Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Дифференцировка трансплантатов эмбрионального неокортекса в мозге взрослых крыс

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Дифференцировка трансплантатов эмбрионального неокортекса в мозге взрослых крыс"

Московский государственный университет Биологический факультет

На правах рукописи

Козлова Елена Николаевна

Днфференцировка трансплантатов эмбрионального неокортекса в мозге взрослых крыс.

03.00.11. - Эмбриология, цитология и гистология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва - 1991

Работа выполнена в Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова

Научный руководитель - к.б.н. М.А.Александрова

Официальные оппоненты - д.б.н. Д.В.Попов

д.б.н. И.В.Викторов

Ведущая организация - Институт Высшей нервной деятельности и Нейрофизиологии АН СССР

Защита состоится на заседании специализированного совета Д053.05.68 в Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119690, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, аудитория __

Автореферат разослан 1 ^ ^'

Ученый секретарь специализированного совета к.б.н. Е.Н.Калистратова

Актуальность проолемы. Оицая характеристика раооты. - i Последние десятилетия ознаменоеалмсь стремительным прогрессом

ИССС Т :1" г

m"" в'области познания структурно-функциональной организации нервной системы и ее высшего отдела - головного мозга. Особое место в исследовании центральной нервной системы (ЦНС) заняла трансплантация эмбриональной нервной ткани UHT) в мозг млекопитающих и человека. которая непосредственно связана с решением фундаментальных задач нейробиологии и ряда медицинских проблем. Иммунологическая "привилегированность" ЦНС у высших аивотных'делает возмои-ным успевнув трансплантацию свда различных презумптивных участков мозга с цельп восстановления утраченных функций ЦНС. индукции компенсаторно-восстановительных процессов, стимуляции регенераци-онного роста поврежденных нервних волокон.Так пересадка эмбриональной черной субстанции компенсирует дефицит допамина у животных (Sladek and Rednond.1989). Трансплантация фетадъной преопти-ческой области животным с репродуктивной дисфункцией приводит к нормализации синтеза гонадотропного релизинг-гормона и лгатеинизи-рущего гормона (flrendash.Gorski. tab'/). Трансплантация вазопрес-синовых нейронов крысам Brattleboro с несахарным диабетом улучшает состояние животных (Sladekand tosh. 1984). Трансплантат вызывает компенсаторно-восстановительные процессы в мозге реципиента с дЩфузным поражением нейронов после гипоксии (Полежаев. Александрова. 1986).

Особый интерес представляет проблема интеграции трансплантата в систему мозга животного-реципиента как составной функциональной части с установлением строго специфических связей. В связи с зпи. актуальным является изучение с одной стороны морофофункциональной и структурной дифференцировки трансплан-

тированной ЭНТ в новом для нее окружении мозге взрослого животного, а с другой стороны - регенерации поврежденных при трансплантации нервных волокон реципиента, их способности врастать в трансплантат и устанавливать новые синаптические связи взамен утраченных при повреждении.

Для ревения этих проблем необходимо понять можно ли использовать трансплантаты для замещения утраченных вследствие тех или иных причин участков мозга; возникают ли в трансплантатах и в окружающем их мозге необходимые условия для прорастания афферентов и эфферентов; насколько нормально проходит дифференцировка нервных и глиальных клеток трансплантатов, в сравнении с их нормальной дифференцировкой в интактном мозге.

Хорошими маркерами дмрреренцировки клеток нервной системы являются белки промежуточных филаментов: нейрофиламенты (Нф), гли-альный фибриллярный кислый белок СГФКБ) и виментин (ВИН). В развитии дифференцировка сопровождается изменением экспрессии и перераспределением этих белков в нейронах и глии.

В мозге крыс Нф-позитивные клетки впервые появляются на 12 день эмбрионального развития (Raju et.al..1981). С 12 до 14 дня эмбриогенеза предшественники нервных клеток зкспрессируют белки нейрофиламентов и виментин (Blßnaai et. al.,1982). С 15 дня эмбриогенеза Нф и ВИЛ экспрессирувтся раздельно, соответственно в преджественниках нервных и глиальных клеток. Незрелые астроциты синтезируют ВКМ. В коре мозга крысы экспрессия ГФКБ начинается в постнатальный период. Переход от ВИН к ГФКБ в астроцитах в мозге крыс наблюдается в течение второй-третьей недели после рождения, в период активной миелинизации волокон (Dahl, 1981). Затем экспрессия ГФКБ в коре мозга крыс снижается, и в мозге взрослых животных видны лижь редкие ГФКБ-позитивные фиброзные астроциты.

Известно.что способность к росту и регенерации нервных волокон эмбриональнального мозга утрачивается нейронами зрелой ЦНС, за

искличением некоторых отделов мозга lUolaoerg arid Frank, labOJ 8 периферической нервной системе, напротив, регенерация поврежденных нервных волокон происходит успешно. Полагают, что это связано с наличием в периферических нерьах оазальной мемораны. богатой

ламинином

(/Щ). In vitro ЛАМ способствует росту нейритов центральных и периферических нейронов ißunge et.al., 19ö7). В ЦНС млекопитающих ЛАМ присутствует только в Сазальной мембране сосудов (Sanes.1989). Имеется корреляция меаду наличием ЛАМ в мозге различных видов животных и способностью к регенерации нервных волокон ЦНС (Liesi.1985). Отсутствие способности к регенерации в ЦНС птиц и млекопитащих связывают с отсутствием в их мозге ламинина. Однако способность к регенерации нервных еолокон нейронов ЦНС сохраняется на протяжении всей жизни животного. Так при помещении проксимальной области повревденного аксона ЦНС в периферический нерв, аксон растет на большие расстояния (figuayo et.al.,1984).

Другим морфогенетически значимым компонентом внеклеточного ' иатрикса является фиоронектин (Фн), который также как и ЛАМ присутствует в эмбриональном мозге млекопитающих, экспрессируется в месте травмы, а также способствует росту нервных волокон in vitro. Как и ЛАМ, Фн усиливает адгезию и рост нейритов как центральных так и периферических нейронов (Sanes.1909). Фн наблвдает-ся также в начале миграционного пути предвественников гранулярных клеток в гистогенезе мозжечка (Hatten et.al.,19ö2).

Таким образом, изучение молекул внеклеточного матрикса (ламинина и смбронектина) в области трансплантации имеет важное значение для оценки возможности интеграции трансплантатов с иозгом животного-реципиента .

Целъ и задачи исследования.

/

Целью данного исследования было изучить динамику морфологической дифференцировки нервных и глиальных клеток трансплантатов в сравнении с дифференцировкой нервных и глиальных клеток коры ин-тактного мозга в ранние сроки после трансплантации. Выяснить насколько нормально проходит процесс дифференцировки клеток трансплантатов в сравнении с соответствующей областью интактной коры и имеются ли в области трансплантации факторы, способные определять врастание афферентных волокон из мозга реципиента в трансплантат и эфферентов из трансплантатов. Перед нами стояли следующие задачи: с помощью морфологических методов с использованием статистического анализа изучить кинетику дифференцировки трансплантированной ЭНТ в сравнении с нормальной дифференцировкой коры; с помощью иммуноцитохимических методов провести сравнительный анализ дифференцировки нейронов и глиальных клеток трансплантатов и коры интактного мозга: исследовать возмо«ное участие молекул внеклеточного матрикса .ламинина и фибронектина, в процессах развития трансплантатов и регенерации окружающей ткани мозга реципиентов.

Научная новизна.

Впервые с помощью иммуноцитохимических методов был проведен анализ дифференцировки неокортикальных трансплантатов ЭНТ. помещенных в мозг взрослых крыс в сравнении с развитием коры интакт-ных «ивогных. С помощью моноклональных антител к нейрофиламентам (Нф). виментину (ВИЮ и поликлональных антител к глиальному фибриллярному кислому белку (ГФКБ) была проведена оценка дифференцировки нервных и глиальных клеток в трансплантатах и интактном мозге. Было показано, что в процессе дифференцировки нервных клеток изменяется экспрессия и распределение белка НфЬН. Эти процес-

сы были сходными в трансплантатах и коре интактного мозга. Напротив. в глиальных клетках трансплантатов экспрессия ГФКБ начиналась раньве, чем в клетках интактного мозга, что свидетельствовало об ускоренной дифференцировке глиальной популяции трансплантатов в сравнении с нормой. Впервые изучали дифференцировку трансплантированной нервной ткани и регенерации нейритов мозга реципиента как процесс межклеточного взаимодействия, опосредованный внеклеточным матриксом с помощью поликлональных антител к ламини-ну и фибронектину, Наблюдали направленный рост нервных волокон белого вещества в сторону трансплантатов в тот период, когда в области трансплантатов активно экспрессировался /амикин. Ьыло показано, что Фн присутствует в трансплантатах длительное время.

С помощью статистического анализа было показано, что трансплантация ЗНТ затылочний области мозга крыс 17 дня развития , помещенная в' кору мозга взрослых животных, дифференцируется синхронно с затылочной ооластыо коры интактных животных.

Практическая значимость раоотн.

Разработка фундаментальных аспектов нгйрптрансплантации, новых критериев оценки трансплантированной ткани, выбор наиоолее оптимальных условий для трансплантации являются необходимой основой для успеиного внедрения зтого направления в нейрохирургию I Виноградова, 1990). В нашей работе с помощью иммуноцитохимических методов была изучена картина дифференцировки и интеграции трансплантата в мозг реципиента в критический начальный период после пересадки. Было показано, что глиальная популяция оказывается исключительно чувствительной к трансплантации, в то время как нейроны трансплантатов, несмотря на их значительную гиоель, оказываются более устойчивыми к пересадке. Показано, что появление внеклеточного матрикса в ооласти трансплантации совпадает с моментом про-

растаккя в него нервных волокон реципиента. В нагих экспериментах показано, что трансплантат, окрашенный рутинными методами, часто оказывается изолированной структурой в системе мозга реципиента, что выявляется при иммуноцитохимическом окраиивании. Разработав критерии оценки дифференцировки нейрональной и глиальной популяции неокортикальных трансплантатов и интактной коры мы ответили на два важных вопроса: насколько нормально проходит дифференци-ровка нейронов и глии трансплантатов в сравнении с нормой, и имеется ли благоприятные условия для интеграции трансплантатов с мозгом реципиента. Таким образом, иммуноцитохимическое изучение разных популяций клеток ЭНТ дает возможность оценивать состояние трансплантата, что может иметь сучественное значение для клинических исследований.

Использованные в работе критерии дифференшровки и патологического состояния клеток с помощью иммуноцитихимии с использованием отечественных антител дают возможность наладить необходимые иммуногистохимические методы для оценки биопсийного и секционного материалов в медицинских учреждениях, а также могут быть использованы на практикумах медицинских и биологических факультетов при исследовании дифференцировки нейронов и глии ЦНС. Полученные результаты об участии внеклеточного матрикса в регенерации нейритов могут способствовать разработке новых подходов к лечению ряда заболеваний, связанных с повреждением нервных окончаний в ЦНС.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Всесовзном симпозиуме "Трансплангация ткани мозга млекопитащих" СПущино, 1988г.); на мевлабораторном семинаре лаоо-ратории цитогенетики и экспериментальной нейрогенетики И0Г£Н АН СССР (Москва,1991г.).

Объем работы. Диссертация изложена на 1Ь5 страницах маыинопи-си. состоит из введения, 4-х пив. заключения и выводов, иллист-рирована 80 микрофотографиями, графиком и таблицей. Указатель литературы содержит 18 отечественных и 180 - зарубежных источника.

Основные результаты, изложенные в диссертации, получены в соавторстве с к.б.н. М.А.Александровой в ин-те иощей генетики АН СССР и с д.б.н. С.В./1юоимовым в bUHLl ЙМН СССР.

Сй/|ЕМАНИ£ РнЫЯИ.

Материалы и методы игследования.

Все эксперименты проведены на 158 крысах Ьистар. Реципиентами служили сачки массой 1аО—¿00 г. Донорами рыли эмбрионы 17 дней внутриутробного развития (317). День после спаривания считали первым днем беременности. После трансплантации эморионального мозга животных забивали путем декапитации через б часов, 1,б',3,5, 7.10,15,20.25,35 дней. Ь месяцев и 1 год. Контролем служил мозг интактных эмбрионов и постнатальных животных соответствующих трансплантату сроков развития.

Трансплантацию проводили под гексиналовим наркозом, двумя способами - по методике описанной Дасом (¡Jas,l974J, и методом трансплантации ЭНТ в искчп твенно приготовленную полость в коре. С помощью бор-машины, просверливали отверстие в черепе диаметром 3 мм. Лзтем, с помощью водоструйного насоса,отсасывали ткань затылочной коры мозга реципиента вплоть до белого вещества. После остановки кровотечения, в полость помещали участок эмбриональной коры мозга, который сверху прикрывали стерильной губкой для фиксации трансплантате) в приготовленной полости.

Для изучения кинотики дифрермщироЕки клеток ЭН'1 и интактной

коры головного мозга использовали методику окраски препаратов по Нисслю.

Исследование нейроглиальной дифференцировки в трансплантатах и в интактном мозге проводили с помощью иммуноцитохимического метода с использованием моноклональных антител к ВИМ, полученных Якубовым Л.З. в ВКЩ АМН СССР, и поликлональных антител к ГФК6, полученными Клиник Т.П. в ВНЦПЗ АМН СССР. Мозг животных с трансплантатом и мозг интактных животных быстро извлекали из черепа, замораживали в жидком азоте, готовили свежезамороженные срезы на криостате толщиной 5 мк. Серийные срезы последовательно располагали на стекле с тем, чтобы одни и те же структуры можно было изучать при различных иммуногистохимических маркерах. Один из срезов инкубировали только со вторыми антителами с целью искляь чить неспецифическую окраску. Рабочее разведение антител и фиксатор для каждого вида антител подбирали эмпирически. Готовые срезы фиксировали в ледяном ацетоне , затем окрашивали непрямым иммуно-цитохимическим методом. Препараты инкубировали с первыми антителами 1 час. Со вторыми антителами - антимыииными или антикроличьими инкубировали также по 1 часу при комнатной температуре. В рабочий раствор антител всегда добавляли нормальную крысиную сыворотку с целью снижения неспецифичесого связывания антител. Препараты заключали в глицерин на фосфатном буфере и изучали во флуоресцентном микроскопе. Фотомикроскоп III (Оптон, ФРГ).11ри этом моноклональные антитела к ВИМ использовали без разведения, а по-ликлокальные антитела к ГФКБ использовали в разведении 1:30.

Нейрональную дифференцировку трансплантатов и интактной коры изучали иммуногистохимически с использованием моноклональных антител к Нф68. Срезы толщиной 5-6 мк фиксировали в 10/С формалине. Далънейвие операции были аналогичны описанным выше. Антитела к Нф68 бши получена Т.Э.Нэуман в институте Биологической и химической физики АН ЗССР, в г.Таллинн. Их использовали в разведение

1:1000.

При изучении вшчуи-гпчниго матрикса в ооласти трансплантации использовали иммуногистохимический метод с использованием поли-клональных антител к /1нМ и Фн.Для этих антител подходили обе фиксации и в ледяном ацетоне, и в формалине. Антитела были получены Любимовым А.В. в ВОНЦ АМН СССР, и были использованы в разведении 1:5 и 1:40 соответственно.

В некоторых случаях использовали двойную метку к Нф и ЛАМ и к Нф и Фн. Для этого готовили раоочий раствор первых и вторых антител. в котором сохранялись пропорции рабочих разведений для каждого из них. В этом случае моноклональные и поликлональные антитела использовали одновременно в качестве первого слоя инкубации, затем отмытые в фосфатном буфере препараты инкубировали со вторыми антителами, представляющими сооой смесь антимышиных и антикроличьих антител, конъюгированных с 'МГЦ и ТРИТЦ.

Для оценки степени дифференцировки трансплантированной ткани в разные сроки после операции, в эмбриональном и постнатальном ин-тактном мозге на гистологических препаратах, окрашенных по Нисслв просчитывали количество нейронов в рассчете на 1000 клеток исследуемой ткани. Критерием нейрональной дифференцировки на ранних стадиях развития служило наличие основного дендрита, а позже и другие морфологические признаки дифференцированного нейрона. Полученные количественные данные подвергали статистической обработке. Определение достоверности различий в степени дифференцировки ткани в разные сроки ее развития определяли по (.-критерию Сть-юдента.

Результатн исследования и их обсуждение.

Неокортикальные трансплантаты, помещенные в мозг взрослых крыс постепенно дифференцировались в затылочной области мозга хозяина. В них выявлялись клеточные типы, характерные для этого отдела коры ба/ъжих полужарий головного мозга, хотя и не происходило типичной послойной организации ткани трансплантатов. Картина морфологической дифференцировки трансплантатов, сходна с таковой в нормальном онтогенезе соответствующей области коры. Однако относительное число нервных клеток с первых дней в трансплантатах было снижено по сравнению с нормальной тканью коры мозга. Сниженный уровень относительного числа нервных клеток в трансплантатах сохранялся на протяжении всей жизни животных-реципиентов. Известно, что наиболее чувствительными к ижемическим и механическим воздействиям. связанными с трансплантацией, оказываются более дифференцированные нервные клетки.которые гибнут в первые дни после пересадки. По этой причине, по-видимому, в трансплантатах редко наблюдали крупные пирамидные нейроны, которые в эмбриогенезе коры возникает раньше других типов нейронов.

Несмотря на резкое снижение относительного числа нервных клеток в трансплантатах, морфологическая дифреренцировка нейронов и в трансплантатах, и в неокортексе нормальных животных происходила синхронно (Рис.1). В период, соответствующий 7- 10 дням после операции, число клеток дифференцирующихся в нейроны,достигало максимального значения. В дальнейжем их количество не менялось, происходили лижъ морфологическая дифференцировка. К 25 дню после операции и к 20 дню после рождения соответствувдего срока развития интактных крыс, нейроны исследуемых областей были уже хороио дифференцированы. Таким образом, трансплантация не изменяла динамику развития трансплантированной ткани в сравнении с нормальным развитием коры мозга.

Лии ртйити!

Рис. 2. Изменение относительною числе нервных клеток в развивающихся неокортккалышх трансплантатах, пересаженных в мозг взрослых крыс, в различные сроки после операции я а нор-малшо дафференцирумщсйси коре мозга крыс соответствующих сроков развития. Н - нормальные жяагоше, Т - трансшингаг

Нейрональную дидоеренцировку и интактной коре и в трансплантированной ткани изучали также с помощью антител к НфЬЙ. Иммуно-цитохимическое исследование показало, что через 6 часов после операции в области трансплантации видны хаотично расположенные Нф-позитивные структуры. Через ¿ дня после операции, Нф выявлялись в околоядерной цитоплазме матричных клеток трансплантата. В мозге интактных животных 15,17 и 13 дней эморионального развития наблюдали Нф-позитивную околоздерную цитоплазму нервных клеток. При этом в 15-дневных трансплантатах встречались лишь отдельные клетки с Нф-позитивной цитоплазмой. В 17- дневных эмбрионах их число значительно увеличивалось. У некоторых клеток наблюдап^ь полярное распределение Нф, был виден неоольшой флуоресцирующий отросток. Отсутствие клеток с отростками в трансплантатах этого срока вероятно связано с гибелью наиоолее дифференцированных клеток в первые дни пиин.' операции.

Через 3 дня после пересадки помимо низкодифференцированных клеток в трансплантатах были видны интенсивно флуоресцирующие' нервные волокна крупного диаметра.расположенные по перирерии и реже, в центре трансплантатов. По-видимому, это волокна вросшие в трансплантат из мозга реципиента, т.к.на границе между трансплантатом и мозгом хозяина в этот срок наблюдали многочисленные Нф-позитивные утолщенные структуры ориентированные в сторону трансплантата и структуры в виде колец, которые отмечали и другие авторы, использовавжие окраску серебрения Нф (ЕиШегу О..1970).

По мере дифференцировки трансплантатов и интакушй коры Нф исчезали из околоядерной цитоплазмы клеток и выявлялись лишь в отростках нейронов. Короткие, слабо флуоресцирующие отростки позже превращались в длинные интенсивно флуоресцирующие нервные волокна большего и меньжего, диаметра. Интенсивность свечения нервных волокон в трансплантатах оставалась более высокой, чем в окружающей ткани мозга на протяжении всего эксперимента. Поздние трансплантаты. через 3-6 месяцев после пересадки, часто оказывались изолированными от мозга реципиента только с одной стороны, при этом в областях интегрирации, наблюдалось взаимное проникновение Нф-по-зитивных волокон.

Известно, что в коре мало миелинизированных аксонов и в ее клетках слабо экспрессируется белок НфЬй. В корковых трансплантатах. однако, мы наблюдали большое число волокон очень крупного диаметра. Трансплантаты часто представляли сооой компартментали-зованные структуры с внутренним ростом пучков волокин и, возмон-но. с замкнутыми на себе нервными контактами. Под такими компарт-ментализованными трансплантатами, как правило наблюдали полость, изолирующую трансплантат от окружающей ткани мозга реципиента. Повыженная экспрессия Нф в таких трансплантатах,возможно, свидетельствовала об их патологическом состоянии. При этом окраска по

Нисслю ТранЬшИНТИТЩ! поздних српкиь развития не выявляла каких-либо особенностей. >

Таким образом, при изучении дидоеренцировки нервной ткани трансплантатов в сравнении с диФФеренцировкой нейронов коры ин-тактного мозга, при иммуноцитихимичеоком' исследовании с помоцьп моноклональных антител к Нф68 Оыло пиказано, что интенсивность экспрессии и место локализации Нф соответствует нормальному ходу дифференцировки. Так, в низкодиФФеренцированннх нейробластах Нф локализовались в околоядерной цитоплазме, затем наблюдали поляризацию расположения Нф в цитоплазме клеток, которая предшествовала росту аксона. К 10 дню после пересадки Нф локализовались в интенсивно флуоресцирующих коротких нервных отростках.которые удлинялись по мере дифференцировки нейронов.

Дифференцировку нейроглии неокортикшшных трансплантатов и интактной коры мозга изучали иммуногистохимически с использованием поликлональных антител к белку промежуточных филаментов -ГФКБ, локализованному в астроцитах с В1 ^паш 1 et.aL.1972) и моноклональных антител к ЬИМ - белку промежуточных филаментов незрелых астроцитов (ИаЫ. 1981). В первые дни после пересадки в трансплантатах прекращался экспрессироваться ЬИМ. в то время как в интактной коре мозга ми наблюдали активную экспрессию ЬИМ глиальны-ми клетками. В 5-дневных трансплантатах экспрессия ЬИМ возобновлялась.

ГФКЬ в трансплантатах появлялся через 5 дней после пересадки, в то время как в интактной коре этого срока развития, наблюдали лишь ГФКБ-позитивную наружную глиальнчга мембрану (НГМ) мизга, в виде прерывистой структуры. Этот факт свидетельствует об ускоренной дифференцировке глии трансплантатов по сравнению с глией интактной коры.Возможно, ранняя дифференцировка глиальных клеток влияет на интеграцию трансплантатов с мозгом реципиента, поскольку известно, что КМ-реактивные астрициты гранэитирно синтезиру-

шПи Фн.Кроме того,степень зрелости ненейрональных элементов трансплантатов, играет ключевую роль в том, какие волокна из мозга реципиента будут прорастать в трансплантат iSmith and tbner, 1986).

Позже, к 15 дни после пересадки во внутренних отделах трансплантатов снижалась экспрессия ГФКБ, что свидетельствовало о диф-ференцировке астроглиалъной популяции в трансплантатах. В интакт-ной коре соответствующих сроков развития экспрессия этого белка увеличивалась вплоть до 1 месяца постнатальной жизни. В дальнейшем. содержание и экспрессия ГФКБ в коре снижалась и в зрелой коре интактного мозга выявлялись лишь редкие ГФКЬ-позитивные фиброзные астроциты. По периферии трансплантатов, в отличии от внутренних областей, наблюдали ГФКБ-позитивный глиальный рубец, который может, по-видимому, активно участвовать в интеграции трансплантатов. Было показано, что в области ГФКБ-позитивного астрог-лиального рубца, врастаюцие в трансплантат нервные волокна реципиента дезориентируются, однако успевно преодалевают это препятствие (ßicrvaai et.al., 1985). Полагают, что формирование глиального рубца способствует нейритному росту вследствие специфических межклеточных взаимодействий в этой области (Krayanek and Goldbery,1984), поскольку здесь синтезируется лакинин и фибронек-тин (Liesi et.al.,1984: Mizutani and Kiшита,1987).

ВИМ выявлялся в трансплантатах »и протяжении всего эксперимента в виде отдельных фибриллярных структур, в то время как из клеток интактной коры он исчезал через 2 недели после рождения. Возможно длительная экспрессия ВИМ в трансплантатах связана с тем. что астроциты 1-типа ( протоплазматические астроциты. составляющие глиальный рубец) могут влиять на диФФеренцировку 02А-преджес твенников. обжих для астроцитов 2-типа (фиброзных аст-родатов) и олигодендроцитов (Raff et.al.,1988). В связи с этим. ГФКБ-позитивный глиальный рубец, может индуцировать задержку диф-

ференцировки трансплантированных ОЛнЬИМ-позитивных клеток-предшественников в зрелые илигодендрпцигн, что. в свою очередь, может выражаться в пролонгированной -du пресс ии ВИМ клетками трансплантатов.

Особого внимания заслушивают корковые трансплантаты, помещенные в гиппокамп или ъ желудочек мозга реципиента, в места, где они не могут установить нормальные межнейрональные связи. Такие трансплантаты на протяжении всего эксперимента оставались ГФКБ-позитивными. а астроциты труним, штатов значительно превышали размеры обычных глиальных клеток, что свидетельствовало о сильном глиозисе в таких гетеротипичн.ких трансплантатах. Очевидно. изолированное положение таких трансплантатов определяло реактивное состояние их глиальной популяции. & них также всегда наблюдались ВИМ-позитиьные структуры.

Внеклеточный матрикс в области трансплантации изучали при помощи поликлональных антител к /IHM и Фн.В мозге интактных животных ЛАМ выявляется в Пазальной мембране >'осудив, а Фн на внутренних стенках сосудов. Через b дней после операции вплоть до 15 дня помимо базальных мембран сосудов, антитела к ЛйМ выявляли также многочисленные фибриллярные структуры не связанные с сосудами. В этот же период, при обработке срезов антителами к Нф наблюдали ориентированный рост нервных волокон белого вещества в сторону трансплантата. В участках, отдаленных от места трансплантации, в области белого вещества оыли видны тонкие, слабо окрашенные волокна. По мере приближения к трансплантату они утолщались и разв-летвлялись.

Важно отметить, что появление в трансплантатах ЛАМ, не связанного с сосудами, совпадает по времени с экспрессией глией ГФКБ. Не исключено, что эти процессы взаимосвязаны, поскольку реактивная глия (ГФКЬ-позитивная) в мозге взрослых крыс при травме может синтезировать ЛЙМ. Возможно, что появление в трансплантатах /ИМ

" является вторичным сооытием по отношению к регенерации нервных волокон реципиента. Было показано, что регенерирующие нервные волокна рыб выделяют определенный фактор, индуцирующий синтез лами-нина глиальными клетками (Cohen and Schwartz.1909).

По-видимому, наличие внеклеточного матрикса является необходимым . но не достаточным условием для регенерации нервных волокон в ДОС. Очевидно необходимы дополнительные факторы, имеющиеся в ЗНТ. Это предположение основано на том. что очищенный ЛАМ. помещенный в место повреждения зрительного нерва, не индуцировал регенерацию нервных волокон. В то же время именно эмбрианалъные трансплантаты, в отличие от неонатальных, индуцировали регенерацию оптического нерва у крыс. Ламинин при этом появлялся на б день после трансплантации в зоне реактивной глии iHausman et.al.,19öy). В другой модели, когда ламинин помещали в соседнюю с эмбриональным трансплантатом полость, отмечали направленный рост к ЛАМ отростков нейронов самого трансплантата При этом рост нейритов мозга хозяина в сторону полости с ЛАМ отсутствовал (Zhou and fizaitia.13ÖÖ).

Фн в области трансплантации выявлялся с первых часов после пересадки на протяжении всего опыта. В первые часы наолюдались бесструктурные Фн-позитивные структуры. По-видимому это плазматический Фн. попавший в область пересадки вместе с кровью. Позже наблюдали фибриллярные Фн-позитивные структуры. В полугодовых трансплантатах Фн выявлялся в цитоплазме клеток. Двойная окраска антителами к Нф и Фн. показала, что Фн не локализовался в нейронах. Присутствие Фн в мозге длительное время после повреждении отмечали и другие авторы сMizirtani and Kinura. 1907 ). Возможно присутствие Фн в трансплантатах через несколько месяцев после операции связано с особенностью сосудов трансплантатов, которые не всегда образуют гематоэнцефалический барьер (Rossenstein, 1987), и могут оказаться проницаемыми для крови. В этом случае

клетки трансплантатои могцт постоянно юроировать плазматический Фн.

Таким образом.при трансплантации ;)НТ в мозг взрослых млекопи-, тающих возникает неооходимая среда для стимуляции регенераторных процессов в поврежденных аксонах, (киоую роль здесь могут играть нейроторофические Фактиры, имеющиеся и ЗНТ. При наличии ламинина и Фн в ооласти трансплантации вшможна регенерация нервных волокон реципиента и ыиюкин самого трансплантата.

Заключение

Таким образом, представленный результаты показывают, что неокортикальные трансплантаты 17-дневных крысиных эмбрионов, помещенные в мозг взрослых крыс дифференцируются и интегрируются с мозгом реципиентов. В результате трансплантации возникают условия, способствующие регенерации волокон реципиента и росту нейритов из трансплантатов в мозг хозяина, вследствие появления в области травмы компонентов эмориинольного внеклеточного матрикса -фибронектина и ламинина. При сравнении диэдеренцировки нейрональ-ной и глиальной популяции трансплантатов с клетками интактной коры головного мозга контрольных животных в сроки, соответствующие срокам развития трансплантатов, оыло показано, что трансплантация не нарушает общего хода дифференцировки этих клеток. При этом глиальная популяция трансплантатов дифференцируется ускоренными темпами в сравнении с глией интактной коры, а нейроны, несмотря на их значительную гиоель, дифференцируются синхронно с нормально дифференцирующейся популяцией нейронов коры интактного мозга, й корковых трансплантатах, изолированных от мозга реципиента полостью, либо попавших в йелудочек или гиппокамп хозяина, т.е. лишенных возможности установить полноценные афферентные и эфферент-

ные связи наблюдали повывеннуи экспрессию Нф в нейронах трансплантатов и ГФКБ в глиальных клетках трансплаантированной ткани на протяжении всего эксперимента.

ВЫВОДЫ

1. В эмбриональных неокортикальных трансплантатах и в интакт-ной коре мозга крысы морфологическая дифференцировка нейронов происходит синхронно,хотя в трансплантатах число нейронов значительно снижено.

2. В трансплантатах эмбриональной коры экспрессия ГФКБ начинается раньве чем в интактной коре, что свидетельствует об ускоренной дифференцировке глиального компонента трансплантатов.

3. В нейронах неокортикальных трансплантатов нейрофиламенты 68КД экспрессирувтся и распределяются также как и в нейронах интактной коры развиваюцегося мозга.

4. Система промежуточных филаментов глиальных клеток в отличие от нейрональных, чувствительна к процедуре трансплантации, что выражается во временном прекратили экспрессии виментина в течение 3-х дней после трансплантации.

5. В неокортикальных трансплантатах выявляются морфогенети-чески значимые белки внеклеточного иатрикса. й именно» ламинин -в период интеграции трансплантата с мозгом реципиента (5-15 дни после пересадки) и фибронектин - на протяжение всего эксперимента (с первых часов до 6 месяцев).

6. В неокортикальных трансплантатах наблюдается отклонение от нормальной дифференцировки интактного мозга, что выражается в длительной экспрессии виментина, глиального фибриллярного кислого белка в пограничной зоне, и сохранении фибронектииа в трансплантатах.

LimcoK оичоликовашшх раоит пи теме диссеации. Козлова E.H.

Дифференцировка нейроглии в эмприональных неокортикальных трансплантатах крыс, помещенных в мпзг взрослых животных. Им-муногистохимическое исследование. ДАН СССР, 198У,т.3Ü7.Nb,c. 148?-14Уи.

Козлова E.H.

Кинетика дифференциривки нервных и глиальных клеток неокортикальных трансплантатов, помещенных в мозг взрослых крыс. Онтогенез.1330.t.x.i.a'v,'- л2ч-

Козлова E.H. .Александрова M.I).

Кинетика развития эмориональний нервной ткани, трансплантированной в мозг взрослых крыс. ДАН СССР, 1988а,tJ00.N1,с.¿¿S-ггЬ.

Козлова E.H..Александрова М.А.

Последовательная морфологическая дифференцировка клеток эмбриональных трансплантатов в мозге взрослых крыс. Всесоюзный симпозиум "Трансплантация ткани мозга млекопитающих" ,г.Пущино.1У806,с.39-40.

Козлова E.H..Александрова H.A.

Количественный анализ развивающихся нейронов эмбриональной ткани коры мозга, трансплантированной в мозг взрослых крыс в сравнение с развитием нейронов в интактном мозге. ДАН СССР.1989,т.30,N2.с.472-47?.

Козлова E.H..Любимов A.B..Александрова М.А, Распределение фибронектина.ламинина и нейрофиламентов в мозге взрослых крыс при трансплантации эмбриональной нервной ткани. ДЙН СССР. 1990. т З/з, а/?, с иki- um-