эти результаты имеют чрезвычайно большое значение для понимания природы дисфункции синапсов. В условиях поставленного эксперимента, когда при экспрессии только АРР (APP-Sw) Ар не секретиру-ется в мозге мух, мы вынуждены сделать вывод, что эффект подавления синтеза синаптотагмина и синаптобревина в мозге трансгенных мух обусловлен гиперэкспрессией полноразмерного АРР. Как нам кажется, существуют три основных подхода в интерпретации эффекта АРР на уровень пресинаптических белков и синаптогенез:

1) АРР, являясь интегральной частью цитоскелета клетки, непосредственно вовлечен в образование и функционирование синапсов [Torroja et al., 1999]. Вполне вероятно, что мутантный АРР или гиперэкспрессия АРР дикого типа приводят к нарушению целостности цитоскелета, дегенерации синаптического компартмента и, как следствие, к уменьшению числа нормальных синапсов;

2) АРР в комплексе с моторным белком кинезином является белком аксонного транспорта синаптических белков и синаптических везикул [Duncan and Goldstein, 2006]. Делеция Appl, ортолога АРР, или экспрессия АРР или APP-Sw в Drosophila вызывали появление одинаковых фенотипов со сниженной экспрессией двух основных моторных белков аксонного

транспорта кинезина и динеина [Goldstein, 2003; Duncan, Goldstein, 2006]. Эти результаты ясно указывают, что нарушения в структуре или экспрессии АРР могут вызывать блокаду транспорта синаптических белков в аксонах, дегенерацию цитоскелета и дисфункцию синапсов;

3) АРР или его фрагменты могут непосредственно влиять на уровень экспрессии синаптических белков.

Анализ уровня мРНК синаптотагмина 1 при экспрессии гена АРР человека в нервных клетках Drosophila melanozaster

Мы показали, что в синаптических структурах мозга трансгенных Drosophila melanogaster, в нервных клетках которых был экспрессирован ген АРР человека, происходит снижение содержания маркерных белков GFP-синаптотагмина и GFP-синаптобревина уже на вторые сутки жизни мух. Оставалось, однако, неясным, какой механизм определяет столь раннее снижение уровня синаптотагмина в мозге трансгенных Drosophila. Для этого мы провели анализ уровня мРНК синаптотагмина 1 в мозге мух линий с секрецией Aß (совместная экспрессия АРР (APP-Sw) и ВАСЕ) и при ее отсутствии (экспрессия только АРР (APP-Sw)) методом ПЦР в реальном времени. На рис. 11 представлен относительный уровень мРНК гена sytl в контрольной линии и линиях с экспрессией АРР на второй день жизни имаго.

Рис. 11. Относительный уровень экспрессии мРНК sytl. Представлены усредненные данные по 4 повторностям опыта. По оси абсцисс - генотипы линий: 1 - ehr, 2 - elav;APP/; 3 - elav;APP/BACE\ 4 - elav;APP-Sw/+; 5 elav;BACE/+;APP-Sw/+. * p < 0,05 = 2 I- I . 1,0 сравнению с соответствующим

показателем в линии elav (one-way ANOVA, Kyplot)

- mmwkwkm

Уровень мРНК в линиях, экспрессирующих АРР, значительно ниже, чем в контрольной линии. Примечательно, что он не отличался как в линиях с генерацией Aß, так и в линиях, где он не образовывался (рис. 11).

Используя метод иммуноблоттинга и программу Image J, мы проанализировали уровень белка sytl на 2-й день жизни имаго. Результаты анализа, представленные на рис. 12, показывают резкое снижение количества белка sytl в линиях с экспрессией гена АРР. Интересно, что если уровень мРНК гена sytl был практически одинаков во всех линиях с экспрессией АРР, то секреция Aß дополнительно снижала количество белка sytl.

Рис. 12. Относительный уровень белка sytl. Л - определение sytl методом Всстерн-блота с помощью антител Dsyt-CLl. Б - нормализованный по линии elav уровень sytl. По оси абсцисс - генотипы линий: 1 - elav, 2 - elav;BACE/+;APP-Sw/+\ 3 - elav\APP/BACE~, 4 - elnv;APP-Sw/+; 5 - elav;APP/+. * p < 0,05 по сравнению с соответствующим показателем в линии elav (one-way ANOVA, Kyplot)

Полученные результаты указывают, что подавление транскрипции гена sytl обусловлено экспрессией именно гена АРР независимо от секреции Ар. Этот удивительный результат позволяет взглянуть на изменение синаптогенеза в выбранной нами модели с точки зрения функций АРР.

При экспрессии АРР человека в нервных клетках Drosophila он транспортировался в пресинаптический терминал нейронов и постсинап-тические участки НМК [Yagi et al., 2000], конкурируя с Appl. Эта конкуренция может подавлять регуляцию экспрессии синаптических белков через протеинкиназа-О-зависимый механизм [Claasen et al., 2009]. Альтернативно фрагменты протеолитического расщепления АРР могут влиять на транскрипционную активность генов Drosophila [Miiller et al., 2007]. Так, цитоплазматический фрагмент АРР (АРР intracellular domain, AICD), генерируемый при протеолизе АРР у-секретазой, может транслоцироваться в ядро, регулировать генную экспрессию, синаптическую пластичность и память [Cao, Sudhof, 2001; Gao, Pimplikar, 2001; Ma et al., 2007]. Как регулятор транскрипции, AICD влияет на ремоделирование хроматина посредством связывания с ацетилтрансферазой гистонов Tip60 [Cao, Sudhof, 2001, 2004]. Примечательно, что трансгенные мыши с гиперэкспрессией AICD проявляли нейропатологические черты, характерные для БА, включая гиперфосфорилирование тау, нейродегенерацию, нарушение памяти [Ghosal et al., 2009], что указывает на важность рассмотрения других продуктов АРР в патогенезе БА. В нашей работе секреция Ар не являлась определяющим фактором в изменении уровня мРНК sytl, хотя и приводила к дальнейшему уменьшению его содержания.

Влияние экспрессии АРР человека на нейродегенерацию в мозге мух

Наблюдаемое с возрастом изменение экспрессии синаптических белков сопровождалось иейродегснерадией, которая оценивалась на парафиновых срезах мозга, окрашенных гематоксилином и эозином (рис. 13).

Рис. 13. Нсйродегенерация в мозге 30-дневных мух. А - площадь иейро-дегенерации, вычисленная в программе Image J. Б - фотографии парафиновых срезов мозга. Окраска эозином и гематоксилином. Цифрами указаны генотипы линий: 1 - elav; 2 - elav;APP/+; 3 - elav,APP-Sw/+; 4 -elav;APP/BACE; 5 - elav;BACE/+;APP-Sw/+. Световая микроскопия, масштаб - 50 мкм

В первые сутки жизни имаго не наблюдалось нейродегенеративных процессов в мозге мух. На 15-17-й день проведения опыта в мозге мух с экспрессией АРР появлялись отдельные небольшие очаги нейродегенера-ции, число которых возрастало к 30-му дню опыта. Вакуоли (участки мозга, в которых отсутствует нервная ткань) различного размера наблюдались в нейропиле мозга и, в меньшей степени, затрагивали оптические доли. В линии дикого типа (линия Canton S) слабовыраженная нейродегенерация в нейропиле и глазах впервые фиксировалась только на 55-60-й день опыта. Хотя число вакуолей варьировалось среди опытных образцов, мы не нашли статистически достоверной разницы между линиями с экспрессией ВАСЕ и без экспрессии ВАСЕ. Во всех линиях с экспрессией АРР наблюдалось статистически достоверное усиление нейродегенерации (рис. 13).

Исследование способности животных к обучению и запоминанию при экспрессии гена АРР человека

Клинически БА проявляется как прогрессирующее снижение когнитивных функций, которое начинается на очень ранних стадиях заболевания. Drosophila имеет хорошо развитую центральную нервную систему и поведенческие реакции, которые делают возможным исследовать нарушение памяти при моделировании нейродегенеративных заболеваний. Именно это обстоятельство позволяет исследовать ранние эффекты, связанные с нарушением памяти при экспрессии в плодовой мушке мутантных генов, вызывающих наследственные формы БА.

Таблица 2

Прогрессирующее с возрастом уменьшение способности к обучению трансгенных мух с экспрессией АРР

Генотип Возраст животных

1-2 день 7-8 день 13-14 день 21-22 день 28-30 день

elav-GAL-f"'* 61,2 ±5,2 46,8 ±3,6 38,6±4,6 34,2±2,8 31,2 ±6,7

UAS-APP* 58,4±4,7 57,0±6,3 52,7±5,8 44,8 ±4,4 37,4 ±7,1

UAS-APP-Sw* 55,4 ±4,3 42,5 ±3,0 33,3±3,6 33,7±2,6 35,3 ±5,3

elav.APP 9,8 ±4,1 9,6 ±4,3 3,6 ±2,3 2,5 ±1,5 2,0 ±1,9

elav;APP/BA СЕ 13,6 ±4,0 9,3 ±2,9 6,4 ±1,8 5,3 ±1,2 3,7 ±2,1

e/av; APP-Sw 22,4 ±2,4 15,3 ±4,8 11,6 ±4,1 4,9 ±2,8 4,0 ±2,3

elav;BACE; APP-Sw 28,0 ±4,2 19,3 ±3,7 13,8 ±3,7 8,2 ±3,0 4,2 ±1,8

Таблица 3

Прогрессирующее с возрастом уменьшение памяти трансгенных мух с экспрессией АРР

Генотип Возраст животных

1-2 день 7-8 день 13-14 день 21-22 день 28-30 день

elav-GALf 57,9±3,5 41,5±2,0 30,2±2,3 27,6 ±1,4 19,7±2,4

UAS-APP* 55,1 ±5,1 44,8 ±4,1 36,2±3,6 39,7 ±3,6 23,4 ±2,7

UAS-APP-Sw* 53,1 ±5,7 33,2±3,9 25,0 ± 3,1 28,7 ±3,4 26,3 ±3,1

elav.APP 5,0 ±3,3 3,9 ±2,1 3,0 ±1,6 1,2 ±0,6 1,0 ±0,8

elav;APP/BACE 13,1 ±3,3 10,4 ±2,2 7,5 ±1,5 4,5 ±1,7 4,9 ±3,2

elav;APP-Sw 9,2 ±1,9 7,0 ±1,5 7,7 ±3,1 7,3 ±2,6 5,2 ±3,3

elav;BACE;APP-Sw 14,5 ±4,8 13,6±2,5 9,1 ±4,2 3,7 ±1,8 4,0 ±2,5

* В таблицах показан индекс обучения и запоминания соответственно. Отмечены контрольные линии. Статистически значимыми считались различия при р < 0,05 (one-way ANOVA и Tukey-Kramer multiple comparison post hoc test). Жирным шрифтом выделены статистически значимые различия по сравнению с контрольными линиями.

Способность мух с экспрессией АРР (APP-Sw) к обучению и запоминанию была исследована с помощью широко известного классического теста на выработку условного обонятельного рефлекса Tully и Quinn [Tully and Quinn, 1985]. Уже'у молодых мух (1-2 дня) всех линий с экспрессией АРР способность к обучению и запоминанию была статистически достоверно ниже (табл. 2 и 3). Эти нарушения усиливались с возрастом. Мы также исследовали способность этих мух различать и избегать 3-октанол, 4-метил-циклогексанол и электрический ток. Не было обнаружено значительной разницы по этим параметрам у мух контрольных линий и мух с экспрессией АРР. Таким образом, наблюдаемые нарушения обучения и памяти у этих мух не являются следствием нарушения обоняния или нарушением способности чувствовать электрический ток.

Анализ морфологических и функциональных нарушений в ненромышечных контактах Drosophila melanoeaster, вызванных экспрессией гена АРР человека

Для понимания клеточных механизмов, лежащих в основе наблюдаемых нами при экспрессии АРР эффектов, мы провели анализ морфологического и функционального состояния НМК личинок Drosophila при экспрессии АРР или APP-Sw, а также при совместной экспрессии АРР или APP-Sw и ВАСЕ человека.

Экспрессия АРР (APP-Sw) приводила к значительным морфологическим и функциональным изменениям в нейромышечных соединениях, вызывая увеличение количества синаптических бутонов (рис. 14А), разрастание аксонов (рис. 14Б), а также уменьшение числа митохондрий в преси-наптических терминалах (рис. 14В).

* А Б В

1

-*■ * sm r-

ш Г * " 2 Г

1« IL* it - ml

iwwidk.

о I 2 3 4 s 12345

Рис. 14. Анализ нейромышечных соединений личинок линий с экспрессией АРР. По оси абсцисс - генотипы линий, на А и Б: 1 - CD8/+-D42/+-2 - CD8/+;APP/+;D42/+; 3 - CD8/+;APP/BACE;D42/+; 4 - CD8/+;D42MPP-Sw-5 - CD8/+;BACE/+;D42/APP-Sw. На В: 1 - mito/+;D42/+; 2 - APP/mito;D42/+; 3 -APP/BACE;D42/mitо\ 4 - mito/+;D42/APP-Sw, 5 - BACE/mito;D42/APP-Sw. НМК - нейромышечный контакт, ИФ - интенсивность флуоресценции. Звездочкой отмечены статистически значимые результаты (р < 0,05)

Влияние экспрессии АРР на функционирование синапсов мы изучили с помощью флуоресцентного красителя FM4-64, позволяющего анализировать синаптический эндо- и экзоцитоз [Verstreken et al., 2008]. В контрольной линии после 5-минутной стимуляции 90 тМ К+ в присутствии красителя в пресинаптических терминалах наблюдался высокий уровень красителя, что указывало на высокий уровень эндо-цитоза FM4-64 (рис. 15А). Внутри синаптического бутона краситель локализовался по периферии бутона, что соответствует пулу везикул, готовых к высвобождению медиатора [Kuromi and Kidokoro, 1998]' Повторная 1-минутная стимуляция 90 шМ К+ без красителя, индуцирующая экзоцитоз, приводила к значительному уменьшению уровня красителя (рис. 15А).

5 мин «загрузка» 1 мин «разгрузка»

СГ к Ш ц 3 ш 40

Ш и

к §.20 5 *

Рис. 15. Анализ эндо- и экзоцитоза в НМК личинок ОгоьорИИа теЫпоцаьгет с экспрессией АРР. А - относительный уровень флуоресценции в НМК при эндо- и экзоцитозе. Б - процент высвобождения красителя при экзоцитозе. По оси абсцисс - генотипы линий: 1 - СйН/+;П42/+-, 2 - С08/+;АРР/+;042/+; 3 -С08/+;АРР/ВАСЕ;1)42/+; 4 - 0)8/+;042/АРРЛи>; 5 - С1)8/+;ВАСЕ/+;042/АРР-$ы

Анализ синаптических бутонов НМК личинок с экспрессией АРР показал, что интенсивность флуоресценции красителя и его распределение внутри бутона при эндоцитозе практически не отличались от контрольных образцов в линиях с экспрессией АРР и АРР-Бн> (рис. 15А), в то время как образование А(3 вызывало, хотя и незначительное, снижение эндоцитоза. Более драматическая ситуация наблюдалась при экзоцитозе. Так, если в синаптических окончаниях личинок контрольной линии за 1 мин «выгружалась» большая часть красителя, то количество красителя, высвобождающееся из синаптических бутонов в линиях с экспрессией АРР (АРР-или АРР (АРР-Бч>) и ВАСЕ, было значительно уменьшено (рис. 15Б). Эти данные показывают, что, хотя в линиях с экспрессией АРР имеется достаточный запас готовых к экзоцитозу синаптических везикул, необходимо больше времени для их слияния с синаптической мембраной. Между линиями с экспрессией только АРР или АРР-Бм> и линиями, где образовывался АР (совместная экспрессия АРР и ВАСЕ и АРР-Бмг и ВАСЕ), статистических различий выявлено не было.

Как было отмечено ранее, трансгенные линии ОгозорИйа позволяют разделить эффекты АРР и Ар. Полученные нами результаты показывают, что наблюдаемые структурные и функциональные нарушения НМК обусловлены экспрессией именно гена АРР независимо от секреции Ар. Хотя наши эксперименты были проведены на трансгенных организмах, в литературе представлены данные о том, что дупликации гена АРР могут приводить к развитию БА [К.оуе1еМ.есгах е! а1., 2006; http://www.molgen.ua.ac.be/ADMutations]. Мы также наблюдали, что эффект экспрессии мутантной формы АРР-Б\\< на синаптогенез был значительно слабее, чем экспрессия АРР дикого типа. Подобная картина описана и у трансгенных мышей при экспрессии АРР дикого типа и мутантной формы

АРР с мутациями Swedish и Indian [Seeger et al., 2009]. Эти данные дают возможность предположить, что мутации в АРР, связанные с СБА, вызывают потерю или снижение его синаптической активности.

Анализ нейропротекторных свойств пептидов-миметиков аполипопротеина Е на модели болезни Альцгеймера на Drosophila melanogaster

Транспорт пептидов через гематоэнцефалический барьер Drosophila melanoeaster

Применение многих существующих лекарственных соединений оказывается низкоэффективным вследствие ограниченного транспорта их из кровотока в мозг и возможности поддержания в нем концентраций препаратов, необходимых для достижения терапевтического эффекта. Эти ограничения обусловлены гематоэнцефалическим барьером (ГЭБ), образуемым эндотелиальными клетками сосудов мозга [Pardridge, 2005]. В целом, ГЭБ является основным барьером для доставки в мозг лекарственных препаратов белковой и пептидной природы, которые могут оказаться эффективными в лечении многих нейрологических заболеваний [Egleton and Davis, 2005; Laskowitz et al., 2006]. Тем не менее существуют как белки, так и пептиды, способные проникать через ГЭБ.

Мы использовали Drosophila melanogaster как простую и удобную физиологическую модель для анализа препаратов, способных проникать через ГЭБ. Для исследования транспорта пептидов, меченных биотином, через ГЭБ Drosophila мы вводили пептиды непосредственно в абдомен, заполненный гемолимфой, омывающей поверхности внутренних органов насекомого, в частности мозга. При этом мы предполагали, что биотини-лированный пептид может обнаруживаться в мозге мух лишь в том случае, если он способен пройти через ГЭБ. Чтобы исключить возможность абсорбции или интернализации пептида в тонком слое клеток ГЭБ, определение пептидов было проведено на срезах мозга. Были исследованы пептиды, проходящие через ГЭБ млекопитающих: пенетратин (Antp 43-58) - RQIKIWFQNRRMKWKK [Derossi et al., 1994]; Cogl33 -LRVRLASHLRKLRKRLL, пептид, имеющий транедуцирующие свойства; и Cogll2, состоящий из последовательности пенетратина и Cogl33 [Li et al., 2006]. В качестве контрольных пептидов, не способных проникать через ГЭБ, были использованы Antp 41-55 - WQRQIKIWFQNRRMK [Bolton et al., 2000] и Antp-rev 58-ФЗ - KKWKMRRNQFWIKIQR.

Анализ распределения интенсивности окраски на денситограммах показал, что каждый пептид проникает в мозг мух с различной эффективностью. Максимальное поглощение было отмечено для Cogl33. В то же время Cogl 12 оказался наименее чувствительным к деградации в мозге, чем другие исследованные пептиды (рис. 16).

Рис. 16. Динамика накопления пептидов в мозге Drosopltila. 1 - Cogll2; 2 - Cogl33; 3 - пснстратин; 4 - Ant-rev; 5 - Ant 41-55. Каждая точка представляет среднюю величину из 4 независимых определений на каждом срезе. Статистически значимыми считали различия при р < 0,05

О 0 2 « 6 в 10 12

Время после инъекции

Функциональные сходства ГЭБ млекопитающих и ГЭБ дрозофилы подтверждают эксперимент с пептидом, который не пересекает ГЭБ. Пептид Ant 41-55, который не проходит через ГЭБ крыс [Bolton et al., 2000], в наших экспериментах не проходил и в мозг Drosophila. Такой же эффект наблюдался и при использовании другого контрольного пептида, Ant 58^-3.

Таким образом, можно предположить, что транспорт различных пептидов в мозг через ГЭБ одинаков для грызунов и для Drosophila. И в этом плане Drosophila представляется одним из очень удобных модельных организмов в разработке новых лекарственных препаратов для лечения заболеваний ЦНС.

Аполипопротеин Е (апоЕ) человека представляет собой полипептид из 299 аминокислотных остатков, основная функция которого заключается в транспорте липидов и липопротеинов. Независимо от своих функций в обмене липидов апоЕ представляет собой основной аполипопротеин центральной нервной системы, регулирующий процессы нейродегенера-ции и нейропластичности, и является модулятором врожденного и приобретенного иммунного ответа in vitro и in vivo. Последовательность рецеп-тор-связывающего домена апоЕ (133—149, LRVRLASHLRKLRKRLL) была использована для создания его пептидных миметиков. В экспериментах in vitro и in vivo было показано, что пептид-миметик апоЕ Cogí33 сохраняет антиокислительные и противовоспалительные свойства нативного апоЕ [Аопо et al., 2002; Misra et al., 2001; Laskowitz et al., 2001; Lynch et al., 2005]. Более того, Cogí 33 проявлял выраженные нейропротекторные свойства на моделях черепно-мозговой травмы у млекопитающих даже при однократном введении спустя 30 мин после травмы [Lynch et al., 2005]. И, как мы показали, Cogl33 и пептид Cogí 12 эффективно проходят через ГЭБ Drosophila. Еще более эффективным терапевтическим пепти-

Эффекг пентидов-миметиков аполипопротеина Е на нейродегенерацию в мозге трапегенных мух

дом оказался укороченный пептидный миметик апоЕ - Cogl410, включающий позиции 138-149 апоЕ и содержащий в позициях 140 и 145 ами-ноизомасляную кислоту [Laskowitz et al., 2006]. Cogl410 также сохранял антиокислительные и противовоспалительные свойства интактного холо-протеина in vitro и in vivo [Laskowitz et al., 2006; Hoane at al., 2009], но оказался более эффективным нейропротектором, чем его предшественник Cogl33 [Hoane at al., 2009]. Мы изучили, как эти пептиды проявляют ней-ропротекторные свойства на модели БА Drosophila melanogaster. Суммарная площадь регистрируемых вакуолей, отражающая степень нейродеге-нерации в мозге мух линий elav;APP/BACE и elav;BACE;APP-Sw, значительно сокращалась после 7 инъекций Cogll2 или Cogl33 (табл. 4). Защитный эффект пептидов наблюдался уже на 15-17-й день после 4-х инъекций. Наиболее значительный эффект был отмечен в случае применения пептида Cogl410. В контрольных экспериментах инъекции пенетратина в тех же концентрациях не блокировали нейродегенерацию.

Таблица 4

Эффект пептидов-миметиков апоЕ на нейродегенерацию _ в мозге трансгенных мух

Генотип Варианты опыта

без пептида, % нейродегенерации инъекции пептида, % нейродегенерации

Сой133

elav;APP / ВАСЕ 20,0±2,8 11,7±2,8*

elav;BACE;APP-Sw 18,3±4,6 8,7±0,5*

Cogí 12

elav;APP /ВАСЕ 20,0±2,8 7,6 ± 1,4*

elav;BA CE;APP-Sw 18,3 ±4,6 10,8 ±1,1*

Cogl410

elav;APP / ВАСЕ 20,0 ±2,8 4,4 ±0,7*

elav;BACE;APP-Sw 18,3 ±4,6 7,5 ±0,9*

пенетратин

elav;APP / ВАСЕ 20,0 ±2,8 16,6 ±2,0

elav;BACE;APP-Sw 18,3 ±4,6 14,8 ± 3,2

* Звездочкой отмечены статистически значимые результаты (р < 0,05) по сравнению с контрольными вариантами опыта (без добавления пептида), one-way ANOVA и тест Тьюки - Крамера. Концентрации пептидов при инъекциях составляли: 11,74 цМ Cogl33, 11,47 цМ Cog 112, 11,26 цМ Cogl410 и 11,71 цМ пенетратина.

Эффект пептидов-миметиков аполипопротеина Е на способность животных к обучению и запоминанию

Мы исследовали, могут ли пептиды-миметики апоЕ восстанавливать способность животных к обучению и запоминанию в 2-х линиях с экспрессией АРР: elav;APP/BACE и elav;BACE/APP-Sw. После 2-х инъекций (возраст мух - 7-8 дней) Cogí 12 или Cogl33 не наблюдалось изменений в обучении мух, но наблюдалось улучшение памяти у мух генотипа elav;APP/BACE при обработке Cogí 12 или Cogl33 (табл. 5).

После 3-х добавочных инъекций (возраст мух - 21-22 дня) наблюдался значительный позитивный эффект на обучение и память мух этого генотипа при применении Cogí 12 и только на обучение - при инъекциях Cogl33. У мух генотипа elav;BACE;APP~Sw наблюдалось статистически достоверное улучшение памяти на 7-8-й день.

При изучении эффекта Cogl410 мы добавляли пептид в корм животным. При кормлении мухи сразу же после вылупления переносились и содержались на среде с Cogí 410, которая менялась ежедневно. Как видно из представленных в табл. 5 данных, на 7-8-й день не наблюдалось статистически достоверного улучшения обучения и памяти ни при применении Cogl410, ни при использовании контрольного пептида. Иная картина наблюдалась на 21-22-й день. Индекс обучения и запоминания увеличивался примерно в 2-3 раза у мух обоих генотипов (etav;APP/BACE и elav;BACE;APP-Sw) при содержании их на среде с Cogl410.

Таблица 5

Эффект пептидов-миметиков апоЕ на обучение и памлть мух линий с экспрессией АРР

Генотип Инъекции пептидоз Индекс обучения, % Индекс памяти, %

7-8 день 21-22 день 7-8 день 21-22 день

elav;APP/BA СЕ - без пептида 9,3 ±2,9 5,3 ±1,2 10,4 ±2,2 4,7 ±2,0

+ Cogl33 11,6±1,3 9,8 ±2,5* 18,0±2,6* 6,2 ±1,4

+ Cogí 12 10,0 ±2,7 8,6± 1,2* 17,6 ±1,4* 12,2±2,3*

+ Cogl410 8,3 ±3,9 20,0 ±6,3* 9,3 ±3,6 18.1 ±3,7*

+ пенетратин 6,0±1,1 6,2 ±1,3 6,1 ±2,7 3,6 ±1,5

е lav; В A CE;APPSw - без пептида 19,1 ±4,1 8,2 ±3,0 13,6 ±2,5 3,7 ±1,8

+ Cogl33 25,4± 1,9 9,3 ±3,5 19,6±1,2* 3,7 ±1,4

+ Cogí 12 21,7±3,1 11,3 ±1,4 15,3± 1,7 5,2 ±2,7

+ Cogl410 23,1 ±4,8 21,5 ±5,7* 16,5 ±2,8 14,2 ±4,0*

+ пенетратин 28,7 ±6,5 10,7± 1,7 10,4 ± 2,1 4,0 ±1,1

* Звездочкой отмечены статистически значимые результаты (р < 0,05) по сравнению с контрольными вариантами опыта (без добавления пегггида), one-way ANO VA и тест Тьюки-Крамера. Концентрации пептидов при инъекциях составляли: 11,74 цМ Cogl33; 11,47 цМ Cogll2; ll,26nMCogl410H 15,71 цМ пенетратина.

Эффект Сое! 12 на отложения Ар

Мы исследовали эффект Со§112 на накопление Ар в мозге Вго$орЫ1а. Мы анализировали эффект Cogll2 в линии генотипа е1ау;АРР/ВАСЕ, в мозге мух которой наблюдался высокий уровень амилоидных отложений, нейродегенерация, снижение уровня синаптических белков. В качестве контрольного пептида был использован пептид Апф-БНв, который представляет собой составной пептид, состоящий из пенетратина и пептида ЭШ. Пептид БШ был выделен при скрининге пептидных библиотек как ингибитор агрегации Ар [8с11\¥аг2тап е1 а1., 2005]. Пептиды добавлялись в среду в следующих концентрациях: 11,47 цМ 0^112 и 3,72 цМ АШр-БШ. Как видно на рис. 18, значительные амилоидные отложения обнаруживаются в местах расположения нервных клеток. Применение АгИ:р-8Н8 заметно уменьшало размер и плотность амилоидных отложений. При применении Со§112 на отдельных препаратах наблюдалось уменьшение размера амилоидных отложений, но возможный эффект трудно оценить из-за значительных вариаций в детектируемых отложениях Ар.

е/акЛРР/ВАСЕ

У"

с1а\;Л1'Г/ВЛСЕ

е/«у;ЛГГ/в.<1СЕ СОСЛ12

еШкЛРРгВАСЕ 811-8

Рис. 18. Влияние пептидов на образование отложений Ар в мозге 1)га$оркИа. Иммуногистохимия, антитела 4С8. Световая микроскопия. А -распределение отложений Ар в мозге 20-дневных мух. Масштаб - 50 мкм. Б - эффект пептидов на накопление Ар в мозге ОгохорИИа. Масштаб — 10 мкм

Мы также исследовали действие пептида Cogl410 на распределение отложений Ар в мозге трансгенных мух 30-дневного возраста. Анализ, проведенный на парафиновых срезах мозга, как и при использовании пептида Cogll2, не выявил значительных различий в распределении Ар в контрольных вариантах (без пептида) и вариантах после инъекций 0^1410.

Природа нейрозащитных функций пептидных миметиков апоЕ в настоящий момент неясна и требует дальнейшего изучения. Принимая во

внимание наши собственные данные и данные, полученные другими исследователями, мы предполагаем, что эффекты апоЕ миметиков обусловлены прямым или опосредованным взаимодействием последних с агентами, модулирующими в первую очередь воспалительные и нейрозащитные реакции организма.

Полученные результаты позволяют предположить, что пептиды-миметики апоЕ являются перспективными агентами для разработки лекарственной терапии БА.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Идентификация мутаций в генах АРР, PS1 и PS2, вызывающих раннюю аутосомно-доминантную форму БА, отводит им основную роль в патогенезе БА. Вместе с тем функции АРР и пресенилинов в настоящее время изучены недостаточно, и, в силу этого обстоятельства, механизм обменных нарушений и физиологических процессов, обусловленный мутациями, остается неясным. Хотя аномальный протеолитический процес-синг АРР, наблюдаемый при наследственных формах БА, послужил основой для выдвижения основной патогенетической гипотезы амилоидного каскада, существует целый ряд наблюдений, вызывающих сомнение в ее универсальности. Так, не все известные на сегодняшний день мутации в генах АРР и пресенилинах приводят к повышенному образованию Aß42 или изменению соотношения Aß40/Aß42 [Duering et al., 2005; Walker et al., 2005; Shen and Keller, 2007]. Во-вторых, попытки создания антиамилоидо-генной терапии потерпели неудачу. В-третьих, уровень Aß и его отложения не коррелируют с прогрессией деменции. Кроме этого, у мышей с гиперэкспрессией АРР человека не обнаруживается нейродегенерация, наблюдаемая у больных БА.

В то же время увеличивается число исследований, свидетельствующих, что нарушения синаптических функций и связанная с ними потеря памяти в ранней фазе БА происходят значительно раньше процессов ней-родегенерации или амилоидоза. В качестве альтернативных гипотез выдвигаются предположения о том, что образование нейротоксических агрегатов Aß и белка тау представляет собой лишь один из многих процессов, вносящих вклад в патогенез заболевания. Так, например, целый ряд наблюдений привел к созданию «пресенилиновой гипотезы» патогенеза БА, в основе которой лежит предположение, что частичная потеря функций пресенилина может вызывать нейродегенерацию и нарушения памяти у больных БА [Shen and Keller, 2007]. «Пресенилиновая гипотеза» объясняет существование и природу мутаций в пресенилинах при БА и поддерживается многочисленными исследованиями на животных. Однако она не без труда объясняет мутации в АРР при СБА.

В данной работе показано, что АРР и пресенилин 1 локализованы в пресинаптических терминалах и непосредственно вовлечены в образование и поддержание синапсов. Также показано, что экспрессия гена АРР человека в нервных клетках ВгояорИИа вызывает изменения экспрессии синаптических белков, морфологии ГТ мозга, отвечающих за обучение и память животных, нейродегенерацию и нарушает способность их к обучению и запоминанию. Экспрессия АРР приводит к структурным и функциональным нарушениям синапсов НМК личинок БгозорЫ1а, при этом наблюдаемые эффекты обусловлены именно экспрессией АРР, а не образованием Ар. Созданная на ОгоБорИПа melanogaster модель БА воспроизводит основные нейроморфологические черты БА, наблюдаемые у людей, а именно изменение синаптической плотности, нейродегенерацию, образование и отложение Ар, а также такие клинические показатели, как нарушение обучения и памяти. Надо отметить, что, хотя большинство СБА обусловлены мутациями в генах АРР и пресенилинах, в литературе представлены данные о том, что дупликации гена АРР могут приводить к развитию БА. В наших экспериментах эффект экспрессии мутантной формы АРР-Бц> был значительно слабее, чем экспрессия АРР дикого типа. На основе этих данных можно предположить, что мутации в АРР, связанные с СБА, вызывают потерю или снижение его синаптической активности.

Мы также показали, что пептиды-миметики аполипопротеина Е способны блокировать нейродегенерацию и улучшать когнитивные функции трансгенных йгозорЫ1а melanogaster с экспрессией АРР человека. Вопрос разработки стратегии терапевтического лечения не только БА, но и других конформационных болезней в настоящее время остается открытым. Например, для БА в настоящее время неизвестно ни одного фармакологического препарата, который бы мог если не предотвратить, то, по крайней мере, замедлить течение этого фатального заболевания. Если бы мы могли разработать препараты, которые ингибировали олигомеризацию Ар и одновременно предотвращали развитие клинического синдрома, мы бы лучше поняли и патогенетическую основу заболевания. Таким препаратом мог бы быть нейропротектор, восстанавливающий и синаптические, и когнитивные функции. Поиск соответствующих препаратов - как раз тот случай, когда развитие фундаментальной науки и разработка практических терапевтических подходов представляют собой единое целое. Мы полагаем, что пептидные миметики аполипопротеина Е являются перспективными агентами для разработки лекарственной терапии БА.

ВЫВОДЫ

1. PSI локализован на поверхности клеточных структур, которые обеспечивают клеточную подвижность и межклеточные контакты: ламел-липодиуме Т-лимфоцитов и КР нейронов, что свидетельствует о вовлечении этого белка в процессы клеточной адгезии.

2. Нокаут гена PS1 приводит к нарушению структуры КР нейронов, их дегенерации и уменьшению числа синапсов.

3. Мутации в гене PS1 приводят к нарушению механизмов клеточной адгезии, что в конечном итоге может обусловливать нарушение формирования и поддержания синаптической сети.

4. Экспрессия гена АРР человека в нервных клетках Drosophila melanogaster вызывает изменения экспрессии синаптических белков, морфологии ГТ мозга, отвечающих за обучение и память животных, нейроде-генерацию и нарушает способность их к обучению и запоминанию. Экспрессия АРР приводит к структурным и функциональным нарушениям синапсов НМК личинок Drosophila melanogaser.

5. Выявленные на модели Б А на Drosophila melanogaster структурные и функциональные нарушения как центральных синапсов имаго, так и синапсов НМК личинок обусловлены экспрессией АРР, а не образованием Ар. Образование Ар приводит к усилению нейропатологических процессов.

6. Пептиды-миметики аполипопротеина Е подавляют нейродегенера-цию и улучшают обучение и память у трансгенных Drosophila melanogaster, воспроизводящих основные признаки БА. Эти пептиды могут быть использованы для создания нейропротекторных лекарственных препаратов.

7. Проведенное исследование на культуре эмбриональных нейронов мышей с нокаутом гена PS1 и на культурах эпителиальных клеток с экспрессией мутантного PSI, а также на модели БА на Drosophila melanogaster позволяет предположить, что нарушение нормальных функций генов PS1 и АРР может приводить к ранней дисфункции синапсов при БА.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ Главы в коллективных монографиях и книгах

1. Саранцева С. В., Шварцман А. Л. Болезнь Альцгеймера и дисфункция синапсов // Нейродегенеративные заболевания: фундаментальные и прикладные аспекты / Под ред. академика М. В. Угрюмова. - М.: Наука, 2010.-С. 286-298.

2. Саранцева С. В., Шварцман А. Л. Моделирование нейропатологических процессов при болезни Альцгеймера и методов их коррекции на Drosophila melanogaster II Нейродегенеративные заболевания: фундамен-

тальные и прикладные аспекты / Под ред. академика М. В. Угрюмова -М.: Наука, 2010. - С. 350-355.

3. Sarantseva S., Schwarzman A. Modeling Amyloid Diseases in Fruit Fly Drosophila Melanogaster // Amyloidosis - Mechanisms and Prospects for Therapy / Edited by S. Sarantseva. - Rijeka: Intech, 2011. - P.199-216.

Статьи в журналах, включенных в перечень ВАК РФ

4. Саранцева С. В., Шварцман А. Л. Болезнь Альцгеймера: амилоидоз или дисфункция синапсов? Уроки моделирования на Drosophila melanogaster II Экологичесая генетика. - 2005. - Т. 3, № 4. - С. 19-25.

5. Шварцман А. Л., Саранцева С. В., Татищева Ю. А., Рунова О. Л, Талалаева Е. К, Витек М. П. Экспрессия на клеточной поверхности пре-сенилина 1 в мотильных поляризованных клетках // Биофизика - 2006 -Т. 51, №4.-С. 839-843.

6. Шварцман А. Л., Саранцева С. В., Соловьев К. В., Рунова О. Л., Талалаева Е. К, Витек М. П. Дегенерация конусов роста в культуре эмбриональных нейронов мыши с нокаутом гена пресенилина 1 // Биофизика -2008.-Т. 53,№6.-С. 1008-1113.

7. Шварцман А. Л., Саранцева С. В., Витек М. П. Дисфункция синапсов и нарушение структуры цитоскелета конусов роста в культуре эмбриональных нейронов мыши с нокаутом гена пресенилина 1 // Технологии живых систем. - 2008. - Т. 5, № 5-6. - С. 5-10.

8. Саранцева С. В., Большакова О. К, Тимошенко С. К, Родин Д. И., Витек М. П., Шваргриан А. Л. Изучение патогенеза болезни Альцгеймера на модели Drosophila melanogaster. дефицит синаптического белка синап-тотагмина в мозге трансгенных мух с избыточной экспрессией АРР человека//Генетика.-2009.-Т. 45, № 1.-С. 119-126.

9. Саранцева С. В., Большакова О. К, Тимошенко С. К, Колобов А. А., Витек М. П., Шварцман А. Л. Транспорт пептидов, содержащих домены белковой трансдукции, через гематоэнцефалический барьер в Drosophila melanogaster II Биомедицинская химия. - 2009. - Т. 55. - Вып. 1. - С. 41-49.

10. Саранцева С. В., Шварцман А. Л. Современные генетические подходы к поиску мишеней для действия лекарственных препаратов // Генетика -Т.45,№7.-С. 869-880.

11. Sarantseva S., Timoshenko S., Bolshakova O., Karaseva E., Rodin D., Schwarzman A. L„ Vitek M. P. Apolipoprotein E-Mimetics Inhibit Neurodegeneration and Restore Cognitive Functions in a Transgenic Drosophila Model of Alzheimer's Disease II PlosOne. - 2009. - V. 4, No. 12. - P. e8191.

12. Шварцман А. Л., Саранцева C.B., Рунова О. В., Талалаева Е. Я, Витек М. Р. Мутации в гене пресенилина 1, наблюдаемые при семейных формах болезни Альцгеймера, подавляют межклеточные взаимодействия в трансфецированных фибробластах // Биофизика. - 2010 - Т 55 №5 -С. 862-867. '

13. Саранцева С. В., Большакова О. И., Тимошенко С. И., Колобов А. А., Витек М. Р., Шварцман А. Л. Дендример D5 - вектор для транспорта пептидов к клеткам мозга // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010.-Т. 150,№ 10.-С. 402-405.

14. Шварцман А. Л., Саранцева С. В. Компенсаторная функция трансти-ретина при болезни Альцгеймера // Цитология. - 2011. - Т. 53, № 10. -С. 16-21.

15. Шварцман А. Л., Саранцева С В., Витек M. П. Потенциальная роль пресенилина 1 в регуляции синаптической функции // Цитология. — 2011.Т. 53, № 12.-С. 43-51.

16. Саранцева С. В., Родин Д. К, Шварцман А. Л. Экспрессия гена АРР человека в нервных клетках Drosophila melanogaster вызывает снижение уровня мРНК синаптотагмина // ДАН. - 2012.-Т. 442, № 2. - С. 279-281.

17. Саранцева C.B., Кислик Г. А., Ткаченко H.A., Васильев А. Н., Шварцман А. Л. Морфологические и функциональные нарушения в ней-ромышечных контактах Drosophila melanogaster, вызванные гиперэкспрессией гена АРР человека // Цитология. - 2012. - Т. 54, № 5. - С. 55-63.

Статьи в научных сборниках и периодических научных изданиях

18. Саранцева C.B. Подходы к коррекции нейродегенеративных заболеваний на модели Drosophila melanogaster // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике / Под. ред. А. Б. Масленникова. -Новосибирск: Альфа Виста, 2005. - Вып. 8. - С. 76-84.

19. Саранцева С. В., Шварцман А. Л. Генетический скрининг в создании новых лекарственных препаратов // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике / Под. ред. А. Б. Масленникова. - Новосибирск: Альфа Виста, 2006. - Вып. 9. - С. 57-66.

20. Саранцева С. В., Большакова О. К, Кузовкова Е. Ф., Родин Д. К, Тимошенко С. И. Моделирование нейродегенеративных заболеваний человека на трансгенных животных // Бреслеровские чтения - II / Под ред. В. А. Ланцова. - Гатчина: Изд-во ПИЯФ РАН, 2007. - С. 224-235.

21. Саранцева C.B., Большакова О.. К, Тимошенко С. К, Родин Д. И., Витек М. П., Шварцман А. Л. Моделирование нейропатологических процессов болезни Альцгеймера на Drosophila melanogaster: дефицит синап-тических белков в мозге трансгенных мух с гиперэкспрессией гена АРР человека // Первая Международная конференция «Дрозофила в экспериментальной генетике и биологии»: сб. науч. ст., 2008. - С. 57-59.

22. Sarantseva S., Bolshakova О., Timoshenko S., Vitek M, Schwarzman A. Modeling Alzheimer's Disease Pathology in Drosophila-. Neurodegeneration and Synapse Dysfunction - Disease of the Cytoskeleton // Biological Motility. Achievements and Perspectives. International Symposium. - Pushchino, 2008. - P. 262-266.

23. Кислик Г. А., Саранцева С. В. Миметики АроЕ и патогенез болезни Альцгеймера // Вторая Международная конференция «Дрозофила в экспериментальной генетике и биологии»: сб. науч. ст., 2010. -С. 27-31.

24. Sarantseva S., Bolshakova О., Timoshenko S., Vitek M, Schwarzman A. Overexpression of Human Amyloid Precursor Protein Causes Neurodegeneration and Loss of Synaptic Proteins in Neural Cells in Transgenic Drosophila // Medimond International Proceedings. ADPD 2009. - 2010. - P. 245-248.

25. Schwarzman A., Sarantseva S., Solovyev K., Talalaeva E., Runova O., Vitek M. Presenilinl Mediates Cell-Cell Adhesion in Transfected L-Fibroblasts // Medimond International Proceedings. ADPD 2009. - 2010.-P. 245-248.

26. Саранцева С. В., Кислик Г. А. Экспрессия АРР вызывает морфологические нарушения в нейромышечных контактах Drosophila melanogaster // Третья Международная конференция «Дрозофила в экспериментальной генетике и биологии»: сб. науч. ст., 2012. - С. 105-108.

Отпечатано в типографии ФГБУ «ПИЯФ»

188300, Гатчина Ленинградской обл., Орлова роща Зак. 184, тир. 100, уч.-изд. л. 1; 19.08.2012 г.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Саранцева, Светлана Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Болезнь Альцгеймера

1.1.1. Эпидемиология

1.1.2. Клинические признаки

1.1.3. Клиническая диагностика

1.1.4. Нейропатоморфологические признаки болезни Альцгеймера

1.1.5. Гипотеза «амилоидного каскада»

1.2. Болезнь Альцгеймера и дисфункция синапсов

1.2.1. Нейродегенеративные заболевания и дисфункция синапсов

1.2.2. Дисфункция синапсов и болезнь Альцгеймера

1.3. Генетические факторы в патогенезе болезни Альцгеймера

1.3.1. АРР, белок предшественник амилоида

1.3.1.1. Локализация, структура и протеолитический процессинг

1.3.1.2. Клеточные функции АРР

1.3.2. Пресенилин

1.3.3. Пресенилин

1.3.4. Клеточные функции PS1 и PS

1.3.5. Аполипопротеин Е (АпоЕ)

1.4. Современные подходы к лечению болезни Альцгеймера

1.5. Изучение патогенеза болезни Альцгеймера на трансгенных моделях животных

1.5.1. Создание моделей болезни Альцгеймера на млекопитающих

1.5.2. Моделирование болезни Альцгеймера на ИгозоркИа melanogaster

1.5.2.1.Преимущества Вгояоркйа теЫпо^аьЬег в моделирования нейродегенеративных заболеваний человека

1.5.2.2.Модели болезни Альцгеймера на ВгоБорНИа melanogaster

1.5.2.3. йгозоркИа melanogaster - модельная система для изучения потенциальных терапевтических соединений

1.5.2.4. Тестирование лекарственных препаратов и гематоэнцефалический барьер

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы и методы работы с культурами клеток

2.1.1. Клеточные культуры

2.1.2. Конструирование кДНК и трансфекция 74 2. 1.3. Антитела

2.1.4. Иммунопреципитация и иммуноблотинг

2.1.5. Сканирующая электронная микроскопия 75 2. 1.6. Конфокальная лазерная микроскопия 76 2.1.7. Анализ агрегации Ь клеток

2.2. Материалы и методы работы с БгоБорЬИа melanogaster 77 2.2.1. Линии БгозоркИа melanogaster 77 2. 2.2. Иммуноблотинг и иммунопрецепитация 79 2. 2.3. Получение парафиновых срезов головного мозга 80 2. 2.4. Иммуногистохимия 80 2. 2.4.1. Определение Ар в мозге мух 80 2.2.4.2. Определение Ар в нейромышечных контактах личинок

2.2.5. Окраска препаратов Тиофлавином Б (ТЫорЫаут 8)

2.2.6. Проведение ПЦР в реальном времени

2.2.7. Приготовление образцов для анализа распределения синаптических белков в мозге и конфокальная микроскопия

2.2.8. Анализ нейродегенерации в мозге мух

2.2.9. Анализ обучаемости и памяти трансгенных мух

2.2.10. Приготовление препаратов и анализ морфологии нейромышечных соединений

2.2.11. Анализ эндо- и экзоцитоза с использованием красителя FM4

2.2.12. Анализ митохондрий в нейромышечных контактах личинок

2.2.13. Пептиды, использованные в работе и их синтез

2.2.14. Условия тестирования пептидов

2.2.15. Определение пептидов, меченых биотином, в мозге мух

2.2.16. Статистическая обработка

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Роль пресенилина 1 в дисфункции синапсов

3.1.1. Определение клеточной локализации PS1 в поляризованных клетках с высоким уровнем экспрессии эндогенного PS

3.3.2. Анализ дегенерации конусов роста в культуре эмбриональных нейронов мыши с нокаутом гена пресенилина

3.1.3. Анализ структуры цитоскелета конусов роста в культуре эмбриональных нейронов мыши с нокаутом гена пресенилина

3.1.4. Анализ плотности синапсов в культуре эмбриональных нейронов мыши с нокаутом гена пресенилина

3.1.5. Анализ эффекта мутаций в гене пресенилина 1, наблюдаемых при семейных формах болезни Альцгеймера

3.1.5.1. Создание генетических конструкций, несущих мутации в PS1 к ДНК. Получение стабильных клонов L-фибробластов с экспрессией GFP-PS1 кДНК

3.1.5.2. Межклеточные взаимодействия в культурах клеток с экспрессией GFP-PS1 дикого типа и его мутантных аналогов

3.1.6. Роль пресенилинов в дисфункции синапсов

3.2. Роль гена белка предшественника амилоида в синаптогенезе

3.2.1. Клеточное распределение АРР и PS 1 в нейронах

3.2.2. Моделирование нейропатологии болезни Альцгеймера на Drosophila melanogaster

3.2.2.1. Экспрессия АРР, образование и отложения Ар

3.2.2.2. Анализ распределения синаптических белков в мозге мух с экспрессией АРР

3.2.2.3. Анализ уровня мРНК синаптотагмина1 при экспрессии гена АРР человека в нервных клетках Drosophila melanogaster

3.2.2.4. Исследование способности животных к обучению и запоминанию при экспрессии гена АРР человека

3.2.2.5. Влияние экспрессии АРР на нейродегенерациию в мозге мух

3.2.2.6. Анализ морфологических и функциональных нарушений в нейромышечных контактах Drosophila melanogaster, вызванных экспрессией гена АРР человека

3.2.3. Роль АРР в дисфункции синапсов 147 3.3. Анализ нейропротекторных свойств пептидов-миметиков аполипопротеина

Е на модели болезни Альцгеймера на Drosophila melanogaster

3.3.1. Транспорт пептидов, содержащих домены белковой трансдукции, через гематоэнцефалический барьер в Drosophila melanogaster

3. 3.2. Дендример D5 - вектор для транспорта пептидов к клеткам мозга

3.3.3. Эффект пептидов-миметиков аполипопротеина Е Cog 133 и Cog на нейродегенерацию в мозге трансгенных мух

3.3.4. Эффект пептидов-миметиков аполипопротеина Е Cog 133 и Cog 112 на способность животных к обучению и запоминанию

3.3.5. Эффект пептида-миметика Cog 112 на отложения амилоидбета-протеина

3.3.6. Модификации пептидов - миметиков АпоЕ. Нейропротекторные свойства пептидного миметика АпоЕ Cog

3.3.7. Возможные механизмы действия миметиков АпоЕ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль генов пресенилина 1 и белка предшественника амилоида в дисфункции синапсов при болезни Альцгеймера."

Актуальность проблемы. Болезнь Альцгеймера (БА) представляет собой наиболее распространенную форму первичных нейродегенеративных заболеваний пожилого возраста, которая характеризуется потерей памяти, расстройством речи и распадом психической деятельности [Davis, Samuels, 1998]. Несмотря на огромный объём накопленных за последнее время данных, этиология и патогенез заболевания остаются неясными. Лекарственные препараты, применяемые в настоящее время для лечения БА, имеют ограниченный эффект, временно улучшая симптоматику, и не задерживают процесс развития заболевания.

Нейроморфология БА хорошо известна и характеризуется накоплением в мозге больных амилоид-бета-пептида (Aß) в составе экстраклеточных амилоидных отложений, агрегированного белка тау в составе внутриклеточных нейрофибриллярных клубков, дисфункцией и дегенерацией синапсов и гибелью нейронов. Однако первые проявления симптомов заболевания, связанные с потерей памяти и нарушением когнитивных функций, происходят в отсутствии каких-либо признаков амилоидоза или нейрофибриллярной патологии и сопровождаются лишь значительным уменьшением синаптической плотности [Terry, 1992, 2000а]. Даже на более поздних стадиях БА потеря синапсов часто отмечается в отсутствии гибели нейронов, что указывает на первичное поражение синапсов при развитии заболевания [Masliah et al, 1994].

Доминирующей гипотезой развития БА является «гипотеза амилоидного каскада», в основе которой лежит положение о том, что повышенная секреция нейротоксичных форм Aß, являющегося главным компонентом амилоидных отложений в мозге больных, обусловливает всю цепочку патологических изменений, приводящих, в конечном счете, к амилоидозу, нейродегенерации, гибели нейронов и развитию деменции [Hardy, Higgins, 1992; Hardy, Selkoe, 2002]. Главными доказательствами этой гипотезы являются генетические данные о том, что семейные формы БА (СБА) обусловлены мутациями в генах белков, непосредственно участвующих в генерации А0: в гене белка предшественника Ар, получившего название АРР (amyloid precursor protein) (АРР)\ гене пресенилина-1 (PS1) и гене пресенилина-2 (PS2) [Hardy, Selkoe, 2002].

Несмотря на широкое признание гипотезы «амилоидного каскада» первые сомнения в ее универсальном характере вызвали сообщения о том, что у больных в ранней фазе СБА нарушения памяти и дисфункция синапсов происходят в отсутствии амилоидогенеза или нейрофибриллярной дегенерации и предшествуют гибели нейронов [Masliah etal., 1994]. Аналогичные результаты были получены и у трансгенных мышей, несущих СБА мутации в генах АРР и PSI [Oddo et al., 2003.]. И, наконец, изучение больных с наследственными формами БА продемонстрировало, что мутации в PS1 и АРР не обязательно ведут к повышению тотального уровня АР, а, напротив, могут приводить к его снижению [Stenh et al., 2002; Bentahir et al., 2006; Kumar-Singh et al., 2006]. При этом в ряде случаев отмечалось изменение отношения секретируемого Ар, содержащего 40 и 42 аминокислоты (соответственно Ар40 и АР42) [Bentahir et al., 2006; Kumar-Singh et al., 2006]. Эти результаты однозначно показывают, что для ясного понимания патогенеза СБА необходимо учитывать не только изменение секреции Ар, но и возможные нарушения клеточных функций АРР и пресенилинов.

Цель и задачи исследования. Основная цель диссертационной работы -выяснение роли генов пресенилина 1 и АРР в развитии синаптической патологии при болезни Альцгеймера. В работе поставлены следующие задачи: 1. Определить клеточную локализацию PS 1 в поляризованных клетках с высоким уровнем экспрессии эндогенного PS1 и исследовать его роль в установлении межклеточных контактов нейронов.

2. Определить эффект мутаций в гене PS1 на образование межклеточных контактов. Выявить возможные связи между нарушением нормальных функций PS1 (участие в клеточной адгезии) и дисфункцией синапсов.

3. Провести анализ структурных, морфологических и функциональных изменений в синапсах при гиперэкспрессии гена АРР человека в Drosophila melanogaster. Создать модель БА на Drosophila melanogaster, позволяющую разделить цитотоксические эффекты АРР и А(3.

4. Провести анализ нейропротекторных свойств пептидов-миметиков аполипопротеина Е на модели БА Drosophila melanogaster.

Научная новизна работы. Методом высокоразрешающей сканирующей иммуноэлектронной микроскопии и конфокальной микроскопии показано, что PS1 участвует в процессах клеточной адгезии. Впервые показано, что в линиях нейронов, полученных от мышей с нокаутом гена PS1, происходит дегенерация конусов роста и уменьшение числа синапсов. Впервые показано, что мутации в гене PS1 снижают накопление PS1 в межклеточных контактах и ведут к нарушениям клеточной адгезии. Впервые разработана модель БА на Drosophila melanogaster, позволяющая разделить цитотоксические эффекты АРР и Ар. Впервые показано, что экспрессия АРР может приводить к структурным и функциональным изменениям в синапсах, нейродегенерации, экспрессии синаптических белков и когнитивным нарушениям независимо от образования Ар. Впервые показано, что пептиды-миметики аполипопротеина Е уменьшают нейродегенерацию и восстанавливают когнитивные функции животных на модели БА в Drosophila melanogaster.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные в настоящей работе данные имеют фундаментальное значение для понимания патогенеза наследственных форм БА. Полученные результаты расширяют представления о роли генов АРР и PS1 в дисфункции синапсов при БА. Проведенные исследования представляют теоретическую базу и адекватную экспериментальную модель для исследования роли АРР и PS1 в проявлении и развитии синаптических нарушений при БА.

Итоги работы представляют несомненный интерес для практической медицины. Результаты проведенных исследований показывают, что миметики аполипопротеина Е являются перспективными агентами для разработки лекарственной терапии БА.

Полученные результаты могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических и медицинских специальностей. Основные положения, выносимые на защиту:

• Клеточные функции PS1 и природа дисфункций, вызываемых мутациями в этом гене при наследственных формах БА, не исчерпываются участием PS 1 в гамма-секретазном комплексе. PS1 вовлечен в процессы клеточной адгезии, формирование и образование синаптических контактов.

• Нокаут гена PS1 может приводить к нарушениям в образовании синапсов.

• Экспрессия гена АРР человека и его мутантной формы APP-Swedish в нервных клетках Drosophila вызывает изменение синаптогенеза, проявляющееся в уменьшении содержания синаптических белков в мозге. Этот эффект коррелирует с нарушением у животных способности к обучению и запоминанию. Экспрессия АРР приводит к структурным и функциональным нарушениям синапсов нейромышечных контактов личинок Drosophila. Наблюдаемые синаптические нарушения предшествуют нейродегенерации и обусловлены экспрессией гена АРР независимо от образования Aß.

• Пептиды-миметики аполипопротеина Е, созданные на основе его рецептор-связывающего домена, эффективно подавляют нейропатологические процессы, вызываемые экспрессией гена АРР человека на модели БА Drosophila melanogaster. Эти пептиды могут быть использованы для создания нейропротекторных лекарственных препаратов.

Личный вклад автора. Основная часть работы выполнена автором самостоятельно. Она включает в себя непосредственное получение экспериментальных данных, разработку темы и методологии исследования, интерпретации полученных результатов, Результы, представленные в разделе 3.1, получены в совместной работе с сотрудниками ФГБУ НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН Татищевой Ю.А., Руновой O.JL, Соловьевым К.В., что отражено в совместных публикациях. Клонирование аллелей пресенилина 1 в плазмидные вектора, электронная и конфокальная сканирующая микроскопия клеточных культур выполнены д.б.н. Шварцманом A.JI. (ФГБУ ПИЯФ). Часть результов, представленных в разделах 3.2. и 3.3., получены совместно с Тимошенко С.И., Большаковой О.И., Кислик Г.А., Родиным Д.И., что также отражено в совместных публикациях. Часть использованных в работе пептидов синтезированы Колобовым A.A. (НИИ ОЧБ, г. Санкт-Петербург). Пептиды-миметики аполипопротеина Е предоставлены Витеком М. (Университет Дьюка, США).

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на следующих отечественных и международных конференциях и симпозиумах: Второй международной конференции «Биотехнология - биомедицина -окружающая среда» (Пущино, 2005); Всероссийской конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2005); Европейской конференции по нейропсихофармакологи (Амстердам, 2005); Третьей международной конференции «Наука и бизнес» (Пущино, 2006), Международном симпозиуме «Биологическая подвижность: фундаментальные исследования и практика» (Пущино, 2006); на Международном симпозиуме «Biological motility: basic research and practice» (Пущино, 2006); Второй научной конференции «Молекулярная генетика, биофизика и медицина»; Бреслеровские чтения - II (Санкт-Петербург, 2006); Первом международном симпозиуме «Combinatorial Sciences in Biology, Chemistry, Catalysts and Materials» (Флоренция, 2007); Европейской конференции по генетике человека (Париж,

2007; Гетеборг, 2010, Амстердам, 2011); Международной конференции «Нейронауки для медицины и физиологии» (Судак, 2007; 2008; 2011); Третьей международной конференции "Фундаментальные науки - медицине" (Новосибирск, 2007); Международном симпозиуме «Biological motility: achievements and perspectives» (Пущино, 2008), на Российском «конгрессе с международным участием "Молекулярные основы клинической медицины -возможное и реальное" (Санкт-Петербург, 2010); на Международном симпозиуме «Biological Motility. From fundamental achievements to nanotechnologies» (Пущино, 2010); на Международной конференции «Дрозофила в экспериментальной генетике и биологии» (Харьков, 2008; Одесса, 2010; Киев, 2012); XXI съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 38 печатных работ, в том числе 14 оригинальных работ, опубликованных в журналах, включенных в список ВАК, две главы в коллективной монографии и 10 статей в сборниках и материалах российских и международных конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертация объемом 234 страницы включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты и обсуждение, 55 рисунков, 10 таблиц, заключение, выводы и список литературы, включающий 496 источников.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Саранцева, Светлана Владимировна

Выводы

1. PS 1 локализован на поверхности клеточных структур, которые обеспечивают клеточную подвижность и межклеточные контакты: ламеллиподиуме Т-лимфоцитов и конусах роста нейронов, что свидетельствует о вовлечении этого белка в процессы клеточной адгезии.

2. Нокаут гена PS1 приводит к нарушению структуры конусов роста нейронов, их дегенерации и уменьшению числа синапсов.

3. Мутации в гене PS1 приводят к нарушению механизмов клеточной адгезии, что в конечном итоге может обуславливать нарушение формирования и поддержания синаптической сети.

4. Экспрессия гена АРР человека в нервных клетках Drosophila melanogaster вызывает изменения экспрессии синаптических белков, морфологии грибовидных тел мозга, отвечающих за обучение и память животных, нейродегенерацию, и нарушает способность их к обучению и запоминанию. Экспрессия АРР приводит к структурным и функциональным нарушениям синапсов нейромышечных контактов личинок Drosophila melanogaser.

5. Выявленные на модели Б А на Drosophila melanogaster структурные и функциональные нарушения как центральных синапсов имаго, так и синапсов нейромышечных контактов личинок обусловлены экспрессией АРР, а не образованием Ар. Образование АР приводит к усилению нейропатологических процессов.

6. Пептиды-миметики аполипопротеина Е подавляют нейродегенерацию и улучшают обучение и память у трансгенных Drosophila melanogaster, воспроизводящих основные признаки БА. Эти пептиды могут быть использованы для создания нейропротекторных лекарственных препаратов.

7. Проведенное исследование на культуре эмбриональных нейронов мышей с нокаутом гена PS1 и на культурах эпителиальных клеток с экспрессией мутантного PSI, а также на модели БА на Drosophila melanogaster позволяет предположить, что нарушение нормальных функций генов PS1 и АРР может приводить к ранней дисфункции синапсов при БА.

Заключение

Идентификация мутаций в генах АРР, PS1 и PS2, вызывающих раннюю аутосомно-доминантную форму БА, отводит им основную роль в патогенезе БА. Вместе с тем функции АРР и пресенилинов в настоящее время изучены недостаточно и, в силу этого обстоятельства, механизм обменных нарушений и физиологических процессов, обусловленный мутациями, остается неясным. Хотя аномальный протеолитический процессинг АРР, наблюдаемый при наследственных формах БА, послужил основой для выдвижения основной патогенетической гипотезы амилоидного каскада, существует целый ряд наблюдений, вызывающих сомнение в ее универсальности. Так, не все известные на сегодняшний день мутации в генах АРР и пресенилинах приводят в повышенному образованию АР42 или изменению соотношения Ар4о/Ар42 [Duering et al., 2005; Walker et al., 2005; Shen, Keller, 2007]. Во-вторых, попытки создания антиамилоидогенной терапии потерпели неудачу. В-третьих, уровень Ар и его отложения не коррелируют с прогрессией деменции. Кроме этого, у мышей с гиперэкспрессией АРР человека не обнаруживается нейродегенерация, наблюдаемая у больных БА.

В то же время увеличивается число исследований, свидетельствующих, что нарушения синаптических функций, и связанная с ними потеря памяти в ранней фазе БА происходит значительно раньше процессов нейродегенерации или амилоидоза. В качестве альтернативных гипотез выдвигаются предположения о том, что образование нейротоксических агрегатов Ар и белка тау представляют собой лишь одни из многих процессов, вносящих вклад в патогенез заболевания. Так, например, целый ряд наблюдений привел к созданию «пресенилиновой гипотезы» патогенеза БА, в основе которой лежит предположение, что частичная потеря функций пресенилина может вызывать нейродегенерацию и нарушения памяти у больных Б A [Shen, Keller, 2007]. «Пресенилиновая гипотеза» объясняет существование и природу мутаций в пресенилинах при БА и поддерживается многочисленными исследованиями на животных. Однако она не без труда объясняет мутации в АРР при СБА.

В данной работе показано, что АРР и пресенилин 1 локализованы в пресинаптических терминалах и непосредственно вовлечены в образование и поддержание синапсов. Также показано, что экспрессия гена АРР человека в нервных клетках ОгоБоркИа вызывает изменения экспрессии синаптических белков, морфологии грибовидных тел мозга, отвечающих за обучение и память животных, нейродегенерацию и нарушает способность их к обучению и запоминанию. Экспрессия АРР приводит к структурным и функциональным нарушениям синапсов нейромышечных контактов личинок йгозорНПа, при этом наблюдаемые эффекты обусловлены именно экспрессией АРР, а не образованием А(3. Созданная на ОгоБоркИа melanogaster модель Б А воспроизводит основные нейроморфологические черты БА, наблюдаемые у людей, а именно, изменение синаптической плотности, нейродегенерацию, образование и отложение А0, а также и клинические показатели, как нарушение обучения и памяти. Надо отметить, что хотя большинство семейных форм БА обусловлены мутациями в генах АРР и пресенилинах, в литературе представлены данные о том, что дупликации гена АРР могут приводить к развитию БА. В наших экспериментах эффект экспрессии мутантной формы АРР-Бы был значительно слабее, чем экспрессия АРР дикого типа. На основе этих данных можно предположить, что мутации в АРР, связанные с семейными формами Б А, вызывают потерю или снижение его синаптической активности.

Мы также показали, что пептиды-миметики аполипопротеина Е способны блокировать нейродегенерацию и улучшать когнитивные функции трансгенных ВгоэоркИа melanogaster с экспрессией АРР человека. Вопрос разработки стратегии терапевтического лечения не только БА, но и других конформационных болезней в настоящее время остается открытым. Например, для БА в настоящее время не известно ни одного фармакологического препарата, который бы мог, если не предотвратить, то, по крайней мере, замедлить течение этого фатального заболевания. Если бы мы могли разработать препараты, которые ингибировали бы олигомеризацию Ар и одновременно предотвращали бы развитие клинического синдрома, мы бы лучше поняли и патогенетическую основу заболевания. Таким препаратом мог бы быть нейропротектор, восстанавливающий и синаптические, и когнитивные функции. Поиск соответствующих препаратов - как раз тот случай, когда развитие фундаментальной науки и разработка практических терапевтических подходов представляют собой единое целое. Мы полагаем, что пептидные миметики аполипопротеина Е являются перспективными агентами для разработки лекарственной терапии БА.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Саранцева, Светлана Владимировна, Санкт-Петербург

1. Гаврилова С.И. Психические расстройства при первичных дегенеративных (атрофических) процессах головного мозга. // Руководство по психиатрии / Под ред. А. С. Тиганова. М.: Медицина, 1999. Т.2. С. 57-117.

2. Гаврилова С.И. Болезнь Альцгеймера клиника и диагностика // Нейродегенеративные заболевания: фундаментальные и прикладные аспекты / Под ред. академика М.В. Угрюмова. М.: Наука, 2010. С. 243252.

3. Иллариошкин С.Н. Конформационные болезни мозга // М.: Янус-К, 2003. 246 с.

4. Кисели Д. Практическая микротехника и гистохимия. Будапешт: Издательство академии наук Венгрии, 1962. 399 с.

5. Adams M.D., Sekelsky J.J. From sequence to phenotype: reverse genetics in Drosophila melanogaster II Nat Rev Genet. 2002. V.3. № 3. P. 189-98.

6. Adolfsen В., Saraswati S., Yoshihara M., Littleton J.T. Synaptotagmins are trafficked to distinct subcellular domains including the postsynaptic compartment // J. Cell. Biol. 2004. V. 166. P. 249-260.

7. Aigner L., Caroni P. Absence of persistent spreading, branching, and adhesion in GAP-43-depleted growth cones // Cell. 1995. V.83, № 2. P. 269-78.

8. Aisen P.S., Saumier D., Briand R., Laurin J., Gervais F., Tremblay P., Garceau D. A phase II study targeting amyloid-beta with 3APS in mild-to-moderate Alzheimer disease // Neurology. 2006. V.67. P. 1757-1763.

9. Alzheimer A. Uber eine eigenartige Erkrankung der Hirnrinde // Allgemeine Zeitschrift Psychiatrie. 1907. V. 64. P. 146-148.

10. Anandatheerthavarada H.K., Devi L. Amyloid precursor protein and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease // Neuroscientist. 2007. V. 13. P. 626-38.

11. Anekonda T.S. Resveratrol-A boon for treating Alzheimer's disease? // Brain Res.Rev. 2006. V. 52. P. 316-326.

12. Aono M., Lee Y., Grant E.R., Zivin R.A., Pearlstein R.D., Warner D.S., Bennett E.R., Laskowitz D.T. Apolipoprotein E protects against NMDA excitotoxicity // Neurobiol Dis. 2002. V. 11, № 1. P. 214-20.

13. Askanas V., Engel W.K, Alvarez R.B, Frangione B., Ghiso J., Vidal R. Inclusion body myositis, muscle blood vessel and cardiac amyloidosis, and transthyretin Vall22Ile allele// Ann Neurol. 2000. V.47. P. 544-549.

14. Bakchine S., Loft H. Memantine treatment in patients with mild to moderate Alzheimer's disease: Results of a randomised, double-blind, placebo-controlled 6-month study // J Alzheimers Dis. 2008. V.13. P. 97-107.

15. Ballabh P., Braun A., Nedergard M. The blood-brain barrier: an overview: Structure, regulation, and clinical implications // Neurobiol. Dis. 2004. V. 16. P. 1-13.

16. Baloyannis S ,J. Dendritic pathology in Alzheimer's disease // J Neurol Sci. 2009. V. 15. P. 153-7.

17. Baskin F., Smith G.M., Fosmire J.A., Rosenberg R.N. Altered apolipoprotein E secretion in cytokine treated human astrocyte cultures // J Neurol Sci. 1997. V. 148, №1. P. 15-18.

18. Benson D.L., Tanaka H. N-cadherin redistribution during synaptogenesis in hippocampal neurons // J.Neurosci. 1998. V.18. P. 6892-6904.

19. Bentahir M., Nyabi 0.,Verhamme J.,Tolia, A., Horrer K., Wiltfang J., Esselmann H., De Strooper B. Presenilin clinical mutations can affect c-secretase activity by different mechanisms // J. Neurochem. 2006. V.96. P. 732-742.

20. Bertoni-Freddari C., Meier-Ruge W., Ulrich J. Quantitative morphology of synaptic plasticity in the aging brain // Scanning Microsc. 1988. V.2. P. 1027-34.

21. Bertoni-Freddari C., Fattoretti P., Casoli T., Meier-Ruge W., Ulrich J. Morphological adaptive response of the synaptic junctional zones in the human dentate gyrus during aging and Alzheimer's disease // Brain Res. 1990. V. 28. P. 69-75.

22. Bertoni-Freddari C., Fattoretti P., Casoli T., Caselli U., Meier-Ruge W. Deterioration threshold of synaptic morphology in aging and senile dementia of Alzheimer'stype // Anal Quant Cytol Histol. 1996. V. 18. P. 209-213.

23. Bertram L., Tanzi R.E. The current status of Alzheimer's disease genetics: what do we tell the patients? // Pharmacol Res. 2004a. V. 50, № 4. P. 385-396.

24. Bertram L., Tanzi R.E. Alzheimer's disease: one disorder, too many genes? // Hum Mol Genet. 2004b. V. 13, № 1. P. 135-141.

25. Bezprozvanny I., Mattson M.P. Neuronal calcium mishandling and the pathogenesis of Alzheimer's disease // Trends Neurosci. 2008. V. 31. P. 454-463.

26. Bhat R.V., Budd-Haeberlein S.L., Avila J. Glycogen synthase kinase 3: a drug target for CNS therapies// J. Neurochem. 2004. V. 89. P. 1313-7131.

27. Binder L.I., Guillozet-Bongaarts A.L., Garcia-Sierra F., Berry R.W. Tau, tangles, and Alzheimer's disease// Biochim Biophys Acta. 2005. V. 1739. P. 216-223.

28. Bird T.D. Genetic aspects of Alzheimer disease // Genet Med. 2008. V.10. №4. P.231-239.

29. Bogoyevitch M.A., Kendrick T.S., Ng D.C., Barr R.K. Taking the cell by stealth or storm? Protein transduction domains (PTDs) as versatile vectors for delivery // DNA Cell Biol. 2002. v. 21, № 12. P. 879-94.

30. Bolton S.J., Jones D.N., Darker J.G., Eggleston D.S., Hunter A.J., Walsh F.S. Cellular uptake and spread of the cell-permeable peptide penetratin in adult rat brain // Eur. J. Neurosci. 2002. V.12. P. 2847-2855.

31. Bossy-Wetzel E., Schwarzenbacher R., Lipton S.A. Molecular pathways to neurodegeneration // Nat Med. 2004. V. 10, № 1. P. 2-9.

32. Braak E., Griffing K., Arai K., Bohl J., Bratzke H., Braak H. Neuropathology of Alzheimer's disease: what is new since A. Alzheimer? // Europ Archives Psych Clin Neuroscie. 1999. Vol. 249. Suppl. 3. P. 14-22.

33. Braak H., Braak E. Demonstration of amyloid deposits and neurofibrillary changes in whole brain sections // Brain Pathol. 1991a. V.l, №3. P. 213-216.

34. Braak H., Braak E. Neuropathological staging of Alzheimer-related changes // Acta Neuropathol (Berl). 1991b. V. 82. P. 239-259.

35. Braak H., Braak E. Evolution of the neuropathology of Alzheimer's disease // Acta Neurologica Scandinavica Supplementum. 1996. V.165. P. 3-12.

36. Braak H., Braak E. Frequency of stages of Alzheimer-related lesions in different age categories // Neurobiol Aging. 1997. V.l8, № 4. P. 351-357.

37. Brand A.H., Perrimon N.Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes // Development. 1993. V.l 18, №. 2. P. 401415.

38. Brandt R., Hundelt M., Shahani N. Tau alteration and neuronal degeneration in tauopathies: mechanisms and models // Biochim Biophys Acta. 2005. V. 1739. P. 331-354.

39. Brousseau T., Legrain S., Berr C., Gourlet V., Vidal O., Amouyel P. Confirmation of the epsilon 4 allele of the apolipoprotein E gene as a risk factor for late-onset Alzheimer's disease // Neurology. 1994. V.44, № 2. P. 342-344.

40. Brown N.H. Integrins as mediators of morphogenesis in Drosophila // Dev. Biol. 2000. V. 223. P. 1-16.

41. Budnik V. Ruiz-Canada C. The fly neuromuscular junction: structure and function // Int. Rev. Neurobiol. V.75. San Diego: Academic Press. 2006. 425 p.

42. Buell S.J., Coleman P.D. Dendritic growth in the aged human brain andfailure of growth in senile dementia // Science. 1979. V. 206. P. 854-856.

43. Bush A.I, Tanzi R.E. The galvanization of beta-amyloid in Alzheimer's disease // Proc Natl Acad Sci USA. 2002. V. 99, № 11. P. 7317-9.

44. Canevari L., Clark J.B. Alzheimer's disease and cholesterol: the fat connection. // Neurochem Res. 2007. V. 32, № 4-5. P. 739-750.

45. Cao W., Song H.J., Gangi T., Kelkar A., Antani I., Garza D., Konsolaki M. Identification of novel genes that modify phenotypes induced by Alzheimer's beta-amyloid overexpression in Drosophila II Genetics. 2008. V.178, №3. P. 1457-7.

46. Cao X., Siidhof T.C. A transcriptionally correction of transcriptively. active complex of APP with Fe65 and histone acetyltransferase Tip60 // Science. 2001. V. 293. P. 115-20.

47. Cao X., Sudhof T.C. Dissection of amyloid-beta precursor protein-dependent transcriptional transactivation // J Biol Chem. 2004. V. 279. P. 24601-11.

48. Carmine-Simmen K., Proctor T., Tschape J., Poeck B., Triphan T., Strauss R., Kretzschmar D. Neurotoxic effects induced by the Drosophila amyloid-beta peptide suggest a conserved toxic function // Neurobiol Dis. 2009. V. 33. №. 2. P. 274-281.

49. Carrell R.V., Lomas D.A. Conformational disease // Lancet. 1997. V. 350. P. 134138.

50. Carrell R.W., Gooptu B. Conformational changes and disease-serpins, prions and Alzheimer's // Curr Opin Struct Biol. 1998. V. 8. P. 799-809.

51. Castano E.M., Roher A.E., Esh C.L., Kokjohn T.A., Beach, T. Comparative proteomics of cerebrospinal fluid in neuropathologicallyconfirmed Alzheimer'sdisease and non-demented elderly subjects // Neurological Research. 2006. V. 28, №2. P. 155-63.

52. Chai C.K. The genetics of Alzheimer's disease // Am J Alzheimers Dis Other Demen. 2007. V.22, № l.P. 37-41.

53. Chan A. Transgenic nonhuman primates for neurodegenerative diseases // Reproductive Biology and Endocrinology. 2004. V. 2. P. 1-7.

54. Chan S.L., Furukawa K., Mattson M.P. Presenilins and APP in neuritic and synaptic plasticity: implications for the pathogenesis of Alzheimer's disease // Neuro Mol Med. 2002. V. 2. P. 167-196.

55. Chauhan N.B. Membrane dynamics, cholesterol homeostasis, and Alzheimer's disease // J Lipid Res. 2003. V. 44, № 11. P. 2019-2029.

56. Chiang H.C., Iijima K., Hakker I., Zhong Y. Distinctive roles of different beta-amyloid 42 aggregates in modulation of synaptic functions // FASEB J. 2009. V. 23, №6. P. 969-1977.

57. Chiang H.C., Wang L., Xie Z., Yau A., Zhong Y. PI3 kinase signaling is involved in Abeta-induced memory loss in Drosophila // Proc Natl Acad Sci U S A. 2010. V. 107, №15. P. 7060-5.

58. Choi Y.H., Yon G.H., Hong K.S., Yoo D.S., Choi C.W., Park W.K., Kong J.Y., Kim Y.S., Ryu S.Y. In vitro BACE-1 inhibitory phenolic components from the seeds of Psoralea corylifolia // Planta Med. 2008. V. 74. P. 1405-1408.

59. Chung H.M., Struhl G. Nicastrin is required for Presenilin-mediated transmembrane cleavage in Drosophila // Nat. Cell Biol. 2001. Vol. 3. P. 1129-32.

60. Citron M. Strategies for disease modification in Alzheimer's disease // Nature Rev. Neuroscie. 2004. V. 5. P. 677-685.

61. Clinton J., Blackman S.E., Royston M.C., Roberts G.W. Differential synaptic loss in the cortex in Alzheimer's disease: a study using archival material // Neuroreport. 1994. V. 5.P. 497-500.

62. Cohen F.E., Kelly J.W. Therapeutic approaches to protein-misfolding diseases // Nature. 2003. V. 426, № 6968. P. 905-9.

63. Coleman M. Axon degeneration mechanisms: Commonality amid diversity // Nat Rev Neurosci. 2005. V. 6. P. 889-898.

64. Coleman P.D., Yao P.J. Synaptic slaughter in Alzheimer's disease // Neurobiol Aging. 2003. V. 24. P. 1023-1027.

65. Couzin J. Genetics. Once shunned, test for Alzheimer's risk headed to market // Science. 2008. V.319, № 5866. P. 1022-1023.

66. Crowther D.C., Kinghorn K.J., Miranda E., Page R., Curry J.A., Duthie F.A., Gubb D.C., Lomas D.A. Intraneuronal Abeta, nonamyloid aggregates and neurodegeneration in a Drosophila model of Alzheimer's disease // Neuroscience. 2005. V.132. P. 123-135.

67. Cruts M., Van Broeckhoven C. Molecular genetics of Alzheimer's disease // Ann Med. 1998. V. 30, № 6. P. 560-565.

68. Cunningham C., Deacon R., Wells H., Boche D., Waters S., Diniz C.P., Scott H., Rawlins J.N., Perry V.H. Synaptic changes characterize early behavioural signs in the ME7 model of murine prion disease // Eur J Neurosci. 2003. V.17. P. 214755.

69. Daneman R., Barres, B.A. The blood-brain barrier lessons from moody flies // Cell. 2005. V.123. № 1. P. 9-12.

70. Davis K.L., Samuels S.C. Dementia and delirium // Pharmacological Management of Neurological and Psychiatric Disorders / New York: McGraw-Hill, 1998. P. 267316.

71. Daw E.W., Payami H., Nemens E.J., Nochlin D., Bird T.D., Schellenberg G.D., Wijsman E.M. The number of trait loci in late-onset Alzheimer disease // Am J Hum Genet. 2000. V. 66, № 1. P. 196-204.

72. DeSalvo M.K., Mayer N., Mayer F., Bainton R.J. Physiologic and anatomic characterization of the brain surface glia barrier of Drosophila II Glia. 2011. V. 59. P. 1322-40.

73. De Sauvage F., Octave J.N. A novel mRNA of the A4 amyloid precursor gene coding for a possibly secreted protein // Science. 1989. V.245, № 4918. P. 651-653.

74. De Strooper B. Aph-1, Pen-2, and Nicastrin with Presenilin generate an active gamma-Secretase complex // Neuron. 2003. V. 38. P. 9-12.

75. De Strooper B.D., Annaert W. Presenilins and the intramembrane proteolysis of proteins: facts and fiction // Nat. Cell Biol. 2001. V. 3, № 10. P. 221-25.

76. De Strooper B., Annaert W. Proteolytic processing and cell biological functions of the amyloid precursor protein // J. Cell Sci. 2002. V.l 13. P. 1857-70.

77. Derossi D., Joliot A.H., Chassaing G., Prochiantz A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes // J. Biol. Chem. 1994. V. 269, № 14. P. 10444-10450.

78. Dhanikula R.S., Argaw F., Bouchard J., Hildgen P. Methotrexate loaded polyether-copolyester dendrimers for the treatment of gliomas: enhanced efficacy and intratumoral transport capability // Mol. Pharmaceutics. 2008. V. 5. P. 105-116.

79. Dodel R., Neff F., Noelker C., Pul R., Du Y., Bacher M., Oertel W. Intravenous immunoglobulins as a treatment for Alzheimer's disease: rationale and current evidence // Drugs. 2010. V.70. P. 513-528.

80. Doody R.S. Therapeutic standards in Alzheimer disease // Alzheimer Dis Assoc Disord. 1999. V.13. Suppl. 2. P. 20-6.

81. Dotti C.G., Simons K. Polarized sorting of viral glycoproteins to the axon and dendrites of hippocampal neurons in culture // Cell. 1990. V.62. P. 63-72.

82. Drin G., Rousselle C., Scherrmann J.M., Rees A.R., Temsamani J. Peptide delivery to the brain via adsorptive-mediated endocytosis: advances with SynB vectors // AAPS PharmSci. 2002. V.4, № 4. E26.

83. Duering M., Grimm M.O., Grimm H.S., Schroder J., Hartmann T. Mean age of onset in familial Alzheimer's disease is determined by amyloid beta 42 // Neurobiol Aging. 2005. V. 26. P. 785-788.

84. Duncan J.E., Goldstein L.S. The genetics of axonal transport and axonal transport disorders // PLoS Genetics. 2006. V. 2. el24-el27.

85. Dyrks T., Dyrks E., Hartmann T., Masters C., Beyreuther K. Amyloidogenicity of beta A4 and beta A4-bearing amyloid protein precursor fragments by metal -catalyzed oxidation //J Biol Chem. 1992. V. 267, № 25. P. 18210-7.

86. Edbauer D., Winkler E., Regula J.T., Pesold B., Steiner H., Haass C. Reconstitution of gamma-secretase activity // Nat Cell Biol. 2003. V. 5, № 5. P. 486-488.

87. Egleton R.D., Davis T.P. Development of neuropeptide drugs that cross the blood-brain barrier // NeuroRx . 2005. V. 2. P. 44-53.

88. Elliott D., Brand H. The GAL4 system. A Versatile System for the Expression of Genes // Methods in Molecular Biology: Drosophila: Methods and Protocols / Edited by C. Dahmann. NJ.: Humana Press Inc., 2008. P. 79-85.

89. Enerly E., Larsson J., Lambertsson A. Reverse genetics in Drosophila: from sequence to phenotype using UAS-RNAi transgenic flies // Genesis. 2002. V. 34, № 1. P. 152-5.

90. Faivre-Sarrailh C., Banerjee S., Li. J., Hortsch M., Laval M., Bhat M.A. Drosophila contactin, a homolog of vertebrate contactin, is required for septate junction organization and paracellular barrier function // Development. 2004. V. 131. P. 4931—4942.

91. Farlow M.R., Evans R.M. Pharmacologic treatment of cognition in Alzheimer's dementia//Neurology. 1998. V. 51(1 Suppl 1). S 36-44.

92. Ferreira A., Caceres A., Kosik K.S. lntraneuronal compartments of the amyloid precursor protein // J.Neuroscie. 1993. V.13. P. 3112-3123.

93. Finch C.E., Stanford C.B. Meat-adaptive genes and the evolution of slower aging in humans // Q Rev Biol. 2004. V. 79, № 1. P. 3-50.

94. Finelli A., Kelkar A., Song H.-J., Yang H., Konsolaki M. A model for studying Alzheimer's AB42-induced toxicity in Drosophila melanogaster // Mol. Cell. Neurosci. 2004. V. 26, № 3. P. 365-375.

95. Fortini M.E., Skupski M.P., Boguski M.S., Hariharan I.K. A survey of human disease gene counterparts in the Drosophila genome // J. Cell Biol. 2000. V.150. P. 2330.

96. Fossgreen A., Brückner B., Czech C., Masters C.L., Beyreuther K., Paro R. Transgenic Drosophila expressing human amyloid precursor protein show y-secretase activity and a blistered-wing phenotype // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1998. V. 95. P. 703-8.

97. Franklin J.L., Berechid B.E., Cutting F.B., Presente A., Chambers C.B., Foltz D.R., Ferreira A., Nye J.S. Autonomous and non-autonomous regulation of mammalian neurite development by Notchl and Deltal // Curr.Biol. 1999. V. 9. P. 1448-1457.

98. Funato H., Enya M., Yoshimura M., Morishima-Kawashima M., Ihara, Y. Presence of sodium dodecyl sulfate-stable amyloid beta-protein dimers in the hippocampus CA1 not exhibiting neurofibrillary tangle formation // Am. J. Pathol. 1997. V.155. P. 23-28.

99. Gao Y, Gao G, He Y, Liu T, Qi R. Recent advances of dendrimers in delivery of genes and drugs. Mini Rev Med Chem. 2008. V.9. P. 889-900.

100. Gao Y., Pimplikar S.W. The gamma -secretase-cleaved C-terminal fragment of amyloid precursor protein mediates signaling to the nucleus // Proc Natl Acad Sci USA. 2001. V. 98. P. 14979-84.

101. Geldmacher D.S., Frolich L., Doody R.S., Erkinjuntti T., Vellas B., Jones R.W., Baneijee S., Lin P., Sano M. Realistic expectations for treatment success in Alzheimer's disease // J Nutr Health Aging. 2006. V. 10. P. 417-429.

102. Gelinas D.S., DaSilva K., Fenili D., St George-Hyslop P., McLaurin J. Immunotherapy for Alzheimer's disease // Proc Natl Acad Sci USA. 2004. V. 101. Suppl 2. P. 4657-62.

103. Genova J.L., Fehon R.G. Neuroglian, Gliotactin, and the Na/K-ATPase are essential for septate junction function in Drosophila II J. Cell Biol. 2003. V. 161, № 5. P. 979-989.

104. Gervais F., Chalifour R., Garceau D., Kong X., Laurin J., Mclaughlin R., Morissette C., Paquette J. Glycosaminoglycan mimetics: a therapeutic approach to cerebral amyloid angiopathy// Amyloid. 2001. V.8. Suppl 1. P. 28-35.

105. Ghosal K., Vogt D.L., Liang M., Shen Y., Lamb B.T., Pimplikar S.W. Alzheimer's disease-like pathological features in transgenic mice expressing the APP intracellular domain // Proc Natl Acad Sci USA. 2009. V. 106. P. 18367-72.

106. Giaccone G., Tagliavini F., Linoli G., Bouras C., Frigerio L., Frangione B., Bugiani O. Down patients: extracellular preamyloid deposits precede neuritic degeneration and senile plaques II Neurosci Lett. 1989. V. 97. № 1-2. P. 232-238.

107. Giacobini E. Do cholinesterase inhibitors have disease-modifying effects in Alzheimer's disease? // CNS Drugs. 2001. V. 15. P. 85-91.

108. Giacobini E. Long-term stabilizing effect of cholinesterase inhibitors in the therapy of Alzheimer' disease // J Neural Transm Suppl. 2002. V. 62. P. 181-7.

109. Giacomotto J., Segalat L. High-throughput screening and small animal models, where are we? //Br J Pharmacol. 2010. V. 160, № 2. P. 204-16.

110. Gibson G.E., Haroutunian V., Zhang H., Park L.C., Shi Q., Lesser M., Mohs R.C., Sheu R.K., Blass J.P. Mitochondrial damagein Alzheimer's disease varies with apolipoprotein E genotype // Ann Neurol. 2000. V. 48, № 3. p. 297-303.

111. Gillingwater T.H, Ribchester R.R. Compartmental neurodegeneration and synapticplasticity in the Wlds mutant mouse // J. Physiol. 2001. V.534. P. 627639.

112. Gilman C.P., Mattson M.P. Do apoptotic mechanisms regulate synaptic plasticity and growth-cone motility? // Neuro Molecular Med. 2002. V. 2. P. 197-214.

113. Gilman S., Koller M., Black R.S. Clinical effects of Ab immunization (AN1792) in patients with AD in an interrupted trial // Neurology. 2005. V. 64. P. 1553-1562.

114. Glenner G.G., Wong C.W., Quaranta V., Eanes E.D. The amyloid deposits in Alzheimer's disease: their nature and pathogenesis // Appl Pathol. 1984. V.2, № 6. P. 357-369.

115. Glenner G., Wong C. Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein // Biochem Biophys Res Commun. 1984. V. 16. P. 885-90.

116. Gloeckner S.F., Meyne F., Wagner F., Heinemann U., Krasnianski A., Meissner B., Zerr I. Quantitative analysis of transthyretin, tau and amyloid-beta in patients with dementia // J. Alzheimers Dis. 2008. V. 14. P. 17-25.

117. Gloeckner S.F., Zerr I. Transthyretin cerebrospinal fluid levels in Alzheimer's disease Is this a biomarker for disease severity? // Europ Neurol Rev. 2010. V. 12, №38. P. 17-19.

118. Goedert M., Spillantini M.G. A century of Alzheimer's disease // Science. 2006. V. 314, №5800. P. 777-781.

119. Goguel V., Belair A.L., Ayaz D., Lampin-Saint-Amaux A., Scaplehorn N., Hassan B.A., Preat T. Drosophila amyloid precursor protein-like is required for long-term memory // J Neurosci. 2011. V. 31, № 3. P. 1032-7.

120. Goldgaber D., Lerman M.I., McBride O.W., Saffiotti U., Gajdusek D.C. Characterization and chromosomal localization of a cDNA encoding brain amyloid of Alzheimer's disease // Science. 1987. V. 235 № 4791. P. 877-880.

121. Golde T.E., Estus S., Usiak M., Younkin L.H., Younkin S.G. Expression of beta amyloid protein precursor mRNAs: recognition of a novel alternatively spliced form and quantitation in Alzheimer's disease using PCR // Neuron. 1990. V. 4, № 2. P. 253-267.

122. Gótz J., Streffer J.R., David D., Schild A., Hoerndli F., Pennanen L., Kurosinski P., Chen F. Transgenic animal models of Alzheimer's disease and related disorders: histopathology, behavior and therapy // Mol Psychiatry. 2004. V.9. № 7, P. 66483.

123. Goutte C., Tsunozaki M., Hale V.A., Priess J.R. APH-1 is a multipass membrane protein essential for the Notch signaling pathway in Caenorhabditis elegans embryos // Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 2002. Vol. 99. P. 775-79.

124. Greeve I., Kretzschmar D., Tschape J-A., Beyn A., Brellinger C., Schweizer M., Nitsch R.M., Reifegerste R. Age-dependent neurodegeneration and Alzheimer-amyloid plaque formation in transgenic Drosophila // J. Neurisci. 2004. V.24. P. 3899-3906.

125. Gunawardena S., Goldstein L.S. Disruption of axonal transport and neuronal viability by amyloid precursor protein mutations in Drosophila //Neuron. 2001. V. 32. P. 389-401.

126. Haass C., Koo E.H., Mellon A., Hung A.Y., Selkoe D.J. Targeting of cell-surface beta-amyloid precursor protein to lysosomes: alternative processing into amyloid-bearing fragments //Nature. 1992. V. 57, № 6378. P. 500-503.

127. Han D. D., Stein, D., Stevens L. M. Investigating the function of follicular subpopulations during Drosophila oogenesis through hormone-dependent enhancer-targeted cell ablation // Development. 2002. V.127, № 3. P. 573-583.

128. Hardy J. Amyloid, the presenilins and Alzheimeris disease // Trends Neurosci. 1997. V. 20. P. 154-159.

129. Hardy J. The genetic causes of neurodegenerative diseases // J AlzheimersDis. 2001. V.3, № l.P. 109-116.

130. Hardy J.A., Higgins G.A. Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis // Science. 1992. V. 256, № 5054. P. 184-5.

131. Hardy J., Selkoe D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. An updated summary of the amyloid hypothesis // Science. 2002. V. 297. P. 353-356.

132. Harper J. D., Wong S.S., Lieber C.M., Lansbury P.J. Assembly of A beta amyloid protofibrils: an in vitro model for a possible early event in Alzheimer's disease // Biochemistry. 1999. V. 38. P. 8972-8980.

133. Hartmann D., De Strooper B., Saftig, P. Presenilin-1 deficiency leads to loss of Cajal-Retzius neurons and cortical dysplasia similar to human type 2 lissencephaly // Current Biol. 1999. V.9. P. 719-727.

134. Henderson V.W. Estrogen-containing hormone therapy and Alzheimer's disease risk: Understanding discrepant inferences from observational and experimental research //Neuroscience. 2006. V. 138. P. 1031-1039.

135. Ho A., Shen J. Presenilins in synaptic function and disease // Trends in Mol Med/. 2011. V.17. P. 617-62

136. Hoane M.R., Kaufman N., Vitek M.P., McKenna S.E. COGMIO improves cognitive performance and reduces cortical neuronal loss in the traumatically injured brain // J Neurotrauma. 2009. V. 26, №1. P. 121-9.

137. Hollenbeck P.J. Mitochondria and neurotransmission: Evacuating the synapse // Neuron. 2005. V. 47. P. 331-333.

138. Huang W., Yu H., Sheng R., Li J., Hu, Y. Identification of pharmacophore model, synthesis and biological evaluation of N-phenyl-l-arylamide and N-phenylbenzenesulfonamide derivatives as BACE 1 inhibitors // Bioorg Med Chem. 2008. V.16.P. 10190-10197.

139. Huet F., Lu J.T., Myrick K.V., Baugh L.R., Crosby M.A., Gelbart W.M. A deletion-generator compound element allows deletion saturation analysis for genomewide phenotypic annotation // Proc Natl Acad Sci USA. 2002. V. 99, № 15. P. 994853.

140. Hughes S.R., Khorkova O., Goyal S., Knaeblein J., Heroux J., Riedel N.G., Sahasrabudhe S. Alpha2-macroglobulin associates with beta-amyloid peptide and prevents fibril formation // Proc. Natl. Acad. Sci. 1998. V. 95. P. 3275-3280.

141. Jack C.R. Jr, Petersen R.C., Grundman M., Jin S., Gamst A., Ward C.P., Sencakova D., Doody R.S., Thai L.J. Longitudinal MRI findings from the vitamin E and donepezil treatment study for MCI // Neurobiol Aging. 2008. V. 29. P. 12851295.

142. Jacobsen K.T., Iverfeldt K. Amyloid precursor protein and its homologues: a family of proteolysis-dependent receptors // Cell Mol Life Sci. 2009. V. 66, № 14. P. 2299-318.

143. Juang J.L., Carlson S.D. Analog of vertebrate anionic sites in blood-brain interface of larval Drosophila // Cell Tissue Res. 1994. V. 277, № 1. P. 87-95.

144. Janssen J.C., Beck J.A., Campbell T.A., Dickinson A., Fox N.C., Harvey R.J., Houlden H., Rossor M.N., Collinge J. Early onset familial Alzheimer's disease:mutation frequency in 31 families // Neurology. 2003. V. 60, № 2. P. 235-239.

145. Jin L.W., Ninomiya H., Roch J.M., Schubert D., Masliah E., Otero D.A., Saitoh T. Peptides containing the RERMS sequence of amyloid beta/A4 protein precursor bind cell surface and promote neurite extension // J Neurosci. 1994. V. 14. P. 5461-5470.

146. John V., Beck, J. P., Bienkowski M. J., Sinha S., Heinrikson R. L. Human P-secretase (BACE) and BACE inhibitors. // J. Med. Chem. 2003. V. 46. P. 4625^630.

147. Justice N. J., Jan Y. N. Variations on the Notch pathway in neural development // Curr. Opin. Neurobiol. 2002. Vol. 12. P. 64-70.

148. Kamal A., Stokin G.B., Yang Z., Xia C.H, Goldstein L.S. Axonal transport of amyloid precursor protein is mediated by direct binding to the kinesin light chain subunit of kinesin-I // Neuron. 2000. V. 28. P. 449^59.

149. Kamboh M.I. Molecular genetics of late-onset Alzheimer's disease // Ann Hum Genet. 2004. V. 68, № 4. P. 381-404.

150. Kanemitsu, H., Tomiyama, T., Mori, H. Human neprilysin is capable of degrading amyloid beta peptide not only in the monomelic form but also the pathological oligomeric form // Neuroscie Let. 2003. V. 350. P. 113-116.

151. Kawas C.H. Clinical practice early Alzheimer's disease // N Engl J Med. 2003. V. 349, № 11. P. 1056-1063.

152. Kazazian H.H. Mobile elements: drivers of genome evolution // Science. 2004. V. 303. P. 1626-1632.

153. Keller J.N., Lauderback C.M., Butterfield D.A., Kindy M.S., Yu J, Markesbery W.R. Amyloid beta-peptide effects on synaptosomes from apolipoprotein E-deficient mice // J Neurochem. 2000. V. 74, № 4. P. 1579-1586.

154. Kenwrick S., Doherty P. Neural cell adhesion molecule LI: relating disease tofunction//BioEssays. 1998. V. 20. P. 668-675.

155. Kilic U., Kilic E., Dietz G.P., Bahr M. Intravenous TAT-GDNF is protective after focal cerebral ischemia in mice // Stroke. 2003. V. 34. P. 1304-1310.

156. Kimberly W.T., LaVoie M.J., Ostaszewski B.L., Ye W., Wolfe M.S., Selkoe D.J. Gamma-secretase is a membrane protein complex comprised of presenilin, nicastrin, Aph-1, and Pen-2 // Proc Natl Acad Sci USA. 2003. V. 100, № 11. P. 6382-6387.

157. Kimura M., Akasofu S., Ogura H., Sawada K. Protective effect of donepezil against Ab (1-40) neurotoxicity in rat septal neurons // Brain Res. 2005. V. 1047. P. 7284.

158. Kitaguchi N., Takahashi Y., Tokushima Y., Shiojiri S., Ito H. Novel precursor of Alzheimer's disease amyloid protein shows protease inhibitory activity // Nature. 1988. V. 331, №6156. P. 530-532.

159. Knobloch M., Konietzko U., Krebs D.C., Nitsch R.M. Intracellular Abeta and cognitive deficits precede betaamyloid deposition in transgenic arcAbeta mice // Neurobiol Aging. 2007. V. 28. P. 1297-306.

160. Koo E.H., Squazzo S.L. Evidence that production and release of amyloid beta-protein involves the endocytic pathway // J Biol Chem. 1994. V. 269, № 26. P. 1738617389.

161. Kopan R., Goate A. A common enzyme connects Notch signaling and Alzheimer'sdisease // Genes Dev. 2000. V. 14. P. 2799-806.

162. Kosik K.S., Bakalis S.F., Selkoe D.J., Pierce M.W., Duffy L.K. High molecular weight microtubule-associated proteins: purification by electro-elution and amino acid compositions // J Neurosci Res. 1986. V. 15, № 4. P. 543-551.

163. Krashes M.J., Waddell S. Drosophila neurobiology. A laboratory manual // New York: Cold Spring Harbor, 2010.

164. Kukar T., Prescott S., Eriksen J.L., Holloway V., Murphy M.P., Koo E.H., Golde T.E., Nicolle M.M. Chronic administration of R-flurbiprofen attenuates learning impairments in transgenic amyloid precursor protein mice // BMC Neurosci. 2007. V. 8. P. 54.

165. Kukull W.A., Higdon R., Bowen J.D., McCormick W.C., Teri L., Schellenberg G.D., van Belle G., Jolley L., Larson E.B. Dementia and Alzheimer disease incidence: a prospective cohort study // Arch Neurol. 2002. V. 59, № 11. P. 1737-1746.

166. Kunkel TA. The mutational specificity of DNA polymerases-alpha and -gamma during in vitro DNA synthesis // J Biol Chem. 1985. V. 260, № 23. P. 12866-74.

167. Kuromi H., Kidokoro Y. Two distinct pools of synaptic vesicles in single presynaptic boutons in a temperature-sensitive Drosophila mutant, Shibre II Neuron. 1998. V. 20. P. 917-925.

168. Du M.J., Pederson T.M., Frail D.E., Reardon C.A., Getz G.S., Falduto M.T. Purification of apolipoprotein E attenuates isoform-specific binding to beta-amyloid // J Biol Chem. 1995. V. 270, № 16. P. 9039-9042.

169. G., Higdon R., Kukull W.A., et al. Statin therapy and risk of dementia in the elderly: a community-based prospective cohort study // Neurology. 2004. V. 63. P. 1624-8.

170. G., Kukull W.A., Peskind E., et al. Differential effect of statins on risk of AD by age, sex and APOE genotype: findings from a community-based prospective cohort study // Alzheimer Dis Assoc Disord. 2006. V. 20. P. 103-4.

171. Mahley R.W., Rail S.C. Jr. Is epsilon4 the ancestral human apoE allele? // Neurobiol Aging. 1999. V. 20, № 4. P. 429-430.

172. Mahley R.W., Rail S.C. Jr. Apolipoprotein E: far more than a lipid transport protein // Annu Rev Genomics Hum Genet. 2000. V. 1. P. 507-37.

173. Mahley R.W., Weisgraber K.H., Huang Y. Apolipoprotein E4: a causative factor and therapeutic target in neuropathology, including Alzheimer's disease // Proc Natl Acad Sci USA. 2006. V. 103, № 15. P. 5644-5651.

174. Mann D.M., Prinja D., Davies C.A., Ihara Y., Delacourte A., Defossez A., Mayer R.J., Landon M. Immunocytochemical profile of neurofibrillary tangles in Down'ssyndrome patients of different ages // J Neurol Sci. 1989. V. 92, № 2-3. P. 247260.

175. Marr R.A., Guan H., Rockenstein E., Kindy M., Gage F.H., Verma I., Masliah E., Hersh L.B. Neprilysin regulates amyloid Beta peptide levels // J. Mol Neuroscie. 2004. V. 22. P. 5-11.

176. Marsh J.L., Thompson L.M. Drosophila in the study of neurodegenerative disease // Neuron. 2006. V.52, № 1. P. 169-78.

177. Masliah E., Mallory M., Hansen L., DeTeresa R., Terry R.D. Quantitative synaptic alterations in the human neocortex during normal aging // Neurology. 1993. V.43. P. 192-197.

178. Masliah E., Mallory M., Hansen L., DeTeresa R., Alford M., Terry R. Synaptic and neuritic alterations during the progression of Alzheimer's disease // Neurosci Lett. 1994. V. 174. P. 67-72.

179. Masliah E., Mallory M., Alford M., DeTeresa R., Hansen L.A., McKeel Jr D.W., Morris J.C. Altered expression of synaptic proteins occurs early during progression of Alzheimer's disease // Neurology. 2001. V.56. P. 127-129.

180. Masliah E., Crews L., Hansen L. Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer's disease // J. Alzheimer's Disease. 2006. V. 9. P. 91-99.

181. Mattson M.P, Guo Q., Furukawa K., Pedersen W.A. Presenilins, the endoplasmic reticulum, and neuronal apoptosis in Alzheimer's Disease // J.Neurochem. 1998. V. 70. P. 1-14.

182. Mattson M.P., Gleichmann M., Cheng A. Mitochondria in neuroplasticity and neurological disorders // Neuron. 2008. V. 60. P. 748-766.

183. Matsumoto K., Toh-e A., Oshima Y. Genetic control of galactokinase synthesis in Saccharomyces cerevisiae: evidence for constitutive expression of the positive regulatory gene gal4 // J. Bacterid. 1978. V. 134. P. 446^157.

184. Mavroudis I.A., Fotiou D.F., Manani M.G., Njaou S.N., Frangou D., Costa V.G., Baloyannis S.J. Dendritic pathology and spinal loss in the visual cortex in Alzheimer's disease: a Golgi study in pathology // Int J Neurosci. 2011. V. 121. P. 347-54.

185. Mawuenyega K.G., Sigurdson W., Ovod V., Munsell L., Kasten T., Morris J.C., Yarasheski K.E., Bateman R.J. Decreased clearance of CNS beta-amyloid in Alzheimer's disease // Science. 2010. V. 330, № 6012. P. 1774.

186. Mayeux R. Epidemiology of neurodegeneration // Annu RevNeurosci. 2003. V. 26, №6. P. 81-104.

187. Mayeux R., Stern Y., Ottman R., Tatemichi T.K., Tang M.X., Maestre G., Ngai C., Tycko B., Ginsberg H. The apolipoprotein epsilon 4 allele in patients with Alzheimer's disease // Ann Neurol. 1993. V. 34, № 5. P. 752-754.

188. McGowan E., Eriksen J., Hutton M. A decade of modeling Alzheimer's disease in transgenic mice // TRENDS in Genetics. 2006. V. 22, № 5. P. 281-289.

189. McGuinness B, CraigD, Bullock R, Passmore P. 2009. Statins for the prevention of dementia. Cochrane Database Syst Rev CD003160.

190. McGuire S.E., Le P.T., Osborn A.J., Matsumoto K., Davis R.L. Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila II Science. 2003. V. 302. P. 17651768.

191. McKhann G., Drachman D., Folstein M., Katzman R., Price D., Stadlan E.M. Clinical diagnosis of Alzheimer's disease: report of the NINCDS-ADRDA Work

192. Group under the auspices of Department of Health and Human Services Task Force on Alzheimer's Disease // Neurology. 1984. V. 34, № 7. P. 939-944.

193. Merched A., Serot J.M., Visvikis S., Aguillon D., Faure G., Siest G. Apolipoprotein E, transthyretin and actin in the CSF of Alzheimer's patients: relation with the senile plaques and cytoskeleton biochemistry // FEBS Letters. 1998. V. 425. P. 225-228.

194. Merdes G., Soba P., Loewer F. Interference of human and Drosophila APP and APP-like proteins with PNS development in Drosophila // EMBO J. 2004. V.23. P. 4082-4095.

195. Metaxakis A., Oehler S., Klinakis A., Savakis C. Minos as a genetic and genomic tool in Drosophila melanogaster //Genetics. 2005. V. 171, № 12. P. 571-81.

196. Milward E.A., Papadopoulos R., Fuller S.J., Moir R.D., Small D., Beyreuther K., Masters C.L. The amyloid protein precursor of Alzheimer's disease is a mediator of the effects of nerve growth factor on neurite outgrowth // Neuron. 1992. V. 9. P. 129-137.

197. Misra U.K., Adlakha C.L., Gawdi G., McMillian M.K., Pizzo S.V., Laskowitz D.T. Apolipoprotein E and mimetic peptide initiate a calcium-dependent signaling response in macrophages // J Leukoc Biol. 2001. V. 70, № 4. P. 677-83.

198. Misztal M., Frankiewicz T., Parsons C.G., Danysz W. Learning deficits induced by chronic intraventricular infusion of quinolinic acid protection by MK-801 and memantine // Eur J Pharmacol. 1996. V. 296. P. 1-8.

199. Moloney A., Sattelle D.B., Lomas, D.A., Crowther D.C. Alzheimer's disease: insights from Drosophila melanogaster models // Trends Biochem Sci. 2010. V. 35, № 4. P. 228-35.

200. Moya K.L., Benowitz L.I., Schneider E., Allinquant B. The amyloid precursor protein is developmentally regulated and correlated with synaptogenesis // Dev Biol. 1994. V. 161. P. 597-603.

201. Mucke L., Maslaih E., Johnson W.B. Synaptotrophic effects of human amyloid b protein precursors in the cortex of transgenic mice // Brain Res. 1994. V. 666. P. 151-167.

202. Muchowsk P.J., Wacker J.L. Modulation of neurodegenerations by molecular chaperons // Nature Rev Neuroscie. 2005. V. 6. P. 11-22.

203. Mullan M., Crawford F., Axelman K., Houlden H., Lilius L., Winblad B., Lannfelt L. A pathogenic mutation for probable Alzheimer's disease in the APP gene at the N-terminus of beta-amyloid // Nat Genet. 1992. V. 1. P. 345-7.

204. Nagafuchi A., Shirayoshi Y., Okazaki K., Yasuda K., Takeichi M. Transformation of cell adhesion properties by exogenously introduced E-cadherin cDNA // Nature. 19987. V. 329. P. 341-3.

205. Nagy Z., Esiri M.M., Jobst K.A., Johnston C., Litchfield S., Sim E., Smith A.D. Influence of the apolipoprotein E genotype on amyloid deposition and neurofibrillary tangle formation in Alzheimer's disease // Neuroscience. 1995. V. 69, №3. P. 757-761.

206. Narindrasorasak S., Lowery D.E., Altman R.A., Gonzalez-DeWhitt P., Greenberg B., Kisilevsky R. Characterization of high affinity binding between laminin and Alzheimer's disease amyloid precursor proteins // Lab Invest. 1992. V. 67. P. 643-652.

207. Naruse S., Thinakaran G., Luo J. Effects of PS1 deficiency on membrane protein trafficking in neurons // Neuron. 1998. V. 21. P. 1213-21.

208. Newhouse Y., Weisgraber K. Apolipoprotein E expression and purification // Methods Mol Biol. 2011. V. 670. P. 127-40.

209. Nicoll J.A., Roberts G.W., Graham D.I. Apolipoprotein E epsilon 4 allele is associated with deposition of amyloid beta-protein following head injury // Nat Med. 1995. V. 1, № 2. P. 135-137.

210. Noll E., Medina M., Hartley D. Presenilin affects arm/beta catenin localization and function in Drosophila // Dev.Biol. 2000. Vol. 227. P. 450^164.

211. Nunomura A., Perry G., Aliev G., et al. Oxidative damage is the earliest event in Alzheimer disease // J Neuropathol Exp Neurol. 2001. V. 60. P. 759-67.

212. Nussbaum R.L., Ellis C.E. Alzheimer's disease and Parkinson's disease // N Engl J Med. 2003. V. 348, № 14. P. 1356-1364.

213. O'Brien R.J., Wong P.C. Amyloid precursor protein processing and Alzheimer's disease // Annu Rev Neurosci. 2011. V. 34. P. 185-204.

214. Oddo S., Caccamo A., Shepherd J.D., Murphy M.P., Golde T.E., Kayed R., Metherate R., Mattson M.P., Akbari Y., LaFerla F.M. Triple-transgenic model of

215. Alzheimer's disease with plaques and tangles: intracellular Abeta and synaptic dysfunction // Neuron. 2003. V. 39. P. 409-21.

216. Ohno M., Cole S.L., Yasvoina M., Zhao J., Citron M., Berry R., Disterhoft J.F., Vassar R. BACE1 gene deletion prevents neuron loss and memory deficits in 5XFAD APP/PS1 transgenic mice // Neurobiol Dis. 2007. V. 26. P. 134-45.

217. Ory S., Zhou M., Conrads T.P., Veenstra T.D., Morrison D.K. Protein phosphatase 2A positively regulates Ras signaling by dephosphorylating KSR1 and Raf-1 on critical 14-3-3 binding sites // Curr. Biol. 2003. V.13. P. 1356-1364.

218. Osterwalder T., Yoon K. S., White B. H., Keshishian H. A conditional tissue-specific transgene expression system using inducible GAL4 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98, №22. P. 596-601.

219. Pardridge W.M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. // NeuroRx. 2005. V. 2, № 1. P. 3-14.

220. Parent A.T, Thinakaran G. Modeling presenilin-dependent familial Alzheimer's disease: emphasis on presenilin substrate-mediated signaling and synaptic function // International J. Alzheimer's Dis. 2010. pii: 825918.

221. Parisiadou L., Angeliki Fassa A., Fotinopoulou A., Bethani I., Efthimiopoulos S. Presenilin 1 and cadherins: stabilization of cell-cell adhesion and proteolysis-dependent regulation of transcription // Neurodegenerative Dis. 2004. V. 1. P. 184-191.

222. Peng T., Liu Y.H., Yang C.L., Wan C.M., Wang Y.Q., Wang Z.R. A new peptide with membrane-permeable function derived from human circadian proteins // Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 2004. V 36. P. 629-636.

223. Perez R.G., Zheng H., Van der Ploeg L.H., Koo E.H. The bamyloid precursor protein of Alzheimer's disease enhances neuron viability and modulates neuronal polarity // J Neurosci. 1997. V. 17. P. 9407-9414.

224. Perez-Tur J., Froelich S., Prihar G. A mutation in Alzheimer's disease destroying a splice acceptor site in the presenilin-1 gene // Neuroreport. 1999. Vol.7. P. 297301.

225. Peskind E.R., Potkin S.G., Pomara N., Ott B.R., Graham S.M., Olin J.T., McDonald S. Memantine treatment in mild to moderate Alzheimer disease: A 24-week randomized, controlled trial // Am J Geriatr Psychiatry. 2006. V. 14. P. 704-715.

226. Philipson O., Lord A., Gumucio A., O'Callaghan P., Lannfelt L., Nilsson L.N. Animal models of amyloid-beta-related pathologies in Alzheimer's disease. // FEBS J. 2010. V. 277. P. 1389-409.

227. Pigino G., Pelsman A., Mori H., Busciglio J. Presenilin-1 mutations reduce cytoskeletal association, deregulate neurite growth, and potentiate neuronal dystrophy and tau phosphorylation // J. Neurosci. 2001. Vol. 21. P. 834-842.

228. Pitas R.E., Boyles J.K., Lee S.H., Foss D., Mahley R.W. Astrocytes synthesize apolipoprotein E and metabolize apolipoprotein E-containing lipoproteins // Biochim Biophys Acta. 1987. V. 917, № 1. P. 148-161.

229. Plant L., Boyle J.P., Smith I.F., Peers C. & Pearson H.A. The production of amyloid peptide is a critical requirement for the viability of central neurons // J. Neuroscie. 2003. V. 23. P. 531-5535.

230. Poirier J., Davignon J., Bouthillier D., Kogan S., Bertrand P., Gauthier S. Apolipoprotein E polymorphism and Alzheimer's disease // Lancet. 1993. V. 342, № 8873. P. 697-699.

231. Ponte P., Gonzalez-DeWhitt P., Schilling J., Miller J., Hsu D., Greenberg B., Davis K., Wallace W., Lieberburg I., Fuller F. A new A4 amyloid mRNA contains a domain homologous to serine proteinase inhibitors // Nature. 1988. V. 331, № 6156. P. 525-527.

232. Priller P., Bauer T., Mitteregger G., Krebs B., Kretzschmar H.A., Herms J. Synapse formation and function is Modulated by the amyloid precursor protein // J. Neurosci. 2006. V. 26. P. 7212-7221.

233. Ramassamy C. Emerging role of polyphenols compounds in the treatment of neurodegenerative diseases: a review of their intracellular targets // Eur. J. Pharmacol. 2006. V. 545. P. 51-64.

234. Raschetti R., Albanese E., Vanacore N., Maggini M. Cholinesterase inhibitors in mild cognitive impairment: a systematic review of randomised trials // PLoS Med.2007. V. 4,№ 11. e338.

235. Roch J.M., Masliah E., Roch-Levecq A.C. Increase of synaptic density and memory retention by a peptide representing the trophic domain of the amyloid b/A4 protein precursor // Proc Natl Acad Sci USA. 1994. Vol. 91. P. 7450-7454.

236. Roher A.E., Baudry J., Chaney M.O., Kuo Y.M., Stine W.B., Emmerling M.R. Oligomerizaiton and fibril asssembly of the amyloid-beta protein // Biochimi. Biophys.Acta. 2000. V. 150. P. 31-43.

237. Rogan S., Lippa C.F. Alzheimer's disease and other dementias: a review // Am J Alzheimers Dis Other Demen. 2002. V. 17, № 6. P. 11-17.

238. Roman G., Endo K., Zong L., Davis R.L. PSwitch., a system for spatial and temporal control of gene expression in Drosophila melanogaster // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V.98, № 12. P. 602-607.

239. Ronnback A., Zhu S., Dillner K., Aoki M., Lilius L., Naslund J., Winblad B., Graff C. Progressive neuropathology and cognitive decline in a single Arctic APP transgenic mouse model // Neurobiol Aging. 2011. V. 32. P. 280-92

240. Roses A.D., Saunders A.M., Alberts M.A., Strittmatter W.J., Schmechel D., Gorder E., Pericak-Vance M.A. Apolipoprotein E E4 allele and risk of dementia // JAMA. 1995. V. 273. P. 374-375.

241. Roses A.D. On the discovery of the genetic association of Apolipoprotein E genotypes and common late-onset Alzheimer disease // J Alzheimers Dis. 2006. V. 9, № 3. P. 361-366.

242. Rorth P. A modular misexpression screen in Drosophila detecting tissue-specific phenotypes // Proc Natl Acad Sci USA. 1996. V. 93, № 22. P. 12418-22.

243. Rosen D.R., Martin-Morris L., Luo L., White, K. A. Drosophila gene encoding a protein resembling the human b-amyloid protein precursor. Proc Natl Acad Sci USA. 1989. V.86, № 7. P. 2478-2482.

244. Rountree S.D., Chan W., Pavlik V.N., Darby E.J., Siddiqui S., Doody R.S. Persistent treatment with cholinesterase inhibitors and/or memantine slows clinical progression of Alzheimer disease//AlzheimersResTher. 2009. V.l. P. 7.

245. Rousselle C., Clair P., Temsamani J., Scherrmann J.M. Improved brain delivery of benzylpenicillin with a peptide-vector-mediated strategy // J. Drug Target. 2002. V. 10. P. 309-315.

246. Sasaki S., Iwata, M. Ultrastructural changes of synapses of Betz cells in patients with amyotrophic lateral sclerosis // Neurosci. Lett. 1999. V. 268. P. 29-32.

247. Sabo S.L., Ikin A.F., Buxbaum J.D., Greengard P. The amyloid precursor protein and its regulatory protein, FE65, in growth cones and synapses in vitro and in vivo // J.Neuroscie. 2003. V. 23. P. 5407-5415.

248. Sang T.K., Jackson G.R. Drosophila models of neurodegenerative disease // NeuroRx. 2005. V. 2, № 3. P. 438^6.

249. Sayre L.M., Zelasko D.A., Harris P.L., Perry G., Salomon R.G., Smith M.A. Four-hydroxynonenal-derived advanced lipid peroxidation end products are increased in Alzheimer's disease // J Neurochem. 1997. V.68. P. 2092-7.

250. Scheff S.W., Price, D.A. Synaptic pathology in Alzheimer's disease: a review of ultrastructural studies //Neurobiol Aging. 2003. V. 24. P. 1029-1046.

251. Schellenberg G.D. Genetic dissection of Alzheimer disease, a heterogeneous disorder // Proc Natl Acad Sci USA. 1995. V. 92, № 19. P. 8552-8559.

252. Schenk D., Barbour R., Dunn W. Immunization with amyloid-beta attenuates Alzheimer-disease-like pathology in PDAPP mouse // Nature. 1991. V. 400. P. 173-177.

253. Schneider L.S., DeKosky S.T., Farlow M.R., Tariot P.N., Hoerr R., Kieser M. A randomized, double-blind, placebocontrolled trial of two doses of Ginkgo biloba extract in dementia of the Alzheimer's type // Curr Alzheimer Res. 2005. V. 2. P. 541-551.

254. Schoenberg B.S., Kokmen E., Okazaki H. Alzheimer's disease and other dementing illnesses in a defined United States population: incidence rates and clinical features // Ann Neurol. 1987. V. 22. P. 724-9.

255. Schubert D., Jin L.W., Saitoh T., Cole G. The regulation of amyloid beta protein precursor secretion and its modulatory role in cell adhesion // Neuron. 1989. V. 3. P. 689-694.

256. Shen J., Kelleher 3rd R. J. The presenilin hypothesis of Alzheimer's disease: evidence for a loss-of-function pathogenic mechanism // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. P. 403-409.

257. Schupf N., Sergievsky G.H. Genetic and host factors for dementia in Down's syndrome // Br J Psychiatry. 2002. V. 180. P. 405-410.

258. Schwabe T., Bainton R.J., Fetter R.D., Heberlein U., Gaul U. GPCR signaling is required for blood-brain barrier formation in Drosophila //Cell. V. 123. № 7. P. 133-144.

259. Schwarze S.R., Ho A., Vocero-Akbani A., Dowdy S.F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse // Science. 1999. V. 285. P. 1569-1572.

260. Schwarzman A.L., Singh N., Tsiper M., Gregori L., Dranovsky A., Vitelc M., Glabe

261. C., St.George-Hyslop P., Goldgaber D. Endogenous presenilin 1 redistributes to the lamellipodia upon adhesion of Jurkat cells to a collagen matrix // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1999. V. 96. P. 7932-7937.

262. Schwarzman A., Tsiper M., Wente H., Wang A., Vitek M.P., Vasiliev V., Goldgaber

263. D. Amyloidogenic and anti-amyloidogenic properties of recombinant transthyretin variants//Amyloid: J. Protein Folding Disord. 2004. V.U. P. 1-9.

264. Selkoe D.J. Alzheimer's disease: a central role for amyloid // J Neuropathol Exp

265. Neurol. 1994. V. 53. P. 438-47. Selkoe D.J. The cell biology of ß-amyloid precursor protein and presenilin in

266. Alzheimer's disease // Trends Cell Biol. 1998. Vol. 8. P. 447-53. Selkoe D.J. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy // Physiol Rev. 2001a. V. 81. P. 741-766.

267. Selkoe D.J. Alzheimer's disease results from the cerebral accumulation and cytotoxicity of amyloid beta-protein // J Alzheimers Dis. 2001b V. 3. P. 75- 80.

268. Selkoe D.J. Alzheimer's disease is a synaptic failure // Science 2002. V.298. P. 789791

269. Selkoe D.J. Soluble oligomers of the amyloid beta-protein impair synaptic plasticity and behavior // Behav Brain Res. 2008 . V. 192. P. 106-113.

270. Senechal Y., Larmet Y., Dev K.K. Unraveling in vivo functions of amyloid precursor protein: Insights from knockout and knockdown studies // Neurodegenerative Dis. 2006. V. 3. P. 134-147.

271. Serretti A., Artioli P., Quartesan R., De Ronchi D. Genes involved in Alzheimer's disease, a survey of possible candidates // J Alzheimers Dis. 2005. V. 7, № 4. P. 331-353.

272. Serot J.M, Christmann D, Dubost T and Couturier M. Cerebrospinal fluid transthyretin: aging and late onset Alzheimer's disease // J Neurol Neurosur Psych. 1997. V. 63. P. 506-508.

273. Sheng Z., Prorok M., Brown B.E., Castellino F.J. N-methyl-D-aspartate receptor inhibition by an apolipoprotein E-derived peptide relies on low-density lipoprotein receptor-associated protein//Neuropharmacology. 2008. V. 55. P. 204-214.

274. Sherington, R., Rogaev, E.I., Liang, Y. Cloning of gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease // Nature. 1995. V. 375. P. 754-759.

275. Shimmyo Y., Kihara T., Akaike A., Niidome T. Sugimoto H. Epigallocatechin-3-gallate and curcumin suppress amyloid beta-induced beta-site APP cleaving enzyme-1 upregulation//Neuroreport. 2008. V. 19. P. 1329-1333.

276. Shoji M., Golde T.E., Ghiso J., Cheung T.T., Estus S., Shaffer L.M., Cai X.D., McKay D.M., Tintner R., Frangione B. Production of the Alzheimer amyloid beta protein by normal proteolytic processing // Science. 1992. V. 258, № 5078. P. 126-129.

277. Shoji M., Kanai M., Matsubara E., Tomidokoro Y., Shizuka M., Ikeda Y., Ikeda M., Harigaya Y., Okamoto K., Hirai S. The levels of cerebrospinal fluid Abeta40 and Abeta42(43) are regulated age-dependently // Neurobiol Aging. 2001. V. 22, № 2. P. 209-15.

278. Silva G.A. Nanotechnology approaches to crossing the blood-brain barrier and drug delivery to the CNS // Neurosci. 2008. V. 9. Suppl 3. S4.

279. Sing C.F., Davignon J. Role of the apolipoprotein E polymorphism in determining normal plasma lipid and lipoprotein variation // Am J Hum Genet. 1985. V. 37. P. 268-85.

280. Purification and cloning of amyloid precursor protein beta-secretase from human brain // Nature. 1999. V. 402, № 6761. P. 537-540.

281. Small D.H., Mok S., Bornstein J.S. Alzheimer's disease and Aß toxicity: from top to bottom // Nature Rev. Neurosi. 2001. V. 2. P. 595-598.

282. Smith D., Wohlgemuth J., Calvi B. R., Franklin I., Gelbart W.M. hobo enhancer trapping mutagenesis in Drosophila reveals an insertion specificity different from P elements // Genetics. 1993. V. 135, № 4. P. 1063-1076.

283. Schneider L.S., Sano M. Current Alzheimer's disease clinical trials: Methods and placebo outcomes // Alzheimers Dement. 2009. V. 5. P. 388-397.

284. Shanley T.P., N.Vasi A., Denenberg H.R. Wong. The serine/threonine phosphatase, PP2A: endogenous regulator of inflammatory cell signaling // J. Immunol. 2001. V. 166. P. 966-972.

285. Stenh C., Nilsberth C., Hammarback J., Engvall B., Náslund J., Lannfelt L. The Arctic mutation interferes with processing of the amyloid precursor protein // Neuroreport. 2002. V. 13, № 15. P. 1857-60.

286. Strittmatter S.M., Fankhauser C., Huang P.L., Mashimo H., Fishman M.C. Neuronal pathfinding is abnormal in mice lacking the neuronal growth cone protein GAP-43 //Cell. 1995. V. 80, №3. P. 445-52.

287. Struhl G., Greenwald I. Presenilin is required for activity and nuclear access of Notch in Drosophila // Nature. 1999. V. 398. P. 522-25.

288. Sun M., Xie W.Cell adhesion molecules in Drosophila synapse development and function // Sci China Life Sci. 2012. V. 55. P. 20-6.

289. Sze C.I., Troncosom J.C., Kawas C., Mouton P., Price D.L., Martin, L.J. Loss of the presynaptic vesicle protein synaptophysin in hippocampus correlates with cognitive decline in Alzheimer disease // J Neuropathol Exp Neurol. 1997. V.56, № 8. P. 933-944.

290. Takasugi N., Tomita T., Hayashi I., Tsuruoka M., Niimura M., Takahashi Y., Thinakaran G., Iwatsubo T. The role of presenilin cofactors in the gamma-secretase complex //Nature. 2003. V. 422, № 6930. P. 438-441.

291. Tan L., Schedl P., Song H.J., Garza D., Konsolaki M. The Toll-NFkappaB signaling pathway mediates the neuropathological effects of the human Alzheimer's Abeta42 polypeptide in Drosophila // PLoS One. 2008. V. 3. e3966.

292. Tandon A., Frazer P. The presenilins // Genome Biology. 2002. V.3. P. 3014.13014.9.

293. Tanimukai H., Grundke-Iqbal I., Iqbal K. Up-regulation of inhibitors of protein phosphatase-2A in Alzheimer's disease // Am. J. Pathol. 2005. V. 166. P. 17611771.

294. Tanzi R.E., McClatchey A.I., Lamperti E.D., Villa-Komaroff L., Gusella J.F., Neve R.L. Protease inhibitor domain encoded by an amyloid protein precursor mRNA associated with Alzheimer's disease // Nature. 1988. V. 331, № 6156. P. 528-530.

295. Tanzi R., Moir R., Wagner S.L. Clearance of Alzheimer's Abeta peptide: the many roads to perdition // Neuron. 2004. V. 43. P. 605-608.

296. Temsamani J., Rousselle C., Rees A.R., Scherrmann J.M. Vector-mediated drug delivery to the brain // Expert Opin. Biol. Ther. 2001. V. 1. P. 773-782.

297. Thomas S.A., Abbruscato T.J., Hruby V.J, Davis T.P. The entry of D-penicillamine 2,5.enkephalin into the central nervous system: saturation kinetics and specificity // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1997. V. 280. P. 1235-1240.

298. Thai D.R., Capetillo-Zarate E., Del Tredici K., Braak H. The development of amyloid beta protein deposits in the aged brain // Sci Aging Knowledge Environ. 2006. V. 6. rel.

299. Terry R.D. The pathogenesis of Alzheimer's disease. What causes dementia? // Neurophilosophy and Alzheimer's disease / Christen et al. (eds). Berlin: Springer, 1992. P. 123-130.

300. Terry RD. Cell death or synaptic loss in Alzheimer disease // J Neuropathol Exp Neurol. 2000a. V. 59, № 12. P. 1118-9.

301. Terry R.D. Where in the brain does Alzheimer's disease begin? // Annals of Neurology. 2000b. V. 47. P. 421.

302. Temsamani J., Rousselle C., Rees A.R., Scherrmann J.M. Vector-mediated drug delivery to the brain // Expert Opin. Biol. Ther. 2001. V. 1. P. 773-782.

303. Ting J.T., Kelley B.G., Lambert T. J. Cook D.G., Sullivan J.M. Amyloid precursor protein overexpression depresses excitatory transmission through both presynaptic and postsynaptic mechanisms // Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. P. 353-358.

304. Torroja L., Luo L., White, K. APPL, the Drosophila member of the APP-family, exhibits differential trafficking and processing in CNS neurons // J Neurosci. 1996. V.16, № 15. P. 4638-4650.

305. Torroja L., Packard M., Gorczyca M., White K., Budnik V. The Drosophila b-Amyloid Precursor Protein homolog promotes synapse differentiation at the neuromuscular junction // J. Neurosci. 1999a. V.15. P. 7793-7803.

306. Torroja L., Chu H., Kotovsky I., White K. Neuronal overexpression of APPL, the Drosophila homologue of the amyloid precursor protein (APP), disrupts axonal transport // Curr Biol. 1999b. V. 9. P. 489-492.

307. Townsend M., Cleary J.P., Mehta T., Hofmeister J., Lesne S., O'Hare E., Walsh D.M., Selkoe D.J. Orally available compound prevents deficits in memory caused by the Alzheimer Amyloid-b oligomers // Ann Neurol. 2006. V. 60. P. 668-676.

308. Trinh N.H., Hoblyn J., Mohanty S., et al. Efficacy of Cholinesterase inhibitors in the treatment of neuropsychiatric symptoms and functional impairment in Alzheimer disease: a meta-analysis // JAMA. 2003. V. 289. P. 210-6.

309. Tschäpe J.A., Hammerschmied C., Mühlig-Versen M., Athenstaedt K., Daum G., Kretzschmar D. The neurodegeneration mutant löchrig interferes with cholesterol homeostasis and Appl processing // EMBO J. 2002. V. 21. P. 6367-6376.

310. Tsai M.S., Tangalos E.G., Petersen R.C., Smith G.E., Schaid D.J., Kokmen E., Ivnik R.J., Thibodeau S.N. Apolipoprotein E: risk factor for Alzheimer disease // Am J Hum Genet. 1994. V. 54, № 4. P. 643-649.

311. Tsuchiya D, Kitamura Y, Takata K, Taniguchi T, Uemura K, Miki H, Takenawa T, Shimohama S. // J Pharmacol Sei. 2006. V. 102. P. 354-358.

312. Tsuda M., Kobayashi T., Matsuo T., Aigaki T. Insulin-degrading enzyme antagonizes insulin-dependent tissue growth and Abeta-induced neurotoxicity in Drosophila 11 FEBS Lett. 2010. V. 584, № 13. P. 2916-20.

313. Tully T., Quinn W.G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster II J. Comp. Physiol. 1985. V. 157, № 2. P. 263-277.

314. Uemura T. The cadherin superfamily at the synapse: more members, more missions // Cell. 1998. V. 93, № 7. P. 1095-8.

315. Uemura K., Kuzuya A., ShimozonoY., Aoyagi N., Ando K., Shimohama S., Kinoshita A. GSK3 activity modifies the localization and function of presenilin 1 //J.Biol.Chem. 2007. V. 282. P. 15823-15832.

316. Uchihara T., Duyckaerts C., He Y., Kobayashi K., Seilhean D., Amouyel P., Hauw J.J. ApoE immunoreactivity and microglial cells in Alzheimer's disease brain // Neurosci Lett. 1995. V. 195, № 1. P. 5-8.

317. Van de Hoef D.L., Hughes J., Livne-Bar I., Garza D., Konsolaki M., Boulianne G.L. Identifying genes that interact with Drosophila presenilin and amyloid precursor protein // Genesis. 2009. V. 47, № 4. P. 246-60.

318. Van Dyck C.H., Tariot P.N., Meyers B., Resnick M.E. A 24-week randomized, controlled trial of memantine in patients with moderate-to-severe Alzheimer disease // Alzheimer Dis Assoc Disord. 2007. V. 21. P. 136-143.

319. Verstreken P., Ohyama T., Bellen HJ. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction // Methods Mol Biol. 2008. V. 440. P. 349-69.

320. Vingtdeux V, Dreses-Werringloer U, Zhao H, Davies P, Marambaud P. Therapeutic potential of resveratrol in Alzheimer's disease // BMC Neurosci. 2008. V. 9. (Suppl 2). S6.

321. Vitek M.P., Christensen D.J., Wilcock D., Davis J., Van Nostrand W.E., Li F.Q., Colton C.A. APOE-Mimetic Peptides Reduce Behavioral Deficits, Plaques and Tangles in Alzheimer's Disease Transgenics // Neurodegenerative Dis. 2012. V. 10. P. 122-126.

322. Walker E.S., Martinez M., Brunkan A.L., Goate A. Presenilin 2 familial Alzheimer's disease mutations result in partial loss of function and dramatic changes in Abeta 42/40 ratios // J Neurochem. 2005. V. 92. P. 294-301.

323. Walsh D.M., Selkoe D.J.Deciphering the molecular basis of memory failure in Alzheimer's disease // Neuron. 2004. V. 44. P. 181-193.

324. Wang X., Su B., Zheng L., Perry G., Smith M.A., Zhu X. The role of abnormal mitochondrial dynamics in the pathogenesis of Alzheimer's disease // J Neurochem. 2009. V. 109. Suppl 1. P. 153-159.

325. Webber K.M., Casadesus G., Marlatt M.W., Perry G., Hamlin C.R., Atwood C.S., Bowen R.L., Smith M.A. Estrogen bows to a new master: the role of gonadotropins in Alzheimer pathogenesis // Ann NY Acad Sci. 2005. V. 1052. P. 201-9.

326. Wenk G.L., Danysz W., Roice D.D. The effects of mitochondrial failure upon cholinergic toxicity in the nucleus basalis // Neuroreport. 1996. V. 7. P. 1453-6.

327. Whitehouse P.J., Struble R.G., Clark A.W., Price D.L. Alzheimer disease: plaques, tangles, and the basal forebrain // Ann Neurol. 1982. V. 12. P. 494.

328. Whitehouse P., Brodaty H. Mild cognitive impairment // Lancet. 2006. V. 367. P. 1979.

329. Wilquet V., De Strooper B. Amyloid-beta precursor protein processing in neurodegeneration // Curr Opin Neurobiol. 2004. V. 14. P.582-8.

330. Wishart T.M., Parson S.H., Gillingwater T.H. Synaptic vulnerability in neurodegenerative disease // J. Neuropathol. Exp. Neurol. 2006. V. 65. P. 733-739.

331. Wolozin B., Kellman W., Ruosseau P., Celesia G.G., Siegel G. Decreased prevalence of Alzheimer disease associated with 3-hydroxy-3-methyglutaryl coenzyme A reductase nhibitors // Arch Neurol. 2000. V. 57. P. 1439-43.

332. Wood J.G., Mirra S.S., Pollock N.J., Binder L.I. Neurofibrillary tangles of Alzheimer disease share antigenic determinants with the axonal microtubule-associated protein tau (tau) // Proc Natl Acad Sci USA. 1986. V. 83. № 11. P. 4040-1043.

333. Wu V.M., Schulte J., Hirschi A., Tepass U., Beitel G.J. Sinuous is a Drosophila claudin required for septate junction organization and epithelial tube size control // J. Cell Biol. 2004. V. 164, №2. P. 313-323.

334. Xu P.T., Gilbert J.R., Qiu H.L., Ervin J., Rothrock-Christian T.R., Hulette C., Schmechel D.E.Specifíc regional transcription of apolipoprotein E in human brain neurons // Am J Pathol. 1999. V. 154. № 2. P. 601-611.

335. Yaffe K., Barrett-Connor E., Lin F., Grady D. Serum lipoprotein levels, statin use, and cognitive function in older women // Arch Neurol. 2002. P. 59. P. 378-84.

336. Yagi Y., Tomita S., Nakamura M., Suzuki T. Overexpression of human amyloid precursor protein in Drosophila II Mol. Cell. Biol. Res. Commun. 2000. V. 4. P. 43^9.

337. Young-Pearse T.L., Chen A.C., Chang R., Márquez C., Selkoe D.J. Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through interactions with integrinbeta 1 //Neural Develop. 2008. V. 3. P. 1-13.

338. Yamazaki T., Koo E.H., Selkoe D.J. Cell surface amyloid beta-protein precursor colocalizes with beta 1 integrins at substrate contact sites in neural cells // J Neurosci. 1997. V. 17. P. 1004-1010.

339. Yao P.J. Bushlin I. Furukawa K. Preserved synaptic vesicle recycling in hippocampal neurons in a mouse Alzheimer's disease model // Biochem. Biophys. Res Commun. 2005. V. 330. P. 34-38.

340. Yao P.J., Zhu M., Pyun E.I., Brooks A.I., Therianos S., Meyers V.E., Coleman P.D. Defects in expression of genes related to synaptic vesicle trafficking in frontal cortex of Alzheimer's disease //Neurobiol Dis. 2003. V.12. P. 97-109.

341. Ye Y., Fortini M.E. Apoptotic activities of wild-type and Alzheimer's diseaserelated mutant presenilins in Drosophila melanogaster // J. Cell Biol. 1999. Vol. 146. P. 1351-1364.

342. Yoshikai S., Sasaki H., Doh-ura K., Furuya H., Sakaki Y. Genomic organization of the human amyloid beta-protein precursor gene // Gene. 1990. V. 87, № 2. P. 257263.

343. Zhang Y.Q., Rodesch C.K., Broadie K. Living Synaptic Vesicle Marker: Synaptotagmin GFP // Genesis. 2002. V. 34. P. 142-145.

344. Zhang V., Han S-V., McKeel D. Interaction of presenilins with the filamin family of actin-binding proteins // J. Neurosci. 1998. Vol. 18. P. 914-922.

345. Zhang Z., Nadeau P., Song W., Donoviel D., Yuan M., Bernstein A., Yankner B.A. Presenilins are required for gamma-secretase cleavage of beta- APP and transmembrane cleavage of Notch-1 // Nat Cell Biol. 2000. V. 2, № 7. P. 463465.

346. Zhou F-Q., Watterman-Storer C.M., Cohan C.S. Focal loss of actin bundles causes microtubule redistribution and growth cone turning // J Cell Biol 2002. V. 157. P. 839-849.

347. Zenisek D., Matthews G. The role of mitochondria in presynaptic calcium handling at a ribbon synapse // Neuron. 2000. V. 25. P. 229-237.

348. Zlokovic, B.V. Clearing amyloid through the blood-brain barrier // J. Neurochem.-2004. V. 89. P. 807-811.