Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ультраструктурное исследование пластичности клеточных элементов и межклеточных взаимодействий в трансплантатах нервной ткани

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Журавлева, Зинаида Николаевна

1. Актуальность проблемы.

Трансплантаты эмбриональной нервной ткани являются прекрасной моделью для исследования таких фундаментальных проблем современной нейробиологии, как закономерности нейроонтогенеза, механизмы регенерации и пластичности. В отличие от культивирования in vitro трансплантация в иммунопривилегированные области дает возможность наблюдать ткань продолжительное время, соизмеримое с жизнью животного. Изучение дифференцировки нервной ткани в передней камере глаза (ПКГ) в отсутствие нормальных афферентов, эфферентных мишеней и тканевого окружения позволяет подойти к проблемам самоорганизации мозга, выявить генетически обусловленные и зависящие от внешних влияний факторы, управляющие развитием. При исследовании внутримозговых трансплантатов особенно важными являются проблемы структурной реконструкции мозга и функциональной интеграции трансплантированной эмбриональной ткани с мозгом взрослого животного-реципиента. Морфофункциональные аспекты этого обсуждены в ряде обзоров (Полежаев, 1981, 1983; Виноградова, 1984, 1990; Vinogradova, 1988, 1990, 1994; Угрюмов, 1989; Fine, 1990; Fisher, Gage, 1993; Гилерович, 1993 и др.).

Актуальность проведенного исследования определяется также тем, что метод нейротрансплантации можно использовать для восстановления нарушенных функций мозга не только в условиях экспериментальной патологии (Bjorklund, Stenevi, 1979; Freed et al., 1981; Александрова, Полежаев, 1982; Dunnett et al, 1982; Брагин и др., 1984; Отеллин и др., 1985; Лущекина и др., 1988; Victorov, Lyjin, 1990; Полежаев и др., 1993; Ермакова и др., 1996; Семченко и др., 1996 и др.; Ярыгин и др., 1997), но и в клинической медицине (Backlund et al., 1985; Lindvall et al., 1987; Кирпатовский, 1988; Spencer et al., 1992; Савельев и др.,1994; Kopyov et al.,1997 и др.; Kordower et.al; 1997). Во многом возможность включения нейротрансплантатов в интегративную деятельность мозга определяется пластическими свойствами клеточных ^элементов и межклеточных взаимодействий. Компенсаторные и адаптационные морфологические преобразования нейронов и их отростков, наблюдавшиеся еще классиками нейрогистологии при . етовой микроскопии (Cajal, 1928), анализируются современными, в > L числе, и отечественными, исследователями электронно-¡фоскопически (Бабминдра, 1972; Попова, 1974; Боголепов, 1975, 'с Косицын, 1976; Манина, 1976; Артюхина, 1979; Лосева, 1982; £ ïob, Петухов, 1982; Мошков, 1985; Хлудова, 1997; Бабминдра и др., ^ ''%). Представляется важным выяснить, как трансплантированная яная ткань реализует свои пластические свойства при развитии и ; Ьвременном функционировании в эктопическом положении.

Дальнейшая разработка проблем нейротрансплантации требует детальных морфологических изысканий для выяснения цитологической организации трансплантатов, степени воспроизведения фенотипических особенностей нервных и глиальных элементов на микро- и ультраструктурном уровне; возможности формирования синаптических взаимодействий между нервными клетками; способности нервных волокон прорастать через границу с мозгом и образовывать функциональные контакты на неадекватных клеточных мишенях; роли глиальных клеток при интеграции. Учитывая, что иммунная привилегированность мозга и, особенно, ПКГ является относительной (Kaplan, Stevens, 1975; Raju, Grogan, 1977; Брагин, Виноградова, 1981; Owens et al., 1994), необходима оценка способности нервной ткани формировать гемато-энцефалический барьер (ГЭБ) в условиях трансплантации. До сих пор неясно, для нормального функционирования каких областей мозга особенно критично восстановление структурной организации; высказываются противоречивые мнения о степени специфичности устанавливаемых трансплантированными нейронами синаптических связей; неизвестны факторы, способствующие или препятствующие интеграции эмбриональной ткани с мозгом взрослого животного, компенсируется ли дефицит нормальных синаптических взаимодействий усилением нейро-нейрональных и нейроглиальных несинаптических коммуникаций.

2. Цель н задачи исследования.

Цель работы состояла в выяснении способности трансплантатов эмбриональной нервной ткани приживаться, дифференцироваться и сохраняться длительное время в ПКГ и мозге взрослых животных, в оценке степени воспроизведения морфологических особенностей и реализации пластических свойств трансплантированной нервной ткани, а также возможности ее функциональной интеграции с соседними структурами. При этом необходимо было определить значение внутренних (генетически детерминированных) и внешних (зависящих от взаимодействия с окружающей тканью) воздействий на рост, развитие и дифференцировку трансплантатов и их клеточных элементов, степень специфичности устанавливаемых синаптических связей как внутри трансплантатов, так и в мозге реципиента, а также значение несинаптических форм межклеточных взаимодействий в функционировании трансплантатов. Для этого нужно было исследовать трансплантаты областей мозга с разной цитоархитекто никой (гиппокамп, зубчатая фасция, септальные ядра, неокортекс), развивающиеся в полной изоляции от мозга (в ПКГ) или в мозге (в гомотопическом и гетеротопическом положении, при трансплантации в паренхиму и в острую полость).

Основные задачи:

1. Изучить цитоархитектонику, микроскопические и ультраструктурные особенности нервных и глиальных клеток, синаптическую организацию в полностью изолированных от мозга (развивающихся в ПКГ) трансплантатах гиппокампа и септальных ядер. Сопоставить выявленные характеристики с таковыми в аналогичных областях мозга in situ. 2. Провести качественную оценку развития нейропиля (соотношение нервных и глиальных элементов, плотность синаптических контактов, степень зрелости и др.), формирующегося в условиях отсутствия нормальных афферентов и адекватных эфферентных мишеней в интраокулярных трансплантатах. 3. Изучить возможность врастания в интраокулярные трансплантаты периферических нервных волокон из радужной оболочки и формирования ими синаптических контактов на нейронах трансплантатов. 4. Выяснить влияние возраста донорской эмбриональной ткани и возраста животного-реципиента на рост интраокулярных трансплантатов, дифференцировку и морфом етрические параметры нервных клеток. 5. Учитывая ограниченность гемато-офтальмического барьера, выяснить влияние иммунологической несовместимости донора и реципиента на приживление, рост и развитие интраокулярных трансплантатов. 6. Определить зависимость выживания тормозных ГАМКергических и не содержащих ГАМК нейронов в гомотопических (интрапаренхимальных и интракавитальных) трансплантатах неокортекса от степени интеграции с мозгом. Сравнить полученные морфометрические данные с таковыми в полностью изолированных от мозга интраокулярных трансплантатах. 7. Оценить степень воспроизведения ультраструктурных характеристик нейронов и синапсов в гетеротопических интракортикальных трансплантатах зубчатой фасции. 8. Используя уникальные морфологические характеристики гигантских синаптических окончаний зубчатой фасции, позволяющие их идентифицировать на электронно-микроскопическом уровне, определить возможность образования функциональных контактов с неадекватными постсинаптическими мишенями как в самом трансплантате, так и в соседних участках мозга реципиента. 9. Изучить компенсаторно-адаптационные пластические преобразования нейронов, нейроглиальных отношений, синаптических связей и несинаптических (в том числе, метаболических) коммуникаций в трансплантатах разных типов и в мозге реципиента. Оценить состояние долгоживущих трансплантатов. 10. Определить роль различных типов глиальных клеток в формировании поверхности трансплантатов и границы между трансплантатом и мозгом. 11. По ультраструктурным признакам оценить состояние гисто-гематического барьера капилляров интраокулярных трансплантатов, получающих кровоснабжение из радужной оболочки с помощью кровеносных сосудов периферического типа.

3. Научная новизна работы.

Работа была начата в период, когда исследования по трансплантации только начали развиваться как в нашей стране, так и зарубежом. Поэтому многие гистологические и ультраструктурные факты, полученные нами, имели приоритетный характер в момент опубликования, а некоторые сохраняют его до сих пор. Например, впервые было показано:

Наличие в интраокулярных нейротрансплантатах капилляров с разной степенью проницаемости — обладающих всеми признаками ГЭБ, со сниженными барьерными свойствами и с проницаемыми, фенестрированными сосудистыми стенками.

Трансформация периферических нервов, врастающих в интраокулярные трансплантаты из радужной оболочки, в центральные типы и формирование ими синаптических контактов с нервными элементами трансплантированной ткани.

Сохранение в трансплантатах признаков продолжающегося роста и развития нервных отростков и отдельных глиоцитов на общем фоне высокого уровня зрелости ткани, а в долгоживущих трансплантатах — одновременное присутствие ультраструктурных показателей дегенеративно-регенеративных процессов.

Усиление транспортно-метаболических коммуникаций и внесинаптических взаимодействий между нервными и глиальными клетками в условиях дефицита специфических синаптических влияний в трансплантатах, особенно в интраокулярных.

Возможность образования неспецифических синаптических контактов аксонами гранулярных клеток зубчатой фасции на нейронах неокортекса, с которым в норме эта структура не имеет связей.

В дополнительной серии экспериментов выявлена нормализация уровня сахара в моче и крови у реципиентов с аллоксановым диабетом после трансплантации эмбриональной поджелудочной железы в переднюю камеру глаза и в желудочки мозга. Приоритет этих данных подтвержден авторским свидетельством и патентом.

4. Теоретическое и практическое значение работы.

Полученные данные расширяют представления об особенностях развития и высокой пластичности нервной ткани и могут быть использованы в теоретических курсах по нейроонтогенезу, регенерации и трансплантации. Кроме того, результаты настоящего исследования важны для оценки перспектив нейротрансплантации и должны учитываться при ее клиническом использовании для восстановления поврежденных функций мозга. В частности, наши данные могут быть полезны при разработке оптимальных условий для приживления, роста и интеграции трансплантатов. Показанные нами высокая степень воспроизведения микроскопических и ультраструктурных характеристик трансплантированной ткани и образование межнейрональных связей со всеми признаками функциональных синапсов свидетельствуют о возможности использования трансплантатов в случаях, когда требуется точное восстановление структурной организации мозга. Наши результаты показывают, что возраст пациентов не является препятствием для применения трансплантационной терапии. Однако необходимо учитывать, что способность трансплантированных нейронов в отсутствие их специфических мишений устанавливать синаптические контакты на атипичных нейрональных мишенях может приводить и к нежелательным функциональным взаимодействиям. В условиях недостаточной афферентации трансплантатов или их полной изоляции могут формироваться эпилептические очаги. Для практической медицины могут быть полезными также данные о компенсации экспериментального диабета путем трансплантации эмбриональной поджелудочной железы.

5. Основные положений, выносимые на защиту.

1. Эмбриональная нервная ткань, помещенная в переднюю камеру глаза и в мозг, приживается, дифференцируется и сохраняется длительное время (соизмеримое с жизнью животного-реципиента). При этом трансплантаты воспроизводят основные микроскопические, морфомегрические и ультраструктурные особенности соответствующей области мозга.

2. Нервные и глиальные элементы в трансплантатах в целом демонстрируют высокую степень зрелости. Вместе с тем концевые отделы отдельных аксонов и дендритов, а также отдельные глиальные клетки имеют морфологические признаки незрелости или продолжающегося роста. В долгоживущих трансплантатах на уровне нервных отростков происходят параллельно идущие регенеративно-дегенеративные процессы. Некоторые нейроны и их органеллы проявляют признаки повышенной функциональной активности.

3. Возраст донорской эмбриональной ткани, возраст реципиента и принадлежность донора и реципиента к одной или разным генетическим линиям оказывают влияние на рост, развитие и цитоархитектонику трансплантатов. Степень интеграции трансплантатов с мозгом положительно коррелирует с числовой плотностью нейронов и влияет на соотношение как ГАМКергических, так и не содержащих ГАМК нейронов.

4. Нейропиль трансплантатов в целом характеризуется нормальным соотношением глиальных и нервных элементов, в том числе, и синаптических окончаний; большинство синапсов имеет типичное для исследованных структур мозга строение и распределение по сомадендритной поверхности. Нормальная плотность синаптических контактов свидетельствует об их достаточно высокой степени генетической детерминированности.

5. Вместе с тем в трансплантатах могут формироваться неспецифические синаптические контакты. Многие межнейронные связи в изолированных от мозга интраокулярных трансплантатах являются внутренними (аутентическими) или формируются врастающими из радужной оболочки периферическими нервными волокнами. В интракортикальных трансплантатах (особенно в гетеротопических) часть синапсов также образована несвойственными для нейронов афферентами.

6. Гранулярные нейроны гетеротопических интракортикальных трансплантатов зубчатой фасции формируют неспецифические синаптические контакты на атипичных клеточных мишенях самого трансплантата и соседнего неокортекса. Гигантские синапсы мшистых волокон воспроизводят свои уникальные структурные особенности, но при этом проявляют признаки усиления метаболических, регуляторных коммуникаций.

7. Недостаток адекватной афферентации в трансплантатах компенсируется усилением транспортно-метаболических и несинаптических форм межклеточных взаимодействий (микропиноцитоз, микрофагоцитоз, коммуникации через щелевые и десмосомоподобные соединения).

8. Возможность функциональной интеграции трансплантатов с соседними структурами может зависеть от клеточной организации краевой зоны. На поверхности трансплантатов т оси1о и на границе с мозгом реципиента интракортикальных трансплантатов могут формироваться зоны, препятствующие или способствующие проникновению нервных волокон. Прорастающие через границу пучки аксонов и дендритов сопровождаются отростками волокнистых астроцитов.

9. В интраокулярных трансплантатах с нормальным соотношением нервных и глиальных элементов кровеносные капилляры обладают всеми морфологическими признаками гемато-энцефалического барьера. В то же время в местах с преобладанием глиальных элементов барьерные свойства сосудистой стенки снижены, а в скоплениях клеток ретикуло-эндотелиальной системы барьер отсутствует. Нервная ткань является индуктором формирования гемато-энцефалического барьера.

6. Апробация работы и публикации.

Материалы работ по теме диссертации были доложены на: Всесоюзной конференции "Физиология и биохимия медиаторных процессов" (Москва, 1976); Всесоюзной конференции "Метаболизм белков центральной нервной системы" (Днепропетровск, 1978); IV Всесоюзной конференции "Память и следовые процессы" (Пущино,

1979); Рабочем совещании "Ультраструктура нейронов и фармакологические воздействия" (Пущино, 1980); 2-ом Рабочем совещании "Ультраструктурные исследования пластичности нейрона" (Пущино, 1982); 1 Всесоюзном симпозиуме "Возбудимые клетки в культуре ткани" (Пущино, 1984); 1-ом Международном симпозиуме "Transplantation in the mammalian CNS" (Лунд, Швеция, 1984); Международном симпозиуме "Neuroontogeneticum 4" (Прага, Чехословакия, 1985); 1-ом Рабочем совещании по трансплантации нервной ткани (Пущино, 1985); Всесоюзной конференции "Механизмы динамической локализации и компенсации функций ЦНС" (Ереван, 1986); XV съезде Всесоюзного физиологического общества им. И.П.Павлова (Кишинев, 1987); Всесоюзном симпозиуме с международным участием "Трансплантация ткани мозга млекопитающих" (Пущино, 1988); Third International Symposium on Neurai Transplantation (Кембридж, Великобритания, 1989); Soviet-Indian Symposium on Neurotransplantation and Developmental Neurobiology (Пущино, 1991); Ежегодной научной конференции ИТЭБ РАН (1995); Совещании российской научной школы "Роль межклеточных взаимодействий в протекании основных тканевых процессов" (Пущино, 1997; 1998).

Апробация диссертации состоялась на межлабораторном научном семинаре.

Публикации. По результатам выполненных исследований в отечественных и международных изданиях опубликовано 46 работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Большинство опытов по трансплантации было проведено на крысах породы Вистар. В основном в качестве реципиентов использовали взрослых самцов массой 200-250 г, однако при изучении возрастного фактора сравнительные эксперименты проводили на молодых (21 дн., 150 г.) и старых (18 мес., 300-400 г.) животных. Специальные эксперименты по межлинейной трансплантации были проведены на молодых и старых реципиентах инбредной линии WAG. В качестве донорского материала служили кусочки эмбрионального мозга из септальной области, гиппокампа (без зубчатой фасции), зубчатой фасции и неокортекса, взятых от 16-18 дневных (или 20 дн. для зубчатой фасции) эмбрионов, или мозга крысят первого дня после рождения. 'Большая часть трансплантатов была исследована через 3-4 мес. после пересадки, что соответствует срокам достижения тканью in situ взрослого дифференцированного состояния. Некоторые трансплантаты изучали через 6, 9, 12 и более месяцев. Всего в работе было изучено около 250 трансплантатов. Для сопоставления и сравнения морфологических результатов использовали также соответствующие структуры нормального мозга.

Методика трансплантации. В стерильных условиях самке-донору под глубоким нембуталовьш наркозом делали кесарево сечение и брали эмбрион. После промывки в растворе Игла извлекали мозг, затем в таком же растворе под стереомикроскопом выделяли эмбриональные закладки необходимых областей мозга. Трансплантацию в переднюю камеру глаза проводили под эфирным наркозом. Перед операцией реципиенту капали в глаз каплю 0.1% атропина для расширения зрачка и одну-две капли дикаина для местной анестезии. В роговице делали небольшой разрез и через него в ПКГ вводили эмбриональную ткань объемом около 1мм3 с помощью шприца со стеклянным капилляром. Трансплантацию в мозг проводили под общим (иембутал, внутрибрюшинно, 30-40 мг/кг веса) и местным наркозом (0.5-2.0% новокаин, подкожно). Животное закрепляли в стереотаксическом аппарате. С помощью бормашины в черепе делали ответстие диаметром 2-3 мм над первичной соматосенсорной корой, снимали твердую мозговую оболочку и, используя вакуумный насос, отсасывали небольшой объем серого вещества коры. В полученную ямку помещали трансплантат и закрывали пористой кровоостанавливающей губкой. При интрапаренхимальной трансплантации эмбриональную ткань вводили в мозг реципиента с помощью микрошприца. Большинство операций по трансплантации было проведено совместно с А.Г. Брагиным.

Морфометрический анализ. Прижизненные измерения объема внутриглазных трансплантатов и определение их формы производили транскорнеально под бинокуляром, ограничивая движения животных слабым эфирным наркозом, через каждую неделю и окончательно при взятии материала для гистологического анализа. Для компьютерного анализа площадей тел и ядер пирамидных нейронов проводили микросъемку клеток на гистологических препаратах и объектмикрометра при одинаковом увеличении микроскопа (объектив 40х, окуляр 7х). Негативные изображения анализировали на вычислительном комплексе системы "Image analysis". Программа обработки, составленная В.И.Хачко, позволяла получать параметры площадей каждого поперечного сечения тела и ядра нейронов в истинных размерах (мкм2) и их средние статистические значения по каждой серии экспериментов. На основании данных строились гистограммы распределения индивидуальных размеров. Достоверность различий во всех морфометрических исследованиях оценивали по критерию Стьюдента.

Для гистологических исследований интраокулярные трансплантаты вместе с участком радужной оболочки фиксировали смесью спирта, формалина и уксусной кислоты в соотношении 17:2:1 или жидкостью Карнуа; заливали в парафин или полиэтиленгликоль с целлоидином. Гистологические срезы окрашивали крезилвиолетом по

РОССИЙСКАЯ . ГОСУДАРСТВЕННАЯ : БИБЛИОТЕКА

Нисслю или раствором галлоцианина с хромовыми квасцами по Эйнарсону (Роскин, Левинсон, 1957).

Для электронно-микроскопических исследований материал фиксировали 2.5% раствором глутарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере при рН 7.2. Дня фиксации интраокулярных трансплантатов крыс-реципиентов анестезировали эфиром, разрезали роговицу и суперфузировали фиксирующим раствором ПКГ с находящимся в ней трансплантатом в течение 20-30 мин. Животных с интракортикальными трансплантатами после предварительного введения гепарина (2500 ед. в 0.5 мл, внутрибрюшинно) под эфирным наркозом перфузировали через сердце сначала физиологическим раствором, а затем глутаровым альдегидом (30 мин.). В том и другом варианте после выделения трансплантатов их дополнительно дофиксировали погружением в тот же фиксатор (2-3 часа), разрезали на маленькие кусочки (или 500 мкм срезы) и постфиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия. Далее проводили стандартную обработку материала и заливку в эпон 812. Ориентацию блоков и выбор участка для ультрамикротомирования производили на полутонких срезах, окрашенных смесью метиленовой сини и буры. Срезы, полученные на ультратоме фирмы LKB, контрастировали насыщенным водным раствором уранилацетата и цитратом свинца. Препараты просматривали и фотографировали в электронных микроскопах Tesla BS 513, Tesla BS 613, JEM-7A и JEM-100B.

Цитохимическое выявление моноаминергических синапсов проводили с помощью хромаффинной реакции (Tranzer, Richards, 1976). Маленькие кусочки ткани фиксировали смесью равных объемов 1% раствора глутаральдегида и 0.4% раствора параформальдегида на 0.1М хромат-бихроматном буфере (рН 7.2), инкубировали в течение суток в 0.2М растворе того же буфера (рН 6.0) и дофиксировали 2% раствором четырехокиси осмия на 0.1 М хромат-бихроматном буфере (рН 7.2). Все операции проводили на холоду. Затем материал по обычной методике дегидратировали и заливали в эпон для электронно-микроскопического исследования. Контрольные эксперименты по отработке метода были проведены на хвостатом ядре мозга и надпочечнике in situ.

Иммуногистохимическое выявление ГАМКергических клеток производили после транскардиальной перфузии реципиентов фиксатором, состоящим из 2,5% параформальдегида и 1% глутаральдегида на 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.2). Ткань с помощью вибротома разрезали на 500 мкм срезы и дофиксировали сначала в том же растворе (12 час., 4 С), а затем в четырехокиси осмия (1,5 час., 4°С), дегидратировали и заливали в эпон 812. Иммуногистохимическое окрашивание проводили на полутонких эпоновых срезах с использованием первичных антител к ГАМК, согласно метода Somogyi et al., (1985). Реакцию и компьютерную морфометрическую обработку этого материала с помощью специализированной установки "Нфагс!

§кагег" (определение числовой плотности и диаметра ГАМК(-) и ГАМК(-) нейронов) проводили в лаборатории проф. Й.Хамори (Венгрия, Семмелвейский университет). "Коэффициент интеграции" трансплантатов с мозгом вычисляли как отношение длины участков полного слияния (без глиапьного рубца) трансплантированной ткани и мозга реципиента к общей протяженности их гистологического контакта.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Характеристика трансплантируемой эмбриональной ткани мозга.

Исследованы эмбриональные закладки септальной области, гиппокампа и соматосенСорной коры 17-18 дневных эмбрионов крысы. Светомикроскопический анализ проведен на полутонких (1-2 мкм толщиной) срезах с образцов, залитых в эпон, после окраски метиленовым или толуидиновым синим. Во всех трех структурах ткань имеет идентичный вид. Она плотно заполнена клетками с большими округлыми или слегка вытянутыми ядрами, некоторые из которых глубоко рассечены инвагинациями ядерной мембраны. Часть клеток имеет ядра неправильной угловатой или бобовидной формы. Кариоплазма слабо базофильна, но на ее фоне четко выделяются интенсивно окрашенные контуры ядер и ядрышки, количество которых в некоторых клетках достигает 5-7 штук. Многие ядрышки располагаются по периферии ядра. Цитоплазма очень светлая, Нисслевских тел не содержит. Объем ее несколько варьирует в разных клетках.

При электронно-микроскопическом анализе эмбриональной ткани гиппокампа и септума, используемой для трансплантации, показано, что популяция нейробластов неоднородна и различается по степени дифференцировки цитоплазмы. Одни клетки имеют светлую цитоплазму с малым количеством органелп, которая узким ободком окружает ядро. Они тесно прижаты друг к другу или разделены одиночными элементами нейропиля. Другие клетки имеют более обширную цитоплазму и друг от друга отделяются значительными нейропильными зонами. Эти клетки содержат разнообразные органеллы, в том числе и микротрубочки. Синтетический аппарат клеток состоит в основном из свободных и собранных в розетки рибосом. Шероховатый эндоплазматический ретикулум развит слабо и представлен лишь отдельными цистернами. Хорошо различаются места отхождения цитоплазматических отростков, имеющих неровные контуры. Наблюдается еще одна разновидность клеток, отличающихся более электронноплотной цитоплазмой, хорошо развитым аппаратом Гольджи и содержанием многочисленных лизосом.

Нейропиль состоит из разнообразных отростков, однако большинство из них еще нельзя квалифицировать как глиальные, дендритные или аксональные. Все они имеют полупустую цитоплазму, включающую в себя какой-то волокнистый материал и отдельные вакуоли. Только в отдельных профилях можно различить микротрубочки или группы везикул, по размеру соответствующие синаптическим. Настоящих синаптических контактов не наблюдается ни на соме, ни на дендритах. Однако в отдельных случаях по характерному расположению соседних отростков можно определить начало формирования функциональной связи. Изредка обнаруживаются профили, содержащие по несколько крупных везикул с электронноплотным центром, и не имеющие специализированных контактов.

В эмбриональной ткани неокортекса произведен морфометрический анализ общей плотности клеток в 1 мм3 ткани, а также определено соотношение ГАМКергических [ГАМК(+)] и не содержащих ГАМК [ГАМК(-)] элементов. Эмбриональная ткань содержит в среднем 710526±185260 ГАМК(-) и 62542±25010 ГАМК(+) клеток, т.е. число ГАМК(+) элементов составляет 8.8% от общей клеточной популяции. ГАМК(+) клетки распределены неравномерно, их максимальная плотность наблюдается в поверхностной зоне кортикальной пластинки. По сравнению с этим во взрослом неокортексе число ГАМК(-) нейронов в 1 мм3 составляет 41708±7816, а ГАМК(+) — 5605±1353, что соответствует 11.8% общей плотности нейронов. Далее эти показатели использованы для сравнения числовой плотности тех и других клеток в трансплантатах разных типов (см. табл. 2).

2. Развитие и дифференцировка трансплантатов эмбриональной нервной ткани в условиях изоляции от мозга - в передней камере глаза.

Для выяснения значения эндогенных и экзогенных факторов в развитии нервной ткани проводили исследование интраокулярных трансплантатов, развивающихся в полной изоляции от мозга. В этой серии экспериментов сравнивали развитие трансплантатов гиппокампа (ТГ) и септума (ТС), которые in situ имеют принципиально разную цитоархитектонику: гиппокамп — слоистая структура, с четко выявляемым слоем пирамидных нейронов; септум организован по ядерному типу, в котором мультиполярные нейроны распределены диффузно.

Приживление и общая организация трансплантатов гиппокампа и септума в ПКГ. В первые 2-3 суток после пересадки эмбриональной ткани в ПКГ наблюдается реакция глаза на трансплантат, выражающаяся в помутнении внутриглазной жидкости. Затем внутриглазная жидкость становится прозрачной; на 4-5 сутки края у трансплантатов становятся ровными и к ним начинают прорастать сосуды от радужки. Форма и размеры большинства трансплантатов стабилизируются к 1.5-3 месяцам после пересадки. Однако некоторые из них (в основном ТГ) изменяют свою форму в течение 6 месяцев. ТС имеют преимущественно округлую форму, а ТГ — вытянутую (рис.1). Некоторые ТГ удивительно напоминают форму гиппокампа крысы, развивающегося в нормальных условиях, хотя значительно меньше по размерам. У 70% ТС отношение длины к ширине равно единице, а в 92% ТГ оно достигает 2.0 и более. Различия формы ТС и ТГ статистически достоверны (р<0.01).

Рис. 1 Общий вид трансплантатов гиппокампа и септума в передней камере глаза крысы. Масштаб 2 мм.

ТГ имеют ббльшую площадь контакта с радужной оболочкой. Они всегда контактируют с ней своей вогнутой (in situ связанной с фимбрией) поверхностью, в то время как их выпуклая поверхность ориентируется в сторону роговицы. По всей границе с радужной оболочкой многочисленные кровеносные сосуды почти параллельными рядами врастают внутрь ТГ, а также оплетают его сверху. Сферические ТС обычно прикрепляются к радужке ограниченной зоной в виде соединительного стебелька, по которому в ТС врастают \-2 крупных кровеносных сосуда, далее разветвляющиеся без особой ориентации.

Цитоархитектоника ТГ и ТС. Клеточный состав трансплантатов исследовали через 3-4 месяца развития в ПКГ. Распределение и соотношение нервных и глиальных клеток в ТС и ТГ различны. В ТС нейроны имеют мультиполярную форму и обычно располагаются диффузно, без какой-либо ориентации. Однако в некоторых трансплантатах выявлена отчетливая тенденция к формированию небольших плотных нейронных скоплений.

Во многих ТГ большинство нейронов имеет пирамидальную форму и образует слой, как в гиппокампе in situ. Слой клеток располагается параллельно плоскости радужки, причем пирамидные нейроны всегда ориентированы апикальными дендритами к радужке, а базальными — к роговице. Более крупные и более мелкие пирамидные нейроны, соответствующие полям СА3 и CAi гиппокампа, пространственно разделены. Однако плотность нейронов в клеточном слое значительно ниже, чем в гиппокампе in situ. Области, занятые разветвленными апикальными и базальными дендритами, содержат лишь разбросанные корзинчатые и смещенные пирамидные нейроны, которые в целом не нарушают слоистой организации ТГ. В результате этого на гистологических срезах, сделанных перпендикулярно радужке, выявляются типичные для гиппокампа цитоархитектонические слои: str. pyramidale, состоящий из тел пирамидных нейронов; str. radiatum, образованный слоями апикальных дендритов, которые затем разветвляются на первичные и вторичные ветви, формируя str. lacunosum-moleculare; базальные дендриты размещаются в str. oriens. Однако в ТГ не воссоздается str. alveus, который в нормальном гиппокампе представляет собой зону упорядочений расположенных аксонов пирамидных клеток. Нейроны, находящиеся вне слоя, имеют неправильную, многоотросчатую форму.

В обоих видах трансплантатов нейроны располагаются в более центральных частях. Плотность глиальных клеток, наоборот, несколько возрастает на периферии и снижается в облаетях, занятых нейронами.

Вся поверхность трансплантатов, обращенная в ПКГ, покрыта сплошным слоем глиальных клеток, который обычно толще в ТС. Глиальная оболочка трансплантатов соединяется с передним эпителием радужки, а если трансплантат разрастается до роговицы, то и с эпителием задней поверхности роговицы. Глиально-эпителиальное покрытие прерывается в областях прикрепления трансплантатов к радужной оболочке, где ее сосудистый слой непосредственно соединяется с трансплантированной нервной тканью.

В трансплантатах всегда присутствует незначительное количество клеток соединительной ткани — макрофаги, фибробласты, лимфоциты, зернистые и незернистые лейкоциты, тучные клетки. Они образуют небольшие агрегаты на границе с радужной оболочкой, а также в кровеносных сосудах и их периваскулярных пространствах. Единичные клетки наблюдаются в паренхиме транспланатов и в самой ПКГ.

Иммуногистохимическое выявление ГАМКергических нейронов в интраокулярных трансплантатах неокортекса. Для определения степени воспроизведения нейрохимического паттерна трансплантированной ткани проведен сравнительный количественный анализ ГАМК(+) и ГАМК(-) нейронов в трансплантатах соматосенсорной коры in oculo и соответствующей области неокортекса in situ. Иммунопозитивные нейроны обычно распределены равномерно, лишь иногда образуя небольшие скопления. Форма их перикарионов чаще овальная, хотя встречаются и мультиполярные или пирамидоподобные клетки. У многих нейронов видны отходящие ГАМК(+) отростки; большое количество таких отростков, перерезанных в разных направлениях, находится между клетками. Подсчет числа нейронов в единице объема трансплантированной ткани (1 мм3) показывает сниженное количество как ГАМК(+), так и ГАМК(-) клеток по сравнению с неокортексом in situ. Так, плотность иммунопозитивных клеток в трансплантатах равна лишь 296±96, а иммунонегативных — 33272±5428, что соответствует 6% и 79% от нормы. Диаметр ядер ГАМКергических нейронов в интраокулярных трансплантатах составляет 11.8±2.3 мкм, а тел — 25.3±2.0 мкм, что достоверно больше, чем в интактном неокортексе (9.5±1.5 мкм и 16.7±1.6 мкм, соответственно). Увеличенные размеры в интраокулярных трансплантатах имеют также и ГАМК(-) клетки; средний диаметр их ядер, составляющий 10.4±0.6 мкм, превышает таковой в контрольном неокортексе (8.6+0.5 мкм; р<0.001).

Таким образом, морфометрический анализ показал, что в трансплантатах сомато-сенсорной коры, развивающихся в ПКГ, изолированно от мозга, плотность ГАМК(-) и особенно ГАМК(+) нейронов значительно ниже, чем в нормальном неокортексе. В то же время размеры тех и других нервных клеток гипертрофированы. Эти данные свидетельствуют о том, что при развитии нервной ткани в условиях изоляции от мозга, сопровождающимся формированием аномальных функциональных связей, происходит нарушение соотношения возбуждающих и тормозных нейронов.

3. Факторы, влияющие на морфометрические характеристики интраокулярных трансплантатов и их нейронов.

Эта серия экспериментов проведена для выявления возможных стимулирующих или угнетающих влияний на приживление, развитие и дифференцировку трансплантатов как со стороны самой эмбриональной ткани, так и со стороны организма, получающего трансплантат. Эмбриональная ткань, обладая в целом высоким содержанием нейротрофических факторов, отличается по потенциям к росту в разные возрастные периоды и в разных отделах мозга. В свою очередь, организм реципиента также оказывает трофические и гуморальные влияния, а из-за ограниченности гисто-гематических барьеров и иммунологические воздействия на трансплантат.

Влияние эмбрионального возраста трансплантируемой ткани на объем трансплантатов гиппокампа и септума. Морфометрические измерения проведены на трансплантах, развивающихся в ПКГ в течение 3-4 мес. Максимальный прирост объема ТС (400%) происходит в том случае, если он берется на 16-е сутки развития. Размеры трансплантатов из ткани, взятой на 18-е сутки эмбрионального и 1-е сутки постнатального периодов развития, меньше соответственно на 37 и 63%. Максимум прироста ТГ наблюдается при его взятии на 16-е и 18-е сутки эмбрионального развития (до 800%), но даже у трансплантатов, взятых на 1-е сутки постнатального периода, объем увеличивается на 75%. В целом в любой из исследованных сроков при одинаковом объеме исходного материала ТГ всегда больше, чем ТС. Таким образом, конечные размеры трансплантатов зависят от возраста эмбриона-донора, однако для разных структур эта зависимость, по-видимому, устанавливается в соответствии со сроками пролиферации основных клеточных элементов.

Влияние возраста реципиента на морфометрические характеристики пирамидных нейронов гиппокампа в интраокулярных трансплантатах. В связи с проблемой возможности использования нейротрансплантации для терапии заболеваний мозга при старении (деменция, болезнь Альцгеймера) встает вопрос, не будут ли трансплантированные эмбриональные клетки вовлекаться в ускоренные процессы дегенерации в старом организме. Для его решения проведено сравнительное исследование пирамидных нейронов в трансплантатах, развивающихся в течение 1,5 мес. в ПГК молодых (3 нед.) и старых (18 мес.) крыс Вистар. Поскольку предполагается разная устойчивость клеток поля CAi и поля СА3 гиппокампа при естественном старении, предварительно проанализировали изменения их параметров у молодых и старых животных in situ. Результаты морфометрирования тел и ядер нейронов поля СА( и поля СА3 в гиппокампе in situ и в его трансплантатах представлены в форме гистограмм распределения площадей сом нейронов (рис.2).

Морфометрия клеток СА, и CA-i в гиппокампе in situ у молодых и старых животных отражает хорошо известные различия размеров пирамидных нейронов СА] и СА3 со значительно большими (вдвое) размерами тел клеток в СА3 и их более широким распределением; то же касается различий ядер. При сравнении по возрастным группам анализ показывает, что средние размеры нейронов поля СА, у старых животных достоверно меньше, чем у молодых: площадь сечений сом уменьшается на 14.4%, а ядер на 9.1%. Гистограммы распределения площадей сом у тех и других животных имеют компактную унимодальную форму, однако у молодых пик значений лежит в области 150-200 мкм2, а у старых — в области 125-175 мкм2. Средние значения размеров клеточных тел и ядер пирамидных нейронов поля СА? животных обеих возрастных групп статистически не различаются. Тем не менее, существенные изменения наблюдаются в форме гистограмм распределения площадей сом нейронов СА3: у старых животных распределение бимодальное. Довольно широкий пик с центром 375 мкм2, наблюдаемый у молодых животных исчезает, а вместо него появляются два пика в областях 300 и 425 мкм2.

Рис.2 Распределение пирамидных клеток CAI и САЗ в гиппокампе in situ и в трансплантатах гиппокампа in oculo у молодых и старых реципиентов. Абсцисса размер клеточных тел в мкм; ордината - число измеренных клеток; Г - гиппокамп in situ; Т - трансплантат гиппокампа; CAI, САЗ - пирамидные нейроны соответствующих полей гиппокампа; М молодые реципиенты; С -старые реципиенты. В скобках для каждой группы указаны средние значения площадей сом. Шаг - 25 мкм.

200 *» еоо Сравнение нейронов in situ и в трансплантатах гиппокампа у молодых и старых реципиентов. Средний размер трансплантированных клеток поля CAi^ достоверно увеличен по сравнению с нормальным гиппокампом у реципиентовобеих возрастных групп. Так, в трансплантатах молодых реципиентов средняя площадь клеточных тел и ядер больше на 12.1%, а у старых реципиентов площадь сом больше на 27.7%, а ядер — на 15.3%. Хотя все гистограммы распределения клеток CAi имеют сходную унимодальную форму, видно, что для клеток трансплантатов как молодых, так и старых животных, их пики смещены в область более высоких значений, чем в гиппокампе in situ.

Различия средних размеров клеток поля СА^ в трансплантатах значительно менее выражены. Так, достоверное увеличение площади клеток СА3 (на 6.0% против 12.1% для CAO обнаружено только для клеточных тел в трансплантатах молодых животных. У старых реципиентов достоверного отличия средних значений площадей сом и ядер не выявлено. Вместе с тем, гистограммы распределения индивидуальных площадей пирамидных нейронов СА3 в трансплантатах молодых и старых реципиентов существенно отличаются от гистограмм, построенных для клеток гиппокампа in situ. Гистограмма распределения клеток в трансплантатах молодых реципиентов, хотя и сохраняет пик в той же области, что и в гиппокампе in situ (350 мкм2), но имеет более пологий правый фронт, свидетельствующий о наличии нейронов с максимально крупными размерами. Бимодальное распределение индивидуальных площадей нейронов, характерное для старых животных in situ, в трансплантатах становится унимодальным, что свойственно для этих клеток у молодых реципиентов.

При сравнении развития нейронов в трансплантатах двух возрастных групп у молодых животных выявлены лишь ббльшие размеры ядер клеток САь показатели незначительной гипертрофии сом клеток СА3 статистически не достоверны.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что клетки полей CAi и СА3 в трансплантированной ткани воспроизводят нормальные морфометрические характеристики, реализуя свой генетический потенциал в условиях полной изоляции от мозга. Вместе с тем, параметры клеток СА| более подвержены изменениям как при естественном старении, так и при трансплантации. Старый возраст реципиента, в целом, не оказывает существенного влияния на развитие трансплантированных клеток обоих типов.

Влияние возраста реципиента и генетических различий донора и реципиента на рост интраокулярных трансплантатов гиппокампа. В этой серии экспериментов исследовали значение гуморальных влияний реципиента, обусловленных изменениями его метаболизма при старении и принадлежностью к иной, чем донор, генетической линии. В качестве донорского материала использовали эмбриональную ткань гиппокампа крыс Вистар (в стадном разведении). Трансплантацию производили в ПКГ крыс-реципиентов той же породы или инбредной линии WAG (ВАГ-производная популяции крыс Вистар) в возрасте 21 день (молодые) и 18 месяцев (старые). Таким образом, в эксперименте было 4 группы реципиентов с трансплантатами гиппокампа (ТГ): молодые Вистар (мВИС), старые Вистар (сВИС), молодые ВАГ (мВАГ), старые ВАГ (сВАГ). Наблюдения проводили на 3, 6 и 12 неделе после трансплантации.

Общие характеристики ТГ. Начальное приживление и васкуляризация ТГ происходит в 100% случаев. У обеих групп ВИС подавляющее большинство ТГ (89%) постепенно приобретает вытянутую, эллипсоидную форму. В обеих группах ВАГ число удлиненных ТГ значительно меньше (58%), остальные ТГ имеют округлую форму. Иногда на более поздних стадиях развития трансплантат распадается на изолированные фрагменты. Такая фрагментация сильно выражена в грушах ВАГ (30-33%). У групп ВИС полная фрагментация наблюдается лишь в единичных случаях (11-18%).

Анализ цитологической организации ТГ выявляет принципиальные различия между тканью, развивающейся в ПКГ реципиентов групп ВИС и ВАГ, независимо от их возраста. У всех животных группы ВИС, за исключением двух (6%), в ТГ хорошо развитые пирамидные нейроны гиппокампа организованы в слой. Существенных различий между группами мВИС и сВИС по длине слоя и плотности нейронов в нем не обнаружено. Однако, у мВИС значительно больше площадь краевых зон трансплантатов, занятых диффузно расположенными нейронами и глиальными элементами. Из всех крыс группы ВАГ организованный слой клеток ТГ обнаружен только у одного животного. У всех остальных (94%) нейроны расположены диффузно и не имеют ориентации. У некоторых животных этих групп в ТГ обнаружены лишь немногочисленные группы нейронов или только глиальные клетки.

Рис.3 Распределение средних объемов трансплантатов гиппокампа (в мм3) у животных разных групп в 3, 6 и 12 нед. после трансплантации. Светлые столбики - 3 нед, косая штриховка - б нед, двойная косая штриховка - 12 нед. после трансплантации. Индексы групп указаны под диаграммами. М -молодые реципиенты; С - старые реципиенты; ВИС - крысы Висгар; ВАГ -крысы породы У/Ав.

Динамика роста ТГ представлена на рис.3. У группы мВИС через 3 нед. после трансплантации половина ТГ не увеличивает или незначительно увеличивает объем, однако остальные ТГ обнаруживают быстрый рост. В среднем происходит увеличение объема трансплантируемой ткани вдвое (2.48±0.46 мм3). В 6 недель число ТГ, существенно не возрастающих по объему, у мВИС остается очень небольшим. Средний объем составляет 5.53±0.97 мм3, а максимальные размеры достигают 8.0 мм3. У группы сВИС в начальный период (3 нед.) ТГ, незначительно изменяющие объем, составляют большинство. Максимальные размеры ТГ достигают всего 4 мм3, хотя их средняя величина (1.9310.47 мм3) недостоверно отличается от этого показателя для группы мВИС. Однако в 6 недель доля слаборастущих ТГ снижается и появляется группа ТГ со значительно увеличившимися размерами. При этом средний объем возрастает вдвое (3.88+0.82 мм3), а максимальный достигает 6 мм3. В группе мВАГ в 3 нед. ТГ отчетливо делятся на две группы, одна из которых совсем не увеличивается или даже несколько уменьшается в объеме, а другая довольно быстро растет, достигая максимальных размеров 4-5 мм3. Средний объем, однако, незначительно превышает объем трансплантированной ткани (1.6710.55 мм3). В последующие сроки значительных изменений распределения объемов, их максимальных и средних показателей не происходит. В группе сВАГ распределение объемов в 3 нед. очень близко к тому, которое наблюдается у мВАГ; при большом числе ТГ, которые не увеличиваются в размерах и даже обнаруживают признаки инволюции, средний объем ТГ у сВАГ составляет всего 1.23±0.35 мм3, что недостоверно отличается от исходного объема. Однако в 6 нед. количество относительно хорошо растущих ТГ увеличивается; отдельные трансплантаты достигают объема 4 мм3, а средний показатель — 1,62±0.49 мм3.

В целом анализ показывает, что рост ТГ во всех группах в основном заканчивается к 6 нед.; при измерении в 12 нед. изменений практически не обнаруживается. Диаграммы распределения индивидуальных объемов во всех вариантах эксперимента отражают наличие групп нерастущих и быстрорастущих ТГ. При этом доля ТГ, не увеличивающихся в размерах, у реципиентов ВИС составляет 16-23%, а у реципиентов ВАГ — 43-45%.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что старение существенно не отражается на развитии и дифференцировке трансплантированной эмбриональной ткани. Вместе с тем, по-видимому, у молодых животных в начальный период присутствуют ускоряющие рост трофические влияния, которых нет у старых. Принадлежность реципиента к иной, по сравнению с донором, генетической линии приводит к резкому нарушению механизмов развития, препятствующему нормальной организации ткани, а также вызывающему снижение темпов и пределов роста трансплантатов.

4. Ультраструктурные характеристики нейронов и их отростков в интраокулярных трансплантатах гиппокампа и септума.

Проведенное нами ЭМ изучение морфологии нейронов и синапсов гиппокампа и других структур мозга in situ позволило при анализе трансплантатов обратить особое внимание на ультраструктурные особенности, которые отсутствуют или очень редко встречаются в нормально развивающемся мозге. Кроме того, морфологические особенности трансплантированной ткани мы всегда сопоставляли с их функциональными характеристиками, которые выявляли в параллельно проводимых на этих же объектах электрофизиологических экспериментах (А.Г. Брагин).

Ультраструктурные особенности перикарионов. При анализе ткани через 3-4 месяца развития в ПКГ видно, что трансплантаты состоят из хорошо развитых, зрелых нейронов со всеми типичными ультраструктурными характеристиками (рис.4). Ядра в нейронах крупные, с плотным ядрышком, на их поверхности часто наблюдаются впячивания, а иногда и глубокие инвагинации внутрь кариоплазмы. В цитоплазме обнаруживаются все обычные для нейронов клеточные элементы: гранулярный и агранулярный эндоплазматический ретикулум, митохондрии, комплекс Гольджи, лизосомы, липофусциновые гранулы, микротрубочки; большие области заняты упорядоченно расположенными цистернами эргастоплазмы. Характерным признаком пирамидных нейронов является присутствие глыбки тифоида над ядром со стороны отхождения апикального дендрита.

Рис.4 Ультраструктура пирамидного нейрона в интраокулярном трансплантате гиппокампа. Я - ядро, С - аксосоматический синапс; * - место отхождения соматического шипика. Масштаб 1мкм.

Отличием трансплантированных нейронов от таковых in situ является наличие в некоторых клетках необычных модификаций эндоплазматического ретикулума в виде слоистых тел. Одни из них представляют собой пачки параллельно идущих гладкоконтурных цистерн с резко суженным просветом. Ультраструктура остальных клеточных органелл остается нормальной. В слоистых телах другой

Рис.5 Трансформация ретикулума в глад-коконтурные цистерны. Масштаб 0.5мкм. гранулярного эндо-плазматического формы параллельные ламеллы спиралевидно закручены в клубки, в центре которых обычно сохраняется островок цитоплазмы. Нейроны, содержащие такие структуры, имеют повышенную плотность цитоплазматического матрикса. Гладкоконтурные пластины в обоих типах слоистых тел переходят в цистерны шероховатого эндоплазматического ретикулума (рис.5). Встречается аппарат Гольджи с расширенными и даже вакуолизированными канальцами. Некоторые митохондрии также имеют локальные вздутия наружней мембраны. Правильная форма некоторых крупных нейронов в ТГ и ТС иногда искажается за счет образования на поверхности впячиваний разной глубины и дополнительных цитоплазматических выростов от незначительных пальцевидных выступов - до довольно длинных соматических отростков в виде микродендритов; некоторые выросты аналогичны дендритным шипикам (рис.4). Внутри соматических шипиков встречаются гладкие цистерны, пузырьки со светлой и плотной сердцевиной; типичный шипиковый аппарат никогда не идентифицируется. Соматические шипики образуют ассиметричные контакты с аксональными терминалями.

Ультраструктурные особенности дендритных отростков нейронов ТГ и ТС. Общий принцип организации дендритного дерева и субмикроскопический состав дендроплазмы в основном не отличается от нормы. Проксимальные отделы дендритов септальных нейронов и пирамидных клеток поля САЬ как и in situ, в основном лишены дендритных шипиков. Многие дендриты пирамидных нейронов поля СА3 на этом же уровне развивают уникальные, типичные для этого поля дендритные шипики с разветвленной головкой, хотя они имеют более упрощенный вид. В норме разветвленные шипики являются постсинаптическими мишенями для гигантских синапсов аксонов гранулярных клеток зубчатой фасции. В нашем материале зубчатая фасция отсутствует, и с каждой головкой такого шипика контактируют небольшие синаптические окончания неизвестной природы. Дендритные ветви третьего и более порядков в обоих типах трансплантатов буквально усеяны дендритными шипиками, которые в большинстве своем имеют очень сложную конфигурацию (рис.6). Помимо классических грибовидных форм часто встречаются шипики с заостренной, клиновидной головкой, в которых активная зона располагается на боковой поверхности. Некоторые шипики имеют дополнительные ответвления, образуя двухъярусные структуры. В то же время встречаются шипики в виде широких низких пеньков, взаимодействующие с пресинаптическим элементом большой площадью. Микровыросты от дендритных шипиков могут перфорировать активные зоны.

Рис.6 Ультраструктура дендритов (Д) и дендритных шипиков (ДШ) в интраокулярном трансплантате септума. Масштаб 1мкм.

Характеризуя дендриты в ТГ и ТС в целом, следует отметить, что они имеют более извитые поверхности по сравнению с in situ. Помимо истинных дендритных шипиков на дендритах наблюдаются многочисленные складки, вздутия, углубления, выросты разной длины. Шипиковый аппарат присутствует реже, чем в нормальной ткани. В более периферических зонах ТГ и ТС встречаются конусы роста дендритов, от поверхности которых ответвляются короткие филоподии. В цитоплазме некоторых дендритов трансплантированных клеток наблюдаются микровакуоли с неправильными контурами, а в ТС встречаются дендриты, в которых на всех уровнях ветвления преобладают микрофиламенты. Содержащиеся в них митохондрии часто имеют вакуолеобразные вздутия. В таких дендритах, кроме того, обнаруживаются везикулы, которые по размеру и внешнему виду не отличаются от синаптических. Признаков участия дендритных везикул в синаптической передаче не обнаруживается. Встречаются дендриты, проксимальные отделы которых окружены миелиновой оболочкой, морфологически не отличимой от аксональной.

Аксональные отростки в интраокулярных трансплантатах. Обзорный ультраструктурный анализ обоих типов трансплантатов свидетельствует, что уровень миелинизации аксонов в них в основном соответствует взрослому состоянию исследованных структур.

Миелинизированные волокна обычно имеют диаметр 0.8-1.0 мкм с осевым цилиндром 0.6-0.9 мкм. Как и in situ, в их аксоплазме содержатся микротрубочки, нейрофиламенты, митохондрии, цистерны агранулярного эндоплазматического ретикулума, отдельные пузырьки, мультивезикулярные тела. Мякотная оболочка в большинстве аксонов имеет строго упорядоченную компактную структуру, характерную для зрелого миелина. Вместе с тем в трансплантатах изредка обнаруживаются аксоны с незрелой миелиновой оболочкой, которая имеет всего 2-4 свободно закрученных витка с обильной глиальной цитоплазмой между ними. У некоторых миелинизированных волокон прослеживается непрерывная связь наружного витка миелиновой оболочки с плазматической мембраной миелинообразующей клетки, что в дифференцированной нервной ткани обычно не наблюдается.

Немиелинизированные аксоны (диаметром от 0.08-0.1 до 0.3-0.4 мкм) в трансплантатах наиболее многочисленны. Они составляют основу нейропильных участков и часто собираются в пучки, в которых располагаются параллельно друг другу. Самые тонкие аксоны содержат только нейротубулы, а более толстые, кроме того, — синаптические везикулы. Кроме терминальных синапсов, аксоны образуют множественные контакты по ходу, заметные по аккумуляции синаптических везикул около активных зон. Способность аксонов формировать сериальные синапсы является характерной особенностью трансплантированной нервной ткани. Многие аксоны имеют конусы роста. Их расширения содержат помимо обычных малых синаптических везикул несколько больших (90-120 нм) светлых ростовых пузырьков (рис.7). Аксоны с признаками конусов роста обычно концентрируются в определенных участках нейропиля. Многие из них образуют синаптические контакты.

Рис.7 Синаптическая тер-миналь, содержащая помимо синаптических пузырьков ростовые везикулы. Масштаб 0,25мкм

Ультраструктура синаптических окончаний, локализованных на разных локусах нейронов ТГ и ТС. Электронно-микроскопический анализ обоих типов трансплантатов показывает, что соотношение синаптических окончаний и других элементов нейропиля визуально не отличается от такового в мозге in situ и, в частности, в гиппокампе и септальной области. Распределение их по сома-дендритной поверхности и общий принцип формирования контактов также в основном соответствует норме.

Количество аксосоматических синапсов на разных нейронах варьирует. Некоторые профили перикарионов почти полностью покрыты синаптическими окончаниями, на других же они редки. Большинство бутонов имеет округлую или овальную форму размером 1-1.5 мкм. Между плотно лежащими перикарионами наблюдаются сильно вытянутые (до 4-6 мкм и более) аксосоматические терминали, образующие серию контактов попеременно на обоих соседних нейронах. В каждом пресинапсе содержится от 1 до 4 митохондрий, округлые и полиморфные везикулы (20-40 нм), а также единичные крупные гранулярные и окаймленные везикулы; пузырьки эллипсоидной формы выявляются редко. Большинство аксосоматических контактов являются, как и в норме, симметричными со слабо выраженными постсинаптическими уплотнениями (тип II по Грею) (Рис.4). Асимметричные контакты (тип I по Грею) встречаются редко, однако их больше в ТС, чем в ТГ, что также соответствует положению, существующему в нормальном мозге. На долю синапсов, локализованных на самом дендритном стволе и на дендритных шипиках приходится основная масса межнейрональных взаимодействий, Пресинаптические компоненты аксодендритных синапсов обычно умеренно заполнены круглыми и полиморфными пузырьками. Большинство бутонов имеет размер 0.5-0.8 мкм, но некоторые достигают 3-4 мкм. Количество синапсов относительно невелико на проксимальной части декдритов и возрастает по направлению к терминальным ветвям. Синапсы, локализующиеся на крупных дендритных стволах, образуют преимущественно симметричные активные зоны, а на дендритах среднего диаметра и мелких дендритных веточках встречаются и асимметричные контакты. Активные зоны синаптических окончаний, локализующихся на дендритных шипиках, всегда асимметричные и достаточно часто прерывистые (рис.8). При этом в качестве постсинаптического элемента может выступать не только головка, но и ножка дендритного шипика.

В трансплантированном материале часто наблюдаются картины, когда одно аксональное окончание контактирует с двумя различными шипиками и, наоборот, на одном дендритном шипике могут заканчиваться два или более синапсов. Аксо-аксональные синаптические контакты в трансплантатах, как и in situ, встречаются относительно редко. Они четко выявляются на начальных сегментах аксонов пирамидных нейронов ТГ. Кроме того, такие контакты обычно образуют между собой аксоны, прорастающие на поверхность интраокулярных трансплантатов. В трансплантатах изредка обнаруживаются также дендро-дендритные и

Рис.8 Синаптический контакт на дендритном шипике

Масштаб 0,5мкм. дендро-шипиковые синапсоподобные контакты. Везикулярный компонент в таких контактах обычно представлен очень скудно или не выявляется вовсе.

Таким образом, несмотря на отсутствие нормальной афферентации интраокулярных трансплантатов, электронно-микроскопический анализ показывает высокую степень воспроизведения ультраструктурных характеристик нейронов, нервных отростков и синаптических окончаний. Вместе с тем некоторые нейроны проявляют морфологические отклонения от нормы, которые могут быть обусловлены, с одной стороны, повышенной функциональной активностью, а с другой стороны, — незрелостью некоторых нервных и глиальных элементов.

5. Идентификация нервных волокон периферического типа в интраокулярных трансплантатах.

Интраокулярные трансплантаты нервной ткани полностью лишены естественных афферентных систем мозга. В них врастают и образуют синаптические контакты периферические нервы из радужной оболочки глаза реципиента. При ультраструктурном исследовании трансплантатов септума и гиппокампа в них обнаруживаются миелинизированные и немиелинизированные аксональные отростки, имеющие морфологические характеристики аксонов периферического типа.

Миелинизированные аксоны периферического типа наблюдаются вблизи кровеносных капилляров, но вне периваскулярных пространств, в зонах трансплантатов с относительно меньшим количеством нервных клеток. Они по всему периметру окружены базальной мембраной. Их осевые цилиндры значительно большего диаметра (до 4 мкм), чем в миелинизированных волокнах из участков с высокой концентрацией нервных элементов. Аксоплазма в основном заполнена нейрофиламентами. Миелиновая оболочка толстая (до 4 мкм) и очень компактная. В отличии от волокон ЦНС, внутренний и наружный витки спирали содержат обильную цитоплазму мИелинобразующей клетки с присущими ей клеточными органеллами. Кроме того, плазмалемма наружного цито плазматического витка имеет многочисленные пиноцитозные инвагинации, свидетельствующие о метаболических взаимодействиях с окружающей его базальной мембраной.

В трансплантатах встречаются также миелинизированные аксоны, сочетающие признаки периферических и центральных нервных волокон. Их относительно небольшой диаметр соответствует аксонам ЦНС, но наличие внутреннего цитоплазматического витка миелинобразующей клетки между осевым цилиндром и компактной миелиновой оболочкой сближает их с аксонами ПНС.

Немиелинизированные аксоны периферического типа.

Прорастающие в трансплантаты пучки безмякотных аксонов с морфологическими признаками периферических нервных волокон обнаруживаются в составе широкой соединительнотканной оболочки кровеносных сосудов. Количество отдельных аксонов, входящих в состав пучка, различно (от 4-5 до 20-30), диаметр осевых цилиндров от 0.15 мкм до 0.5 мкм, пучок изолирован цитоплазмой Шванновской клетки. Плазматические мембраны отростков соседних Шванновеких клеток плотно примыкают друг к другу и формируют короткие десмосомоподобные контакты. Весь пучок снаружи окружен базальной мембраной и рыхлой волокнистой соединительной тканью периваскулярного пространства. Каждый аксон в пучке (иногда 2-3 аксона вместе) располагается внутри желобка, образованного цитоплазмой той же Шванновской клетки (рис.9).

Рис.9 Пучок немиелинизированных аксонов (а) периферического типа в составе периваскулярной оболочки. Масштаб 0,5мкм.

Пучки периферических немиелинизированных аксонов, выходя из периваскулярных пространств, лишаются базальной мембраны и сливаются с нейропилем трансплантата. Электронно-микроскопически их можно идентифицировать только до тех пор, пока они находятся в комплексе со Шванновской клеткой и имеют характерные для периферических нервов морфологические особенности. Некоторые аксоны, продолжая оставаться внутри глиального желобка, содержат везикулы, характерные для синаптических окончаний. Освобождаясь, хотя бы частично, от глйальноЙ оболочки, они вступают в синаптический контакт с рядом расположенными постсинаптическими структурами. Для образования специализированного контакта аксоны могут давать боковые коллатеральные ответвления в виде синаптической терминали.

Цитохимическая идентификация моноаминергических аксонов и синапсов в ТГ. Собственных моноаминергических (МА) нейронов в гиппокампе нет. В интраокулярные трансплантаты симпатические МА волокна врастают из радужной оболочки и наиболее часто встречаются в частях, находящихся неподалеку от нее и около крупных кровеносных сосудов. При проведении специальной хромаффинной реакции для выявления МА синапсов продукт реакции выявляется в виде электронношютных зерен или гранул, заполняющих сердцевину пузырьков и мелких вакуолей. Размер пузырьков и содержащихся в них гранул сильно варьирует. По принципу преимущественного содержания тех или иных хромаффинных структур можно выделить по крайней мере три разновидности аксональных синаптических расширений.

Синаптические окончания, содержащие мелкие (диаметром 40-50 нм) гранулярные пузырьки, обычно обнаруживаются в областях хорошо развитого нейропиля. Некоторые из них образуют четкие асимметричные синаптические контакты с дендритами и дендритными шипиками, хотя наблюдаются также и аксональные расширения без синаптических активных зон. В интерварикозных участках такие аксоны не содержат синаптических везикул и имеют очень тонкий диаметр (около 0.2 мкм).

Другой тип МА аксонов содержит преимущественно большие (60-90 нм) гранулярные пузырьки. Они наблюдаются и по ходу аксона, и внутри аксональных расширений. Везикулы различаются по размерам электронногаютной сердцевины и степени ее осмиофильности. Эти синаптические окончания наблюдаются в специализированном контакте с дендритами, причем вблизи активной зоны располагается обычно группа мелких (около 40 им) светлых пузырьков (рис. 10). Аксосоматических контактов с положительной реакцией в нашем материале не наблюдается.

Третий тип МА терминалей отличается содержанием крупных (до 200-300 нм) хромаффин-положительных гранул. Реакционный продукт чаще заполняет почти всю сердцевину, оставляя прозрачным лишь небольшой ободок, но иногда занимает только незначительный объем. МА терминали этого типа не имеют выраженных активных зон. Места предполагаемых функциональных взаимодействий угадываются по аккумуляции мелких везикул в пресинапсе и характерной аппозиций пре-и постсинаптических мембран. МА аксональные расширения с крупными поверхности почти гладкоконтурны, но поверхности, обращенные в просвет капилляров, извилисты и имеют большое количество микроворсинок. Отростки соседних эндотелиоцитов обычно заходят друг за друга, образуя в местах стыков плотные соединения. Поры в эндотелиальной трубке отсутствуют. Имеется большое количество пиноцитозных пузырьков, располагающихся вдоль плазмалеммы. За слоем эндотелия следует сплошная, плотная базальная мембрана. Перициты и их отростки также имеют гладкие контуры и обладают высокой пиноцитозной активностью (рис.11). Иногда отростки перицитов располагаются в 2-3 ряда и каждый из них окружен базальной мембраной. Вокруг капилляров располагаются глиальные отростки, часто в несколько слоев, и их подстилает собственная базальная мембрана. Таким образом, вокруг многих капилляров наблюдается 3-4 слоя базальной мембраны.

Рис.11 Ультраструктура капилляра из центральной части интраокулярного трансплантата. Плотные соединения между эндотелиальными клетками обозначены стрелками. Видны многочисленные пиноцитозные везикулы. БМ - базальная мембрана. Масштаб 1мкм.

В капиллярах периферических участков трансплантатов поверхность эндотелиоцитов неровная — с многочисленными выростами и микроворсинками, обращенными как в просвет сосуда, так и к базальной мембране. Отростки соседних эндотелиоцитов соединяются конец в конец или с небольшими перекрытиями, образуя короткие плотные или десмосомоподобные контакты. В некоторых капиллярах цитолеммы эндотелиоцитов в местах стыков извитые, места контактов чередуются с расширенными межклеточными щелями, в которых наблюдаются микроворсинки. Чем более извилисты цитолеммы эндотелиоцитов, тем выше их пиноцитозная активность. Характерной особенностью этих капилляров является широкая наружная соединительнотканная оболочка. Толщина ее в разных капиллярах варьирует от 2 до 6 мкм. Базальная мембрана, подстилающая эндотелио-и перициты, непрерывная, но более рыхлая, чем в капиллярах центральных частей. Перициты в периваскулярном пространстве располагаются свободно, их разветвленные отростки направлены не только вдоль их главной оси, но и перпендикулярно ходу капилляра. В составе соединительнотканной оболочки обнаруживаются также фибробласты, макрофаги и лимфоциты. Все обширные экстрацеллюлярные промежутки заполнены коллагеновыми и эластичными волокнами и основным аморфным веществом. Резко очерченной границы между стенками капилляров и окружающей тканью, как это бывает в центральной части трансплантатов, не наблюдается. Глиальные отростки не образуют плотного перикапиллярного слоя, характерного для капилляров ЦНС, а некоторые из них проникают внутрь соединительнотканной оболочки капилляров и иногда непосредственно контактируют с отростками адвентициальных клеток, что свидетельствует об их возможных метаболических взаимодействиях. Окружающая глиальные отростки базальная мембрана в местах таких контактов отсутствует. Встречаются капилляры с очень узким просветом, в которые не проникают клеточные элементы крови.

Совершенно другой тип кровеносных капилляров обнаружен в местах скоплений клеток соединительной ткани. Помимо сильно выраженной извилистости базальных и люминальных поверхностей эндотелиальных клеток и множества микроворсинок, их эндотелий характеризуется наличием очень утонченных участков, перфораций и фенестр. По морфологическим признакам эндотелиоциты некоторых капилляров напоминают окружающие макрофаги. Их ядра — крупные, лишь слегка вытянутые, часто многолопастные с расширенными перинуклеарными пространствами. Цитоплазма характеризуется прозрачным матриксом и ячеистой формой эндоплазматической сети. В таких сосудах реже наблюдаются явления пиноцитоза, но чаще присутствуют перфорации в эндотелиальной трубке. Базальная мембрана — рыхлая, фрагментированная, в некоторых местах отчетливо не выявляется, а сливается с окружающим перикапиллярным основным веществом. Перициты в этих капиллярах представлены скудно.

Таким образом, в большей части ткани трансплантатов, имеющей высокую плотность нейронов, формируются типичные мозговые капилляры, обладающие гематоэнцефалическим барьером. Исключение составляют небольшие участки ткани с повышенным содержанием глиалъных клеток, где барьерные свойства сосудистой стенки снижены, и скопления соединительнотканных клеточных элементов, где обнаружены проницаемые фенестрированные капилляры. Кровеносные сосуды всех типов характеризуются более высоким уровнем транспортных процессов, чем капилляры мозга.

Ультраструктурная организация поверхности трансплантатов в ПКГ. Выявлены две разновидности организации глиальной оболочки вокруг трансплантатов: многослойная и однослойная. Мощная капсула, характерная в большей степени для ТС, образована из плотно расположенных рядов глиальных клеток и их отростков. На срезах, перпендикулярных поверхности трансплантатов, эти клетки выглядят длинными, тонкими, с узким ободком цитоплазмы в ядросодержащей зоне. Органеллы, среди которых наиболее отчетливо выделяется комплекс Гольджи, лизосомы и митохондрии, располагаются неравномерно и концентрируются в узких периферических частях клетки (рис.12). Гранулярно-фибриллярный матрикс придает цитоплазме

Рис.12 Глиальные клетки на поверхности трансплантата септума. Масштаб 0,5 мкм. умеренную электронную плотность. Структурной особенностью этих глиоцитов является то, что они содержат микротрубочки, которые в интактном мозге характерны для олигодендроцитов. Основную массу глиальной капсулы составляют переплетенные и наложенные друг на друга отростки этих клеток, которые в более глубоких зонах перемежаются с отростками волокнистых астроцитов. Соединения типа puncto adhaerentes скрепляют их в общий пласт. Толщина глиальной капсулы в некоторых трансплантатах достигает 20-30 мкм.

Между глиальными отростками наблюдаются группы немиелизированных, очень тонких (диаметр 0.1-0.2 мкм) нервных волокон, которые содержат нейротрубочки, а в расширенных участках — и синаптические пузырьки. Аксоны подходят непосредственно к поверхности трансплантатов и заканчиваются синаптическими бутонами, содержащими, помимо малых светлых, несколько больших светлых и электронноплотных пузырьков. Хотя во многих пресинаптических терминалях обнаружены скопления синаптических пузырьков, истинные синаптические контакты встречаются редко, иногда они четко идентифицируются как аксо-аксональные. При этом в качестве постсинаптической структуры выступают менее зрелые синаптические бутоны.

Рис.13 Фиброзный астроцит на поверхности трансплантата гиппокампа.

Масштаб 0,5 мкм.

Поверхность большинства ТГ сформирована распластанными в один ряд клетками, похожими на густо заполненные филаментами астроциты (рис.13). Мощные цитоплазматические отростки таких астроцитов в местах стыка черепицеобразно накладываются друг на друга и образуют между собой плотные скрепления или контакты типа "замков" и многочисленные пиноцитозные инвагинации. Плазмалеммы большинства тел и отростков клеток, обращенные в ПКГ, имеют небольшие, нерегулярные микровыросты. В то же время есть клетки с хорошо развитыми микроворсинками и ресничками наподобие эпендимы желудочков мозга, что способствует всасыванию метаболитов из ПКГ.

В трансплантатах, где краевая зона сформирована такими фиброзными астроцитами, на поверхность никогда не проникают отростки нервных клеток. Это, по-видимому, свидетельствует о трансформации их из предшественников эпендимоцитов, покрывающих эмбриональный гиппокамп.

Таким образом, свободная поверхность трансплантатов in oculo покрыта капсулой из глиальных клеток, которые осуществляют метаболические взаимодействия с жидкостью, содержащейся в ПКГ. Клеточный состав поверхностной глиальной оболочки и проницаемость ее для нервных отростков зависит от местоположения исследуемой структуры в мозге in situ. Участки трансплантатов, имеющие нативное эпендимальное покрытие, представляют собой препятствие для аксонов, в то время как участки, иссеченные из паренхимы мозга, проницаемы для них.

Клеточные элементы ретикуло-эндотелиальной системы.

Клетки ретикуло-эндотелиальной системы, встречающиеся в областях трансплантатов, содержащих преимущественно нейроны и хорошо развитый нейропиль, как правило, не проявляет морфологических признаков фагоцитарной активности и не отличаются от резидентной микроглии, всегда присутствующей в интактном мозге. Число их несколько увеличено вблизи кровеносных сосудов и в периваскулярных пространствах. Специальному электронно-микроскопическому исследованию подвергались участки трансплантатов, содержащие скопления соединительнотканных клеток, располагающиеся вблизи радужной оболочки. Как правило, это трансплантаты крупных размеров, имеющие значительную область контакта с iris. В таких клеточных агрегатах главным образом идентифицируются макрофаги, имеющие различные стадии зрелости и уровни функциональной активности. Между ними содержатся многочисленные пучки коллагеновых и эластических волокон, заключенных в аморфное основное вещество соединительной ткани. Макрофаги имеют извитые контуры и цитоплазматические выросты. Их ядра содержат большие глыбки хроматина, цитоплазма вакуолизиравана, эндоплазматический ретикулум ячеистой формы. Большинство клеток содержат незначительное число лизосом, но некоторые из них включают в себя крупные электронноплотные тела с ламинарными структурами. Соседние клетки и их отростки образуют между собой контакты типа десмосом и zonula occludens; свободные поверхности покрыты микроворсинками. Сильно расширенные межклеточные пространства с выступающими в их просвет микроворсинками формируют некие специфические лакуны, напоминающие профили капилляров (рис.14). Просветы лакун электронно-прозрачны или заполнены филаментозным материалом. По-видимому, по ним может циркулировать внутриглазная (тканевая) жидкость и продукты синтеза или метаболизма окружающих клеток соединительной ткани. Агрегаты клеток ретикуло-эндотелиальной системы хорошо васкуляризованы перфорированными кровеносными сосудами. Наблюдаются непосредственные соединения наружной соединительнотканной оболочки кровеносных капилляров и основного вещества межлеточных пространств, что, по-видимому, обеспечивает непрерывный транзит веществ между ними. В таких агрегатах кроме макрофагов идентифицируются тучные клетки и клетки крови.

Рис.14 Скопление макрофагов в интраокулярном трансплантате гиппокампа. Расширенное межклеточное пространство заполнено микроворсинками (стрелки). Масштаб 1мкм.

Таким образом, ультраструктурный анализ скоплений клеток ретикуло-эндотелиальной системы свидетельствует о том, что они участвуют в транспортно-метаболических процессах, способствующих росту и развитию интраокулярных трансплантатов.

7. Исследование интракортикальных трансплантатов

В этой серии экспериментов изучали особенности развития, дифференцировки и интеграции гомотопически (трансплантаты неокортекса — ТН) и гетеротопически (трансплантаты зубчатой фасции — ТЗФ) пересаженной эмбриональной нервной ткани. Это позволило выяснить роль тканеспецифических факторов в экспрессии органотипических признаков.

Иммуногистохимическое исследование цитологического состава гомотопических трансплантатов неокортекса при разных способах трансплантации. Для определения зависимости цитологической организации трансплантатов от способа трансплантации и степени их интеграции с мозгом проведена сравнительная оценка числа ГАМК(+) и ГАМК(-) нейронов в интракортикальных трансплантатах соматосенсорной коры при помещении их в острую полость (интракавитально) и в паренхиму неокортекса (интрапаренхимально). Морфологическим показателем интеграции является отсутствие глиального рубца между тканями трансплантата и мозга реципиента. Количественно этот показатель может быть выражен как "коэффициент интеграции". Интрапаренхимальиые трансплантаты проявляют более высокую степень интеграции. Их коэффициент интеграции равен 0.8±0.2, в то время как для интракавитальных трансплантатов он составляет 0.410.2. Результаты морфометрического анализа ГАМК(+) и ГАМК(-) нейронов представлены в табл. 1 и 2, где они сопоставлены с таковыми для интраокулярных трансплантатов, полностью изолированных от мозга.

Таблица 1. Диаметры ядер и тел (в мкм) ГАМК(+) и ГАМК(-)нейронов в неокортексе и в трех группах трансплантатов (Х±Бх).

Объект Тип трансплантации Ядра, ГАМК(+) Тела, ГАМК(+) Ядра, ГАМК(-)

Эмбрионы, 17 дней 5.8±0.8 — 6.4±0.

Контрольная кора 9.5±1.5а 16.7±1.68 8.6±0.5б кора около трансплантатов — 18.6+1.7 —

Интрапаренхимальная 11.9±1.4Г 21.1±1.9Д 8.510.7*

Интракавитальная 11.6±1.9Г 20.6±2.7е 8.6Ю.5Ж

Интраокулярная 11.8±2.3Г 25.3±2.0Д 10.4Ю. а<г, р<0.05; в<д, р<0.005; ж<г, р<0.001; б<з, р<0.001; в<е, р<0.

Таблица 2. Средняя числовая плотность (в 1 мм3) ГАМК(+) и ГАМК(~) нейронов в неокортексе и трех группах трансплантатов.

Тип трансплантации Коэффициент интеграции Плотность ГАМК(+) нейронов Плотность ГАМК(-) нейронов % ГАМК(+) нейронов от общего числа нейронов

Контрольный неокортекс 5605а11353 41708б±7816 11.

Интрапаренхимальная 0.8+0.2 959В1674 75393г+9127 1.

Интракавитальная 0.410.2 1360в1402 61950*122147 2.

Интраокулярная — 296в196 33272е15428 0. а>в, р<0.0001; б<д, р<0.05; б>е, р<0.

Размеры нейронов. Средний диаметр ядер ГАМК(-) клеток не различается в обоих типах интракортикальных трансплантатов и в соседнем неокортексе (8.610.5; 8.5+0.7; 8.6+0.5 мкм). В то же время диаметр ядер ГАМК(+) нейронов в трансплантатах (11.9±1.4; 11.611.9 мкм) достоверно больше, чем в интактном неокортексе (9.5±1.5 мкм). Гипертрофия ГАМК(+) нейронов проявляется также при измерении диаметров тел нейронов. В интракортикальных трансплантатах двух типов их средний размер составляет 20.6+2.7 мкм и 21.111.9 мкм по сравнению с 16.7+1.6 мкм в контрольной коре (р<0.001). Увеличенные размеры имеют также ГАМК(+) клетки в соседнем неокортексе (18.6±1.7 мкм) в отличие от более удаленных участков коры (16.711.6 мкм).

Плотность ГАМК(-) нейронов значительно выше в обоих типах интракортикальных трансплантатов (7539319127 в интрапаренхимальных и 61950122147 нейронов в 1 мм3 в интракавитальных), чем в неокортексе реципиента, что в процентном выражении равно 180% и 154%, соответственно.

Плотность ГАМК(+) нейронов в интракортикальных трансплантатах значительно ниже, чем в нормальной коре (Табл.2). Количество ГАМК(+) клеток в 1 мм3 интрапарехимальных трансплантатов — 9591674, а интракавитальных — 13601402, что соответствует 1.4% и 2.5% от общего числа нейронов и 17% и 24% от плотности иммуноположительных клеток в контрольном неокортексе. При сопоставлении морфометрических значений с коэффициентом интеграции выявлена положительная корреляция его с общей числовой плотностью нейронов. Эти результаты хорошо дополняются данными, полученными на трансплантатах, развивающихся в ПКГ, изолированно от центральной нервной системы (т. е. имеющих нулевой коэффициент интеграции), и характеризующихся самой низкой плотностью нервных

15 Корреляция между общей числовой плотностью нейронов в трансплантатах неокортекса (абсцисса) и коэффициентом интеграции трансплантатов (ордината). Кружки - интраокулярные трансплантаты; квадраты -интракавитальные трансплантаты в неокортексе; треугольники - интрапа-ренхимальные трансплантаты в неокортексе. клеток (рис.15). Количество FAMK(+) клеток в целом не коррелирует с коэффициентом интеграции, хотя в полностью изолированных трансплантатах (в том числе и в интраокулярных) обнаруживается самая низкая плотность ГАМК(+) нейронов.

Клеточная организация и синоптические взаимодействия внутри гетеротопических интракортикальных трансплантатов зубчатой фасции. Трансплантаты зубчатой фасции в неокортексе, с которым в норме зубчатая фасция не имеет анатомических связей, успешно приживаются и развиваются. Из 11 проведенных операций трансплантаты обнаружены в 9 случаях. Они обычно полностью погружены в полость, сформированную в неокортексе, но некоторые из них частично возвышаются над поверхностью мозга реципиента. Основную нейронную популяцию в трансплантатах, как и в зубчатой фасции in situ, представляют гранулярные клетки с незначительной примесью пирамидных нейронов гиппокампа и полиморфных клеток хилуса. Все клеточные типы воспроизводят свои цитотипические характеристики. Большинство клеток-зерен (9-10 мкм в диаметре) организовано в плотно упакованные кластеры, которые иногда напоминают фрагменты клеточного слоя in situ. Они имеют относительно крупное светлое ядро и узкий ободок цитоплазмы с диффузно распределенными небольшими группами цистерн шероховатого эндоплазматического ретикулума. Дендритные отростки нервных клеток также характеризуются высоко дифференцированной структурой. В трансплантатах обнаруживаются сйнаптические окончания разных типов:

Рис.16 Ультраструктура интракортикального трансплантата зубчатой фасции.

ГН - гранулярный нейрон; С - синаптические окончания.

Масштаб 1мкм. аксосоматические, аксодендритные и аксошипиковые. Общий вид нейропиля демонстрирует обычную для нервной ткани плотность синаптических контактов (рис. 16). В части аксосоматических и аксодендритных терминален, образующих симметричные активные зоны, выявляются эллипсоидные везикулы, что соответствует тормозной природе этих синаптических взаимодействий в норме. Происхождение большинства синапсов определить невозможно. Они могут принадлежать как нейронам самого трансплантата, так и афферентам, прорастающим из неокортекса реципиента. Благодаря своим уникальным структурным особенностям четко идентифицируются только окончания аксонов гранулярных клеток, которые, как и in situ, имеют гигантские размеры (до 4-5 мкм в сечении), инвагинированные внутритерминальные синаптические контакты и характерные набор и упаковку везикул. В основном они заполнены малыми светлыми везикулами (20-40 нм), которые при обычном анализе выглядят морфологически однородными. Однако нами обнаружено (при исследовании нормального гиппокампа), что эти везикулы различаются по химическому составу, одна часть из них реагирует с цинк-иод-осмиевым реагентом, другая — нет. Помимо малых светлых сферических пузырьков гигантские терминали содержат также крупные везикулы с осмиофильным центром разной величины. Одна терминаль может одновременно контактировать с несколькими соседними дендритами и, наоборот, с одним дендритом могут взаимодействовать несколько гигантских бутонов. Если в нормальном гиппокампе они заканчиваются на толстых проксимальных шахтах апикальных дендритов пирамидного поля СА3 и их огромных разветвленных thorny excrescences, в трансплантатах они наблюдаются не только на крупных дендритах, но и на дендритах малого диаметра и их концевых веточках. Большинство дендритных шипиков, образующих интратерминальные контакты с гигантскими терминалями, имеет обычные размеры (1.0-1.5 мкм в длину) и небольшие округлые головки (рис.17). Вместе с тем, наблюдаются шипики извитой и разветвленной формы. Подобно тому, что наблюдается в ткани in situ, терминали мшистых волокон образуют химические синаптические контакты с аккумуляцией везикул на дендритных шипиках, а на дендритных стволах — преимущественно десмосомоподобные соединения.

Рис.17 Гигантское синаптическое окончание (ГО) аксона гранулярной клетки, формирующее многочисленные ассимметричные синаптические контакты с дендритными шипиками (ДШ) в трансплантате зубчатой фасции. Масштаб 1мкм.

Ультраструктурные признаки регенеративнодегенеративных процессов в долгоживущих интрамозговых трансплантатах зубчатой фасции. Хотя в целом клеточные элементы в ТЗФ демонстрируют высокую степень дифференцировки, детальный ультраструктурный анализ обнаруживает даже через 9 мес. после операции некоторые признаки незрелости ткани. Поверхность некоторых гранулярных и пирамидных нейронов, особенно располагающихся вне плотных клеточных кластеров, имеет сильно извитые контуры за счет глубоких инвагинаций и цитоплазматических филоподий. Дендриты,

Рис. 18 Олигодендроцит (ОЦ), формирующий миелиновую оболочку аксона (А). Видна связь цитоплазматического выроста олигодендроцита с внешней ламеллой миелиновой оболочки (#). Масштаб 1мкм помимо обычных дендритных шипиков, также имеют дополнительные микровыросты и короткие боковые веточки. На шипикоподобных соматических и дендритных отростках синаптические активные зоны отсутствуют. Они содержат в основном мелкозернистый осмиофильный материал, однако в некоторых микровыростах и концевых отделах дендритных веточек содержатся цитоплазматические органеллы, связанные с синтетическими процессами (рибосомы, цистерны эндоплазматического ретикулума, митохондрии, мультивезикулярные тела). Присутствие дополнительных выростов на телах и дендритах характерно для онтогенетически незрелого материала. Признаки продолжающегося роста наблюдаются и в аксонах трансплантированных нейронов. Некоторые аксоны заканчиваются типичным конусами роста или имеют рыхлые, несформированные миелиновые оболочки. Встречаются миелинобразующие клетки со светлой цитоплазмой, характерной для незрелых олигодендроцитов. Можно наблюдать непосредственную морфологическую связь отростков этих клеток с наружным витком миелиновой оболочки, что также не типично для зрелой ткани (рис. 18).

Одновременно со свидетельствами продолжающегося роста в трансплантатах присутствуют признаки дегенеративных изменений. На уровне клеточных тел они незначительны. Отмечается лишь наличие вакуолей в ядрах и увеличение числа лизосом и липофусциновых гранул в цитоплазме некоторых нейронов. Встречаются единичные интернейроны с повышенной филаментозностью матрикса и искаженными (уплощенные с перетяжками) формами митохондрий. Признаки дегенерации чаще наблюдаются в некоторых отростках нервных клеток и особенно отчетливо в аксонах и их окончаниях. Дегенирирующие миелинизированные и немиелинизированные аксоны на срезах имеют вид расширенных профилей, содержащих массу лизосом разного размера, а также электронноплотные и слоистые тела. Такие профили иногда встречаются в нейропиле поодиночке, но чаще образуют скопления около границы трансплантата с мозгом реципиента. Наличие деструктивных признаков во многих дегенерирующих отростках сочетается с присутствием в них митохондрий, тубулярного ретикулума, полиморфных везикул, в том числе ростовых, что свидетельствует о параллельно идущих репарационных процессах.

Таким образом, анализ гомо- и гетеротопических интрамозговых трансплантатов свидетельствует о том, что тканеспецифические факторы не оказывают влияния на развитие, дифференцировку и экспрессию органотипических признаков в трансплантированной ткани. Вместе с тем нервная ткань в гетеротопических ТЗФ характеризуется неустойчивым состоянием, присутствием незрелых элементов и признаков регенерационно-дегенерационных процессов. На примере трансплантатов неокортекса показана зависимость цитологической организации, а именно, общей числовой плотности нейронов и соотношения ГАМК(+) и ГАМК(-) клеток в них от степени интеграции с мозгом реципиента.

8. Исследование возможности интеграции гетеротопических интракортикальных трансплантатов с мозгом реципиента.

Одной из наиболее важных проблем в области нейротрансплантации является степень специфичности устанавливаемых трансплантированными нейронами синаптических контактов. Исследование этого вопроса проведено на интракортикальных трансплантатах зубчатой фасции, т.к. уникальные морфологические особенности гигантских синаптических окончаний мшистых волокон воспроизводятся в условиях трансплантации, и это позволяет четко идентифицировать их в неокортексе реципиента.

Ультраструктура границы между трансплантатом зубчатой фасции и неокортексом животного-реципиента. Исследование границы между ТЗФ и мозгом реципиента проведено для определения возможности прорастания через нее аксонов трансплантированных нейронов. В интерфазе обнаруживаются области полного слияния тканей и участки, где трансплантат и мозг разделены глиальным рубцом или внедряющимися между ними кровеносными сосудами. Глиальная зона раздела легко идентифицируется при малых увеличениях, и в различных участках варьирует по составу и плотности клеточных элементов. Ширина ее колеблется от 2-5 мкм до 15-20 мкм. В зависимости от клеточного состава выделены три типа пограничной зоны: астроцитарная, эпендимапьная и периваскулярная.

Астроцитарная граница. Глиальные клетки, принимающие участие в организации границы, имеют разные морфологические характеристики; Некоторые из них не отличаются от типичных фиброзных астроцитов. Их тела и отростки имеют светлую цитоплазму с относительно небольшим количеством органелл; число глиафиламентов в них варьирует. Некоторые отростки из пограничной области проникают в глубь трансплантата или неокортекса. Другие глиальные клетки резко отличаются от зрелых, дифференцированных астроцитов меньшими размерами и компактной электронноплотной цитоплазмой с множеством клеточных органелл. Их сильно вытянутые тела и неразветвленные отростки ориентируются вдоль границы. Между глиальными элементами интерфазы проникают многочисленные нервные отростки, обычно собранные в пучки. Тонкие немиелизированные аксоны (около 0.1 мкм в диаметре) напоминают мшистые волокна гранулярных клеток. Пучки миелинизированных аксонов (до 2.0 мкм в диаметре), состоящие из 15-20 волокон и окруженные отростками фиброзных астроцитов, похожи на фасцикулы в соседнем неокортексе. Встречаются также смешанные пучки, содержащие не только миелинизированные и немиелинизированные аксоны, но и дендриты (Рис. 19).

Рис.19 Поперечные профили миелинизированных (М) и немиелинизированных (а) аксонов на границе между трансплантатом зубчатой фасции и мозгом реципиента. Я - ядро астроцита. Масштаб 0,5мкм.

Эпендимальная граница. Клетки эпендимы, которые присутствуют в эмбриональной закладке ЗФ, активно пролиферируют в трансплантированном материале и в некоторых местах полностью заполняют пограничную зону. Они отличаются от соседних астроцитов и элементов нейропиля большей электронной плотностью. Их цитоплазма, густо заполненная короткими и относительно толстыми филаментами, содержит множество митохондрий, лизосом и аутофагических вакуолей. Наиболее яркой отличительной особенностью их является присутствие многочисленных ресничек и их базальных тел. Профили ресничек наблюдаются не только на поверхности цитоплазмы, но и в глубине ее; кроме того, они плотно заполняют межклеточные пространства (рис.20). Тела эпендимоцитов и их отростков с извитыми контурами плотно прилегают друг к другу, образуя между собой взаимные инвагинации и десмосомоподобные контакты, достигающие в длину 3 мкм и более. Хотя такой тип организации пограничной зоны представляет собой довольно серьезное препятствие для прорастания нервных отростков, в ней часто наблюдаются пересекающие границу нервные волокна. Небольшие группы аксонов используют узкие щели между клетками. Вместе с тем, в интерфазе этого типа наблюдаются также мощные транзитные пучки, состоящие из мякотных и безмякотных аксонов и дендритов, по ходу образующих между собой синаптические контакты. Такие пучки всегда сопровождаются отростками фиброзных астроцитов.

Рис.20 Клетки эпендимы (Э) на границе между трансплантатом зубчатой фасции (ТЗФ) и мозгом реципиента. Р - реснички в межклеточном пространстве. Масштаб 1мкм.

Периваскулярная граница. В некоторых участках пространство между трансплантатом и мозгом хозяина полностью заполнено многочисленными профилями кровеносных сосудов и окружающими их периваскулярными элементами. Такие сосуды характеризуются наличием толстой многослойной стенки с большим числом перицитов. Обильно представленная перикапиллярная глия состоит в основном из фиброзных астроцитов. Многочисленные ряды и ответвления базальной мембраны проникают между телами и отростками перицитов и астроцитов. В таких участках границы никогда не наблюдаются даже единичные нервные волокна. Иногда базальные мембраны на большом протяжении располагаются параллельно границе, создавая препятствие для интеграции трансплантата и неокортекса. В то же время следует отметить, что, кроме базальных мембран и адвентициальных клеток, других элементов соединительной ткани (например, фибробластов, коллагеновых волокон, скоплений основного неклеточного вещества), обычно присутствующих в рубцовой ткани, не обнаружено ни в этом, ни в других типах пограничной зоны.

Синоптические контакты нейронов трансплантатов зубчатой фасции с неспецифическими клеточными мишенями в соседнем неокортексе. Гигантские синаптические окончания мшистых волокон гранулярных клеток зубчатой фасции идентифицируемые в неокортексе, в целом, аналогичны таковым в самом трансплантате. Часто они сгруппированы в небольшие кластеры вокруг некоторых перикарионов и дендритных стволов и имеют сложные конфигурации. Их синаптоплазма плотно заполнена светлыми круглыми синаптическими пузырьками с примесью везикул с электронноплотной сердцевиной; в некоторых из них находятся также ростовые везикулы. В каждом гигантском бутоне присутствует до 10-15 митохондрий, обычно сконцентрированных вместе и, возможно, представляющих срезанные фрагменты одной большой разветвленной митохондрии (рис.21). Структуры, с которыми гигантские терминали образуют синаптические контакты в соседнем неокортексе, очень разнообразны. Часто в качестве постсинаптических мишеней ими используются перикарионы и проксимальные отделы крупных дендритных стволов пирамидных нейронов неокортекса. Некоторые терминали глубоко инвагинируют в цитоплазму нейрона и образуют асимметричные активные зоны с его плазмалеммой. Создается впечатление, что инвагинации перикарионов способствуют увеличению поверхности нейронов при недостатке вакантных мест для подрастающих мшистых волокон. При контактировании с дендритными шахтами на последних могут формироваться разветвленные дендритные шипики, которые типичны для str. lucidum гиппокампа (зоны окончания мшистых волокон in situ), но абсолютно не свойственны дендритам неокортекса. Гигантские синапсы присутствуют также и на более дистальных уровнях дендритов и даже на тонких концевых веточках, что никогда не бывает в нормальном гиппокампе. Необычные дендритные выросты и концевые дендритные веточки, вступающие в синаптический контакт с гигантскими терминалями, содержат многочисленные цитоплазматические органеллы, такие как полирибосомы, митохондрии, мультивезикулярные тела, цистерны агранулярного эндоплазматического ретикулума, что свидетельствует об активных синтетических процессах в них.

Рис.21 Гигантские синаптические окончания (ГО) аксонов гранулярных клеток трансплантатов зубчатой фасции, образующие синаптические контакты с неспецифическими мишенями в неокортексе реципиента. Д - дендрит; ДШ - дендритный шипик. Масштаб - 0,5 мкм.

Гигантские терминали, располагающиеся на атипичных мишенях, кроме асимметричных химических внутритерминальных синапсов с дендритными шипиками, с поверхностью дендритов или перикарионов формируют десмосомоподобные симметричные контакты аналогично тому, как это происходит в мозге in situ. Около десмосомоподобных соединений никогда не наблюдается аккумуляции везикул, однако в этих местах со стороны терминали всегда присутствует группа митохондрий, а с противоположной, дендритной, стороны обычно располагаются цистерны. гранулярного и агранулярного эндоплазматического ретикулума. Для атипичных синаптических связей мшистых волокон в неокортексе также, как и в самом трансплантате, характерно увеличение протяженности и осмиофильности десмосомоподобных участков, что, по-видимому, свидетельствует об активизации происходящих через них метаболических и регуляторных коммуникаций.

Таким образом, результаты ультраструктурного анализа свидетельствуют о том, что аксоны трансплантированных нейронов могут прорастать через глиальный рубец на границе между трансплантатом и мозгом реципиента и формировать контакты на неспецифических клеточных мишенях неокортекса со всеми признаками функциональных синапсов.

9.Транспортно-метаболические и несинаптические взаимодействия между клеточнымими элементами в трансплантатах нервной ткани.

Интраокулярные трансплантаты. В соответствующих разделах указывались морфологические показатели высокого уровня транспортно-метаболических коммуникаций между не-нервными элементами в стенке капилляров, в скоплениях ретикулоэндотелиальных клеток, в поверхностной глии интраокулярных трансплантатов. Высокая транзитная способность капилляров выражается в обилии пиноцитозных везикул и тубулярных структур в эндотелиальных клетках и перицитах. Соединительнотканные и краевые глиальные клетки, помимо большого числа микропиноцитозных инвагинаций, развивают на своей поверхности многочисленные микроворсинки и реснички, а между соседними плазматическими мембранами формируются десмосомные контакты; расширенные межклеточные пространства часто заполнены осмиофильным материалом.

В паренхиме трансплантатов также обнаруживаются активные метаболические взаимодействия, в которых принимают участие как глиальные, так и нервные элементы. Глиа-глиальные взаимодействия обычно происходят между соседними фиброзными астроцитами. Они наиболее эффективны в местах с повышенным содержанием отростков глиоцитов, обычно вблизи поверхности. Вытянутые пластинчатые отростки, наложенные друг на друга, могут формировать своеобразные капсулы вокруг отдельных нейронов. Их смежные плазмалеммы образуют щелевые контакты (gap junctions) разной протяженности и множественные пиноцитозные инвагинации. Глиальные капсулы иногда объединяют вместе перикарион и проходящий рядом крупный дендрит.

Рис.22 Проявления нейро-глиальных (А) и нейро-нейрональных (Б) транспортно-метаболических взаимодействий. ОЦ - сателлитный олигодендроцит, Н - нейрон. Масштаб 0,25мкм.

Нейро-глиальные метаболические взаимодействия наиболее четко идентифицируются в местах соприкосновения тел нейронов и сателлитных олигодендрацитов и астроцитов (рис.22А). В участках активного транспорта межклеточная щель бывает несколько расширена (до 50-70 нм) и заполнена слегка осмиофильным материалом типа гликокаликса, в прилежащей цитоплазме наблюдаются пиноцитозные пузырьки и субповерхностные цистерны эндоплазматического ретикулума. Активные трофические взаимодействия возможны и между самими нейронами. При тесном прилежании перикарионов на большом протяжении наблюдаются целые коммуникационные комплексы. Соседние плазмалеммы образуют щелевые контакты и пиноцитозные инвагинации. В цитоплазме контактирующих участков обеих клеток располагаются гладкие и окаймленные везикулы, митохондрии, цистерны гранулярного и агранулярного эндоплазматического ретикулума, небольшие скопления электронноплотного вещества. Нередко пиноцитозному пузырьку, митохондрии или цистерне эндоплазматической сети в одной из контактирующих клеток соответствует симметрично расположенная одноименная органелла в соседней клетке, что может указывать на координированность коммуникации(рис.22Б). Аналогичные картины наблюдаются и при близком придежании перикариона и крупного дендрита или двух дендритных профилей большого сечения.

Между нервными отростками метаболические взаимодействия осуществляются обычно в виде микропиноцитозных инвагинаций и эвагинаций. Инвагинированный участок плазмалеммы имеет электронноплотное опушение. При отшнуровывании пиноцитозных структур образуются так называемые окаймленные пузырьки. Пиноцитозные углубления чаще встречаются на аксональных мембранах, в том числе вблизи активных зон синапсов, хотя они могут присутствовать и на дендритах. В местах скопления синаптических терминалей иногда создается впечатление, что макромолекулярные коммуникации направлены в сторону какой-то определенной терминали.

Рис.23 Взаимодействие между пре- и постсинаптической частями аксодендритного синапса в форме спинул (стрелки). Д - дендрит, С -синаптическое окончание. Масштаб 0,5мкм.

В обычный пиноцитозный пузырек захватываются вещества из межклеточного пространства. Однако в интраокулярных трансплантатах широко представлен и иной способ трофических связей — захват и поглощение нейроном фрагментов плазматической мембраны и прилежащей цитоплазмы соседней клетки (разновидность микрофагоцитоза). Наиболее распространен он между пре- и постсинаптической частями синапса в форме так называемых спинул (рис.23). Микрофагоцитоз может происходить как в области активной зоны, так и вне ее, и, возможно, служит для регуляции синаптической передачи. В пиноцитозную ямку, образованную синаптолеммой, внедряется фрагмент постсинапса. Между пре- и постсинаптической мембранами остается зазор от 10 до 30 нм. Диаметр инвагинаций в основном составляет 60-80 нм, но некоторые достигают 150-200 нм в поперечнике. Высота их различна; иногда они почти насквозь пронзают пресинаптический профиль. Выпуклая часть инвагинации всегда имеет характерное для эндоцитозного впячивания осмиофильное опушение. Наблюдаются также разветвленные формы спинул. Иногда их внутренняя часть имеет высокую электронную плотность. Создается впечатление, что в этих случаях внутрь спинулы захватывается часть постсинаптического уплотнения; на поперечном срезе такие спинулы ничем не отличаются от пузырька с осмиофильным центром (dense core vesicle). Микрофагические структуры с более светлым содержимым на поперечных срезах выглядят как двухконтурные пузырьки (double-walled vesicles). Иногда спинулярные структуры обнаруживаются и между двумя соседними аксональными терминалями

Интрамозговые трансплантаты. Исследована ультраструктура гомотопических (неокортекс) и гетеротопических (зубчатая фасция) трансплантатов. Обнаружено, что в целом при обоих видах интрамозговой трансплантации клеточные элементы имеют меньший уровень транспортно-метаболических коммуникаций, чем при интраокулярной. Транзитная способность стенки кровеносных капилляров практически не отличается от таковой в сосудах интактного мозга. Пиноцитозная и микрофагическая активность плазматических мембран нервных и глиальных клеток в нейропиле также в основном соответствует норме; значительно менее распространены щелевые контакты между отростками астроцитов. Вместе с тем, при формировании синаптических связей мшистых волокон гранулярных клеток зубчатой фасции с неспецифическими мишенями, что описывалось выше, наблюдаются некоторые ультраструктурные модификации зоны контакта, которые можно интерпретировать как морфологические показатели усиления метаболических взаимодействий между пре- и постсинаптическими элементами (более осмиофильные и протяженные десмосомоподобные соединения, концентрация митохондрий и цистерн эндоплазматического ретикулума). Явные признаки интенсивных метаболических коммуникаций обнаружены в области глиального рубца, образованного эпендимоцитами на границе между трансплантированной зубчатой фасцией и мозгом реципиента. Аналогично тому, как поверхностные глиальные клетки интраокулярных трансплантатов участвуют в доставке метаболитов из ПКГ, глиоциты рубца взаимодействуют с тканевой жидкостью трансплантационной ямки. Расширенные пространства между соседними эпендимоцитами выглядят как большие лакуны, в которые направлены многочисленные микроворсинки и реснички (рис.20). Смежные плазмалеммы формируют десмосомоподобные соединения значительной длины, реже щелевые контакты, а также обладают высокой пиноцитозной активностью.

Таким образом, наши данные показывают, что, хотя в интракорковых трансплантатах определенные типы глиальных клеток активно участвуют в транзите метаболитов и есть признаки усиления несинаптических коммуникаций между нервными отростками, в целом уровень транспортно-метаболических и р^гуляторно-функциональных взаимодействий в изолированных от мозга интраокулярных трансплантатах значительно выше.

Заключение Диссертация по теме "Эмбриология, гистология и цитология", Журавлева, Зинаида Николаевна

ВЫВОДЫ

1. Трансплантированная эмбриональная нервная ткань различных структур мозга (гиппокамповая формация, септальные ядра, неокортекс), развивающаяся в полной изоляции от мозга (передняя камера глаза, ПКГ), а также в окружении гомо- и гетеротопической ткани мозга взрослых реципиентов успешно приживается, васкуляризуется, дифференцируется, воспроизводит основные органотипические черты морфологии, нейрохимии и ультраструктуры нейронов и сохраняется в течение времени, соизмеримого с жизнью животного-реципиента.

2. Электронно-микроскопический анализ трансплантатов свидетельствует о том, что нервные и глиальные клетки в них имеют все признаки высокодифференцированных, зрелых элементов. Нейропиль имеет нормальную плотность и состав. Плотность синаптических контактов, их распределение по сома-дендритной поверхности близки к таковым в интактном мозге, а их ультраструктурные характеристики свидетельствуют о возможности осуществления ими функциональных коммуникаций между нейронами.

3. Рост и развитие трансплантатов зависит от ряда различных факторов (возраст и тип донорской эмбриональной ткани, возраст реципиентов, генетические характеристики). Конечный объем трансплантатов больше при использовании ткани более раннего эмбрионального возраста. Трансплантаты структур, нейрогенез которых in situ начинается относительно поздно (гиппокамп), всегда имеют большие конечные размеры, чем рано развивающиеся (септум). Старый возраст реципиента (крысы 21 мес.) не оказывает существенного влияния на величину и цитоархитектонику трансплантатов, а также на морфометрические характеристики клеточных тел и ядер нейронов. Генетические различия донора (крысы породы Вистар) и реципиента (крысы линии WAG) отрицательно воздействуют на рост и развитие интраокулярных трансплантатов, что указывает на ограниченность "иммунной привилегированности" в ПКГ.

4. Важным фактором, влияющим на цитологический состав и организацию трансплантатов является степень их интеграции с окружающей нервной тканью (и отсутствие таковой при интраокулярных пересадках). Общая плотность нервных клеток в трансплантатах положительно коррелирует с коэффициентом их интеграции с мозгом. Иммуногистохимический анализ показал, что это особенно отражается на числовой плотности ГАМКергических клеток, которая значимо снижена в изолированных интраокулярных и слабо интегрированных интракортикальных трансплантатах. Снижение числовой плотности сопровождается гипертрофией размеров нейронов (особенно

65

ГАМКергических), что может рассматриваться как проявление компенсаторных механизмов.

5. В условиях дефицита афферентных синаптических влияний в трансплантатах происходит усиление несинаптических межклеточных взаимодействий в форме протяженных щелевых контактов между соседними нейронами и астроцитами, многочисленных нейроглиальных и нейро-нейрональных коммуникаций посредствдм микропиноцитоза и особой формы микрофагоцитоза (спинулы). Для некоторых синаптических контактов (гигантские синапсы мшистых волокон) характерно усиление взаимодействий через десмосомоподобные соединения. При полной изоляции интраокулярных трансплантатов повышенный уровень транспортно-метаболических процессов проявляют элементы стенки капилляров, поверхностные глиоциты, клетки ретикуло-эндотелиальной системы.

6. В компенсации дефицита афферентных влияний могут участвовать атипичные источники связей. В интраокулярных трансплантатах по ультраструктурным признакам идентифицированы миелинизированные и немиелинизированные нервные волокна периферического типа, цитохимически идентифицированы моноаминергические аксоны, врастающие из радужной оболочки глаза. Внутри паренхимы трансплантатов они трансформируются в аксоны центрального типа и формируют синаптические контакты с нейронами ЦНС, что указывает на роль тканевого окружения в индукции морфологических характеристик аксонов.

7. В изолированных интраокулярных трансплантатах обнаружены ультраструктурные отклонения, одни из которых можно объяснить повышенной функциональной активностью ткани вследствие компенсаторного развития внутренних связей между клеточными элементами, другие - продолжающимся ростом и неполной зрелостью отдельных клеток: гиперхромные нейроны, трансформированный в слоистые тела гранулярный эндоплазматический ретикулум, вакуолизированные органеллы, конусы роста, дендритные и соматические выросты, незрелые миелиновые оболочки. В долгоживущих (9 мес.) интракортикальных трансплантатах зубчатой фасции в концевых отделах нервных отростков присутствуют цитологические признаки параллельно идущих регенеративно-дегенеративных пластических изменений. Таким образом, трансплантированная нервная ткань сохраняет динамические характеристики в течение всего срока.

8. Лишенные адекватных эфферентных мишеней нейроны могут устанавливать функциональные контакты с атипичными элементами, что особенно выражено в изолированных интраокулярных трансплантатах. В гетеротопических интракортикальных трансплантатах аксоны клеток

66 зубчатой фасции, изолированной от ее естественных мишеней (гигантские шипики на проксимальных сегментах апикальных дендритов пирамидных нейронов поля САЗ гиппокампа), контактируют с нейронами неокортекса, используя в качестве постсинаптических элементов, помимо вакантных дендритных локусов, соматические инвагинации, тонкие веточки дендритов и вновь образуемые дендритные выросты. При этом гигантские синаптические окончания мшистых аксонов воспроизводят свои уникальные ультраструктурные особенности.

9. В интракортикальных трансплантатах и в центральных зонах интраокулярных трансплантатов, характеризующихся высокой плотностью нервных элементов, врастающие капилляры обладают всеми признаками гемато-энцефалического барьера. В периферических участках интраокулярных трансплантатов с повышенным содержанием глиальных элементов барьерные свойства капилляров снижены. В небольших агрегатах клеток соединительной ткани, формирующихся в основании этих трансплантатов, ответвления тех же сосудов имеют высокопроницаемые и даже фенестрированные стенки, что указывает на индукцию свойств капилляров окружающими их клеточными элементами.

10. Клеточный состав пограничной зоны трансплантатов зависит от ее характеристик у пересаживаемого мозга in situ. На поверхностях, иссеченных из паренхимы мозга, образуется многослойная капсула из астроцитов и модифицированных одигодендроцитов, через которую свободно прорастают аксоны. На поверхностях, in situ граничащих с желудочками мозга, активно пролиферирует эпендимальная глия, несколько затрудняющая, но не препятствующая полностью проникновению нервных отростков. Барьером, полностью блокирующим интеграцию интрамозговых трансплантатов с мозгом реципиентов, являются только периваскулярные базальные мембраны кровеносных сосудов, плотно заполняющие отдельные участки переходной зоны.

11. Таким образом, трансплантированная нервная ткань при развитии в мозге и передней камере глаза, с одной стороны, реализует многие морфо-специфические характеристики структуры-донора, демонстрируя высокую степень детерминированности развития, с другой - проявляет значительные способности к пластическим адаптационно-компенсаторным перестройкам, вплоть до формирования синаптических связей с неспецифическими клеточными мишенями. Эти свойства необходимо учитывать при использовании трансплантатов для компенсации нарушенных функций мозга.

67

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Журавлева, Зинаида Николаевна, Пущино

1. Александрова М.А., Полежаев Л.В. Трансплантация нервной ткани мозга в головной мозг крысы. Докл. АН СССР, 263, 2, 460-463,1982.

2. Александрова М.А., Полежаев Л.В. Трансплантация эмбриональной замороженной ткани мозга в головной мозг взрослых крыс, интактных и после гипоксии. Докл. АН СССР, 269, 5, 1206-1209, 1983.

3. Александрова М.А., Гирман C.B., Ревищин A.B. Экспрессия кальцийсвязывающих белков парвальбумина и кальбиндина в нейронах неокортикальных трансплантатов. Докл. АН СССР, 355, 1, 130-133, 1997.

4. Артюхина Н.И. Структурно-функциональная организация нейронов и межнейрональных связей. М.: Наука, 1979.

5. Бабаева А.Г. Регенерация и система имуногенеза. М.: Медицина. 255, 1985.

6. Бабминдра В.П. Структурная пластичность межнейронных синапсов. Л.: Изд. ЛГУ, 1972.

7. Бабминдра В.П., Новожилова А.П., Братина Т.А. и др. Структурные основы регуляции чувствительности нейронов. Морфология, 6, 22-27, 1998.

8. Беркинблит М.Б., Божкова В.П., Бойцова Л.Ю. и др. Высокопроницаемые контактные мембраны. М. Наука. 1981.

9. Боголепов H.H. Ультраструктура синапсов в норме и патологии. М.: Медицина, 1975.

10. Боголепов H.H. Пластичность и стабильность синапсоархитектоники коры большого мозга. Бюлл. экспер. биол. мед. 3, 321-323, 1996.

11. Боголепов H.H., Яковлева Н.И., Фрумкина JI.E. и др. Различные виды несинаптических межклеточных контактов в развивающемся мозге крысы. Архив анат., гистол., эмбриол., 40, 2, 45-53, 1986.

12. Божкова В.П., Розанова Н.В. Современное состояние проблемы щелевых контактов и представление об их роли в развитии. Онтогенез, 29, 1, 5-20, 1998.

13. Брагин А.Г., Виноградова О.С. Гомо- и гетеровидовая трансплантация эмбриональной ткани нервной системы. Бюл. экспер.биол. мед., 10,486-489,1981.

14. Брагин А.Г., Виноградова О.С. Активность нейронов септум и гиппокампа, трансплантированных в переднюю камеру глаза крысы. Журн. высш. нервн. деят., 33,4,708-716, 1983.

15. Брагин А.Г., Виноградова О.С., Громова Е.А. и др. Влияние трансплантации норадренергической нервной ткани на уровень норадреналина мозга и поведение крыс с разрушением катехоламинергических систем. Докл. АН СССР, 276, 4, 9991003,1984.

16. Брагин А.Г., Виноградова О.С., Миронов С.Ф. Активность нейронов септум и гиппокампа при изолированном и совместном развитии в передней камере глаза крысы. Нейрофизиология, 17, 1, 61-69,1985.

17. Викторов И.В. Роль афферентных взаимодействий в формировании нейронного фенотипа: развитие дендритных систем нейронов. Сб.: Методологические, теоретические и методические аспекты современной нейроморфологии, М., Мин. здрав. РСФСР, 20-22, 1987.

18. Виноградова О.С. Развитие нервной ткани млекопитающих при трансплантации в мозг и переднюю камеру глаза: проблемы и перспективы. Онтогенез, 15, 3, 229-251, 1984.

19. Виноградова О.С. Клинические аспекты нейротрансплантации. Журн. высш. нервн. деят., 40, 2,403-409, 1990.

20. Воробьев B.C. Цитологические основы нервной трофики. ВИНИТИ. Морфология человека и животных. Антропология, 10, 68-136,1983.

21. Воробьев B.C., Самойлов М.О. Фагоцитозная активность неокортикальных дендритов при аноксии. Цитология, 23, 879-884, 1981.

22. Гилерович Е.Г. Ксенотрансплантация эмбриональных нервных тканей. Морфология, 3/4, 11-26, 1993.68

23. Гладкович Н.Г. Развитие нейронов в норме и в условиях деафферентации. Сб. Нейроонтогенез, М. Наука, 77-96, 1985.

24. Гладкович Н.Г., Лущекина Е.А., Шулейкина К.В., Леонтович Т.А. Количественная морфологическая характеристика развивающихся нейронов сенсорных ядер тройничного нерва котят. Нейрофизиология. 14, 592-600, 1982.

25. Ермакова И.В., Кузнецова Г.Д., Лосева Е.В. и др. Влияние нейротрансплантации на аудиогенные судороги у крыс разных генетических линий. Журн. высш. нервн. деят. 46, 4, 77-785, 1996.

26. Кирпатовский И.Д. Первый клинический опыт успешной аллотрансплантации ядер переднего гипоталамуса и нейрогипофиза на сосудистых связях. Тез. Трансплантация ткани мозга млекопитающих. Пущино, ОНТИ ПНЦ РАН, 27-28, 1988.

27. Косицын Н.С. Микроструктура декдритов и аксодендритических связей ЦНС. М.: Наука, 1976.

28. Косицын Н.С. Ультраструктурные основы трофических взаимодействий в центральной нервной системе. Архив анат., гистол., эмбриол. 74, 5,47-53, 1978.

29. Косицын Н.С., Колосов Н.Г. Ультраструктурные аспекты несинаптического взаимодействия между нейронами (межнейрональный транспорт). Докл. АН СССР, 230, 1,213-215, 1976.

30. Лосева Е.В. Влияние выработки оборонительного условного рефлекса на структуру и численность синапсов в гиппокампе крыс. Изв. АН СССР, сер. Биол., 5, 789-795, 1982.

31. Лущекина Е.А., Курбатова М.Б., Хоничева Н.М., Подачин В.П. Трансплантация эмбриональной ткани амигдалы в мозг амигдалэктомированных крыс. Журн. высш. нервн. деят., 48, 4, 769-772, 1988.

32. Малунова Л.Б., Самойлов М.О. Ранние постаноксические изменения ультраструктуры нейронов и нейропиля коры большого мозга кошки. Архив анат., гистол., эмбриол. 86, 1,46-49, 1984.

33. Манина A.A. Ультраструктурные основы деятельности мозга. Л.: Медицина, 1976.

34. Мошков Д.А. Адаптация и ультраструктура нейрона, М. Наука, 1985.

35. Отеллин В.А. Межклеточное пространство и несинаптические межнейронные связи головного мозга млекопитающих. Архив анат., гистол., эмбриол. 43, 9, 5-19, 1987.

36. Отеллин В.А., Кучеренко Р.П. Ультраструктурные проявления серотониндефицитных состояний в нейронах дорсального ядра шва. Морфология, 104, 5/6, 7-15, 1993.

37. Полежаев Л.В. Трансплантация участков головного мозга у амфибий и млекопитающих. Успехи совр. биол. 92, 440-454,1981.

38. Полежаев Л.В. Трансплантация участков и клеток нервной ткани в головной мозг и проблема восстановления функций. Успехи совр. биол., 95, 440-454, 1983.

39. Полежаев Л.В., Александрова М.А., Витвицкий В.Н. Трансплантация ткани мозга в биологии и медицине. М. Наука, 239, 1993.69

40. Попов В.И., Петухов В.В. Некоторые особенности ультраструктурных изменений в синапсах поля САЗ гиппокампа при различных функциональных состояниях in vitro. Докл. АН СССР, 265,4, 1005-1009, 1982.

41. Попова Э.Н. Морфология функциональных изменений нейронов и межнейрональных связей при лизергиновом возбуждении. Кн. Функционально-структурные основы системной деятельности и механизмы пластичности мозга. М.: Ин-т мозга АМН СССР, вып.З,185-188,1974.

42. Роскин Г.И., Левинсон Л.Б. Микроскопическая техника. М., Советская Наука, 1957.

43. Савельев С.В., Лебедев В.В., Войтына С.В. и др. Трансплантация фетальной и ксеногенной нервной ткани при болезни Паркинсона. Бюлл. экспер. биол. мед., 4, 369-372,1994.

44. Самойлов М.О., Мокрушин А.А. Роль объёмной передачи адаптогенных сигналов в формировании приспособительных реакций. Рос. физиол. журн., 85, 1, 4-20, 1999.

45. Саульская Н.Б. Объемная передача как способ межнейронального взаимодействия в стриатуме. Журн. высш. нервн. деят., 47, 2, 362-373,1997.

46. Угрюмов М.В. Трансплантация гипоталамуса при нарушениях нейроэндокринной регуляции (теоретические и прикладные аспекты). Успехи физиол. наук, 20,4,110-122,1989.

47. Хлудова Г.Г. Исследование связи между ультраструктурной синаптической пластичностью и числом рибосом в дендритных окончаниях на клеточной модели обусловливания в неокортексе крыс. Ж. высш. нервн. деят., 47,6, 1011-17, 1997.

48. Хрущов Н.Г. Функциональная цитохимия рыхлой соединительной ткани. М. Наука, 240 е., 1969.

49. Чайлахян Л.М. Межклеточные взаимодействия основа целесообразного поведения многоклеточных систем. Биол. мембр., 14, 6, 567-573,1997.

50. Чернов Ю.В., Чепурнов С.А.,Чепурнова Н.Е., Гельмс В.И. Изменения синапсов в амигдалоидном комплексе кролика после унилатеральной лобэктомии. Нейрофизиология, 8,134-138. 1976.

51. Ярыгин В.Н., Малинина И.Е., Бибаева Л.В. Влияние трансплантации эмбриональной нервной ткани на морфофункциональные характеристики нейронов Locus coeruleus. Бюлл. экспер. биол. мед., 7, 106-108,1997.

52. Alvarado-Mallart R.M., Sotello С. Differentiation of cerebellar anlage heterotopically transplanted to adult rat brain: a light and electron microscopic study. J. Compar. Neurol., 212, 3, 247-267, 1982.

53. Bach-y-Rita. The brain beyond the synapse. Neuroreport, 5,1553-1557, 1994.

54. Backlund E.O., Granberg P.O., Fardel L. et al. Transplantation of adrenal medullary tissue to striatum in parkinsonism: first clinical trials. J. Neurosurg., 62, 169173, 1985.

55. Baker H., Spencer R.F. Transneuronal transport of WGA-HRP from the olfactory epithelium to the brain of the adult rat. Exp. Brain Res. 63, 3,461-473, 1986.

56. Bayer S.A. The development of the septal region in the rat. J. Сотр. Neurol. 183, 89-106, 1979.

57. Bayer S.A. Development of the hippocampal region in the rat. J.Comp. Neurol. 190,87-114,1980.

58. Beach R.L., Bathgate S.L., Cotman C.W. Identification of cell types in rat hippocampus slices maintained in organotypic cultures. Dev. Brain Res. 3,1, 3-20, 1982.

59. Bennett M.V.L. Function of electronic junctions in embryonic and adult tissues. Fed. Proc. 32, 65-75, 1973.70

60. Bjorklund A., Stenevi U. Reformation of the severed septohippocampal cholinergic pathway in the adult rat by transplanted septal neurons. Cell Tiss. Res., 3, 289-302, 1977.

61. Bjorklund A., Stenevi U. Regeneration of monoaminergic and cholinergic neurons in the mammalian central nervous system. Physiol. Rev., 59, 1, 62-100,1979.

62. Brodsky F.M. New fashions in vesicle coats. Trends Cell Biol., 7, 5,175-79,1997.

63. Cajal-Y-Ramon. Degeneration and Regeneration of the Nervous System. London, Oxford Univer. Press, 1928.

64. Chen L., Meng M.Q. Compact and scattered gap junctions in diffusion mediated cell-cell communication. J. Theor. Biol. 176, 39-45, 1995.

65. Chevassus-An-Louis N„ Rafiki A., Jorguera I., et al. Neocortex in the hippocampus: an anatomical and functional study of CA1 heterotopias after prenatal treatment with methylazoxymethanol in rats. J. Comp. Neurol., 394, 4, 520-536, 1998.

66. Clarke D.J., Bjorklund A. Restoration of cholinergic circuitry in the hippocampus by foetal grafts. In: Frotscher M., Misgeld U. eds, Central Cholinergic Synaptic Transmission. Birkhauser Verlag, Basel 275-287, 1989.

67. Deller T., Frotscher M., Nitsch R. Morphological evidence for the sprouting of inhibitory commissural fibers in response to the lesion of the excitatory entorhinal input to the rat dentate gyrus. J. Neuroscience, 15, 10, 6868-6878, 1995.

68. Dermietzel R. Gap junction wiring: a "new" principle in cell-to-cell communication in the nervous system? Brain Res. Rev., 26, 2/3, 176-183, 1998.

69. Dezawa M., Mutoh T., Dezawa A., et al. Putative gap junctional communication between axon and regenerating Schwann cells during mammalian peripheral nerve regeneration. Neurosci., 85, 3, 663-667,1998.

70. Dunnett S.B., Low W.C., Iversen S.D. et al. Septal transplants restore maze learning in rats with fornix-fimbria lesions. Brain Res. 251,2, 335-348, 1982.

71. Easter S.S., Purves D., Rakic P., et al. The changing view of neural specificity. Science, 230, 507-511, 1985.

72. Edwards F.A. Anatomy and electrophysiology of fast central synapses lead to a structural model for long-term potentiation. Physiol. Rev., 75, 4, 759-87, 1995.

73. Evans V., Griffiths T., Meldrum B. Early changes in the rat hippocampus following seizures induced by bicuculline of L-allylglucine. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 9, 39-52, 1983.

74. Fiala J.C., Feinberg M., Popov V., et al. Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1. J. Neurosci., 18, 2, 8900-8911,1998.

75. Fine A. Transplantation of adrenal tissue into the central nervous system. Brain Res., 15, 121-133, 1990.

76. Fischer L.J., Gage F.H. Grafting in the mammalian central nervous system.Physiol. Rev. 73, 3, 583-616, 1993.

77. Fitzsimonds R.M., Poo M.M. Retrograde signalling in the development and modification of synapses. Physiol. Rev., 78, 1, 143-170, 1998.

78. Freed W.J., Morihisa J.M.,Spoor E. et al. Transplanted adrenal chromaffin cells in rat brain reduce lesion-induced rotational behaviour. Nature, 292, 5821, 351-52,1981.

79. Frotscher M., Nitsch C., Hassler R. Synaptic reorganization in the rabbit hippocampus after lesion of comissural afferents. Anat. Embriol. 163, 15-30, 1981.

80. Fujii M. Long distance transplant-to-host axon elongation without target differentiation. Neuroreport. 5, 2, 161-164, 1993.

81. Fuxe K., Agnati L.F. (Eds) Volume Transmission in the Brain. N.Y., Raven Press, p.602, 1991.

82. Cardial , Racca C., Triller A. Dendritic and postsynaptic protein synthetic machinery. J.Neurosci., 19, 1, 168-179, 1999.

83. Goldowitz D., Seiger A., Olson L. Anatomy of the isolated area dentata grown in the rat anterior eye chamber. J. Compar. Neurol., 208, 4, 382-400, 1982.

84. Grobstein C. Cytodifferentiation and its controls. Science, 143, 643-650, 1964.

85. Hamlyn L.H. The fine structure of the mossy fibre endings in the hippocampus of the rabbit. J. Anat. (Lond.) 96, 112-120, 1962.71

86. Haring J.H., Yan W., Faber K.M. Neuronal dye coupling in the developing rat fascia dentata. Dev. Brain Res. 103, 2, 205-208, 1997.

87. Hart M.N:, Fabty Z. CNS antigene presentation. Trends Neurosci. 18, 11, 475481,1995.

88. Hickey W.F., Kimura H. Graft-vs-host disease elicits expression of class 1 and 2 histocompatibility antigens and the presence of scaffered T-limpocytes in rat CNS. Proc. NAS USA, 84, 7, 2082-2086, 1987.

89. Huang E.P., Synaptic transmission: spillover at central synapses. Curr. Biol., 8,17, 613-615, 1998.

90. Ignatius M.J., Shooter E.M., Pitas R.E., et al. Lipoprotein uptake by neuronal growth cones in vitro. Science, 236, 4804,959-962,1987.

91. Isacson O., Deacon T. Neural transplantation studies reveal the brain's capacity for continuous reconstruction. Trends Neurosci. 20, 10, 477-482,1997.

92. Jefferys J.G.R. Nonsynaptic modulation of neuronal activity in the brain: electric currents and extracellular ions. Physiol. Rev. 75,4, 689-723, 1995.

93. Kandler K., Katz L.C. Coordination of neuronal activity in developing visual cortex by gap junction-mediated biochemical communication. J. Neurosci. 18, 4, 14191427, 1998.

94. Kaplan H.J., Stevens T.R. A reconsideration of immunological privilege within the anterior chamber of the eye. Transplantation. 19,4, 302-309, 1975.

95. Kopyov O.V., Jacques D., Liberman A., et al. Outcome following intrastriatal fetal mesencephalic grafts for Parkinson's patients is directly related to the volume of grafted tissue. Exptl. Neurol. 146, 2, 536-545, 1997.

96. Kordower J.H., Goetz C.G., Freeman T.B. et al. Dopaminergic transplants in patients with Parkinson's disease: neuroanatomical correlates of clinical recovery. Exptl. Neurol. 144, 1, 41-46, 1997.

97. Kullmann D.lyl., Asztely F. Extrasynaptic glutamate spillover in the hippocampus: evidence and implications. Trends Neurosci. 21, 1,8-14, 1998.

98. Lavi E., Suzumura A., Murasko D.M., et al. Tumor necrosis factor induces expression of MHC class I antigens on mouse astrocytes. J. Neuroimmunol. 18, 3, 245253, 1988.

99. Lee K.S., Gerbrandt L„ Lynch G. Axo-somatic synapses in the normal and X-irradiated dentate gyrus: factors, affecting the density of afferent innervation. Brain Res. 249, 51-56, 1982.

100. Lewis E.R., Cotman C.W. Mechanisms of septal lamination of the developing hippocampus revealed by outgrowth of fibers from septal implants. Brain Res. 196, 2, 307-330, 1980.

101. Lewis E.R., Cotman C.W. Neurotransmitter characteristics of brain grafts: striatal and septal tissues form the same laminated input to the hippocampus. Neuroscience, 8, 1,57-66,1983.

102. Lindvail O., Backlund E., Farde L. et al. Transplantation in Parkinson's disease: two cases of adrenal medullary grafts to the putamen. Ann. Neural. 22, 457-468,1987.

103. Loevenstein W.R. The ceil-to-cell channel of gap junctions. Cell. 48, 5, 425-426, 1987.

104. Male D.K. Immunology of brain endothelium and the blood brain barrier. In: Physiol. Pharm. of the BBB. M.W.B. Bradburg (Ed.) Springer-Verlag, Berlin, 397-415, 1992.72

105. Masuko S., Shimada Y. Neuronal cell-surface specific antigen is expressed during the terminal mitosis of cells destined to become neuroblasts. Dev. Biol., 96, 2, 3960404, 1983.

106. Mathews M.A. Transplantation of fetal lateral geniculate nucleus to the occipital cortex: connectivity with host's area 17. Exp, Brain Res. 58, 473-389, 1985.

107. Matsumoto A., Murakami S., Arai Y., et al. Synaptogenesis in the neonatal preoptic area grafted into the aged brain. Brain Res. 347, 363-367, 1985.

108. McWilliams J.R., Lynch G. Sprouting in the hippocampus is accompanied by an increase in coated vesicles. Brain Res. 2It, 158-164,1981.

109. HS.Mrzljak L., Pappy M„ Leranth C., et al. Cholinergic synaptic circuitry in the macaque prefrontal cortex. J.Comp. Neurol. 357, 4,603-617,1995.

110. Nadarajah B., Makarenkova H., Becker D.L. et al. Basis FGF increases communication between cells of the developing cortex. J.Neurosci. 18,19,7881-7890, 1998.

111. Owens T., Renno T., Taupin V., Krakowski M. Inflammatory cytokines in the brain: does the CNS shape immune responses? Immunol. Today. 15, 12, 566-71, 1994.

112. Palfrey H.C., Artalejo C.R. Vesicle recycling revisited: rapid endocytosis my be the first step. Neuroscience, 83, 4, 969-989, 1998.

113. Prewitt C.M.F., Niesman I.R., Kane C.J.M. et al. Activated macrophage/microglial cells can promote the regeneration of sensory axons into the injured spinal cord, Exptl. Neurol. 148, 2, 433-443, 1997.

114. Purpura D.P. Dendritic differentiation in human cerebral cortex: normal and aberrant development patterns. Advances in Neurol. Kreutzberg G.W. (Ed.), Raven Press, N-Y, 12,91-116, 1975.

115. Raisman G., Ebner F.F. Mossy fiber projections into and out of hippocampal transplants. Neurosci. 9, 783-801,1983.

116. Raisman G., Morris R.J., Zhou C.F. Specificity in the reinnervation of adult hippocampus by embiyonic hippocampal transplants. Progr. Brain Res. 71, 325-333, 1987.

117. Raju S., Grogan J.B. Immunologic study of the brain as a privileged site. Transplant. Proceed. 9, 1, 1187-1191,1977.

118. Rocha A.F. The brain as symbol-processing machine. Progr. Neurobiol. 53, 2, 121-198, 1997.

119. Rosenstein J.M. Permeability of the blood brain barrier to protein and H3. GABA in intraparenchymal fetal CNS tissue grafts. Exp. Neurol. 142, 1, 66-79, 1996.

120. Rossi D.J., Hamann M. Spillover mediated transmission at inhibitory synapses promoted by high affinity a-6 subunit GABAa receptors and glomerular geometry. Neuron, 20, 4, 783-795, 1998.

121. Schmid S.L., Damke H. Coated vesicles: a diversity of form and function. Fed. Amer.Soc. Exper. Biol. J. 9, 14, 1445-1453, 1995.

122. Schulz'e C., Firth J.A. Interendothelial junctions during blood-brain barrier development in the rat: Morphological changes at the level of individual tight junctional contacts. Dev. Brain Res. 69, 85-95, 1992.

123. Schuster T., Krug M., Wenzel J. Spinules in axospinous synapses of the rat dentate gyrus: changes in density following long-term potentiation. Brain Res. 523, 1, 171-174, 1990.

124. Sladek J.R., Gash D.M. Morphological and functional properties of transplanted vasopressing neurons. In: Sladek D.R., Gash D.M. eds, Neural Transplants: Development and Function. New York-London, Plenum Press, 243-282, 1984.

125. Somogyj P., Hodgson A.J., Chubb I.W. et al. Antisera to y-aminobutyric acid. J. Histochem. Cytochem. 33, 240-248, 1985.

126. Sorensen T., Zimmer J. Ultrastructural organization of normal and transplanted rat fascia dentata: I. A qualitative analysis of intracerebral and intraocular grafts. J. Compar. Neurol. 267, 15-42,1988.

127. Sorra K.E., Fiala J.C., Harris K.M. Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation, J. Сотр. Neurol. v398, 2, 225-240, 1998.

128. Steward O. Regulation of synaptogenesis through the local synthesis of protein at the postsynaptic site. Progr Brain Res. 71, 267-279, 1987.

129. Stewart P.A., Tuor U.I. Blood eye barrier in the rat: correlation of ultrastructure with function. J.Comp. Neurol. 340, 4, 566-576, 1994.

130. Stichel C.C., Muller H.W. The CNS lesion scar: new vistas on an old regeneration barrier.Cell Tiss. Res. 294, 1, 1-9, 1998.

131. Sunde N.A., Zimmer 1. Cellular, histochemical and connective organization of the hippocampus and fascia dentata transplanted to different regions of immature and adult rat brains. Develop. Brain Res. 8, 2/3, 165-191, 1983.

132. Tranzer J.P., Richards J,G. Ultrastructurai cytochemistry of biogenic amines in nervous tissue: methodologic improvements. J. Histochem. Cytochem. 24, 11781193,1976.

133. Velasquez J.L.P., Han D., Carlen P.L. Neurotransmitter modulation of gap junctional communication in the rat hippocampus. Eur. J. Neurosci. 9, 12, 2522-31, 1997.

134. Verkhratsky A., Kettenmann H. Calcium signalling in glial cells. Trends Neurosci., 19, 8, 346-352, 1996.

135. Victorov I.V., Krukoff T.L. Patterns of reaggregation and formation of linear aggregate chains in collagen-well cultures of dissociated mouse brain and spinal cord. Brain Res. 198, 167-182, 1980.

136. Victorov I. V., Lyjin A.A. Intracerebral transplantation of cultivated glio-neuronal aggregates and fetal brain tissue fragments. Proc. Indian Natl. Sci. Acad. B56, 1, 73-84, 1990.

137. Vinogradova O.S. Functional characteristics of nervous tissue (hippocampus and septum) transplanted into the anterior eye chamber and brain. Sov. Sci. Rev. F.Physiol. Gen. Biol. 2,477-528,1988.

138. Vinogradova O.S. Perspectives and limitation of neurotransplantation. Proc. Indian Natl. Acad. B56, 1, 109-124, 1990

139. Vinogradova O.S. Some factors controlling morpho-functional integration of the transplanted embryonic brain tissue. Журн. высш.нервн.деят. 3, 414, 1994.

140. Von Bartheld C.S., Byers M.R., Williams R., et al. Anterograde transport of neurotrophins and axodendritic transfer in the developing visual system. Nature, 379, 6568, 830-833,1996.

141. Williams K.C., Dooley N.P., Ulvestad E., et al. Antigen presentation by human fetal astrocytes with the cooperative effect of microglia or the microglial-derived cytokine IL-1. J.Neurosci. 15, 3(1), 1869-1878, 1995.

142. Wood M.J.A., Sloan D.J., Dallman M.J., et al. Specific tolerance to neural allografts induced with an antibody to the interleukin 2 receptor. J. Exptl. Med. 117, 3, 597-603, 1993.

143. Yoshida Y., Yamada M., Wakabayashi K., Jkuta F. Endothelial fenestra! in the rat fetal cerebrum. Dev. Brain Res. 44, 2,211 -219, 1988.

144. Zhou W., Raisman G., Zhou C. Transplanted embryonic entorhinal neurons make functional synapses in adult host hippocampus. Brain Res. 788, 1/2, 202-206, 1998.74

145. СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

146. Журавлева З.Н., Буданцев А.Ю. Цинк-йод-осмиевая импрегнация гигантских синаптосом, выделенных из гиппокамповой формации кролика. Цитология. 1975, 17, 5,491-494.

147. Журавлева З.Н. Электронно-микроскопическое исследование синаптических окончаний разной медиаторной природы, выделенных из гиппокампа кролика. Тезисы "Физиология и биохимия медиаторных процессов". Москва. 1976, 51-52.

148. Журавлева З.Н. Ультраструктурное исследование синапсов гиппокампа. Сб.: Нейрохимия и физиология синаптической передачи. Пущино. 1976, 116-142.

149. Журавлева З.Н. Возможный механизм транспорта белков в гиппокампе. Тезисы "Метаболизм белков центральной нервной системы". Днепропетровск. 1978, 72-73.

150. Косицын Н.С., Журавлева З.Н., Воробьев B.C. Ультраструктурные особенности системы мшистых волокон гиппокампа, потенциально связанных со следовыми процессами. Тезисы 4-ой Всесоюзной Конференции "Память и следовые процессы". Пущино. 1979, 104-105.

151. Журавлева З.Н. Изменение ультраструктуры моноаминергических синапсов при действии розерпина. Сб.: Ультраструктура нейронов и фармакологические воздействия. Пущино. 1981,29-33.

152. Брагин А.Г., Куликов A.B., Журавлева З.Н., Третьяк Т.М. Компенсация аллоксанового диабета у крыс трансплантацией трани эмбриональной поджелудочной железы в переднюю камеру глаза и желудочки мозга. Бюлл. экспер. биол. и мед. 1983, 95, 6, 106-108.

153. Журавлева З.Н., Буданцев А.Ю. Электронно-микроскопическое исследование моноаминергических терминалей в хвостатом ядре головного мозга крыс. Цитология. 1983,25, 10, 1132-1136.

154. Брагин А.Г., Журавлева З.Н., Виноградова О.С. Развитие трансплантатов септальной области мозга и гиппокампа в передней камере глаза. Арх. анат. гист. эмбриол. 1984, 87, 8, 3946.

155. Журавлева З.Н., Брагин А.Г. Ультраструктура нервных трансплантатов в передней камере глаза. Сб.: Возбудимые клетки в культуре ткани. Ред. Б.Н. Вепринцев, А.Р. Чубаков. Пущино. 1984, 159-163.

156. Zhuravleva Z.N., Bragin A.G., Vinogradova O.S. Organization of the nervous tissue (hippocampus and septum) developing in the anterior eye chamber. 1. General characteristic and non-neural elements. J. Hirnforsch. 1984,25, 3, 313-330.

157. Журавлева 3.H., Брагин А.Г, Виноградова О.С. Ультраструктура кровеносных капилляров трансплантатов нервной ткани, развивающихся в передней камере глаза. Арх. анат. гист. эмбриол. 1985, 88, 1, 34-40.

158. Журавлева З.Н., Брагин А.Г, Виноградова О.С. Строение поверхности трансплантатов нервной ткани, развивающихся в передней камере глаза крыс. Арх. анат. гист. эмбриол. 1985, 88, 2, 17-23.

159. Zhuravleva Z.N., Bragin A.G. Development of the rat's embryonal tissue in the anterior eye chamber. Abstr. Symposium "Neuroontogeneticum 4", Praga. 1985, 151.

160. Zhuravleva Z.N., Bragin A.G., Vinogradova O.S. Organization of the nervous tissue (hippocampus and septum) developing in the anterior eye chamber. II. Neuronal perikarya and dendritic processes. J. Hirnforsch. 1985, 26,4,417-437.

161. Zhuravleva Z.N., Bragin A.G., Vinogradova O.S. Organization of the nervous tissue (hippocampus and septum) developing in the anterior eye chamber. III. Axonal processes and their synaptic endings. J. Hirnforsch. 1986, 27, 3, 323-341.

162. Брагин А.Г., Куликов A.B., Третьяк T.M., Журавлева З.Н. Способ моделирования компенсации сахарного диабета. Авт. свид. № 36939, 1987; Патент 1993.

163. Журавлева З.Н. Ультраструктура нервной ткани, развивающейся в передней камере глаза. Перикарионы и дендриты. Онтогенез. 1987, 18, 4, 369-379.

164. Журавлева З.Н. Ультраструктура синаптических окончаний в трансплантатах нервной ткани, развивающихся в передней камере глаза. Онтогенез. 1987, 18, 6,631-638.

165. Кичигина В.Ф., Брагин А.Г., Журавлева З.Н. Состояние и активность нейронов гиппокампа крысы, трансплантированного в септум кролика, в различных экспериментальных условиях.76

166. Тез. XV съезда Всесоюзн. физиолог, общества им. И.П. Павлова, Кишенев. JI. Наука, Ред. Н.П. Бехтерева и др. 1987. т. 2, с. 200.

167. Zhuravleva Z.N., Vinogradova O.S., Bragin A.G. Incomplete maturation of the nervous tissue transplanted into the anterior eye chamber. In.: Ontogenesis of the Brain. Universitas Carolina-Pragensis. Ed. S. Trojan & F. Stastny. 1987, v.4, 67-70.

168. Журавлева З.Н. Электронно-микроскопическое исследование иннервации интраокулярных трансплантатов нервной ткани периферическими волокнами радужной оболочки. Тез. Всесоюзн. симпозиума "Трансплантация ткани мозга млекопитающих", Пущино. 1988,27-28.

169. Журавлева З.Н., Сайфуллина В.Н., Волкова А.Г. Морфометрическое исследование клеток различных полей гиппокампа в норме и при трансплантации в переднюю камеру глаза молодых и старых крыс. Там же. 1988,29-30.

170. Сайфуллина В.Н., Журавлева З.Н. Морфометрическое исследование ги ппокам пал ьных трансплантатов, развивающихся в передней камере глаза крыс различного возраста и разных линий. Там же. 1988, 55-56.

171. Zhuravleva Z.N., Bragin A.G., Vinogradova O.S. Ultrastructure of blood capillaries in nervous tissue grafts developing in the anterior eye chamber. Neurosci. and Behav. Physiol. 1988, 18, 2, 94-99.

172. Zhuravleva Z.N., Bragin A.G., Vinogradova O.S. Surface structure of nervous tissue grafts developing in the anterior eye chamber of the rat (electron microscopic investigation). Neurosci. and Behav. Physiol.1988, 18,2,99-104.

173. Журавлева З.Н. Электронно-микроскопическое исследование проявлений транспортно-метаболических взаимодействий в интраокулярных трансапантатах нервной ткани. Цитология. 1989, 31,1,42-48.

174. Zhuravleva Z.N., Pakhotin P.I., Vinogradova O.S. Some unusual characteristics of the nucleus anterodorsalis thalami: neurophysiological and ultrastructural investigation. J.Hirnforsch. 1989, 30,5,619-635.

175. Журавлева З.Н. Ультраструктура моноаминергических синапсов периферических волокон в интраокулярных трансплантатах нервной ткани крысы. Сб. Ультраструктура и пластичность нейронов. Ред. Д.А. Мошков, Пущино. 1990, 110-118.77

176. Сайфуллина В.Н., Виноградова О.С., Журавлева З.Н., Брагин А.Г. Динамика роста интраокулярных трансплантатов гиппокампа крыс: влияние возраста и линии реципиентов. Там же. 1990, 118-127.

177. Saifullina V.N., Vinogradova O.S., Zhuravleva Z.N., Bragin A.G. Growth of the hippocampal grafts in the rat anterior eye chamber: effects of age and strain of the recipients. J. Hirnforsch. 1990, 31, 4, 505-513.

178. Bragin A., Takacs J., Vinogradova O., Zhuravleva Z., Hamori J. Number of GABA-immunopositive and GABA-immunonegative neurons in various types of neocortical transplantats. Exp. Brain Res. 1991,85,114-128.

179. Zhuravleva Z.N. Intracortical dentate fascia grafts in the adult rat hosts. Ultrastructure of the graft/host interface. J. Hirnforsch. 1991, 32, 4,511-524.

180. Zhuravleva Z.N. Ultrastructural signs of regenerative-degenerative recycling in the long-term neurotransplantats. Abstr. Soviet Indian Symp. on Neurotranspl. and Develop. Neurobiol., Puschino, 1991,46.

181. Zhuravleva Z.N. Ultrastructure of the graft/host interface in the intracortical grafts of the dentate fascia. Ibid. 1991,47.

182. Zhuravleva Z.N., Vinogradova O.S. Giantic mossy fiber synapses in the host neocortex and in the grafts of isolated dentate fascia: problem of the contact specifity. Ibid. 1991,47-48.

183. Vinogradova O.S., Bragin A.G., Stafekhina V.S., Zhuravleva Z.N. Afferent integration of the homotopic and heterotopic intracortical grafts with the host brain: problem of specificity. Abstr. Proceedings of IBRO Congress, Montreal. 1991,218.

184. Zhuravleva Z.N., Vinogradova O.S. Intracortical dentate fascia grafts: mossy fiber synapses in the host neocortex. J. Neural Transpl. & Plasticity. 1994, 5,3, 169-182.

185. Zhuravleva Z.N. Ultrastructural signs of regenerative-degenerative processes in the long-term dentate fascia grafts. J. Neural Transpl. & Plasticity. 1994, 5, 3, 183-197.

186. Zhuravleva Z.N., Saifullina V.N., Zenchenko C.I. Morphometric analysis of the hippocampal neurons in the grafts developing in the anterior eye chamber of young and aged rats. J. Neural Transpl. & Plasticity. 1996, 6, 1, 49-57.

187. Журавлева З.Н. Транспортно-метаболические межклеточные взаимодействия в нервной ткани, развивающейся в условиях дефицита афферентации (трансплантаты в передней камере глаза). Биологические мембраны. 1997, 14, 6, 593-600.78

188. Журавлева 3,Н. Дифференцировка нейронов и синапсов мшистых волокон в трансплантатах зубчатой фасции, развивающейся в неокортексе крыс. Онтогенез. 1998,29,2, 85-91.

189. Zhuravleva Z.N. Intercellular transport-metabolic interactions in the nervous tissue developing under conditions of afferentation deficit. Membr. Cell. Biol. 1998, 11,6, 727-735.

190. Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований (фанты № 96-04-48537, № 97-04-49800 и № 96-15-98035).