Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза

ВАК РФ 03.02.12, Микология

Автореферат диссертации по теме "Особенности возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза"

На правах рукописи

РАУШ Екатерина Рудольфовна

ОСОБЕННОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ВНУТРИБОЛЬНИЧНОГО ИНВАЗИВНОГО КАНДИДОЗА

Специальность 03.02.12 - микология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

АПР 2015

005566649

Санкт-Петербург 2015

005566649

Работа выполнена в НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Васильева Наталья Всеволодовна - доктор биологических наук, профессор. Официальные оппоненты:

Клясова Галина Александровна - доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение Гематологический научный центр Министерства здравоохранения Российской Федерации, руководитель научно-клинической лаборатории клинической бактериологии, микологии и антибиотической терапии.

Цинзерлинг Всеволод Александрович - доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, руководитель лаборатории патоморфологии.

Ведущая организация: Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Защита состоится «29» апреля 2015г. в Ю00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.086.06. при государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Северо-Западный государственный медицинский университет цм. И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (195067,"г. Санкт-Петербург, пр. Пискаревский, 47).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (195067, г. Санкт-Петербург, пр. Пискаревский, 47, www.szgmu.ru).

Автореферат разослан « »_2015г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук

Шевяков Михаил Александрович

Актуальность темы. Микромицеты рода Candida из состава нормальной микробиоты тела человека могут быть возбудителями внутрибольничного ин-вазивного кандидоза. Ежегодно в мире выявляют до 200000 пациентов с внут-рибольничным инвазивным кандидозом (ИК), из которых 100000 больных умирают (Arendrup MC. et al., 2011). Несмотря на то, что основными возбудителями ИК остаются С. albicans, С. parapsilosis, С. glabrata, С. tropicalis и С. krusei, в последнее десятилетие отмечают нарастание доли С. нв-albicans видов, в том числе редких (Ashton Q., 2013, Tortorano AM. et al., 2006).

Известно, что лишь у 50 - 75% больных ИК выявляют Candida spp. при посевах крови. Даже в случаях, когда удается выделить культуру Candida, большинство используемых в микробиологической лаборатории методов видовой идентификации дрожжей обеспечивают получение результата только через 2 суток и более. Кроме того, особую проблему представляет быстрая и надежная идентификация С. н^-albicans видов (Ashton Q., 2013). В последние годы все чаще сообщают о появлении резистентных штаммов возбудителей ИК (Garo S. et al., 2014). Однако, существует не только проблема устойчивости Candida spp. к противогрибковым препаратам, но и трудности с выбором метода определения чувствительности клинически значимых дрожжей к антимикотикам.

Несмотря на перспективность современных методов молекулярной биологии для точной видовой идентификации и быстрого выявления резистентности грибов к противогрибковым препаратам, использование этих методов в повседневной диагностической практике ограничено.

Таким образом, быстрое установление этиологии ИК и определение чувствительности возбудителей к противогрибковым препаратам современными методами является актуальной проблемой.

Степень разработанности темы. В последние годы, благодаря внедрению современных методов, в том числе ДНК-секвенирования и технологии MALDI-TOF масс-спектрометрии, этиология ИК в ряде зарубежных стран постоянно уточняется (Alam MZ. et al., 2014). В исследовании ИК в отделениях реанимации и интенсивной терапии, проводившемся в России ранее, использовали только морфологические и биохимические методы видовой идентифика-

ции возбудителей (Пестова Л.А., 2004). При этом до 10% штаммов Candida spp. не удавалось определить до вида.

В период с 2003 по 2008 гг. в России в рамках многоцентрового глобального исследования ARTEMIS DISK была определена чувствительность возбудителей ИК к флуконазолу (78%) стандартизованным диско-диффузионным методом CLSI М44-А (Веселов A.B. и др., 2008).

Однако сведения о чувствительности возбудителей ИК в РФ к антимико-тическим препаратам, в том числе сравнительно нового поколения (ворикона-золу, каспофунгину и позаконазолу), полученные референтными методами немногочисленны. Введение новых критериев интерпретации результатов определения чувствительности для основных возбудителей ИК, предложенных Европейским комитетом по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам (EUCAST, 2012 г.) и Институтом по клиническим и лабораторным стандартам (CLSI, США, 2012 г.) обусловило необходимость проведения оценки различных методов определения чувствительности Candida spp. к противогрибковым препаратам (Orasch С. et al., 2014).

Цель исследования - изучить особенности возбудителей внутри-больничного инвазивного кандидоза для оптимизации лабораторной диагностики.

Задачи исследования:

1. Определить видовой спектр возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза в стационарах РФ с помощью современных методов идентификации.

2. Сравнить методы видовой идентификации Candida spp. и выявить наиболее эффективные для применения в рутинной практике.

3. Определить чувствительность возбудителей инвазивного кандидоза к современным антимикотикам с помощью стандартизованных методов (CLSI М27-АЗ, CLSI М44-А) и микробиологического анализатора (VITEK 2 Compact).

4. Сравнить методы определения чувствительности Candida spp. к современным антимикотикам и выявить наиболее эффективный для применения в рутинной практике.

5. Разработать алгоритм лабораторной диагностики внутрибольничного инвазивного кандидоза.

Научная новизна исследования

Впервые:

1. Установлена этиология внутрибольничного инвазивного кандидоза в РФ современными молекулярно-биологическими методами. Соотношение С. albicans и С. нв-albicans видов составляет 1:1,3. Выявлены географические особенности этиологии инвазивного кандидоза в различных регионах РФ.

2. Определены профили чувствительности возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза в РФ референтным методом CLSI М27-АЗ к противогрибковым препаратам: флуконазолу, вориконазолу, каспофунгину, позакона-золу.

3. Установлены диапазоны МПК, МПК50, МПК90 флуконазола, вориконазола, каспофунгина, позаконазола для возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза в России.

4. Определены масс-спектропрофили возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза, в том числе редких видов Candida; внутри вида С. parapsi-losis выявлено 5 субкластеров.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты диссертационного исследования вносят вклад в изучение глобальных тенденций в этиологии внутрибольничного инвазивного кандидоза и определение чувствительности возбудителей ИК к антимикотическим препаратам; они также важны для быстрой и точной идентификации патогенов - возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза. Собранная в результате исследования коллекция чувствительных и резистентных к противогрибковым препаратам изолятов Candida spp. от пациентов с внутрибольничным инвазив-ным кандидозом депонирована в Российскую коллекцию патогенных грибов и служит основой для изучения молекулярных механизмов резистентности к азо-ловым препаратам. Разработан алгоритм лабораторной диагностики возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза с помощью современных методов.

Методология и методы исследования. Данная диссертационная работа -многоцентровое исследование. Объекты исследования — культуры Candida spp., выделенные от пациентов с внутрибольничным инвазивным кандидозом. Для

выполнения работы использовали микробиологические, физико-химические, молекулярно-генетические и статистические методы. Положения, выносимые на защиту:

1. Возбудители внутрибольничного инвазивного кандидоза в России представлены основными видами Candida spp. (96%): С. albicans, С. para-psilosis, С. glabrata, С. tropicalis, С. krusei, С. guilliermondii и редкими (4%): С. lusiíaniae, С. dubliniensis, С. pararugosa, С. bracarensis, С. kefyr, С. lipoly-tica, С. utilis, С. inconspicua.

2. Распространенность С. albicans как основного возбудителя инвазивного кандидоза в РФ снизилась с 54% в 2012 г. до 32,8% в 2014 г. (р=0,015), С. parapsilosis - возросла с 9,8% (2012 г.) до 27,8% (2014 г.), р=0,01, тогда как уровень С. glabrata, С. tropicalis и С. krusei остается неизменным.

3. Чувствительность изолятов С. не-albicans видов к флуконазолу in vitro составила 58%, к вориконазолу - 95,7%. К каспофунгину все штаммы возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза были чувствительны.

Степень достоверности и апробация результатов диссертационного исследования. Степень достоверности результатов, полученных при проведении исследования, подтверждается достаточным и репрезентативным объёмом выборки выполненных исследований, подтверждена адекватными методами статистической обработки данных. Методы математической обработки полученных результатов соответствуют поставленным задачам.

Материалы диссертационного исследования представлены на конференциях и конгрессах:

международных - 12-я конференция Американского общества микробиологов «Candida и кандидоз», США, 2014 г., 23-й Европейский конгресс по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям, Германия, 2013г.; 6-й конгресс «Тенденции в медицинской микологии», Дания, 2013 г.; 24-й Европейский конгресс по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям, Испания, 2014 г.,

российских: Всероссийская научно-практическая конференция по медицинской микробиологии и клинической микологии «Кашкинские чтения» (Санкт-Петербург, 2013 г., 2014 г.); отчетные сессии научных подразделений СЗГМУ

им. И.И.Мечникова (Санкт-Петербург, 2013 г., 2014 г.). По теме диссертации опубликовано 22 научные работы, в т. ч. 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК.

Личный вклад диссертанта. Автор лично выполнил основные микробиологические исследования по теме диссертации, анализ полученных данных, статистическую обработку, обобщение и оформление результатов.

Структура и объем диссертации Диссертационная работа изложена на 146 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания методов и материалов исследования, результатов работы, заключения, выводов, практических рекомендаций. Диссертация содержит 25 таблиц и 42 рисунка. В работе использованы 30 отечественных и 154 иностранных источников литературы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы. Изучены 322 изолята грибов рода Candida, выделенных от 284 пациентов с внутрибольничным ИК (в 37 стационарах, преимущественно - в отделениях реанимации и интенсивной терапии 12 городов России) в течение 2011-2014 гг. Большая часть культур Candida spp. была получена в результате многоцентрового исследования внутрибольничного инвазивного кандидоза (ВБИК) и доставлена для исследования в НИИ медицинской микологии им. П.Н.Кашкина.

Исследуемые изоляты Candida spp. были выделены из биосубстратов: периферическая кровь (268), перитонеальная жидкость (24), плевральная жидкость (6), содержимое абсцессов внутренних тканей (8), цереброспинальная жидкость - ЦСЖ (6), биоптаты - мочеточник, кишечник, легкие, тромб сердца при аутопсии (5), желчь (4), пунктат суставной жидкости (1) при посеве на питательные среды. Для выделения культур Candida spp. полученные образцы крови засевали на жидкие питательные среды (бульон Сабуро) и во флаконы для посева крови (Signal, Oxoid и BactAlert, BioMerieux), инкубировали при 35 -37°С до 10 суток. При выявлении признаков роста (при их отсутствии - через 10 суток) пересевали на агар Сабуро в чашках Петри. Другие биосубстраты засевали непосредственно на агар Сабуро и в среду обогащения (бульон Сабуро).

Параллельно с посевом биосубстраты микроскопировали, отмечали наличие дрожжевых клеток и псевдомицелия.

Возбудители ВБИК были идентифицированы до вида с помощью ДНК-секвенирования, MALDI-TOF масс-спектрометрии (Bruker, Германия) и тест-системы AUXACOLOR 2 (BioRad, США).

Для выделения ДНК использовали двухсуточные культуры Candida spp. Выделение ДНК производили по модифицированому методу Doyle и Doyle (Doyle J.J., Doyle J.L., 1987). Молекулярно-генетическую идентификацию проводили с помощью секвенирования ДНК согласно рекомендациям CLSI ММ 18-А (2008 г.). Секвенирование ДНК выполняли по методу Сэнджера на генетическом анализаторе ABI Prizm 3500 в лаборатории молекулярно-генетической микробиологии (зав. лаб. - к.м.н Тараскина А.Е.).

MALDI-TOF масс-спектрометрию проводили на приборе «Autoflex speed» TOF/TOF (Bruker, Германия) с получением масс-спектропрофиля и сравнивали его с базой данных для видовой идентификации (программный пакет MALDI Biotyper 3.1). При исследовании клинических изолятов грибов рода Candida использовали протокол полной экстракции белка с помощью этанола и муравьиной кислоты. Результат учитывали, используя следующие критерии оценки результата MALDI-TOF масс-спектрометрии: коэффициент >2 - вид и род определены с точностью 100%; 1,8-1,99- 100% определение рода, неуверенное определение вида; <1,79 - сомнительное определение рода (MALDI Biotyper 3.1. User manual Bruker Daltonics, 2012). Определение внутривидового сходства исследуемых изолятов С. parapsilosis проводили с помощью анализа главных компонент - Principal Component Analysis (РСА) путем построения дендрограм-мы, которая представляла собой графическое изображение близкородственных индивидуальных спектров по отнощению к другим.

Видовую идентификацию изучаемых изолятов Candida spp. с помощью AUXACOLOR 2 проводили в соответствии в прилагаемым к тесту руководством.

Макроморфологические особенности культур Candida spp. изучали на «гигантских» колониях с помощью стереоскопического люминесцентного микроскопа SteREO Lumar.V12 (Carl Zeiss, Германия), микроморфологические - с

помощью флуоресцентного микроскопа AxioImager.Z 1 (Carl Zeiss, Германия), используя оптику Номарского.

Чувствительность Candida spp. к противогрибковым препаратам in vitro была определена по протоколам CLSI (М27-АЗ, М44-А) и на микробиологическом анализаторе Vitek 2 Compact (BioMerieux).

Выполнение микроразведений в жидких питательных средах (CLSI М27-АЗ) проводили в стерильных одноразовых 96-луночных планшетах с U - образными лунками. Планшеты инкубировали в термостате при температуре 35°С в течение 24 часов. Учет результатов производили визуально и сравнивали с критериями интерпретации МПК флуконазола, вориконазола и каспофунгина для основных 6 видов Candida - CLSI M27-S4 (декабрь 2012 г.), для остальных видов - CLSI M27-S3 (2008 г.)

Для определения чувствительности микромицетов к противогрибковым препаратам в соответствии с протоколом CLSI М44-А использовали бумажные диски (Oxoid, Великобритания), пропитанные противогрибковыми препаратами (диски с вориконазолом содержали 1 мкг препарата, диски с флуконазолом - 25 мкг препарата), и плотную питательную среду Мюллер-Хинтона, содержащую 2% глюкозы и 0,5 мкг/мл красителя метиленового синего. Инкубировали при температуре 35°С 18-24 часа. Учет результатов проводили автоматически с помощью микробиологического анализатора BIOMIC Vision (Giles Scientific, США) по диаметру зоны задержки роста (НИЛ микологического мониторинга и биологии грибов, зав. лаб. Богомолова Т.С., исполнитель - н.с. Выборнова И.В.).

Для определения чувствительности на микробиологическом анализаторе Vitek 2 Compact (BioMerieux) использовали карты AST-YS01 (BioMerieux), содержащие серийные разведения противогрибковых препаратов (флуконазол, вориконазол, амфотерицин В, 5-флуцитозин). Время определения чувствительности дрожжей к противогрибковым препаратам составляло 18-35 часов. Учёт результатов проводили в соответствии с критериями интерпретации CLSI М27-S4 (2012 г.) и CLSI M27-S3 (2008 г.).

Статистическая обработка результатов. Результаты исследования обрабатывали с помощью программы STATISTICA for Windows версия 6.0. Использовали непараметрические и параметрические методы. Критерием статистической

достоверности получаемых данных считали общепринятую в медицине величину р < 0,05.

Результаты исследования. Среди исследованных 322 изолятов Candida spp. 83,2% возбудителей ИК были выделены из крови.

По результатам исследования 97 штаммов Candida spp. референтным методом ДНК-секвенирования (протокол CLSI ММ 18-А) и MALDI-TOF масс-спектрометрии были определены 9 видов Candida, среди которых С. albicans составили 50,5%, другие виды Candida - 49,5% (С. parapsilosis - 14,3%, С. tropicalis - 12,5%, С. glabrata— 11,4%, С. krusei— 7,2%, С. lipolytica, С. lusitaniae, С. bracarensis, С. kefyr - по 1,0%). Совпадение результатов было обнаружено в 100% случаев (рисунок 1).

12,514,

□ С. albicans

И С. krusei

□ С. lusitaniae

Рисунок 1 - Спектр грибов рода Candida, идентифицированных методами ДНК-секвенирования и MALDI-TOF масс-спектрометрии (п=97).

Так как ДНК-секвенирование является дорогостоящим, трудоемким, продолжительным по времени и рассчитанным на специально обученный персонал методом, учитывая сопоставимость результатов масс-спектрометрии и ДНК-секвенирования, в качестве основного мы применили метод быстрой и точной идентификации - MALDI-TOF масс-спектрометрию.

По результатам видовой идентификации методом MALDI-TOF масс-спектрометрии (п=322) выявлено, что исследуемые штаммы принадлежали к 14 видам грибов рода Candida-. С. albicans - 139 (43,2%), С. parapsilosis - 65

10

50,5

■ С. parapsilosis □ С. tropicalis ЕВ С. bracarensis ■ С. lipolytica □ С. kefyr

(20,2%), С. glabrata - 37 (11,5%), С. tropicalis - 31 (9,6%), С. krusei - 20 (6,2%), С. guilliermondii - 17 (5,3%), С. lusitaniae - 4 (1,3%), С. pararugosa - 2 (0,6%), С dubliniensis - 2 (0,6%), С. inconspicua - 1 (0,3%), С. bracarensis - 1 (0,3%), С. и/z-/« - 1 (0,3%), С. kefyr- 1 (0,3%), С. lipolytica - 1 (0,3%). Таким образом, методом MALDI-TOF масс-спектрометрии определено, что 43,2% клинических изо-лятов принадлежат к С. albicans и 56,8% являются представителями С. не-albicans видов. Кроме часто встречающихся штаммов С. ae-albicans видов, выявлены также редкие виды — С. utilis, С. pararugosa и С. inconspicua (рисунок 2).

И С. krusei Е С. guilliermondii И С. lusitaniae Н С. pararugosa

□ С. dubliniensis 0 С. inconspicua ■ С.bracarensis □ С. utilis И С. tefyr □ С. lipolytica

Рисунок 2 - Видовой спектр Candida spp., определенный методом MALD1-TOF масс-спектрометрии (п=322).

С помощью тест-системы AUXACOLOR 2 среди 322 исследуемых штаммов - возбудителей ИК идентифицировали 11 видов грибов рода Candida: С. albicans - 134 (41,6%), С. parapsilosis - 65 (20,2%), С. glabrata - 35 (10,9%), С. tropicalis - 29 (9,0%), С. krusei - 20 (6,2%), С. guilliermondii - 16 (5,0%), С. с/кй-liniensis - 13 штаммов (4,0%), С. lusitaniae - 3 штамма (0,9%), С. rugosa - 2 (0,6%), С. kefyr - 1 (0,3%), С. lipolytica - 1 (0,3%). Для двух (0,6%) штаммов Candida spp. видовая принадлежность не определена (Таблица 1).

Таблица 1 — Сравнение результатов идентификации возбудителей ИК тест-системой АиХАСОЬОЯ 2.

MALDI-TOF MC AUXACOLOR 2

Верная ИД Неверная ИД

С. albicans (139) 128 11

С. parapsilosis (65) 64 1

С. glabrata (37) 35 2

С. tropicalis (31) 29 2

С. krusei (21) 20 1

С. guilliermondii (17) 16 1

С. lusitaniae (4) 3 1

С. pararugosa (2) 0 2

С. bracarensis (1) 0 1

С. dubliniensis (2) 2 0

С. lipolytica (1) 1 0

С. kefyr (1) 1 0

С. inconspicua (1) 0 1

С. utilis (1) 0 1

Всего (322) (%) 300 (93,2%) 22 (6,8%)

При сравнении полученных результатов видовой идентификации 322 штаммов совпадение составило 93,2%, достоверных различий между ними выявлено не было (р > 0,05). Однако, учитывая, что наибольший процент ошибок идентификации отмечен среди С. не-аШсапя видов, отличающихся сниженной чувствительностью к противогрибковым препаратам, предпочтительно использовать метод МЛЬО!-ТОР масс-спектрометрии (рисунок 3).

20,2

Ш С. inconspicua

Q С. albicans □ С. tropicalis

С. lusitaniae

□ С. parapsilosis Ш С. krusei

□ С. pararugosa ■ С. bracarensis

□ С. lipolytica

И С. glabrata S С. guilliermondii

□ С. dubliniensis

□ С. ui/7/s

0 С. /се/уг

Рисунок 3 — Спектр возбудителей внутрибольничного ИК в РФ (п=322).

Следует отметить, что в крови в качестве возбудителя ИК преимущественно изолировали С. нв-albicans виды - 61,2%, в том числе С. krusei (природно устойчивый к флуконазолу вид) - 6%, а также редкие виды (4,9%). В других биосубстратах (перитонеальная и плевральная жидкости, желчь, ЦСЖ) доминировали С. albicans, из биоптатов с одинаковой частотой выделяли С. albicans и С. glabrata.

При анализе данных видового спектра Candida spp. было обнаружено, что среди 268 штаммов, выделенных из крови, преобладали С. нв-albicans виды (р=0,008), а среди 54 штаммов, выделенных из других биосубстратов - С. albicans (р=0,013).

Мы проанализировали видовой спектр возбудителей ВБИК, выделенных нами в отдельные годы периода исследования (2012, 2013 и 2014 гг.). В 2012 году при изучении 61 изолята Candida spp. было отмечено, что преобладали С. albicans (54%), а С. нв-albicans составили 46%. Среди изученных в 2013 году 198 штаммов Candida spp. доля С. albicans составила уже 43,4%, С. не-albicans виды - 56,6%. В 2014 году среди возбудителей ВБИК (61 штамм), мы обнаружили, что доля штаммов С. albicans составила 32,8%, а С. нв-albicans — 67,2%.

Таким образом, видовой спектр возбудителей внутрибольничного ИК в течение 2012, 2013, 2014 гг. изменился: во-первых, уровень С. albicans снизился

с 54% (2012 г.) до 32,8% (2014 г.), р=0,01; во-вторых, заметно возрос уровень С. нe-albicans видов с 46% (2012 г.) до 67,2% (2014 г.), р=0,001. При этом вырос также уровень С. parapsilosis: с 9,8% (2012 г.) до 27,8% (2014 г.), р=0,01. Доли часто встречающихся видов С. glabrata (16,4% и 13,2%), С. tropicalis (10,6% и 8,2%) и С. krusei (8,2% и 6,1%) существенно не изменились. Также были выявлены редкие виды возбудителей ВБИК.

Исследуемые штаммы грибов рода Candida были выделены от пациентов в стационарах 12 городов 6 федеральных округов (ФО) РФ: Южного (Ростов-на-Дону, Краснодар), Центрального (Москва), Северо-Западного (Санкт-Петербург, Петрозаводск), Приволжского (Пермь, Нижний Новгород, Казань), Уральского (Тюмень, Сургут), Сибирского (Иркутск, Омск).

При изучении видового спектра возбудителей ИК в федеральных округах установлены географические особенности. Так, в Сибирском и Уральском федеральных округах доля С. albicans в структуре возбудителей ИК была достоверно выше, чем в Северо-Западном и Южном федеральных округах, р < 0,05.

При анализе видового распределения штаммов в различных городах РФ было выявлено, что между крупными городами (Санкт-Петербург и Москва) достоверных различий в видовом спектре нет (р=0,2), тогда как существуют видовые различия между долями С. albicans в структуре возбудителей ИК в Иркутске и Ростове-на-Дону, достоверно (р=0,0009) выявлено преобладание С. albicans в Иркутске. Также были выделены единичные штаммы из следующих городов: Омск - С. tropicalis (1), Петрозаводск - С. guilliermondii (1), Нижний Новгород — С. parapsilosis (1), Казань - 3 штамма: С. tropicalis, С. parapsilosis, С. lusitaniae, Сургут — 4 штамма: С. albicans (2), С. krusei (1), С. inconspicua (1).

После установления видовой принадлежности каждого штамма Candida spp. было проведено макро- и микроморфологическое описание обнаруженных видов, включая редкие. Было выявлено, что у некоторых видов Candida существует сходство между собой как по внешнему виду колоний, так и морфологии дрожжевых клеток, что затрудняет их дифференциацию. Особенно важно, что подобные совпадения обнаружены между часто встречающимися и редкими видами (С. krusei и С. inconspicua, С. glabrata и С. bracarensis).

Использование технологии МАЬБ1-ТОР масс-спектрометрии позволило обнаружить внутривидовое сходство среди исследуемых изолятов по композиции рибосомального протеома. Для изучения внутривидового сходства было отобрано 65 штаммов С. рагар$Пси1$ — представителей комплекса С. рага/ш7<и/5 (рисунок 4).

Штаммы С. рагарзИси!.^

и о С

293031м;м!3ги;ог;!1м1ш434:5 244241 *51»40Мг7 444»»« 33 ШЗПКЗЗ »3 347 3« 37 1145 Номера изолятов

Рисунок 4 - Дендрограмма белковых масс-спектров штаммов С. рагаръ'йоъЬ (п=65). №№ 1-5 - номера субкластеров.

Проведенный иерархический кластерный анализ основных масс-спектро профилей комплекса С. /?ага/ш7о«5 выявил, что все исследуемые штаммы комплекса принадлежали только к виду С. рагархИоя1.ч. Все полученные масс-спектры распределились на 5 субкластеров. Дальнейшее, более дробное, деление масс-спектров на группы также проводили по принципу родства. Были обнаружены близкородственные масс-спектры у некоторых изолятов, которые были выделены в одних и тех же городах, в одних и тех же стационарах, примерно в одно и тоже время, но от разных пациентов (изоляты М» 29, 30, 31 - г.

Москва, №№ 14, 15 - г. Тюмень, №№ 24, 42 - г. Санкт-Петербург). Также выявлено, что изоляты №№ 21 и 39, устойчивые к флуконазолу, располагались в одном субкластере № 2, а изоляты №№ 24 и 41 устойчивые к вориконазолу - в субкластере №3.

В ходе исследования 322 изолятов Candida spp. к флуконазолу были чувствительны 75%, умеренно-чувствительными были 13% штаммов, устойчивыми - 12%. С. albicans были чувствительны в 97% случаев, умеренно-чувствительными - 0,7% и устойчивыми 2,3%. Среди С. не-albicans 58% были чувствительными, умеренно-чувствительными - 23%, устойчивыми — 19% (рисунок 5а). Таким образом, наибольший процент штаммов со сниженной чувствительностью к флуконазолу наблюдали среди видов С. не-albicans'. С. glabrata (37), С. krusei (21), С. parapsilosis (8), С. tropicalis (2).

Candida С. С. не- Candida spp. С. albicans С. не-

spp. albicans albicans albicans

а б

Рисунок 5 - Чувствительность возбудителей инвазивного кандидоза к флуконазолу (а) и вориконазолу (б) (метод CLSI М27-АЗ, п=322); У - устойчивый, УЧ -умеренно-чувствительный, Ч- чувствительный.

Среди Candida spp. чувствительными к вориконазолу (рисунок 56) были 97,5%, умеренно-чувствительными — 0,9% штаммов, устойчивыми — 1,6%. С. albicans были чувствительны в 99,7% случаев, устойчивыми - 0,3%. Среди С. не-albicans 95,7% были чувствительными, умеренно-чувствительными - 1,6% и устойчивыми 2,7%. Штаммами С. не-albicans, обладающими сниженной чувствительностью к вориконазолу, были С. parapsilosis (2), С. tropicalis (2), С. krusei

Обнаружено 6 штаммов, устойчивых и к флуконазолу, и к вориконазолу, среди С. guilliermondii (2), С. parapsilosis (2), С. tropicalis (1), С. albicans (1). Таким образом, полирезистентных к азолам штаммов среди Candida spp. было 1,8% (С. albicans - 0,3%, С. нe-albicans - 1,5%). К каспофунгину все штаммы были чувствительны.

В нашем исследовании достоверных различий в распределениях возбудителей ИК по категориям чувствительности к противогрибковым препаратам по регионам и периодам наблюдения не обнаружено. Также в период проведения исследования (2011 - 2014 гг.) не было выявлено (р=0,6) достоверного возрастания числа штаммов со сниженной чувствительностью.

Для 6 часто встречающихся видов (С. albicans, С. parapsilosis, С. tropicalis, С. guilliermondii, С. glabrata, С. krusei) были определены: диапазон МПК, МПК50, МПК90 флуконазола, вориконазола, каспофунгина, позаконазола.

Для оценки устойчивости вида к антимикотикам использовали значения МПК50 и МПК90.. Для С. tropicalis, С. albicans эти значения находились в пределах чувствительной категории. Однако, у С. parapsilosis и С. guilliermondii значения МПК90 выходят за пределы категории чувствительности, что указывает на формирование устойчивости к флуконазолу у этих видов Candida.

Поскольку для позаконазола критерии интепретации чувствительности к противогрибковым препаратам не установлены, а по литературным данным известно, что МПК для чувствительных штаммов не превышает 1мкг/мл, то на основании полученных нами значений МПК для Candida spp. относительно позаконазола (0,008 - 0,25 мкг/мл) можно заключить, что все исследуемые штаммы Candida spp. были чувствительны к этому антимикотику.

У 15 пациентов биосубстраты для культурального исследования были взяты повторно, при этом вид возбудителя не изменился; у одного из них выявили устойчивый к флуконазолу штамм С. parapsilosis при повторном заборе, тогда как штамм С. parapsilosis, выделенный первоначально, был чувствительным к этому препарату.

При сравнении результатов определения чувствительности к противогрибковым препаратам изолятов Candida spp. (п=141), полученных двумя методами - CLSI М27-АЗ и CLSI М44-А, достоверных различий в распределении

17

штаммов по категориям чувствительности не выявлено (р > 0,05). Среди изоля-тов С. не-albicans к флуконазолу были чувствительны 48,8% (CLSI М27-АЗ) и 46,6% (CLSI М44-А), устойчивыми были 29,5% (CLSI М27-АЗ) и 27,3% (CLSI М44-А). В отношении вориконазола процент чувствительных штаммов среди изолятов С. нe-albicans: 92% (CLSI М27-АЗ) и 83% (CLSI М44-А), умеренно-чувствительными были 2,3% (CLSI М27-АЗ) и 9% (CLSI М44-А) и устойчивыми - 5,7% (CLSI М27-АЗ) и 7,9% (CLSI М44-А).

При сравнении данных МПК (82 штамма Candida spp.), полученных методом CLSI М27-АЗ и с помощью анализатора Vitek 2 Compact в соответствии с критериями интерпретации чувствительности микромицетов к антимикотикам референтного протокола CLSI M27-S4 (2012 г.), статистически значимых различий не обнаружили; р > 0,05 (Таблица 2). В случае оценки чувствительности по критериям интепретации протокола CLSI M27-S3 (2008 г.) к флуконазолу 82 штаммов Candida spp. установлено, что процент несовпадений с критериями 2012 г. составил 16%, к вориконазолу - 6,6%; р < 0,05.

Таблица 2 — Результаты определения значений МПК азоловых антимикоти-

ков (CLSI М27-АЗ и Vitek 2 Compact)

Изоляты Противогрибковые препараты Метод МПК (мкг/мл) Среднее геометрическое % согласия

Диапазон МПК50 МПК90

Candida spp. (n=82) Флуконазол CLSI М27-АЗ 0,25-128 1 64 2,8 90,3

Vitek 2 1-64 1 32 2,3

Вориконазол CLSI М27-АЗ 0,015-8 0,06 0,5 0,07 94

Vitek 2 0,125-8 0,125 0,25 0,14

Заключение

Таким образом, можно констатировать, что использование современных методов видовой идентификации (ДНК-секвенирование и MALDI-TOF масс-спектрометрия) способствует уточнению этиологии внутрибольничного ин-вазивного кандидоза. На основании проведенного исследования можно заключить, что для рутинного использования в практической деятельности лабораторий целесообразно применять диско-диффузионный метод (СЕ81 М44-А) как наиболее простой и экономичный, а в качестве альтернативного — ис-

18

пользовать микробиологический анализатор Vitek 2 Compact (критерии CLSI M27-S4 2012 г.).

Алгоритм диагностики возбудителей инвазивного кандидоза

Выводы

1. Этиология внутрибольничного инвазивного кандидоза в РФ (2011-2014 гг.) представлена следующими основными видами Candida (С. albicans — 43,2%, С. parapsilosis - 20,2%, С. glabrata - 11,5%, С. tropicalis - 9,6%, С. krusei - 6,2%, С. guilliermondii - 5,3%) и редкими (С. lusitaniae - 1,3%, С. dubliniensis - 0,6%, С. pararugosa - 0,6%, С. bracarensis - 0,3%, С. kefyr -0,3%, С. lipolytica - 0,3%, С. utilis - 0,3%, С. inconspicua - 0,3%).

2. Установлено, что в этиологической структуре основных возбудителей инвазивного кандидоза возросла доля С. нc-albicans (с 46% в 2012 г. до 67,2% в 2014 г.), при этом увеличилась доля С. parapsilosis (9,8% в 2012 г. против 27,8% в 2014 г., р < 0,05). Уровень С. albicans достоверно выше в Сибирском (75%) и Уральском (57,8%) федеральных округах, р < 0,05, по сравнению с другими федеральными округами (Северо-Западный - 37%, Южный - 35%).

3. MALDI-TOF масс-спектрометрия является методом выбора для определения вида возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза.

4. Чувствительными к флуконазолу были 97% штаммов С. albicans, к вори-коназолу — 99,7%. Среди штаммов С. не-albicans видов чувствительными к флуконазолу были 58%, к вориконазолу - 95,7%. К каспофунгину устойчивых штаммов не обнаружено (CLSI М27-АЗ).

5. Диско-диффузионный метод CLSI М44-А является методом выбора для определения чувствительности возбудителей инвазивного кандидоза к противогрибковым препаратам в практике микробиологических лабораторий.

Практические рекомендации

1 У пациентов с признаками инвазивного кандидоза необходимо проводить исследование всех стерильных в норме биосубстратов (кровь, ЦСЖ, пери-тонеальная жидкость) на наличие грибов рода Candida.

2 Обязательно определять до вида все культуры Candida spp., выделенные из различных локализаций от пациентов с инвазивным кандидозом современными методами. Для точной идентификации С. не-albicans видов рекомендуется использовать метод MALDI-TOF масс-спектрометрии.

3 Обязательно определять чувствительность всех культур Candida spp., выделенных из стерильных в норме биосубстратов к противогрибковым препаратам стандартизованными методами.

Перспективы разработки темы 1 Анализ главных компонент белков масс-спектра (РСА-анализ) с построением РСА-дендрограмм является перспективным для внутривидового ти-пирования штаммов Candida spp. и анализа эпидемиологического процесса в отделениях реанимации и интенсивной терапии.

2 Разработка быстрых некультуральных методов обнаружения Candida spp. в крови и определения их чувствительности на основе достижений гено-мики и протеомики.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Видовая идентификация возбудителей инвазивного кандидоза методом MALDI-TOF масс-спектрометрии / Е.Р. Рауш, Ю.В. Михайлова, Н.В. Васильева и др. // Сборник материалов 1-ой отчетной сессии научных подраз-

делений СЗГМУ им. И.И.Мечникова. «Фундаментальные исследования в современной медицине: достижения и перспективы». — 2013. — С.25-26.

2. Идентификация Candida spp. с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии / Е.Р. Рауш, И.В. Васильева, Е.В. Шагдилеева и др. // Проблемы медицинской микологии. - 2013. - Т. 15.-№2,- С. 115-116.

3. Инвазивный кандидоз на отделениях реанимации и интенсивной терапии Ленинградской областной клинической больницы / Е.В. Шагдилеева, Е.Р. Рауш, Н.В. Васильева и др. // Проблемы медицинской микологии. — 2014. -Т. 16,- №2. -С. 147.

4. Определение видов возбудителей инвазивного кандидоза: в поиске быстрых решений / Е.Р. Рауш, Н.В. Васильева, H.H. Климко и др. // Проблемы медицинской микологии. -2013.-Т. 15.- №4. - С. 87-91.

5. Случай успешного лечения микст-микоза — инвазивного кандидоза (канди-демии) и инвазивного аспергиллеза (легких, придаточных пазух и мягких тканей носа) у пациента с неходжкинской лимфомой / Е.В. Шагдилеева, Е.Р. Рауш, С.Н. Хостелиди и др. // Проблемы медицинской микологии. -2013.-Т. 15. - №1. - С. 22-28.

6. Определение чувствительности возбудителей инвазивного кандидоза к противогрибковым препаратам методами CLSI М27-АЗ и CLSI М44-А / Е.Р. Рауш, Т.С. Богомолова, Н.В. Васильева и др. // Сборник материалов 1-ой отчетной сессии научных подразделений СЗГМУ им. И.И.Мечникова. «Фундаментальные исследования в современной медицине: достижения и перспективы». - 2013. - С.24-25.

7. Определение чувствительности возбудителей инвазивного кандидоза к флуконазолу и вориконазолу по международным стандартам / Е.Р. Рауш, Н.В. Васильева, Т.С. Богомолова и др. // Проблемы медицинской микологии. - 2013. - Т. 15. - №1. - С. 60-63.

8. Первое описание случая успешного лечения микотического менингита, обусловленного Candida albicans и Trichosporon asahii / Е.В. Шагдилеева, Е.Р. Рауш, Н.В. Васильева и др. // Проблемы медицинской микологии. -2013.-Т. 15,-№2.-С. 138-139.

9. Случай успешного лечения микст-микоза, обусловленного Candida krusei и Aspergillus flavus / Е.В. Шагдилеева, Е.Р. Рауш, С.Н. Хостелиди и др. // Сборник научных трудов Всероссийской конференции с международным участием Пятые научные чтения, посвященные памяти член-корр. РАМН, з.д.н. РФ, профессора O.K. Хмельницкого "Современные подходы в клини-ко-морфологической диагностике и лечении заболеваний человека". — 2013.

- С. 374-375.

10. Случай успешного лечения рецидивирующего диссеминированного канди-доза с поражением ободочной кишки и легких у пациентки, получающей хронический гемодиализ / Е.В. Шагдилеева, Е.Р. Рауш, Т.С. Богомолова и др. // Научное издание «Успехи медицинской микологии». — 2014. — Т. XIII. -Гл. 11.-С. 280-281.

11. Случаи микст-микозов (инвазивных кандидоза и аспергиллеза) у гематологических больных / Е.В. Шагдилеева, Е.Р. Рауш, Т.С. Богомолова и др. // Проблемы медицинской микологии.-2014. - Т. 16.-№2.-С. 147-148.

12. Случай успешного лечения микотического перитонита (возбудитель — Candida albicans) у пациентки с острым панкреонекрозом / Е.В. Шагдилеева, Е.Р. Рауш, Т.С. Богомолова и др. // Проблемы медицинской микологии. -2014.-Т. 16,-№2.-С. 131-132.

13. Случай успешного лечения кандидозного перитонита (возбудитель-Candida albicans) у пациентки с острым панкреонекрозом / С.Н. Хостелиди, Е.Р. Рауш, Е.В. Шагдилеева и др. // Проблемы медицинской микологии.

- 2014. - Т. 16. - №3. - С. 26-31.

14. Успешное лечение сочетанного микоза - инвазивного кандидоза и инвазив-ного аспергиллеза у пациента с неходжкинской лимфомой / Е.В. Шагдилеева, Е.Р. Рауш, С.Н. Хостелиди и др. // Сборник материалов 86-ой конференции «Мечниковские чтения-2013». - 2013. - С.94-95.

15. Antifungal susceptibility profiles of pathogens of invasive candidiasis in Russia / E. Raush, N. Vasilyeva, E. Shagdileeva et al. // Final Program European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (Barcelona, Spain, 10-13 May 2014)-P.103.

16. Combination of invasive candidiasis and invasive aspergillosis in hematological patients / S. N. Khostelidi, E. R. Raush, T. S. Bogomolova et al. // Final Programm and Abstracts 12th ASM Conference on Candida and Candidiasis (New Orleans, Louisiana, USA, 26-30 March 2014) - P.107.

17. Combination of invasive aspergollosis and invasive candidiasis in hematological patients / S. Khostelidi, E. Raush, T. Bogomolova et al. // 6th advances against aspergillosis. - 2014.-P. 164.

18. Identification of the etiologic agents of invasive candidosis by matrix-assisted laser desorption/ionisationtime of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) / N.V. Vasilyeva, E.R. Raush, S.V. Sidorenko et al. // Final Programm European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (Berlin, Germany, 29 April 2013)-P. 148.

19. Invasive candidiasis in intensive care units of the tertiary hospital in St. Petersburg, Russia / E. V. Shagdileeva, E. R. Raush, N.V. Vasilyeva et al. // Final Programm and Abstracts 12th ASM Conference on Candida and Candidiasis (New Orleans, Louisiana, USA, 26-30 March 2014) - P. 106-107.

20. Species distribution and antifungal susceptibility profiles among Candida spp. in Russia / E. Raush, N. Vasilyeva, E.Shagdileeva et al. // Final Programm and Abstracts 12th ASM Conference on Candida and Candidiasis (New Orleans, Louisiana, USA, 26-30 March 2014) - P. 87.

21. Susceptibility testing of invasive candidosis pathogens to fluconazole by CLSI M27-A3 method / E. Raush, N.V. Vasilyeva, E. Shagdileeva et al. // Mycoses. -2013.-Vol. 56.-P.109.

22. Successful treatment of combination of invasive candidiasis (C. krusei) and aspergillosis (A. flavus) in haematological patient / E. Shagdileeva, E.R. Raush, T.S. Bogomolova et al. // Mycoses. - 2013. - Vol. 56. - P.l 16.

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) - Институт клинических и лабораторных стандартов

MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization - Time-of-Flight

mass-spectrometry) - MALDI-TOF масс-спектрометрия (Матрично-ассоцииро-

ванная лазерная десорбция/ионизация - время-пролетная масс-спектрометрия)

23

PCA (Principal Component Analysis) - анализ главных компонент spp. - виды (микромицетов)

ВБИК — внутрибольничный инвазивный кандидоз ИК — инвазивный кандидоз

МПК — минимальная подавляющая концентрация

МПК50 - МПК, подавляющая рост 50% изучаемых штаммов данного вида мик-ромицета

МПК90 — МПК, подавляющая рост 90% изучаемых штаммов данного вида мик-

ромицета

У — устойчивый

УЧ - умеренно-чувствительный ЦСЖ — цереброспинальная жидкость Ч - чувствительный

Рауш, Е.Р. Особенности возбудителей внутрибольничного инвазивного канди-доза...автореф. дис...канд.мед.наук: 03.02.12 - микология / Рауш Екатерина Рудольфовна. - СПб.,2015,24с.

Подписано в печать 16.02. 2015 Формат 60x847,6 Цифровая Печ.л 1.0 Тираж 100 Заказ №25/02 печать

Типография «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2, Сайт: falconprint.ru)