Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Масс-спектрометрия MALDI-TOF для исследования сайтов и скорости гидролиза белков ангиотензинпревращающим ферментом и трипсином in vitro и в плазме крови

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Масс-спектрометрия MALDI-TOF для исследования сайтов и скорости гидролиза белков ангиотензинпревращающим ферментом и трипсином in vitro и в плазме крови"

На правах рукописи

Торопыгин Илья Юрьевич

Масс-спектрометрия MALDI-TOF для исследования сайтов и скорости гидролиза белков ангиотензинпревращающимферментом и трипсином in vitro и в плазме крови

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 R НОЯ 2013

Москва 2013

005540151

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский инстшут биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича» Российской академии медицинских наук (ФГБУ «ИБМХ» РАМН)

Научный руководитель: доктор биологических наук

Мошковский Сергей Александрович

Официальные оппоненты: Нарыжный Станислав Николаевич

доктор биологических наук,

ФГБУ «Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова», зав. лабораторией

Иванов Алексей Сергеевич

доктор биологических наук, профессор, ФГБУ «ИБМХ» РАМН, зав. лабораторией

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреядение науки Инстшут биохимии им. АН. Б axa Российской академии наук

Защита состоится 12 декабря 2013 г. в 1500 часов на заседании совета Д 001.010.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций три Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский инстшут биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича» Российской академии медицинских наук по адресу 119121, г. Москва, Погодинская ул. д.10, стр.8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ИБМХ» РАМН.

Автореферат разослан "_" ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 001.010.01

кавдвдат химических наук ■ t'^'v-jL Карпова Е.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящей работе в качестве экспериментального подхода для изучения протеаз использованы методы, основанные на времяпролетной масс-спекгрометрии с лазерной десорбцией-ионизацией из матрицы, или MALDI-TOF (от англ. Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight). В основе метода лежит особый вариант лазерной десорбции и ионизации, осуществляемой из объема специально подобранного вещества, обычно называемого матрицей. Для разделения ионов и их регистрации используется времяпролетный детектор. Этот способ анализа образцов обеспечивает определение молекулярной массы исследуемого соединения или молекулярных масс компонентов сложных смесей.

В случае исследования белков видов с известным геномом несложная предварительная обработка образца, как правило, позволяет идентифицировать один или несколько белков в смеси. Кроме того, благодаря конструктивным особенностям ионного источника MALDI, имеется возможность работы с биологическим материалом без предварительной очистки или фракционирования образца, например, цельной сывороткой крови.

Возможность одновременного измерения молекулярных масс нескольких компонентов смеси позволяет наблюдать гидролиз природного субстрата или нескольких субстратов, например, по накоплению продуктов реакции. Однако в условиях ионного источника MALDI, как и практически любого другого типа масс-спектрометра, в газовой фазе ионы различных пептидов образуются с неодинаковой эффективностью, поэтому MALDI в исходном варианте нельзя отнести к количественным методам и применять для точных количественных оценок. Для количественных измерений требуется использование специальных методов анализа, например введения изотопных меток.

В данной работе при помонщ масс-спекгрометрии MALDI-TOF были исследованы взаимодействия выделенных ферментов и субстратов, а также гидролиз экзогенных субстратов протеазами сыворотки крови и подавление активности экзогенного фермента ингибиторами протеаз сыворотки крови.

В первой части работы исследован гидролиз пептида АЬ (1-16) белка амилоида бета, участвующего в патогенезе болезни Альцгеймера (БА), ангиотензинпревращаюшим ферментом (АПФ). То, что АПФ гидролизует амилоид-бета, было известно ранее, однако

сайт гидролиза и влияние на гидролиз изомеризации аспарагиновой кислоты не были установлены.

Во второй части работы изучался гидролиз цельной сыворотки трипсином. В условиях in vitro, в системе из протеазы и субстрата содержащийся в низкой концентрации фермент способен гидролизовать многократно превышающее его собственное количество белка. Однако в крови этого не происходит, благодаря сбалансированной системе ингибиторов. При этом ингибиторы могут быть разделены на два типа. Ингибиторы первого типа, например, альфа-1-ингибитор протеиназ (смИП), известный как антитрипсин, полностью блокируют активность фермента, необратимо связываясь с ним. Другой важный белок крови, альфа-2-макроглобулин (агМ) образует с протеазами комплекс, в котором активный центр фермента остается свободен, но пространственная структура образованного комплекса ограничивает взаимодействие с частью субстратов и ингибиторов, изменяя специфичность фермента. В зависимости от соотношений трипсина и ингибиторов в реакционной смеси должны наблюдаться различные продукты гидролиза. Если ингибиторы связаны с патологическим процессом, то изменения регистрируемых продуктов указывает не только на наличие и относительную концентрацию ингибиторов, но и на развитие или состояние заболевания.

Возможности MALDI-TOF-масс-спекгрометрии как метода инструментального анализа ограничены чувствительностью и динамическим диапазоном, что в итоге ограничивает информативность получаемых спектров. При этом, в случаях присутствия в образце протеазы, даже в недостаточном для выявления количестве, ее активность может приводить к образованию значительных количеств легко детектируемых продуктов, которые регистрируются на масс-спекгрометрических профилях

Цели и задачи

Целью работы является разработка метода прямого MALDI-TOF масс-спекгрометрического анализа образцов сывороток крови с применением разных концентраций вводимого искусственно трипсина.

Основные задачи исследования

1. Используя модельную систему в составе пептида амилоида-бета АЬ(1-16) в качестве субстрата и ангиотензинпревращающего фермента, определить сайты гидролиза пептида

амилоида-бета АЬ(1-16), определить каталитически активный домен и влияние природной модификации изомеризации остатка А5р-7 на эффективность гидролиза.

2. Осуществить масс-спекгрометрический анализ МА1Х)1-ТОР продуктов гидролиза плазмы крови различными концентрациями экзогенного трипсина (титрование трипсином).

3. Исследовать динамику накопления продуктов гидролиза трипсином сыворотки крови путем количественного анализа посредством МАЫ)1-ТОР-масс-спекгрометрии и установить условия, необходимые гидролиза высококопийных (мажорных) сывороточных белков.

4. Сравнить профили МА1ЛЭ1-ТОР-масс-спекгрометрии плазмы крови при гидролизе экзогенным трипсином в норме и при раке яичника.

Научная новизна

В работе впервые показано, что в М-домен АПФ специфично гидролизует пептид АЬ (1-16) на два пептида, АЬ-(1-5) и АЬ-(6-16), при этом С-домен АПФ не гидролизует пептид АЬ-(1-16). Кроме того, методом количественной масс-спекгрометрии определено, что изомеризация остатка аспарагиновой кислоты приводит к 4-кратному увеличению скорости гидролиза АЬ-(1-16), по сравнению с пептидом с нормальным остатком аспарагиновой кислоты.

Впервые установлено, что при гидролизе сыворотки трипсином, состав продуктов гидролиза меняется в зависимости от количества вносимого трипсина. При этом, при введении трипсина в концентрации меньше 2 мг/мл сыворотки, удается регистрировать масс-спектры, свободные от продуктов гидролиза так называемых мажорных белков, обычно целенаправленно удаляемых при проведении прямых масс-спекгрометрических исследований.

Представлен новый метод регистрации изменений в составе ингибиторов протеаз крови с использованием прямой масс-спекгрометрии. Концентрации ингибиторов повышаются, в том числе, при развитии онкологических заболеваний. Масс-спекгрометрическая регистрация таких изменений проводилась по изменению состава продуктов триптического гидролиза.

Впервые методом количественной масс-спекгрометрии в условиях прямого масс-спекгрометрического анализа измерены скорости накопления отдельных продуктов гидролиза. Изменения скорости накопления продуктов отражают изменение активности ингибиторов, модифицирующих активность трипсина. Таким образом, при прямом масс-

спектрометрическом исследовании определено изменение концентраций белков, содержащихся в крови в концентрации порядка 10"6 М, недоступных для непосредственной регистрации методом прямого масс-спекгрометрического исследования.

Практическая значимость работы

Практическая значимость работы заключается в разработке методов анализа и измерения активности протеаз методом масс-спектрометрии MALDI-TOF с использованием нативных субстратов в сыворотке крови и in vitro. В работе также показана возможность использования функциональных свойств протеолитических ферментов и ингибиторов сыворотки крови для прямой масс-спектрометрии образцов 1фОВИ и ее производных.

Показанные в работе особенности гидролиза АПФ пептида АЬ (1-16) и его формы с изомеризованным остатком аспарагиновой кислоты могут указывать на потенциальную биологическую роль АПФ как фермента, связанного с развитием болезни Альцгеймера. Это находит подтверждение в работах других авторов. Так, выявлены два полиморфных варианта гена АПФ, связанных с увеличением накопления Ab (Kehoe PG 2009, Miners JS et al 2010), со ссылкой на представленную работу.

Использование функциональных свойств протеаз и ингибиторов позволяет по изменениям в их активности при проведении прямого масс-спекгрометрического профилирования (ПМСП) оценивать содержание белков, присутствующих в концентрациях порядка 10"6 М, недоступных для непосредственной масс-спекгрометрической регистрации; таким образом, продемонстрирована возможность использования молекулярных зондов при прямой масс-спектрометрии.

Положения, выносимые на защиту

1. N-концевой домен ангиотензинпревращающего фермента специфично гидролизует пептид амилоида-бета АЬ(1-16) с образованием двух пептидов АЬ(1-5) и АЬ(6-16), причем изомеризация остатка аспарагиновой кислоты в 7 положении этого пептида приводит к 4-кратному увеличению скорости гидролиза АПФ. С-концевой домен не гидролизует пептид амилоида-бета Ab(l -16).

2. Состав продуктов гидролиза сыворотки трипсином зависит от количества вводимого фермента. При концентрациях трипсина около 8,5 мМ в спектрах представлены продукты, отличные от пептидов альбумина.

3. Скорость накопления продуктов гидролиза трипсином и минимальное количество трипсина, необходимое для начала гидролиза альбумина для образцов сывороток больных аденокарциномой яичника выше, чем для образцов сыворотки крови здоровых доноров.

4. С использованием гидролиза сывороток концентрациями трипсина около 10 мкМ возможно получение MALDI-TOF-профилей, позволяющих различать образцы сыворотки больных аденокарциномой яичника и здоровых доноров.

Апробация работы

Результаты работы доложены 3-ей Международной школе-семинаре «Масс-спекгрометрия в химической физике, биофизике и экологии» (Звенигород, апрель 2007) на VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, апрель 2007), 6-м Всемирном Конгрессе HUPO (Сеул, Корея, октябрь 2007), 38-ом Конгрессе Федерации европейских биохимических обществ, FEBS (Санкг Петербург, июль 2013).

Публикация работы

По материалам диссертации опубликовано 27 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях, в том числе 10 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России, 1 патент на изобретение и 16 публикации в трудах конференций. Индекс Хирша автора равен 7.

Структура и объем диссертации

Материалы диссертации изложены на 111 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов, их обсуждения, выводов, списка цитированной литературы, включающего 136 источников. Работа содержит 24 рисунка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Образцы сывороток крови больных раком яичников и здоровых доноров предоставлены кафедрой акушерства и гинекологии лечебного факультета РНИМУ им. Н.КПирогова (зав. кафедрой проф. Макаров О.В.). Синтетический пептид сывороточного амилоида A (SAA) 88-104, NH2-SGKDPNHFRPAGLPEKY-CONH2 синтезирован и любезно предоставлен научным сотрудником лаборатории белковой инженерии ФГБУ «ИБМХ» РАМН к.х.н. Е.А. Алешиной. N- и С-домены бычьего соматического АПФ (N-АПФ и С-АПФ) были предоставлены к.х.н. П.В. Биневским (МГУ, химический факультет).

В работе использован рекомбинантный белок сывороточный амилоид A (rSAA) USBiological (США).Синтетические пептиды, ацетилированные по N-концу и амидированные по С-концу, Ab-(1-16/Asp7), получены от Sigma-Genosys, США.

Вода Н2180, 95-98 % 180 (Cambridge Isotope Laboratories Andover, MA USA), а-циано-4-гидроксикоричная кислота (НССА) (Bruker Daltonics, Bremen, Germany), модифицированный свиной трипсин (Promega, Madison, WI, USA). Все другие реагенты -Sigma-AMrich (St. Louis, МО),

Ферментативный гидролиз. Гидролиз каждого пептида, Ab-(1-16 /Asp7) или АЬ-(1-16/isoAsp7), N- иди С-доменами АПФ проводили при 37 °С в 20 мкл реакционной смеси. Концентрации реагентов в смеси составляли: 20 мкМ пептида амилоида-бета, 0,02 мкМ домена АПФ, 150 мМ NaCl, в 50 мМ бикарбонатном буфере (pH 7,8). В экспериментах с лизиноприлом его концентрация в реакционной смеси составляла 10 мкМ. Для количественного анализа в заданные моменты времени из реакционной смеси отбирали по 5 мкл и добавляли к 15 мкл 0,5 % трифгоруксусной кислоты (ТФУ).

Количественные измерения продуктов гидролиза АПФ. Количественные измерения продуктов гидролиза пептидов АПФ проводили без какой либо предварительной очистки, выделения или фракционирования с использованием MALDI TOF масс-спекгрометрии и меченного 180 внутреннего стандарта. Для получения меченого стандарта проводили гидролиз исследуемых пептидов в растворе 25 мкл воды Hî180 содержащем 20 мкМ пептида Ab-(1-16/Asp7). Абсолютные концентрации исследуемого пептида вычисляли из соотношения интенсивностей изотопных сигналов смеси анализируемого пептида и его меченого 180 аналога известной концентрации.

Подготовку образцов сыворотки для масс-спектрометрического профилирования проводили согласно определенным в рамках данной работы условиям контролируемого протеолиза. Для этого сыворотку (2,5 мкл) смешивали с необходимым количеством (7,5 мкл) раствора трипсина в концентрации 25 мкг/мл. Гидролиз проводили в течение 2 часов при температуре 37°С. Такой вариант подготовки образов позволяет регистрировать продукты гидролиза белков, отличных от сывороточного альбумина.

Количественные масс-спекгрометрические измерения проводили с использованием в качестве стандарта синтетического пептида SAA 88-104, амидированного по С-концевой аминокислоте, в результате чего его молекулярная масса была на 1 а.е.м. меньше молекулярной массы пептида, получающегося в результате гидролиза.

Исследование динамики накопления продуктов гидролиза SAA в сыворотке осуществляли, отбирая в заданные моменты времени аликвоты из реакционной смеси и смешивая их с раствором стандарта, после чего регистрировали масс-спектр полученной смеси. Необходимое количество вносимого стандарта определяли опытным путем. Концентрацию природного пептида вычисляли из соотношений интенсивностей моноизотопных сигналов т/: 1913 и m/z 1912 и известной концентрации стандарта (рис. 1).

Масс-спекгры зарегистрированы на MALDI-TOF масс-спектрометре Bruker Ultraflex TOF/TOF (Bruker Dattonics, ФРГ).

Масс-спектры фрагментации получены в тандемном режиме MALDI-масс-спекгрометра Ultraflex в режиме положительных ионов, при первом ускоряющем напряжении 8 кВ, втором ускоряющем напряжении 19 кВ и отражающем напряжении на рефлекгроне 29 кВ.

Идентификацию белков проводили при помощи системы идентификации белков Mascot (MatrixSciense, Великобритания), по базе данных NCBInr Национального центра биотехнологической информации США (NCBI). Статистический анализ, построение функции классификации и определение параметров надежности и достоверности полученного классификатора выполнены с помощью программного пакета Bruker ClinProTools.

Рис. 1. Спектр пептида 8АА 88-104 в сыворотке пациента (А), синтетический амидированный пептид ЭАА 88-104 (В) и спектр сыворотки пациента с добавленным синтетическим пептидом

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В работе с использованием масс-спекгрометрии MALDI-TOF исследованы активности и субстратная специфичность протеаз крови, определены скорости гидролиза с использованием природных субстратов и стандартов с изотопной меткой в системе in vitro и непосредственно в плазме и сыворотке крови. В работе также изучено изменение активности трипсина при гидролизе белков сыворотки крови содержащимися в ней ингибиторами.

Гидролиз пептида Ab (1-16) ангнотеизинпревращающим ферментом и влияние изомеризации Asp7 на скорость гидролиза

Взаимодействие в системе выделенных и очищгнных доменов АПФ и синтетических пептидов и параметры реакции исследовали с помощью MALDI-TOF. Параллельно проводили контрольные эксперименты с аналогичными условиями реакции, но с добавлением лизиноприла, известного как ингибитор ферментативной активности АПФ. Продукты всех реакций исследовали с помощью MALDI-TOF масс-спекгрометрии. Чтобы определить, какой из доменов отвечает за гидролиз фрагмента амилоида бета Ab (116) и его аналога с изоаспартатом в 7 положении (isoAsp7), а также чтобы определить сайты гидролиза, аликвоты каждого пептида инкубировали с N-АПФ и С-АПФ в течении различных промежутков времени от 10 до 130 мин при 37°С. Кроме того, в качестве контроля проводили гидролиз с аналогичными условиями реакции, но с добавлением лизиноприла (концентрация 10 мМ), известного как ингибитор ферментативной активности АПФ. Продукты всех реакций были исследованы с помощью MALDI-TOF масс- спектрометрии.

На рис. 2 показан масс-спектр образца из реакционной смеси Ab-(1-16/Asp7) инкубированной в присутствии N-АПФ в течение 20 мин. Кроме иона протонированного пептида (m/z 1995,9) и иона полученного в результате присоединения катиона натрия (m/z 2017,9), в спектре также зарегистрированы четыре других интенсивных сигнала, m/z 679,3, 701,2, 1335,6 и 1357,5. При этом m/z 679,3 и m/z 701,2 соответствуют однозарядному протонированному иону АЬ-(1-5) и этому же пептиду с натрием, m/z 1335,6 и 1357,5 относятся к пептиду Ab-(6-16/Asp7). Спектр пептида с изомеризованной аспарагиновой кислотой Ab-(l-16/isoAsp7) после инкубации с N-АПФ содержит сигналы, соответствующие тем же самым массам, что и для неизомеризованного пептида АЬ-(1-16/Asp7).

a.u. 8000

6000

4000

2000

0

Рис. 2. Масс-спектр MALDI-TOF образца реакционной смеси после 20 мин инкубации пептида Ab(l-16/Asp-7) с N-доменом АПФ.

Основываясь на этих данных, можно заключить, что N-домен АПФ специфично гидролизует пептидную связь Arg5-His6 Ab-(1-16) в условиях in vitro в домене АЬ-(1-16). В результате гидролиза образуются два стабильных продукта, а именно АЬ-(1-5) и АЬ-(6-16), которые не подвергаются дальнейшему гидролизу в присутствии N-АПФ. В тех же условиях реакции, но с использованием С-концевого домена АПФ, гидролиз связи АЬ-(1-16/Asp7) или Ab-(l-16/isoAsp7) не обнаружен.

Чтобы оценить влияние изомеризации остатка аспарагиновой кислоты на эффективность гидролиза пептида АЬ-(1-16) N-АПФ, проводили количественные измерения накопления продуктов гидролиза АПФ в каждой реакции. Методом MALDI-TOF с использованием стандарта меченного 180. Использование изотопной метки необходимо, так как интенсивность регистрируемого сигнала в условиях MALDI зависит от множества факторов, часть из которых не установлена.

В представленной работе показано, что N-АПФ гидролизует пептид АЬ-(1-16) после остатка Arg5, образуя пептиды АЬ-(1-5) и АЬ-(6-16). Такая особенность гидролиза позволила нам использовать трипсин для получения изотопно-меченных стандартов, 180-АЬ-(1-5) и lsO-Ab-(6-16/Asp7). Стандарты получали путем исчерпывающего гидролиза трипсином предварительно точно измеренного количества пептида Ab-(1-16/Asp7) в воде Н2180. В результате гидролиза, дезамидирования С-концевой группы и одновременного обмена атома кислорода С-концевой карбоксильной группы и воды, получали эквимолярные количества пептидов 180-АЬ-(1-5) и lsO-Ab-(6-16/Asp7). Каждый из них содержал один или два атома 180, что было подтверждено масс-спекгрометрией MALDI, которая показала замещение исходных пиков АЬ-(1-5) и АЬ-(6-16) с m/z 679,3 и 1335,6, пиками с одним замешенным изотопом кислорода, соответственно, m/z 681,3 и 1338,6 и двумя замещенными кислородами |80, соответственно, m/z 683,3 и 1340,6. Химические

2000 т/2

свойства молекул, а следовательно и эффективность образования ионов, при замене одного изотопа другим не изменяются, однако изменение атомной массы легко регистрируется масс-спекгрометрически. Относительные изменения интенсивностей 3 и 5 пиков в изотопных пакетах рассматриваемых пептидов обусловлено введенным изотопом. По отклонению интенсивности этих сигналов от природного распределения интенсивностей пиков были вычислены относительные концентрации пептидов с одним и двумя замещенными 180 атомами, они составили 19% и 81% для АЬ-(1-5) и для пептида АЬ-(6-16) - 18,5% и 81,5% соответственно. Необходимо отметить, что пептид 18 О - АЬ- (6-16/Лзр7) был дезамидирован на С-конце, таким образом, его наиболее интенсивный пик в спектрах характеризовался т/: 1340,6 и соответствовал молекуле с двумя атомами 180.

На рис. 3 показаны фрагменты масс-спектра МАЦ)1-ТОР — изотопные пакеты, соответствующих пептидам без метки АЬ-(1-5) (рис. За) и ЛЬ-(6- 16/А<;р7) (рис. Зе), меченым стандартам 180-АЬ-(1-5) (рис. ЗЬ) и |80-АЬ-(6-16/А$р7) (рис. 31), и смесей анализируемых реакционных растворов со стандартами (рис. 3 с, <1, ¡> и Ь). Из соотношений изотопных пиков в этих спектрах вычисляли абсолютные концентрации соответствующих пептидов в реакционных смесях (Мв^огосккауа ?Л а1, 2000). Результаты расчетов показаны в виде гистограмм на рис. 4.

Таким образом, установлено, что после 20 мин гидролиза 20 мкМ пептида АЬ-(1-16/АБр7) М-АПФ в реакционной смеси содержалось 4 ± 0,4 мкМ АЬ-(1-5) и 4 ± 0,4 мкМ АЬ-(6-16/Аяр7). Важно отметить, что при использовании в качестве субстрата того же количества пептида с изомеризованным остатком аспарагиновой кислоты, АЬ-(1-16/БоАзр7) М-АПФ гидролизовал пептид существенно более эффективно, а через 20 мин в реакционной смеси содержалось 13±1,3 мкМ АЬ-(1-5) и 14±1,4 мкМ АЬ-(6-16/БоАзр7). Из представленных результатов следует, что К-домен АПФ гидролизует пептид АЬ-(1-16), и продуктами гидролиза являются два пептида, АЬ-(1-5) и АЬ-(6-16). При этом С-домен фермента не гидролизует пептид АЬ-(1-16). Изомеризация остатка АБр7 исследованного пептида является важной модификацией, возможно, значимой в патогенезе болезни Альцгеймера. Исследуя взаимодействие Ы-домена с двумя формами пептида мы показали, что АЬ-(1-16/%оАзр7) гидролизуется Ы-доменом АПФ примерно в три раза более эффективно, чем АЬ-(1-16/Азр7), если измерять накопление продуктов гидролиза в определенный момент времени (20 мин инкубации). Наблюдаемое явление может указывать на потенциальную биологическую роль >1-домена АПФ как фермента, участвующего в удалении связываемой

688 т/г 1334

1346 т/г

Рис. 3. Фрагменты МАЦЭ1-Т0Р масс-спектров: изотопные пакеты, соответствующие пептидам без метки АЬ-(1-5) (а) и АЬ-(6-16/Азр7) (е), меченным стандартам 180-АЬ-(1-5) (Ь) и 180-АЬ-(6-16/Азр7)(1), и анализируемым реакционным смесям со стандартами (с, с1, g. Ь)

АВЧ1-5)

А(3-(6-16)

Рис. 4. Концентрации пептидов АЬ-( 1-5) и АЬ-(6-16) в реакционной смеси через 20 мин инкубации с Ы-доменом АПФ: АЬ-(1-16/Азр-7) (белые столбцы) и АЬ-(1-16/воА$р-7) (серые столбцы),

с БА изоформы АЬ. Таким образом, была показана эффективность использования масс-спекгрометрии MALDI-TOF для мониторинга реакций, идентификации субстрата и определения скоростей реакций. Проведенные эксперименты позволили выявить влияние на гидролиз АЬ посредством АПФ изомеризации Asp-7, неферментативной модификации, по некоторым данным, связанной с возрастными изменениями при болезни Альцгеймера (Zirah et а), 2006).

Исследование особенностей иигибирования сывороткой экзогенного трипсина при различных количествах вводимого фермента путем масс-спектрометрии М ALDI-TOF полученных пептидных продуктов

Гидролиз экзогенных субстратов, как и функционирование вводимых в сыворотку протеаз, существенно отличается практически от любой системы in vitro тем, что реакции протекают в присутствии конкурирующих протеаз, субстратов и ингибиторов. Так как в работе гидролиз сывороточных белков проводился трипсином, то выбор условий проведения такого гидролиза основывается на литературных данных о составе и особенностях ингибиторов трипсина в крови, условно разделяемых на два типа. Ингибиторы первого типа полностью инакгивируют трипсин при связывании. В основном это антитрипсин (tti-ИП), концентрация которого в норме составляет в среднем 36 мкМ и меняется в зависимости от состояния организма в диапазоне от 2 до 70 мкМ. Принципиально отличается по взаимодействию с протеазами аг-макроглобулин (С12М), который способен связываться с протеазами всех классов. При этом характер взаимодействия агМ с протеазами, в том числе и с трипсином, таков, что активный центр ферментов остается свободным. Показано, что в комплексе трипсин способен гидролизовать небольшие белки - например, протамины. Отметим также, что в комплексе с СХ2М трипсин приобретает устойчивость к действию других белковых ингибиторов плазмы крови. Кроме того, агМ характеризуется высоким сродством к трипсину, в 6-7 раз превышающим сродство к сцИП. Поэтому при введении в образец трипсина в первую очередь будет образовываться комплекс с агМ, и уже затем с ailOT. Только после исчерпывания а]ИП в плазме начнется гидролиз основного его белка - альбумина. Таким образом, введение трипсина в плазму крови в концентрациях ниже концентрации спИП будет приводить к образованию активной формы фермента в концентрации, соответствующей концентрации 0L2M. Полагалось, что образующиеся при патологии белки будут подвергаться гидролизу, и это удастся выявить с помощью масс-спекгрометрии.

Так как предложенный метод предполагалось использовать для масс-спекгрометрического профилирования образцов сывороток крови больных раком яичника, регистрируемые масс-спектрометрические сигналы были подробно исследованы на примере сывороток крови здоровой женщины, пациентки с серозной цистаденомой и двух пациенток с диагностированной аденокарциномой яичника. В соответствии с разработанным протоколом осуществлен гидролиз сывороток трипсином в концентрации 2 мкг/мл, незначительно превышающей концентрацию агМ. Полученные спектры приведены на рис. 5.

Среди зарегистрированных в образцах сигналов 31 характерен только для сывороток здоровых женщин, 58 уникальных сигналов обнаружено среди продуктов гидролиза сывороток больных раком яичника и 15 общих сигналов для здоровых и больных.

Время гидролиза сыворотки было выбрано равным 2 часам. Это время, за которое в спектрах образуется характеристическая композиция сигналов, было определено как оптимальное для получения спектров, пригодных для клинического использования в результате серии «кинетических экспериментов» на примере сыворотки №431.

Представляется интересным отметить спектры, получаемые при коротком времени гидролиза. Через 30 мин гидролиза в спектре наблюдается только два пика со значительной интенсивностью: т/: 1913 и т/: 1259 (рис. 6). Для этих пиков были

3 г

-.......' ■ 1 • ■ - ■ 1 1 ; I

мімі

¿.пі ,

И I а

1 М » 1,1 .11

1§ г Л 11;

= ¡5 я = г Г |Г , I 5 5 е ' Г- ■ _'. " 1 ■1 :1 1 ■ ■ ■.

Рис. 5. Масс-спектры продуктов гидролиза трипсином сывороток крови а - здорового донора. Ь - больного с миомой матки, с и сі- больных с аденокарциномой яичника.

Рис. 6. Масс-спектр МАІХ>І-ТОР образца сыворотки пациентки с аденокарциномой яичника №431 через 30 мин гидролиза трипсином при 37°С.

получены спектры фрагментации, и по полученным данным MS/MS с использованием Mascot они были достоверно идентифицированы как пептид сывороточного амилоида SAA (84-104) (m/z 1913) и фрагмент а2М VGFYESDVMGR (mlz 1259) (рис. 7). В соответствии с известными свойствами а2М при ингибировании им трипсина должен образовываться именно этот пептид (Sottrup-Jensen, 1989).

Через 2 часа гидролиза относительная интенсивность сигнала m/z 1259 значительно снижается, в то же время пик m/z 1913 входит в группу наиболее интенсивных сигналов состоящую из m/z 1456,7, 1465,7, 1514,7, 1550,7, 1612,8, 1913,0,2178,0, причем эти сигналы не регистрируются в образцах, полученных от здоровой женщины.

Таким образом, как и предполагалось, в полученных спектрах не было обнаружено сигналов продуктов триптического гидролиза сывороточного альбумина. При этом общее число регистрируемых ионов в гидролизованных образцах возросло примерно в три раза по сравнению с контрольными образцами, инкубированными без трипсина. С использованием алгоритма SNAP, при ограничении параметра сигнал/шум не менее 6, в диапазоне 900-2500 Да в масс-спектрах продуктов гидролиза сывороток больных детектировали около шестидесяти различных ионов, и около двадцати в контрольных.

Часть зарегистрированных сигналов удалось идентифицировать. Для этого был использован алгоритм идентификации белка по наборам масс продуктов гидролиза MOWSE с использованием поисковой системы MASCOT. Кроме того, пять пептидов этого белка были идентифицированы по спектрам фрагментации.

Проведенный анализ позволил идентифицировать одиннадцать пептидов как продукты трипсинолиза SAA. Идентифицированные сигналы и соответствующие им участки аминокислотной последовательности представлены на рис. 8.

100 200 300 400 500 600 700 800 900 (ООО 1100 1200

Рис. 7. Масс-спектр фрагментации пептида m/z 1259, отмечены соответствия с аминокислотной последовательностью пептида VGFYESDVMGR белка а2М.

Сывороточный амилоид A (SAA) присутствует в крови в виде серии вариантов из продуктов двух генов с высокой гомологией (saal и saa2, гомология более 90%). При этом в продуктах гидролиза преимущественно регистрируются триптические пептиды двух изоформ SAA Al а и SAA А2а, как в виде исходных форм, так и без N-концевого аргинина. Аминокислотные последовательности этих белков приведены на рис. 8 а и Ь.

Из приведенных результатов можно заключить, что удалось провести гидролиз в условиях, позволяющих избежать влияния на результат эксперимента присутствия в сыворотке большого количества альбумина и получить представительные и интенсивные спектры. При этом выявлены значительные различия в спектрах образцов больных и здоровых пациентов и идентифицировано присутствие в образцах SAA. Как уже было указано, SAA является молекулярным маркером рака яичника, хотя и неспецифичным. Тем не менее, предложенная методика подготовки образца позволяет дополнительно регистрировать около пятидесяти пептидов, что обеспечивает ее диагностический потенциал.

saa1

1 RS ITS n,GExW)GAlU]MlfllAX SDMREAHY I GSDKYFtUUUSMYllMlKftGlHSlSVMXAEM SD'JUIENIQRFFG^IGUDSLUIQMNKWGRSGIIX РНЮТ pagl pp.гу

saa2 ь

i ! i i i so, i i i i _

HSrFSFT^EATDGAMJMm^YSDMRZANTIGSDKYrHJÄGNTOAAXRGPGi^

rSAA С

b¿tSFl*9 еъселпмзавоммрах 8DMRXAKYiasDKXFHARGkrYDAAKSGR»G.viiAAXAlsi^AE ka: Q'- pFda<SAEDSLADC)AANKltQR5G^DPHtn>RPACLPEKX 101

Рис. 8. Аминокислотные последовательности белков SAA Ala (a), SAA A2a (b) и rSAA (с) и их триптические пептиды, регистрируемые в масс-спектрах MALDI-TOF среди продуктов гидролиза сывороток.

Так как в данной работе впервые был обнаружен эффект гидролиза белков сыворотки низкими концентрациями трипсина, представилось целесообразным более подробно исследовать образование и накопление продуктов при таком гидролизе.

Нами была исследована динамика накопления SAA 88-104 в ходе гидролиза. Для этого с помощью количественной масс-спекгрометрии были определены изменения концентрации пептида SAA 88-104 в зависимости от времени реакции, что, в свою очередь позволяет судить об активности комплекса трипсина с ингибиторами сыворотки. Ввиду того, что регистрируемые масс-спекгрометрически количества SAA были обнаружены нами только в сыворотке больных, для изучения гидролиза в сыворотке здоровой женщины использовали рекомбинантный белок SAA - rSAA. имеющий замены Asn 60 Asp и His 71 Arg а также на N-концевой Met, однако С-концевые участки обоих пептидов одинаковы, и, следовательно, одинаковы пептиды SAA 88-104.

Для проведения этих измерений использовали пептид SAA 88-104, амидированный по С-концевой аминокислоте, в результате чего его молекулярная масса оказывалась на 1 а.е.м. меньше, чем у пептида, получающегося в результате гидролиза природного белка. Исследовали динамику изменения концентрации этого пептида в реакционной смеси. Измерения осуществляли путем отбора в выбранные моменты времени из реакционной смеси аликвот и их смешивания с раствором стандарта, после чего регистрировали масс-спектр полученной смеси. Концентрация природного пептида вычислялась из интенсивностей моноизотопных сигналов m/z 1913 и т/: 1912.

с; 1.6 г

■ч-2 0.8

£0.2

сыворотка больной сыворотка больной сыворотка больной сыворотка

аденокарциномой аденокарциномой аденокарциномой больной миомой

с добавлением без добавления с добавлением с добавлением

ГЭЛА ГЗАА Г5АА гБАА

за вычетом природного

Рис. 9. Динамика накопления пептида, тЬ 1913 гвАА в сыворотке больной аденокарциномой яичника (а-с) и миомой матки(<1).

Измеренное содержание пептида ЭАА 88-104 в сыворотках в зависимости от времени представлено в виде диаграмм на рис. 9.

Сравнение количества пептида, образовавшегося в результате гидролиза за два часа, показывает, что в сыворотке больного раком яичника белок гБАА гидролизуется в три раза более эффективно, чем в сыворотке здорового человека, даже при том, что одновременно гидролизуется и природный 8АА, а максимальная концентрация С-концевого пептида БАА 88-104 достигается к 2-4 часам. Необходимо отметить, что пептид ЭАА 88-104 содержит еще два сайта потенциального гидролиза трипсином, однако его расщепление начинает наблюдаться только после 2-4 часов реакции. В сыворотке здоровой женщины максимальная концентрация при гидролизе достигается к 24 часам.

На основании полученных данных можно утверждать, что большая скорость в сыворотке больной с раком яичника обусловлена присутствием в ней большей концентрации агМ и соответственно большей концентрации трипсина в виде комплекса с этим ингибитором.

Таким образом, определяя скорости гидролиза искусственного субстрата при контролируемом трипсинолизе, можно масс-спектрометрически оценивать уровень а2-М, что при надлежащем образом выбираемой концентрации трипсина становится дополнительным параметром при масс-спекгрометрическом профилировании. Стоит

отметить имеющиеся в литературе сведения, что повышение уровня агМ указывает не только на наличие онкологического заболевания, но и на присутствие метастазов.

Также известно, что заболевание раком характеризуется увеличением концентрации ингибиторов в сыворотке, в том числе уровня с^ИП (ЛПавОуа а1 гЛ, 2006). Используя методы прямой масс-спекгрометрии, также возможно оценить уровень ингибиторов трипсина в крови. Для этого сыворотки «титровали» трипсином для определения минимальной концентрации, при которой регистрируется характерный для гидролиза сывороточного альбумина набор масс-спектрометрических сигналов, то есть до начала гидролиза альбумина. По сути, альбумин является подходящим субстратом благодаря высокому содержанию в крови и простоте регистрации продуктов его гидролиза в сыворотке. Группу пептидов т/.1467,8, 1623,8 и 1770,9 использовали как критерий начала гидролиза альбумина. Как указано ранее, характеристический набор пиков может быть зарегистрирован через 2 ч реакции. Через 24 ч инкубации интенсивность сигналов падает.

Эксперименты были проведены на трех образцах: двух сыворотках больных раком яичников (№411 и №431) и на одной сыворотке больной миомой матки (№417). Молярное отношение между трипсином и средним известным из литературы содержанием оцИП составляло 2:1. Все интенсивные ионы в сыворотке №417 относились к альбумину, покрывая 60% его последовательности (рис. 10 а). При этом в сыворотках №411 (рис. 10, Ь) и №431 (рис. 10, с) пиков, соответствующих альбумину не обнаруживалось, но сигналы пептидов БАА присутствовали. В этих сыворотках пептиды альбумина появлялись через 2 часа реакции только при концентрации трипсина 200 мкМ в сывоторке №431 (5-кратное превышение нормального уровнбя а[ИП, рис. 10<1) и 400 мкМ в сыворотке 411 (10-кратное превышение, рис 10 е). Это указывает на значительно более высокое содержание ингибиторов трипсина в крови больных раком яичника. Таким образом, тестирование образцов сыворотки введением различных концентраций трипсина позволяет определять содержание ингибиторов протеаз (спектры представлены на рис. 10). Заметим, что таким способом продемонстрирована регистрация изменения эффективности ингибиторов протеаз крови, при том, что в силу низкой концентрации эти ингибиторы недоступны для исследования прямым масс-спекгрометрическим анализом.

Для оценки возможности создания формального метода классификации пациентов -прототипа диагностики, был проведен гидролиз сывороток 10 больных с клинически диагностированной аденокарциномой яичника, 10 пациенток с диагностированными доброкачественными опухолями яичников и матки и 10 сывороток здоровых доноров.

Сыворотки были подвергнуты гидролизу трипсином по предложенному в работе методу, после чего были зарегистрированы масс-спектры продуктов реакции. Полученные масс-

JÜ1

•

• 1311.7 • — 1467. 550.7 » • •• SSgp • . п О л « • • <о og з

„I ,1 1 ,1 L„> i ® .111Г M 1 cJ ?5 8 ■ ...... L.. ...

LL.

J-JL

i г Jú

= le

1L

■А M.ü.....

г

iH.

i<. -i

? L

J_U

jLÜJL

1

s

гs i

Ж

I t ЗЙ

.. I ti, .,.[.

lio».

¡j

]h = - £ s

-г J a gil E

4Д.......Ш

Рис. 10. Масс-спектры трипсиновых гидролизатов сыворотки больной миомой матки №417 (а) и больных раком яичника №411 (Ь,с1), №431 (с,е). Концентрация трипсина 2 мкМ, концентрации в реакционной смеси о^ИП 0,9 мкМ (а-с), 0,18 мкМ (<1) и 0,36 мкМ (е) (рассчитаны исходя из концентрации с^ИП в сыворотке в норме 36 мкМ)

спектры были использованы для формализованного поиска закономерностей с использованием метода опорных векторов.

С помощью программы Bruker ClinProTools, где используется метод опорных векторов, для предложенного метода подготовки образцов плазмы к протеомному профилированию были построены классифицирующие поверхности. При этом точность классификации без перекрестной проверки составила 100%, а после этой проверки она составила 95,45%.

ВЫВОДЫ

1. Масс-спекгрометрический анализ MALDI-TOF с использованием изотопной метки |80 подходит для исследования сайтов и скорости гидролиза протеазой, что показано in vitro на модельной системе из ангиотензинпреврашщощгго фермента и пептида амилоида-бета АЬ(1-16). Установлено, что N-концевой домен, но не С-концевой домен фермента специфично гидролизует пептид а АЬ(1-16) с образованием двухпептядов АЬ(1-5) и АЬ(6-16), причем изомеризация остатка аспарагиновой кислоты в 7 положении этого пептида с образованием изоаспарагиновой кислоты приводит к 4-кратному увеличению скорости гидролиза АПФ.

2. При введении в сыворотку крови экзогенного трипсина для протеомного профилирования состав регистрируемых путем MALDI-TOF масс-спекгрометрии продуктов зависит от концентрации трипсина. При концентрации трипсина в сыворотке меньше 10 мкМ регистрируются масс-спектры, свободные от продуктов гидролиза высококопийных белков, например, альбумина, пептиды которого появляются при повышении концентрации фермента.

3. Регистрация в качестве первого по времени появления продукта гидролиза плазмы пептида «2 макроглобулина указывает на участие этого белка в изменении специфичности трипсина при титровании им плазмы крови.

4. MALDI-TOF-профиль продуктов гидролиза плазмы крови экзогенным трипсином отличается в норме и при раке яичников, по-видимому, вследствие разного уровня ингибиторов протеаз в плазме. Профили с контролируемым трипсинолизом использованы для диагностической классификации 30 образцов от пациентов с раком яичника и здоровых доноров, которая показала 95% точность диагностики.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Lokhov P.G., Tikhonova O.V., Moshkovskii S.A., Goufman E.I., Serebriakova M.V., Maksimov B.I., Toropyguine I.Y., Zgoda V.G., Govorun V.M., Archakov A.I. Database search postprocessing by neural network: Advanced facilities for identification of components in protein mixtures using mass spectrometric peptide mapping. // Proteomics. 2004. V.4(3). P.633-642.

2. Гоуфман Е.И., Мошковский C.A., Тихонова O.B., Лохов П.Г., Згода В.Г., Серебрякова М.В., Торопыгин И.Ю., Власова М.А, Сафарова М.Р., Макаров О.В., Арчаков А.И. Протеомное исследование термостабильной фракции сыворотки пациентов с различными опухолями с применением двумерного электрофореза. II Биохимия. 2006. Т.71(4). С.445-463.

2а. Goufman E.I., Moshkovskii S.A., Tikhonova O.V., Lokhov P.G., Zgoda V.G., Serebryakova M.V., Toropygin I.Y., Vlasova M.A., Safarova M.R., Makarov O.V., Archakov A.I. Two-dimensional electrophoretic proteome study of serum thermostable fraction from patients with various tumor conditions. // Biochemistry (Mosc). 2006. V.71(4). P.354-360.

3. Морозов C.T., Грибова И.Е., Юпошник Т.П., Сидякин А.А., Гнеденко Б.Б., Торопыгин И.Ю., Фадеев Д.А., Зозуля С.А., Коверная Е.Ж., Сарманова З.В. Влияние повышенного уровня антител к основному белку миелина у самок мышей на постнатальное развитие и поведенческие реакции потомства. II Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2007. №10. С.432-435.

4. Егоров Е.Е., Молдавер М.В., Вишнякова Х.С., Терехов С.М., Дашинимаев Э.Б., Чеглаков И.Б., Торопыгин И.Ю., Ярыгин К.Н., Чумаков П.М., Корочкин Л.И., Антонова Г.А, Рыбалкина Е.Ю., Сабурина И.Н., Бурнаевский Н.С., Зеленин А.В. Усиление контроля пролиферации в теломеризованных клетках. // Онтогенез. 2007. Т.38. №2. С.105-119.

5. Курбатов Л.К., Чеглаков И.Б., Ярыгин К.Н., Сухих Г.Т., Вартанян Г.В., Торопыгин И.Ю., Арчаков А.И. Сравнительный протеомный и транскриптомный анализ фетальной печени человека. // Биомедицинская химия. 2008. Т.54. №2. С.140-153.

6. Toropygin I.Y., Kugaevskaya E.V., Mirgorodskaya О.A., Elisseeva Y.E., Kozmin Y.P., Popov I.A., Nikolaev E.N., Makarov A.A., Kozin S.A. The N-domain of angiotensin-converting enzyme specifically hydrolyzes the Arg-5-His-6 bond of Alzheimer's Abeta-(1-16) peptide and its isoAsp-7 analogue with different efficiency as evidenced by quantitative matrix-assisted

laser desorpton/ionration time-of-fight mass spectrometry. // Rapid Commun Mass Spectrom. 2008. V.22(2). P.231-239.

7. Манойлов A.B., Торопыгин И.Ю., Козьмин Ю.П., Краснов Н.В., Самус H.JI., Новиков

A.В., Бубляев Р.А., Миргородская О.А. Клиническая протеомика: новые диагностические возможности масс-спектрометрии. // Научное приборостроение. 2008. Т. 18, №4, С.16-23.

8. Манойлов А.В., Торопыгин И.Ю., Козьмин Ю.П., Новиков А.В., Бубляев Р.А., Миргородская О.А. Комплексный анализ лекарственных препаратов, содержащих стрептокиназу, с использованием масс-спектрометрии // Научное приборостроение. 2010. Т.20, №4, С.50-58.

9. Karpova М.А., Moshkovskii S.A., Toropygh I.Y., Archakov A.I. Cancer-specific MALDI-TOF profiles of blood serum and plasma: biological meaning and perspectives. // J Proteomfcs. 2010. V.73(3). P.537-551.

10. Toropygin I.Yu., Mirgorodskaya O.A., Moshkovskii S.A., Serebryakova M.V., Archakov A.I. Controlled trypsinolysis of human cancer and non-cancer sera for direct matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry // International Journal of Mass Spectrometry. 2012. V.325-327. P.121-129.

Патент на изобретение

11. Пат. 2351932 Российская Федерация, МПК G01N 33/53 Способ регистрации и идентификации макромолекул при помощи сопряженной системы на основе сканирующей пробной микроскопии и масс-спектрометрии. /Арчаков А.И., Иванов Ю.Д., Плешакова Т.О., Торопыгин И.Ю., Згода В.Г., Быков В.А. - №2006129865/15, Заявл. 18.08.2006, опубл. 10.04.2009, Бюл. № 10.

Материалы трудов конференций

12. Toropyguine I.Yu., Archakov A.I. Direct MALDI-MS Application for Different Disease Diagnostics. // Abstr. HUPO 3th Annual World Congress. Beijing, China. Molecular & Cellular Proteomics. 2004. V.3(10) (Supplement). P.S230.

13. Ярыгин K.H., Егоров E.E., Чеглаков И.Б., Торопыгин И.Ю., Курбатов JI.K., Ярыгин

B.Н. Пост-транскрипционная геномика в исследовании клеточных культур. // Материалы докладов конференции «Стволовые клетки и перспективы их использования в здравоохранении». Москва. 2006. С.4.

14. Торопыпш И.Ю., Серебрякова М.В., Миргородская O.A. Использование неполного протеолиза плазмы крови в диагностике рака яичника. // Материалы докладов VI Симпозиума ((Химия протеолитических ферментов». Москва. 2007. С.65.

15. Кугаевская Е.В., Елисеева Ю.Е., Торопыгин И.Ю., Миргородская O.A., Козин С.А. Гидролиз характеристического для болезни Альцгеймера амилоидного пептида N-доменом ангиотензин-ревращающего фермента. // Материалы докладов VI Симпозиума ((Химия протеолитических ферментов». Москва. 2007. С. 165.

16. Торопыгин И.Ю., Хряпова Е.В., Серебрякова М.В., Козьмин Ю.П., Миргородская O.A. Использование методов количественной масс-спекгрометрии в изучении кинетических параметров ферментативных реакций. // Материалы докладов VI Симпозиума ((Химия протеолитических ферментов». Москва. 2007. С.166.

17. Торопыгин И.Ю., Серебрякова М.В., Хряпова Е.В., Мирогородская O.A. Ограниченный протеолиз сывороток крови для целей диагностической протеомики. // Мат. доклад 3-ей Международной школы-конференции молодых ученых «Масс-спекгрометрия в химической физике, биофизике и экологии». Звенигород. 2007. С. 156.

18. Торопыгин И.Ю., Кугаевская Е.В., Миргородская О.А, Елисеева Ю.Е., Козьмин Ю.П., Попав И.А., Николаев E.H., Макаров A.A., Козин С.А. Определение эффективности гидролиза изоформ бета-маилоидного пептида болезни Альцгеймера N-доменом Ангиотензин-превращающего фермента. // Материалы докладов 3-ей Международной школы-конференции молодых ученых «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии». Звенигород. 2007. С. 133.

19. Toropygh I.Yu., Archakov A.I. Controlled trypsinolysis of normal and cancer sera for direct MALDI-MS profiling. // Abstr. HUPO 6th Annual World Congress. Seoul, Korea. 2007. HA-0460 P. 150.

20. Кугаевская E.B., Козин C.A., Торопыгин И.Ю., Миргородская O.A., Елисеева Ю.Е., «Ангиотензин превращающий фермент гидролизует амилоидный пептид, накапливающийся при болезни Альцгеймера». // Материалы докладов конференции «Протеолиз, механизмы его регуляции и роль в физиологии и патологии клетки". Минск. 2007. С.67.

21. Moshkovskü S.A., Vlasova М.А., Toropygin I.Y., Pyatnitsky M.A., Archakov A.I. Plasma proteome profiling by MALDI-TOF-mass-spectrometry for cancer diagnostics. // Abstr. 4th International Conference "Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanobiotechnofogies for Medicine". Moscow-Nizhny Novgorod-Moscow, Russia. 2008. P.17.

22. Toropygin I.Yu., Mirgorodskaya O.A. Controlled trypsinolisys // Abstr. 4th International Conference "Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanobiotechnologies for Medicine". Moscow-Nizhny Novgorod-Moscow, Russia. 2008. P. 10.

23. Moshkovskii S., Vlasova M., Pyatnitskiy M., Toropygin I., Archakov A. Analysis of peak intensity correlations to improve diagnostic accuracy and maximize biological meaning of mass-spectral diagnostics of ovarian and prostate cancer. // Abstr. HUPO 7th Annual World Congress. Amsterdam, Nederlands. 2008. P-TUE-165. P.lll.

24. Yarygin K., Cheglakov I., Kurbatov L, Toropygin I, Archakov A, Sukhikh G, Vartanian G. Comparative traascriptomics and proteomics of fetal and aduh human liver. // Abstr. HUPO 7th Annual World Congress. Amsterdam, Nederlands. 2008. p-mon-353 P. 95.

25. Moshkovskii S.A., Karpova M.A., Toropygin I.Y., Archakov A.I. Proteome bar-code for cancer diagnostic: the state-of-the-art and prospects. // Abstr. 5th International Conference "Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanobiotechnologies for Medicine". Saint-Petersburg, Russia. 2010. P.58.

26. Melnik S.A., Moshkovskii S.A, Karpova M.A. Sycheva A.M., Fomchenkova E.F., Yurasova O.V. Toropygin I.Y., Unanyan A.G., Sidorova I.I., Paulus A., Archakov A.I. 2D-electrophoresis-baseo comparative stady of umbilical cord and maternal blood plasma. // Abstr. 5th International Conference "Genomics, Proteomics, Bk>informatics and Nanobiotechnologies for Medicine". Saint-Petersburg, Russia. 2010. P.59.

27. Toropygin I.Yu., Mirgorodskaya O. A., Khrypova E.V. The use of peptide probes to profile protease activity in cancer and non-cancer sera. // Proc 38th FEBS Congress. StPetersburg, Russia. 2013. P.637.

Благодарность

Автор выражает глубокую признательность за обучение и помощь в планировании, проведении и обсуждении экспериментов доктору химических наук O.A. Миргородской (ФГБУ НИИ гриппа Минздрава России, г. Санкт-Петербург).

Финансирование работы осуществлялось из средств программы Российской академии медицинских наук «Протеомика в медицине и биотехнологии», грантов Российского фонда фундаментальных исследований и государственных контрактов по заказу Министерства образования и науки Российской Федерации.

Подписано в печать: 07.11.13 Заказ № 2853 Тираж: 100экз.

Типография «ОПБ-Принт» ИНН 7715893757 107078, г. Москва, Мясницкий пр-д, д. 2/1 (495) 777 33 14 www.opb-print.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Торопыгин, Илья Юрьевич, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ БИОМЕДИЦИНСКОЙ ХИМИИ ИМ В.Н. ОРЕХОВИЧА» РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

)

На правах рукописи 04201365344

ТОРОПЫГИН ИЛЬЯ ЮРЬЕВИЧ

МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ MALDI-TOF ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ САЙТОВ И СКОРОСТИ ГИДРОЛИЗА БЕЛКОВ АНГИОТЕНЗИНПРЕВРАЩАЮЩИМ ФЕРМЕНТОМ И ТРИПСИНОМ

in vitro И В ПЛАЗМЕ КРОВИ

Специальность 03.01.04 — биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук Мошковский С. А.

Москва - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

СОДЕРЖАНИЕ..............................................................................................2

1. ВВЕДЕНИЕ................................................................................................4

1.1. Актуальность проблемы............................................................................4

1.2. Цель и задачи исследования.......................................................................6

1.3. Научная новизна работы............................................................................7

1.4 Практическая значимость работы................................................................8

1.5. Положения, выносимые на зашдту.............................................................9

1.6. Публикации и апробация работы...............................................................9

1.7. Объем и структура работы........................................................................11

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................12

2.1. Использование масс-спектрометрии при изучении бежов.........................12

2.2. Основы МА1£)1-времяпролетной масс-спектрометрии белков и пептидов. 14

2.2.1. Устройство масс-спектрометра..............................................................14

2.2.2. Образование свободных ионов в МАЬШ................................................16

2.2.3. Измерение масс ионов...........................................................................22

2.2.4. Влияние изотопии.................................................................................23

2.2.5. Времяпролетный масс-анализатор.........................................................24

2.2.6 Принцип действия времяпролетнош масс-анализатора..........................25

2.2.7. Основные параметры масс-анализаторов................................................26

2.2.9. Фрагментация пептидов в МАЬБ1.........................................................28

2.2.10. Измерение т/г фрагментов..................................................................32

2.2.11. Детектор времяпролетнош анализатора...............................................33

2.3. Масс-спектрометрия в биологии и медицине.............................................34

2.3.1. Протеомное профилирование образцов..................................................36

2.3.2. Про филирование для медициской диагностики......................................37

2.4. Ингибиторы протеаз в плазме крови..........................................................41

2.4.1. Механизмы действия ингибиторов протеиназ.........................................42

2.4.2. Стандартный механизм действия ингибиторов сериновых протеиназ....43

2.4.3. Отклонения от стандартной модели действия ингибитора.......................44

2.4.4. Альфа 2-Макроглобулин.......................................................................45

2.5. Ренин-ангиотензиновая система...............................................................47

2.5.1. Ангиотеюинпревращаюший фермент....................................................50

2.6. Амилоцц-бета и болезнь Альцгеймера.......................................................52

2.6.1. Аншотензинпревращающий фермент в метаболизме амилоида-бега......58

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ......................................................................61

3.1. Клинический материал.............................................................................61

3.2. Пептиды и белки......................................................................................61

3.4. Гидролиз пептидов амилоида бета отдельными доменами АПФ..............63

3.5. Количественные измерения продуктов гидролиза пептидов амилоида-бега.64

3.6. Получение фрагмента Ab( 1 -5), меченного О..........................................64

3.7. Гидролиз сывороток трипсином...............................................................65

3.8. Гидролиз сывороток в присутствиирекомбинантнош SAA (rSAA)..........65

3.9. Количественные MALDI-TOF анализы SAA............................................65

4.РЕЗУЛБТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ..............................................................69

4.1. Гидролиз пептида АЬ (1-16)......................................................................69

4.1.1. Гидролиз пептида Ab (1 -16) ангиотензинпревращающим ферментом и влияние изомеризации Asp7 на скорость гидролиза........................................69

4.1.2. Сравнение скоростей гидролиза изомеров пептидов АЬ АПФ с использованием количественной масс-спектрометрии с меченными О внутренними стандартами..............................................................................74

4.2. Измерение активности протеаз в плазме и сыворотке крови.....................79

4.2.1. Исследование особенностей ингибирования сывороткой экзогенного трипсина при различных количествах вводимого фермента с исследованием путем масс-спектрометрии MALDI-TOF полученных пептидных продуктов .80

4.2.1. Избирательный протеолиз в сыворотке крови трипсином......................83

4.2.2. Трипеинолизрекомбинангного SAA(rSAA) в сыворотке больной аденокарциномой (№411) и миомой (№417)..................................................89

4.2.3. Сравнение степеней необратимого ингибирования трипсина в сыворотках больных аденокарциномой яичника (№411 и №431) и миомой матки (№417)..................................................................................................94

4.2.4. Диагностическая классификация образцов ракаяичникаи нераковых образцов.........................................................................................................97

5. ВЫВОДЫ...................................................................................................99

БЛАГОДАРНОСТЬ.....................................................................................100

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.................................................101

Сокращения.................................................................................................111

1. ВВЕДЕНИЕ 1.1. Актуальность проблемы

Протеазы, или протеолитические ферменты катализируют гидролиз белков по пептидным связям. Биоинформационный анализ генома человека, показал, что к протеазам и гомологичным им белкам относится 566 генов, или 1,7% генома.

До недавнего времени протеазы рассматривались как ферменты, конвертирующие неактивных предшественников физиологически активных белков и пептидов, включая ферменты и гормоны, в активное состояние. Однако в настоящее время стало очевидным, что перечень физиологических функций протеаз значительно шире. Протеазы выполняют важную роль во многих процессах и задействованы не только в метаболических, но и в сигнальных молекулярных сетях. В силу физиологической значимости протеазы играют важную роль и в патогенезе различных заболеваний, а значит, являются привлекательным диагностическими и лекарственными мишенями.

Чтобы наиболее полно понимать функциональное значение протеаз в тех или иных процессах, необходимо определить специфичность фермента, идентифицировать эндогенные субстраты и продукты гидролиза, а также активаторы и ингибиторы фермента. Для описания и моделирования молекулярных сетей, в которых задействованы протеазы, также необходимы количественные оценки концентраций и активностей ферментов, в том числе in vitro, ex vivo и in vivo.

В настоящей работе в качестве экспериментального подхода для изучения протеаз использованы методы, основанные на масс-спектрометрии MALDI-TOF - лазерной десорбции/ионизации из объема специального вещества - матрицы, с времяпролетным детектором. Этот способ анализа образцов обеспечивает определение молекулярной массы исследуемого образца или молекулярных масс компонентов сложных смесей.

В случае исследования белков видов с известным геномом несложная предварительная обработка образца, как правило, позволяет идентифицировать один или несколько белков в смеси. Кроме того, благодаря конструктивным особенностям ионного источника MALDI, имеется возможность работы с биологическим материалом без предварительной очистки или фракционирования образца, например, цельной сывороткой крови.

Возможность одновременного измерения молекулярных масс нескольких компонентов смеси позволяет наблюдать гидролиз природного субстрата или нескольких субстратов, например, по накоплению продуктов реакции. Однако в условиях ионного источника MALDI, как и практически любого другого типа масс-спектрометра, ионы в газовой фазе различных пептидов образуются с неодинаковой эффективностью, поэтому MALDI нельзя отнести к количественным методам, и для сколь-нибудь точных количественных оценок требуется использование специальных методов анализа, например введения изотопных меток.

В данной работе при помощи масс-спектрометрии MALDI-TOF были исследованы взаимодействие выделенных ферментов и субстратов и ингибирование экзогенного фермента ингибиторами протеаз сыворотки крови.

В первой части работы исследован гидролиз пептида АЬ (1-16) белка амилоида бета, связываемого с болезнью Альцгеймера (БА), ангиотензинпревращающим ферментом (АПФ). То что белок амилоид бета гидролизуется АПФ, было известно ранее, однако сайт гидролиза и влияние на гидролиз изомеризации аспарагиновой кислоты (связываемое с БА возрастное изменение) не были установлены.

Во второй части работы изучался гидролиз цельной сыворотки трипсином. В условиях in vitro в системе из протеазы и субстрата содержащийся в низкой концентрации фермент способен гидролизовать количество белка, многократно превышающее его собственное содержание.

Однако в крови этого не происходит благодаря сбалансированной системе ингибиторов. Иными словами, гидролиз сыворотки трипсином происходите присутствии ингибиторов, при этом ингибиторы могут быть разделены на два типа. Ингибиторы первого типа, например альфа-1 ингибитор протеиназ, (а1ИП) известный как антитрипсин, полностью блокируют активность фермента, необратимо связываясь с ним. Другой важный белок крови, альфа 2-макроглобулин (а2М), образует с протеазами комплекс, в котором активный центр фермента остается свободен, но пространственная структура образованного комплекса ограничивает взаимодействие с частью субстратов и ингибиторов, изменяя специфичность фермента. В зависимости от соотношений трипсина и ингибиторов в реакционной смеси должны наблюдаться различные продукты гидролиза. Так, если ингибиторы связаны с патологическим процессом, то изменения регистрируемых продуктов не только указывает на наличие и относительную концентрацию ингибиторов, но и на развитие или состояние патологического процесса.

Масс-спектрометрия MALDI-TOF использована в настоящей работе как подходящий инструмент для исследования сайтов и скорости гидролиза беков ангиотензинпревращающим ферментом и трипсином in vitro и в плазме крови.

1.2. Цель и задачи исследования Целью работы является разработка метода прямого MALDI-TOF масс-спектрометрического анализа образцов сывороток крови с применением разных концентраций вводимого искусственно трипсина..

Основные задачи исследования.

1. Используя модельную систему в составе пептида амилоида-бета АЬ(1-16) в качестве субстрата и ангиотензинпревращающего фермента, определить сайты гидролиза пептида амилоида-бета АЬ(1-16), определить

каталитически активный домен и влияние природной модификации изомеризации остатка Азр-7 на эффективность гидролиза.

2. Осуществить масс-спектрометрический анализ МА1Л31-ТОР продуктов гидролиза плазмы крови различными концентрациями экзогенного трипсина (титрование трипсином).

3. Исследовать динамику накопления продуктов гидролиза трипсином сыворотки крови путем количественного анализа посредством МА1ЛЭ1-ТОР-масс-спектрометрии и установить условия, необходимые гидролиза высококопийных (мажорных) сывороточных белков.

4. Сравнить профили МАЬ01-ТОР-масс-спектрометр ии плазмы крови при гидролизе экзогенным трипсином в норме и при раке яичника.

1.3. Научная новизна работы

1. В работе впервые показано, что в ^концевой домен АПФ специфично гидролизуетпептид АЬ (1-16) с образованием пептидов АЬ(1-5) и АЬ(6-16), при этом С-домен АПФ не гидролизует пептид АЬ(1-16).

2. Кроме того, методом количественной масс-спектрометрии определено, что изомеризация остатка аспарагиновой кислоты приводит к 4-кратному увеличению скорости гидролиза АЬ(1-16) по сравнению с пептидом с нормальным остатком аспарагиновой кислоты.

3. В работе впервые показано, что при гидролизе сыворотки трипсином состав продуктов гидролиза меняется в зависимости от количества вносимого трипсина. При этом, при введении трипсина в концентрации меньше 2 мг/мл сыворотки, удается регистрировать масс-спектры, свободные от продуктов гидролиза так называемых мажорных белков, целенаправленно удаляемых при проведении прямых масс-спектрометрических исследований.

4. В работе впервые показано, что с использованием методов прямой масс-спектрометрии возможно регистрировать изменения в составе ингибиторов протеаз крови, концентрация которых повышается, в том числе

при развитии онкологических заболеваний. Масс-спектрометрическая регистрация таких изменений проводилась по изменению состава продуктов триптического гидролиза.

5. Впервые методом количественной масс-спектрометрии в условиях прямого масс-спектрометрического исследования была исследована динамика накопления отдельных продуктов гидролиза. Изменения скорости накопления продуктов отражают изменение активности ингибиторов, модифицирующих активность трипсина. Таким образом, используя эти свойства при прямом масс-спектрометрическом исследовании, было определено изменение в концентрации белков содержащихся в крови в концентрации порядка 10~6 М, ранее недоступных для регистрации методом прямого масс-спектрометрического исследования, и таким образом продемонстрирована возможность использования молекулярных зондов при прямом масс-спектрометрическом профилировании (ПМСП).

1.4 Практическая значимость работы

1. Практическая значимость работы заключается в разработке методических подходов к анализу и измерению активности протеаз методом масс-спектрометрии MALDI-TOF с использованием нативных субстратов в сыворотке крови и in vitro. В работе также показана возможность использования функциональных свойств протеолитических ферментов и ингибиторов сыворотки крови для прямого профилирования образцов.

2. Выявленная способность АПФ гидролизовать форму пептида бета-амилоида АЬ(1-16) с изомеризованным остатком аспарагиновой кислоты в четыре раза более эффективно по сравнению с интактной формой может указывать на потенциальную биологическую роль АПФ как фермента, связанного с развитием болезни Альцгеймера. Это находит подтверждение в работах других авторов. Так, выявлены два полиморфных варианта гена АПФ связанных с увеличением накопления АЬ [1][2], со ссылкой на представленную работу. Проводятся исследования влияния

ингибиторов АПФ на развитие БА, также со ссылкой на представленную работу.

3. Использование функциональных свойств протеаз и ингибиторов позволяет по изменениям в их активности при проведении прямого масс-спектрометрического профилирования (ПМСП) оценивать содержание белков, присутствующих в концентрациях порядка 10"6 М, недоступных для непосредственной масс-спектрометрической регистрации.

1.5. Положения, выносимые на защиту

1. №концевой домен ангиотензинпревращающего фермента специфично гидролизует пептид амилоида-бета АЬ(1-16) с образованием двух пептидов АЬ(1-5) и АЬ(6-16), причем изомеризация остатка аспарагиновой кислоты в 7 положении этого пептида приводит к 4-кратному увеличению скорости гидролиза АПФ. С-концевой домен не гидролизует пептид амилоида-бета АЬ(1-16).

2. Состав продуктов гидролиза сыворотки трипсином зависит от количества вводимого фермента. При концентрациях трипсина около 8,5 мМ в спектрах представлены продукты, отличные от пептидов альбумина.

3. Скорость накопления продуктов гидролиза трипсином и минимальное количество трипсина, необходимое для начала гидролиза альбумина для образцов сывороток больных аденокарциномой яичника выше, чем для образцов сыворотки крови здоровых доноров.

4. С использованием гидролиза сывороток концентрациями трипсина около 10 мкМ возможно получение МАЬШ-ТОР-профилей, позволяющих различать образцы сыворотки больных аденокарциномой яичника и здоровых доноров.

1.6. Публикации и апробация работы

По материалам диссертации опубликовано 27 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях, в том числе 10 статей в научных

журналах, рекомендованных ВАК Мннобрнаукн России, и 16 публикации в трудах конференций, один патент. Индекс Хирша автора равен 7.

Результаты работы доложены на 3-м Всемирном Конгрессе НЦРО (Пекин Китай, октябрь 2003), конференции «Фундаментальные науки в медицине», (Москва, июль-август 2006), конференции «Стволовые клетки и перспективы их использования в здравоохранении», (Москва, май 2006), III конференции «Мужское здоровье» (Москва, октябрь 2006), VI Симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, апрель 2007), 3-ей Международной школе семинаре «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии» (Звенигород, апрель 2007), на VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, апрель 2007), 3-ем Международном симпозиуме «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии» (Дубна, январь 2007), 6-ой Парнасовской конференции «Молекулярные механизмы клеточных сигнальных систем» (Краков, Польша, май-июнь 2007), 6-м Всемирном Конгрессе НПРО (Сеул, Корея, октябрь 2007), конференции «Протеолиз, м�