Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Развитие эмбриональной нервной ткани при аллотрансплатации в мозг взрослых крыс

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Развитие эмбриональной нервной ткани при аллотрансплатации в мозг взрослых крыс"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ им. И.П. ПАВЛОВА

^ Г В О Д "Р183* РУКШ,ИСИ

- 9 ИЮЛ 1^97

ТУБА Аидреа

РАЗВИТИЕ ЭМБРИОНАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ ТКАНИ ПРИ АЛЛОТРАНСПЛАНТАЦИИ В МОЗГ ВЗРОСЛЫХ КРЫС

03.00.11 - "эмбриология, гистология и цитология" 03.00.13 - "физиология человека и животных"

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1997

Работа выполнена в лаборатории морфологии ЦНС Института физиологии им. И.П. Павлова и I Анатомическом отделе медицинского университета им. И. Земмельвейса (Будапешт, Венгрия).

Научные руководители: кандидат медицинских наук Ф.Н.Макаров кандидат биологических наук М.Кальман

Официальные оппоненты:

Чл. - корр. РАМН, доктор медицинских наук,

профессор В.А.Отеллнн Доктор биологических наук Н.И. Чалнсова

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский Государственный Университет

Защита диссертации состоится "23" июня 1997 года в П_часов на заседании Диссертационного Совета (К 002.36.01) по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при Институте физиологии им. И.П. Павлова РАН (199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6.)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиолог! им. И.П. Павлова РАН.

Автореферат разослан "22" мая 1997 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета,

кандидат биологических наук О.Г. Чивилева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы Трансплантация эмбриональной нервной ткани привлекает в последние годы пристальное внимание исследователей различного профиля - физиологов, морфологов, генетиков, нейрохими-ков и клиницистов. В рамках этого направления получены новые факты, необходимые для раскрытия механизмов нейрогистогенеза, миграции и дифференцировки клеток нервной ткани, механизмов реализации генетических программ в клеггках в измененных условиях их развития (Александрова М.А, Полежаев JI.B., 1984; Виноградова О .С., 1985; Отеллин В.А., с соавт. 1984; Полежаев Л.В., 1985; BjorkJund А. et al., 1982; Das G.D., 1985; Gash D.M. et al., 1985).

В дальнейшем эти наблюдения были углублены и расширены в исследованиях ряда авторов, что послужило основанием для клинического использования модели нейротрансплантации с целью лечения нейроде-генеративных и нейроэндокринных заболеваний (Бехтерева Н.П., Отеллин В .А. с соавт., 1990; BjorklundA. 1991; и др.).

Накопленный опыт экспериментального и клинического использования нейротрансплантации свидетельствует о существовании ряда нерешенных вопросов в биологии развития клеточных элементов нервной ткани, касающихся реакций отторжения трансплантатов и участия в них различных форм глии, а также формирования морфофункциональных межклеточных взаимодействий, имеющих место при совместном культивировании разных структур мозга.

Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось изучение характера развития и приживления клеток эмбриональной нервной ткани крыс различного возраста при разных способах ее алло-трансплантации в мозг взрослых животных.

В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи:

I. Оценить значение васкуляризации донорского мозга эмбрионов для жизнеспособности ненротрансплантатов у крысы.

2. Проследить динамику и условия развития различных типов гли-альных клеток (радиальной, астро-, олигодендроглии и эпендимы) в нейротрансплантатах.

3. Установить возраст донорской эмбриональной нервной ткани верхних шейных ганглиев, при котором нейротрансгшантаты оказываются наиболее жизнеспособными.

4. Исследовать гистогенез нервной ткани при совместной трансплантации закладки черного вещества и стриатума.

Научная новизна. В настоящем комплексном исследовании основное внимание было сосредоточено на изучении особенностей развития эмбриональной нервной ткани различного возраста и факторов, способствующих лучшей выживаемости ткани в условиях её аллотранспланта-ции в мозг взрослых крыс.

Впервые с использованием глиальных Марксов обнаружено более раннее, по сравнению с развитием эмбриональной ткани in situ, появление асгроцитов (трансформация виментин-иммунопозитивной радиальной глии в асгроциты иммунопозитивные к тиальному кислому фибриллярному белку - GFAP) и ускоренная дифференцировка асгроглии. Впервые установлено, что лишь при экспериментальном кольцевидном заворачивании трансплантируемых кусочков эмбриональной ткани вен-трикулярной поверхностью внутрь, удается закономерно получить образование эпендимного слоя клеток во всех нейротрансплантатах. Новые данные получены в отношении значения выбора для трансплантации васкуляризированной донорской ткани (на стадии Е14). Именно такая ткань обнаруживала большую жизнеспособность по сравнению с ранней стадией развития эмбриона Е12, когда имеет место лишь начало васку-ляризации ткани. Впервые экспериментально обоснована пригодность аллотрансплантации зрелых симпатических верхних шейных ганглиев. Показано, что совместная аллотрансплантация эмбриональной черной

субстанции и стрнатума в мозг взрослых животных увеличивает число их успешных приживлений.

Научно-практическое значение. Настоящая работа относится к числу фундаментальных исследований, направленных на выяснение механизмов развития и днфференцировкн эмбриональной нервной ткани. Показан характер развития глиального и . сосудистого компонентов нервной ткани и их значение для жизнеспособности нейротранспланта-тов при разных способах их пересадки. Полученные данные о корреляции между сроками васкуляризации эмбриональной нервной ткани и её последующим приживлением при трансплантации, а также данные о возможности успешной пересадки зрелых симпатических ганглиев могут быть использованы исследователями в экспериментальных разработках, направленных на восстановление целостности поврежденного мозга.

Предложена модель аллотрансплантации эмбриональной нервной ткани для исследования морфо-физиологических особенностей нейро-глиальных взаимодействий. Она может быть использована для изучения эффектов воздействия биологически активных веществ на процессы днфференцировкн дофаминэргических нейронов и формирование функциональных свойств клеток-мишеней в котрансплантатах.

Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены и обсуждены на Съезде Венгерского Физиологического Общества (Печ, Венгрия, 1992); на 16-ом Ежегодном Конгрессе Европейской Ассоциации нейронаук (Мадрид, Испания, 1993); на Съезде Анатомического Общества Германии (Марбург, ФРГ, 1994); на 5-ом Международном Симпозиуме по Нейротрансплантации (Шатене - Малабри, Франция,

1994); на Конференции Памяти Н.И. Зазыбина "Актуальные проблемы нейрогисгологии и нейроонтогенеза" (Киев, Украина, 1994); на 1-ом Съезде Венгерского Общества по Нейронаукам (Печ, Венгрия, 1994); на 2-ом Съезде Венгерского Общества по Нейронаукам (Сегед, Венгрия,

1995); на Съезде Анатомического Общества Германии (Грац, ФРГ, 1995);

на 3-ем Съезде Венгерского Общества по Нейронаукам (Балатонфюред, Венгрия, 1996).

Структура и объем. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования и изложения результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 110 страницах машинописного текста, содержит 74 рисунка и 4 таблицы. Список литературы включает 210 источников.

Публикашд1. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, в которых отражены основные положения диссертации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа была выполнена на 511 взрослых крысах линии Вистар. Всего было проведено 5 серий экспериментов. Для нейротрансплантации кусочки эмбриональной ткани извлекались из мозга эмбрионов на сроке Е 10-21. Донорская ткань иссекалась из переднего мозга, вентральной части среднего мозга, спинного мозга. Извлекался также и верхний шейный ганглий. Кроме того использовался материал от крыс в постна-тальноы периоде (1-3 дня и 5-8 недель). Имплантация кусочков ткани размером 2x1 мм осуществлялась в лобную или париетальную области мозга (интрапаренхимально) и в переднюю камеру глаза взрослых крыс-реципиентов. Время переживания трансплантатов составляло - 2-4 недели, а в передней кам<фе глаза - 3-7 дней или 1 месяц. Фиксация ткани производилась транскардиальной перфузией животных 4% парафор-мальдегидом или фиксатором Карновского. Свего-, электронно микроскопическое и иммуногистохимическое исследование проводилось на обычных гистологических, полугонких, ультратонких и вибротомных срезах.

Для анализа материала использовали следующие методики: обще-гисгологическую окраску толуидиновым синим, иммуногистохимиче-

ские реакции на GFAP, виментин, тирозингидрокснлазу. Для исследования аксонных связей использовался флуоресцентный маркер Dil.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

В наших экспериментах исследовались основные явления, сопровождающие развитие нейротрансплантатов: корреляция между возникновением сосудов, дифференцировкой глиальных элементов и жизнеспособностью донорской эмбриональной ткани.

Анализировались условия, которые способствовали развитию эпендимы в нейротрансплантатах.

При трансплантации верхних шейных ганглиев изучалось взаимоотношение вегетативной и центральной нервной систем, а также корреляция между степенью развития нервной ткани и её жизнеспособностью при трансплантации. Оценивалось приживление эмбриональных мезен-цефалона и сгриатума при их раздельной и совместной трансплантации.

Значение васкуляризацин донорского мозга эмбрионов для жшнеспособности интраокулярных трансплантатов у крысы. Задачей первой серии экспериментов являлось изучение значения наличия и степени васкуляризацин донорской эмбриональной нервной ткани для её диффе-ренцировки и выживания при трансплантации. Для этого пересаживался теленцефалический участок мозга эмбриона крысы на двух стадиях развития Е12 и Е14, т.е. в момент начала васкуляризацин и при хорошо развитой сосудистой сети в мозге, развивающемся in situ.

Васкуляризацин нервной ткани начинается на довольно ранней стадии развития. У крыс это происходит вскоре после формирования нервной трубки на 11-е и 12-е сутки эмбрионального развития (EI1-E12) в спинном и головном мозге соответственно. Стенки желудочков мозга на этой стадии состоят из нейроэпителия. Дифференцировка нервных и глиальных элементов начинается через несколько суток, когда нервная •псань становится достаточно хорошо васкуляризированной. До сих пор

s

неясно, является ли начало инвазии сосудов в эмбриональный мозг инициирующим моментом для дифференцировкн нервных клеток, или они (сосуды) только обеспечивают питание формирующихся нейронов. Согласно литературным данным, при нейротрансплантации ткани, находящейся в нейроэпнтепнальной стадии, сосуды из ткани хозяина хорошо врастают в трансплантат в первые послеоперационные сутки (Broadwell R.D. et al., 1990). При этом врастающие сосуды соединяются с собственными сосудами трансплантата. В других экспериментах показано, что, по крайней мере, при ксенотрансплантации врастающие сосуды хозяина образуют совершенно новую васкулярную систему, в то время как собственная сеть кровеносных сосудов трансплантата дегенерирует.

На стадии Е12 и Е14 теленцефалон представлен слоем нейроэпите-лия. Кровеносные сосуды начинают врастать в нейроэпитеяий на стадии El 2, а на стадии El 4 наблюдается более высокая степень васкуляриза-ции.

Выявлено, что доля выживших кусочков ткани на стадиях El 2 и Е14 различна: 15% (11 из 72) и 58% (14 из 24) соответственно (Р< 0,01).

Все трансплантаты, взятые из мозга эмбрионов на стадии El 4, обнаруживают как признаки дифференцировкн нервной ткани, так и богатой васкуляризации. Нейроны имеются во всех участках трансплантата, но располагаются неравномерно, часто в виде кластеров, тогда как распределение астроцитов более равномерное. Некоторые из них прилежат к нейронам, являясь их сателлитами. Миелинизированные волокна отсутствуют. В трансплантате регулярно обнаруживаются двуядерные нейроны, которые не характерны для ткани in situ.

Часть трансплантатов Е12 имеет структуру сходную с таковой трансплантатов El 4, но в 4 из 11 выживших трансплантатов не обнаружено ни васкуляризации, ни даже дифференцированных нейронов и глии.

Рост этих аваскулярных трансплантатов значительно задержан. Трансплантаты плотно соединяются с передней поверхностью радужки, хотя ткани трансплантата и хозяина не проникают друг в друга. Радужка богато васкуляризирована на обращенной к трансплантату стороне, но при этом ее сосуды не врастают в него. В таких трансплантатах нейроны располагаются по их периферии в виде неровного слоя, покрытого уплощенными клетками напоминающими эндотелий. В некоторых случаях нейроны группируются в участках трансплантата, тесно прилежащих к поверхностным сосудам радужки. Во внутренней зоне трансплантата нейроны отсутствуют, но обнаруживаются макрофаги и астроциты.

Таким образом, гистологическая ткань телеицефалона на стадиях Е12 и Е14 (начальная и более поздняя стадии васкуляризации) соответствует имеющимся в литературе описаниям (Strong L.H., 1986). Значительное различие в жизнеспособности нейротрансплантатов, взятых от эмбрионов на стадиях EI2 и Е14 при их одномесячном культивировании в передней камере глаза, демонстрирует определяющую роль стадии васкуляризации донорской ткани в процессе ее дальнейшего развития. Структура васкуляризированных трансплантатов сходна со структурой интраокулярных трансплантатов, описанной ранее многими авторами (Александрова М.А., Клещинов В.Н., 1990; Krum J.M., Rosenstein J.M., 1988). Кластерное расположение нейронов может быть обусловлено от- ' ' сугствием врастающих извне нервных волокон, которые разделяют нейроны во время нейрогистогенеза in situ. Поверхностно расположенные клетки, по видимому, являются эндотелиальными клетками радужки. •

В тех трансплантатах (Е12), которые развиваются без исходной вас- -куляризации, нейроны дифференцируются и переживают только в пери- ' ферических частях, где они могут получать питание через жидкость пе--реднейкамеры глаза.

В центре трансплантата дегенерация нейронов активирует макрофаги. Могут ли некоторые нейробласгы мигрировать из центра к поверх-

носги трансплантата, в соответствии с градиентом оксигенации, остается неясным. В центре трансплантата находятся и дифференцируются астро-циты, являющиеся менее чувствительными к гипоксии. Вместе с тем, задержка роста аваскулярных трансплантатов свидетельствует о том, что пролиферация глиобластов, также как и нейробластов, значительно ограничена в данных условиях. Отсутствие миепинизированных волокон как у Ei2, так и у Е14 трансплантатов невозможно связать с наличием или отсутствием кровеносных сосудов в исходной донорской ткани.

Таким образом, полученные в настоящей серии данные свидетельствуют о том, что васкуляризированная in situ донорская эмбриональная ткань при её трансплантации в переднюю камеру глаза способна получать кровеносные сосуды из ткани животного-хозяина и быть жизнеспособной, по крайней мере, в течение одного месяца.

Особенности развития радиальной н астроцитарной глии у крыс в нейротрапеплантатах. В этом разделе излагаются собственные данные о сроках развития и особенностях дифференцировки радиальной и астроцитарной глии в нормальных условиях in situ, а также в условиях ее трансплантации на сроке El5 в мозг взрослых животных. Для этого были использованы два глиальных маркера - виментин и GFAP.

Как известно, радиальная гния в процессе эмбрионального развития характеризуется наличием длинных биполярных отростков, соединяющих вентрикулярную и пиальную поверхности мозга. Эта глия играет важную роль в ориентации и направлении мигрирующих нейробластов в корковых пластинках. После миграционного периода радиальная глия у млекопитающих исчезает, трансформируясь в астроциты (FedorofT S., 1986). Ранее было установлено (Bjorkland Н., et al., 1984), что наличие виментина (цитоскелетный белок) характеризует развивающуюся глию, и он почти полностью исчезает в процессе созревания глии. GFAP характерен для более зрелых астроцитарных клеток.

Для изучения развивающейся глии in situ был взят материал в следующие сроки - PO, Р4, Р7, Р10 и PI4, что соответствовало по срокам поспрансплантационным дням при пересадке эмбриональной ткани Е15 т.е. РТ7, PTI1, РТ14, РТ17 и РТ21, учитывая что гесгационный периоду крыс равен 22 дням.

Анализ иммуногнсгохимических светооптических препаратов показал, что в нервной ткани мозга на стадии Е15, обнаруживались только виментин - иммунопозитивные радиальные волокна, которые располагались от вентрикулярной до пиальной поверхности. GFAP-иммунопозитивные структуры на этом сроке отсутствовали.

Та же самая картина наблюдалась in situ в коре у животных на сроке от РО до Р7. Астроциты не обнаруживались ни на срезах обработанных виментин-, ни GFAP - иммуногисгохимическими методиками. Вместе с тем следует отметить, что в других частях мозга (мозолистое тело, внутренняя капсула и передняя комиссура) GFAP-иммунопозитивные астроциты обнаруживались уже в течение первой посгнатальной недели развития.

Впервые немногочисленные GFAP-иммунопозитивные элементы -радиальная и асгроцитарная глия - были обнаружены в коре на сроке Р10. Количество GFAP-позитивных асгроцитов увеличивалось до стадии Р14, в то время как количество виментин-положительных радиальных волокон постепенно уменьшалось.

В трансплантатах на стадии PI 4 уже трудно обнаружить GFAP-позитивные радиальные волокна, в то время как виментин-позитивные волокна встречаются довольно часто.

На ранних сроках развития трансплантатов РТ7 GFAP-иммунопозитивные элементы были представлены только отдельными волокнами на периферии пересаженного кусочка и вблизи сосудов.

Выявление GFAP-позитнвных структур является более характерным для ткани трансплантата. Вокруг трансплантата образуется реактивный глиоз.

При развитии трансплантата на 7 посггрансплантационный день на периферии трансплантата появляются отдельные GFAP-позитивные волокна вблизи сосудов. Реактивный пхиоз относится главным образом к ткани мозга реципиента.

После иммуноцитохимической реакции на виментин в трансплантированной коре, спустя II дней после трансплантации, маркировалась только сеть длинных волокон. Показано, что организация этих волокон и их ориентация по отношению к границе трансплантата и ткани хозяина отличались от таковых, свойственных первоначальной радиальной глин. Отсутствие правильной организации и иная ориентация волокон происходили вследствие деформации стенки теленцефалона в процессе пересадки. В реципиентной коре вокруг трансплантата окрашивались только отдельные реактивные астроциты.

В трансплантатах на стадии Р14 вместо волокон выявляются зрелые GFAP-позитивные астроциты. В нескольких трансплантатах, однако, окрашиваются и немногочисленные длинные волокна.

Астроциты большей частью были похожи на клетки, которые наблюдались в мозге взрослых крыс, но их распределение было более плотным.

Виментин-иммунопозитивносгь также обнаруживалась, но была свойственна только немногим астроцитам, и, в целом, была слабее по сравнению cGFAP-иммунопозитивностью.

Таким образом, было показано, что в условиях трансплантации астроглия нервной ткани претерпевает ускоренный гистогенез по сравнению с развитием in situ (более раннее появление GFAP-иммунопозитивности, укорочение периода трансформации радиальной глии в асгроглии: 5-8 дней вместо 2-3 недель in situ). Мы рассматриваем

это как приспособительные изменения глии в ответ на травматизацию ткани в процессе трансплантации. По-видимому, эти изменения могут играть важную роль для жизнеспособности трансплантатов.

Развитие эпендимы в трансплантатах эмбриональной ткани у крыс. Как известно эпендима в процессе нормального развития эмбрионального мозга развивается из самого внутреннего слоя стенки мозгового пузыря (Das G.D., 1979). Несмотря на большое число экспериментальных работ по нейротрансплантации, нам удалось найти только несколько публикаций, которые были посвящены развитию эпендимы в трансплантированном эмбриональном мозге (Bernstein, 1985; Огеллин и др., 1990). Smith L.M. и Ebner F.F. (1985) в своей обзорной статье приходят к заключению, что эпендима не развивается в трансплантированной нервной ткани.

Задачей данной серии экспериментов явился анализ условий развития эпендимной глии в нейротрансплантатах.

Осуществлялась трансплантация участков стенки конечного мозга эмбрионов крыс El 5 в мозг взрослых животных.

Трансплантаты Е15, извлеченные через месяц после операции, хорошо развивались и переживали, были богато васкуляризированы, содержали дифференцированные нейроны, аслроглию и были интегрированы в ткань мозга хозяина-реципиента. На полутонких срезах в ткани трансплантата были отчетливо видны цисты, окаймленные изнутри слоем эпителиоподобных клеток. Характерное пограничное, линейное, однослойное расположение клеток, кубовидных или цилиндрических по форме, а также наличие на их апикальной поверхности микроворсинок и ресничек (киноцилий) позволило нам рассматривать их в качестве эпен-димных клеток. В нашем материале обращало на себя внимание спорадическое, нерегулярное появление таких цист в ткани трансплантатов. Они встречались в менее чем 10% случаев исследованных трансплантатов. Мы предположили, что к образованию таких меыбраноокруженных

цист могли приводить случайные скручивания, сворачивания кусочков стенки переднемозгового пузыря в процессе их трансплантации. В таких ситуациях может происходить образование кольцевидных структур с полостью внутри, причем внутренняя поверхность эмбриональной стенки оказывается свободной от контактов с какими-либо тканями, что может обеспечивать свободное развитие эпендимных клеток. Для проверки этой гипотезы была выполнена специальная работа. В этой серии кусочки стенки переднемозгового пузыря от эмбрионов на стадии Е15 заворачивались таким образом, чтобы вентрикулярная поверхность была внутри, а пиальная, соответственно, снаружи. Трансплантаты, подготовленные таким образом, укладывались внутрипаренхимально, в толщу церебральной коры взрослых крыс. Кусочки удерживались в этой позиции костным фрагментом, укладывавшимся сверху.

В результате анализа материала, взятого через один месяц после трансплантации, было установлено, что описанные ранее цисты встречались гораздо чаще, а именно в 5 случаях из 7 трансплантатов. Электрон-номикроскопически были выявлены все морфологические признаки характерные для эпендимных клеток. Показано, что поверхность клеток покрыта богатой системой микроворсинок, среди которых встречаются киноцилии. Соседние клетки контактировали друг с другом посредством плотных соединений (tight junctions). В некоторых случаях были видны капилляры, тесно прилежавшие к поверхности энендимных клеток, отделяясь от них только базальной мембраной.

Таким образом, если в обычных условиях трансплантации эпендима развивается лишь спорадически, то экспериментальное создание свободной поверхности для ткани нейротрансплантата приводит к закономерному появлению и развитию эпендимного слоя клеток.

Жизнеспособность верхних шейных ганглиев на разных стадиях развития при трансплантации в Церебральную кору взрослых крыс. Трансплантация дофаминэргических нейронов и структур является пер-

спективным направлением в экспериментальной и клинической практике коррекции дофаминдефинитных состояний. Для этого наиболее часто используется хромафинная ткань, а также ткань центральной нервной системы - например, черная субстанция. Однако, к настоящему времени известны экспериментальные и клинические данные о пересадках вегетативного верхнего шейного ганглия, нейроны которого также способны продуцировать дофамин (Bjorklimd et al., 1970; Rosenstein, Brigtinan, 1979). Вместе с тем, существуют немногочисленные и к тому же противоречивые данные в отношении пригодности к трансплантации верхних шейных ганглиев в эмбриональном или перинатальном периодах развития. В настоящей серии экспериментов мы задались целью сравнения жизнеспособности трансплантатов верхних шейных ганглиев (ВШГ) на стадиях: эмбриональной (Е17-20), неонатальной (Р1-3) и зрелой (5-6 недель) при пересадке их в кору мозга взрослых крыс. Ткань ВШГ, полученная в экспериментальных сериях, а также in situ на тех же сроках развития, анализировалась свегооптически на полутонких срезах.

Ганглий на стадии Е17 состоит из полигональных клеток, которые формируют тесные группы. Большинство клеток имеет большое ядро и малое количество цитоплазмы, которые слабо окрашиваются. Более темно окрашенные и небольшие по размерам клетки, по-видимому, являются предшественниками сателлитной глии. Митотические фигуры в них наблюдались лишь спорадически. Сходная гистологическая структура была характерна для ганглиев на сроках Е18- Р1, но в этих случаях не наблюдаются митозы. Клетки продолжают оставаться плотноупако-ванными.

Значительные морфологические изменения отмечаются на стадии РЗ. Клетки становятся большими и округлыми, их ядра и цитоплазма похожи на таковые у нейронов ганглиев взрослых животных. Структура ганглия менее компактна, поскольку врастающие и разветвляющиеся волокна разделяют нейроны. На этой стадии клетки-сателлиты органи-

зуются вокруг нейронов. Однако на периферии ганглиев отмечаются группы безъядерных дегенерирующих клеток.

Структура взрослого ганглия характеризуется наличием больших мультиполярных нейронов, находящихся в тесном контакте с клегками-сатеплитами и выраженными пучками нервных волокон.

Перинатальные трансплантаты в случае их приживления были значительно меньшими по размерам, чем соответствующие ганглии in situ. В таких случаях у трансплантатов не было соединительнотканной капсулы и они были окружены рыхлой соединительной тканью, заполнявшей трансплантационную полость. В ткани трансплантата определялись лишь отдельные кровеносные сосуды. Немногочисленные нейроны были достаточно хорошо дифференцированы, имели выраженное вещество Ннсспя, а размер сомы был сходен с таковым у зрелых симпатических нейронов in situ. Форма нейронов перинатальных трансплантатов была полигональной, а у зрелых симпатических клеток - округлой. Однако сателлитные клетки не прилежали столь плотно к нейронам, как это имеет место in situ. В паренхиме ганглия отсутствовали пучки нервных волокон.

Размер трансплантированных зрелых ганглиев оставался сравнимым с таковым у ганглиев in situ. Эти трансплантаты имели богатую васкуляризацию. На препаратах эти сосуды имели большой диаметр и, очевидно, хорошо перфузировались фиксирующими жидкостями, что свидетельствует об их связи с сосудистой системой животного-хозяина. Трансплантаты обычно были хорошо инкапсулированы соединительной тканью. В нейропиле обнаруживались группы крупных мультиполярных нейронов, преимущественно на периферии трансплантата, аналогичных симпатическим ганглионарным нейронам in situ. Нисслевская субстанция состояла из гранул меньшего размера, чем у нейронов трансплантатов EI7, что позволяет предположить в этих клетках более интенсивный синтез белка. Сателлитные клетки плотно прилегали к нейронам, а в

нейропиле обнаруживались толстые пучки волокон. В центре трансплантата находились, главным образом, глиальные шванновские клетки. Большинство нервных волокон были немиелинизированы.

В данной серии экспериментов была продемонстрирована различная степень жизнеспособности трансплантированной ткани ВШГ на разных стадиях развития. Процент успешных приживлений составлял: эмбриональные трансплантаты El 7-20 -12,1%; неонатальные трансплантаты Р1-3 -12,5%; зрелые трансплантаты - 5-6 недель - 61,9%.

Таким образом, именно зрелые вегетативные ганглин обнаруживают гораздо более высокую жизнеспособность при аллотрансплантации по сравнению с эмбриональными или перинатальными. Это значительно отличает их от нервной ткани центральной нервной системы, которая только на эмбриональной стадии развития пригодна для трансплантации.

Раздельная и совместная трансплантация эмбрионального мезенцефалона н стрнатума в мозг взрослых крыс. В этой серии экспериментов при совместной трансплантации эмбрионального стриатума и эмбрионального мезенцефалона на стадии Е15 успешно переживали в коре мозга взрослых крыс 38,6% трансплантатов (17 из 44), при раздельной трансплантации эмбрионального мезенцефалона переживали только 8,8% (4 из 45).

При совместной трансплантации стриатума и мезенцефалона, между тканями трансплантатов наблюдалась четкая граница. Жизнеспособные трансплантаты через месяц после пересадки обнаруживали довольно плотную популяцию крупных полигональных нейронов. Эти клетки имели хорошо выраженную Нисслевскую субстанцию и одна или две са-теллитные клетки тесно примыкали к почти каждому нейрону. Форма и размеры клеток напоминали таковые из черной субстанции in situ, однако в них не обнаруживалось гранул меланина. В нейропиле были видны

только отдельные миелинизнрованные нервные волокна. Нейроны сгриатума были меньшими по размеру и Нисслевская субстанция в них была не столь выражена. В мезэнцефалических трансплантатах были обнаружены ТН-иммунонозитивные клетки. Они образуют небольшие группы, однако не столь многочисленные, как в черном веществе животного-хозяина. За пределами мезенцефалических трансплантатов, а именно в котрансплантате сгриатума и церебральной коре хозяина наблюдались ТН-иммунопозитивные волокна, но отсутствовали окрашенные нейроны.

Для выявления сформированных нервных связей между ко-трансплантатами использовался флуоресцентный маркер Dil. При таком маркировании трансплантатов мезенцефалона наблюдали его сильную флуоресценцию. Со стороны светлой массы трансплантата определялись прямые полосы, направляющиеся к слабо флуоресцирующей зоне, которая локализовалась в котрансплантате сгриатума. При этом в любых других направлениях были видны только короткие флуоресцирующие протрузии. Полученные результаты свидетельствуют о том, что помимо волокон проникающих извне, в самом трансплантате формируются волокна, направляющиеся от мезенцефалона к сгриатуму.

Таким образом, совместная, в течение одного месяца трансплантация закладки черного вещества и эмбрионального сгриатума повышает число успешных приживлений котрансплантатов. Ткань нейротранс-плантатов была хорошо дифференцирована, нейроны формировали ре-ципрокные нервные связи и обнаруживали продуцирование дофамина.

ВЫВОДЫ.

1. Трансплантация участков эмбрионального конечного мозга на стадии Е12 и EI4 в переднюю камеру глаза взрослых крыс показала, что хорошо васкуляризированный эмбриональный донорский мозг на стадии El 4 обнаруживает большую жизнеспособность (почти в 4 раза), по

сравнению со стадией Е12, когда происходит лишь начало васкуляриза-ции нервной ткани.

2. При иммуноцитохимическом анализе с помощью глиальных маркеров GFAP и вкментина показано, что в условиях трансплантации асгроглия нервной ткани претерпевает ускоренный гистогенез по сравнению с ее развитием in situ. Это заключается в более раннем появлении GFAP-иммунопозитнвности и укорочении периода трансформации радиальной глин в астроглию (5-8 дней вместо 2-3 недель in situ).

3. Показано, что развитие и дифференцировка эпендимы в нейро-трансплантатах, пересаженных в толщу коры мозга взрослых крыс, происходит активно лишь при наличии свободной поверхности на вентри-кулярной стороне трансплантата, то есть, при отсутствии тесного прилежания трансплантата к ткани животного - реципиента.

4. Аллотрансплантация зрелых верхних шейных ганглиев (ВШГ) на стадии Р35-Р42 в кору головного мозга взрослых крыс приводила к значительно лучшему их приживлению и хорошей сохранности ганглионар-ных нейронов по сравнению с трансплантатами ВШГ на сроках Е17 или PI-P3.

5. Совместная трансплантация закладки черного вещества и эмбрионального стриатума у крыс на стадии Е15-Е16 в толщу коры мозга взрослых крыс увеличивала количество успешных приживлений ко-трансплантатов. Установлено формирование нервных связей между трансплантатами через месяц после трансплантации, в черном веществе иммуноцитохимически выявлены тнрозин-гидроксилаза-позитивные нейроны.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Kaiman М., Tuba A., Adeghate Е., Fulop Z. Development of striatal tissue implanted into the anterior eye chamber of rat. J. Neural Transplantation. 1992, v.3, №4. pp. 183-184.

2. Kalman M., Tuba A. Embryonic neural tissue survival may depend upon' its stage of vascularization. Eur. J. Neurosci., 1993, suppl. 6., p.303.

3. Туба А., Кальман M. Особенности развития гомотрансплантата эмбрионального мозга крысы, пересаженного в переднюю камеру глаза, в зависимости от стадии развития эмбриона. В сб.: Аюуалын проблеми нейролсгологн та нейроонтогенезу. Киев, 1994,с. 53.

4. Kalman М., Tuba A. Of superior cervical ganglia for grafting the adult one is to bepreffered. Neurobiology, 1994, №2, p. 65.

5. Kalman M., Tuba A. Epitelial differentiation inneural transplants. Ann. Anat. 1994, Suppl.176, pp. 122-123.

6. Tuba A., Ajtai В., Kalman M. Development of ependyma in telencephalic transplants. 5th Int. Symposium on Neural Transplantation. Chatenay-Malabry, France, 1994. MP87.

7. Kalman M., Tuba A., Senatorov Y.V. Effect of the donor age on the suitability of the superior cervical ganglion for transplantation. 5th Int. Symposium on Neural Transplantation. Chatenay- Malabry, France, 1994. SP10.

8. Kalman M., Tuba A. Development of neural connection between co-grafted rat embryonic mesencephalon and sriatum. Neurobiology, 1995, v.3, №1, p.71

9. Kalman M., Tuba A. Survival of embryonic rat mesencephalic tissue transplanted into cerebral cortex in the presence of co-grafted embryonic striatum. Neurobiology, 1995, v.3, №2, pp. 165-174

10. Kalman M., Tuba A., Ajtai B. Development of ependyma in neural transplants. Int. J. Develop. Neuroscience, 1995, v. 13, №2,pp.75-79

i I. Kalman M., Tuba A., Senatorov V.V., Fulop Z. Mature but not fetal or neonatal rat superior cervical ganglion transplants survive in the cortex of adult rats. Int. J. Develop. Neuroscience, 1996, v. 14, №5, pp. 631-640

12. Туба А., Кальман М., Макаров Ф.Н. Значение васкулярнзацин донорского мозга эмбрионов для жизнеспособности интраокулярных трансплантатов у крысы. Морфология, 1996, т.110, N4, С. 29-32

13. A. Tuba, L. Koillai, M.Kalman. A rapid replacement of the vimentin -containing radial glia by GFAP containing astrocytes in trasplanted telencephalon. J. Neural Transplantation and Plasticity. 1997, v.6, №1, pp.21-29.